バイオ医薬品のLC/MSによる定量と特性解析に必要な基礎知識と … · 6 ©2016 Nihon Waters K.K. 11 バンド拡散: 1) インジェクターからカラム手前まで

1

©2016 Nihon Waters K.K. 1

バイオ医薬品のLC/MSによる定量と特性解析に

必要な基礎知識と応用例

日本ウォーターズ株式会社

BioPh 2016 実践研修講座

April 2016


トピックス

イントロダクション

バイオ医薬品分析におけるLC/MSの注意点と推奨条件

– HPLC

– MS

バイオ医薬品分析におけるLC/MSの応用事例

– 抗体医薬品バイオアナリシス

– 糖タンパク質N型糖鎖解析

サマリー

Q&A

2


バイオ医薬品の例

MW 1,000 ～5,000

MW 34,000

MW 147,000

ペプチド

エリスロポエチン

モノクローナル抗体 DNA

RNA

MW 6,000

インシュリン


Trastuzumab (Herceptin®) MW 148,000 Light Chain: （C1032H1603N277O335S6） Heavy Chain: （C2192H3387N583O671S16）

モノクローナル抗体医薬品の例

3


Monoclonal Antibody

Monoclonal Antibody

Monoclonal Antibody

Fusion Protein

Monoclonal Antibody

Monoclonal Antibody

GEN Report 2014

製薬マーケットの状況

In 2014, 4 of the top 5 selling drugs ere protein-based.

In 2008, 1 of the top 5 selling drugs was protein-based.

Evaluate Pharma


血友病薬

抗がん剤

ホルモン製剤

感染症治療薬

中枢神経系薬

リウマチ薬

Modified slide from McKinsey and Company Data Source: Evaluate Pharma

2015 2014 2013 2012 2011 2010

PEGIntron

Erbitux

NovoRapid/NovoLog

4.3 Lantus Neulasta

Avonex Rebif

NovoSeven Kogenate Procrit/Eprex

Tysabri

Pegasys

5.7

Avastin Rituxan Herceptin Remicade

6.1

2020 2019 2018 2017 2016

Enbrel

Humira

Levemir

Norditropin SimpleXx

NovoMix

Humalog

モノクローナル抗体 Other protein

US Patent Expiration Date

バイオ医薬品の成長

2021

2009 sales ($Billion)

1.1

0.8

4


低分子医薬品と高分子医薬品の違い

MW = 148,000 Daltons MW = 558 Daltons

“Concept of Biosimilars” – Kirankaur Oberoi


5


トピックス



– HPLC

– MS




サマリー

Q&A


1

1

k

k

4

NRs

最大化するには : 幅広いケミストリラインアップ複数のパーティクル基材幅広い使用pH範囲 [BEH] 高い保持能 [HSS] 幅広い選択性 [CSH™]

最大化するには : 超低分散システム小さい粒子径[< 2 µm] 高耐圧性適切に設計されたカラム

分離への影響 Nを2倍 kを2倍 αを2倍

改善% 20 – 40% 15 – 20% > 400%

初期値（理論段数：N=10000段、保持係数：k=5、分離係数：α=1.1）の場合

液体クロマトグラフィー分離に影響を与えるファクター

6


バンド拡散: 1) インジェクターからカラム手前まで 2) カラム入口からカラム出口まで 3) カラム出口から検出器までカラム外

カラム内

どこでピークの拡散が起こるか？


カラム内拡散を理解するために van Deemter 式：基礎

van Deemterの式1)は拡散に影響する要因を実験的に示しており、移動相の線速度および粒子径の関数として得られる

A項は粒子径（dp）に一定に比例すると考えられていて、フローの不均一性について考慮

B項はカラム軸方向の拡散で、線速度が高くなると低減

C項は移動相と固定相間の物質移動で、線速度が高くなると

上昇

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Linear Velocity u

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Linear Velocity u

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Linear Velocity u

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Linear Velocity u

H-u

A-term

B-term

C-term

HETP(H) = A + B / u + C u =a・dp+B/u+c・dp

2・u

1) J.J.van Deemter, F.J.Zuiderweg, and A.Klinkenberg, Chem.Eng.Sci.5,271(1956)

7


拡散についての理解: van Deemterプロット

A Term

(Eddy Diffusion)

C Term

(Mass Transfer)

B Term

(Axial Diffusion)

HETP(H) = A + B / u + C u =a・dp+B/u+c・dp

2・u


拡散についての理解: van Deemterプロット

カラム効率（理論段数:N）∝カラム長 (L)/粒子径 (dp)

理論段高(HETP:H)=L/N～１理論段あたりのカラム長

カラム圧(Δp) ∝カラム長 (L)/粒径 2(dp2)

8


粒子径2 µm以下のパーティクルの耐圧試験結果

圧力

流速

理想的なプロフィール

HPLC Silica until 2004

可変圧力 (MeOH)

流速をモニター


Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788

シリカマトリックス中の架橋エタン

BEH パーティクル合成法

2004: 第二世代エチレン架橋型ハイブリッドパーティクル

U.S. Patent No. 6,686,035 B2

UPLC技術の具現化エチレン架橋型ハイブリッドパーティクル

9


粒子径2 µm以下のパーティクルの耐圧試験結果

圧力

流速

理想的なプロフィール

HPLC Silica

ACQUITY UPLC BEH 1.7 µm

可変圧力 (MeOH)

流速をモニター


ACQUITY UPLC BEH パーティクル

5 μm 分析カラム用パーテイクル (毛髪の1/12)

1.7 μm ACQUITY UPLC BEHパーティクル圧力下で最高のカラム効率を発揮するために最適化されたパーティクルディストリビューション

60 μm ヒト毛髪

(very fine) エチレン架橋型ハイブリッドパーティクル一般的なシリカパーティクル

10


1997

2004

1996

UPLC技術の具現化超高耐圧&超低拡散システムの開発


Dm m2/sec = 1.4 e-10

Dm m2/sec = 1.99 e-10

Dm m2/sec = 3.46 e-10

Dm m2/sec = 7.12 e-10

Plate Height vs. flow Rate

0

10

20

30

40

50

60

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Flow rate (mL/min)

H (

um

)

MW 300

MW 1000

MW 2500

MW 4500

バイオ医薬品 van Deemterプロットによる予測: 分析種サイズの最適流速への影響

3.5 µm particle

11


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Flow rate (mL/min)

H (

um

)

3.5 um

1.7 um

Plate Height vs. Flow Rate

バイオ医薬品 van Deemterプロットによる予測: 充塡剤粒径の影響

1.7 µm 充塡剤が顕著に性能を向上させる

2500 MW Peptide

Gilar et al, Journal of separation science 2005, 28, 1694


Time 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

%

0

100

0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

%

0

100

0.92

0.94

0.95

130 Å Pore Size

300 Å Pore Size

バイオ医薬品細孔径の影響: Teriparatide MW 4118

50° C

2.1 X 50mm ACQUITY UPLC BEH C18, 1.7 µm

12


ペプチドのためのUPLC 技術: スクリーニングプロトコール

ACQUITY UPLC BEH300 C18 2.1 X 50 mm, 1.7 µm Peptide Separation

Technology (PST) カラム

– ペプチドスタンダードでQC 試験

– 300Å PST カラムが幅広いペプチドにオーバーオールで（特にピーク形状）最適な性能を発

揮

– 2.1 X 50 mmが十分なスループットを提供

ゼネリックグラジエント

o 移動相 A = 0.1% ギ酸

o 移動相 B = 0.1% ギ酸アセトニトリル溶液

o 流速 = 0.4 mL/min

o 15% B to 75% B over 2 minutes

• 高極性ペプチドについては5% B から開始

o 全サイクルタイム：3.5 minutes

Note: 移動相に使用されたギ酸はTFAでおこるMSサプレッションを回避


広範囲のペプチドを単一メソッドでスクリーニング

Time 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

%

0

MRM of 5 Channels ES+ 1 3 2 4

5

3.5分サイクルのグラジエントでピーク幅 2-3秒で充分なMSデータポイントが取得されている

Analyte MW

Peak

Width

(seconds)

MS Data

Points

Across

Peak

1. Vasopressin 1084 1.8 15

2. Angiotensin II 1046 2.2 15

3. Desmopressin 1069 2.2 18

4. Bivalirudin 2180 2.4 18

5. Enfuvirtide 4492 2.1 16

13


トピックス



– HPLC

– MS




サマリー

Q&A


質量分析計の構成

INLET ANALYSER SOURCE ION DETECTER DATA SYSTEM

試料導入 ②イオンの分離 ①イオン化 ③イオンの検出データ処理

④真空システム

14


イオン化の種類真空下 or 大気圧下

真空下におけるイオン化：non-API

– 電子イオン化

Electron Ionization - EI

– 化学イオン化

Chemical Ionization – CI

GC/MSで一般的

大気圧下におけるイオン化：API

– エレクトロスプレーイオン化

ElectroSpray Ionization - ESI

– 大気圧化学イオン化

Atmospheric Pressure Chemical

Ionization – APCI

– 大気圧光イオン化

Atmospheric Pressure

Photoionization - APPI

LC/MS向きのイオン化法


イオン化法の適応範囲 (ESI, APCI, APPI)

Analyte polarity

MW

100

1,000

10,000

10

ESI

APCI

APPI

ionic nonpolar

バイオ医薬品（高分子）にはESIが適している

15


排気

ターボモレキュラーポンプ

ロータリーポンプ

ネブライザーガス

サンプル

アナライザー脱溶媒ガス

サンプルコーン

エキストラクションコーン

RF レンズ

プローブステンレスキャピラリー

エレクトロスプレーイオン化法（ESI）インターフェース


ESI法におけるイオン化の過程

プラスまたはマイナスの高電圧

ポジティブ：2-4kV

ネガティブ：2-3kV

①帯電液滴の形成

高温のガス

イオン蒸発フロー

ステンレス

キャピラリー

③気相イオンの生成 ②溶媒蒸発と液滴の分裂

+ ++

++

+

+

++

+++ ...+ ++

++

+

+

++

+++ ...

半径≦10nmの液滴では、液滴の分裂よりも、静電斥力による液滴表面からのイオン蒸発が起こるイオンは液相から気相に変わる

16


ESI の特徴

ソフトなイオン化

– [M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+K]+ など

– [M–H]-、[M+CH3COO]-、[M+Cl]- など

中～高極性及びイオン性、低～高分子（蛋白質では 150 kDa 程度まで) と

広い範囲の化合物を比較的高感度にイオン化できる

生体高分子、ポリマーでは多価イオンを生成

– [M+nH]n+, [M+n(NH4)]n+

– [M–nH]n-

熱に不安定な化合物もイオン化できる

非共有結合複合体もイオン化できる


質量分析計の構成

INLET ANALYSER SOURCE ION DETECTER DATA SYSTEM

試料導入 ②イオンの分離 ①イオン化 ③イオンの検出データ処理

④真空システム

17


イオンの分離四重極

イオンは四重極の中で、 DCとRFにより

振動しながら、そのm/zに固有の軌道を

描く。DCとRFの比をある範囲に保ち、

その大きさを変えると、特定のイオン

のみを通過させることができる。検出器

Nonresonant Ion

Resonant Ion

pos:V(t)= +(U+Vcos wt) neg:V(t)= - (U+Vcos wt)

DC：直流電圧 RF：交流電圧

+ +

-

-


タンデム四重極

イオン化部 – 加熱ガスのスプレーにより生成したイオンをMS内部に導入させる

光学輸送系 – 真空下へ導入されたイオンを収束させる

MS1 – 質量数の選択

コリジョンセル – コリジョンガスと衝突させてイオンを解離（衝突誘起解離）させフラグメントにする。解離時の

イオンの分散を抑制する

MS2 – 質量数の選択

MS1 MS2

Collision Cell

光学輸送系 (Q0)

イオン化部（大気圧）

18


SIMクロマトグラム

ターゲット1 ターゲット2 MRM*クロマトグラム

妨害物質

タンデム四重極：マルチプルリアクションモニタリング(MRM*)

MS1でプリカーサーイオンを選択しコ

リジョンセルでアルゴンガスと衝突誘起

解離、MS2で特長あるプロダクトイオ

ンを選択

– イオン量は減るがケミカルノイズが大幅に

下がるため、S/Nが向上

– 高選択性で高感度定量分析に最適

– ターゲット化合物のための分析手法

*MRM=selected reaction monitoring (SRM)


四重極MSの取り込み(Dwell Time)

コリジョンセル

100msec

10msec 切り替え時に排除

100 msecの平均値＞ 10 msecの平均値

19


四重極MSの取り込み(Dwell Time) イオンが等速で輸送される場合


四重極MSの取り込み(Dwell Time) イオンがパケット輸送される場合

20


四重極MSの取り込み (データポイントとDwell Time)

各ピークのデータポイントの確認

・12～15ポイント/ピークが目安、これ以下だと面積値の再現性が低下

Dwell Timeの最大化

・ポイント数が確保できる範囲内で最大のDwell Timeを設定

設定Dwell Timeでの再現性

・設定したDwell Timeで再現性を確認する


質量分離の原理 -TOFの場合

同時に加速した後、一定の距離を飛行させ検出器に到達するまでの時間を測定する。

・分解能が高いので精密質量測定が可能・飛ばしたイオンはすべて検出するので、スキャン測定の感度が高い

pusher

M1

M2

M3

M2

M1

M3

TOF-MSとは Time-of-flight mass spectrometerのこと。

21


イオンサプレッション

80% ion suppression

No ion suppression

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

%

0

100

MRM472.2 > 436.4

1.27e6

1.89

MRM472.2 > 436.4

1.27e61.91

ﾐｯｸｽﾓｰﾄﾞ固相抽出Oasis® MCX

タンパク沈澱処理Terfenadine

Terfenadine

tg = 1.5 min

80% ion suppression

No ion suppression

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

%

0

100

MRM472.2 > 436.4

1.27e6

1.89

MRM472.2 > 436.4

1.27e61.91

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

%

0

100

MRM472.2 > 436.4

1.27e6

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

%

0

100

MRM472.2 > 436.4

1.27e6

1.89

MRM472.2 > 436.4

1.27e6

1.89

MRM472.2 > 436.4

1.27e61.911.91

ﾐｯｸｽﾓｰﾄﾞ固相抽出Oasis® MCX

タンパク沈澱処理Terfenadine

Terfenadine

tg = 1.5 min

ESIによるイオン生成の過程において様々な要因によりイオン化効率が変動することがある

減少 → イオンサプレッション増加 → イオンエンハンスメント


イオンサプレッション

サンプルマトリックス成分の影響 – マトリックス効果

o 分析対象化合物と同時にイオン源内に入ってきた化合物によって起こる

o 汚いサンプル（例：血漿、尿などの生体サンプル、食品、環境サンプルなど）にてサンプルマトリックス成分と分析対象成分が未分離の場合に発生

移動相 – TFA、ギ酸、etc…

カラム – 汚染 – カラムブリード

バイアル – 汚染 – 抽出物

MS/MSのクロマト上に妨害がなくても

「見えない夾雑成分」が存在するため

LC-MS/MSにおいてもLCによる分離は重要 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60

min 20

100

%

F2:SIR of 8 channels,ES+ 411

4.920e+004

29Jan_24 10ppb 82 pesticide mix in Avocado Extract (SIR)

3.61

4.30

5.53 Nicosulfuron

3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 min 0

100

%

F2:MRM of 8 channels,ES+

411

8.084e+003

29Jan_30

10ppb 82 pesticide mix in Avocado Extract (MRM)

Nicosulfuron MS/MS

MS

22


マトリックス効果を回避するためには

LC上で完全分離

安定同位体を内部標準として使用

マトリックス成分を添加した標準で検量線を作成

サンプル前処理


m/z 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

%

0

100

Scan ES+ 9.91e7

m/z 1494 1495 1496 1497 1498 1499 1500 1501 1502 1503

%

0

100 ENFUVIRTIDE Scan ES+

1498.32

1498.01

1498.64

1498.89

1499.34

バイオ医薬品分析におけるトリプル四重極MSの選択: プリカーサーイオンのためのMSレンジの重要性

Enfuvirtide

MW 4492

可能性のあるプリカーサー推算値 – 3+ at m/z 1498

– 4+ at m/z 1124

MSスキャン実施

3+ 価のイオンが最も高いシグナル値 – 少なくても1500 amu以上のレンジがMS1に必要

1498

Enfuvirtide Sequence: Ac-Y-T-S-L-I-H-S-L-I-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-E-Q-E-L-L-E-L-D-K-W-A-S-L-W-N-W-F-aM

23


m/z 400 600 800 1000 1200 1400 1600

%

0

100

バイオ医薬品分析におけるトリプル四重極MSの選択: フラグメントのためのMSレンジの重要性

Bivalirudin (MW 2180) 2価のプリカーサーイオン

1価のフラグメントイオン

650

1091 1530

2価のプリカーサーイオン


バイオ医薬品分析におけるイオン選択：ペプチドイミニウムイオン: 高強度、だけど…

24


バイオ医薬品分析におけるイオン選択：ペプチドイミニウムイオンフラグメントの回避

02-Mar-2012

Time 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

%

0

100

0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

%

0

100

1: MRM of 4 Channels ES+ 867 > 136 (Lantus)

9.40e5 0.99

0.56

1.68

1.58

1.20 1.15

1.30 1.49 1.40

1: MRM of 4 Channels ES+ 867 > 984 (Lantus)

8.97e5 0.99

867 -> 136 (チロシンのイミニウムイオン)

867 -> 984

特異性消失


Time 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

%

0

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

%

0

MRM of 2 Channels ES- 1031.5 > 1026.8

3.20e4 2.48

3.36

MRM of 2 Channels ES- 825 > 821.3

3.26e4 2.48

1.67

1.22 1.63

1.96 2.49

m/z の大きなプリカーサ―およびフラグメントイオンを使用

Human Plasma Extract

4th charge state 1031.5 -> 1026.8

5th charge state 825 -> 821.3

25


m/z1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

%

0

100

1: TOF MS ES+ 4.91e41162.3542

1162.3403

1162.1512

1161.9482

1161.7524

1129.9305

1107.3191

1162.5503

1162.7603

1162.9493

1163.1523

1163.3553

1452.69471166.7542

1452.42861167.3573

1452.19381167.55371453.17981458.4440

m/z1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

%

0

100

1: TOF MS ES+ 4.91e4

m/z1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

%

0

100

1: TOF MS ES+ 4.91e41162.3542

1162.3403

1162.1512

1161.9482

1161.7524

1129.9305

1107.3191

1162.5503

1162.7603

1162.9493

1163.1523

1163.3553

1452.69471166.7542

1452.42861167.3573

1452.19381167.55371453.17981458.4440

5+

4+

m/z1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

%

0

100

TOF MS ES+ 1.16e51452.8917

1452.3910

1162.3069

1162.1110

1110.7625

1104.7563

1452.14061162.7130

1162.9159

1163.11891246.7325

1163.3151

1166.9028

1451.89031382.7155

1262.7163

1453.1422

1453.3927

1936.5212

1453.6432 1936.1780

1458.3903

1458.6412

1458.8763 1935.8528

1459.1431

1463.63211518.6868 1935.5095

1936.8464

1937.1898

1937.5151

1943.8459

1944.5157

1944.84181951.16631958.4913

m/z1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

%

0

100

TOF MS ES+ 1.16e5

m/z1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

%

0

100

TOF MS ES+ 1.16e51452.8917

1452.3910

1162.3069

1162.1110

1110.7625

1104.7563

1452.14061162.7130

1162.9159

1163.11891246.7325

1163.3151

1166.9028

1451.89031382.7155

1262.7163

1453.1422

1453.3927

1936.5212

1453.6432 1936.1780

1458.3903

1458.6412

1458.8763 1935.8528

1452.8917

1452.3910

1162.3069

1162.1110

1110.7625

1104.7563

1452.14061162.7130

1162.9159

1163.11891246.7325

1163.3151

1166.9028

1451.89031382.7155

1262.7163

1453.1422

1453.3927

1936.5212

1453.6432 1936.1780

1458.3903

1458.6412

1458.8763 1935.8528

1459.1431

1463.63211518.6868 1935.5095

1936.8464

1937.1898

1937.5151

1943.8459

1944.5157

1944.84181951.16631958.4913

5+

4+

3+

m/z1452 1453 1454 1455

%

0

100

TOF MS ES+ 1.16e51452.89171452.6415

1452.3910

1452.1406

1451.8903

1453.1422

1453.3927

1453.6432

1453.8936

1454.1284

1454.3947

m/z1452 1453 1454 1455

%

0

100

TOF MS ES+ 1.16e5

m/z1452 1453 1454 1455

%

0

100

TOF MS ES+ 1.16e51452.89171452.6415

1452.3910

1452.1406

1451.8903

1453.1422

1453.3927

1453.6432

1453.8936

1454.1284

1454.3947

特異的プリカーサーイオンのフォーメーションに与える流速の影響

200 µL/min

10 µL/min


トピックス



– HPLC

– MS




サマリー

Q&A

26


トピックス

抗体医薬品バイオアナリシス

– タンパク質バイオアナリシスワークフロー

o 概説と課題

o タンパク質レベルにおけるクリーンアップ

o 消化

o ペプチドレベルにおけるクリーンアップ

– ProteinWorks:標準化され再現するキットベースアプローチ

o 概容

o 適用

o ProteinWorksのアドバンテージ

• モノクローナル抗体

• 抗体薬物複合体(ADC:Antibody Drug Conjugates)


タンパク質定量メソッド

リガンドバインディングアッセイ

Ligand Binding Assay(LBA)

– 高感度

– ハイスループット

– 少容量サンプルに適合

– 簡単

– 交叉反応不正確な結果

– 抗体作成に時間とコストを要する

LC-MS/MS

– 高い特異性と真度

– 1度に多成分を分析可能

– 高い直線性と広いダイナミックレンジ

– 迅速メソッド開発

http://www.bioanalysis-zone.com/wp-content/uploads/2014/07/Bio-figure.jpg

27


LC-MS/MS タンパク質バイオアナリシス: サロゲートペプチドアプローチ

血清/血漿タンパク質

LC/MS Data

タンパク質レベルクリーンアップ (オプション)

ペプチドレベルクリーンアップ (オプション)

ペプチド消化

精製されたタンパク質

精製されたペプチド

高感度

ではありますが…


ワークフローの課題と選択

標準化されていない, 多くの選択

時間と労力を要するサンプル調製 (8-24 hr)

消化 - 長い消化時間,主たる変動要因

メソッド移管 - 課題、実験者間、ラボ間

メソッド開発 - 課題、時間を浪費

専門性 – 低分子の研究者は“高分子”の課題（例：分子の複雑性、可変性、高い

内因性バックグラウンド、非特異的吸着）と直面

28


タンパク質レベル(消化前) クリーンアップ法の選択

タンパク質クリーンアップ

一般的なタンパク質

モノクローナル抗体創薬開発感度時間コスト

無し x x x low Fastest none

MWカットフィルター x x x x low $

除タンパクプレート x x x x low $

タンパク沈殿 (ペレット消化)

x x x x medium $

Protein A/G x x x medium $$

Kappa (ヒト抗体) x x high $$$

特異的抗体の開発 x x x high $$$$

目的に合わせ、これらのクリーンアップ技術のいずれか一つを使用




特異性 & 感度: タンパク質レベルクリーンアップ

100uL SPE, Kappa

Time7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100

7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100

7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100

7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100

500ngmL_plasma_051314_003 MRM of 6 Channels ES+ 485.2 > 721.4 (FTISADTSK HC)

1.30e5Area


1.30e5Area

8.43810


1.30e5Area

8.43401

blank_plasma_051314_003 MRM of 6 Channels ES+ 485.2 > 721.4 (FTISADTSK HC)

1.30e5Area

8.43 3412

100uL SPE, Protein A, 1:5 Worthington, DTT, 17hr digestion

Time7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100

7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100

7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100

7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100


6.43e4Area


6.43e4Area

8.49722


6.43e4Area

8.50345


6.43e4Area

8.49163

8.50 1707

Trastuzumab 485.2>721.4 (FTISADTSK)

50uL SPE, whole plasma, 1:12.5 Worthington, DTT

Time7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100

7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100

7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100

7.50 8.00 8.50 9.00

%

0

100


2.60e4Area

8.38493


2.60e4Area

8.4179


2.60e4Area


2.60e4Area

特異的: ヒト抗体 in ラット血漿

汎用的: Protein A in ヒト血漿

無し:ヒト血漿直接消化

タンパク質レベルのクリーンアップは必要とする感度と特異性により決定される

500 ng/mL

100 ng/mL

Blank Plasma

50 ng/mL

29


シンプルで低コストな方法: タンパク沈殿（ PPT :Protein Precipitation) アルブミン削減とハーセプチンペプチド強度

Solvent 4 によるタンパク沈殿はアルブミンペプチドの半分以上を除去し、ハーセプチンペプチドの感度と特異性を増加させた

Technology Brief 720005574EN

% A

rea

(Norm

alized to

no P

PT)


消化: メソッド開発の課題

タンパク質変性最適化

実験消化再現性

5 STEPS •変性 •還元 •アルキル化 •酵素消化 •消化停止

還元/アルキル化最適化試薬濃度、時間、温度、試薬

選択、; Or..省略?

選択酵素ベンダータンパク/酵素比温度

ペプチド消化

タンパク質

消化時間最適化

30


消化: メソッド開発の課題


ペプチドレベルクリーンアップ: 課題

ペプチド


より低濃度のターゲット分析種

マトリックス効果による感度低下

消化酵素、バッファー、塩、リン脂質などの妨害

ターゲットペプチドの回収率

高レベルの必要が無い内因性ペプチド

どうしてペプチドをクリーンアップしなければ

いけないの?


システムの頑健性

31


トピックス

抗体医薬品バイオアナリシス

– タンパク質バイオアナリシスワークフロー

o 概説と課題

o タンパク質レベルにおけるクリーンアップ

o 消化

o ペプチドレベルにおけるクリーンアップ

– ProteinWorks:標準化され再現するキットベースアプローチ

o 概容

o 適用

o ProteinWorksのアドバンテージ

• モノクローナル抗体

• 抗体薬物複合体(ADC:Antibody Drug Conjugates)


ProteinWorks

A Family of (5) Sample Preparation Kits for

簡単で, 標準化され再現する

LC-MS/MS タンパク質定量

32


ProteinWorks キットワークフロー


LC/MS Data

タンパク質レベルクリーンアップ (オプション)


ペプチド消化



eXpress 消化キット •変性 •還元 •アルキル化 •酵素消化 •消化停止

µElution SPE キットターゲットペプチドの精製


ProteinWorks eXpress 消化キット

消化

タンパク質

最大5 ステップ •変性 •還元 •アルキル化 •酵素消化 •消化停止

ProteinWorks 紹介キット*

eXpress 消化キット

アフィニティー精製されたサンプル用

eXpress Direct 消化キット

アフィニティー精製されていないサンプルの直接消化用

* 初めの容量が15-70 µLのサンプルに最適化

5 ステップ消化

~ 3 時間

または

3 ステップ消化

– 還元アルキル化無し

– ~2 時間

新変性フォーマットサンプル量に最適化されたMS- フレンドリーな変性剤RapiGestが96本の反応用チューブに秤量

ペプチド

33


eXpress 消化キット & Direct 消化キット構成品

室温保存品冷蔵保存品

還元剤アルキル化剤

トリプシン

変性剤入り1 mL チューブ, 12x8 strips

チューブキャップ

消化バッファー

消化停止剤

トリプシン溶解溶液


ProteinWorks μElution SPE クリーンアップキット

1 キット:

• アフィニティ精製したタンパク質の消化サンプルおよび

直接消化サンプルどちらにも使用可能

• 構成:

•Oasis MCX µElution プレート

•700µL コレクションプレート

•キャップマット

•SPE プロトコール

ペプチド


µElution SPE キットターゲットペプチドの精製

34


ProteinWorks μElution SPE クリーンアップキット

Oasis MCX μElution プレート

700 μL コレクションプレート＆キャップ

分析を妨害する消化試薬とバッファーを除去高効率な単一のSPEメソッドによりユニークおよびジェネリックペプチドを回収乾固工程を排除するµElutionフォーマットにより最少のサンプルロス µElutionフォーマットにより最大15倍濃縮

トリプシンペプチドのクリーンアップのための、ユニバーサルで最適医会されたSPEキットとプロトコール

Technology Brief p/n 720005544EN


キットに含まれないもの推奨品

ヒートブロック(製品番号 186007985)

ACQUITY Peptide BEH C18 300A, 1.7μm, 2.1 x 150mmカラム

インキュベーター (Boekel or comparable)

8連ピペッター

Intact mAb Check スタンダード (製品番号 186006552)

(スタートアップキットに同梱)

•ワークフローの練習 •システムチェック •ジェネラルインターナルスタンダード

ペプチドシークエンスクロマトグラフィー条件 MRM条件完備

35


Intact mAb Check スタンダード

製品番号186006552, 1mg/vial

スタートアップキットに同梱

ワークフローの練習

システムチェック

ジェネラルインターナルスタンダード– 創薬研究向け

ジェネリック内標準とタンパク質バイオアナリシスワークフローチェック用スタンダードとしての

マウス由来インタクトモノクローナル抗体

ペプチドシークエンスクロマトグラフィー条件 MRM条件完備

ワークフローの初回練習用に最適!

Technology Brief 720005543JA


ProteinWorks Kit キットの適用範囲

eXpress 消化キット*

– Protein A/G などでアフィニティー精製したサンプル用

– Protein A/G アフィニティー精製とOasis MCX µElution による精製の組み合わせにより高感度を達成 (10ng/mL, 100ng/mL)

– タンパク量 ~0.2 – 1.0 mg に適応

* Protein A/G 等のアフィニティー精製用品は含みません


– 血漿、血清の直接消化用

– タンパク質レベルの精製無し

– LOQ > 100 ng/mL

– ペレット消化と併用

– 総タンパク量~1.0 – 5.25 mgに適応

スタートアップキット

– Oasis MCX µElution SPEキットと Intact mAb Mass check スタンダードをお求めやすい価格で同梱

36


ProteinWorks Kit キットの適用範囲 : 創薬 & 早期開発

血清/血漿

LBA アフィニティー

精製

消化

SPE

LC MS

アフィニティー

精製

消化

LC MS

消化

LC MS

消化

SPE

LC MS

eXpress 消化スタートアップ

キット

eXpress 消化キット

eXpress Direct 消化スタートアップキット


176003695

176003696

176003689

176003688


The ProteinWorks アドバンテージ: 以下を兼ね備え、簡易化され加速されたワークフロー

再現性

標準化

柔軟性

感度

37


ProteinWorks 再現性

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

%CV

of P

eptid

e Ar

ea C

ount

s

Intra-Kit (Within Kit) ReproducibilityeXpress Direct Digest Kit

Kit #1

Kit #2

Kit #3

Kit #4

Kit #5

Intra-Kit: Each bar is 6 replicate injections Inter Kit: 5 Different Lots of Trypsin Raw Area Counts, No Internal Standard

Inter-kit and Intra-kit Reproducibility ProteinWorks eXpress Direct Digest Kit

Technology Brief 720005570en

キット内 (avg 3.4% CV) 、キット間 (avg 6.2% CV) と、バイオアナリシスガイドライン（15%以下）よりも低い10%未満の相対標準偏差


ProteinWorks 再現性

38


ProteinWorks eXpress 消化キットを使用したInfliximabの高感度定量

ProteinWorks eXpress Digest Kit

QCサンプルに優れた真度と精度, SINSATHYAESVK ペプチドの平均相対標準偏差 < 3%

Time 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40

%

0

100

2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40

%

0

100

MRM of 11 Channels ES+ 469.6 > 603.8 (Remicade SINSATHYAESVK )

2.20e4 Area

4.15 361

MRM of 11 Channels ES+ 469.6 > 603.8 (Remicade SINSATHYAESVK )

2.20e4 Area

Blank plasma

SINSATHYAESVK Unique Signature Peptide

10 ng/mL infliximab

35 µL plasma

% P

eak H

eig

ht

Retention Time

% P

eak H

eig

ht

Application Note 720005535en


ProteinWorks uElution SPE キット優れた回収率

0

20

40

60

80

100

120

Oasis MCX

トリプシンペプチドに優れた回収率; 装置稼働時間と感度を最大化

イオン交換と逆相と全く異なる保持原理のミックスモード固相が低濃度定量のための高感度を提供

39


抗体薬物複合体 Antibody-Drug Conjugates

ADCはモノクローナル抗体の特異性と癌細胞を殺す細胞毒薬物を組み合わすこと

により、健康細胞と病的細胞の識別を可能にする

ADCに複合する薬物の数にはバリエーションがある

ProteinWorks はADCの全mAb 濃度を測定

– 全mAbの測定はADCの薬物動態プロファイルに重要


ProteinWorks によるADC 分析: 全抗体量の定量

Bioconjugate Chemistry 2014, 25, 1223-1232

低分子ペイロード薬物+ Linker 956.3644 Da

(Linker) 219.0895 Da

Drug Maytansinoid

Data courtesy of Liuxi Chen Applications Note 720005619

ADC Trastuzumab Emtansine,T-DM1 (Kadcyla™)

Trastuzumab-based

Lysine-conjugated

40


アプリケーション

Application Notes

キットベースの標準化された迅速なアプローチでラット血漿中のインフリキシマブを高感度定量[720005535]

ProteinWorks eXpress Digest キットを用いた Bevacizumab (Avastin) のシンプルで標準化された高

感度定量 [720005534]

創薬研究サンプルの直接消化における、モノクローナル抗体医薬品定量の汎用キットベースアプローチ

[720005541]

キットベースの汎用アプローチによる、血漿中抗体医薬品トラスツズマブとその抗体薬物複合体トラスツズマブエム

タンシン (T-DM1) 定量

[720005619]

Technology Briefs

タンパク質バイオアナリシスにおけるトリプシンペプチドのクリーンアップに最適化されたユニバーサル SPE プロトコール

[720005544]

ジェネリック内標準とタンパク質バイオアナリシスワークフローチェック用スタンダードとしてのマウス由来インタクトモノク

ローナル抗体 [720005543]

ProteinWorks eXpress 消化キットによる相対標準偏差10%未満の再現性[720005570]

ProteinWorks eXpress 消化キットを使用した抗体定量 [720005575]

ペレット消化（タンパク質を沈殿後に消化）とProteinWorks eXpress Direct 消化キットを使用した

TrastuzumabのLC-MS定量 [720005574]



Protein Works 今後の予定

ライブWebinar 「LC/MSによるタンパク質バイオアナリシスソリューション～トリプシン消化からペプチド精製までのワークフローを標準化～」

日時】5月11日(水) 15:00-16:00

【場所】オンライン

【参加費】無料

◆ ライブWebinar 詳細・お申し込みはこちら

http://www.waters.com/waters/eventInstance.htm?eiid=134884318


http://wvmc.waters.com/proteinworks/?lang=ja


http://www.waters.com/waters/eventInstance.htm?eiid=134884318




41


トピックス



– HPLC

– MS




サマリー

Q&A


糖鎖は生体において重要な役割を担う

糖鎖の役割は… タンパク質のフォールディング細胞間連絡生物活性抗体活性(ADCC）血清半減期タンパク質半減期細胞接着

全てのタンパク質の約50％は糖鎖が結合した糖タンパク質

IgG-Fc / RIIIa Interaction

42


バイオ医薬品の糖鎖解析に関するICHの動向

ICH ガイドライン Q6B 一部抜粋

糖鎖特性解析は、バイオ医薬品の重要品質特性（CQA）特定に必要な評価・

試験の一つ


FDA がバイオ医薬品分析の具体的な改革を要望

Steven Kozlowski, M.D. Director, Office of Biotechnology Products Office of Pharmaceutical Science Center for Drug Evaluation and Research Food and Drug Administration

1. Post-translation Modifications As indicated previously, proteins contain added structural features, such as attached sugar chains, that may be critical for their clinical activity. These attached modifications can be complex and heterogeneous, and we currently lack standardized analytical methods to qualitatively and quantitatively assess the structure as it relates to the intact protein and understand the relationship of the modifications to potency and clinical performance. We are particularly interested in better methods for analyzing the sugars (glycosylation) and other modifications known to affect the medicinal activity of these products.

TESTIMONY BEFORE THE SUBCOMMITTEE ON TECHNOLOGY AND INNOVATION COMMITTEE ON SCIENCE AND TECHNOLOGY U.S. HOUSE OF REPRESENTATIVES SEPTEMBER 24, 2009

43


日本薬局方17改正


糖タンパク質キャラクタリゼーションワークフロー

糖タンパク質

糖ペプチド & ペプチド N- 結合型糖鎖

MALDI 蛍光/MS標識

MW Profile ESI MS

Peptide Mapping UPLC-UV UPLC-MS

HILIC UPLC-FL, UPLC-MS

44


今までの糖タンパク質糖鎖解析プロトコール例

糖タンパク質

可溶化＆糖鎖切り出し酵素またはヒドラジン分解で糖鎖切り出し

1

切り出した糖鎖の抽出・精製 2

糖鎖の蛍光標識 3

過剰な標識試薬の除去 4

蛍光標識糖鎖

MALDI MS

LC-FLR

LC-FLR-MS

数時間～オーバーナイト

数時間

数時間

5時間～ 2日


酵素による糖鎖切り出し

課題

– 糖鎖切り出しに時間がかかる

– 再現性が低い

– 収率が悪い

IgG Fc 領域のN結合型糖鎖

45


酵素による糖鎖切り出し


RapiGest SF は上記条件を満たす界面活性剤酸性条件下で分解し、分解物はLC、LC/MS、MALDI MS分析の妨害とならない

効率化

– 酵素の活性を維持した状態で糖タンパク質を可溶化

– 再現性良く完全な切り出しが行われるように変性


迅速糖鎖切り出し RapiGest SF Assisted

46


糖鎖標識

課題

– 標識に時間と手間がかかる

– 収率が悪い

– 再現性が低い



糖鎖標識 RapiFluor-MS 試薬による効率化

アミノ酸分析用の迅速蛍光標識にMS用イオン化部位を追加し糖鎖解析用標識に活用: •迅速 •高い蛍光強度 •高いMSイオン化効率

Patent Pending

RapiFluor-MS

AccQ·Fluor

Rapid Fluorescence

47


糖鎖標識 RapiFluor-MS 試薬による効率化

PNGase F

+

Protein N-Glycan

切り出した N-Glycan (グリコシルアミン)

Protein

Rapi Fluor標識


標識糖鎖の精製

課題

– 精製に時間と手間がかかる

– 収率が悪い


48


Labeled Glycan Labeled Deglycosylated Protein

Byproducts

Colle

ct

Labeled Glycan

Reaction Byproducts

標識糖鎖精製 HILIC SPEによる効率化

標識後の１回の精製で高純度サンプルを取得可能


標識糖鎖の精製 HILIC μElutionプレートによる効率化

SPE Recovery

~74%

Mixture of hIgG and bovine fetuin N-glycans

0.0E+0

1.9E+6

0 5 10 15

0.0E+0

2.3E+6

0 5 10 15

After SPE (1x SPE)

No SPE

Crude Reaction Mixture

FA2 FA2G2S1

A3S1G3S3

A3G3S3

FLR

49


標識糖鎖のMS検出

課題

– 蛍光とMS感度が両立できない

– 糖鎖構造によりシグナル強度が大きく異なる

– シアル酸が付加した糖鎖のシグナル強度が著しく低い


比較的最近開発された糖鎖標識試薬

Procainamide

Klapoetke, S.; Zhang, J.; Becht, S.; Gu, X.; Ding, X., J Pharm Biomed Anal 2010, 53 (3), 315-24.

Rapid Tagging for MS

Rapid Tagging for FLR

Rapid

FLR

MS Cook, K. S.; Bullock, K.; Sullivan, T., Biologicals 2012, 40 (2), 109-17.

Gong, B.; Hoyt, E.; Lynaugh, H.; Burnina, I.; Moore, R.; Thompson, A.; Li, H., Anal Bioanal Chem 2013, 405 (17), 5825-31.

50


標識糖鎖のMS検出効率化標識試薬による感度比較 1

0.0E+0

4.0E+6

3 4 5 6 7 8 9 10

0.0E+0

3.0E+4

3 4 5 6 7 8 9 10

0.0E+0

4.0E+6

3 4 5 6 7 8 9 10

0.0E+0

3.3E+6

3 4 5 6 7 8 9 10

100x zoom

0.0E+0

3.3E+6

3 4 5 6 7 8 9 10

FA2 (2.2 pmol)

FA2

FA2 (2.6 pmol)

FA2

105.8

7.4

126.9

0.8

0

50

100

150

RapiFluor-MS 2-AB

Reponse F

acto

rs(P

eak A

rea p

er

pm

ol Labele

d FA2 /

1000)

RapiFluor-MS Labeled

FLR

MS (BPI)

FLR

MS (BPI)

2-AB Labeled

RapiFluor-MS Labeled N-Glycans from Pooled Human IgG

FLR

MS (BPI)

Response F

acto

rs

(Peak A

rea p

er

pm

ol of

Labele

d F

A2 G

lycan /

1000)

2-AB Labeled N-Glycans from Pooled Human IgG

RapiFluor-MS

2-AB


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Fluorescence MS (BPI)

Instant AB Labeled

RapiFluor-MS Labeled

2-AB Labeled

Rela

tive P

erf

orm

ance (

%)

52.5

7.0

0.1 0.6

Procainamide Labeled

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

30.0*

7.0*

(*) Comparative result extrapolated from a published comparison of N-glycans, wherein it was found that procainamide provided comparable fluorescence and up to 50 fold greater ESI-MS sensitivity when compared to 2-AB(Klapoetke et al. 2010).

標識糖鎖のMS検出効率化標識試薬による感度比較 2

51


Conventional 2-AB Glycan from 10 µg of Protein 1.5 Day Sample Prep

RapiFluor-MS Glycan from 0.1 µg Protein <1 hr Sample Prep

糖鎖構造解析 UPLC/FLR/Xevo G2-XS

100x Sensitivity

10 20 min

Time (minutes)

5.50 10.00 15.00 20.00 25.00

1: TOFMSES+BPI

6.93e6

1: TOFMSES+BPI

6.93e6

Example courtesy of Y. Yu

Characterization

High Resolution LC-MS(/MS)


Time (minutes)

5.50 10.00 15.00 20.00 25.00

1: TOFMSES+BPI

6.93e6

1: TOFMSES+BPI

6.93e6


RapiFluor-MS Glycan from 0.1 µg Protein <1 hr Sample Prep 100x

Sensitivity


10 20 min

0.3 ugp/ul Refi ma

m/z800 1000 1200 1400 1600

%

0

100

RapiFluor-MS-NIST Refimab_yqy_11212014_01 443 (7.810) Sm (SG, 100x5.00); Cm (442:446)2.07e5

800 1600 m/z

1130.921, 2+

Characterization



FA2G2Ga1

52


FA2BG2S2

糖鎖構造解析 ESIイオン化の促進

5.3e2

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

RapiFluorMS_hIgG_14pmol_18Nov14_04 283 (5.065)3.47e6

2AB_hIgG_halfload_20Nov14_10 235 (4.234)2.89e4

2AB_hIgG_halfload_20Nov14_10 495 (8.689)529


m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100





m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100





m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100





500 2000 m/z

500 2000 m/z

500 2000 m/z

500 2000 m/z

2.9e4

1.2e5

3.5e6 2+

3+

2+ 2+

1+

FA2

2-AB RapiFluor-MS


標識糖鎖HPLC分離

課題

– 分離が悪い

– 分離に時間がかかる

– 分離カラムの耐久性が低い

– 再現性が悪い

HILICカラムによる効率化

– アミドHILIC結合相

– 1.7 µmパーティクル

– 耐久性の高いエチレン架橋型ハイブリッドパーティクル

– 2-AB標識ヒト型IgG糖鎖スタンダードでパーティクルバッチのQCテスト実施

53


ACQUITY UPLC BEH Glycan カラムケミストリー

官能基タイプ: トリファンクショナル結合型アミド

粒子径: 1.7 µm (HPLC用：2.5μm, 3.5μm)

エンドキャッピング: None

推奨使用pH範囲: 2 - 11

BEH Particle


30.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00

24.00 28.00 32.00 36.00 40.00 44.00 48.00 52.00 56.00 60.00 64.00

Alliance HPLC XBridge Glycan BEH Amide, 130Å, 2.5µm 3.0 X 225 mm total length (150 mm + 75 mm) Flow Rate: 0.56 mL/minute

H-Class BIO UPLC ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide, 130Å, 1.7µm 2.1 X 150 mm Flow Rate: 0.40 mL/minute

Total Run Time = 55 minutes

Total Run Time = 121.3 minutes

Flu

ore

scence (

rela

tive)

Time (minutes)

HPLCにおいても同等な感度と分離～サンプルロード容量3倍、分析時間2倍の場合

LC装置が異なるラボ間におけるメソッド移管

RapiFluor-MS 標識糖鎖 UPLC ⇔ HPLCメソッド移管

54

©2016 Nihon Waters K.K. 107 Patent Pending

GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan キットたった30分でサンプル調製が終了


FA2 Rep #1

1.6 pmol Rep #2

1.7 pmol

100% Theoretical Yield = 2.3 pmol

1.5x107 pg IgG1 pmol

150,000 pg

2 pmol glycan

1 pmol IgG0.45 pmol FA2

1 pmol total

glycan pool

10 μL injection

400 μL

sample

prepared

X X X X = 2.3 pmol

Step Yield Testing to confirm minimal bias

Deglycosylation Complete Intact mass analysis Gel shift assays Subunit LC-MS

Labeling >95% Released glycan profile vs subunit derived glycan information

SPE ~74% Recovery measurements

Glycan profile before vs after SPE

Entire Workflow (experimentally

determined) ~73% Yield

GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan キット高い収率

55


GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan キット糖鎖モニタリングから特性解析まで同じワークフロー

サンプル調製分離検出＆データー解析

GlycoWorks RapiFluor-MS キット

ACQUITY FLR/QDa and Empower 3

Software

FLR/Xevo G2-XS QTof MS and UNIFI Scientific Information System

ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide

カラム

糖鎖切り出し、標識と精製を 30分で完了

蛍光とMS検出共に比類の無い感度

FLR Quantification GU Retention

MS Confirmation

FLR Quantification GU Retention

Accurate Mass Confirmation MS/MS Fragmentation

FLR

TIC

MS/MS


GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycanキット蛍光もMSも高感度～確実な糖鎖モニタリング

56


QDa MS検出器が可能にする迅速製造プロセス開発

EU

0

20

40 蛍光

Inte

nsity

0

1x10 6

2x10 6

Minutes 1 2 3 4 5 6

QDa SIR Overlay

Trastuzumab N-Glycan Analysis RapiFluor-MS labeled glycans - 10 minute method In

tensity

0

50000

Inte

nsity

0

200000

Inte

nsity

0

1x10 6

2x10 6

Inte

nsity

0

50000

100000

Inte

nsity

0

1x10 6

Inte

nsity

0

200000

400000

Inte

nsity

0

20000

Minutes

1 2 3 4 5 6

A2G(4)1 896.4 m/z

F(6)A2 888.4 m/z

F(6)A2G(4)1 969.4 m/z

F(6)A2G(4)2 1050.5 m/z

A2 815.3 m/z

F(6)A2G(4)2S1 865.5 m/z

M5 774.1 m/z


QDa MS検出器による重要な糖鎖比のモニタリング – Keeping Tabs on Mannose 5

Time 1 Time 2 Time 3

Low Medium High

Mean 0.58 0.91 1.16

StDev 0.03 0.05 0.04

% RSD 5.44 5.47 3.85

Inte

nsity

0

60000

120000

180000

240000

Minutes 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

Inte

nsity

0.0

35000.0

70000.0

105000.0

140000.0

Minutes 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

F(6)A2G(4)1 SIR: 969.4 m/z

M5 SIR: 774.1 m/z

Man5: F(6)A2G(4)1 Ratio

57


GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycanキット＋QDa MS検出器が可能にするソリューション

GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan キットにより30分でサンプル調製

RapiFluor-MS 標識によりN型糖鎖がシンプルなQDa MS検出器でモニター可能

QDa により高い選択性、ハイスピード分析と

MSデータによる確実な糖鎖帰属が可能となり、信頼性と生産性が向上

MS確認と信頼性を伴った、迅速で強力なN型糖鎖モニタリングソリューション

RapiFluor-MS

+ ACQUITY QDa


GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycanキット＋Xevo G2-XS QTofが可能にするソリューション

58



RapiFluor-MS Glycan from 0.1 µg Protein <1 hr Sample Prep


100x Sensitivity

10 20 min

Time (minutes)

5.50 10.00 15.00 20.00 25.00

1: TOFMSES+BPI

6.93e6

1: TOFMSES+BPI

6.93e6


Characterization



Time (minutes)

5.50 10.00 15.00 20.00 25.00

1: TOFMSES+BPI

6.93e6

1: TOFMSES+BPI

6.93e6


RapiFluor-MS Glycan from 0.1 µg Protein <1 hr Sample Prep 100x

Sensitivity


10 20 min

0.3 ugp/ul Refi ma

m/z800 1000 1200 1400 1600

%

0

100

RapiFluor-MS-NIST Refimab_yqy_11212014_01 443 (7.810) Sm (SG, 100x5.00); Cm (442:446)2.07e5

800 1600 m/z

1130.921, 2+

Characterization



FA2G2Ga1

59


FA2BG2S2

GlycoWorks RapiFlour-MS キットシアル酸付加糖鎖のMS検出効率化

5.3e2

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100





m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100





m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100





m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100





500 2000 m/z

500 2000 m/z

500 2000 m/z

500 2000 m/z

2.9e4

1.2e5

3.5e6 2+

3+

2+ 2+

1+

FA2

2-AB RapiFluor-MS

シアル酸


糖タンパク質キャラクタリゼーションワークフロー

糖タンパク質

糖ペプチド & ペプチド N- 結合型糖鎖

MALDI 蛍光/MS標識

MW Profile ESI MS

Peptide Mapping UPLC-UV UPLC-MS

HILIC / UPLC-FL, UPLC-MS

60


Glycoprotein Characterization Multiple Strategies – Complementary Information

HILIC Hydrophilic Interaction Chromatography


Proof of Concept on Large Molecule HILIC RNase B

PDB: 1RBB

Glycan structure shown to scale with protein

High Mannose Man5 to Man9

Modified from Structure 1999, 7 (7), R155-60.

61


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

A214

Time (min)

Unbonded BEH 130Å

HILIC Stationary Phases


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

A214

Time (min)

Unbonded BEH 130Å

Amide Bonded BEH 130Å


Increased Retentivity (>10% H2O) Improved Resolution

BEH

Particle

62


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

A214

Time (min)

Unbonded BEH 130Å




BEH 300Å 1.7 μmBEH 130Å 1.7 μm

Improved Resolution for Large Analytes

Highly Branched Glycans

Intact mAbs

Patent pending


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

A214

Time (min)

Unbonded BEH 130Å




BEH 300Å 1.7 μmBEH 130Å 1.7 μm

Improved Resolution for Large Analytes

Highly Branched Glycans

Intact mAbs

Patent pending

130Å

300Å

63


Orthogonality and LC-MS

0

0.09

0.18

0.27

6 8 10 12 14 16 18 20

A214

Time (min)

RNase B

aglycosylated

+Man5

+Man6+Man7+Man8

+Man9

Reversed PhaseBEH C4300Å


0

0.02

0.04

0.06

6 8 10 12 14 16 18 20

A214

Time (min)

+Man5

+Man6

+Man7

+Man8

+Man9

RNase B

aglycosylated

HILICBEH Amide300Å


0

0.09

0.18

0.27

6 8 10 12 14 16 18 20

A214

Time (min)

RNase B

aglycosylated

+Man5

+Man6+Man7+Man8

+Man9


Patent pending

64


0

0.02

0.04

0.06

6 8 10 12 14 16 18 20

A214

Time (min)

+Man5

+Man6

+Man7

+Man8

+Man9

RNase B

aglycosylated

HILICBEH Amide300Å


0

0.09

0.18

0.27

6 8 10 12 14 16 18 20

A214

Time (min)

RNase B

aglycosylated

+Man5

+Man6+Man7+Man8

+Man9


Patent pending

13500 14000 14500 15000 15500 16000

m/z

Man9 Glycoform


Orthogonal Peptide Mapping Techniques Trastuzumab Lys-C Digest

0.0

0.5

1.0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90

A214

Time (min)

0.0

0.5

1.0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

A214

Time (min)

Peptide BEH C18 300Å 1.7 µm

Glycoprotein BEH Amide 300Å 1.7 µm

Non-glycosylated Peptides

Glycopeptides

Non-glycosylated Peptides

Peptide Reversed

Phase

HILIC

65


Assaying Deglycosylation and Glycan Occupancy on Intact mAbs

Intact

2 N-Glycans

1 N-Glycans

0 N-Glycans



Intact

2 N-Glycans

1 N-Glycans

0 N-Glycans

Patent pending

5.0 10.0 min

2 N-Glycans

1 N-Glycan 21.5%

0 N-Glycans 3.1%

Trastuzumab Partially Deglycosylated

Intr

insic

Flu

ore

scence D

ete

ction

66


Trastuzumab Native

5.0 10.0 min

2 N-Glycans

1 N-Glycan 1.0%

2 N-Glycans

1 N-Glycan 21.5%

0 N-Glycans 3.1%

Trastuzumab Partially Deglycosylated

Trastuzumab (2 N-Glycans)

Trastuzumab (1 N-Glycan)

FA2/FA2 148,057 Da

FA2/FA2G1 148221 Da

FA2 146,614 Da

FA2G1 146,773 Da

1,000 5,000 m/z

1,000 5,000 m/z

145 149 kDa

145 149 kDa


Intact

Intr

insic

Flu

ore

scence D

ete

ction

Patent pending

5.0 10.0 min


0E+0

1E+7

7 8 9 10 11 12 13 14 157 15 min 8 9 10 11 12 13 14

HILIC of Intact N-Deglycosylated EPO O-Linked Glycan Characterization

Intact O-Linked Glycan

N-Linked Glycans

Rapid Deglycosylation

O-Linked Glycan

Intr

insic

Flu

ore

scence D

ete

ction

Patent pending

67


0E+0

1E+7

7 8 9 10 11 12 13 14 15

Aglycosylated

18000 18500 19000 19500 20000

18000 18500 19000 19500 20000

PNGase F

18237.4 Da

+TFA

18893.8 Da

19185.3 Da

+TFA

+TFA

*Truncated C-terminus

7 15 min 20 kDa 18 8 9 10 11 12 13 14

HILIC of Intact N-Deglycosylated EPO O-Linked Glycan Characterization

Intact

O-Linked Glycan

O-Linked Glycan

Intr

insic

Flu

ore

scence D

ete

ction

Patent pending

* *

*


サマリー



– HPLC

– MS




68


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バイオ医薬品のLC/MSによる定量と特性解析に 必要な基礎知識と … · 6 ©2016 Nihon Waters K.K. 11 バンド拡散: 1) インジェクターからカラム手前まで

バイオ医薬品のLC/MSによる定量と特性解析に必要な基礎知識と … · 6 ©2016 Nihon Waters K.K. 11 バンド拡散: 1) インジェクターからカラム手前まで