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FOLHA DE APROVAÇÃO
Dissertação defendida por Renata Heidtmann Bemvenuti e aprovada em 11 de
março de 2011, pela Comissão Examinadora constituída pelos professores:
_________________________________________________________________
Profª. Dra. Eliana Badiale Furlong - FURG
_________________________________________________________________
Profª. Dra. Giniani Carla Dors – IFC – Campus Concórdia
_________________________________________________________________
Profª. Dra. Susana Juliano Kalil – FURG
_________________________________________________________________
Profª. Dra. Jaqueline Garda Buffon - FURG
ii
À minha mãe Joice
Aos meus avós maternos Iracema (in memorium) e Jorge
Ao Leandro, muito mais que meu marido, meu companheiro e meu amigo.....
iii
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Eliana Badiale Furlong
Pela incansável orientação, dedicação, incentivo, paciência, pelos ensinamentos de
vida...e por saber que posso contar com ela sempre que for preciso....
À FURG e a CAPES
Por proporcionarem o desenvolvimento de meus estudos.
À Michele
Pela ajuda imensurável no desenvolvimento desse trabalho, e principalmente pela
amizade que pude contar em todos os momentos...obrigada pela incondicional
ajuda...tu és uma pessoa muito especial!
À Helen, Ana e Tânia
Pelos momentos divertidos que fazem as coisas se tornarem mais fáceis e pela
indispensável ajuda nas análises do HPLC...
À Jessica, Náthali e Fran
Por me ajudarem nas análises deste trabalho....
À Vivian, Le, Adri, Cristiano, Jaque e Jesus
Pelas conversas agradáveis e por saber que posso contar sempre com vocês...
À Gini
Que mesmo de longe, tanto me ajudou via email para que eu pudesse me preparar
para a seleção do Doutorado...
À Islanda e Aline
Por estarem sempre dispostas para o que fosse preciso...
Aos professores do Programa de Pós-Graduação
Pelos ensinamentos desde a graduação, em especial as professoras Susana Kalil e
Janaina Burkert pelas dicas na qualificação.
Ao IRGA e à IRGOVEL
Pelo fornecimento de amostras.
Ao Professor Emerson Dal Ponte (UFRGS)
Por ceder esporos de Fusarium graminearum.
iv
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .................................................................................................. VIII
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... X
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................ XI
RESUMO .................................................................................................................... XII
ABSTRACT ............................................................................................................... XIII
CAPÍTULO I
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 2
2 OBJETIVOS............................................................................................................... 4
2.1 Objetivo Geral ......................................................................................................... 4
2.2 Objetivos Específicos .............................................................................................. 4
CAPÍTULO II
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 6
3.1 Arroz ....................................................................................................................... 6
3.1.1 Características morfológicas do grão de arroz ..................................................... 6
3.1.2 Composição química do grão de arroz ................................................................. 8
3.1.2.1 Carboidratos ..................................................................................................... 9
3.1.2.2 Proteínas ........................................................................................................ 11
3.1.2.3 Lipídios ........................................................................................................... 11
3.1.2.4 Minerais .......................................................................................................... 12
3.1.2.5 Vitaminas ........................................................................................................ 12
3.1.2.6 Compostos fenólicos ....................................................................................... 13
3.1.3 Produção e consumo de arroz ........................................................................... 13
3.1.4 Doenças na cultura de arroz .............................................................................. 16
3.2 Agrotóxicos ........................................................................................................... 18
3.2.1 Controle de pragas na cultura de arroz .............................................................. 19
3.2.2 Riscos à saúde pela ingestão de resíduos de agrotóxicos na dieta.................... 20
3.2.3 Mecanismo dos fungicidas dos grupos triazol e estrobilurina ............................. 22
3.3 Micotoxinas ........................................................................................................... 23
3.3.1 Micotoxinas produzidas por fungos do gênero Fusarium ................................... 26
3.3.1.1 Zearalenona .................................................................................................... 27
3.3.1.2 Tricotecenos ................................................................................................... 27
3.3.2 Legislação para micotoxinas .............................................................................. 29
3.3.3 Métodos de determinação de micotoxinas ......................................................... 30
v
CAPÍTULO III
4 DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO ................................................................... 34
ARTIGO 1
VALIDAÇÃO DE MÉTODO QuEChERS MODIFICADO PARA DETERMINAÇÃO DE
FUSARIOTOXINAS EM ARROZ................................................................................. 36
RESUMO .................................................................................................................... 36
ABSTRACT ................................................................................................................ 37
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 38
2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 39
2.1 Padrões e reagentes ............................................................................................. 39
2.2 Amostras .............................................................................................................. 40
2.3 Extração das micotoxinas ..................................................................................... 41
2.4 Desenvolvimento do método cromatográfico ........................................................ 41
2.5 Validação do método analítico .............................................................................. 42
2.5.1 Limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) .......................................... 42
2.5.2 Curva analítica e linearidade .............................................................................. 42
2.5.3 Precisão ............................................................................................................. 43
2.5.4 Exatidão (recuperação) ...................................................................................... 44
2.5.5 Seletividade ....................................................................................................... 44
2.6 Aplicação do método cromatográfico .................................................................... 44
2.7 Confirmação da recuperação de DON e ZEA ....................................................... 44
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................. 45
3.1 Desenvolvimento do método analítico ................................................................... 45
3.2 Validação do método analítico .............................................................................. 46
3.3 Aplicação do método analítico .............................................................................. 49
4 CONCLUSÃO .......................................................................................................... 49
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 50
ARTIGO 2
CONTAMINAÇÃO FÚNGICA E OCORRÊNCIA DE MICOTOXINAS NAS FRAÇÕES
DO BENEFICIAMENTO DO ARROZ .......................................................................... 57
RESUMO .................................................................................................................... 57
ABSTRACT ................................................................................................................ 58
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 59
2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 60
2.1 Amostras .............................................................................................................. 60
vi
2.2 Micota presente no grão recém colhido ................................................................ 61
2.3 Indicativos de mérito e determinação de glicosamina ........................................... 62
2.4 Extração e quantificação das micotoxinas ............................................................ 62
2.5 Análise estatística ................................................................................................. 63
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 63
4 CONCLUSÃO .......................................................................................................... 69
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 69
ARTIGO 3
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BIOQUÍMICA DE ARROZ FERMENTADO
COM Fusarium graminearum EM PRESENÇA E AUSÊNCIA DE FUNGICIDAS ........ 76
RESUMO .................................................................................................................... 76
ABSTRACT ................................................................................................................ 77
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 78
2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 79
2.1 Amostras .............................................................................................................. 79
2.2 Fermentação em estado sólido ............................................................................. 80
2.2.1 Preparo do inóculo ............................................................................................. 80
2.2.2 Processo fermentativo ....................................................................................... 80
2.3 Caracterização físico-química dos fermentados .................................................... 80
2.3.1 Composição proximal, pH e acidez .................................................................... 80
2.3.2 Determinação de fenóis totais ............................................................................ 80
2.4 Caracterização bioquímica .................................................................................... 81
2.4.1 Atividade enzimática da amilase ........................................................................ 81
2.4.1.1 -amilase ........................................................................................................ 81
2.4.1.2 -amilase ........................................................................................................ 81
2.4.2 Atividade enzimática da protease ...................................................................... 82
2.4.3 Atividade enzimática da lipase ........................................................................... 82
2.5 Análise estatística dos dados ................................................................................ 83
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 83
3.1 Caracterização do substrato ................................................................................. 83
3.2 Caracterização físico-química e bioquímica dos fermentados com e sem emprego
de fungicidas .............................................................................................................. 83
4 CONCLUSÃO .......................................................................................................... 89
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 90
vii
ARTIGO 4
EFEITO DO USO DE FUNGICIDAS NO DESENVOLVIMENTO FÚNGICO E NA
MANIFESTAÇÃO DE POTENCIAL TOXIGÊNICO NO ARROZ: UM ESTUDO in vitro 95
RESUMO .................................................................................................................... 95
ABSTRACT ................................................................................................................ 96
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 97
2 MATERIAL E METODOS ......................................................................................... 98
2.1 Amostras .............................................................................................................. 98
2.2 Meio de cultivo para produção de esporos de Fusarium graminearum ................. 98
2.3 Fermentação em estado sólido ............................................................................. 98
2.3.1 Preparo do inóculo ............................................................................................. 98
2.3.2 Processo fermentativo ....................................................................................... 99
2.4 Determinação de glicosamina ............................................................................... 99
2.5 Extração e quantificação das micotoxinas .......................................................... 100
2.6 Análise estatística ............................................................................................... 100
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 100
4 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 105
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 105
CAPÍTULO IV
5 CONCLUSÕES GERAIS ....................................................................................... 111
CAPÍTULO V
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 113
ANEXO A – PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO CLA E SNA PARA PRODUÇÃO
DE ESPOROS DE FUSARIUM GRAMINEARUM. .................................................... 139
viii
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO II
Tabela 1. Composição proximal média de arroz integral, branco polido e parboilizado
polido. ........................................................................................................................... 8
Tabela 2. Fungicidas utilizados em lavouras de arroz. ................................................ 20
Tabela 3. Classes toxicológicas dos agrotóxicos com base na DL50. ......................... 21
Tabela 4. Exemplos de micotoxinas e seus principais fungos produtores, commodities
afetados e efeitos biológicos no homem e animais. .................................................... 25
CAPÍTULO III - Artigo 1
Tabela 1. Descrição das micotoxinas DON e ZEA. ..................................................... 40
Tabela 2. Condições cromatográficas para as micotoxinas DON e ZEA. .................... 45
Tabela 3. Limites de detecção e quantificação instrumental (μg.L-1) e do método de
QuEChERS modificado (μg.kg-1). ............................................................................... 46
Tabela 4. Resultados obtidos para calibração externa das micotoxinas DON e ZEA no
sistema HPLC-UV-FL. ................................................................................................ 47
Tabela 5. Repetibilidade (RSDr) e precisão intermediária (RSDpi) do método
QuEChERS. ............................................................................................................... 47
Tabela 6. Teste de diferença de médias das micotoxinas DON e ZEA (Tukey) no grão
de arroz (endosperma amiláceo). ............................................................................... 49
CAPÍTULO III - Artigo 2
Tabela 1. Teores de glicosamina, umidade e micotoxinas nas diferentes porções do
grão de arroz. ............................................................................................................. 64
Tabela 2. Incidência de fungos nas amostras de arroz provenientes de cultivo com e
sem emprego de fungicidas. ....................................................................................... 68
CAPÍTULO III - Artigo 3
Tabela 1. Composição centesimal do arroz fermentado com Fusarium graminearum na
presença e ausência de fungicidas. ............................................................................ 86
Tabela 2. pH acidez e conteúdo fenólico total do arroz fermentado com Fusarium
graminearum na presença e ausência de fungicidas. ................................................. 87
Tabela 3. Atividades enzimáticas do arroz fermentado com Fusarium graminearum na
presença e ausência de fungicidas. ............................................................................ 88
ix
CAPÍTULO III - Artigo 4
Tabela 1. Glicosamina (mg.g-1) no arroz com e sem fungicidas. ............................... 102
Tabela 2. Micotoxinas no arroz com e sem fungicidas. ............................................. 103
x
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO II
Figura 1. Estrutura do grão de arroz (NEPOMUCENO, 2010). ..................................... 6
Figura 2. Produção do arroz em casca no RS comparativamente a produção no Brasil
(IBGE, 2010). .............................................................................................................. 14
Figura 3. Participação (%) dos principais estados produtores de arroz do Brasil em
2008 (IBGE, 2008). ..................................................................................................... 15
Figura 4. Estrutura química da zearalenona (SHIER, 1998). ...................................... 27
Figura 5. Estrutura química dos tricotecenos. ............................................................ 28
CAPÍTULO III - Artigo 1
Figura 1. Cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado aos detectores de
ultravioleta e fluorescência.......................................................................................... 41
CAPÍTULO III - Artigo 4
Figura 1. Halos de fungos nos meios de cultura estudados. .................................... 101
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
DON – deoxinivalenol
ZEA - zearalenona
IRGA – Instituto Rio Grandense do arroz
IRGOVEL – Indústria Riograndense de óleo de arroz
FURG – Universidade Federal do Rio Grande
LCA – Laboratório de Ciência de Alimentos
QuEChERS – rápido, fácil, econômico, robusto e seguro, do inglês, Quick, Easy,
Cheap, Rugged and Safe
LOD – limite de detecção
LOQ – limite de quantificação
LC-MS/MS – cromatografo líquido de alta eficiência acoplado ao detector de massas.
RSDr - reprodutibilidade
RSDpi – precisão intermediária
RSDpi - desvio padrão relativo para precisão intermediária
RSDr - desvio padrão relativo para repetitividade
LMR – limite máximo de resíduo
N – nitrogênio
P – fósforo
K – potássio
KNO3 – nitrato de potássio
MgSO4.7H2O – sulfato de magnésio hidratado
KCl – coreto de potássio
KH2PO4 – posfato de potássio di-básico
pH – potencial hidrogeniônico
HPLC-UV-FL – cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado aos detectores de
ultravioleta e fluorescência
GC – cromatógrafia a gás
HPTLC – cromatografia em camada delgada de alta eficiência.
LODm – limite de detecção do método.
LODi – limite de detecção do instrumento.
LOQm – limite de quantificação do método.
LOQi – limite de quantificação do instrumento.
NH2CONH2 – uréia.
HCl – ácido clorídrico.
xii
RESUMO
Durante seu ciclo no campo, o arroz se torna susceptível ao desenvolvimento de fungos, que sob determinadas condições, podem produzir micotoxinas além de reduzir o rendimento da cultura, requerendo a utilização de fungicidas na lavoura ou durante o armazenamento. O objetivo desse trabalho foi verificar o efeito in vivo e in vitro da utilização dos fungicidas na multiplicação e na manifestação do potencial toxigênico de Fusarium graminearum em arroz. Foi padronizada metodologia para avaliar a ocorrência de deoxinivalenol e zearalenona em arroz utilizando extração por QuEChERS modificado e quantificação em HPLC-UV-FL. O efeito in vivo da utilização dos fungicidas azoxistrobina, trifloxistrobina, propiconazole e ciproconazole foi verificado no endosperma, farelo e casca do arroz natural e parboilizado tratado e não tratado com fungicidas em campos experimentais. Nesse experimento foi avaliado o desenvolvimento fúngico e a incidência dos principais gêneros no arroz pós-colheita e realizada a determinação das micotoxinas DON e ZEA. O efeito in vitro da utilização de fungicidas azoxistrobina e trifloxistrobina foi verificado através de uma fermentação em estado sólido utilizando arroz com casca moído como substrato em presença de Fusarium graminearum durante 30 dias, amostrando a cada 3 dias. Foram determinadas as características físico-químicas (umidade, cinzas, proteínas, lipídios, fenóis, pH e acidez) e bioquímicas (atividade de α-amilase, β-amilase, protease e lipase), bem como o desenvolvimento fúngico e a presença das micotoxinas DON e ZEA. O desenvolvimento fúngico foi indicado pela determinação de glicosamina e a extração de DON e ZEA do arroz utilizando o método de QuEChERS modificado que foi adequado para a quantificação utilizando HPLC-UV-FL. No estudo in vivo, a contaminação fungica e a produção de ZEA ocorreram em todas as amostras e DON em 92%. Os fungicidas foram eficientes para o controle de Fusarium em arroz, porém, os teores de micotoxinas detectados sugerem que apesar da redução da incidência deste fungo, de 14,5 para 7,7%, os fungicidas podem ter favorecido a produção das micotoxinas. O processo de parboilização favoreceu a contaminação com ZEA no endosperma. No estudo in vitro, os fungicidas demonstraram capacidade de reduzir a velocidade de multiplicação de fungos, porém não impossibilitaram o desenvolvimento de fungos ao longo dos 30 dias, além de induzir a produção de ZEA, sendo que os níveis de DON foram menores em sua presença. O uso de fungicidas durante a fermentação proporcionou uma redução da umidade, um aumento das cinzas e proteínas e afetaram pouco os teores de lipídios. O pH aumentou em presença de azoxistrobina enquanto a acidez foi maior quando o meio não continha fungicidas. Os fungicidas reduziram a atividade de α-amilase, protease e lipase. Os elevados níveis de micotoxinas encontrados no arroz atentam para a importância de se conhecer os fatores que estimulam a sua produção com intuito de atuar em seu controle. Palavras chave: trifloxistrobina, azoxistrobina, propiconazole, ciproconazole, deoxinivalenol, zearalenona.
xiii
ABSTRACT
EFFECT OF THE FUNGICIDES ON DEVELOPMENT AND MANIFESTATION OF THE
TOXIGENIC POTENCIAL OF Fusarium graminearum IN RICE.
During its cycle in the field, the rice becomes susceptible to mold growth, which under certain conditions, can produce mycotoxins and reduce crop yield, requiring the use of fungicides in crops or during storage. The aim of this study was to assess the effect in vivo and in vitro use of fungicides on multiplication and the manifestation of toxigenic potential of Fusarium graminearum in rice. Was standardized methodology to evaluate the occurrence of deoxynivalenol and zearalenone in rice using extraction by modified QuEChERS and quantification in HPLC-UV-FL. The in vivo effect of the use of fungicides azoxystrobin, trifloxystrobin, propiconazole and cyproconazole was found in the endosperm, bran and husk of brown and parboiled rice treated and untreated with fungicides in field trials. In this experiment we evaluated the fungal development and incidence of the major genres in rice post-harvest and made the determination of the mycotoxins DON and ZEA. In vitro effects of the use of fungicides azoxystrobin and trifloxystrobin was verified through a solid state fermentation using rice husk as substrate ground in the presence of Fusarium graminearum during 30 days, sampling every 3 days. We determined the physico-chemical caracteristic (moisture, ash, proteins, lipids, phenols, pH and acidity) and biochemical (activity of α-amylase, β-amylase, protease and lipase) and the fungal development and presence of mycotoxins DON and ZEA. The fungal development was indicated by the determination of glucosamine and extraction of DON and ZEA in rice using the modified method QuEChERS that was suitable for quantification using HPLC-UV-FL. In vivo study, the fungal contamination and ZEA production occurred in all samples and DON in 92%. The fungicides were effective for control of Fusarium in rice, however, the mycotoxins levels detected suggest that despite the reduction in the incidence of this fungus, from 14.5 to 7.7%, fungicides may have favored the production of mycotoxins. The parboiling process favored contamination with ZEA in the endosperm. In vitro study, fungicides demonstrated ability to slow the proliferation of fungi, but not prevented the development of fungi during 30 days, and induced the production of ZEA, and the levels of DON were lower in its presence. The use of fungicides during fermentation provided a reduction of moisture, an increase in ash and protein and little affected lipid content. The pH increased in the presence of azoxystrobin while the acidity was greater when the medium contained no fungicide. The fungicide reduced the activity of α-amylase, protease and lipase. The high levels of mycotoxins found in rice pay attention to the importance of knowing the factors that stimulate its production in order to act within their control. Keywords: trifloxystrobin, azoxystrobin, propiconazole, cyproconazole, deoxynivalenol, zearalenone.
CAPÍTULO I
2
1 INTRODUÇÃO
O arroz é um dos grãos mais importantes em termos de valor econômico,
sendo a espécie que apresenta maior potencial para combater a fome no mundo. O
Brasil se destaca como o maior produtor de arroz fora do continente Asiático, sendo a
região Sul responsável por cerca de 60% da produção no país (EMBRAPA, 2010).
Devido à composição rica em carboidratos, atividade de água variável ao longo
da maturação do grão e forma de cultivo, o arroz possui grande susceptibilidade ao
ataque fúngico, tanto antes quanto após a colheita, sendo que destes algumas
espécies toxigênicas podem produzir micotoxinas (VIEIRA et al., 2007). Espécies do
gênero Fusarium são amplamente distribuídas na natureza e comumente contaminam
cereais e outras plantas no campo, sendo que este gênero fúngico possui espécies
responsáveis pela produção de micotoxinas como zearalenona e deoxinivalenol
(MARTINS, 2002; SOHN et al., 1999).
Em áreas cultivadas são adotadas medidas preventivas e/ou corretivas contra
diferentes pragas, sendo no caso de fungos pela utilização de fungicidas, porém a
resposta à aplicação desses produtos é diferente para cada cultivar e é influenciada
pelas condições metereológicas durante o desenvolvimento da cultura, pela reação de
resistência da cultivar, pela distribuição do princípio ativo nos tecidos vegetais e pela
própria susceptibilidade da espécie fúngica contaminante (DALLAGNOL et al., 2006).
Os fungicidas são compostos químicos tóxicos aos seres humanos e animais
de criação por serem cancerígenos, mutagênicos, teratogênicos e mimetizadores de
hormônios, além de possuírem uma grande capacidade de persistência no meio
ambiente (ALISTER, 2006). No caso do arroz, teoricamente, esses agrotóxicos se
concentrariam somente na casca, sendo eliminados no beneficiamento, ficando os
maiores níveis de resíduos na casca e farelo (DORS, 2010). Porém, estudos têm
mostrado que a aplicação de fungicidas na cultura está relacionada com a
manifestação do potencial toxigênico da micota, aumentando em alguns casos, os
níveis de micotoxinas de Fusarium como DON (HÝSEK et al., 2005) e ZEA (DORS,
2010). Portanto o monitoramento do efeito do uso de fungicida e produção de
micotoxinas na cultura de arroz é importante para a tomada de providências
especialmente diante do grande consumo mundial desse cereal que, se contaminado,
pode resultar em danos agudos ou crônicos à população humana ou de animais de
criação.
Levando-se em consideração o sistema de cultivo irrigado do arroz, uma
prática comumente utilizada no Rio Grande do Sul, o F. graminearum poderá continuar
a infectar a cultura, devendo os produtores atentar para a utilização de técnicas de
3
cultivo seguida por condições específicas de armazenamento e beneficiamento que
constituam um conjunto harmônico, proporcionando a agregação dos interesses do
produtor e do consumidor, através da produção de um arroz com elevado rendimento
em grãos e sem presença de compostos tóxicos ou que estejam dentro de limites
aceitáveis por legislações de países que regulam micotoxinas.
4
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar in vitro e in vivo o efeito do uso de fungicidas na multiplicação e na
manifestação do potencial toxigênico de Fusarium graminearum em arroz.
2.2 Objetivos Específicos
- Padronizar metodologia analítica para avaliar a ocorrência de DON e ZEA em
arroz, utilizando extração pelo método de QuEChERS modificado e quantificação em
HPLC-UV-FL.
- Avaliar o efeito do emprego dos fungicidas azoxistrobina, trifloxistrobina,
ciproconazole e propiconazole no cultivo do arroz irrigado na contaminação fúngica e
micotoxicológica do arroz e suas porções.
- Avaliar o efeito do emprego dos fungicidas azoxistrobina e trifloxistrobina no
desenvolvimento de Fusarium graminearum e na produção de toxinas durante
fermentação sólida tendo arroz como substrato.
- Avaliar o efeito do emprego dos fungicidas azoxistrobina e trifloxistrobina nas
características físico-químicas e bioquímicas da biomassa de arroz fermentado com
Fusarium graminearum.
5
CAPÍTULO II
6
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Arroz
3.1.1 Características morfológicas do grão de arroz
O arroz (Oryza sativa, L.) é constituído por diversos tecidos que apresentam
estruturas morfológicas, composição química e funções biológicas diferenciadas
(BADIALE-FURLONG & SOARES, 1995). In natura, o grão deste cereal é formado por
uma camada externa protetora (casca) composta por pálea e lema, e pela cariopse
composta por pericarpo, tegumento, camada de aleurona, endosperma e gérmen
(JULIANO, 1993; COFFMAN & JULIANO, 1987).
Botanicamente o arroz é uma planta da família das gramíneas classificada no
grupo de plantas C-3, adaptada ao ambiente aquático e é constituído por sete
espécies: Oryza barthii, Oryza glaberrima, Oryza latifolia, Oryza longistaminata, Oryza
punctata, Oryza rufipogon e Oryza sativa (CEPEA, 2003).
Segundo a FAO, (2006) já foram identificadas 140.000 variedades de arroz,
sendo que as principais diferenças observadas entre elas são origem genética,
dimensões e composição do amido quanto ao teor de amilose. Nos países asiáticos,
mais de dois bilhões de habitantes têm o arroz e seus derivados como fontes de 60 a
70% das calorias ingeridas diariamente.
O arroz é uma excelente fonte de energia, devido à alta concentração de
amido, fornecendo também proteínas, vitaminas e minerais e possui baixo teor de
lipídios (KENNEDY et al., 2002), sendo considerado a espécie que apresenta maior
potencial para o combate a fome no mundo (EMBRAPA, 2005). A Figura 1 ilustra a
estrutura do grão de arroz mostrando as porções que representam a casca e a
cariopse (farelo e grão).
Figura 1. Estrutura do grão de arroz (NEPOMUCENO, 2010).
7
A casca do arroz geralmente é usada como combustível em fornalhas e para
proteção do solo. O farelo é utilizado para obtenção do óleo de arroz e o farelo
desengordurado na ração animal. O grão é a parte consumida como alimento (IRGA,
2005), sendo que apenas uma pequena quantidade de arroz é consumida como
ingrediente em produtos processados, tendo em vista que seu maior consumo se dá
na forma de grão beneficiado (KENNEDY et al., 2002).
A casca constitui de 15 a 30% do peso do grão, dependendo da variedade,
práticas culturais, localização geográfica, estação do ano e temperatura. Minerais
(sílica) e celulose são os maiores componentes da casca (SALUNKHE et al., 1999;
FELIPE et al., 1997; GUTOSKI & ELIAS, 1994).
Através do descascamento separa-se a casca da cariopse, obtendo-se o arroz
integral. Este pode ser polido para remoção do farelo (pericarpo, tegumento, camada
de aleurona e gérmen) que representa 8,5 a 14,8% do arroz integral (KUNRATH et al.,
2010; JULIANO & BECHTEL, 1985), obtendo-se o arroz branco polido. Os grãos
também podem ser submetidos à parboilização, processo hidrotérmico através do qual
se obtém o arroz parboilizado, o qual pode ser consumido na forma integral ou polido
(ALVES et al., 2010).
O farelo contém a maior parte da reserva lipídica do arroz, entre 15 e 20%.
Além disso, possui de 5 a 8% de proteínas, 40 a 50% de carboidratos solúveis e de 5
a 8% de fibras (MORETTO & FETT, 1998).
O pericarpo (1 a 2% da massa do grão integral) é composto por epicarpo
(formado por camadas de textura esponjosa, de células parenquimatosas parcialmente
destruídas), mesocarpo, camada média, testa e exosperma (MATSUO, 1995). A testa
e a exosperma se unem, devido ao colapso celular que ocorre no processo de
enchimento do grão durante o amadurecimento (STORCK, 2004). Segundo Salunkhe
et al., (1999) o pericarpo é rico em proteínas, lipídios, vitaminas e sais minerais.
O embrião representa 2 a 3% do peso do grão integral e está ligado ao
endosperma. As células do embrião contêm amido, proteína e gordura armazenados,
os quais são usados na germinação como fonte de energia e síntese de enzimas
(MARSHALL & WADSWORTH, 1993).
O endosperma (89 a 91% da massa do grão integral) é formado pela aleurona,
sub-aleurona (células do endosperma que se concentram na parte mais externa, em
contato com a camada de aleurona) e o próprio endosperma amiláceo. A camada de
aleurona é formada pela parte externa do endosperma, sendo que o número de
camadas presentes varia dependendo da origem do grão, variedade e fatores
ambientais. As células do endosperma são uma excelente fonte de carboidratos
complexos, representados principalmente pelo amido, que se encontra presente na
8
forma de amilose e amilopectina. O conteúdo de amilose varia de 12 a 35% no arroz
normal, enquanto que variedades cerosas contêm um baixo teor de amilose
(SALUNKHE et al., 1999). As células de aleurona são menores que as demais que
formam o grão, possuem forma cúbica e têm uma parede celular grossa,
armazenando principalmente proteína e lipídios no seu interior. As células do
endosperma (sub-aleurona) têm forma similar às células da aleurona e o material que
armazenam contém principalmente corpos protéicos, com mínima quantidade de
amido (MATSUO, 1995).
3.1.2 Composição química do grão de arroz
O arroz é constituído principalmente por amido, seguido por proteína e
pequenas quantidades de lipídios, minerais e vitaminas (Tabela 1). Entretanto, a
composição de cada uma dessas frações é bastante sensível a vários fatores, tais
como diferenças varietais, variações ambientais, de manejo, de processamento e de
armazenamento (ZHOU et al., 2002), produzindo grãos com características
nutricionais diferenciadas. Além disso, os nutrientes não estão uniformemente
distribuídos nas diferentes frações do grão. As camadas externas apresentam maiores
concentrações de proteínas, lipídios, fibra, minerais e vitaminas, enquanto o centro é
rico em amido. Dessa forma, o polimento resulta em redução no teor de nutrientes,
exceto de amido, originando as diferenças na composição entre o arroz integral e o
polido (STORCK, 2004). A Tabela 1 apresenta a composição proximal do arroz
integral, branco polido e parboilizado polido.
Tabela 1. Composição proximal média (% matéria seca) de arroz integral, branco
polido e parboilizado polido.
Constituinte Arroz integral Arroz branco polido Arroz parboilizado
polido
Amido total 74,1 87,6 85,1
Proteínas 10,5 8,9 9,4
Lipídios 2,5 0,4 0,7
Cinzas 1,2 0,3 0,7
Fibra total 11,7 2,9 4,1
Fibra insolúvel 8,9 1,1 1,6
Fibra solúvel 2,8 1,8 2,5
Fonte: STORCK, 2004.
9
3.1.2.1 Carboidratos
Os carboidratos são os principais constituintes do arroz. Além do amido, que
corresponde a aproximadamente 90% da matéria seca do arroz polido, também estão
presentes açúcares livres e fibra. Enquanto o endosperma é composto principalmente
por amido, o farelo e o gérmen apresentam principalmente fibra, contendo pequenas
quantidades de outros carboidratos (JULIANO, 1993).
O arroz branco contém maior quantidade de carboidratos disponíveis à
digestão do que o integral, o qual contém expressiva quantidade de fibra alimentar
(JULIANO, 1993).
Os carboidratos potencialmente digeríveis do arroz fornecem em média 60% do
valor calórico total ingerido diariamente, sendo indispensáveis para manter a
integridade funcional do tecido nervoso e cerebral (MAHAN, 1998).
Amido
Os cereais são fonte rica de amido, uma vez que armazenam este nutriente
para suprir as necessidades energéticas durante a germinação. Em conseqüência
disso, estes grãos também são usados na alimentação humana como fonte de energia
(ROSIN et al., 2002).
A concentração de amido no arroz pode variar devido a fatores genéticos e
ambientais (FREI et al., 2003). O processamento também influencia o percentual de
amido, sendo este maior no arroz branco polido (87,6%) e no parboilizado polido
(85,1%) comparado ao integral (74,1%) (Tabela 1), devido à remoção do farelo. Além
das variações na concentração, são observadas diferenças na taxa e extensão da
digestão do amido, que podem ser influenciadas pela variação na proporção
amilose:amilopectina, processamento do grão, propriedades físico-químicas, tamanho
de partícula e presença de complexos lipídio-amilose (GODDARD et al., 1984).
O amido é um homopolissacarídeo composto por cadeias de amilose e
amilopectina. A primeira é formada por uma cadeia linear de glicose unida por ligações
glicosídicas do tipo α-1,4. A segunda é um polímero ramificado, constituído de
ligações glicosídicas do tipo α-1,4, com cadeias de glicose ligadas em α-1,6. As
proporções em que estas cadeias aparecem diferem entre genótipos e classificam os
grãos como ceroso (1 a 2% de amilose), conteúdo de amilose muito baixo (2 a 12%),
baixo (12 a 20%), intermediário (20 a 25%) e alto (25 a 33%) (JULIANO, 1993).
O conteúdo de amilose é considerado um dos principais parâmetros para a
qualidade tecnológica e de consumo do arroz. De forma geral, grãos com maior teor
de amilose apresentam textura mais firme após o cozimento, sendo preferidos em
10
diversos países, como o Brasil, e por isso essa característica é avaliada durante o
desenvolvimento de cultivares. Entretanto, outros fatores, como a estrutura das
cadeias de amilopectina e o teor de proteína também influenciam essa característica
(ONG & BLANSHARD, 1995).
Uma das principais características relacionadas à resposta metabólica ao arroz
consumido é a relação amilose-amilopectina. O maior teor de amilose no arroz, assim
como em outros alimentos amiláceos, resulta em menor resposta glicêmica e
insulinêmica (MILLER et al., 1992; GODDARD et al., 1984). Essas diferenças
fisiológicas são interessantes na prevenção e no tratamento de doenças, como o
diabetes, pois a menor digestão e absorção de carboidratos auxilia na manutenção de
níveis regulares de glicose no sangue (VELANGI et al., 2005). O consumo de
alimentos com menor resposta glicêmica também tem sido associado à redução dos
lipídios séricos em pacientes hiperlipidêmicos, diminuindo os riscos de
desenvolvimento de doenças cardiovasculares (JENKINS et al., 2002).
O amido é classificado como rapidamente digerível (ARD), lentamente digerível
(ALD) e amido resistente (AR). O amido resistente é a soma do amido e produtos da
sua degradação, não absorvidos no intestino delgado de humanos saudáveis (CHAMP
& FAISANT, 1996).
Açucares livres
O arroz apresenta pequena quantidade de açúcares livres, localizados
principalmente nas camadas externas do grão, sendo sua concentração afetada pela
variedade, grau de polimento e processamento. Os principais açúcares são sacarose
(aproximadamente 90%), glicose e frutose (MATSUO, 1995).
Fibra alimentar
Os polissacarídeos não digeridos pelas enzimas no trato gastrintestinal, como
celulose, hemiceluloses, amido resistente e pectinas, fazem parte da fração fibra
alimentar que pode ser dividida em solúvel (hemiceluloses solúveis, pectinas, gomas,
mucilagens) e insolúvel (celulose, hemicelulose, lignina e amido resistente). Sua
concentração é maior nas camadas externas do grão e diminui em direção ao centro,
resultando em baixa concentração desses componentes nos grãos polidos
(GODDARD et al., 1984).
11
3.1.2.2 Proteínas
As proteínas do arroz estão distribuídas em todos os tecidos do grão,
apresentando uma maior concentração no gérmen e no farelo. No endosperma a
concentração protéica diminui da periferia para o centro do grão (DAMIR, 1985).
O conteúdo de proteína no arroz varia de 4,3 a 18,2% (COFFMAN & JULIANO,
1987). Os fatores que podem influenciar no teor desde nutriente são nitrogênio do
solo, radiação solar, grau de maturação da planta, aplicação de fertilizantes,
temperatura, períodos de curta maturação e beneficiamento (ISLAM et al., 1996).
As proteínas do arroz são classificadas em albumina, globulina, prolamina e
glutelina e estão organizadas em dois tipos de corpos protéicos no endosperma. O
primeiro é composto por grandes estruturas esféricas com anéis concêntricos, ricos
em prolamina. Por outro lado, o segundo grupo de corpos protéicos não apresenta a
estrutura em anéis e são ricos em glutelina e globulina (ZHOU et al., 2002). No
endosperma, a glutelina forma a principal fração, correspondendo a aproximadamente
80% das proteínas, com menor concentração de albumina e globulina (15%) e
prolamina (5 a 8%). O farelo apresenta aproximadamente 60% de albumina, seguido
por prolamina e glutelina (27%) e globulina (7%) (JULIANO, 1993).
A qualidade da proteína depende de seu conteúdo em aminoácidos. Assim,
como em outros cereais, o arroz apresenta a lisina como aminoácido limitante. Porém,
entre os cereais, o arroz apresenta uma das maiores concentrações de lisina,
resultando em balanço de aminoácidos mais completo (JULIANO & BECHTEL, 1985).
Além dos aminoácidos protéicos o arroz também apresenta pequena
quantidade de aminoácidos livres, localizados principalmente no gérmen (595 mg 100
g-1) e no farelo (361 mg 100 g-1), com pequena concentração no endosperma
(53 mg 100 g-1). Entre os aminoácidos livres, predominam aspartato e glutamato, que
correspondem a aproximadamente 60% do total (SAIKUSA et al., 1994).
Para melhorar o perfil de aminoácidos, pesquisas vêm sendo conduzidas
visando a aumentar a concentração de certos aminoácidos, como lisina, metionina e
cisteína, através de modificação genética (WALTER et al., 2008).
3.1.2.3 Lipídios
O teor de lipídios presente no arroz é relativamente baixo, sendo afetado pela
variedade e condições de crescimento (VIEIRA & CARVALHO, 1999). Os lipídios
podem ser encontrados organizados em corpos lipídicos na camada de aleurona, no
embrião e no endosperma ou associados a grânulos de amido (LUMEN & CHOW,
12
1995). Entretanto, as maiores concentrações ocorrem no gérmen (1/3 do conteúdo
total) e na camada de aleurona. Dessa forma, a concentração de lipídios é maior no
arroz integral, sendo reduzida com o polimento, geralmente observando-se
concentrações inferiores a 1% no arroz polido (Tabela 1) (WALTER et al., 2008).
Os principais ácidos graxos no arroz são os ácidos palmítico (16:0), oléico
(18:1) e linoléico (18:2), correspondendo a aproximadamente 95% dos ácidos graxos
presentes nos lipídios totais (MANO et al., 1999).
3.1.2.4 Minerais
De forma geral, os minerais apresentam-se em maior concentração nas
camadas externas do grão, com aproximadamente 72% no farelo e 28% no grão
polido. Entretanto, alguns minerais apresentam distribuição mais uniforme, como sódio
e cálcio, permanecendo no arroz branco polido 63% do sódio e 74% do cálcio do arroz
integral (ITANI et al., 2002). Embora o arroz integral tenha maior concentração de
minerais do que o polido, isso não significa necessariamente maior quantidade de
minerais absorvidos pelo organismo, visto que a biodisponibilidade pode ser afetada
pela presença de maiores teores de fibra e ácido fítico no arroz integral (JULIANO,
1993).
A concentração de minerais difere nas frações do grão. Enquanto no arroz com
casca o silício é componente dominante, no arroz integral e polido, destacam-se
fósforo, potássio e magnésio. Ferro e zinco são dois minerais essenciais para a saúde
humana e estão disponíveis em baixas concentrações no grão (JULIANO &
BECHTEL, 1985).
Dentre os fatores que podem afetar os níveis de minerais no arroz, estão o
fator genético e o processo de beneficiamento, destacando-se o polimento e a
parboilização dos grãos (STORCK, 2004).
Na parboilização, o conteúdo de matéria mineral aumenta. Isso acontece
porque os minerais solúveis em água, presentes na camada externa, migram para o
endosperma amiláceo, causando aumento nos teores desses componentes e
melhorando o valor nutritivo dos grãos (COFFMAN & JULIANO, 1987).
3.1.2.5 Vitaminas
O arroz contém principalmente vitaminas do complexo B e α-tocoferol (vitamina
E), com concentrações insignificantes das vitaminas A, D e C (BELITZ & GROSCH,
1997). A concentração é maior nas camadas externas do grão, sendo que, para
13
tiamina, riboflavina, niacina e α-tocoferol, aproximadamente 78, 47, 67 e 95%,
respectivamente, estão presentes no farelo (JULIANO, 1993). Sendo assim, o arroz
integral contém maior teor de vitaminas do que o branco, pois o polimento remove
cerca de 80% de tiamina, 70% da riboflavina e 68% da niacina (JULIANO, 1993).
Assim como os minerais, os teores de vitaminas também podem ser afetados pelo
fator genético e beneficiamento (STORCK, 2004).
Pesquisas vêm sendo desenvolvidas para aumentar a concentração de
vitaminas no arroz, melhorando suas características nutricionais. Entre elas,
destacam-se aquelas relacionadas à vitamina A devido à importância de sua
deficiência, que atinge milhões de pessoas, e seus efeitos na saúde. As pesquisas
levaram à obtenção do Golden rice, um arroz transgênico contendo carotenóides em
seu endosperma, precursores da vitamina A (PAINE et al., 2005; BEYER et al., 2002).
3.1.2.6 Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos ou polifenóis são metabólitos secundários dos vegetais
com diferentes funções nas plantas. Eles podem ser classificados em diferentes
grupos, sendo os ácidos fenólicos, os flavonóides e os taninos os principais na dieta
(KING & YOUNG, 1999). Diversos compostos fenólicos já foram identificados,
destacando-se, no arroz, os ácidos fenólicos, principalmente, os ácidos ferúlico e ρ-
cumárico (TIAN et al., 2004; ZHOU et al., 2004).
Além de suas conhecidas funções nos vegetais, pesquisas têm demonstrado o
efeito benéfico de compostos fenólicos de diferentes fontes na saúde humana,
inclusive do arroz. Este efeito decorre de sua ação antioxidante, auxiliando na
prevenção de danos celulares e de doenças crônicas, incluindo doenças
cardiovasculares, envelhecimento, diabetes e câncer (HYUN & CHUNG, 2004; XIA et
al., 2003; KOIDE et al., 1996).
3.1.3 Produção e consumo de arroz
De acordo com a CONAB, (2011) a produção nacional de arroz deste ano deve
ficar em 12.628 mil toneladas, tendo um incremento ao redor de 967,3 mil toneladas
(8,3%) em relação à safra 2009/10 que foi de 11.660,9 mil toneladas. O acréscimo se
deve notadamente ao Rio Grande do Sul, principal produtor, com aproximadamente
63,9% de participação na produção nacional, que registrou um aumento de 18,7% na
produção esperada e 6,4% na área plantada, em relação a 2010. Neste Estado houve
uma retomada de áreas que na safra 2010, devido às chuvas intensas no período da
14
semeadura, não puderam ser instaladas (IBGE, 2011). A Figura 2 mostra a produção
do arroz em casca no Brasil e no Rio Grande do Sul no período de 1990 à 2008.
Figura 2. Produção do arroz em casca no RS comparativamente a produção no Brasil
(IBGE, 2010).
Segundo as projeções de produção e consumo de arroz, avaliadas pela
Assessoria de Gestão Estratégica do MAPA, (2011a), mostram que o Brasil vai colher
14,12 milhões de toneladas de arroz na safra 2019/2020. Equivale ao aumento anual
da produção de 1,15% nos próximos dez anos. O consumo deverá crescer a uma taxa
média anual de 0,86%, alcançando 14,37 milhões de toneladas em 2019/2020. A taxa
anual projetada para o consumo de arroz nos próximos anos, de 0,86%, está pouco
abaixo da expectativa de crescimento da população brasileira.
O arroz é um dos mais importantes grãos em termos de valor econômico. É
considerado o cultivo alimentar de maior importância em muitos países em
desenvolvimento, principalmente na Ásia e Oceania, onde vivem 70% da população
total dos países em desenvolvimento e cerca de dois terços da população subnutrida
mundial (EMBRAPA, 2005).
De acordo com dados da FAO, divulgados em 2006, entre os continentes, a
Ásia é o maior produtor mundial (90,5%), seguido das Américas (5,9%), África (3,0%),
Europa (0,5%) e Oceania (0,1%). O Brasil se destaca como o maior produtor fora do
continente Asiático e ocupa a nona colocação no ranking mundial de produção de
arroz, sendo o maior produtor americano.
Entre 1975 e 2005, o Brasil reduziu a área de plantio em torno de 26% e,
mesmo assim, aumentou sua produção de arroz em 69%, graças ao aumento de
15
128% na produtividade média. O crescimento da produção permitiu ao país tornar-se
auto-suficiente em arroz na safra 2003/2004. Em 2005, o Brasil chegou a exportar 272
mil toneladas de arroz. Hoje apenas 5% da produção nacional é destinada à
exportação (MAPA, 2011b). O Brasil se destaca na produção de culturas como soja,
milho, arroz, feijão e cana-de-açúcar. O arroz e o feijão são destinados,
principalmente, ao consumo interno (MAPA, 2011c).
A Ásia é o principal continente exportador e importador de arroz, respondendo
por 60,5% das exportações e 47,1% das importações mundiais. O continente
americano responde por 22,8% das exportações e 12,6% das importações. A Europa
abarca 12,3% das exportações mundiais e 20,1% das importações. A Oceania
responde por 2,3% das exportações mundiais e 1,6% das importações e à África
corresponde 2,1% das exportações mundiais e 18,5% das importações mundiais
(EMBRAPA, 2009).
O cultivo de arroz irrigado, praticado na região Sul do Brasil contribui, em
média, com 69% da produção nacional (Figura 3), sendo o Rio Grande do Sul o maior
produtor brasileiro, seguido dos Estados de Santa Catarina e Maranhão (MAPA,
2011a; EMBRAPA, 2009; IBGE, 2008), sendo que no Brasil o consumo anual é de 25
quilos por habitante em média (MAPA, 2011b).
Figura 3. Participação (%) dos principais estados produtores de arroz do Brasil em
2008 (IBGE, 2008).
Segundo os dados da pesquisa do IBGE, realizada entre os meses de maio de
2008 e maio de 2009, a quantidade média que cada brasileiro consumia de arroz caiu
16
cerca de 41%. Ou seja, de 24,6 kg de arroz por ano, passaram a consumir 14,6 kg,
sendo que o consumo do arroz cai na medida em que aumenta a renda da família.
A produtividade média do Estado do Rio Grande do Sul está próxima a obtida
em países tradicionais no cultivo, como Estados Unidos, Austrália e Japão
(EMBRAPA, 2005).
3.1.4 Doenças na cultura de arroz
O arroz, durante todo seu ciclo no campo, é afetado por doenças que reduzem
a produtividade e a qualidade dos grãos, pois o seu cultivo, aliado as condições
favoráveis de clima e manejo da cultura predispõe a lavoura ao ataque de pragas
(NUNES et al., 2003), sendo as doenças fúngicas responsáveis por danos variáveis
entre 20 e 50% na produtividade das lavouras de arroz no Rio Grande do Sul
(BALARDIN & BORIN, 2001).
Entre as doenças que ocorrem em lavouras de arroz, a de maior destaque,
devido ao prejuízo causado na produtividade, podendo comprometer até 100% da
produção, é a Brusone (causada pelo fungo Pyricularia grisea). Com menor
importância seguem a mancha parda, a escaldadura das folhas, a mancha das
glumas, podridão do colmo, queima das bainhas, a mancha das bainhas e a mancha
estreita (RIBEIRO & SPERANDIO, 1998).
Segundo Prabhu et al., (1999) a prevalência e severidade das doenças que
reduzem a produtividade e a qualidade dos grãos, dependem da presença de
patógeno virulento, de ambiente favorável à incidência do patógeno e da
suscetibilidade da cultivar.
As sementes de arroz são responsáveis pela disseminação de inúmeros
patógenos que causam doenças nessa cultura, além de ser um eficiente meio de
sobrevivência desses patógenos na natureza (AMARAL, 1987). Os fungos são o
principal grupo de organismos patogênicos que podem se associar às sementes de
arroz, abrangendo aproximadamente 50 espécies já relatadas (RICHARDSON, 1990).
Com base em diagnóstico sobre a ocorrência de pragas na cultura do arroz
irrigado no Rio Grande do Sul, foi constatado que algumas espécies são
frequentemente encontradas em níveis populacionais elevados. De maneira geral, as
pragas podem ser classificadas de acordo com a parte da planta que atacam (CBAI,
2005):
a) sementes e raízes - são atacadas por larvas e adultos de coleópteros antes
e/ou depois da inundação;
17
b) colmos e folhas - sofrem o ataque de insetos mastigadores, sugadores e
raspadores, sendo os dois primeiros grupos os mais importantes;
c) grãos - são atacados por um complexo de insetos sugadores que afetam
diretamente a quantidade e a qualidade do produto.
Em patologia de sementes, é importante conhecer, além do percentual de
ocorrência de um patógeno, a localização deste em relação à semente. Esse tipo de
informação permite não só definir métodos de detecção e de tratamento de sementes,
quando necessário, como estimar o modelo de desenvolvimento de doenças no
campo (COLHOUN, 1983).
À medida que avança o processo de maturação dos grãos, diminui a sua
resistência ao ataque das pragas e dos microorganismos. A colheita deve ser
realizada no momento próprio e de forma adequada, pois o retardamento e as
danificações mecânicas podem determinar que sejam colhidos grãos com qualidade já
comprometida ou com pré-disposição para grandes perdas durante o armazenamento
e/ou a industrialização (ELIAS et al., 1996; PUZZI, 1986).
A umidade de colheita está diretamente associada com a qualidade e com o
rendimento industrial dos grãos. Colheita em umidades inadequadas pode prejudicar
essa qualidade, pela redução na conservabilidade e no rendimento do produto, bem
como promover uma maior ocorrência de defeitos, os quais se intensificam durante o
armazenamento, prejudicando a tipificação na classificação comercial dos grãos,
reduzindo-lhes qualidade e valor (ELIAS et al., 1996). Na maioria das variedades, os
grãos devem ser colhidos quando sua umidade se situar entre 18 e 23% de umidade
(ELIAS et al., 2000).
Para o produtor controlar as doenças das plantas, o método mais prático e
econômico consiste na semeadura de cultivares mais resistentes ao ataque por
patógenos. Porém, na prática, a resistência em níveis elevados, geralmente não
ocorre em uma única cultivar para todas as doenças, ou não é durável por vários anos.
Por esses motivos, é necessário escolher as cultivares de arroz mais
resistentes às principais doenças (brusone e outras) ocorrentes na Região e somar
aos efeitos desta resistência, outras medidas preventivas de controle integrado
(manejo das práticas culturais, controle biológico e controle químico). Desta forma, os
danos serão economicamente menores e o nível de controle obtido mais eficiente e
duradouro.
18
3.2 Agrotóxicos
Os agrotóxicos são produtos e agentes de processos físicos, químicos ou
biológicos destinados ao uso nos setores de produção, armazenamento e
beneficiamento de produtos agrícolas, pastagens, proteção de florestas nativas ou
implantadas e de outros ecossistemas, bem como de ambientes urbanos, hídricos e
industriais (MAPA, 2011d). Esses compostos começaram a ser utilizados no Brasil na
década de 40. Inicialmente apreocupação era somente com o aumento da
produtividade para acompanhar a demanda populacional, sem observar as
conseqüências para o meio ambiente e para a saúde humana (CONWAY, 2003). Na
década de 70 começaram a aparecer os primeiros casos de contaminação ambiental e
problemas de saúde associados ao uso excessivo e desordenado dos agrotóxicos
(LIMA, 2008).
Na década de 80, o Brasil procurou implementar um novo método de controle
de pragas já em uso em outros países, o Manejo Integrado de Pragas, combinação de
métodos levando-se em consideração princípios ecológicos, econômicos e sociais
para a localidade afetada. Foram feitas discussões políticas e construídos novos
instrumentos legais, entre eles a nova Constituição Brasileira e a Lei 7802/1989 que
dispõe sobre a regularização, o descarte e o uso em geral de agrotóxicos. Com esta
Lei, para comercializar os agrotóxicos é necessário a obtenção de um registro onde
são avaliados quanto aos aspectos de impactos ao meio ambiente, à saúde humana e
à eficácia agronômica (COSTA, 2010; ALVES FILHO, 2002). No final dos anos 80,
devido a essas informações, vários estudos com relação ao uso dos agrotóxicos em
geral foram realizados no Brasil, visando adequações para enfrentar corretamente o
problema das pragas (COSTA, 2010; ALVES FILHO, 2002).
Alguns estudos comprovaram que o aumento do uso de agrotóxicos, em
determinadas culturas, aumentaram consideravelmente o número de pragas, surgindo
inclusive outras espécies igualmente danosas (ALVES FILHO, 2002). Além disso,
estudos revelaram que, em alguns casos, o emprego de fungicida acarreta maior
contaminação com micotoxinas no grão do que quando a cultura não é submetida a
tratamento químico (DORS, 2010; HÝSEK, 2005). Isso pode ser devido ao estresse do
fungo pela adição dos produtos químicos, com consequente produção de micotoxinas.
Sendo assim, a aplicação do fungicida nem sempre esta relacionada com a redução
de fungos e de micotoxinas no grão. Porém, o tratamento adequado das sementes
com fungicidas pode ser favorável influenciando positivamente no desempenho das
sementes no campo, protegendo a semente contra patógenos do solo durante a
19
germinação e de patógenos da parte aérea na fase inicial do desenvolvimento da
planta (NEERGAARD, 1979).
A agricultura praticada no Brasil é bastante dependente de insumos químicos,
dentre os quais os agrotóxicos que têm sido usados por mais de 40 anos devido a sua
eficácia em controlar uma grande variedade de pragas, doenças e plantas daninhas
que infestam as lavouras, garantindo assim uma maior produtividade e,
consequentemente, um maior retorno econômico da atividade agrícola. Entretanto
muitos questionamentos são feitos sobre a necessidade da utilização desses produtos
na agricultura para gerar uma maior produção de alimentos, devido aos riscos que
podem causar à saúde do consumidor e ao meio ambiente em geral (FARIA, 2004).
Apesar da criação de leis, portarias e resoluções na tentativa de controle e
diminuição do uso de agrotóxicos, o que vêm ocorrendo no Brasil é o aumento
significativo do uso desses compostos, principalmente dos proibidos em outros países,
pois os empresários do setor de defensivos agrícolas vêem, no Brasil, uma
oportunidade de continuidade de seu empreendimento, comercializando-os (COSTA,
2010).
Segundo dados da ANVISA, (2010) há crescimento da importação de
agrotóxicos à medida que eles são proibídos em seus países. Como exemplos de
agrotóxicos que aumentaram seu consumo no Brasil, após serem banidos em outros
países, o paration (banido da China em 2006), o carbofurano (banido na União
Européia em 2005) e o paraquate (banido pela União Européia em 2006) (COSTA,
2010).
Com relação ao quadro de vendas de agrotóxicos no Brasil, as indústrias de
agrotóxicos em 2009 negociaram 1,06 milhão de toneladas, batendo o recorde
(SINDAG, 2010). Atualmente, o Brasil é o maior consumidor de agrotóxicos do mundo
e tem o maior mercado destes produtos em âmbito mundial, com 107 empresas
autorizadas para registro de seus compostos químicos, respondendo por 16% do
mercado mundial. A importação de agrotóxicos em nosso país cresceu 236% entre
2000 e 2007 (ANVISA, 2010).
3.2.1 Controle de pragas na cultura de arroz
O controle das pragas na cultura de arroz pode ser feito através de diferentes
métodos: cultural, mecânico e químico, os quais podem ser utilizados isoladamente ou
integrados entre si. O método químico, através do uso de agrotóxicos, é um dos mais
utilizados (CORDEIRO, 2007). Para combater insetos, ácaros, bactérias, erva daninha,
fungos, moluscos, roedores visando garantir maior produtividade. Podem ser
20
classificados correlacionando o organismo vivo envolvido no seu emprego com a sua
estrutura química. Neste contexto, são classificados como inseticidas, acaricidas,
bactericida, herbicidas, fungicidas, moluscidas, raticidas entre outros (LARINI, 1999).
A Tabela 2 apresenta alguns dados de fungicidas utilizados na cultura do arroz,
do grupo estrobilurina (azoxistrobina e trifloxistrobina) e triazol (tebuconazole,
propiconazole, ciproconazole).
Tabela 2. Fungicidas utilizados em lavouras de arroz.
Fungicida LMR
(mg.kg-1)
Intervalo de
segurança N° CAS
Fórmula
química
Classificação
toxicológica
Azoxistrobina 0,1 30 dias 131860-33-8 C22H17N3O5 Classe III
Trifloxistrobina 0,2 15 dias 141517-21-7 C20H19F3N2O4 Classe II
Tebuconazole 0,1 35 dias 107534-96-3 C16H22ClN3O Classe IV
Propiconazole 0,1 45 dias 60207-90-1 C15H17Cl2N3O2 Classe II
Ciproconazole 0,03 42 dias 94361-06-5 C15H18ClN3O Classe III
LMR: limite máximo residual. Fonte: ANVISA, 2010.
3.2.2 Riscos à saúde pela ingestão de resíduos de agrotóxicos na dieta
Existem três vias principais responsáveis pela contaminação direta em
humanos por agrotóxicos (COSTA, 2010; SOUZA, 2006; MOREIRA et al., 2002):
1. Via ocupacional que é caracterizada pela intoxicação do grupo de
trabalhadores que lidam diretamente com os agrotóxicos, sendo responsável por mais
de 80% dos casos de intoxicação.
2. Via ambiental que é caracterizada pela distribuição ou dispersão dos
agrotóxicos, contaminando todos os segmentos ambientais, tais como: lençóis
freáticos, rios, córregos, lagos, solos, contaminação atmosférica por meio da
pulverização e contaminação da fauna e da flora.
3. Via alimentar que tem como característica a contaminação por agrotóxicos
devido à ingestão de produtos com resíduos destes compostos. Esta via atinge,
portanto, uma parcela maior da população, que são os consumidores.
21
Os agrotóxicos químicos integram o conjunto das substâncias “xenobióticas”
(estranhas ao organismo) e são considerados agentes tóxicos. Todos apresentam um
certo grau de toxicidade, podendo provocar danos aos organismos. A interação de um
agente tóxico com o organismo provoca diversos sinais ou sintomas específicos e é
denominada intoxicação (COUTINHO, 2000). Esses compostos podem causar efeitos
adversos ao sistema nervoso central e periférico, ter ação imunodepressora ou ser
cancerígeno (ECOBICHON, 1993).
A toxicidade da maioria dos agrotóxicos é expressa em valores referentes à
DL50, por via oral, representada por miligramas do ingrediente ativo do produto por
quilograma de peso vivo, necessários para matar 50% da população de ratos ou de
outro animal teste. A DL50 é usada para estabelecer as medidas de segurança a serem
seguidas para reduzir os riscos que o produto pode apresentar à saúde humana
(EMBRAPA, 2006).
Os agrotóxicos são agrupados em classes, de acordo com a sua toxicidade
(Tabela 3) referente aos resultados de testes ou estudos realizados em laboratórios,
estabelecidos pela portaria n°3/MS/SNVS, de 16 de janeiro de 1992, da Agência de
Vigilância Sanitária (ANVISA, 2010).
Tabela 3. Classes toxicológicas dos agrotóxicos com base na DL50.
Classe Classificação Cor da faixa no rótulo da
embalagem
I Extremamente tóxico
(DL50 menor que 50 mg.kg-1peso vivo)
Vermelho vivo
II Altamente tóxico
(DL50 de 50 mg.kg-1 a 500 mg.kg-1peso vivo)
Amarelo intenso
III Medianamente tóxico
(DL50 500 mg.kg-1 a 5000 mg.kg-1 peso vivo) Verde intenso
IV Pouco tóxico
(DL50 maior que 5000 mg.kg-1 peso vivo) Verde intenso
Fonte: EMBRAPA, 2006.
O mercado consumidor de produtos in natura ou processados tem exigido
requerimentos fitossanitários rigorosos, o que requer uma visão diferenciada de
produção de arroz, priorizando a segurança do alimento e do meio ambiente. Nesse
enfoque, a qualidade do grão é de vital importância para a conquista de novos nichos
de mercado, principalmente quando considerada em relação ao LMR aceito pelos
22
países importadores e recomendado pelo Codex Alimentarius (FAO, 2009). Alimentos
com resíduos químicos acima dos limites estabelecidos pelo Codex Alimentarius
podem causar enormes prejuízos aos produtores, visto a proibição imposta por
mercados externos. Além disto, não oferecem segurança alimentar e ambiental para
os consumidores internos. Assim, níveis de resíduos de agrotóxicos devem ser
monitorados para evitar barreiras econômicas (EMBRAPA, 2005).
3.2.3 Mecanismo dos fungicidas dos grupos triazol e estrobilurina
Os processos bioquímicos ou funções das organelas celulares, onde um
fungicida interfere podendo matar as células fúngicas, podem ser descritos de várias
formas, sendo que os fungicidas do grupo dos triazóis, como propiconazole,
tebuconazole e ciproconazole atuam na interrupção das funções da membrana celular,
mais especificamente na inibição da biossintese dos esteróis. Os fungicidas do grupo
das estrobilurinas, como trifloxistrobina e azoxistrobina atuam na inibição da
respiração fúngica (ZAMBOLIM et al., 2007).
Os esteróis são componentes funcionais da manutenção da integridade da
membrana. Os lipídios são os principais componentes estruturais da membrana
plasmática, juntamente com as proteínas. O principal lipídio da membrana plasmática
de fungos é o ergosterol, cujo precursor é o lanosterol e sua sintese é realisada
através da ação catalítica da acetil-CoA. Uma redução na disponibilidade de ergosterol
resulta no rompimento da membrana e no extravasamento de solutos iônicos (BOA,
2005).
Diversos grupos de fungicidas utilizam como alvo a respiração mitocondrial.
Respiração é um mecanismo onipresente no complexo oxidativo que conserva
energia, liberada pelo catabolismo de moléculas tais como carboidratos, através da
produção de ATP a partir de ADP e ortofosfatos. Vários componentes podem ser
identificados na sequencia de reações. Acetil CoA formado na quebra de carboidratos
(via glicolítica), proteínas e gorduras são degradadas no ciclo do ácido tricarboxílico.
Neste processo o cofator NAD+ (nocotinamina adenina dinucleotídio) e FAD (flavina
adenina dinucleotídio) são reduzidos para formar NADH e FADH2, respectivamente.
Os co-fatores oxidados são regenerados rendendo seus elétrons em uma cascata de
cadeia respiratória terminando na redução do oxigênio da água. A cadeia de
transporte será unida para a produção de ATP através do processo de fosforilação
oxidativa e complementar uma pequena quantidade de ATP sintetizada durante as
reações iniciais de glicólise. Os inibidores de reação não somente privam o organismo
de seu principal produto, o ATP, mas também interferem com a produção de outras
sínteses intermediárias vitais (KUCK & MEHL, 2003; VENÂNCIO et al., 2000).
23
3.3 Micotoxinas
As micotoxinas provêm do metabolismo secundário de fungos toxigênicos,
cujas principais características são amplo espectro de toxicidade, baixo peso
molecular, não-imunogenicidade, termo-estáveis e atuam em baixas concentrações
(BOK et al., 2004). O estresse, desbalanço de nutrientes e as condições ambientais
propiciam o desenvolvimento de micotoxinas pelas espécies toxigênicas (SWEENEY &
DOBSON, 1998). A maioria das micotoxinas afeta órgãos e tecidos, induzindo várias
patologias, tais como neoplasia, mutagênese, teratogênese, imunossupressão entre
outras (FERNANDES, 2004; FERNANDEZ et al., 1997). Os principais órgãos afetados
são conhecidos para algumas micotoxinas dentre elas estão: aflatoxinas o fígado;
zearalenona o sistema reprodutor; ocratoxinas A e citrinina os rins, fumonisinas os
pulmões; tricotecenos o trato digestório e sistema imunológico (TANAKA, 2001).
Os principais fungos produtores de micotoxinas são dos gêneros Aspergillus,
Penicillium e Fusarium. Entre as principais micotoxinas de interesse na área de
alimentos estão as afatoxinas, patulina, ocratoxina, zearalenona, tricotecenos e
fumonisinas (SWEENEY & DOBSON, 1998).
O isolamento de fungos toxigênicos a partir de grãos, estocados em condições
recomendadas, não significa obrigatoriamente risco imediato para consumo. Assim
como, a ausência de fungos em alimentos, não significa ausência de micotoxinas, ou
seja, o fungo pode estar ausente, mas a toxina pode estar presente e ativa (PITT &
HOCKING, 1997; OSBORNE, 1982).
Os fungos toxigênicos podem infectar os cultivos em crescimento, em
consequência de danos causados por insetos e outros agentes, e produzir toxinas
antes ou durante a colheita e após seu armazenamento (ZLOTOWSKI et al., 2004;
MALLMANN et al., 1994). Além disso, os tipos de alimentos podem contribuir para a
produção de micotoxinas, uma vez que alguns grãos são substratos mais adequados
que outros para a multiplicação de determinados fungos (ROSSETTO et al, 2003;
SANTURIO, 2000).
Em condições favoráveis, várias espécies fúngicas podem produzir micotoxinas
em alimentos, nos quais sua ingestão em níveis suficientes leva a um quadro clínico
grave denominado micotoxicose (alteração patológica e/ou funcional no organismo,
causada pela micotoxina) em animais e humanos (SANTURIO, 2000; JAIRAMAN &
KALYANASUNDARAM, 1990). A Tabela 4 mostra exemplos de micotoxinas, os
principais produtos afetados e os efeitos biológicos no homem e animais.
A micotoxicose pode ser do tipo primária ou secundária, sendo que destas, a
secundária pode ser mais difícil de identificar devido aos baixos níveis de toxinas na
24
amostra não resultarem, muitas vezes, em um quadro clínico de micotoxicose
específica, mas sim num quadro de suscetibilidade exacerbada a infecções
intercorrentes devido à imunossupressão ocasionada pela toxina (OSBORNE, 1982).
Outro aspecto importante das micotoxinas é o fato destas não serem produtos
voláteis e permanecem associadas à estrutura dos fungos, esporos ou substrato em
que foram liberadas. Seu processo de formação não é contínuo, entretanto, deve-se
partir do pressuposto que, se um fungo estiver presente no ambiente laboral e forem
capazes de produzir toxinas, estas poderão estar presentes no alimento (PITT &
HOCKING, 1997).
Ainda são restritos os conhecimentos sobre fisiologia, produção de toxinas e
desenvolvimento de fungos produtores de micotoxinas. Já se sabe que a multiplicação
de fungos e produção de micotoxinas podem ocorrer nas diversas fases do
desenvolvimento, maturação, colheita, transporte, processamento ou armazenagem
dos alimentos (LILLEHOJ, 1991).
A dificuldade de colheita dos cereais no estágio correto de umidade e
maturação pode ser o ponto crítico no que tange a produção de micotoxinas. Cereais
colhidos com alta umidade facilitam o desenvolvimento fúngico antes da secagem e
armazenamento, sobretudo se forem armazenadas sem um correto processo de
secagem. Por outro lado, cereais na lavoura, após a maturação fisiológica dos grãos,
ficam sujeitos a alta umidade a ao ataque de pragas que propiciam condições
favoráveis ao desenvolvimento fúngico (MALLMANN, 2007).
A produção de micotoxinas está ligada a multiplicação do fungo. Entretanto, a
presença do fungo produtor não indica a presença de micotoxinas (GONÇALEZ,
2001).
25
Tabela 4. Exemplos de micotoxinas e seus principais fungos produtores, commodities
afetados e efeitos biológicos no homem e animais.
Micotoxinas Fungos
produtores Commodities contaminados
Efeitos em animais
Efeitos no homem
Aflatoxina (B1, B2, G1, G2 e M1)
Aspergillus flavus
Aspergillus parasiticus
Amendoim,
pistachio, milho
amêndoa, leite
e seus derivados
Hepatotoxici-dade,
Hepatocarci-noma
e hemorragia
Hepatocarcinogênese,
cirrose em crianças,
síndrome de Reye,
degeneração da gordura
de vísceras
Ocratoxina A
Aspergillus
alutaceus
Penicillium
verrucosum
Grãos de café,
arroz, cevada,
produto animal
(rins, carne)
Nefrotóxico e
hepatotóxico
Nefropatia de Balkan,
tumor renal
Patulina Penicillium
expansum
Maçã,
suco de maçã
Hepatotóxico,
afeta rins, baço e cérebro
Provável ação
carcinogênica,
mutagênica,
teratogênica e
fetotóxica
Tricotecenos
(deoxinivalenol,
nivalenol,
toxina T-2)
Fusarium
graminearum
Trigo, cevada,
arroz, sorgo
Vômito, diarréia,
perda de peso,
descamação da pele
e hemorragia
ATA (aleucia
tóxica alimentar)
Zearalenona Fusarium
graminearum
Milho, sorgo,
trigo
Efeitos estrogênicos,
infertilidade
Câncer cervical
Fumonisinas
(B1, B2 e B3)
Fusarium
moniliforme
Fusarium
proliferatum
Milho e seus
derivados
LEME (leucoencefa-
lomalácia eqüina), edema
pulmonar
em suínos
Câncer de esôfago
Alcalóides
do Ergot
Claviceps
purpurea
Centeio, milho,
grama
Gangrena nas
extremidades,
convulsões
Ergotismo (gangrena
nos membros)
Fonte: GONÇALEZ et al., 2001.
26
3.3.1 Micotoxinas produzidas por fungos do gênero Fusarium
Apesar das utilidades e benefícios do emprego de alguns fungos em diversos
processos industriais, quando alguns deles contaminam os produtos alimentícios
podem representar perigo à saúde pública, pois além de diminuírem a disponibilidade
de nutrientes, alteram as características sensoriais e podem produzir substâncias
tóxicas (MENEZES, 1992).
As principais espécies fúngicas toxigênicas encontradas nos alimentos são as
dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Enquanto as espécies de Fusarium
são patógenos para as plantas antes ou imediatamente após a colheita, produzindo
micotoxinas, espécies de Aspergillus e Penicillium são mais comumente encontradas
como contaminantes de equipamentos e alimentos durante a secagem e estocagem
(SWEENWEY & DOBSON, 1998).
O Fusarium e suas micotoxinas, em especial fumonisinas, tricotecenos e
zearalenona são detectados com grande frequência em grãos que servem de preparo
para alimentos e rações. Tanto em plantações como em humanos e animais que se
alimentam de tais grãos, os efeitos causados pelos fungos são graves, levando a um
prejuízo econômico e problemas de saúde (LEAL et al., 2005). Estas toxinas no Brasil
são relativamente pouco estudadas e a maioria dos relatos de contaminação provém
de matérias-primas produzidas nos estados do Paraná, Rio Grande do Sul e Santa
Catarina, devido à alternância de noites frias e dias quentes (SANTURIO, 2000).
A infecção por Fusarium em grãos de cereais não somente resulta em redução
do rendimento da cultura, mas também em um grão de baixa qualidade,
especialmente pela produção de micotoxinas, a qual é ocasionada pelo estresse do
fungo com liberação de substâncias toxigênicas (BOTTALICO, 1998).
Vários trabalhos têm sido realizados com o intuito de aumentar a resistência
das plantações ao Fusarium e suas micotoxinas procurando variedades de espécies
de plantas que tenham resistência ao fungo por melhoramento genético. Também tem
sido estudadas espécies de microrganismos que tenham antagonismo competitivo
pelo Fusarium (LEAL et al., 2005).
As micotoxinas de Fusarium são perigosas para a saúde de humanos e
animais. Alguns fungicidas podem ser eficientes para o controle de Fusarium.
Metconazole, prothioconazole e tebuconazole têm sido reportados como fungicidas
efetivos para esse fim, reduzindo o nível das principais micotoxinas que ocorrem em
grãos de cereais (SUTY-HEINZE & DUTZMANN, 2004; KANG et al., 2001). Porém, se
exercem ação estressante para o metabolismo fúngico, os fungicidas podem
desencadear a manifestação toxigênica em algumas espécies.
27
3.3.1.1 Zearalenona
A zearalenona (ZEA) (Figura 4) é um metabólito estrogênico produzido por
espécies de Fusarium tais como F. culmorum, F. crookwellense (F. cerealis), F.
graminearum, entre outros (AKIYAMA, 2001; STROKA, 2000).
Como a maioria dessas espécies fúngicas também são produtoras de outras
toxinas como DON, NIV e T-2, é muito difícil que apenas a ZEA seja encontrada
ocorrendo naturalmente na natureza, quando essas espécies estão contaminando os
grãos (SMITH & HENDERSON, 1991).
Figura 4. Estrutura química da zearalenona (SHIER, 1998).
A zearalenona é sintetizada pela via do acetato-polimalonato, resultando na
condensação de unidades de acetato dentro de um poliquetídeo, que requer
relativamente pequenas modificações para completar a conversão para a molécula
final da toxina (SHIER, 1998). Essa toxina tem efeito estrogênico em animais,
incluindo infertilidade, aumento do útero e glândulas mamárias, atrofia dos testículos e
ovários (GAUMY et al., 2001; HOLLINGER et al., 1999; D’MELLO et al., 1999).
Zearalenona não é conhecida por ser um composto com alta toxicidade, pois
em uma única dosagem de 20 µg.kg-1 em camundongos e ratos e 15 µg.kg-1 em aves
não causou mortalidade (YOSHIZAWA, 2001).
3.3.1.2 Tricotecenos
Os tricotecenos são produtos do metabolismo secundário de fungos dos
gêneros Fusarium, Myrothecium, Trichothecium, Cephalosporium, Verticimonosporium
e Stachybotrys (SWEENWEY & DOBSON, 1998). A contaminação com estas
micotoxinas ocorrem em temperatura entre 0 e 35ºC e umidade relativa entre 80 e
90% (BADIALE-FURLONG, 2000).
28
Os tricotecenos (12,13-epoxitricotecenos) são um grupo de mais de cem
micotoxinas e possuem esse nome devido a sua estrutura química, composta de um
anel com esqueleto tetracíclico 12,13-epoxitricotecenos (SANTIN, 2000). Apresentam
uma dupla ligação entre os carbonos 9 e 10 e podem ser classificados em 4 grupos (A,
B, C e D) (Figura 5).
No grupo A estão os tricotecenos cuja posição 8 tem como substituintes grupos
acilados ou hidroxilas, incluindo assim toxina T-2, toxina HT-2, neosolaniol e
diacetoxiscirpenol (DAS). O grupo B é constituído por compostos onde na posição 8
está um grupamento cetônico, incluindo o deoxinivalenol (DON, vomitoxina), nivalenol
e fusarenona-x. Os tricotecenos do tipo C possuem dois grupamentos epóxidos, como
a crotocina. O grupo D é constituído pelos tricotecenos macrocíclicos, onde estão a
roridina, a verrucarina e a satratoxina (UENO, 1980). A síntese dos grupos A e B
parece ser característica particular do gênero Fusarium (MELLO & MACDONALD,
1997).
Figura 5. Estrutura química dos tricotecenos (SYDENHAM & THIEL, 1996).
O grupo epóxido e a dupla ligação na posição 9 e 10 são os elementos
fundamentais para a toxicidade dos tricotecenos, no entanto, os outros substituintes,
suas posições e tamanhos também influenciam no grau de toxicidade (SCOTT, 1990).
Essas substâncias são descritas como potentes irritantes da pele e agentes
inflamatórios com rápida destruição das células em divisão (MIROCHA & PATHRE,
1973).
29
Os tricotecenos são responsáveis por vários tipos de micotoxicoses em
animais, causando vários efeitos adversos à saúde. Eles também são causadores de
algumas doenças do homem. O deoxinivalenol (DON) e a toxina T-2 são os
tricotecenos mais potentes (CERVERÓ et al., 2007).
Os tricotecenos são, em geral, compostos muito estáveis, tanto durante a
moagem como no armazenamento, cozimento e processamento de alimentos, e eles
não se degradam em altas temperaturas (ERIKSEN & ALEXANDER, 1998).
Os tricotecenos, não são voláteis e podem ser desativados sob condições
drásticas ácidas ou alcalinas, em presença de hidretos de alumínio, lítio ou peróxidos
e hidratação em autoclave, onde o anel epóxido pode sofrer abertura. A enzima
epóxido hidrase também é capaz de abrir o anel e produzir glicóis. Fungos e bactérias
podem também alterar a estrutura deste tricoteceno, detoxificando-o (GARDA-
BUFFON & BADIALE-FURLONG, 2008).
3.3.2 Legislação para micotoxinas
O Brasil possui legislação apenas para regular aflatoxinas (Resolução RDC nº
274, da ANVISA, de 15 de outubro de 2002), sendo o limite máximo permitido em
alimentos como amendoim (com casca, descascado, cru ou tostado), pasta de
amendoim (pasta ou manteiga de amendoim) e milho em grão (inteiro, partido,
amassado, moido) e farinhas ou sêmolas de milho de 20 µg.kg-1 para a soma das
aflatoxinas B1, B2, G1 e G2.
Para os demais produtos direcionados ao consumo humano prevalece à
legislação de 1974 do Ministério da Saúde, Resolução nº 34/76, publicada no Diário
Oficial da União, em 19 de janeiro de 1977: aflatoxinas B1 + G1 = 30 µg.kg-1. Países
vizinhos ao Rio Grande do Sul, como o Uruguai possuem legislação para aflatoxinas
B1, B2, G1, G2 em alimentos e especiarias de 20 μg.kg-1, zearalenona em milho e
cevada de 200 μg.kg-1, patulina em sucos de frutas de 50 μg.kg-1 e ocratoxina A de 50
μg.kg-1 para alimentos como arroz, cevada, porotos, café e milho direcionados ao
consumo humano (FAO, 2004).
Comparada com a numerosa legislação para aflatoxinas em alimentos e
rações, poucos limites máximos são estipulados para os tricotecenos. Entre os mais
conhecidos esta o nível do US Food and Drug Administration para DON, sendo o limite
máximo aceitável 1 mg.kg-1 para o farelo, farinha e gérmen para o consumo humano
(KRSKA et al., 2002).
A Hungria é um dos poucos países em que há regulação para tricotecenos. O
limite máximo tolerado para DON é 1,2 mg.kg-1 em farelo e 1 mg.kg-1 em cereais e
30
vários produtos moídos. Para toxina T-2 o limite é 0,31 mg.kg-1 em cereais e produtos
moídos (EKE, 2004).
A zearalenona possui limites máximos regulamentados na França, Itália e
Romênia, onde os limites são, respectivamente, 200 μg.kg-1 para cereais e óleos
vegetais, 100 μg.kg-1 para cereais e produtos e 30 μg.kg-1 para todos os alimentos
(FAO, 2004).
3.3.3 Métodos de determinação de micotoxinas
Vários métodos podem ser utilizados para detecção e quantificação de
micotoxinas, dentre esses se destacam os cromatográficos (cromatografia em camada
delgada, cromatografia líquida de alta resolução e cromatografia gasosa) e os
métodos imunoensaios (ELISA e radioimunoensaio) (MALLOZZI & CORRÊA, 1998).
A detecção e a determinação de micotoxinas devem ser realizadas por
métodos sensíveis e específicos, pois além de ocorrerem em níveis de ng.g-1 (ppb),
constituem também um grupo de estruturas muito semelhantes exigindo métodos que
além de as separar, também confirme suas identidades. Além disso, os métodos
também devem ser rápidos, confiáveis e economicamente viáveis (MAROCHI et al.,
1996). O desenvolvimento de um método para a análise de micotoxinas é dificultado
por diversos fatores, tais como tempo, grande volume de solventes, várias etapas de
extração, tornando a análise extremamente laboriosa. Um procedimento inclui
normalmente quatro etapas: preparo de amostra, a extração, clean up e determinação
cromatográfica para identificação e quantificação (PALMA et al., 2007).
Algumas micotoxinas podem ser facilmente quantificadas por sua fluorescência
outras apresentam baixa interação com a radiação eletromagnética necessitando de
sistemas especiais de detecção (detectores de chama, espectrometria de massa,
captura eletrônica e outros. Algumas micotoxinas são mais difíceis de serem
detectadas, como é o caso dos tricotecenos, em virtude de vários aspectos físico-
químicos. Um deles é a grande faixa de polaridade dos componentes do grupo que
dificulta a extração da matriz, sendo necessário o emprego de solventes que arrastam
também uma série de compostos interferentes. A ocorrência simultânea de
tricotecenos com diferentes níveis de toxicidade torna importante a quantificação
separada, sendo os métodos cromatográficos os mais indicados (SYNDER, 1986).
Algumas etapas analíticas são consideradas importantes nos métodos
utilizados na determinação de micotoxinas em alimentos, por exemplo, etapas de
preparação da amostra, extração com solvente, limpeza do extrato, triagem,
confirmação e quantificação (TANAKA, 2001; GILBERT, 1999).
31
O preparo da amostra consta de etapas como quarteamento, trituração e
homogeneização. A escolha do solvente para as etapas de extração e purificação
baseia-se na polaridade e solubilidade diferencial das micotoxinas, podendo-se
mencionar clorofórmio, acetona, metanol, acetonitrila, benzeno, acetato de etila,
hexano e água (TANAKA, 2001; GILBERT, 1999). O emprego de solventes orgânicos
em mistura com água também tem sido utilizado, pois apesar da solubilidade de
algumas micotoxinas em água ser pequena, o solvente aquoso pode penetrar
hidrofilicamente nos tecidos, resultando em maior eficiência na extração por solventes
não aquosos (EGMOND & PAULSCH, 1986).
No processo de clarificação, um dos precipitantes mais utilizados é o sulfato de
amônio e se a amostra for gordurosa faz-se uma etapa extra de desengorduramento
seja com hexano ou isoctano por exemplo. Para limpeza são bastante utilizadas
colunas de extração em fase sólida e os adsorventes utilizados são os mais variados,
como carvão ativo, celite, alumina e florisil (BADIALE-FURLONG & SOARES, 1995;
MAROCHI & SOARES, 1993; ROMER, 1986).
Os procedimentos de limpeza do extrato envolvem partição líquido-líquido,
colunas de extração em fase sólida (sílica gel, C18, silicato de magnésio) (AKIYAMA
et al., 2001) e colunas de imunoafinidade (KRSKA et al., 2002; STROKA et al., 2000)
O processo de derivação se faz necessário quando se utiliza a CG, pois reduz
a polaridade de grupamentos livres, aumenta a volatilidade, introduz grupos que
tornam o composto adequado para o sistema de detecção e, além de tudo, possibilita
a separação de substâncias muito semelhantes entre si no seu estado natural. Para os
tricotecenos as derivações mais usuais são a sililação, a fluoroacetilação e a
fluoroalquilação (LANGSETH & RUNDBERGET, 1998; KIENTZ & VERWEIJ, 1986). A
escolha do reagente de derivação depende do propósito da análise, da concentração
da micotoxina, do sistema de detecção, da matriz e se somente o DON ou também
outros tricotecenos serão determinados (KOCH, 2004; EKE & TORKOS, 2004). O
TFAA (anidrido trifloruacético) é um reagente bastante usado na derivação de
tricotecenos, pois a sensibilidade de detecção depende do número e posição dos
grupos funcionais hidroxila disponíveis para a acilação, sendo que a maior resposta
relativa é obtida pelo DON o qual possui três grupos hidroxila responsáveis pela
formação de um ester de trifluoro acetato ( RADOVÁ et al., 1998).
Testes de confirmação são recomendados, principalmente quando se emprega
cromatografia em camada delgada. Dentre estes testes está mencionado o emprego
de solventes e reveladores distintos, além de reações químicas de derivação
(TANAKA, 2001; BADIALE-FURLONG & SOARES, 1995; MAROCHI, 1988). Para a
cromatografia gasosa, o tempo de retenção através de reações de redução e
32
acetilação que alteram as propriedades cromatográficas, o uso de diferentes fases
estacionárias e detectores têm auxiliado no processo de confirmação. Para a
cromatografia líquida tem se utilizado diferentes fases móveis, colunas, detectores e
ainda reações de derivação pré e pós-coluna (TANAKA, 2001; BADIALE-FURLONG &
SOARES, 1995).
De acordo com Hackbart (2009), uma tendência do século XXI para análise de
micotoxinas tem incorporado novas tecnologias que buscam minimizar impacto
ambiental, tempo de exposição dos analistas a solventes tóxicos, apontando para o
desenvolvimento de multimétodos que determinam uma ampla variedade de
substâncias em uma única extração. Neste contexto, há a necessidade do
desenvolvimento de novas metodologias, que sejam rápidas, baratas, mas que ao
mesmo tempo possam identificar e quantificar os analitos em amostras complexas em
níveis de traços, com recuperação do analito superior a 80%.
O método de QuEChERS, sigla do inglês para caracterizar procedimento de
extração de analitos rápido, confiável, fácil, econômico, robusto e seguro, foi proposto
por Anastassiades et al., (2003) para extração de agrotóxicos e Hackbart, (2009) o
modificou para adaptá-lo para extração de ocratoxina A e citrinina.
O método oficial descrito na Association of Official Analytical Chemists (AOAC)
para análise quantitativa de micotoxinas envolve a determinação por cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a diferentes tipos de detectores que
permitem determinar uma extensa variedade de compostos químicos e biológicos,
além de ser aplicada na análise de rotina em muitas áreas do conhecimento (POPPI et
al., 2007; FURLANI et al., 1999; SYDENHAM & SHEPHARD, 1996; GUIMARÃES &
COLLINS, 1993).
33
CAPÍTULO III
34
4 DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO
Para melhor entendimento, o trabalho foi dividido em quatro artigos:
Artigo 1: Validação de método QuEChERS modificado para determinação de
fusariotoxinas em arroz.
Artigo 2: Contaminação fúngica e ocorrência de micotoxinas nas frações do
beneficiamento do arroz.
Artigo 3: Caracterização físico-química e bioquímica de arroz fermentado com
Fusarium graminearum em presença e ausência de fungicidas.
Artigo 4: Efeito do uso de fungicidas no desenvolvimento fúngico e na
manifestação de potencial toxigênico no arroz: um estudo in vitro.
35
ARTIGO 1
36
VALIDAÇÃO DE MÉTODO QuEChERS MODIFICADO PARA DETERMINAÇÃO DE
FUSARIOTOXINAS EM ARROZ
Laboratório de Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, Universidade
Federal do Rio Grande (FURG), Rua Engenheiro Alfredo Huch, 475, CEP 96201-900,
Caixa Postal 474, Rio Grande, RS, Brasil
RESUMO
Foi validado e aplicado um método para extração e quantificação simultânea de micotoxinas de Fusarium graminearum, DON e ZEA, em amostras de arroz. A validação foi verificada em termos de limite de detecção e quantificação, curva analítica, linearidade, precisão instrumental, repetibilidade, precisão intermediária, exatidão e seletividade utilizando HPLC-UV-FL. A recuperação das micotoxinas foi confirmada em equipamento LC-MS/MS. O método QuEChERS modificado foi aplicado para a quantificação de DON e ZEA em arroz natural e parboilizado, cultivados com e sem emprego de fungicidas. Os limites de detecção para o método e instrumento foram de 30 µg.kg-1 e 100 µg.L-1 para DON e de 6 µg.kg-1 e 20 µg.L-1 para ZEA e os limites de quantificação de 300 µg.kg-1 e 1000 µg.L-1 para DON e de 60 µg.kg-1 e 200 µg.L-1 para ZEA, respectivamente. A precisão instrumental foi de 1,3% para DON e 4,9% para ZEA. A repetibilidade (RSDr) e precisão intermediária (RSDpi) foram de 0,2 a 8,1% e 1,5 a 8,1%, respectivamente. A recuperação foi de 81,6% para DON e de 86,1% para ZEA. A aplicação do método sugeriu que o processo de parboilização favorece a contaminação com ZEA, que atingiu níveis de 18,3 µg.g-1, e que o tratamento com fungicida durante o cultivo esta relacionado com a ocorrência de micotoxinas no grão. Palavras-chave: deoxinivalenol, zearalenona, cromatografia líquida.
37
ABSTRACT
Was validated and applied a method for simultaneous extraction and quantification of mycotoxins of Fusarium graminearum, DON and ZEA in samples of rice. The validity was checked in terms of quantification and detection limit, calibration curve, linearity, instrumental precision, repeatability, intermediate precision, accuracy and selectivity using HPLC-UV-FL. The recovery of the mycotoxins was confirmed in LC-MS/MS equipment. The modified method QuEChERS was applied for quantification of ZEA and DON in natural and parboiled rice, grown with and without use of fungicides. The limits of detection for the method and instrument were 30 µg.kg-1 and 100 µg.L-1 for DON and 6 µg.kg-1 and 20 µg.L-1 for ZEA and quantification limits of 300 µg.kg-1 and 1000 µg.L-1 for DON and 60 µg.kg-1 and 200 µg.L-1 for ZEA, respectively. Instrumental precision was 1.3% for DON and 4.9% for ZEA. The repeatability (RSDr) and intermediate precision (RSDpi) were 0.2 to 8.1% and 1.5 to 8.1%, respectively. The recovery was 81.6% for DON and 86.1% for ZEA. The application of the method suggested that the parboiling process lead to the ZEA contamination, which reached levels of 18.3 μg.g-1, and that treatment with fungicide during growth is associated with the occurrence of mycotoxins in grain. Keywords: deoxynivalenol, zearalenone, liquid chromatography.
38
1 INTRODUÇÃO
Um método analítico precisa fornecer informações confiáveis e interpretáveis
sobre a amostra (RIBANI, 2004; CODEX, 1995) que podem ser demonstradas por um
conjunto de propriedades, tais como: especificidade e seletividade, linearidade,
precisão, limite de quantificação e exatidão adequados à aplicação de interesse
(RIBANI et al., 2004; ANVISA, 2003, INMETRO, 2003; BRITO et al., 2003). Motivado
pela necessidade de prevenir danos causados ao meio ambiente, metodologias que
gerem o mínimo de resíduos para descarte vem sendo privilegiadas. Neste sentido
Anastassiades et al., (2003) propuseram um procedimento para extração de
agrotóxicos denominado QuEChERS, que caracteriza procedimento de extração de
analitos rápido, confiável, fácil, econômico, robusto e seguro.
A extração de micotoxinas utilizando método QuEChERS é útil, pois elas
requerem uma série de cuidados decorrentes de suas características físico-químicas,
de sua ocorrência em quantidades traços, bem como da necessidade de determinar
separadamente os compostos de uma mesma família que possuem pequenas
diferenças estruturais, porém distintos potenciais toxigênicos (SCOTT, 1984). No caso
da determinação de micotoxinas, o procedimento foi modificado por Hackbart (2009)
para ocratoxina A e citrinina e por Zachariasova (2010) para micotoxinas de Fusarium,
resultando em indicativos promissores.
O método oficial descrito na Association of Official Analytical Chemists (AOAC)
para análise quantitativa de micotoxinas envolve a determinação por cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a diferentes tipos de detectores que
permitem determinar uma extensa variedade de compostos químicos e biológicos,
além de ser aplicada na análise de rotina em muitas áreas do conhecimento (POPPI et
al., 2007; FURLANI et al., 1999; SYDENHAM & SHEPHARD, 1996; GUIMARÃES &
COLLINS, 1993).
O arroz é um dos grãos mais importantes em termos de valor econômico,
sendo a espécie que apresenta maior potencial para combater a fome no mundo. O
Brasil se destaca como o maior produtor de arroz fora do continente Asiático, sendo a
região Sul responsável por cerca de 60% da produção no país (EMBRAPA, 2010). A
riqueza de nutrientes do grão o torna susceptível a contaminação por diversos
patógenos, com destaque para os fungos. Dentre estes, alguns são toxigênicos e, no
caso de cereais, pertencem principalmente aos gêneros: Fusarium, Aspergillus e
Penicillium. Algumas espécies de Fusarium são fitopatogênicas produzindo
micotoxinas antes ou imediatamente após a colheita, enquanto que espécies de
39
Aspergillus e Penicillium são mais comumente encontradas como contaminantes de
alimentos durante a secagem e armazenamento (SWEENEY & DOBSON, 1998).
A infecção por Fusarium nos cereais resulta na redução do rendimento da
cultura e na baixa qualidade dos grãos, além da possibilidade de produção de
micotoxinas que tornam o grão e seus derivados num potencial risco para a saúde de
animais e humanos (BOTTALICO, 1998). A zearalenona (ZEA) e o deoxinivalenol
(DON), são produzidas naturalmente por espécies de fungos do gênero Fusarium e
vem sendo frequentemente detectados em diferentes cereais nas últimas décadas
(ZACHARIASOVA, 2010; BERTHILLER, 2007; FEDDERN et al., 2007; MARTINS,
2002). No caso do arroz e seus derivados, alguns autores mencionam a ocorrência
destas micotoxinas em níveis que podem levar a efeitos adversos crônicos,
especialmente pelo consumo frequente em diversas formas de alimentos (DORS,
2010; HINOJO et al., 2006; PARK et al., 2005).
Em vista destas considerações, o objetivo desse trabalho foi validar e aplicar
uma metodologia de extração do tipo QuEChERS modificado seguido por
quantificação em HPLC-UV-FL de micotoxinas produzidas por Fusarium graminearum
em arroz.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Padrões e reagentes
As soluções estoque de micotoxinas (Tabela 1) foram preparadas conforme
metodologia descrita por Scott, (1990). Cada padrão de micotoxina, contendo
aproximadamente 5 mg, foi dissolvido em 100 mL de benzeno:acetonitrila (95:5). Para
a estimativa da concentração das soluções trabalho foram utilizados comprimento de
onda de máxima absorção de 260 e 317 nm e a absortividade molar de 1410 e
6060 L mol-1 cm-1 para DON em acetato de etila e ZEA em benzeno, respectivamente
(AOAC, 2000; BENNET & SHOTWELL, 1990). Foi utilizando espectrofotômetro UV-Vis
modelo Cary 100-Varian para as leituras de absorbância. As soluções trabalho foram
armazenadas a 4°C no caso do DON e -18°C no caso da ZEA, e no momento do uso
foram secas, ressuspensas em acetonitrila e homogeneizadas em banho ultrassônico.
A estabilidade das soluções foi monitorada, repetindo o procedimento de quantificação
durante o período do experimento. As fases móveis utilizadas, acetonitrila grau HPLC
(J. T. Baker Brasil) e água ultra pura (Milli-Q), foram previamente desgaseificadas em
banho ultrassônico e a acetonitrila filtrada em filtro millipore com poros de 0,45 µm de
diâmetro.
40
Tabela 1. Descrição das micotoxinas DON e ZEA.
Micotoxina Fornecedor Grau de
pureza (%)
Peso
molecular
(g.mol-1)
Número CAS
Deoxinivalenol Sigma Aldrich > 98 296,32 51481-10-8
Zearanenona Sigma Aldrich > 98 318,36 17924-92-4
2.2 Amostras
Amostra de arroz com casca moído foi utilizada para validação do método.
Amostras de arroz natural e parboilizado cultivadas com e sem fungicidas,
totalizando quatro amostras, foram utilizadas para aplicação do método validado.
Todas as amostras foram cedidas pelo Instituto Rio Grandense do Arroz
(IRGA) de Cachoeirinha, RS, Brasil. A cultivar utilizada foi a BR-IRGA 417 semeada no
sistema de cultivo mínimo, com densidade de semeadura de 100 kg.ha-1. A adubação
de base foi com 400 kg.ha-1 de N:P:K 05:20:30. A adubação nitrogenada em cobertura
foi com 80 kg.ha-1 de nitrogênio, no arroz com 8 folhas antes do início da diferenciação
do primórdio da panícula. Houve aplicação dos herbicidas clomazona (600 kg.ha-1)
antes da primeira adubação de cobertura e bispiribaque de sódio (150 kg.ha-1) após a
segunda adubação de cobertura. Foram aplicados os inseticidas carbofurano e fipronil
(4 kg.ha-1) após a terceira adubação de cobertura (50 kg.ha-1 uréia e 50 kg.ha-1 KCl).
Os fungicidas trifloxistrobina, propiconazole, azoxistrobina e ciproconazole foram
aplicados na forma de concentrado emulsionável no início das panículas (0,7550 L.ha-
1). Após a colheita, as amostras foram secas até 13% de umidade e beneficiadas na
forma de arroz natural polido e parboilizado polido em engenho de provas (Zacaria
PAZ1DTA). A parboilização foi realizada empregando uma relação massa de
grãos:água de 1:1,5 a 65 ± 2°C durante 5 horas, auto-clavados 116 ± 1°C a pressão
de 0,6 ± 0,05 kPa por 10 min, secos a 40 ± 1°C até atingir 13% de umidade. Os grãos
foram temperados por 24 a 48 horas para reduzir o desequilíbrio termo-hídrico antes
do descascamento. No beneficiamento, foram separadas as frações casca, farelo e
endosperma amiláceo, que foram encaminhadas ao Laboratório de Ciência de
Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande (FURG) onde foram moídas em
moinho de facas marca Tecnal modelo Te-631 e peneirados recolhendo a fração retida
na malha 32 (0,5 mm) para as determinações.
Os resultados foram avaliados estatisticamente por análise de variância
(ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p < 0,05), utilizando o
Software Statística v. 7.0.
41
2.3 Extração das micotoxinas
O método de extração observou o procedimento de QuEChERS proposto por
Anastassiades et al., (2003) para agrotóxicos e modificado por Hackbart, (2009) para
micotoxinas. Foram adicionados 20 mL de água e em seguida 20 mL de acetonitrila
em 10,00 g de arroz com casca moído. O meio foi acidificado com 0,20 mL de ácido
acético sendo agitado a 180 rpm por 5 min em mesa agitadora orbital. Em seguida, foi
adicionada uma mistura de sais (1,50 g de sulfato de magnésio e 0,85 g de acetato de
sódio) seguido por mais 5 min de agitação. A mistura foi centrifugada (5200 g, 15 min)
sendo removido 6 mL do sobrenadante para um tubo de centrifuga e adicionado 0,30 g
de sulfato de magnésio e 0,20 g de celite seguido de agitação manual por 1 minuto.
Foram removidos 3 mL do sobrenadante para um frasco âmbar, o solvente foi seco
sob atmosfera de nitrogênio e posteriormente realizada a quantificação das
micotoxinas utilizando um cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado com
detectores ultravioleta e fluorescência (HPLC-UV-FL).
2.4 Desenvolvimento do método cromatográfico
Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC) composto por
bomba LC-AT, desgaseificador DGU, controlador CBM-20A, detector SPD-20A, injetor
manual 7725i com válvula de injeção de 20 μL, detector FL-10AXL e software LC
Solution- Shimadzu (Figura 1).
Figura 1. Cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado aos detectores de
ultravioleta e fluorescência.
As colunas testadas para a separação das micotoxinas diferiram quanto à fase
estacionária, diâmetro de partícula e dimensões: Phenomenex Synergi Fusion RP 80A
(4 µm, 250 x 4,6 mm), Waters Spherisorb ODS2 Column (5 µm, 150 x 4,6 mm) e C-18
Bondesil (5 μm, 250 x 4,6 mm).
42
Para escolher a composição da fase móvel foram testadas diferentes
proporções de solventes, todos no método isocrático de eluição, sendo eles:
acetonitrila:água:metanol (80:10:10), acetonitrila:água:metanol (5:70:25) e
acetonitrila:água (7:93). A vazão foi escolhida com base em ensaios experimentais,
sendo testadas: 0,4; 0,5 e 0,6 mL.min-1. Os tempos da corrida cromatográfica testados
foram de 10, 8 e 7 min. O espectro de máxima absorção na região ultravioleta foi
obtido pela injeção do DON em três concentrações crescentes nos comprimentos de
onda de 220 e 218 nm. O aumento do sinal da micotoxina confirmou seu tempo de
retenção (tr). O comprimento de onda que proporcionou maior absorção pelo DON foi
o escolhido para a análise, sendo este detectado por sua absorção na região do
ultravioleta (UV).
Os testes de composição e vazão da fase móvel e tempo da corrida
cromatográfica para a ZEA foram realizados no detector de fluorescência (FL)
empregando o comprimento de onda de excitação e emissão de 270 nm e 455 nm,
respectivamente (SANTOS et al., 2010).
2.5 Validação do método analítico
Definidas as melhores condições cromatográficas para determinação de
micotoxinas no HPLC-UV-FL, foi realizada a validação do método para determinação
de DON e ZEA em arroz, empregando as seguintes figuras analíticas de mérito: limite
de detecção, limite de quantificação, curva analítica e linearidade, precisão (precisão
instrumental, repetibilidade, precisão intermediária), exatidão e seletividade
(INMETRO, 2003; ANVISA, 2003). A recuperação das micotoxinas foi confirmada em
LC-MS/MS.
2.5.1 Limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ)
Para a determinação do LODi e do LOQi do instrumento foram realizadas
injeções de soluções padrão em ordem decrescente de concentração (3; 2; 1; 0,1;
0,001 μg.mL-1 para DON e 1; 2; 0,2; 0,04 e 0,02 μg.mL-1 para ZEA) até que o pico do
sinal atingisse uma altura três vezes superior o sinal/ruído da linha de base, no tempo
de retenção do pico de interesse. Para determinação do LOQi, adotou-se dez vezes o
LOD (INMETRO, 2003).
2.5.2 Curva analítica e linearidade
A linearidade do instrumento foi avaliada pela construção da curva analítica
através de padronização externa com soluções analíticas nas concentrações (μg.mL-1):
43
0,5; 1; 3; 5; 8 para DON e 0,1; 0,2; 2; 5; 8 para ZEA, preparadas a partir de soluções
estoque de 10 μg.mL-1 de DON e 35 μg.mL-1 de ZEA, sendo as diluições feitas em
acetonitrila.
Os dados de regressão linear foram obtidos com auxílio do software do
equipamento. A partir destes dados foi avaliado o coeficiente de correlação linear (r)
do instrumento.
2.5.3 Precisão
A precisão instrumental foi avaliada a partir de 10 injeções sucessivas de uma
concentração do estudo da linearidade do instrumento (RIBANI et al., 2004).
A precisão do método foi avaliada em termos de repetibilidade (RSDr) e
precisão intermediária (RSDpi) após fortificação do arroz com casca moído em três
níveis (3, 5 e 7 vezes o LOD previamente determinado em HPTLC), sendo eles: 22;
36; 51 μg.kg-1 para DON e 23; 38; 53 μg.kg-1 para ZEA e extração das micotoxinas
com o procedimento QuEChERS. A repetibilidade (precisão intra-ensaio) foi avaliada
de acordo com recomendações da ICH (1995) e ANVISA (2003) por nove injeções
sendo três níveis de concentração do padrão em triplicata. Cabe lembrar que a
repetibilidade em ensaios químicos em um curto intervalo de tempo, muitas vezes não
representa a precisão dos resultados de um procedimento utilizado em rotina, assim
um estudo de precisão intermediária foi adotado para melhor representar a rotina
analítica (SABIN, 2007). A precisão intermediária foi obtida por diferentes analistas e
dias seguindo as mesmas recomendações que para a repetibilidade (ANVISA, 2003;
ICH, 1995).
Os resultados de precisão foram expressos através da estimativa do desvio
padrão relativo percentual (RSD%) ou coeficiente de variação (CV%) (Equações 1 e
2).
1
2
n
xxs (1)
x
sRSD
100.(%) (2)
Em que:
s = estimativa do desvio padrão absoluto; x = média das áreas (replicatas); x =
medida da área; n = número de repetições.
44
2.5.4 Exatidão (recuperação)
A exatidão foi avaliada pela injeção das mesmas amostras do estudo da
precisão (ANVISA, 2003; ICH, 1995) e calculada conforme Equação 3:
100.3
21(%)
C
CCR
(3)
Em que:
C1 = concentração determinada na amostra fortificada; C2 = concentração
determinada na amostra não fortificada; C3 = concentração adicionada do padrão
fortificação.
2.5.5 Seletividade
A seletividade foi avaliada comparando o sinal gerado pela injeção da matriz
isenta das micotoxinas e desta adicionada de padrão (RIBANI et al., 2004; SHABIR,
2003; SWARTZ, 1998; CODEX,1995; ICH, 1995).
2.6 Aplicação do método cromatográfico
As micotoxinas DON e ZEA foram extraídas por QuEChERS das amostras de
arroz natural e parboilizado com e sem aplicação de fungicidas no cultivo e
quantificadas em HPLC-UV-FL utilizando o método desenvolvido neste trabalho.
2.7 Confirmação da recuperação de DON e ZEA
Em cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado ao detector de massas
(LC-MS/MS) foi confirmada a recuperação de DON e ZEA extraídas de arroz com
casca moído da mesma forma como foi descrito no item 2.5.4, extraindo as
micotoxinas pelo procedimento QuEChERS. A coluna utilizada foi Water x terra MS
C18 (3,0 x 50 mm d.i. 3,5 μm); a fase móvel consistiu em acetonitrila:água ultra pura
milli-Q (60:40) com vazão de 0,4 mL.min-1 durante 7 min. A análise realizada por LC-
MS/MS teve como parâmetros para o detector de massas: voltagem do capilar 4 KV,
voltagem do cone 4 KV e temperatura da fonte 120°C.
45
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1 Desenvolvimento do método analítico
As condições cromatográficas padronizadas para quantificação das
micotoxinas encontram-se na Tabela 2.
Tabela 2. Condições cromatográficas para as micotoxinas DON e ZEA.
Parâmetros HPLC-UV-FL
Coluna C-18 Bondesil (5 μm, 250 x 4,6 mm)
Fase Móvel Acetonitrila:Água Ultra Pura Milli-Q (7:93)
Vazão da fase móvel 0,6 mL.min-1
Alça de injeção 20 L
Tempo de corrida 7 min
Detector DON Ultravioleta (UV), 218 nm
Detector ZEA Fluorescência (FL), 270 nm (excitação), 455 nm (emissão)
tr DON 2,5 min
tr ZEA 5,5 min
As colunas utilizadas em HPLC geralmente possuem partículas porosas com
tamanho igual ou inferior a 10 μm (JARDIM et al., 2006). As colunas de fase ligada
(cadeia de hidrocarboneto saturado com 2 a 30 carbonos), como é o caso da C-18 e
ODS, são classificadas de fase reversa por serem apolares (lipofílicas) (SOARES,
2006) e são interessantes para determinação de compostos pouco polares como é o
caso das micotoxinas deste estudo.
A coluna mais adequada para separação de DON e ZEA em HPLC UV-FL nas
condições do experimento possuía diâmetro de partícula 5 μm, maior comprimento (25
cm) e fase estacionária C18. A diminuição do tamanho da partícula da fase
estacionária acarreta um aumento de pressão na coluna aumentando a eficiência de
separação dos picos (LANÇAS, 2008), pois na medida que aumenta o tamanho da
partícula, aumenta a profundidade dos poros e, consequentemente, os componentes
da amostra têm seus tempos de retenção aumentados, pois penetram mais nos poros,
bem como o alargamento da banda. Neste caso o tempo de corrida foi relativamente
pequeno demonstrando o efeito benéfico do pequeno diâmetro das partículas da fase
estacionária.
46
3.2 Validação do método analítico
Na Tabela 3 são apresentados os limites de detecção e quantificação do
instrumento HPLV-UV-FL (LODi, LOQi) e do procedimento de QuEChERS modificado
(LODm, LOQm) para as micotoxinas DON e ZEA.
Tabela 3. Limites de detecção e quantificação instrumental (μg.L-1) e do método de
QuEChERS modificado (μg.kg-1).
Micotoxina LODi (μg.L-1) LOQi (μg.L-1) LODm (μg.kg-1) LOQm (μg.kg-1)
Deoxinivalenol 100 1000 30 300
Zearalenona 20 200 6 60
LODi = limite de detecção do HPLC-UV-FL; LOQi = limite de quantificação do HPLC-UV-FL;
LODm = Limite de detecção para QuEChERS; LOQm = limite de quantificação para QuEChERS.
Outros autores como Omurtag et al., (2005) quantificaram DON por HPLC-UV e
obtiveram LODi de 125 μg.L-1. Dors, (2010) quantificou DON, ZEA e outras
micotoxinas em HPLC-DAD obtendo LOQi de 50 μg.L-1 para DON e 1 μg.L-1 para ZEA.
Esses dados mostram que o limite proporcionado pelos detectores utilizados neste
trabalho foram superiores aos registrados em DAD, mas ainda assim adequado para
determinações destas micotoxinas, pois permitem observar os limites estabelecidos
pelos órgãos de legislação e fiscalização de diferentes países que são parceiros
comerciais no mercado de grãos. Além disso, o protocolo de extração permite a
concentração da amostra, propiciando um menor limite de detecção do método. Uma
alternativa para reduzirmos o limite de detecção do instrumento seria realizar a
derivatização das micotoxinas, dessa forma estaríamos adequando mais o analito aos
detectores do instrumento. Porém, esta seria mais uma etapa no processo,
aumentando o tempo da análise, reduzindo a recuperação dos analitos e, além disso,
gerando mais resíduos, o que vem em desfavor da proposta desse estudo.
Os dados da determinação de linearidade estabelecidos através de calibração
externa encontram-se na Tabela 4.
47
Tabela 4. Resultados obtidos para calibração externa das micotoxinas DON e ZEA no
sistema HPLC-UV-FL.
Micotoxina Curva analítica no solvente r
Deoxinivalenol y= 16165,02 x 0,985
Zearalenona y= 5504,3 x 0,982
r = coeficiente de correlação.
O modelo de regressão linear foi adequado para a determinação das
micotoxinas em estudo e pode ser mostrado pelos coeficientes de correlação (r) na
Tabela 4, pois foram maiores que 0,90, conforme indicação do INMETRO, (2003) e
outros trabalhos (DORS, 2010; HACKBART, 2009; CELLI, 2006). Os valores de
precisão instrumental (RSD%) foram 1,3% para DON e 4,9% para ZEA. A precisão do
método de extração das micotoxinas (QuEChERS) foi avaliada através dos estudos de
repetibilidade (RSDr) e precisão intermediária (RSDpi) obtendo-se um coeficiente de
variação na faixa entre 0,2 a 8,1% e 1,5 a 8,1%, respectivamente. Os valores de RSDr
e RSDpi estão apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Repetibilidade (RSDr) e precisão intermediária (RSDpi) do método
QuEChERS.
Precisão (%) Concentração DON (μg.kg-1) Concentração ZEA (μg.kg-1)
22 36 51 23 38 53
RSDr 8,1 1,6 0,9 0,6 0,2 0,3
RSDPI 8,1 1,5 3,8 4,1 3,8 5,9
RSDr = Repetibilidade; RSDpi = precisão intermediária.
Rodrigues, (2010), empregando procedimento de QuEChERS para extração de
agrotóxicos, obteve repetibilidade (RSDr) e precisão intermediária (RSDpi) na faixa de
3,3 a 20,0% e 2,0 a 20,0%, respectivamente, sendo maior que a encontrada para as
micotoxinas de interesse do presente trabalho. Tendo em vista que para as
micotoxinas a repetibilidade foi maior, mais promissor é o método QuEChERS para
esses analitos, além de sua facilidade, rapidez e quantidade mínima de resíduos
químicos gerados.
Cabe salientar que tanto a precisão quanto a exatidão dos métodos analíticos
são dependentes da matriz, da concentração do analito e da técnica de análise, sendo
que a precisão aceitável varia entre 2 e 20% (SANCO, 2007; RIBANI et al., 2004).
48
Diante disso, os resultados encontrados no presente trabalho mostram que a
metodologia de extração e detecção dos analitos foi adequada para avaliar a
ocorrência dessas micotoxinas em arroz.
Utilizando método QuEChERS para extração de ocratoxina A e citrinina de
arroz, Hackbart, (2009) obteve valores de repetibilidade (RSDr) entre 1,3 e 1,6% para
citrinina e 0,9 e 3,2% para ocratoxina A, confirmando a aplicabilidade da extração para
micotoxinas com a mesma eficiência que o originalmente proposto por Anastassiades
et al., (2003) para agrotóxicos.
A eficiência do procedimento de extração do método de QuEChERS foi
demonstrada pelos valores de recuperação que foram para DON 81,6% e para ZEA
86,1%. O mesmo extrato foi aplicado em LC-MS/MS e mostrou recuperações médias
para as micotoxinas de 70% para DON e 82,4% para ZEA. Esses resultados foram
próximos de 100% e são aceitáveis em vista de sua exatidão e recuperação (ANVISA,
2003). Além disso, no caso da exatidão as recuperações devem estar entre 70 e 120%
(RIBANI et al., 2004; SANCO, 2003) o que pôde ser observado.
No trabalho de Zachariasova et al., (2010), foi realizada extração de DON, ZEA
e outras micotoxinas de cereais pelo método de QuEChERS as quais foram
detectadas em UPLC/TOF-MS obtendo recuperação para DON em milho, trigo e
cavada de 89,6 (±17,8), 85,4 (±1,7), e 96,7 (±6,0) e para ZEA de 99,7 (±15,0), 88,0
(±29,4), 88,7 (±7,5), respectivamente.
Dors, (2010) em seu estudo, obteve recuperação de DON e ZEA de 77,7 e
82,3%, respectivamente, empregando método Tanaka (2001) para extração das
micotoxinas que foram quantificadas em HPLC-DAD, e repetibilidade na faixa de 11 a
15% e 3 a 6%, respectivamente e precisão intermediária na faixa de 12 a 15% e 2 a
4%. Esses resultados mostram que a extração de micotoxinas empregando o método
de QuEChERS obtém melhores resultados de exatidão e precisão quando comparado
a extração realizada por Tanaka (2001).
O método de Tanaka (2001) que é rotineiramente aplicado para extração de
micotoxinas (SOUZA, 2008; FEDDERN et al., 2007) utiliza cerca de 6 vezes mais
solvente que o de QuEChERS. Além disso, com o QuEChERS é possível fazer até 8
amostras em 30 min enquanto que com o Tanaka (2001) são feitas 8 amostras em 6
horas, expondo o analista a um maior tempo de contato com o solvente, além de gerar
maior volume de resíduos.
O tipo de detecção empregado em cromatografia é um fator que influencia nos
níveis de recuperação do método, porém os valores obtidos neste trabalho foram
semelhantes aos estudos acima citados, demonstrando que o detector apresenta
performance comparável a outros empregados.
49
A comparação da matriz isenta das micotoxinas e da matriz fortificada mostrou
que nenhum interferente eluiu no tempo de retenção delas, ficando estas bem
separadas dos demais compostos presentes na amostra, demonstrando que o método
de extração de micotoxinas utilizado é também seletivo.
3.3 Aplicação do método analítico
Houve diferença significativa (5%) entre a contaminação com DON no arroz
parboilizado tratado e não tratado com fungicidas, enquanto para o arroz natural não
houve diferença (Tabela 6). Para ZEA foram constatados maiores níveis no arroz
parboilizado cultivado sob as duas formas.
Tabela 6. Teste de diferença de médias das micotoxinas DON e ZEA (Tukey) no grão
de arroz (endosperma amiláceo).
Arroz (endosperma
amiláceo)
Tratamento com
fungicidas DON (μg.g-1) ZEA (μg.g-1)
Natural Não 0,2ab 11,3b
Natural Sim 0,2 ab 9,2b
Parboilizado Não 0,0b 18,3ª
Parboilizado Sim 0,4a 16,9ª
Esses resultados sugerem que a parboilização favoreceu a migração de
zearalenona para o interior do grão. Para deoxinivalenol os resultados foram
aleatórios, o que dificulta uma conclusão sobre o perfil.
Dors et al., (2009) observaram, ao avaliar a migração de micotoxinas para o
endosperma amiláceo durante o processo de parboilização, que as condições de
processo (tempo de encharcamento e autoclavagem) e nível de fortificação
influenciavam de maneira diferente na migração das micotoxinas DON, ZEA e AFA B1.
Nesse mesmo trabalho foi verificado que o processo de parboilização favorece a
migração de micotoxinas como DON e ZEA para o interior do grão de arroz. Coelho et
al., (1999) também demonstraram que ocorria a migração das aflatoxinas para o
endosperma amiláceo do grão de arroz durante o processo de parboilização.
4 CONCLUSÃO
A extração de micotoxinas de Fusarium empregando o procedimento de
QuEChERS foi adequada para quantificação de DON e ZEA em arroz, pois os
50
indicativos de mérito estão de acordo com recomendações de órgãos oficiais, sendo
os limites de detecção para o método e instrumento de 30 µg.kg-1 e 100 µg.L-1 para
DON e de 6 µg.kg-1 e 20 µg.L-1 para ZEA e os limites de quantificação de 300 µg.kg-1 e
1000 µg.L-1 para DON e de 60 µg.kg-1 e 200 µg.L-1 para ZEA, respectivamente. A
precisão instrumental foi de 1,3% para DON e 4,9% para ZEA. A repetibilidade (RSDr)
e precisão intermediária (RSDpi) foram de 0,2 a 8,1% e 1,5 a 8,1%, respectivamente. A
recuperação foi de 81,6% para DON e de 86,1% para ZEA. O processo de
parboilização favoreceu a contaminação com ZEA no endosperma. Os elevados níveis
de micotoxinas encontrados no arroz atentam para a importância de se conhecer os
fatores que estimulam a sua produção com intuito de atuar em seu controle.
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56
ARTIGO 2
57
CONTAMINAÇÃO FÚNGICA E OCORRÊNCIA DE MICOTOXINAS NAS FRAÇÕES
DO BENEFICIAMENTO DO ARROZ
Laboratório de Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, Universidade
Federal do Rio Grande (FURG), Rua Engenheiro Alfredo Huch, 475, CEP 96201-900,
Caixa Postal 474, Rio Grande, RS, Brasil
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo verificar a contaminação fúngica e a produção de micotoxinas em diferentes frações de arroz polido e parboilizado cultivado em campos experimentais do IRGA com e sem emprego de fungicidas bem como verificar os principais gêneros de fungos presentes no arroz pós-colheita. A glicosamina foi utilizada como indicativo de contaminação fúngica. A extração das micotoxinas DON e ZEA de arroz e suas porções foi realizada pelo método QuEChERS. A quantificação das micotoxinas foi realizada em cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado com detector ultravioleta e fluorescência (HPLC-UV-FL). Foi realizada a determinação dos principais gêneros fúngicos presentes nas amostras de arroz com casca. Os maiores teores de glicosamina foram no farelo e casca. A micotoxina DON se concentrou na casca (0,8 a 5,7 µg.g-1) e ZEA no farelo (10,6 a 33,1 µg.g-1), sendo que apareceram contaminando 92 e 100% das amostras analisadas, respectivamente. Os fungicidas aplicados nas sementes de arroz foram eficientes para o controle de Fusarium, cujos percentuais foram de 7,7 e 14,5 nas amostras cultivadas tradadas e não tratadas com eles, respectivamente. A frequência de ocorrência e os níveis detectados das micotoxinas sugerem que não houve inibição da produção delas. Palavras-chave: deoxinivalenol, zearalenona, QuEChERS, glicosamina.
58
ABSTRACT
This study aimed to determine the fungal contamination and mycotoxin production in different fractions of milled rice and parboiled rice cultivated in experimental fields of the IRGA with and without use of fungicides as well as verifying the main genera of fungi present in rice post-harvest. Glucosamine was used as an indicator of fungal contamination. The extraction of mycotoxins DON and ZEA in rice and their portions were analyzed by QuEChERS. The quantification of mycotoxins was performed in high performance liquid chromatography coupled with fluorescence and ultraviolet detection (HPLC-UV-FL). Was performed to determine the main genera of fungi present in samples of paddy. The highest levels of glucosamine were in the bran and husk. The mycotoxin DON focused on the shell (0.8 to 5.7 μg.g
-1) and ZEA in the bran (10.6 to
33.1 μg.g-1), and appeared infecting 92 and 100% of the samples analyzed respectively. Fungicides applied as seed rice were effective in controlling Fusarium, whose percentages were 7.7 and 14.5 in the samples grown trades and not dealt with them, respectively. The frequency of occurrence and levels of mycotoxins detected suggest that there was no inhibition of their production. Keywords: deoxynivalenol, zearalenone, QuEChERS, glicosamine.
59
1 INTRODUÇÃO
O arroz, durante todo seu ciclo no campo, é afetado por doenças que reduzem
a produtividade e a qualidade dos grãos, pois o seu cultivo, aliado as condições
favoráveis de clima e manejo da cultura predispõe a lavoura ao ataque de pragas
(NUNES et al., 2003). Para controlá-las, são empregados cuidados no manuseio da
cultura e colheita empregando métodos culturais, mecânicos e químicos, sendo este
último através da utilização de agrotóxicos (NETO, 2008).
Os fungos que invadem sementes e grãos são divididos em dois grupos:
fungos do campo, que infectam o produto ainda no campo e fungos de
armazenamento, que invadem a semente ou grão durante o armazenamento. A
distinção entre fungos de campo e de armazenamento não é baseada na classificação
taxonômica, mas sim de acordo com as condições ambientais e/ou ecológicas que
favorecem a multiplicação dos mesmos. Também não é absoluta, pois pode ser
influenciada por hábitos de crescimento e local para os danos ocorrerem. Os fungos
do campo, como Cephalosporium, Fusarium, Gibberella, Nigrospora,
Helminthosporium, Alternaria e Cladosporium requerem um teor de umidade de
equilíbrio e/ou umidade relativa de 90 a 100% para crescerem (MÁRCIA & LAZARI,
1998). A infecção por Fusarium spp., que inclui espécies fitopatogênicas, pode resultar
na redução do rendimento da cultura e na baixa qualidade dos grãos pelas
características físicas ou pela produção de micotoxinas (BOTTALICO, 1998) como a
zearalenona e os tricotecenos, antes ou imediatamente após a colheita, dependendo
da espécie e cepa (SUTY-HEINZE & DUTZMANN, 2004).
Em áreas cultivadas são adotadas medidas preventivas contra diferentes
pragas, sendo no caso de fungos a utilização de fungicidas, porém, a resposta à
aplicação desses produtos é diferente para cada cultivar e é influenciada pelas
condições metereológicas durante o desenvolvimento da cultura, pela reação de
resistência da cultivar, pela distribuição do principio ativo nos tecidos vegetais e pela
própria susceptibilidade da espécie fúngica contaminante (DALLAGNOL et al., 2006).
Os fungicidas são compostos químicos tóxicos aos seres humanos e animais
de criação por serem cancerígenos, mutagênicos, teratogênicos e mimetizadores de
hormônios, além de possuírem uma grande capacidade de persistência no meio
ambiente (ALISTER, 2006). Estudos têm mostrado que a aplicação de fungicidas na
cultura está relacionada com a manifestação do potencial toxigênico da micota,
aumentando em alguns casos, os níveis de micotoxinas de Fusarium como DON
(HÝSEK et al., 2005) e ZEA (DORS, 2010), portanto o monitoramento do efeito do uso
de fungicida e produção de micotoxinas na cultura de arroz é importante para a
60
tomada de providências especialmente diante do grande consumo mundial desse
cereal que, se contaminado, pode resultar em danos agudos ou crônicos à população
humana ou de animais de criação.
No caso de contaminação de uma matriz por fungos filamentosos, sua
estimativa direta é difícil devido à capacidade desses micro-organismos em
penetrarem profundamente nas partículas do meio onde se desenvolvem. Em função
deste fato os métodos indiretos baseados na atividade biológica e análise de
constituintes da célula fúngica têm sido descritos, destacando-se a determinação da
atividade enzimática, ergosterol, glicosamina e proteínas sendo que cada um tem suas
peculiaridades (PANDEY et al., 2001; LONSANE et al., 1985).
Alguns autores mostraram que a atividade enzimática e ergosterol variam de
forma bastante distinta em cada espécie e ao longo do desenvolvimento do fungo
(CARVALHO, 2004; BARAJAS-ACEVES et al., 2002; DESGRANGES, 1991). A
determinação de proteínas tem como principal fonte de erro a presença de nitrogênio
nem sempre de origem fúngica, presente no substrato, especialmente quando se trata
de matriz alimentar (DALSENTER, 2005). A medida da glicosamina tem demonstrado
ser um bom indicador para estimativa do desenvolvimento fúngico uma vez que está
presente nos fungos e não é encontrada em materiais vegetais empregados como
alimentos ou quando são estimados em substratos submetidos a processos
fermentativos (MENESES, 2006; MITCHELL et al., 2004; NAGEL et al., 2001;
SCOTTI, 2001; ROCHE et al., 1993; DESGRANGES et al., 1991). Todavia, fontes de
carbono utilizadas em fermentação com estruturas químicas semelhantes a da
glicosamina, podem interferir no resultado obtido. Para minimizar esse efeito a mesma
determinação deve ser realizada na biomassa não fermentada ou empregando
procedimentos analíticos que considerem o efeito da matriz (TOMASELLI-SCOTTI et.
al., 2001; PENMAN et al., 2000).
O objetivo desse trabalho foi verificar a contaminação fúngica e
micotoxicológica de arroz e seus derivados cultivados com e sem emprego de
fungicida através da determinação de glicosamina, micotoxinas e dos principais
gêneros fúngicos presentes em amostras recém colhidas.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Amostras
O arroz foi cultivado em campos experimentais do Instituto Rio Grandense do
Arroz (IRGA), localizado em Cachoeirinha, Rio Grande do Sul, Brasil. A cultivar
61
utilizada foi a BR-IRGA 417 semeada no sistema de cultivo mínimo, com densidade de
semeadura de 100 kg.ha-1. A adubação de base foi com 400 kg.ha-1 de N:P:K
05:20:30. A adubação nitrogenada em cobertura foi com 80 kg.ha-1 de nitrogênio, no
arroz com 8 folhas antes do início da diferenciação do primórdio da panícula. Houve
aplicação dos herbicidas clomazona (600 kg.ha-1) antes da primeira adubação de
cobertura e bispiribaque de sódio (150 kg.ha-1) após a segunda adubação de
cobertura. Foram aplicados os inseticidas carbofurano e fipronil (4 kg.ha-1) após a
terceira adubação de cobertura (50 kg.ha-1 uréia e 50 kg.ha-1 KCl). Os fungicidas
trifloxistrobina, propiconazole, azoxistrobina e ciproconazole foram aplicados na forma
de concentrado emulsionável no início das panículas (0,7550 L.ha-1). Após a colheita
as amostras foram secas até 13% de umidade e beneficiadas na forma de arroz
natural polido e parboilizado polido em engenho de provas (Zacaria PAZ1DTA). A
parboilização foi realizada empregando uma relação massa de grãos:água de 1:1,5 a
65 ± 2°C durante 5 horas, auto-clavados 116 ± 1°C a pressão de 0,6 ± 0,05 kPa por 10
min, secos a 40 ± 1°C até atingir 13% de umidade. Os grãos foram temperados por 24
a 48 horas para reduzir o desequilíbrio termo-hídrico antes do descascamento. No
beneficiamento, foram separadas as frações casca, farelo e endosperma amiláceo,
que foram encaminhadas ao Laboratório de Ciência de Alimentos da Universidade
Federal do Rio Grande (FURG) onde foram moídas em moinho de facas marca Tecnal
modelo Te-631 e peneirados recolhendo a fração retida na malha 32 (0,5 mm) para as
determinações.
2.2 Micota presente no grão recém colhido
Pelo Laboratório de Análises de Sementes da estação experimental do IRGA,
as amostras de arroz com casca foram submetidas ao teste do "Papel Filtro com
Congelamento" conforme descrito por Neergaard, (1979), onde foram utilizadas 400
sementes por amostra distribuídas em 16 repetições de 25 sementes. O substrato
utilizado foi papel mata-borrão (ou papel filtro), umedecido com água destilada,
colocando-se três folhas por caixa gerbox (caixa plástica transparente, medindo 11 x
11 x 3 cm com tampa). Após, as gerboxes foram colocadas em freezer a temperatura
de -20°C por 24 horas e em seguida em uma incubadora BOD por sete dias a
temperatura de 25°C e fotoperíodo de 12 horas. A identificação dos gêneros fúngicos
(Bipolaris, Curvularia, Phoma, Alternaria padwickii, Fusarium, Alternaria alternata,
Nigrospora, Epicoccum, Penicillium, Microdochium, Cercospora, Rhizoctonia,
Aspergillus) foi realizada de acordo com as características de Alcorn (1988), onde
foram observadas a forma do conídio, a germinação, a posição de emergência e a
62
direção do crescimento do tubo germinativo basal. Foi também estimado o percentual
de ocorrência de cada gênero.
2.3 Indicativos de mérito e determinação de glicosamina
O procedimento de extração de glicosamina foi executado para determinar os
indicativos de performance: curva analítica, linearidade, limite de quantificação e
recuperação. A curva padrão foi construída entre as concentrações de 0,01 a 0,20 g.L-
1 de glicosamina em água. A recuperação do método foi determinada em níveis de
fortificação que variaram de 1 a 3 mg de glicosamina em triplicata.
A determinação de glicosamina foi realizada segundo Aidoo et al., (1981). Para
tal, foram adicionados 5 mL de HCl 6 M à 1 g de amostra, colocando a mistura em
banho de água fervente por 2 horas. Após o resfriamento, a amostra foi filtrada. Foi
transferido 1 mL do filtrado para balão de 25 mL, adicionando solução alcoólica de
fenolftaleína 0,5% (p.v-1) e neutralizando com solução de NaOH 3 N. Foi realizada uma
titulação reversa com solução de KHSO4
1% (p.v-1), até que a coloração rosa
desaparecesse e o volume do balão foi completado com água destilada. Para
quantificação da glicosamina, 3 mL do extrato e 1 mL de solução de acetil acetona em
Na2CO
3 0,5 N (1 mL de acetil acetona em 50 mL de solução Na2CO3 0,5 N) foram
colocados em um tubo de ensaio levando a mistura em banho de água fervente por 20
min. Após o resfriamento das amostras, foram adicionados 6 mL de etanol e 1 mL de
reagente de Erlich (2,67 g de p-dimetilaminobenzaldeído em um volume de 30 mL de
etanol:ácido clorídrico 1:1, completou-se o volume em balão de 50 mL com água
destilada). Os tubos foram incubados a 65ºC por 10 min, resfriados, e a absorbância
lida em espectrofotômetro (Femto 700 Plus, Brasil) a 530 nm.
2.4 Extração e quantificação das micotoxinas
O método de extração utilizado foi de QuEChERS proposto por Anastassiades
et al., (2003) para agrotóxicos e modificado por Hackbart, (2009) para micotoxinas.
Foram adicionados 20 mL de água e em seguida 20 mL de acetonitrila em 10 g de
arroz com casca moído. O meio foi acidificado com 0,2 mL de ácido acético sendo
agitado a 180 rpm por 5 min em mesa agitadora orbital. Foi adicionada uma mistura de
sais (1,50 g de sulfato de magnésio e 0,85 g de acetato de sódio) e agitado por mais 5
min. A mistura foi centrifugada (5200 g, 15 min) sendo removidos 6 mL do
sobrenadante para um tubo de centrifuga e adicionado 0,30 g de sulfato de magnésio
e 0,20 g de celite seguido de agitação manual por 1 minuto. Do sobrenadante foram
63
removidos 3 mL para um frasco âmbar e o solvente foi seco sob atmosfera de
nitrogênio. Previamente a determinação cromatográfica, a amostra foi ressuspendida
em 1 mL de acetonitrila grau HPLC J. T. Baker (Brasil).
Para quantificação das micotoxinas DON e ZEA no arroz e seus derivados foi
utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC) composto por bomba LC-
AT, desgaseificador DGU, controlador CBM-20A, detector SPD-20A, injetor manual
7725i com válvula de injeção de 20 μL, detector RF-10AXL e software LC Solution
Shimadzu.
As condições cromatográficas utilizadas foram fase móvel composta de
água:acetonitrila (93:7), fluxo de 0,6 mL.min-1 por 7 min e coluna C18 Bondesil (4,6
mm x 25 cm x 5 μm). O DON foi detectado em ultravioleta (UV) com comprimento de
onda de 218 nm e a ZEA em detector de fluorescência (FL) no comprimento de onda
de excitação e emissão de 270 e 455 nm, respectivamente.
2.5 Análise estatística
Os resultados dos teores de glicosamina e de micotoxinas obtidos nas frações
do arroz sob diferentes condições de cultivo foram avaliados pela comparação de
médias de Tukey utilizando o Software Statistica v. 7. As diferenças foram
consideradas significativas quando p < 0,05.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A equação da curva de calibração da glicosamina foi y = 0,0412 x, onde x foi a
concentração em µg.mL-1 e y a absorbância. O coeficiente de correlação foi de 0,9959,
demonstrando a linearidade da relação nas concentrações da curva analítica. O limite
de quantificação foi de 26 µg e a recuperação de 112%.
Foi verificada diferença significativa (5%) na glicosamina entre as diferentes
porções do arroz (parboilizado e polido), sendo os maiores níveis encontrados no
farelo (4,4 mg.g-1 ± 0,8) e na casca (3,6 mg.g-1 ± 0,8), seguido de menor teor no
endosperma (1,8 mg.g-1 ± 0,9) (Tabela 1), sugerindo que a contaminação se da nesta
ordem, pois o usual é que os micro-organismos e outras pragas se situem nas porções
mais externas do grão (AMATO & ELIAS, 2005; AMATO et al., 2002). A casca protege
o grão contra infecção no campo, porém os resultados sugerem que os fungos
produziram celulases e lignases para desenvolvimento na casca e posteriormente no
farelo, obtendo nutrientes para aumento da biomassa. Além disso, a maior
contaminação no farelo pode ser atribuída a danos na casca e umidade durante o
64
cultivo, uma vez que o arroz deste estudo foi cultivado na forma irrigada e no período
de formação do grão a água de irrigação não foi drenada.
Tabela 1. Teores de glicosamina, umidade e micotoxinas nas diferentes porções do
grão de arroz.
Porção
do arroz
Tipo de
beneficiamento Fungicida
Glicosamina
(mg.g-1
)
Umidade
(%)
DON
(μg.g-1
)
ZEA
(μg.g-1
)
Endosperma Polido Não 1,1f 15,4
a 0,2
b 11,3
de
Endosperma Polido Sim 1,3ef 15,5
a 0,2
b 9,2
e
Endosperma Parboilizado Não 1,9def
15,4a n.d.
b 18,3
cde
Endosperma Parboilizado Sim 3,0bcd
13,7b 0,4
ab 16,9
cde
Casca Polido Não 3,4bcd
14,8a 4,3
ab 20,9
bcd
Casca Polido Sim 2,9cde
13,0bd
5,7a 25,6
abc
Casca Parboilizado Não 3,6bcd
13,3b 0,8
ab 9,0
e
Casca Parboilizado Sim 4,7ab
12,2cd
0,9ab
9,4de
Farelo Polido Não 4,5abc
13,2b 1,2
ab 31,6
ab
Farelo Polido Sim 5,5a
12,7bcd
1,7ab
33,1a
Farelo Parboilizado Não 3,8abc
12,0ce
0,2b 15,5
cde
Farelo Parboilizado Sim 3,9abc
11,1e 0,5
ab 10,6
de
n.d. = não detectado; letras iguais = teores não diferem estatisticamente; letras diferentes =
diferem estatisticamente.
Não houve diferença entre os teores de glicosamina determinados nas
amostras provenientes de arroz tratado e não tratado com fungicidas, sugerindo que a
aplicação desse agrotóxico não inibiu o desenvolvimento fúngico de forma marcante,
ou pelo menos não reduziu a produção do composto da parede microbiana.
O endosperma e a casca do arroz parboilizado apresentaram conteúdos de
glicosamina significativamente maiores que o arroz polido, mesmo sendo ambos
cultivados com emprego de fungicidas (Tabela 1). No entanto, para o farelo não foi
65
observada diferença quando esse foi parboilizado ou não, o que indica que o
tratamento térmico não inativa os esporos fúngicos. Durante a maceração, no
processo de parboilização, ocorre o inchamento do grão e possivelmente a ruptura da
casca, ainda o período de arrefecimento prévio ao polimento pode propiciar o
desenvolvimento de esporos microbianos, explicando a maior contaminação fúngica
no endosperma do arroz parboilizado quando comparado ao arroz polido.
Na Tabela 1 também estão registrados os níveis das micotoxinas de Fusarium
determinadas. O DON apresentou-se sempre em menores níveis que ZEA e
concentrando-se principalmente na casca. A parboilização do arroz não afetou os
níveis de DON presente nas frações internas do grão. A ZEA esteve presente em
níveis mais altos que DON, especialmente no farelo.
A maior contaminação com DON na casca do arroz polido tratado com
fungicida no campo indicou que a aplicação deles pode ter funcionado como agente
estressor do fungo. Essa contaminação foi maior estatisticamente em relação à
constatada no endosperma do arroz polido tratado ou não, endosperma e farelo
parboilizado, provenientes de grãos não tratados com fungicidas durante o cultivo. Nas
demais frações não foram verificadas diferenças significativas nos teores desta
micotoxina.
As maiores concentrações de ZEA foram encontradas no farelo e na casca do
arroz polido tratado com fungicida e no farelo do arroz polido não tratado. O processo
de parboilização não afetou a contaminação do endosperma amiláceo. Dentre as
amostras avaliadas, 92% estavam contaminadas com DON e 100% com ZEA.
Também Dors, (2010) analisando amostras de arroz cultivados em condições
semelhantes a deste trabalho, encontrou contaminação com deoxinivalenol e
zearalenona em 87% delas em outras safras, e destacou que todas as frações
provenientes de grãos tratados com fungicidas estavam contaminadas com pelo
menos uma destas micotoxinas.
Nunes et al., (2003) realizando um levantamento micotoxicológico em amostras
de arroz destinado ao consumo humano verificaram que as de arroz parboilizado e
arroz polido apresentavam contaminação com deoxinivalenol (266 e 300 g.kg-1),
zearalenona (559, 1117 e 1955 g.kg-1) e ocratoxina A (104 e 128 g.kg-1). Dors et al.,
(2009) observaram, ao avaliar a migração de micotoxinas para o endosperma
amiláceo durante o processo de parboilização, que havia relação entre as condições
de processo (tempo de encharcamento e autoclavagem) e nível de fortificação. No
entanto a migração de cada tipo de micotoxina respondia de forma diferente a esses
parâmetros.
66
A legislação sobre micotoxinas varia de acordo com o país, sendo que o nível
aceitável para deoxinivalenol varia de 200 a 2.000 µg.kg-1 para alimentos destinados
ao consumo humano. No Brasil, os níveis são regulados pela Resolução RDC N° 7 de
fevereiro de 2011. A regulação tem aplicação imediata para aflatoxinas M1, B1, B2, G1
e G2, ocratoxina A, deoxinivalenol, fumonisina (B1+ B2), zearalenona e patulina sendo
que a regulação para aplicação em outros produtos alimentícios e em níveis mais
rígidos para os já regulados com aplicação em 2012, 2014 e finalmente em 2016. Para
DON, a regulação brasileira prevê um limite máximo de 750 µg.kg-1 para arroz
beneficiado e derivados e 200 µg.kg-1 para alimentos a base de cereais para
alimentação infantil e para ZEA um limite máximo de 20 µg.kg-1 para alimentos a base
de cereais para alimento infantil. Na Europa, foi estabelecido 1.250 µg.kg-1 como limite
máximo permitido para cereais destinados ao consumo humano para DON e 100
µg.kg-1 para ZEA (COMMISSION REGULATION, 2005).
Os níveis e a frequência das micotoxinas encontradas neste trabalho
demonstram a importância de se conhecer os fatores que favorecem a produção delas
para atuar em seu controle, haja visto que os valores detectados estão acima dos
limites mundias estabelecidos para DON e ZEA. Embora a ênfase deste estudo tenha
sido a presença ou não de fungicidas durante o cultivo, variáveis ambientais como
clima, água de irrigação, micro-organismos antagonistas e uso de outros agrotóxicos
podem ter atuado como agentes estressantes para as espécies fúngicas toxigênicas e
desencadeado a produção das micotoxinas. Autores como Tibola et al., (2009)
também detectaram níveis de DON (1335,1 µg.kg-1) e ZEA (143,0 µg.kg-1) acima do
permitido pela legislação européia, neste caso em trigo e atribuíram o fato à elevada
frequência de precipitações no período da floração e da colheita, o que ocasionou
infecção com Fusarium nos grãos e a consequente produção de micotoxinas. Cabe
salientar que fenômeno parecido foi verificado na região do cultivo do arroz deste
trabalho durante a safra 2009-2010, quando os índices pluviométricos foram mais
elevados que o usual nesta época do ano.
Hýsek et al., (2005) verificaram que a produção de DON foi fortemente
dependente da pré-cultura, da variedade da cevada e do tratamento com fungicidas
sendo que o tratamento com azoxistrobina, em algumas variedades, propiciou maior
contaminação com DON que quando tratada com tebuconazole e em qualquer caso
sempre a maior contaminação ocorria no cereal tratado com fungicida. Blandino et al.,
(2006), verificaram que o tratamento de grãos de trigo com fungicidas do grupo dos
triazóis (tebuconazole e procloraz) não afetava a produção de DON quando
comparado com o tratamento controle. Porém, quando foi utilizada uma mistura de
fungicidas do grupo dos triazóis e estrubirulinas ocorria um aumento na produção da
67
micotoxina, particularmente nos anos mais frios e úmidos. Similar as condições a que
foram submetidos os cultivos deste estudo.
Ramirez et al., (2004) verificaram que o tratamento de meios a base de trigo (in
vitro) com fungicidas (tebuconazole, propiconazole, epoxiconazole, procloraz e
azoxistrobina) em alguns casos estimulava e em outros reduzia a produção de DON, e
que a produção era influenciada por complexas interações entre atividade de água,
temperatura, concentração de fungicidas e tempo de incubação do fungo. Matthies et
al., (1999) verificaram que a produção de 3 acetil DON por F. graminearum em
presença de tebuconazole (0,1 a 0,5 µg.mL-1) foi maior quando comparado ao mesmo
experimento onde foi realizado o cultivo submerso. Em contraste, a toxina foi reduzida
quando a concentração de fungicidas aumentava para 1 µg.mL-1. Nesse mesmo
estudo foi verificado que com concentrações menores que 3 µg.mL-1 de tebuconazole
estimula a produção de DON e ZEA.
Considerando os valores de umidade encontrados neste trabalho (Tabela 1),
após a colheita o endosperma parece ser a fração mais susceptível a contaminação
por fungos de armazenamento, pois foi a que apresentou os valores de umidade mais
elevados em relação as demais. Hoeltz et al., (2009) constataram influência positiva
da umidade sobre a contaminação com Aspergillus ssp. e Penicillium ssp. em grão de
arroz com casca armazenados em um silo metálico cilíndrico. Porém, o arroz e suas
porções analisados nesse trabalho não foram submetidos a armazenamento e
dificilmente este efeito poderia ter sido observado.
Os percentuais de fungos do gênero Fusarium (Tabela 2) nas amostras de
arroz com casca recém colhido sugerem que os fungicidas foram eficientes para o
controle desse fungo, reduzindo praticamente pela metade a contaminação, porém, os
resultados dos níveis de micotoxinas sugerem que apesar da redução do fungo, o
fungicida pode ter favorecido a produção de toxinas no grão pelo estresse causado ao
fungo antes de torná-lo inviável.
A incidência de fungos do gênero Penicillium (Tabela 2) em amostras de arroz
tratadas com fungicidas alerta para a real necessidade da utilização de agrotóxicos,
uma vez que quando a amostra não foi tratada com o produto químico não apresentou
contaminação por esse fungo nos campos experimentais. Isso pode ser devido à
presença de alguma espécie fúngica nos grãos não tratados que pode ter atuado
como inibidor de Penicillium. No caso desses fungos serem GRAS (Generaly
Regarded Air Safe) esse efeito é benéfico e pode vir a construir uma possibilidade
promissora. Outros gêneros cujo percentual de ocorrência foi beneficiado pelo uso do
fungicida foram Bipolaris, Curvularia, Phoma e Alternaria alternata.
68
Tabela 2. Incidência de fungos nas amostras de arroz provenientes de cultivo com e
sem emprego de fungicidas.
Incidência de fungos na semente de arroz (%)
Tratada com fungicidas Não tratada com fungicidas
Bipolaris 36,0 12,8
Curvularia 18,2 11,5
Phoma 14,0 10,3
Alternaria padwickii 8,3 12,7
Fusarium 7,7 14,5
Alternaria alternata 2,2 1,75
Nigrospora 1,0 1,5
Epicoccum 1,5 6,0
Penicillium 0,5 n.o.
Microdochium n.o. 5,3
Cercospora n.o. 1,0
Rhizoctonia n.o. 0,5
Aspergillus n.o. 0,5
n.o. = não observada.
A eficiência dos fungicidas é reduzida quando a folhagem esta molhada no
momento de sua aplicação, portanto, pelo fato de o arroz ser uma cultura irrigada, este
pode ter sido um fator que contribuiu para o não controle de todos os fungos pelos
fungicidas (ZAMBOLIM et al., 2007).
Alguns autores como Schuch et al., (2006) avaliando a qualidade sanitária de
sementes de arroz tratadas ou não com carboxina e tiram verificaram que o tratamento
com fungicidas aumentou a porcentagem de germinação bem como foi eficiente na
diminuição da incidência dos principais fungos associados às sementes de arroz
(Fusarium spp., Alternaria spp., Gerlachia sp., Dreschlera spp., Curvularia sp., Phoma
sp.). Porém Lobo, (2008) verificou que o tratamento de sementes de arroz com
carboxim e thiram não diferiu da testemunha no controle da brusone, causada pelo
fungo Pyricularia grisea. Franco et al., (2001) verificaram durante cinco safras de arroz
irrigado no Rio Grande do Sul os seguintes percentuais de fungos associados às
sementes: Pyricularia oryzae, 0,04%; Bipolares oryzae, 2,6%; Curvularia lunata,
4,9%; Nigrospora oryzae, 16,3%; Alternaria sp. 6,3%; Fusarium sp., 1,8%; Phoma
sp., 11,1%; Cladosporium sp., 11,6%; Epicocum sp., 1,5%; Aspergillus sp., 7,6%;
Penicillum sp., 34,4%; Gerlachia oryzae, 18,0%; Tricochoniella padwickii, 8,4%;
outros, 5,1%. Esses resultados demonstram que a capacidade dos fungicidas na
69
seleção de espécies fúngicas toxigênicas é afetada também pelo tipo de cultura e
constitui-se, portanto, num ponto muito importante a ser avaliado quando se pretende
minimizar os riscos de contaminação por micotoxinas, especialmente sob condições
rotineiras de cultivo em campo.
O mecanismo pelo qual os fungicidas estimulam a produção de toxinas de
Fusarium ssp. ainda não esta bem elucidado, mas vem sendo demonstrado que em
presença de concentrações sub letais, certos fungicidas propiciam a manifestação do
potencial toxigênico de algumas espécies (RAMIREZ, 2003). Então no caso deste
trabalho o fato de ter sido feito cultivo irrigado pode ter afetado a disponibilidade dos
fungicidas diluindo-o e tornando seus níveis sub letais para o fungo, o que também
poderia justificar a contaminação por toxinas observada. Os resultados dos
experimentos aliados aos mencionados por outros autores corroboram com a hipótese
de que o fungicida empregado na cultura do arroz pode ter atuado como um agente
estressor e determinado a manifestação do potencial toxigênico em espécies de
Fusarium, que contaminaram o arroz no campo.
4 CONCLUSÃO
O desenvolvimento fúngico e a contaminação com ZEA ocorreram em todas as
amostras e DON em 92%. Os fungicidas foram eficientes para o controle de Fusarium
em sementes de arroz, porém, os resultados de micotoxinas sugerem que apesar da
redução da incidência do fungo, o fungicida pode ter favorecido a produção das
micotoxinas, cujos elevados níveis encontrados alertam para a importância de estudos
que visem o conhecimento dos fatores que aceleram a produção dessas toxinas no
arroz. Com este trabalho ficou evidenciado que nem sempre o beneficiamento propicia
a descontaminação em limites aceitáveis para comercialização e consumo.
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75
ARTIGO 3
76
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BIOQUÍMICA DE ARROZ FERMENTADO
COM Fusarium graminearum EM PRESENÇA E AUSÊNCIA DE FUNGICIDAS
Laboratório de Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, Universidade
Federal do Rio Grande (FURG), Rua Engenheiro Alfredo Huch, 475, CEP 96201-900,
Caixa Postal 474, Rio Grande, RS, Brasil
RESUMO
Foi verificado o efeito do uso de fungicidas nas características físico-químicas e bioquímicas do arroz fermentado com Fusarium graminearum. Arroz da variedade BR-IRGA 417 foi utilizado como substrato para fermentação em estado sólido com F. graminearum na ausência e presença de azoxistrobina e trifloxistrobina durante 30 dias a 22°C. Amostras de biomassa fermentada foram obtidas de 3 em 3 dias para determinações físico-químicas (umidade, cinzas, lipídios, proteínas, pH, acidez e fenóis totais) e bioquímicas (atividade de α-amilase, β-amilase, protease e lipase). A presença dos fungicidas nos substratos reduziu os percentuais de umidade e aumentou os de cinzas e proteínas, enquanto que os níveis de lipídios variaram pouco com o desenvolvimento da biomassa fúngica. O pH do fermentado em presença de azoxistrobina foi aumentado em relação aos demais e a acidez foi maior nos substratos fermentados sem fungicidas. Os antifúngicos químicos praticamente não interferem nos fenóis. Os fungicidas atuaram inibindo as atividades das enzimas α-amilase, proteases e lipases. Palavras-chave: azoxistrobina, trifloxistribina, amilase, protease, lipase.
77
ABSTRACT
Was checked the effect of fungicide use on physico-chemical and biochemical characteristics in rice fermented with Fusarium graminearum. Rice variety BR-IRGA 417 was used as substrate for solid-state fermentation with F. graminearum in the absence and presence of azoxystrobin and trifloxystrobin for 30 days at 22°C. Fermented biomass samples were obtained from three determinations in three days for physicochemical (moisture, ash, lipids, proteins, pH, and total phenols) and biochemical (activity of α-amylase, β-amylase, protease and lipase). The presence of fungicides in the substrate reduced the percentage of moisture and increased ash and protein, and lipid levels varied little with the development of fungal biomass. The pH of the fermentation in the presence of azoxystrobin was increased compared to the other and the acidity was higher in the fermented substrate without fungicides. The antifungal agents did not interfere in the chemical phenol. The fungicides acted by inhibiting the activity of the enzymes α-amylase, protease and lipases. Keywords: azoxystrobin, trifloxistribina, amylase, protease, lipase.
78
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é o maior produtor de arroz fora do continente Asiático, sendo a região
Sul responsável por cerca de 60% da produção total deste cereal no país (EMBRAPA,
2010). A ocorrência de doenças fúngicas é um dos maiores fatores limitantes da
produção. A planta de arroz, em qualquer fase de desenvolvimento, está sujeita a
doenças que reduzem tanto a qualidade quanto a quantidade final do produto (MIURA,
2002). As doenças fúngicas podem ser causadas por espécies de fungos do gênero
Fusarium, os quais são patógenos para as plantas antes ou imediatamente após a
colheita (SWEENWEY & DOBSON, 1998). Os danos causados pelos fungos são
graves, levando a prejuízo econômico quando afeta a lavoura e que se estende
quando afeta a saúde de humanos e animais de criação (LEAL et al., 2005). Para
diminuir estes riscos, são empregados agrotóxicos produzidos sinteticamente para
combater insetos, ácaros, bactérias, ervas daninhas, fungos, moluscos, roedores
visando garantir maior produtividade (BAIRD, 2002). Esses compostos, porém, são
potencialmente tóxicos ao homem, podendo causar efeitos adversos ao sistema
nervoso central e periférico, ter ação imunodepressora ou ser cancerígeno, como
também podem se difundir pelo meio ambiente ocasionando dano em outros
ecossistemas (RODRIGUES, 2010).
O arroz é uma excelente fonte de energia na dieta, devido à alta concentração
de amido, fornecendo também proteínas, vitaminas e minerais, e possui baixo teor de
lipídios (KENNEDY et al., 2002), sendo considerado a espécie que apresenta maior
potencial para o combate a fome no mundo (EMBRAPA, 2010). Os nutrientes não
estão uniformemente distribuídos nas diferentes frações do grão. As camadas
externas apresentam maiores concentrações de proteínas, lipídios, fibra, minerais e
vitaminas, enquanto o centro é rico em amido (STORCK, 2004). Os compostos
fenólicos, ou polifenóis, são metabólitos secundários dos vegetais com diferentes
funções nas plantas, destacando-se entre elas a proteção da estrutura contra o ataque
de patógenos (KING & YOUNG, 1999; HYUN & CHUNG, 2004; TIAN et al., 2004;
ZHOU et al., 2004). O emprego de alguns agrotóxicos de efeito sistêmico, como os
fungicidas pode afetar a formação desses compostos de valor nutricional e funcional
durante a formação do grão e desta forma afetar o seu papel na dieta ou ainda tornar
a matéria prima mais susceptível a contaminação nas condições de processos
convencionais de armazenamento e beneficiamento.
Muitos autores vêm estudando a fermentação em estado sólido como forma de
produzir compostos como proteínas e enzimas (SILVEIRA et al., 2010; MENONCIN,
2007; FERNANDES, 2007) e alguns trabalhos relatam a utilização da fermentação in
79
vitro para verificar efeitos diversos no metabolismo de um determinado tecido, como
no caso de Pagnussatt, (2010) que avaliou in vitro o efeito inibitório de extratos
protéicos de arroz, aveia e trigo sobre o desenvolvimento de fungos toxigênicos, de
Oliveira, (2010) que estudou a ação degradatória do Rhizopus oryzae sobre o farelo
de arroz e de Garda-Buffon et al., (2010) que demonstraram que ocorria a degradação
de DON por ação de Rhizopus oryzae e Aspergillus oryzae. No caso do efeito de
fungicidas no grão, Dors, (2010) demonstrou que o uso de fungicidas no campo
afetava as características físico-químicas e bioquímicas do grão de arroz e seus
derivados e sugeriu que um estudo envolvendo fermentação in vitro poderia avaliar
melhor se estas alterações foram determinadas pelo fungicida, uma vez que, as
demais variáveis abióticas dificilmente podem ser controladas em campo.
As atividades celulares estão mediadas por enzimas, sendo a capacidade
enzimática uma característica de cada indivíduo. A ausência de enzimas específicas
ou de fatores ambientais que dificultem a interação delas com o substrato podem
impossibilitar a multiplicação de um fungo ou alterar as propriedades tecnológicas e
afetar a vida útil do material em que ambos estão presentes. No caso do uso de
fungicidas pode afetar não só a atividade das enzimas do fungo, mas também as
próprias da matriz que atua como substrato.
O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do uso de fungicidas nas
características físico-químicas e bioquímicas do arroz fermentado com Fusarium
graminearum.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Amostras
O arroz em casca, utilizado como substrato na fermentação, foi cultivado sem
fungicidas em campos experimentais do Instituto Rio Grandense do Arroz (IRGA),
localizado em Cachoeirinha, Rio Grande do Sul, Brasil. A cultivar utilizada foi a BR-
IRGA 417 semeada no sistema de cultivo mínimo, com densidade de semeadura de
100 kg.ha-1. A adubação de base foi com 400 kg.ha-1 (N:P:K = 05:20:30). A adubação
nitrogenada em cobertura foi com 80 kg.ha-1 de nitrogênio no arroz com 8 folhas antes
do início da diferenciação do primórdio da panícula.
Após a colheita, as amostras foram secas até 13% de umidade. O arroz foi
encaminhado ao Laboratório de Ciência de Alimentos (LCA) da Universidade Federal
do Rio Grande (FURG) onde foi moído em moinho de facas marca Tecnal modelo Te-
631 e armazenado à -18°C até o momento da fermentação.
80
2.2 Fermentação em estado sólido
2.2.1 Preparo do inóculo
Esporos do fungo Fusarium graminearum foram cedidos pelo departamento de
Fitopatologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. As culturas foram
mantidas a 4°C em meio ágar batata dextrose 1,95% (p.v-1) e os esporos foram
propagados, na ocasião do uso, através de uma emulsão aquosa de Tween 80 (1%)
com auxilio de uma alça de Drigalski, sendo a concentração dos esporos estimada por
enumeração em câmara de Neubauer.
2.2.2 Processo fermentativo
A fermentação foi realizada em biorreatores de bandejas, com dimensões 29 x
17 x 5,5 cm. O substrato de arroz com casca moído (100 g) foi disposto nos
biorreatores, na forma de camada fina de aproximadamente 2 cm de altura, onde foi
homogeneizado o substrato com 45 mL da solução salina (KH2PO4 2 g.L-1, MgSO4 1
g.L-1, NH2CONH2 1,8 g.L-1 em HCl 0,4 N) e suspensão de esporos perfazendo a
concentração inicial de 7,5 x 104 esporos.g-1 (BADIALE-FURLONG et al., 2007). A
adição dos fungicidas (azoxistrobina e trifloxistrobina) foi feita na concentração de 0,1
mg.kg-1. A umidade foi ajustada para 70% com adição de água destilada estéril. As
bandejas foram cobertas com uma manta de algodão de forma a evitar a
contaminação e permitir a aeração do meio. A incubação foi realizada em estufa a
22°C por 30 dias, sendo realizada amostragem da biomassa fermentada de 3 em 3
dias para as determinações.
2.3 Caracterização físico-química dos fermentados
2.3.1 Composição proximal, pH e acidez
A umidade, cinzas, lipídios, proteínas (fator de conversão 5,95), pH e acidez
foram determinados pelos procedimentos da AOAC, (2000).
2.3.2 Determinação de fenóis totais
A extração dos compostos fenólicos foi realizada a frio com álcool metílico na
proporção de 1:5 (massa seca:solvente) em agitador orbital horizontal, seguida da
81
partição com hexano e clarificação com hidróxido de bário 0,1 M e sulfato de zinco 5%
(p.v-1). O conteúdo de fenóis totais foi quantificado através do método
espectrofotométrico utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau 2 N (diluído 1:2 com
água destilada), empregando uma curva padrão de ácido felúrico entre as
concentrações de 0 a 16 μg.mL-1 (SOUZA, 2008; BADIALE-FURLONG et al., 2003).
2.4 Caracterização bioquímica
2.4.1 Atividade enzimática da amilase
A enzima foi extraída de 6 g da biomassa fermentada (com e sem fungicidas)
com 30 mL de solução NaCl 0,5% (p.v-1) após homogeneização em mesa agitadora
orbital à 30°C por uma hora e meia. A suspensão foi centrifugada a 2800 g por 10 min
e filtrada usando banho de gelo (OLIVEIRA, 2010).
2.4.1.1 -amilase
A reação enzimática foi realizada empregando 0,5 mL de uma solução de
amido solúvel 0,4% (p.v-1) como substrato, 0,1 mL de solução tampão citrato com KCl
0,2 M pH 7,0 e 0,3 mL de água destilada. A mistura foi mantida em banho-maria na
temperatura de 50°C por 5 min, seguido por adição de 1 mL do extrato enzimático e 5
min de incubação. A reação foi interrompida pela adição de 0,5 mL de HCl 1 N e o
amido remanescente foi determinado com adição de 0,1 mL de solução de iodo (0,3%
de I2 em solução de KI 3%) e o volume completado para 15 mL com água. A
absorvância do complexo amido-iodo foi medida a 620 nm. O mesmo procedimento foi
realizado para o tempo zero de reação, adicionando-se o ácido antes do extrato
enzimático. Uma unidade dextrinizante (UD) foi definida como a capacidade da enzima
para hidrolisar 1 mg de amido por minuto por miligrama de proteína no extrato
enzimático (GARDA-BUFFON et al., 2010; OLIVEIRA, 2010).
2.4.1.2 -amilase
O procedimento neste caso foi iniciado com 0,5 mL da solução de amido 0,4%
(p.v-1) e 1 mL do extrato enzimático. A mistura foi mantida à 60°C por 5 min e a
hidrólise enzimática foi interrompida com a adição de 1 mL do ácido 3,5-
dinitrossalicíllico e ebulição por 5 min. Após o resfriamento, foram adicionados 7,5 mL
de água e seguido pela leitura da absorvância em espectrofotômetro a 546 nm. O
82
mesmo procedimento foi realizado para o tempo zero de reação, adicionando-se o
ácido antes do extrato enzimático. A quantidade de açúcar redutor na solução foi
obtida usando uma curva de calibração de maltose (0,03 a 0,1 mg.mL-1). Uma unidade
de atividade sacarificante foi definida como a capacidade da enzima formar 1 mg de
maltose nas condições do experimento (GARDA-BUFFON et al., 2010; OLIVEIRA,
2010).
2.4.2 Atividade enzimática da protease
O extrato enzimático foi obtido da mesma forma que a descrita no item 2.4.1. A
hidrólise enzimática foi realizada com 1 mL do extrato enzimático e 2,5 mL do
substrato albumina 0,5% (p.v-1) em banho-maria a 35°C por 20 min. A reação foi
interrompida com a adição de 5 mL de ácido tricloroacético (TCA) 10% (p.v-1). No
tempo zero o TCA foi adicionado antes do extrato. Ao término da reação os
aminoácidos produzidos foram determinados com 3 mL do extrato enzimático em 6 mL
de NaOH 1 N e 1 mL do reagente Folin-Ciocalteau 2 N (diluído 1:2 com água) sendo a
absorvância do complexo lida após 10 min em espectrofotômetro a 660 nm. A
atividade enzimática específica do extrato foi definida como a quantidade (mg) de
tirosina liberada (mg) por minuto por miligrama de proteína, sendo a curva de tirosina
previamente construída entre as concentrações de 0 a 0,02 mg.mL-1 (BADIALE-
FURLONG et al., 1994).
2.4.3 Atividade enzimática da lipase
Para extração da lipase, 1 g do arroz fermentado foi agitado a 200 rpm em
agitador orbital com 10 mL de tampão fosfato 50 mM pH 7,0 à 37°C por 30 min. A
mistura foi filtrada e centrifugada a 2800 g por 10 min e o sobrenadante enzimático foi
utilizado na determinação da atividade lipolítica.
A atividade lipolítica foi avaliada utilizando como substrato uma emulsão 1:3 de
óleo de oliva e solução de detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) 10% (v.v-1)
preparada em um agitador magnético. A mistura reacional contendo 5 mL da emulsão
de azeite, 2 mL do tampão fosfato 50 mM pH 7,0 e 1 mL do extrato enzimático foi
incubada a 37°C por 30 min. Após, a reação foi interrompida pela adição de 15 mL de
solução acetona:etanol 1:1 e os ácidos graxos liberados foram titulados com uma
solução padronizada de NaOH 0,05 N. Uma unidade de atividade lipolítica (U) foi
definida como a quantidade de enzima que libera 1 mol de ácidos graxos por minuto
(FERNANDES, 2007).
83
2.5 Análise estatística dos dados
Os resultados das determinações foram submetidos a análise de variância
(ANOVA) em um nível de significância de 5% (p<0,05) utilizando o Software Statistica
v. 7.0 para avaliar in vitro o efeito do uso dos fungicidas no fermentado.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Caracterização do substrato
A umidade (13,1%), cinzas (5,6%), proteínas (5,6%), lipídios (0,4%), pH (5,7),
acidez (8,7) e o teor fenólico (185,1 µg.g-1) foram determinados na amostra do arroz
que foi empregado como substrato para a fermentação.
De acordo com a tabela brasileira de composição de alimentos (TACO, 2006),
o arroz integral (Oryza sativa) contém 12,2% de umidade, 1,9% de lipídios, 7,3% de
proteínas e 1,2% de cinzas. De acordo com IBGE, (1999) esses valores são,
respectivamente: 12,4; 1,6; 8,1 e 1,3%. Os valores encontrados neste trabalho estão
de acordo com essas fontes levando-se em consideração que o arroz utilizado como
substrato estava com a casca, a qual constitui de 15 a 30% do grão e contém elevado
teor de cinzas e elevada quantidade de carboidrato não digerível (SALUNKHE et al.,
1999). Além disso, no caso dos lipídios, a presença de casca pode ter dificultado a
extração dos lipídios. Segundo Moro et al., (2004), a composição centesimal do arroz
varia de acordo com vários fatores como região em que o grão é cultivado, tipo de
solo, clima entre outros. Nesse caso a principal fonte de variação foi o fato de o grão
ser avaliado inteiro, que efetivamente é a fonte de nutrientes para o desenvolvimento
fúngico, ao passo que a maioria das informações referem-se a porções comestíveis.
Vieira et al., (2007), encontraram conteúdo fenólico total médio no arroz com
casca de 278 µg.g-1. O conteúdo fenólico pode variar de acordo com as variáveis
abióticas durante a época do plantio e colheita e com período da colheita, sendo que
sementes verdes possuem menos antioxidantes que as maduras (SCAGLIONI et al.,
2009; CHEN & BERGMAN, 2002).
3.2 Caracterização físico-química e bioquímica dos fermentados com e
sem emprego de fungicidas
Os dados das características de composição centesimal das amostras de arroz
fermentado com Fusarium graminearum com e sem emprego de fungicidas aparecem
84
na Tabela 1. Os resultados demonstram que a umidade foi significativamente reduzida
ao longo da fermentação, mas de forma menos acentuada no meio em que não foram
empregados fungicidas. Segundo Zambolim et al., (2007), fungicidas do grupo das
estobilurinas atuam na inibição da respiração do fungo, o que poderia justificar o
comportamento verificado.
Os teores de cinzas apresentaram um aumento significativo ao longo da
fermentação, de 53% em média, quando foi aplicado fungicida ao meio, sendo que no
meio sem fungicidas esse teor manteve-se inalterado. As proteínas aumentaram com
o passar do tempo em uma taxa maior para o meio com azoxistrobina (0,12) do que
nos meios sem fungicida e com trifloxistrobina (0,07). Os teores de vários
componentes da biomassa aumentaram ao longo do processo fermentativo, e no caso
das proteínas também isso também foi observado por Silveira & Badiale-Furlong,
(2007) empregando trigo e farelo de arroz como substrato para Rhizopus sp. e
Aspergillus oryzae. O aumento demonstrou que o desenvolvimento fúngico ocorria
mesmo em presença do fungicida, mesmo que em menores proporções que na
ausência desse.
Os níveis de lipídios variaram pouco com o desenvolvimento da biomassa
fúngica, sugerindo que esta via metabólica é pouco utilizada para o desenvolvimento
de F. graminearum.
Os valores de pH (Tabela 2) aumentaram em presença de azoxistrobina no
meio fermentado, porém manteve-se praticamente constante quando utilizado
trifloxistrobina da mesma forma que no meio controle. A concentração de H+ afeta a
velocidade das reações químicas, e este pode ser um dos fatores que controlam o
desenvolvimento microbiano. A acidez (Tabela 2) manteve-se praticamente inalterada
ao longo do processo de fermentação. No meio sem fungicidas, foram constatados os
maiores níveis de acidez em relação ao inicio da fermentação do substrato com os
fungicidas. Cabe lembrar que a medida de acidez é uma variável que está intimamente
relacionada com a qualidade da matéria-prima, pois a acidificação geralmente é
resultante do aumento de ácidos graxos livres, de fosfatos ácidos e de aminoácidos
produzidos pela ação de lipases, fitases e proteases, respectivamente. Entre esses
três grupos de compostos, o maior e mais rápido aumento ocorre nos ácidos graxos
(SMITH & BERJAK, 1995, citado por BIAGGIONI & BARROS, 2006). Portanto os
resultados sugerem que a utilização de fungicidas conservou mais o grão, uma vez
que os fungicidas utilizados inibiram enzimas deteriorantes do grão, conforme pode
ser observado na Tabela 3.
Houve aumento do conteúdo fenólico (Tabela 2) ao longo da fermentação nos
meios com e sem fungicidas, porém os compostos químicos praticamente não
85
interferiram nos fenóis. Scaglioni et al., (2009) encontraram maiores teores fenólicos
no arroz tratado com tebuconazole (grupo triazóis) em comparação ao sem
tratamento, mostrando que o efeito do fungicida sobre o conteúdo fenólico varia com o
tipo de fungicida utilizado. Dors, (2010) estudando a influência do uso de fungicida no
cultivo de arroz irrigado nas características físico-química do grão não verificou
diferença entre os valores de pH, acidez, lipídios e proteínas do grão tratado ou não
com tebuconazole, mais uma vez mostrando a dependência do efeito ao principio ativo
nas características do grão de arroz. Scaglioni et al., (2009), salientaram que os níveis
dos componentes centesimais podem ser afetados por diferentes variáveis e dentre
elas pelo uso de fungicidas.
86
Tabela 1. Composição centesimal do arroz fermentado com Fusarium graminearum na presença e ausência de fungicidas.
Tempo
fermentação
(dia)
Umidade (%) Cinzas (%) Proteínas (%) Lipídios (%)
AZO TRI SF AZO TRI SF AZO TRI SF AZO TRI SF
0 43,1cdB 44,8aA 43,7aA 4,8dA 4,6dA 2,2bB 5,1dAB 5,9cdA 4,6fB 0,4defC 0,7bcA 0,6cdB
3 44,7aB 41,7cA 41,3bB 4,8dA 4,5dA 2,9bB 5,3dA 5,4dA 4,9defA 0,5cdefC 0,7bcB 0,9abA
6 44,6aA 41,6cB 41,4bB 5,0cdA 4,6dA 2,4bB 5,2dB 6,2cdA 4,8efC 0,4efA 0,6cdA 0,6cdA
9 33,8cdAB 25,5eB 39,1cA 6,3abcA 5,3cdB 2,5bC 6,0cdB 6,6cdA 6,5abcAB 0,5cdefB 0,7bcA 0,1efC
12 42,1abA 32,6dC 36,8dB 4,9cdA 5,2cdA 2,8bB 5,7dA 6,2cdA 5,4defA 0,4defB 0,6cdA 0,1efC
15 33,9cdB 32,4dC 38,6cA 6,4abA 5,9abcA 2,8bB 6,1cdB 6,7cAB 7,3aA 0,7bA 0,8abcA 0,04fB
18 35,9bcA 22,0fC 33,0eB 6,5abA 6,3abcA 2,8bB 6,2cdA 6,9bcA 5,8bcdA 0,6bcdA 0,8abcA 0,3deB
21 30,6cdA 11,4gC 26,1fB 6,2abcA 6,7abA 3,0bB 7,2bcAB 8,1abA 6,7abB 0,7bcB 1,0aA 0,6cdB
24 27,3dA 10,8gC 20,9iB 7,0aA 7,2aA 3,0bB 7,4bcAB 8,2aA 6,6abB 0,6bcdB 0,8abcB 1,1aA
27 19,0eB 10,8gC 24,5hA 7,3aA 6,9aA 2,9bB 7,6abA 8,4aA 6,4bcB 0,6bcdeA 0,8abcA 0,8bcA
30 14,6eB 11,3gC 25,8gA 7,3aA 7,1aB 2,9bC 8,8aA 8,2abA 6,7abB 1,0aA 0,9abA 0,6bcdB
AZO = azoxistrobina; TRI = trifloxistrobina; SF = sem fungicida
Letras minúsculas demonstram diferença ou semelhança entre os dias da fermentação; Letras maiúsculas demonstram diferença ou semelhança entre a
utilização ou não de fungicidas.
87
Tabela 2. pH acidez e conteúdo fenólico total do arroz fermentado com Fusarium graminearum na presença e ausência de fungicidas.
Tempo
fermentação
(dia)
pH Acidez Fenóis totais (µg.g-1)
AZO TRI SF AZO TRI SF AZO TRI SF
0 3,0 ghA 3,2deA 3,2bcA 9,6abcAB 8,9cB 11,9abA 161,1deC 178,9gC 245,6cdB
3 2,9 hC 3,0eB 3,3bA 10,3abcB 9,3bcB 12,6abA 177,3eC 180,2gC 282,3bcdB
6 3,2 fghA 3,2cdeA 3,1cA 10,6abcAB 8,9cB 14,6abA 186,1deC 219,1fBC 271,6bcdB
9 3,0 ghB 3,2deA 3,2bcA 8,6cC 9,9abcB 13,3abA 171,7deD 224,1efC 283,6bcdB
12 3,4efgA 3,5cA 3,2bcB 9,2abcA 12,6abcA 12,3abA 180,3deC 270,4cdB 299,7abcB
15 3,5defB 3,9bA 3,1cC 10,6abcA 12,6abcA 12,9abA 358,5deC 324,6bB 316,6abcB
18 3,8cdeA 3,2deB 3,1cB 9,9abcA 11,9abcA 14,9abA 251,2aC 358,8aB 435,0abA
21 4,4bA 3,2deB 3,2bcB 14,2aB 13,6abcB 15,6abA 201,3bC 300,9bcB 323,4abcB
24 3,9cdA 3,1eB 3,1cB 13,3abcA 13,6abcA 19,2aA 221,7cdD 260,9deC 381,7aB
27 3,6cdefA 3,1eB 3,1cB 12,3abcA 14,9aA 13,9abA 251,6bcC 250,4defC 311,9abcB
30 4,0bcA 3,4cdB 3,2bcB 13,9abB 14,6abB 18,5aA 245,4bC 242,8defC 335,6abcB
AZO = azoxistrobina; TRI = trifloxistrobina; SF = sem fungicida
Letras minúsculas demonstram diferença ou semelhança entre os dias da fermentação; Letras maiúsculas demonstram diferença ou semelhança entre a
utilização ou não de fungicidas.
88
Na Tabela 3 encontram-se os valores das atividades das enzimas hidrolíticas ao longo da fermentação do arroz com e sem fungicidas.
Tabela 3. Atividades enzimáticas do arroz fermentado com Fusarium graminearum na presença e ausência de fungicidas.
Tempo
fermentação
(dia)
α-amilase (U.mg-1) β-amilase (U.mg-1) Protease (U.mg-1) Lipase (U.mg-1)
AZO TRI SF AZO TRI SF AZO TRI SF AZO TRI SF
0 8,4aB 8,8aB 21,6fA 2,7aA 2,0aA 1,8bcA 0,6bcB 0,3bB 8,3bcA 21,9aB 24,5aB 53,7bcA
3 5,3aB 5,9aB 28,8defA 2,4aA 1,8aA 2,1bcA 0,6bcB 0,3abB 10,7bA 17,2cC 23,1aB 54,8bcA
6 3,8aB 0,6aB 33,5cdeA 1,1aB 0,9aB 5,9abA 0,5bcB 0,3bB 15,7aA 17,3cB 15,2bcB 57,0bA
9 6,9aB 2,7aB 117,1aA 1,4aA 3,5aA 4,1abcA 0,4bcB 0,3bB 9,9bA 20,1bB 13,7cC 57,0bA
12 6,5aB 4,5aB 86,1bA 1,9aA 1,9aA 2,7bcA 1,2aB 0,4abB 6,5cdA 12,6efC 16,7bcB 73,9aA
15 6,5a\b 1,8aB 41,6cA 2,4aA 0,9aA 2,8bcA 0,7bB 0,3bC 3,5deA 14,6dB 15,6bcB 59,2bA
18 3,7aB 5,9aB 25,7efA 0,3aA 0,3aA 1,4bcA 0,3bcB 0,3bC 4,5deA 11,4fB 16,2bcB 62,2bA
21 3,0aB 3,3aB 28,3defA 0,4aB 0,6aAB 1,2cA 0,3cB 0,6abB 2,6eA 11,1fC 17,5bB 58,5bA
24 3,5aB 2,7aB 26,9efA 0,7aA 0,6aA 0,05cA 0,5bcA 0,8abA 2,4eA 13,5deB 16,6bcB 44,6cdA
27 3,6aB 3,3aB 27,8efA 1,1aAB 0,5aB 3,2bcA 0,4bcB 0,9aB 2,8eA 13,6deB 16,0bcB 39,1deA
30 2,3aB 3,4aB 37,6cdA 1,6aAB 0,3aB 8,2aA 0,3bcB 0,2bB 6,3cdA 12,6efB 15,4bcB 33,3feA
AZO = azoxistrobina; TRI = trifloxistrobina; SF = sem fungicida
Letras minúsculas demonstram diferença ou semelhança entre os dias da fermentação; Letras maiúsculas demonstram diferença ou semelhança entre a
utilização ou não de fungicidas.
89
Foi possível observar que os compostos químicos utilizados para inibição do
desenvolvimento do Fusarium graminearum dificultaram a ação das enzimas α-
amilase, protease e lipase, pois os valores no meio controle (sem fungicidas) foram
significativamente maior do que quando foram utilizados os fungicidas. Para a β-
amilase o uso de fungicida não alterou tanto sua atividade enzimática.
No meio sem fungicidas, a α-amilase, β-amilase, protease e lipase obtiveram o
máximo de atividade no 9º, entre o 6º e 9º, 6º e 12º dia de fermentação,
respectivamente. Alguns fungos produzem lipase que hidrolisam os lipídios a glicerol e
ácidos graxos (ESPOSITO & AZEVEDO, 2004). Tal fato explica o menor teor de
lipídios no período acima citado (Tabela 1), sugerindo que ou o fungo utiliza o lipídio
como fonte de nutrientes ou sua presença desencadeia a atividade de enzimas
endógenas do farelo.
Se por um lado a composição dos fermentados teve alterado especialmente o
conteúdo protéico decorrente do desenvolvimento fúngico a presença dos fungicidas
afetou a atividade de enzimas fundamentais para o desenvolvimento microbiano e
possivelmente a atividade das próprias enzimas do substrato. Assim, ambos os
fungicidas estudados parecem atuar de forma bastante similar e conforme já havia
sido comentado por Dors, (2010) possivelmente alguns cuidados durante o
armazenamento se tornem necessários quando se emprega este tipo de agrotóxico
(fungicidas).
4 CONCLUSÃO
O uso de fungicidas proporcionou uma redução na umidade e aumento no
conteúdo de cinzas e proteínas do arroz fermentado com Fusarium graminearum. Os
níveis de lipídios variaram pouco com o desenvolvimento da biomassa fúngica. O pH
aumentou quando foi utilizado azoxistrobina, nos demais casos manteve-se constante
ao longo da fermentação. A acidez foi maior quando o meio não continha fungicidas
nos últimos dias de fermentação. O conteúdo fenólico total praticamente não alterou
em presença de fungicida. Os compostos químicos utilizados afetaram a atividade de
α-amilase, protease e lipase.
90
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94
ARTIGO 4
95
EFEITO DO USO DE FUNGICIDAS NO DESENVOLVIMENTO FÚNGICO E NA
MANIFESTAÇÃO DE POTENCIAL TOXIGÊNICO NO ARROZ: UM ESTUDO in vitro
Laboratório de Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, Universidade
Federal do Rio Grande (FURG), Rua Engenheiro Alfredo Huch, 475, CEP 96201-900,
Caixa Postal 474, Rio Grande, RS, Brasil
RESUMO
O objetivo desse trabalho foi verificar in vitro o efeito do uso de fungicidas no desenvolvimento fúngico e na manifestação do potencial toxigênico de Fusarium graminearum, tendo o arroz como substrato. Inicialmente foram estudadas as melhores condições para esporulação do fungo (folha de cravo ágar, ágar sintético pobre em nutrientes, ágar batata dextrose 3,9% e ágar batata dextrose 1,95%), do qual foi obtida a solução de esporos para ser utilizada na fermentação do arroz em estado sólido com e sem a presença dos fungicidas azoxistrobina e trifloxistrobina. A glicosamina foi utilizada como indicativo de desenvolvimento fúngico na biomassa fermentada. A extração de micotoxinas foi realizada de acordo com QuEChERS modificado e sua quantificação foi em HPLC-UV-FL. A glicosamina aumentou ao longo da fermentação do arroz com e sem fungicidas. A manifestação do potencial toxigênico de ZEA foi favorecida pelo emprego dos fungicidas. Palavras-chave: deoxinivalenol, zearalenona, glicosamina, Fusarium graminearum.
96
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate in vitro the effect of the use of fungicides on fungal development and demonstration of toxigenic potential of Fusarium graminearum, with rice as the substrate. Initially we studied the best conditions for fungus sporulation (carnation leaf-piece agar, syntetic nutrient-poor agar, potato dextrose agar 3.9%, potato dextrose agar 1.95%), which was obtained by the solution of the spores to be used in the fermentation of rice in solid state with and without the presence of fungicides azoxystrobin and trifloxystrobin. Glucosamine was used as an indicator of fungal development in fermented biomass. The extraction of mycotoxins was performed according to modified QuEChERS and its measurement was HPLC-UV-FL. Glucosamine has increased during the fermentation of rice with and without fungicides. The outbreak of toxigenic potential of zearalenone seems to have been favoured by the use of fungicides. Keywords: deoxynivalenol, zearalenone, glucosamine, Fusarium graminearum.
97
1 INTRODUÇÃO
Devido à composição rica em carboidratos, atividade de água variável ao longo
da maturação do grão e forma de cultivo, o arroz possui grande susceptibilidade ao
ataque fúngico, tanto antes quanto após a colheita, sendo que desses algumas
espécies toxigênicas podem produzir micotoxinas (VIEIRA et al., 2007). Espécies do
gênero Fusarium são amplamente distribuídas na natureza e comumente contaminam
cereais e outras plantas no campo, sendo que esse gênero fúngico possui espécies
responsáveis pela produção de micotoxinas (MARTINS, 2002; SOHN et al., 1999).
As micotoxinas mais encontradas em alimentos de consumo rotineiro e com
limites de consumo estabelecidos por muitos países são: aflatoxinas B1, B2, G1 e G2,
ocratoxina A, zearalenona, deoxinivalenol, toxina T-2 e fumonisina (FONSECA, 2006).
No Brasil, esta sendo estudada uma legislação mais ampla que abrange essas
micotoxinas em 16 alimentos, entre eles o arroz.
No caso de contaminação de uma matriz por fungos filamentosos geralmente
não é possível fazer uma determinação direta da biomassa, devido à impossibilidade
de separar eficientemente a biomassa fúngica do substrato, o que descarta os
métodos gravimétricos. A biomassa pode ser medida de forma indireta pela
determinação de componentes celulares como glicosamina (presente na quitina,
componente da parede celular de fungos), ergosterol (presente na membrana celular),
proteínas ou ácidos nucléicos, e até mesmo atividade de enzimas exocelulares
(PANDEY et al., 2001; LONSANE et al., 1985).
A determinação de proteínas tem como principal fonte de erro a presença de
nitrogênio que não é de origem fúngica, presente no substrato (DALSENTER, 2005). A
medida da glicosamina tem mostrado ser um bom indicador para estimar o
desenvolvimento fúngico uma vez que está presente nos fungos e, se encontrada em
materiais vegetais comumente utilizados como substratos em fermentação em estado
sólido, os teores são baixos e interferem pouco na avaliação do desenvolvimento
fúngico (MENESES, 2006; MITCHELL, et al., 2004; NAGEL et al. 2001; SCOTTI,
2001; ROCHE, et al., 1993; DESGRANGES et al., 1991). Todavia, fontes de carbono
utilizadas em fermentação com estruturas químicas semelhantes a da glicosamina
interferem no resultado, e para minimizar esse efeito a mesma determinação deve ser
realizada na biomassa não fermentada (PENMAN et al., 2000) ou podem ser utilizadas
técnicas analíticas que proporcionam a correção do efeito matriz.
O objetivo desse trabalho foi verificar o efeito in vitro do uso de fungicidas no
desenvolvimento fúngico e na manifestação do potencial toxigênico de Fusarium
graminearum tendo arroz como substrato.
98
2 MATERIAL E METODOS
2.1 Amostras
O arroz em casca, utilizado como substrato da fermentação, foi cultivado sem
fungidicas em campos experimentais do Instituto Rio Grandense do Arroz (IRGA),
localizado em Cachoeirinha no Rio Grande do Sul, Brasil. A variedade de arroz BR-
IRGA 417 foi semeada no sistema de cultivo mínimo, com densidade de semeadura
de 100 kg.ha-1. A adubação de base foi com 400 kg.ha-1 de N:P:K (05:20:30). A
adubação nitrogenada em cobertura foi com 80 kg.ha-1 de nitrogênio no arroz com 8
folhas antes do início da diferenciação do primórdio da panícula. Após a colheita as
amostras foram secas até 13% de umidade. O arroz com casca foi encaminhado ao
Laboratório de Ciência de Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande (FURG)
onde foi moído em moinho de facas marca Tecnal modelo Te-631 e armazenado à -
18°C até o momento da fermentação.
2.2 Meio de cultivo para produção de esporos de Fusarium graminearum
Primeiramente, foi verificada a produção de esporos de Fusarium graminearum
em diferentes meios de cultivo de forma a obter o meio mais apropriado para produção
de esporos para serem utilizados durante o processo fermentativo. Foram testados in
vitro os seguintes meios: ágar com folha de cravo (CLA), ágar sintético pobre em
nutrientes (SNA) (ANEXO A) (LESLIE & SUMMERELL, 2006), ágar batata dextrose
3,9% (BDA) e ágar batata dextrose 1,95% (BDA diluído). Esporos do fungo foram
inoculados nos meios que foram levados à estufa a 22°C por 15 dias. Após a
incubação, foi realizada a enumeração de esporos das soluções dos meios de cultura
em câmara de Neubauer.
2.3 Fermentação em estado sólido
2.3.1 Preparo do inóculo
Esporos de Fusarium graminearum foram cedidos pelo departamento de
Fitopatologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. As culturas foram
mantidas a 4°C no meio que proporcionou mais esporos do fungo (item 2.2 - ágar
batata dextrose 1,95%) e os esporos foram propagados através de uma emulsão
99
aquosa de Tween 80 (1%) com auxilio de uma alça de Drigalski, sendo a concentração
dos esporos estimada por enumeração em câmara de Neubauer.
2.3.2 Processo fermentativo
A fermentação foi realizada empregando reatores de bandeja (com dimensões
29 x 17 x 5,5 cm), contendo 100 g de arroz com casca moído formando uma camada
de aproximadamente 2 cm de altura. O substrato foi homogeneizado com 45 mL da
solução salina (KH2PO4 2 g.L-1, MgSO4 1 g.L-1, NH2CONH2 1,8 g.L-1 em HCl 0,4 N) e
suspensão de esporos na concentração inicial de 7,5 x 104 esporos.g-1 (BADIALE-
FURLONG et al., 2007). A adição dos fungicidas (azoxistrobina e trifloxistrobina) foi
feita na concentração de 0,1 mg.kg-1. A umidade foi ajustada para 70% com água
destilada estéril. As bandejas foram cobertas com uma manta de algodão, de forma a
evitar a contaminação e permitir a aeração do meio. A incubação foi realizada em
estufa a 22°C por 30 dias, sendo realizada amostragem da biomassa fermentada de 3
em 3 dias para as determinações das características físico-químicas. As amostras
coletadas foram armazenadas a -18°C até o momento das determinações.
2.4 Determinação de glicosamina
Em 1 g de amostra foram adicionados 5 mL de HCl 6 M, colocando a mistura
em banho de água fervente por 2 horas. Após resfriamento, a amostra foi filtrada e
transferido 1 mL do sobrenadante para balão de 25 mL, adicionando solução alcoólica
de fenolftaleína 0,5 % (p.v-1). A neutralização foi feita com NaOH 3 N até que a mistura
atingisse a coloração rosa e após titulação reversa com solução de KHSO4
1% (p.v-1),
até que essa desaparecesse. O volume do balão foi completado com água destilada.
Para quantificação da glicosamina 3 mL do extrato e 1 mL de solução de acetil
acetona em Na2CO
3 0,5 N (1 mL de acetil acetona em 50 mL de solução Na2CO3 0,5
N) foram colocados em tubo de ensaio, colocando a mistura em banho de água
fervente por 20 min. Após o resfriamento das amostras, foram adicionados 6 mL de
etanol e 1 mL de reagente de Erlich (2,67 g de p-dimetilaminobenzoldeído em 30 mL
de etanol:ácido clorídrico 1:1, e o volume foi aferido para 50 mL com água destilada
em balão volumétrico). Os tubos foram incubados a 65ºC por 10 min, resfriados, e a
absorvância lida em espectrofotômetro (Femto 700 Plus, Brasil) a 530 nm. A curva
padrão foi construída entre as concentrações de 0,01 a 0,20 g.L-1 de glicosamina em
água (AIDOO et al., 1981). O mesmo procedimento para determinação de glicosamina
foi realizado no substrato não fermentado.
100
2.5 Extração e quantificação das micotoxinas
O método de extração utilizado foi de QuEChERS proposto por Anastassiades
et al., (2003) para agrotóxicos e modificado por Hackbart (2009) para micotoxinas.
Foram adicionados 20 mL de água e em seguida 20 mL de acetonitrila em 10 g de
arroz com casca moído. O meio foi acidificado com 0,2 mL de ácido acético e agitado
a 180 rpm por 5 min em mesa agitadora orbital. No extrato, foi adicionada uma mistura
de sais (1,50 g de sulfato de magnésio e 0,85 g de acetato de sódio) e agitado por
mais 5 min. A mistura foi centrifugada (5200 g, 15 min) sendo removidos 6 mL do
sobrenadante para um tubo de centrifuga aos quais foram adicionados 0,30 g de
sulfato de magnésio e 0,20 g de celite agitando manualmente durante 1 minuto. Do
sobrenadante foram removidos 3 mL para um frasco âmbar e o solvente foi seco sob
atmosfera de nitrogênio. Para a determinação cromatográfica, a amostra foi
ressuspensa em 1 mL de acetonitrila grau HPLC J. T. Baker (Brasil).
A quantificação das micotoxinas DON e ZEA no arroz e seus derivados foi
realizada utilizando um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC) composto por
bomba LC-AT, desgaseificador DGU, controlador CBM-20A, detector SPD-20A, injetor
manual 7725i com válvula de injeção de 20 μL, detector RF-10AXL e software LC
Solution- Shimadzu. As condições cromatográficas utilizadas foram fase móvel
composta de água:acetonitrila (93:7), fluxo de 0,6 mL.min-1 por 7 min e coluna C18
Bondesil (4,6 mm x 25 cm x 5 μm). O DON foi detectado em ultravioleta (UV) com
comprimento de onda de 218 nm e a ZEA em detector de fluorescência (FL) no
comprimento de onda de excitação e emissão de 270 e 455 nm, respectivamente.
2.6 Análise estatística
Os resultados das determinações de glicosamina e micotoxinas foram
avaliados pela comparação de médias de Tukey com nível de significância de p < 0,05
utilizando o Software Statistica v. 7.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O meio ágar batata dextrose 1,95% foi o que forneceu maior concentração de
esporos de Fusarium graminearum (8,81.106 esporos.mL-1), seguido dos meios folha
de cravo ágar (3,59.106 esporos.mL-1), ágar sintético pobre em nutrientes (1,19.106
esporos.mL-1) e por último o ágar batata dextrose 3,90% (0,94.106 esporos.mL-1). A
101
atividade de água mínima para a multiplicação de Fusarium é de 0,90 (SCUSSEL,
2002), o que pode explicar o melhor desenvolvimento desse fungo no meio com maior
atividade de água. Os meios de cultura proporcionaram Fusarium graminearum com
micélios aéreos de pigmentação rosa esbranquiçada a exceção do meio ágar sintético
pobre em nutrientes em que o fungo apresentou micélio raso esbranquiçado (Figura1).
CLA SNA BDA (3,9%) BDA (1,9%)
Figura 1. Halos de fungos nos meios de cultura estudados.
Amorim et al., (1991) estudando a multiplicação de Fusarium nos meios
cenoura dextrose ágar (CDA), farinha de milho dextrose ágar (FDA), ágar batata
dextrose (BDA), arroz dextrose ágar (ADA) e malte dextrose ágar (MDA) verificaram
que para a multiplicação micelial o fungo utilizou melhor o meio CDA, BDA e FDA,
porém esporulou mais no BDA. Angelotti et al., (2005) para identificarem espécies de
Fusarium associado a giberela do trigo e triticale cultivaram esse fungo em meio ágar
batata dextrose (BDA), no escuro para verificar a morfologia das colônias
(pigmentação e multiplicação micelial) e em meio de folha de cravo ágar (FCA) para
avaliar a forma e o tamanho de macroconídios, formação, forma e tamanho de
microconídios e formação de clamidósporos. Franco, (2007) verificaram que grãos de
sorgo mantidos no claro promoveram esporulação superior de Fusarium tucumaniae
quando comparados ao cultivo no escuro. Esses resultados indicam que dependendo
da finalidade que se pretende cultivar Fusarium deve-se utilizar um ou outro meio de
cultura, visto que estes micro-organismos são muito susceptíveis as condições do
meio.
Conforme mostra a Tabela 1, a glicosamina aumentava ao longo da
fermentação do arroz com e sem fungicidas, apresentando diferença estatística entre
o meio sem e com fungicidas até o 6º dia, sugerindo que ambos os fungicidas
utilizados mantém seu principio ativo até em torno desse período, sendo a taxa de
multiplicação de fungos menor para o meio com azoxistrobina (0,077 mg.g-1.dia-1) do
que para os meios sem fungicida e com trifloxistrobina (0,177 mg.g-1.dia-1) até esse
período. No decorrer da fermentação, a taxa da multiplicação de fungos variou, porém,
ao final dos 30 dias a média foi a mesma para os meios com e sem fungicidas (0,1
mg.g-1.dia-1).
102
Tabela 1. Glicosamina (mg.g-1) no arroz com e sem fungicidas.
AZO TRI Sem fungicida
NF 1,7eA 1,7Ea 1,7fA
0 3,8dAB 2,7cdeB 4,3eA
3 3,9dB 2,5deC 4,9deA
6 4,2dB 3,5bcdB 5,7bdA
9 4,5dA 4,3bcA 5,9bcdA
12 4,4dB 4,6bB 6,0bcA
15 4,9cdC 7,2aA 6,2abcB
18 6,5bcAB 7,1aA 6,2abcB
21 6,8abB 7,8aA 6,7 abcB
24 7,1abA 7,7aA 6,9abA
27 8,1abA 8,1aA 7,0abA
30 8,4aA 8,3aAB 7,3aB
AZO = azoxistrobina; TRI = trifloxistrobina; NF = não fermentado.
Letras minúsculas demonstram diferença ou semelhança entre os dias da fermentação; Letras
maiúsculas demonstram diferença ou semelhança entre a utilização ou não de fungicidas.
Na Tabela 2 estão os valores das micotoxinas produzidas por F. graminearum
nas condições dos experimentos, e pode ser verificado que houve aumento na
concentração de DON ao longo da fermentação quando foram utilizados ou não os
fungicidas, sendo esse aumento igual até o 9º dia, chegando a maiores níveis no meio
sem fungicida ao final da fermentação. A concentração de ZEA aumentou durante a
fermentação quando foram utilizados fungicidas, mas não aumentou no meio sem os
fungicidas. Além disso, a produção de ZEA foi a mesma em todos meios até o 12º dia
variando após esse período e atingindo maiores concentrações nos meios com
fungicida ao final da fermentação, sugerindo que esse influencia de forma diferente a
produção de cada micotoxina, e/ou que as vias metabólicas de síntese são
influenciadas em pontos diferentes.
103
Tabela 2. Micotoxinas no arroz com e sem fungicidas.
DON (µg.g-1) ZEA (µg.g-1)
AZO TRI Sem
fungicida AZO TRI
Sem
fungicida
NF 1,6cA 1,6cA 3,0dA 6,3eA 6,3fA 4,8aA
0 3,7 cdA 1,8 cA 5,2dA 9,7deA 9,7efA 5,0aA
3 2,7 cdA 2,1 bcA 5,5dA 9,4deAB 12,3cdefA 5,8aB
6 3,0 cdA 2,6abcA 3,1dA 8,5deA 8,9efA 4,9aA
9 2,7 cdA 3,8abcA 5,3dA 7,9eA 11,1defA 5,0 aA
12 3,8 bcdB 4,7aAB 8,1dA 6,7eA 12,0cdefA 5,9 aA
15 4,3 bcdA 1,4cB 3,4dAB 10,6deAB 16,7bcdefA 6,7 aB
18 3,9 bcdA 2,4abcA 2,7dA 14,2cdeB 21,8bcA 6,7aC
21 5,8abdA 3,7abcA 5,5dA 22,4bcdA 17,1bcdeAB 6,8aB
24 7,9aB 2,5abcC 58,1aA 27,4bcA 20,5bcdA 4,8aB
27 6,9abB 3,8abcB 39,8bA 32,7abA 25,9abA 4,8aB
30 6,1abdB 4,5abB 24,3cA 41,9aA 35,9aA 5,0aB
AZO = azoxistrobina; TRI = trifloxistrobina; NF = não fermentado.
Letras minúsculas demonstram diferença ou semelhança entre os dias da fermentação; Letras
maiúsculas demonstram diferença ou semelhança entre a utilização ou não de fungicidas.
A maioria dos trabalhos encontrados na literatura que avaliaram o efeito do
fungicida no controle de doenças nas plantas leva em consideração o rendimento em
grãos (JUNIOR et al., 2004; MARZARI et al., 2007; POLI, 2009; SILVA, 2009), que é
de fato de maior interesse para o produtor, e o foco mais frequente vem sendo dado a
cultura de trigo. Poucos trabalhos relatam o efeito desses produtos químicos na
produção de toxinas no grão, que pode causar sérios danos a saúde de humanos e
animais que consomem esses derivados. Blandino et al., (2006) estudaram o efeito do
uso de fungicidas em grãos de trigo de inverno no controle da giberela de Fusarium,
rendimento e concentração de DON nos grãos. Os ensaios tratados com uma mistura
de triazóis e estrobirulinas, apesar de aumentar o rendimento em grãos (8%)
comparado ao tratamento com triazóis, e mostrar uma redução na sintomatologia do
patógeno (80% na incidência de giberela em comparação a testemunha), induziu a
produção de DON, que frequentemente foi superior a testemunha nas condições mais
úmidas. O presente trabalho também não mostrou relação direta entre redução de
fungo e de micotoxinas e o uso de fungicidas, confirmando que essa relação é
104
bastante dependente do tipo de principio ativo utilizado, do fungo, das micotoxinas e
seus caminhos de biossintese, da matriz em estudo e das condições do cultivo.
Gonzalez et al., (2006) em seu estudo, verificaram a presença de ocratoxina A
em 7,8% das amostras de arroz não orgânico com contaminação de 4,3 a 27,3 µg.kg-1,
enquanto que 30% das amostras orgânicas estavam contaminadas com a micotoxina
em níveis que variaram entre 1 a 7,1 µg.kg-1.
Folcher et al., (2009), verificaram uma redução na população de insetos e de
micotoxinas (tricotecenos, fumonisina e zearalenona) na cultura de milho resultante do
tratamento com inseticida, porém não houve redução para Fusarium spp., nem de
micotoxinas quando utilizado inseticida+fungicida. Porém, Reddy & Muralidhraran,
(2009) verificaram que tanto os fungicidas (carbendazim, contaf plus, folicur,
propiconazol e saaf) como as substâncias químicas não convencionais (vanilina e
cloreto de sódio) inibiram a multiplicação micelial de Aspergillus ssp. e produção de
aflatoxina B1 em arroz.
Dors, (2010) estudou durante 4 safras o efeito do uso de tebuconazole na
produção de micotoxinas durante o cultivo do arroz e verificou que o uso desse
fungicida estava relacionado com a manifestação do potencial toxigênico da micota.
Dentre as amostras avaliadas, 87% estavam contaminadas com DON e ZEA, sendo
que todas as tratadas com fungicida estavam contaminadas com uma dessas
micotoxinas e a contaminação com aflatoxina B1 e ocratoxina A foi verificada em 37%
das amostras, sendo a metade delas tratadas.
Koch et al., (2005) estudaram o efeito de fatores ambientais, de práticas
culturais e suas interações na produção de DON em grãos de trigo e demonstraram
que a escolha de uma cultivar resistente à pragas é uma ferramenta muito importante
para assegurar baixos níveis de DON nos grãos, mesmo sob condições favoráveis
para sua produção.
Visto o sistema de cultivo irrigado do arroz, uma prática consagrada no Rio
Grande do Sul, e o sistema de cultivo mínimo, o F. graminearum continuará a infectar
a cultura, devendo os produtores atentar para a utilização de práticas culturais que em
conjunto possam agregar os interesses do produtor e do consumidor. Isso poderá
resultar num arroz com elevado rendimento em grãos e sem presença de compostos
tóxicos, ou pelo menos dentro de limites máximos aceitáveis por legislações de países
que regulam micotoxinas.
105
4 CONCLUSÃO
O aumento dos níveis de glicosamina, indicador da multiplicação de fungos, ao
longo da fermentação do arroz com e sem fungicidas, demonstrou que eles não
impossibilitam o desenvolvimento fúngico. Ambos os fungicidas (azoxistrobina,
trifloxistrobina) mantiveram sua capacidade de reduzir a velocidade de multiplicação
de fungos até o 6º dia. A presença dos fungicidas esta relacionada com a indução da
produção de ZEA, mas os níveis de DON foram menores quando eles foram
adicionados nos meios.
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110
CAPÍTULO IV
111
5 CONCLUSÕES GERAIS
Os indicativos de mérito da validação do método de QuEChERS modificado
com aplicação no arroz em casca moído em HPLC-UV-RF tiveram limites de detecção
para o método e instrumento de 30 µg.kg-1 e 100 µg.L-1 para DON e de 6 µg.kg-1 e 20
µg.L-1 para ZEA e os limites de quantificação de 300 µg.kg-1 e 1000 µg.L-1 para DON e
de 60 µg.kg-1 e 200 µg.L-1 para ZEA, respectivamente. A precisão instrumental foi de
1,3% para DON e 4,9% para ZEA. A repetibilidade (RSDr) e precisão intermediária
(RSDpi) foram de 0,2 a 8,1% e 1,5 a 8,1%, respectivamente. A recuperação foi de
81,6% para DON e de 86,1% para ZEA. O processo de parboilização favoreceu a
contaminação com ZEA no endosperma.
No estudo in vivo, o desenvolvimento fúngico e a contaminação com ZEA
ocorreram em todas as amostras e DON em 92%. Apesar dos fungicidas
azoxistrobina, trifloxistrobina, ciproconazole e propiconazole terem sido eficientes para
o controle de Fusarium, podem ter favorecido a produção das micotoxinas DON e
ZEA. Além disso, a utilização de fungicidas estimulou o desenvolvimento de 5
(Bipolaris, Curvularia, Phoma, Alternaria auternata e Penicillium) dos 13 gêneros
estudados.
Durante o estudo in vitro, os fungicidas azoxistrobina e trifloxistrobina
demonstraram capacidade de reduzir a velocidade de multiplicação de Fusarium
graminearum até o 6º dia de fermentação, mas não impossibilitaram o
desenvolvimento de fungos ao longo dos 30 dias do estudo. A presença dos fungicidas
induziu a produção de ZEA, mas os níveis de DON foram menores em sua presença.
Quanto às características físico-químicas da biomassa, o uso dos fungicidas
proporcionou redução na umidade e aumento no conteúdo de cinzas e proteínas. Os
lipídios variaram pouco com o desenvolvimento da biomassa. O pH aumentou quando
foi utilizado azoxistrobina e a acidez foi maior na ausência dos fungicidas. Os
antifúngicos sintéticos praticamente não alteraram o conteúdo de fenóis, porém,
reduziram a atividade de α-amilase, protease e lipase.
112
CAPÍTULO V
113
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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139
ANEXO A – Preparo dos meios de cultivo CLA e SNA para produção de esporos de
Fusarium graminearum.
140
Folha de Cravo Ágar (CLA)
O meio CLA foi preparado colocando folhas de cravo estéril com
aproximadamente 3-5 mm² em uma placa de petri estéril contendo ágar 2% diluído em
água. Um pedaço de folha de cravo foi acrescentado por 2 ml de meio. As folhas de
cravo foram preparadas a partir de folhas frescas livre de resíduos de fungicida ou
inseticida. As folhas foram cortadas em pedaços 5-8 mm², e foram secas em estufa a
70°C por 4 horas. Os pedaços de folhas secas foram acondicionados em placas de
petri estéreis até serem utilizados.
Ágar sintético pobre em nutrientes (SNA)
Para preparer o meio SNA foi autoclavado o meio com 1 L de água contendo: 1
g de KH2PO4, 1 g de KNO3, 0,5 g MgSO4.7H2O, 0,5 g KCl, 0,2 g de glicose, 0,2 g de
sacarose e 20 g de ágar. Em cada placa de petri estéril foi colocado um pedaço de 1
cm2 de papel filtro Whatman № 1 estéril em 20 mL do meio.
