はじめにForenSeq DNA Sigunature Prepキットは、法医学ゲノム解析アプリケーション専用に設計された、検証済みの 1包括的なDNAからデータまでのソリューション、MiSeq FGx™ システムの一部です（図 1）。ForenSeq DNA Signature Prepキットには、科学捜査用 DNAサンプルからシーケンス用ライブラリー *を調製するために必要なすべての試薬が含まれています（図 2）。シンプルなプレートフォーマットのワークフローにより、業界で最も信頼され、広く採用されているテクノロジー 2、イルミナ次世代シーケンサー（NGS）用に最大 96個の DNAサンプルを調製します。

ForenSeq™ DNA Signature Prepキット複雑な混合物や分解された DNAから高解像度の卓越した精度を達成

• 複数の STRキットが不要に

200個の遺伝子マーカーを 1度の統合されたワークフローで解析

• 幅広い有益な SNPへのアクセス

法医学上関連性の高い高密度の SNPセットが、既存技術では得ることができない貴重な情報を提供

• 困難なサンプルを優れた性能で解析

複雑な混合物や分解された DNAでも、わずか 1ngのDNAから高性能を発揮

• マルチプレックス操作と迅速なサンプル処理

シンプルなプレートフォーマットとラボの標準的機器を使用して、最大 96サンプルのライブラリーを同時に調製

特長

ForenSeq DNA Signature Prepキットは、ライブラリー調製、DNAシーケンシングプラットフォーム、および法医学ゲノム解析専用に設計されたデータ解析ソフトウェアを含む、「Sample to Answer」の統合されたソリューションの一部です。

図1：ForenSeq DNA Signature Prepキットのワークフロー

* シーケンス用「ライブラリー」とは、1つの DNAサンプルから得られる増幅されたDNA断片の集まりです。

a. SNPおよび STRの染色体位置は、「ForenSeq DNA Signature Prep Kit User Guide」（support.Illumina.com/downloads/forenseq-dna-signature-prep-guide-15049528.html）に記載されています。

表1：ForenSeq DNA Signature Prepキット法医学用の遺伝子座

機能マーカーの数 a

アンプリコンサイズの範囲（bp）

DNA Primer

Mix Aに含まれる

DNA Primer

Mix Bに含まれる

常染色体 STR 27 61-467 はい はい

Y-STR 24 119-390 はい はい

X-STR 7 157-462 はい はい

個人識別 SNP 95 63-231 はい はい

表現型 SNP 22 73-227 いいえ はい

人種識別 SNP 56 67-200 いいえ はい

ForenSeq Prepキット

ForenSeq Prepキット

ForenSeq Prepキット

MiSeq FGxシステム

ForenSeqソフトウェア

ターゲットを識別し、増幅

インデックス化されたライブラリーを濃縮し、精製

ライブラリーを標準化し、プール

クラスター形成および DNAシーケンスを自動的に実行

データを解析し、表示し、レポートを作成

ForenSeq DNA Signature Prepキットには、PCR試薬、インデックスアダプター、精製および標準化ビーズなど、シーケンス用の DNAライブラリーを調製するために必要なすべての試薬が含まれます。

図2：ForenSeq DNA Signature Prepキット

Data Sheet: Forensic Genomics

複数の STRキットが不要にForenSeq DNA Signature Prepキットは、現在ケースワークおよび犯罪捜査 DNAデータベース作成のために全世界で使用されている、すべての常染色体短反復配列（STR）マーカーを、1度に解析できるワークフローに統合しています。これにより複数の STR試験を実行する必要がなくなりました（図 3）。さらに重要な点として、DNAの量が限られている場合には関連性の高いSTR試験の「いずれかを選択」する必要があり、有益な情報が得られる可能性のある遺伝子データを見逃すリスクがあるという問題がありました。ForenSeq DNA Signature Prepキットは約 200個の遺伝子マーカーを 1度の解析で提供するため、DNAの量が少ないなどの手法の制約によるトレードオフやリスクもなくなります。さらに、DNAの必要量がわずか 1ngであるため、貴重なサンプルを使って別の様々なケースに対応することができます。

より幅広い有益な SNPにアクセス直接的な STRプロファイルの比較では容疑者が見つからず、地域または国内の犯罪捜査 DNAデータベースで手がかりが見つからない場合は、ケースワークが非常に困難になります。常染色体STR、X-STR、および Y-STRに加えて、ForenSeq DNA Sig-nature Prepキットは、従来のキャピラリー電気泳動（CE）法では通常は得られないマーカーセットを提供します。これには、DNAの持ち主の属性特定に有益な同定情報を提供する 1塩基多型（iiSNP）3,4、目の色（青、中間色、茶）、髪の色（茶、赤、黒、ブロンド）の予測に役立つ表現型の情報を提供する SNP（piSNP）5、生物地理学的起源の情報を提供する人種識別 SNP（aiSNP）6 の高密度のセットが含まれます。aiSNPおよびpiSNPは、他の方法では行き詰まることがある「該当データなし」のケースで捜査の手がかりを得るために非常に重要です（表 1）。

困難なサンプルを優れた性能で解析多くのケースは複雑で、場合によっては分解が進んだ DNA、質の低い DNA、または複雑な DNA混合物の存在といった原因のために解決されないこともあります。ForenSeq DNA Signature Prepキットでは、このような困難なサンプルの処理能力が向上しています。

ForenSeq DNA Signature Prepキットに含まれるほとんどのSNPには、サイズが 125bp以下のアンプリコンが含まれるため、分解された DNAや、さらには大きく阻害された DNA抽出物の解析に最適です（図 4）。また、ForenSeq DNA Signature Prepキットは、従来の STRおよび CE解析では検出されないことがある混合物中の低濃度の微量成分を検出する能力が向上しています。この能力の向上は、キットに含まれる（多くは多型性の）数多くのマーカーと、合成化学によるイルミナ次世代シーケンスに固有の感度の組み合わせにより実現されたものです（図 5）。

マルチプレックス操作と迅速なサンプル処理ForenSeq DNA Signature Prepキットは、シンプルなプレートフォーマットと、標準的な機器を利用して、最大 96サンプルのライブラリーの同時調製をサポートしています。1回の反応で、プライマーミックス Aによりすべての常染色体、X染色体、および Y染色体 STRターゲットに加えて、すべての iiSNPセットの試験が可能です。プライマーミックス Bには aiSNPおよびpiSNPも含まれます。

ForenSeq DNA Signature Prepキットの特長：

• マルチプレックス操作 -1回の反応でSTRおよびSNPアンプリコンを増幅し、1回のシーケンシングランで最大 96サンプルのシーケンスを行います。

• DNA Primer Mix A-59の STR（27個の常染色体 STR、7個の X、および 24個の Yハプロタイプマーカーを含む）および同定情報を提供する 95の SNPのプライマー対が含まれます。

• DNA Primer Mix B-DNA Primer Mix Aのすべてのマーカーに加えて、生物地理学的起源に関する情報を提供する 56のSNP、および表現型に関する情報を提供する 22の SNP（2つの aiSNPも表現型の予測に使用される）のプライマー対が含まれます。

使いやすく統合されたワークフローによって、トレーニングプログラム、検証手順、習熟度試験、また外部認定および認証プログラムにより求められるその他の品質保証 /品質管理法が簡略化され、ラボの効率も最大化されます。このソリューションは、既存のキャピラリー電気泳動法によるアリル呼び出しとの下位互換性があります。

まとめForenSeq DNA Signature Prepキットは、法医学ゲノム解析アプリケーションに特化して設計されたエンドツーエンドの次世代シーケンスソリューションの一部です。ForenSeq DNA Signature Prepキットは、MiSeq FGxシステムの高いスループットと卓越したデータ精度をさらに高めます。

1回のワークフローに約 200個の遺伝子マーカーが含まれるMiSeq FGxシステムは、STRおよび SNPの最も包括的なマルチプレックス操作を行い、人物特定への最も直接的な道筋を提供します。

図3：ForenSeq DNA Signature Prepキット法医学用の遺伝子座確認と捜査のワークフロー

全常染色体 STR

Y-STR

X-STR

個人識別 SNP

生物地理学的人種識別 SNP

表現型 SNP

ForenSeq DNA Signature Prepキット

被疑者

いいえ はい

データベース検索

該当 該当なし

レポート作成 捜査の手がかり

被疑者を含める 被疑者を除外

レポート作成 捜査の手がかり

Data Sheet: Forensic Genomics

ForenSeq DNA Signature Prepキットでの高分子量 gDNAと一部が分解された gDNAの性能の比較。ほとんどの ForenSeq SNP（黒い円）は長さが125bp未満であるため、不明サンプルから最大限の情報を抽出できます。すべて、またはほとんどの STR（青い円）が失われた場合でもパワフルな統計データが算出されます。比較できる容疑者がいない場合は、DNAプロファイルが部分的なものであっても、遺伝子に関する捜査の手がかりを別のタイプの SNPから得ることができます。

図4：完全な高分子DNAと分解されたDNAの解析の比較

スタッター、アリル数、不均衡などのクオリティアイコン（灰色のパネル）と単一由来サンプルのカラーインジケータ（緑 /オレンジ色のドット）を使用したDNAの検出。ポップアップパネルを使用して遺伝子座データを詳しく調べ、サンプル混合物を確認し、解読します。たとえば、SNP遺伝子座のボックスをクリックすると、アリル間の定量強度の均衡を示す円グラフを含むポップアップが表示されます。

図5：ForenSeq DNA Signature PrepキットによるDNA混合物の検出

スタッター アリル数

解読閾値 ユーザー変更点

不均衡 低カバレッジ

単一由来サンプル94/94 遺伝子座タイプ

単一由来サンプル遺伝子座間の均衡56/60 遺伝子座タイプ

完全な高分子 gDNA

長さ（bp）

強度（読み取り数）

強度（読み取り数）

長さ（bp）

一部が分解された gDNA

STR（DYS635）アリル名：23長さ（bp）：274強度（読み取り数）：625

Data Sheet: Forensic Genomics

4. Sanchez JJ, Phillips C, Borsting C, Balogh K, Bogus M, et al. (2006)A multiplex assay with 52 single nucleotide polymorphisms for human identi� cation. Electrophoresis 27(9): 1713–1724.

5. Walsh S, Liu F, Wollstein A, Kovatsi L, Ralf A, et al. (2013) The HIrisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from DNA.Forensic Sci Int Genet 7(1): 98–115.

6. Kidd KK, Speed WC, Pakstis AJ, Furtado MR, Fang R, et al. (2013)Progress toward an ef� cient panel of SNPs for ancestry inference.Forensic Sci Int Genet 10: 23–32

詳細情報ForenSeq DNA Signature Prepキットの詳細については、次のウェブサイトをご覧ください。www.illuminakk.co.jp/products/forenseq-dna-signature-kit.ilmn

MiSeq FGxシステムについては、次のウェブサイトをご覧ください。www.illuminakk.co.jp/systems/miseq-fgx.ilmn

ForenSeqユニバーサル解析ソフトウェアについては、次のウェブサイトをご覧ください。www.illumina.com/informatics/research/sequencing-data-analysis-management/forenseq-universal-analysis-software.html

MiSeq FGxシステムを使用したミトコンドリア DNA解析については、次のウェブサイトをご覧ください。www.illuminakk.co.jp/applications/forensics/missing_persons_and_unidenti� ed_human_remains.ilmn

参考文献1. The full MiSeq FGx System work� ow is validated per the Scienti� c

Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM) guidelines (www.swgdam. org).

2. Nakazato T, Ohta T, Bono H. (2013) Experimental design-based func-tional mining and characterization of high-throughput sequencing data in the sequence read archive. PLoS One 22;8(10): e77910.

3. Kidd KK, Pakstis AJ, Speed WC, Grigorenko EL, Kajuna SL, et al. (2006) Developing a SNP panel for forensic identi� cation of individuals. Forensic Sci Int 164(1): 20–32.

表3：ForenSeq DNA Signature Prepキットキットの内容

試薬 説明

ボックス 1

FCD ForenSeq Control DNA

PCR1 ForenSeq PCR1Reaction Mix

DPMA DNA Primer Mix A

DPMB DNA Primer Mix B

FEM ForenSeq Enzyme Mix

ボックス 2

PCR2 ForenSeq PCR2 Reaction Mix

HP3 2N NaOH

LNA1 Library Normalization Additives 1

LNS2 Library Normalization Additives 2

LNW1 Library Normalization Wash 1

HSC Human Sequencing Control

A501～ A508 i5 Indexed Adapters

R701～ R712 i7 Indexed Adapters

ボックス 3

SPB Sample Puri� cation Beads

RSB Resuspension Buffer

LNB1 Library Normalization　Beads 1

製品情報

製品 カタログ番号

ForenSeq DNA Signature PrepKit TG-450-1001

ForenSeq Index Adapter Fixture FC-451-1001

仕様 値

サンプルタイプgDNA、口腔粘膜採取物、FTAカード

サンプルあたりのヒト gDNAの最少必要量

1ng

サンプルあたりの FTAカードパンチの最少必要量

1.2mm

ランあたりのマルチプレックス処理能力 8~96サンプル

アンプリコンサイズ ≧65bp

混合物の検出精度主要成分の 5%未満の微量成分を検出

遺伝子座マルチプレックス能力約 200個の遺伝子マーカーを同時に解析

表2：ForenSeq DNA Signature Prepキットの仕様

Data Sheet: Forensic Genomics

代理店イルミナ株式会社

本製品の使用目的は研究に限定されます。© 2015 Illumina, Inc. All rights reserved.

販売条件：www.illuminakk.co.jp/tc_fgx

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Pub. No. 1470-2014-J003 29MAY2015