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I
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
FORMAS DE DIAGNÓSTICO DE Mycobacterium tuberculosis e
Mycobacterium bovis
Fernando Augusto Fernandes Corrêa
Orientador:Prof. Dr. Edmar Soares Nicolau
GOIÂNIA
2011
II
FERNANDO AUGUSTO FERNANDES CORRÊA
FORMAS DE DIAGNÓSTICO DE Mycobacterium tuberculosis e
Mycobacterium bovis
Seminário apresentado junto à
Disciplina Seminários Aplicados do
Programa de Pós-Graduação em
Ciência Animal da Escola de Veterinária
da Universidade Federal de Goiás.
Nível: Mestrado
Área de concentração:
Sanidade, Higiene e Tecnologia de Alimentos
Linha de Pesquisa:
Higiene, ciência, tecnologia e inspeção de alimentos
Orientador:
Prof. Dr. Edmar Soares Nicolau - UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Albenones José de Mesquita - UFG
Prof. Dr. Eurione Antônio Garcia da Veiga Jardim – UFG
GOIÂNIA
2011
III
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO DE LITERATURA 5
2.1 Histórico 5
2.2 Agente 7
2.3 Epidemiologia 9
2.4 Zoonose 11
2.5 Diagnóstico 13
2.5.1 Histopatológico 14
2.5.2 Baciloscopia 15
2.5.3 Cultura 17
2.5.4 Raio X 22
2.5.5 PCR 22
2.5.6 Tuberculinização 24
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS 29
REFERÊNCIAS 30
1
1 INTRODUÇÃO
A tuberculose é uma doença infecto contagiosa crônica que possui
processos inflamatórios específicos que pode causar infecções no homem e em
todo os mamíferos e aves (CORREA; CORREA, 1992). É uma zoonose de
grande importância para a classe veterinária transformando em uma zoonose
ocupacional tanto a veterinários que trabalham a campo, quanto veterinários na
clínica e em inspeção de produtos de origem animal, devido à manipulação
incorreta de animais, carnes, leite e outros produtos ou sub produtos
contaminados.
A tuberculose é um dos principais problemas de saúde publica em um
grande número de países, no Brasil o Sistema de Informação de Agravos de
Notificação do Ministério da Saúde (SINAN-MS) mostra que 85 mil novos casos
de tuberculose são notificados todo ano no Brasil, sendo que a maioria é por
diagnóstico apenas clínico ou epidemiológico, não tendo o costume de coletar
amostras para a realização de cultura para a identificação do bacilo. E destes,
aproximadamente 6.000 vem a óbito anualmente, mesmo o tratamento tendo uma
eficácia acima dos 95%. Estima-se que esta doença ainda atravessará as
próximas décadas utilizando grande parte dos recursos destinados à saúde e
gerando muito sofrimento nas pessoas (BRASIL, 2002).
A Organização Mundial da Saúde estima que dois de bilhões pessoas do
mundo, o que representa um terço da população mundial, estão infectadas com
os agentes causadores da tuberculose. E somente 22 países são responsáveis
por mais de 80% do total de casos de Tuberculose no mundo. O primeiro lugar no
Ranking é a Índia, o Brasil neste, está em 15º lugar (HIJJAR et al. 2001;
BIERRENBACH, 2007), pelos dados já expostos sobre a quantidade de novos
casos pelo SINAN-MS o coeficiente de incidência corresponde a quase
50/100.000 habitantes. Devido a isso a OMS criou o Plano Mundial para Deter a
Tuberculose, o plano pretende controlar a tuberculose no mundo entre os anos de
2006 a 2015 (WHO, 2006).
Apesar de ser uma das doenças mais estudadas e possuir relatos de sua
ocorrência em humanos em fosseis da era Neolítica e em Múmia, a tuberculose
continua sendo um dos grandes mistérios e desafios da Saúde Pública,
2
principalmente nos países em desenvolvimento. A tuberculose humana é
considerada a principal causa de morte em adultos por um único agente
infeccioso, sendo responsável por 26% das mortes passíveis de prevenção no
mundo, tendo o Mycobacterium tuberculosis como a causa mais comum de
tuberculose humana e uma proporção desconhecida de casos provocados pelo
Mycobacterium bovis (HIJJAR et al., 2001, MAZARS et al., 2001, COUSINS,
2001).
Dentre as mortes por tuberculose relatadas na história temos algumas
vitimas famosas como:
Álvares de Azevedo (1831 - 1852) (20 anos), escritor brasileiro;
Auta de Souza (1876 - 1901) (24 anos), poetisa brasileira;
Castro Alves (1847 - 1871) (24 anos), poeta brasileiro;
Ismael Nery (1900 - 1934) (33 anos), pintor brasileiro;
João de Cruz e Sousa (1861 - 1898) (36 anos), escritor brasileiro,
precursor do estilo literário Simbolismo;
José de Alencar (1829 - 1877) (48 anos), escritor brasileiro;
Manuel Bandeira (1886 - 1968) (82 anos), escritor brasileiro;
Noel Rosa (1910 - 1937 (26 anos), cantor e compositor brasileiro;
D. Pedro I do Brasil (IV de Portugal) (1798 - 1834) (35 anos);
Anton Tchecov (1860 - 1904) (44 anos), escritor Russo;
George Orwell (1903 - 1950) (46 anos), escritor Britânico;
Giovanni Battista Pergolesi (1710 - 1736) (26 anos), compositor italiano
do Barroco;
Júlio Dinis (1839 - 1871) (31 anos), escritor português;
Cesário Verde (1855 - 1886) (31 anos), poeta português;
Lev Vygotsky (1896 - 1934) (37 anos), psicólogo bielo-russo;
Souji Okita (1843- 1868), samurai do séc XIX, pertencente à milícia
Shinsengumi, que morreu de tuberculose aos 25 anos, no primeiro ano da era
Meiji;
Vivien Leigh (1913 – 1967) (53 anos), atriz inglesa, vencedora de 2
Academy Awards, famosa por seu papel como Scarlett O'Hara na adaptação
cinematográfica de E o Vento Levou, de 1939;
3
John Keats (1795 - 1821) (25 anos), poeta inglês. Foi o último dos poetas
românticos do país.
Em humanos o principal agente causador da tuberculose é o M.
tuberculosis. O Mycobacterium bovis é o agente responsável pela tuberculose
bovina que continua a ser um grande problema econômico em vários países e
constitui um sério risco a saúde publica nos países em desenvolvimento. Nos
bovinos, geralmente, a tuberculose é de natureza crônica, o bovino pode
transmitir o bacilo mesmo antes de apresentar sintomatologia e lesões
características. (GOODCHILD & CLIFTON-HADLEY 2001, LIVINGSTONE et al,
2006)
Dados do IBGE (2009) mostra que o rebanho bovino no Brasil era de
aproximadamente 205 milhões de cabeças em 2009. As informações sobre a
incidência de bovinos tuberculosos no Brasil são escassas, o Ministério da
Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) indica que a média da prevalência
nacional é de 1,3%, dados de notificações obrigatórias do ano de 1989 a 1998
(BRASIL, 2006), Caso mantenha esta média mais de 2 milhões de cabeças são
positivas para tuberculose. Como há uma sub notificação dos casos,
aproximadamente 40% dos testes positivos não são notificados (PARDO, et al.,
2001), a provável incidência está além destes informados pelo MAPA. Em um
levantamento realizado pelo MAPA em 1999 no estado de Minas Gerais, estimou
a prevalência aparente de animais infectados em 0,8% dos 23.000 analisados,
neste estudo mostrou que 5% das 1.600 propriedades visitadas possuíam animais
positivos, e este valor subiu a 15% em propriedades leiteiras (BRASIL, 2006).
Este alto índice (comparado às propriedades totais) se dá devido a forma de
criação do gado leiteiro, pois estes animais tem um contato maior entre si e o
tempo de permanência destes na propriedade é muito superior ao gado de corte.
As perdas econômicas levadas por esta enfermidade nos bovinos
destacam-se a redução de 10 a 20% da produção de leite e ganho de peso,
infertilidade e na condenação de carcaças nos frigoríficos (BRASIL, 2006).
Apesar de saber que sempre ocorre uma baixa notificação dos casos, a
tuberculose bovina está em níveis percentuais baixos devido ao programa
instaurado pelo MAPA intitulado de Programa Nacional de Controle e Erradicação
da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT). Neste programa os animais
4
comprovadamente positivos para tuberculose (de acordo com a reação à
aplicação intra-dérmica da tuberculina) são sacrificados; este modelo de
programa é utilizado em muitos países industrializados (COUSINS, 2001,
BRASIL, 2006). Tem-se esta rigorosidade de sacrificar os animais pois a
tuberculose bovina é uma zoonose, sendo transmitida diretamente pela via
aerógena, quando inalado o M. bovis no ar, ou indiretamente, pelo consumo de
leite e produtos lácteos não pasteurizados ou pela ingestão de carne ou produtos
cárneos contaminados (FIGUEIREDO, et al., 2008)
Em países onde há outros animais de vida selvagem que possam
transmitir a tuberculose aos bovinos são utilizados vacinas contra tuberculose
para serem utilizadas como estratégia de controle nos rebanhos bovinos
(BUDDLE, et al., 2006) porém a vacina é uma técnica que não tem grande
eficiência onde a tuberculose é endêmica. O controle por meio de vacinas no
Brasil é feito somente em seres humanos.
Devido à situação Mundial referente à tuberculose, é de extrema
necessidade desenvolver métodos para um rápido diagnóstico desta doença. O
padrão ouro para diagnóstico do Mycobacterium sp., em humanos, é a cultura
para a identificação do bacilo, método que pode demorar até de 20 a 40 dias para
o resultado, com o advento da AIDS, formas disseminadas rapidamente
progressivas de tuberculose e de outras micobacterioses, são encontradas com
freqüência. Em contraste com o passado, quando a natureza crônica da doença
tornava aceitável essa espera pelo resultado, porém as apresentações
disseminadas em imunodeprimidos exigem diagnóstico mais rápido.
Diante do exposto, objetivou-se, com o presente trabalho, mostrar fatos
históricos importantes relacionados à tuberculose assim como a importância do
agente causador da doença e mostrar formas de diagnóstico de tuberculose e
identificação do Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium bovis.
5
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Histórico
A tuberculose é uma das doenças mais antigas da humanidade, é uma
doença infecto contagiosa crônica, que afeta o homem a milênios, acredita-se que
esta micobactéria esteja em nosso planeta mesmo antes da existência da raça
humana, que data de aproximadamente 25 mil anos atrás. A doença foi achada
em esqueletos do período neolítico de 5 mil anos a.C. e em múmias egípcias à 3
mil anos a.C., na dinastia de Ramsés II no Egito, apresentando lesões
características de tuberculose ósteo articular. Um outro estudo em múmias de 700
anos a.C. mostra a presença de abscessos, característicos de tuberculose,
localizados no músculo psoas (Hershkovitz, et al., 2008). Uma teoria é que o
precursor seja o Mycobacterium bovis, responsável pela tuberculose bovina.
Provavelmente os homens das cavernas se infectaram ao consumir leite e carne
de bovinos tuberculosos. Diante disso a tuberculose é apontada como a primeira
doença conhecida da humanidade (CORREA & CORREA, 1992, ROXO, 1996,
BERTOLLI FILHO, 2001)
Prosseguindo com o avançar dos tempos, Hipócrates em 460 a.C. no
Império Romano, descrevia a tuberculose, até então conhecida como “phthisis” ou
tísica, como uma doença caquetizante e incurável era recomendado aos doentes
boa alimentação e ar fresco, evitar o Miasma, ar sujo ou contaminado. Já
Aristóteles - 384 a 322 a.C.- em estudos com a embriologia suína, notou
manifestações de escrofulose, tuberculose cutânea com acometimento de
linfonodo cervicais e inguinais, e pressupôs ser de caráter infeccioso pois
acometia diversos animais que conviviam juntos aos suínos doente (THOMAZ et
al. 2009, PAULA, 1988, CORRÊA; CORRÊA, 1992).
No Brasil a tuberculose foi trazida em 1500 pelos portugueses e
missionários jesuítas, Visto que a partir do século XVI a tuberculose foi a principal
causa de morte entre os índios (BERTOLLINI FILHO, 2001).
No século XVII em 1720, Sylvio de La Boë na Holanda, foi o primeiro a
chamar a presença de tubérculos como uma característica dos portadores de
Tísica (tuberculose pulmonar). Suas análises foram tão profundas que Sylvio de
6
La Boë conseguiu relacionar o comprometimento pulmonar (tísica) com as
manifestações tegumentares (escrofulose) (THOMAZ et al., 2009). E durante a
Revolução Industrial milhares de casos de tuberculose surgiram na Europa,
devido à aglomeração dos trabalhadores e as condições insalubres de trabalho,
sem contar a condição precária que estes enfrentavam.
No início do século XX, a doença que tinha na época uma mortalidade de
50% dos infectados, devastava a Europa, principalmente por acometer mais
jovens e crianças (PAULA, 1988). Carmichael, em 1810, erroneamente associou
a escrófula em crianças a fatores nutricionais, pois estas se adoeciam com mais
freqüência ao tomar leite de vaca. Uma teoria mais sensata foi criada por Klencke,
em 1945, ao perceber que a incidência de escrofulose em crianças que tomavam
leite de vaca era maior do que as que alimentavam com o leite materno, com isso
Klencke afirmou que o leite era uma fonte de infecção da doença (FERREIRA
NETO; BERNARDI, 2011).
Villemin (1827 – 1892), Cirugião militar Francês, em 1865 foi o primeiro
pesquisador a propor que a tuberculose é uma doença infecciosa causada por um
agente específico, e que este agente poderia estar presente no ar, Villemin fez um
estudo onde inoculou em coelhos leite de vacas tuberculosas, e estes
apresentaram a doença. Com isso Villemin mostrou que o leite de vacas
infectadas era fonte de infecção da doença, sugerindo um maior rigor na inspeção
do leite e da carcaça dos animais.
Passados 17 anos (1882) deste postulado de Villemin, Robert Koch
(1843-1910) mostrou o bacilo causador da tuberculose, utilizando recursos
tintoriais e meios de cultura apropriados, devido a isso o agente causador da
tuberculose também é conhecido como Bacilo de Koch. Em 1883 Zopf denominou
o Bacilo de Koch como Bacterium tuberculosis e Lehmann e Neumann incluiu no
gênero Mycobacterium (FERREIRA NETO; BERNARDI, 2011). Além disso Koch
também contribuiu para a história dos avanços contra a tuberculose
desenvolvendo a tuberculina em 1891. Desenvolvimento este que favoreceu
Pirquet e Mantoux a iniciar o estudo do uso da tuberculina e o método
Intradérmico.
Até o ano de 1970 o bacilo causador da tuberculose bovina era
considerado uma variante do M. tuberculosis, Karlson e Lessel classificou como
7
uma espécie o Mycobacterium bovis (FERREIRA NETO; BERNARDI, 2011). A
tuberculose bovina chegou a índices tão grandes que na década de 30 cerca de
40% dos bovinos abatidos na Inglaterra possuíam lesões tuberculosas na
inspeção post mortem e 35% das vacas leiteiras estavam infectadas (HARDIE;
WATSON, 1992, KANTOR; RITACCO 1994).
Na década de 40 se descobre a estreptomicina e se verificou a eficiência
em laboratório da isoniazida para combater o Mycobacterium, estas descobertas
foram importantes para a elaboração, na década de 60, do esquema de utilização
de 3 antibióticos simultâneos durante 18 a 24 meses em regime de internação em
sanatórios. Este esquema consegue curar cerca de 95% dos casos da doença
(KRITSKI et al., 2000).
2.2 Agente
As micobactérias do Complexo Mycobacterium tuberculosis pertencem ao
genero Mycobacterium, família Mycobacteriaceae, ordem Actinomycetales, filo
Tallophyta e reino Vegetal (somente foi aceita a inclusão destes microrganismos
no reino Vegetal para facilitar a classificação dos mesmos, pois eles não são
verdadeiros vegetais e tão pouco são animais) (ABRAHÃO, 1998).
O agente causador da tuberculose são bacilos retos ou ligeiramente
curvos, curtos com dimensões que variam de 0,2 a 0,6 µm de largura por 1 a 10
µm de comprimento, aeróbios, não formam cápsula, são imóveis, não flagelados,
são bacilos álcool-ácidos resistentes, característica fundamental pela qual o
microrganismo é classificado como micobactéria, pois quando corados a quente
pela fucsina resistem à descoloração com álcool - ácido, possui aspecto granular
quando corados (KANTOR, 1979, CORREA; CORREA, 1992, KONEMAN et al.,
2001).
Uma das principais características das micobactéria, e que as diferenciam
das demais bactérias estão relacionadas com a quantidade de lipídeos complexos
que estes germes contêm na parede celular (KANTOR, 1979). Seu alto teor de
lípides, atinge a concentração de até 40% do peso seco dos bastonetes e 60% da
parede celular. Com auxilio da microscopia eletrônica, identificaram-se na rígida
parede micobacteriana, três camadas dispostas de fora para dentro: uma
8
lipoprotéica, uma polissacarídica e a mais interna mucopeptídica. A estrutura
química da parede celular das micobactérias é complexa, inclundo
peptidoglicanos, arabinogalactanos, ácido micólicos e superficialmente, uma
variedade de lipídios, entre os quais peptidoglicanos e glicolipídios como os
sulfolipídios (CPZ, 1979, ABRAHÃO, 1998)
Os glicolipídios da parede celular das micobactérias, especialmente os
sulfolipídios, contribuem para a sua virulência, porém não está muito bem
estabelecido esta relação. Ainda possuem somente hipóteses, e elas dizem que
os glicolipídios podem impedir a fusão lisossomo-fagossomo e talvez impedir a
lise da bactéria nos fagócitos. Um sulfolipídio denominado “fator corda”, devido à
característica macroscópica que ele espressa na cultura das micobactérias,
isolado de M. tuberculosis e M. Bovis virulentos, possui ação tóxica e lesiva aos
tecidos e foi considerado o principal fator de virulência dessas micobactérias
(CPZ, 1979, PAULA, 1988, ROXO, 1996)
O alto teor de lípides da parede celular também são responsáveis por um
outro fator que as diferenciam das demais bactérias, crescimento relativamente
lento (cerca de 18 a 20 horas de tempo de geração) e torna esses bacilos
impermeáveis a vários corantes hidrossolúveis (ABRAHÃO, 1998).
O gênero Mycobacterium inclui parasitas obrigatórios, saprófitos e formas
intermediarias, este gênero possui mais de 70 espécies conhecidas. O complexo
Mycobacterium tuberculosis é representado pelas micobactérias responsáveis
pela tuberculose em humanos e animais domésticos e silvestres, as espécies
pertencentes a este complexo são: O M. tuberculosis, M. bovis, M.africanum, M.
microti, M. canetti, M. bovis BCG (bacilo de Calmette-Guérin) e as recém
identificadas M. caprae e M. pinnipedii, fazem parte deste complexo por
compartilharem similaridades genômicas (ARANAZ et al., 2003; COUSINS et al.,
2003). O M. tuberculosis e o M. bovis são espécies fortemente relacionadas, com
homologia nucleotídica de 99,95% (ABALOS; RETAMAL, 2004). As diferenças
entre elas correspondem a deleções ocorridas no genoma de M. bovis e o
polimorfismo nucleotídicos únicos em genes que codificam para proteínas
secretadas e de parede celular (ABALOS; RETAMAL, 2004)..
O gênero Mycobacterium é altamente exigente no que se refere a
nutriente, quando comparados com outras bactérias patogênicas. Sendo difícil a
9
sua cultura, favorecendo para essa dificuldade o alto tempo de geração do bacilo
(BALIAN, 2002). Apesar do M. bovis e o M. tuberculosis serem bactérias
altamente exigente e serem patógenos intracelular obrigatório, eles possuem
resistência ambiental e termorresistêntecia. As evidências experimentais mostram
que eles pode sobreviver fora de um hospedeiro animal, no meio ambiente, por
longos períodos de tempo (acima de 2 anos), sob condições favoráveis. Esta
elevada resistência das micobactérias, ao meio ambiente, são atribuída ao alto
teor de lipídios da parede bacteriana. A hidrofobicidade desses lipídios pode ter
um papel importante na resistência à desidratação, e garantindo a sobrevivência
desses microrganismos sob condições adversas (ABRAHÃO, 1998). North e Partk
(1927) mostraram que no leite ela é eliminada do leite à 61,1ºC por 30 minutos,
durante algum tempo o Mycobacterium spp foi utilizado como referência para a
pasteurização do leite.
Sobre a resistência às drogas, se dá pois ocorre mutação espontânea e
independente do contato prévio do bacilo com a droga. Na população de células
bacterianas sensíveis existe sempre uma pequena porcentagem de mutantes
resistentes. Por esta razão o tratamento não pode ser realizado com apenas uma
droga, porque a maioria dos bacilos seria inibida ou morta e as células mutantes
resistentes multiplicariam até se tornarem maioria (BRASIL, 2005).
2.3 Epidemiologia
A tuberculose é considerada em sua essência uma “epidemia lenta”, e
uma das últimas pestes que assolaram a humanidade (peste branca) e que
ressurge nos dias de hoje como uma “emergência global”, sendo a principal causa
de morte provocada por um único agente, a tuberculose leva mais indivíduos ao
óbito que qualquer outra doença infecciosa e entre os doentes infectados pelo
vírus da AIDS, é a maior causa de morte, mesmo quando utilizado o tratamento
anti-retroviral (WORKSHP, 2002). A Organização Mundial da Saúde (OMS)
estima a ocorrência de oito a nove milhões de novos casos de tuberculose por
ano no mundo. A partir disto pode-se afirmar que a cada segundo, um indivíduo é
infectado pelo M. tuberculosis. Cerca de um terço da população encontra-se
infectada pelo bacilo da Tuberculose, e anualmente cerca de dois milhões
10
falecem por causa desta doença, que é uma doença curável. A estimativa é que
até 2020, aproximadamente um bilhão de pessoas estarão infectadas; destas 200
milhões de pessoas ficarão doentes e 35 milhões irão morrer de tuberculose, caso
o controle não seja eficiente e rígido (HIJJAR et al., 2001, MAZARS et al., 2001,
WORKSHOP, 2002)
Nos 22 países com maior carga de tuberculose, países estes que
somados representam 80% dos casos de tuberculose do mundo, a estimativa é
de 6.910.000 casos, estando a Índia na 1ª posição, o Brasil ocupa 15º lugar neste
ranking. No Brasil estima-se a incidência de 129.000 casos por ano, dos quais
apenas 90.000 são notificados. O coeficiente de mortalidade em 1998 foi de
3,5/100.000 habitantes; o percentual de detecção de casos igual a 67% e
percentual de cura de 72%. Para o abandono do tratamento, registrou-se 14%,
alcançando em algumas capitais o valor de 30-40%, provavelmente
proporcionando elevadas taxas de resistência aos medicamentos. (HIIJAR;
OLIVEIRA; TEIXEIRA, 2001, BIERRENBACH, 2007).
Um estudo mais completo de HIIJAR et al (2001), mostra que os números
do Brasil são preocupantes, tanto considerando o pais como um todo ou por
regiões. Em 2000 foram notificados 82.249 casos novos, sendo 38.690 no
sudeste, 23.196 no nordeste, 9.281 no sul, 5.901 no norte e 3.522 no centro-
oeste.
Dados oficiais sobre a epidemiologia em bovinos são escassos, segundo
dados de KANTOR (1988) e KANTOR & RITACCO (1994) em 1986, com uma
população estimada de 137 milhões de cabeças de gado, o nível de infecção pela
tuberculose no rebanho bovino brasileiro variou entre 0,9 a 2,9%. Neste mesmo
ano, a taxa de lesões tuberculosas encontradas em matadouros foi de 0,14% .
No período de 1989 a 1998 os dados de notificações oficiais da doença
indicavam uma prevalência média de animais infectados nacional de 1,3%. Um
levantamento realizado em 1999, pelo Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento, no Triângulo Mineiro e nas regiões do centro e sul de Minas
Gerais, envolvendo aproximadamente 1.600 propriedades e 23.000 animais,
estimou a prevalência aparente de animais infectados em 0,8%. No mesmo
estudo foram detectadas 5% das propriedades com animais reagentes à
11
tuberculina, e este valor subiu a 15% no universo das propriedades produtoras de
leite (BRASIL, 2006).
Um trabalho epidemiológico a respeito da tuberculose bovina, realizado
no Rio Grande do Norte, apontou a impressionante incidência de 43,9%7
(LANGENEGGER et al., 1991). (OLIVEIRA, et al., 2007) mostram dados
diferentes para em seu experimento, que avaliou 150 animais submetidos ao teste
de tuberculina em Mossoró, Rio Grande do Norte, onde destes 8,66% foram
positivos. Das 21 propriedades analisadas, 10 tinham pelo menos um animal
positivo, representando 47,62% das propriedades.
Neste sentido, o governo brasileiro, por meio do Ministério Agricultura,
Pecuária e Abastecimento, Departamento de Defesa Animal, criou, em 2001, o
Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal
(PNCEBT), com os objetivos de reduzir o risco à saúde pública e promover o
incremento da competitividade da pecuária nacional (BRASIL, 2006).
Em 2006, Kantor e Ritacco (2006) avaliaram e apontaram que, dos cerca
de 374 milhões de bovinos alojados na América Latina e Caribe, 70%
encontravam-se em áreas onde as taxas de infecção pelo M. bovis eram maiores
que 1%. Verificaram que as medidas para controle da doença eram aplicadas
parcial ou extensivamente na maioria dos países da Região estudada, baseadas
em testes tuberculínicos, abate dos animais positivos, notificação, inspeção post-
mortem e vigilância em abatedouros.
2.4 Zoonose
Como vimos a tuberculose é uma das zoonoses mais importantes,
aproximadamente 10% dos relatos em seres humanos, se deve ao M. bovis,
bacilo procedente de bovinos. O M. bovis é tão patogênico para o homem quanto
o M. tuberculosis (ROXO, 2008).
As formas de transmissão do M. bovis do gado para os seres humanos se
dá diretamente pela via aerógena, mediante a inalação do M. bovis e
indiretamente, pelo consumo de leite e produtos lácteos não pasteurizados, e
além disso o bovino elimina o bacilo no corrimento nasal, nas fezes, urina, nas
secreções vaginais e uterinas e pelo sêmen. Diferente do que muitos acreditam a
12
carne bovina, em via de regra, não pode ser apontada como fonte de infecção
para a tuberculose humana, desde que passada por cocção, pois é raro o
encontro do bacilo na musculatura. Porém para evitar algum problema a inspeção
sanitária faz a condenação parcial ou total das carcaças, conforme o caso, é feito
pois a carne pode ser contaminada com secreções, fezes ou conteúdo dos
granulomas formados (PARDO, 2007).
A infecção causada pelo M. bovis já foi o principal problema de saúde
pública quando os bacilos eram transmitidos ao homem pelo leite de vacas
infectadas. Por isso tuberculose bovina era considerada uma doença de crianças
que tinham como fonte de alimentação leite não pasteurizado, a doença envolvia
linfonodos cervicais, o trato intestinal ou as meninges, resultando em formas
extrapulmonares. Sendo assim, as formas de tuberculose mais freqüentes, eram
a ganglionar, ósteo-articular e meningite. Esta forma clínica era caracterizada pelo
inchaço e alastramento dos linfonodos tuberculosos no pescoço sendo
denominada escrófula (ROSEMBERG et al., 1990; GRANGE & YATES, 1994).
A contaminação advinda do M. bovis, por meio da inalação de aerossóis
contendo o bacilo, proveniente do gado infectado ou mortos (manuseio das
carcaças), ocorre com menor freqüência, porém sua incidência não é desprezível,
sobretudo em grupos ocupacionais de maior exposição à doença, como
tratadores, ordenhadores, trabalhadores da industria de carnes e médicos
veterinários, além de membros da comunidade rural que vive em contato mais
direto com os animais (ABRAHÃO, 1998).
De todas as áreas de atuação agropecuária, a produção de gado de leite
é o setor rural de maior risco para o homem, devido ao estreito contato do
ordenhador e seus familiares com os animais, além do que vacas leiteiras
apresentam uma maior suscetibilidade à tuberculose bovina. As principais causas
dessa suscetibilidade maior são o estresse, o estreito contato entre os animais e a
manutenção de animais de maior idade para a produção láctea (ABRAHÃO,
1998)
13
2.5 Diagnóstico
As principais medidas para conter o avanço da TB no mundo englobam o
diagnóstico precoce dos pacientes, tratamento efetivo contra as formas
resistentes de TB e uma vacina mais aperfeiçoada e protetora do que a atual
BCG.(WHO, 2001) O raciocínio diagnóstico desenvolve-se a partir do exame
clínico, dos dados epidemiológico e da interpretação dos resultados dos exames
solicitados.
Os sintomas da tuberculose, em humanos, é compatível com o de uma
doença infecciosa de curso geralmente crônico, e destaca-se os seguintes
sintomas; febre, emagrecimento, astenia e, em sua forma clínica mais prevalente,
tosse com expectoração que pode evoluir para escarros sanguíneos e hemoptise.
O quadro clinico varia, evidentemente, com as diversas formas extrapulmonares
que a tuberculose pode apresentar e a gravidade do caso. Durante a investigação
a história de contato com indivíduos ou animais tuberculosos, é de fundamental
importância para a suspeita diagnóstica (ABRAHÃO, 1998).
Para os bovinos, o diagnóstico clínico, diferentemente do ser humano,
possui valor relativo, pois o animal pode estar infectado com foco localizado, e
apresentar-se clinicamente sadio, o que leva o proprietário do animal a duvidar do
laudo de tuberculose, pois ainda acredita-se muito que o animal tuberculoso é o
animal caquético. Quando a tuberculose está mais evoluída, o exame clínico é de
extrema importância e evidente por meio de alguns sintomas clínicos como tosse
seca, curta e repetitiva, e períodos febris. Percebe-se que os animais
tuberculosos geralmente vêm atrás do rebanho, demonstrando cansaço e baixa
capacidade respiratória, e outros sinais também podem aparecer como
linfadenomegalia localizada ou generalizada.
No animal vivo as modificações causados pela tuberculose podem ser
difíceis de verificar, porém as modificações observadas na necropsia, são
facilmente reconhecidas. Os métodos mais utilizados para a detecção de
tuberculose bovina é a tuberculinização e a detecção de lesões nos matadouros
(BRASIL, 2006).
14
Além do exame clínico, no homem, os exames usualmente realizados
para a detecção da doença são: bacteriológicos, radiológicos, histopatológicos e
imunológicos.
No bovino, a tuberculose é diagnosticada in vivo pelos sinais clínicos e
pelo teste tuberculínico (imunológico) e após a morte, pelos exames post mortem
(na busca de lesões macroscópicas), bacteriológicos e histopatológicos (ROXO,
1996; BRASIL, 2006).
Basicamente os procedimentos microbiológicos básicos para o
diagnóstico etiológico das doenças causadas por micobactérias incluem: pesquisa
de bacilos álcool-ácidos resistentes (BAAR) por microscopia direta (Baciloscopia),
e a cultura dos espécimes clínicos, seguida da identificação das espécies
isoladas, embora exista atualmente a disponibilidade de técnicas diagnósticas
mais avançadas (CPZ, 1979).
A detecção macroscópica de lesões típicas na necropsia, juntamente com
o exame histopatológico da lesão aumenta a confiança do diagnóstico, porém o
diagnostico definitivo somente pode ser dado pelo isolamento bacteriano do M.
bovis. Entretanto, o longo tempo requerido para o isolamento e identificação do M.
bovis faz com que, nos locais onde a prevalência da doença é alta, a cultura não
seja solicitada, baseando-se o diagnóstico apenas no encontro de lesões
macroscópicas, durante o exame post mortem. A cultura é necessária nos locais
onde a prevalência da doença é baixa, como nos estágios finais de uma
campanha de erradicação, ou quando o animal não apresenta lesões
macroscópicas visíveis, mas é responsivo à tuberculina (ABRAHÃO, 1998).
2.5.1 Histopatológico
O Exame histopatológico é um diagnóstico que pode ser empregado,
principalmente quando a suspeita é de formas extrapulmonares da tuberculose
em humanos utiliza-se material de biópsia, e em animais utiliza-se lesões
proveniente de lesões encontradas no exame post mortem, especialmente
bovinos. As lesões produzidas pelo M. tuberculosis e M. bovis são semelhantes
ao exame histopatológico, apresentando-se como um granuloma, geralmente com
necrose de caseificação e infiltrado hitiocitário. Estes achados também podem
15
ocorrer em outras doenças, portanto, apenas o achado do BAAR na lesão,
através do isolamento e identificação do bacilo, permite afirmar a etiologia
tuberculosa (ABRAHÃO, 1998, BRASIL, 1994).
2.5.2 Baciloscopia
Para a visualização dos bacilos Robert Koch corava os esfregaços com
uma solução alcalina de azul de metileno durante 24 horas. Paul Ehrlich em 1882
foi o primeiro que assinalou a propriedade tintorial característica do bacilo da
tuberculose, a àcido-resistência, ao observar que os bacilos corados durante 15-
30 minutos com violeta de metila ou fucsina básica em óleo de anila, resistiam ao
descoramento pelo ácido nítrico. Ziehl descobriu um método muito semelhante ao
de Ehrlich, no qual o óleo de anila havia sido substituído por fenol essa
modificação melhorava significativamente a estabilidade da coloração. Neelsen,
em 1883, introduziu o uso de fucsina ao invés de violeta de metila e empregou o
ácido sulfúrico no lugar do ácido nítrico (ABRAHÃO, 1998). Até hoje é utilizado
este padrão de coloração, chamado de método de Ziehl-Neelsen onde o bacilo se
cora de vermelho brilhante sobre um fundo azul.
A baciloscopia é o procedimento diagnóstico prioritário, pois permite
descobrir as fontes mais importantes da infecção que são os casos bacilíferos.
Com o desenvolvimento da infecção, o escarro começa a ser produzido devido a
um aumento da inflamação e a necrose do tecido pulmonar. Com isso, a
baciloscopia é o método prioritário de triagem, diagnóstico e controle durante o
tratamento da tuberculose (TEIXEIRA et al., 2007).
A baciloscopia, apesar de sua simplicidade e baixo custo, tem como
principal desvantagem o fato de ser negativa em 30 a 50% dos casos de pessoas
infectadas com M. tuberculosis, em parte devido à necessidade da presença de
pelo menos 5000 bacilos/mL de escarro (TEIXEIRA et al., 2007), além disso esta
técnica não permite distinguir os membros da família Mycobacteriaceae (não
difere o M. bovis do M. tuberculosis) e outros microrganismos tais como
Corynebacterium, Nocardia e Rhodococcus que tem as mesmas características
tintoriais (PRITCHARD, 1988; ROXO, 1996). Os dois tipos de corantes mais
frequentemente utilizados são a fucsina fenicada (Ziehl-Neelsen) e os corantes
16
fluorescentes, como a auramina e rodamina (ABRAHÃO, 1998; PARDO et al.,
2001).
A baciloscopia pelo método de Ziehl-Neelsen, como já foi dito, é um
exame simples, seguro, rápido, econômico e permite a identificação da principal
fonte de infecção da Tuberculose, pela visualização microscópica dos Bacilos
Álcool-Ácidos Resistentes em laminas, examinado realizado em microscópio ótico
com objetiva de imersão. É utilizado rotineiramente em amostras de escarros de
expectoração humana (também pode ser utilizado por decalque de lesão, no
aspirado gástrico, lavado broncoalveolar, biópsia transbronquial, urina, sangue,
líquor, líquido pleural e peritoneal (TEIXEIRA et al., 2007) além de suspensão de
colônias fixadas pelo calor). Para que o método seja eficiente é necessário de
5.000 a 10.000 bacilos por mL de amostra, conferindo baixa sensibilidade ao
procedimento. Assim podem ocorrer os resultados falso negativos em espécies
paucibacilares. A baciloscopia pode apresentar resultados falso positivo, pela
presença de bacilos mortos, que são evidenciados na coloração de Ziehl-Neelsen
(MARTINS, 2000; KRITSKI et al., 2007)
Além do método de Ziehl-Neelsen, a técnica de fluorescência com
auramina apresenta a mesma acurácia do Ziehl-Neelsen, com tempo de leitura
menor, mas é pouco empregada, pois exige pessoal treinado e tem custo mais
elevado. Além disso, as lâminas positivas pela técnica de fluorescência precisam
ser confirmadas pelo Ziehl-Neelsen (TEIXEIRA et al.,2007).
A técnica de fluorescência, corado pela auramina e/ou rodamina, exige
microscópio de fluorescência. ABRAHÃO (1998) e PARDO et al. (2001) afirmam
que a microscopia fluorescente além de ser mais rápida é mais sensível do que a
microscopia ótica comum (Ziehl-Neelsen), pois a utilização de uma objetiva de
menor capacidade de resolução reduz o tempo necessário para examinar a
superfície do esfregaço, uma vez que o campo visualizado é 25 vezes maior que
aquele observado através da objetiva de imersão. O aumento da sensibilidade é
atribuído à maior probabilidade de detecção dos BAAR face à maior área do
esfregaço examinada e à maior facilidade de visualização dos bacilos
fluorescentes. O método da coloração fluorescente pode proporcionar até 30%
mais de achados que o de Ziehl-Neelsen.
17
Sendo assim, na prática, a baciloscopia é, por si só, de grande valor
diagnóstico. Nos casos de evolução favorável, observa-se uma redução
progressiva do número de bacilos até seu desaparecimento completo. A
persistência da baciloscopia positiva servirá como sinal de advertência à mudança
de um esquema terapêutico ineficaz (ROXO, 1996).
2.5.3 Cultura
A cultura é o que se chama de Padrão Ouro, pois é o método já
certificado para este diagnóstico. Apresenta sensibilidade maior que a
baciloscopia para a detecção da micobactéria, como vimos, para uma
baciloscopia de escarro ser positiva, são necessários 5.000 a 10.000 bacilos por
mililitro deste espécime, a cultura é capaz de detectar, pela multiplicação do
agente, apenas 10 bacilos por mililitro do espécime clínico analisado. Desta
forma, a cultura assume uma grande importância para a detecção de BAAR em
espécimes extrapulmonares, e dos suspeitos de tuberculose pulmonar
persistentemente negativos à baciloscopia. Além de que, o cultivo permite
posterior identificação da micobactéria isolada (e/ou complexo) assim como a
realização de testes de sensibilidade a antibióticos (ROXO, 196; MARTINS, 2000;
KRITISK et al., 2007)
As micobactérias tem a temperatura ideal de crescimento de 37ºC em pH
de 6,5. As principais desvantagens diagnósticas, estão no tempo
demasiadamente prolongado entre a inoculação e o surgimento de colônias
macroscopicamente visíveis (24 a 40 dias) e o fato de requerer organismos
viáveis para sua realização, exigindo uma adequada manipulação dos espécimes
clínicos (KONEMAN et al., 2001).
Nos laboratórios que realizam a cultura, cerca de 70% dos casos de
tuberculose pulmonar confirmados bacteriológicamente são diagnosticados pela
baciloscopia e 30% pela cultura. No Brasil a média tem sido de 65%
diagnosticado pela baciloscopia (ABRAHÃO, 1998). Valores baixos, pois o
micobactérium tem facilidade para adquirir resistência aos antibióticos, se não
forem utilizados da forma correta, e somente a baciloscopia não gera informações
18
suficientes referente ao microrganismo e o método não permite a análise da
sensibilidade a antimicrobianos.
Os principais fatores que influenciam o sucesso do isolamento nos
espécimes clínicos são: o meio de cultura utilizado, o processo de
descontaminação e as condições de incubação (ROXO, 1996).
A cultura consiste em realizar a inoculação dos espécimes em meios de
cultura que contenham, além de ingredientes adequados ao crescimento ótimo
das micobactérias (ovo, fécula de batata, asparagina, glicerina), um corante capaz
de inibir a microbiota de contaminação (usualmente, verde de malaquita)
(ABRAHÃO, 1998).
O meio de cultura ideal para a detecção de micobactérias, deveria
oferecer condições para seu crescimento rápido, permitir diferenciação entre
micobactérias patogênicas e não patogênicas pelas características morfológicas
das colônias, inibir o crescimento de contaminantes e ser preparado a partir de
ingredientes prontamente disponíveis para sua reprodutibilidade. A maioria dos
meios utilizados não satisfazem a grande parte destas características, pois
possuem em sua composição materiais orgânicos complexos, tais como soro
animal, gema de ovos ou extrato de batata, que não garantem reprodutibilidade
de um lote para outro (SIMPSON E REED, 1958).
Os principais meios de cultura utilizados são o de Lowenstein-Jensen e o
Middlebrook (sólido ou líquido, à base de ágar) e o meio Stonebrink.
O meio de Lowenstein-Jensen, meio de cultura sólido à base de ovo, é o
mais recomendável e o mais indicado para uso rotineiro no Brasil e, é aprovado
pela Organização Mundial de Saúde. Este meio permite isolar a maioria das
micobactérias de interesse clínico (TEIXERA et al., 2007). O meio de Lowenstein-
Jensen contém 0,75% de glicerina e permitem o crescimento tanto do bacilo
humano como o do bovino (ABRAHÃO, 1998). Além de poder ser utilizado para
antibiograma.
Os meios de cultura Middlebrook 7H10 e o 7H11 (diferenciam-se entre si
pela presença do hidrolisado de caseína no 7H11 que facilita o crescimento das
micobactérias fastidiosas e resistentes à isoniazida) são sólidos a base de Agar,
compostos por uma variedade de sais inorgânicos que provêem de substancias
que a micobactéria necessita. À formulação básica adicionou-se o enriquecimento
19
OADC, contendo ácido oléico (acido graxo de cadeia longa que participa do
metabolismo das bactérias), albumina bovina (confere proteção dos bacilos contra
agentes tóxicos e favorece o primo-isolamento), dextrose como fonte de energia,
cloreto de sódio para manter o equilíbrio osmótico, e catalase que destrói os
peróxidos que possam estar no meio. E também podem ser utilizados para
antibiograma, assim como o meio de Lowenstein-Jensen (KONEMAN et al., 2001,
ABRAHÃO, 1998).
O meio Stonebrink é mais indicado e permanece como padrão ouro para
o crescimento e detecção do M. bovis, pois o bacilo bovino tem dificuldade em
crescer em meios de cultura que contém glicerol, o bacilo bovino apresenta
crescimento digônico, porque utiliza preferencialmente o piruvato como fornte de
carbono, e o meio Stonebrink contém piruvato de sódio e não glicerol em sua
composição (ABRAHÃO, 1998).
Há também outros meios como o meio ATS (American Trudeau Society),
que contém 1% de glicerina, o que permitem o crescimento tanto do bacilo
humano como o do bovino. O meio B83 tem em sua base Agar sangue. Existem
também meios de cultura líquidos para o cultivo do bacilo da tuberculose, tais
como: caldo glicerinado a 5%, Middlebrook 7H9 utilizado nos métodos
automatizados para o cultivo e antibiograma, meio de Sauton, Long e Seibert,
Dubos e outros. A literatura também mostram outros dois métodos de cultura, o
sistema bifásico, que consiste em um meio solidificado (Middlebrook 7H10, 7H11,
Lowenstein-Jensen) e um meio líquido (Middlebrook 7H9), para o isolamento de
micobactérias do sangue e de materiais paucibacilares e o sistema de lise-
centrififugação que permite a lise das células sanguíneas para proporcionar a
liberação das micobactérias que estejam em seu interior e a concentração por
centrifugação, sendo que o sedimento pode ser semeado em meios de cultura
convencionais ou no sistema BACTEC (ABRAHÃO, 1998, ROXO, 1996)
Apesar do M.bovis crescer melhor em meios de cultura que contenham
piruvato de sódio, algumas cepas não demonstram preferência pelo substrato,
crescendo também nos meios contendo glicerol. Por esse motivo, o crescimento
diferencial nesses dois meios de cultura sugere, mas não confirma que a cepa
isolada é de M. bovis (ABRAHÃO, 1998).
20
Mesmo sabendo que os meios a base de Agar são facilmente
contaminados, recomenda-se a sua utilização juntamente com os meios à base
de ovo, aplicando uma pequena concentração de CO2 (não superior a 5%), para
o isolamento primário do M.bovis.
As amostras clínicas utilizadas para o isolamento de micobactérias podem
vir contaminados, ou seja, podem apresentar uma microbiota associada, diferente
da micobactéria de interesse. Com isso as amostras são divididas em amostras
contaminadas e as não contaminadas.
As amostras clínicas, advindas de humanos, utilizados para o isolamento
de micobactérias consideradas contaminadas naturalmente são o escarro, urina,
lavados, aspirados, secreção de cavidade aberta, biópsias e materiais ressecados
de órgãos que se comunicam com o exterior, as não contaminadas podem ser
exemplificadas pelo líquor, derrames serosos, sangue e tecidos (TEIXEIRA et al.,
2007).
No bovino, dependendo da forma de coleta e o espécime clínico utilizado
para a investigação do bacilo, podem vir contaminados. Utiliza-se para a cultura
microbiana o muco laríngeo e traqueal colhido com um swab, porque o bovino
não expectora, fezes, urina, leite, corrimento uterino ou pus, e os materiais
colhidos por punção: exsudatos, líquidos articulares e cefalorraquidianos. As
peças anatômicas (biópsias) procedentes de linfonôdos submaxilares,
retrofaríngeos ou outros, são fundamentais para o encontro do bacilo. Porém a
coleta dos linfonodos deve ser totalmente asséptica, para prevenir ou minimizar a
contaminação dos tecidos com a terra e fezes que podem conter outras
micobactérias ou outro microrganismos que poderiam interferir na cultura,
oscurecendo o M. bovis (ABRAHÃO, 1998).
As amostras não contaminadas são semeadas diretamente, sem qualquer
tratamento prévio descontaminante, ao passo que as amostras contaminadas,
antes de semeadas, devem sofrer um tratamento com substâncias
descontamiantes, devido ao longo período de incubação, estes métodos de
descontaminação visam a eliminação da microbiota associada, que por se
desenvolver muito mais rápido, contamina o meio de cultura e impede a
multiplicação dos bacilo, a liquefação do muco e da fibrina e conservação da
viabilidade do bacilo da tuberculose. O método de descontaminação mais
21
difundido, e largamente usado, é o de Petroff que utiliza o hidróxido de sódio a 4%
como agente fluidificante e descontaminante (CPZ, 1979).
Além do método de descontaminação de Petroff existem outros métodos
de descontaminação, tais como o lauril sulfato de sódio, ácido oxálico a 5%,
método de Coper e Stoner modificado (fosfato trissódico a 23% + fosfato
monossódico a 20%), método de Kubica e Dye (N-acetil-L-cisteína-hidróxido de
sódio) método de Jensen (ácido sulfúrico a 4%) e o método do cloreto de
cetilpiridínio (CCP) que é somente indicado para conservação e transporte do
escarro (CPZ, 1979).
Apesar de sua importância, como vimos, a cultura das micobactérias é um
processo demorado, pois o bacilo tem um crescimento lento (15-20 h), e a cultura
nem sempre apresenta 100% de positividade (TEIXEIRA et al., 2007).
Após o tempo requerido pela cultura é feito alguns testes para diferenciar
o Mycobacterium tuberculosis do Mycobacterium bovis, para isso é análisado as
seguintes características: Morfologia bacilar e velocidade de crescimento;
intensificação do glicerol para o crescimento do M. tuberculosis e supressão para
o M. bovis; síntese da niacina pelo M. tuberculosis e não pelo M. bovis; morfologia
colonial, o M. tuberculosis produz colônias exuberantes, e o M. bovis pequenas
colônias planas; intensificação de piruvato para o crescimento do M. bovis;
preferência ao oxigênio, o M. bovis é microaerófilo e M. tuberculosis é aeróbio;
ambos são estritamente mesófilos e não pigmentados; o nitrato é reduzido pelo
M. tuberculosis mas não pelo M. bovis; resistência à pirazinamida do M. bovis e
sensibilidade do M. tuberculosis; suscetibilidade ao TCH (hidrazida do ácido
tiofeno-2-carboxílico) pelo M. bovis mas não pelo M. tuberculosis; sensibilidade do
M. bovis ao ácido p-aminosalicílico (ABRAHÃO, 1998).
Há também os sistemas radiométricos automatizados para detecção de
micobactérias como o BACTEC 460 TB®, BACTEC 9000® e o MGIT® que
utilizam meios enriquecidos que promovem a aceleração do crescimento
bacteriano, que detecta o crescimento das micobactérias em caldos de 9 a 14
dias, a detecção é feita através da identificação de gás carbônico radioativo
induzido pela bactéria em caldo Middlebrook 7H9, com ácido palmítico marcado
com carbono 14, mas podem também indicar resultados falso-positivos devido à
22
contaminação por outras bactérias (TEIXEIRA et al., 2007, BECTON DICKINSON,
1985).
2.5.4 Raio X
O exame radiológico é amplamente utilizado em humanos, é um método
auxiliar, utilizado em pacientes sintomáticos e negativos à baciloscopia. O método
se baseia na presença de opacidade radiológica. Contudo é importante lembrar
que não existe imagem patognomônica de tuberculose na radiografia do tórax e
sim, imagem sugestiva (ABRAHÃO, 1998), visto que lesões pulmonares
semelhantes às causadas pela tuberculose podem ocorrer em outras doenças. A
tomografia computadorizada do tórax também é um método radiológico porém de
resolução e mais sensível do que a radiografia de tórax, mas apresenta alto custo,
só estando disponível em centros de referência e também não serve como
diagnóstico definitivo (TEIXEIRA et al. 2007).
Na rotina, o exame radiológico não é utilizado em animais para o auxilio
no diagnóstico de tuberculose, salvo as exceções de quando o animal é de alto
valor zootécnico. As maiores dificuldades para a realização desse exame nos
bovinos consistem no tamanho da caixa torácica e dos órgãos nela contidos, além
da indocilidade da maioria dos animais.
2.5.5 PCR
Com o avanço da biologia molecular, atualmente é permitido o
desenvolvimento de métodos para a identificação de algumas espécies ou
complexos de micobactérias, através da detecção de sequências de DNA ou RNA
especificas destas micobactérias (ABRAHÃO, 1998). Dentre as técnicas
relacionadas à biologia molecular a Reação em Cadeia da Polimerase
(Polymerase chain reaction), mais conhecida por sua sigla, em inglês, PCR.
Devido às perdas consideráveis de bacilos viáveis nos processsos de
descontaminação, e também pelo consumo de várias semanas entre o isolamento
primário e a identificação final da espécie, que pode variar de 6 a 8 semanas,
23
métodos biomoleculares funcionam como metodologia diagnóstica auxiliar à
bacteriologia clássica (COUSINS et al., 1991).
A PCR é uma técnica descoberta na década de 80 por Mullis, a PCR
permite a amplificação in vitro de um trecho de DNA, milhões de vezes em poucas
horas. A PCR é uma técnica qualitativa, ou seja mostra ausência ou presença do
material genético procurado, que reproduz o processo natural de replicação do
DNA, coma vantagem da extrema rapidez e de se determinar o trecho de DNA
alvo. Com isso mesmo com uma quantidade muito pequena de bacilos na
amostra, ou mesmo que estejam mortos a técnica consegue detectar,
apresentando assim uma elevada especificidade e sensibilidade (ZANINI et
al.,2001).
Para começar a duplicação, é necessário que a fita a ser duplicada já
possua alguns nucleotídeos complementares pareados ao seu início. A separação
das fitas ocorre pela desnaturação térmica do DNA, para isto termicicladores
computadorizados realiza as variações térmicas cíclicas de maneira rápida e
precisa. Para ocorrer a amplificação de um trecho de DNA específico é
necessário um oligonucleotídeo complementar a este trecho, para garantir o
pareamento e iniciar a replicação, esse oligonucleotídeo é denominado de
Iniciador ou Primer.
Só haverá amplificação do DNA se houver hibridização do primer,
servindo como um modelo do trecho do DNA a ser procurado, isto confere a
especificidade à reação. Devido isso é importante que seja projetado um bom
primer, a ser utilizado, para que aquela sequência somente seja encontrada no
microrganismo alvo (ABRAHÃO, 1998).
Um dos elementos que viabilizou a realização da PCR foi a descoberta de
uma espécie de bactéria (Thermus aquaticus) resiste a altas temperaturas, desta
bactéria foi extraído a Taq polimerase, que é uma DNA polimerase capaz de
resistir aos ciclos térmicos da PCR,que atinge até 96ºC. Para a visualização do
DNA amplificado, pode ser utilizado gel de eletroforese corado com brometo de
etidio (ABRAHÃO, 1998).
Com a modernização e a informatização, a técnica de PCR tem algumas
variações, dentre elas pode citar a técnica da PCR em tempo real, que também
serve como forma quantitativa. A técnica da PCR em tempo real permite o
24
monitoramento da síntese de produtos de amplificação no decorrer da própria
reação e não apenas no final da reação, como ocorre na técnica tradicional da
PCR. A PCR em tempo real monitora a fluorescência emitida durante a reação
como um indicador da produção das amplificações em cada ciclo da PCR. As
principais vantagens de se utilizar esta técnica são as de gerar resultados com
maior sensibilidade, precisão, velocidade nas análises, facilidade na
quantificação, melhor controle de qualidade no processo e menor risco de
contaminação, já que a reação ocorre em um sistema tubular fechado, não
havendo a necessidade de eletroforese para a visualização das amplificações
(RODRIGUEZ et al. 2007).
Apesar destas a técnica possui algumas dificuldades, como as dificuldade
intrínsecas no processo como o grande risco de contaminação da amostra com
DNA de fontes exógenas, para isso tem que possuir uma sala e materiais
exclusivos para a realização da PCR, profissionais capacitados para a execução
da técnica e alto custo com equipamentos tb 01(19) pg 189, utilização de
substâncias tóxicas (ROXO et al., 2002).
Além destas dificuldades citadas as micobactérias possuem uma parede
celular complexa, rica em lipídeos dificultando a extração e a purificação do DNA
cromossomal, tornando a lise da parede celular para a liberação do DNA como
um fator crucial na execução da técnica, essa dificuldade é maior principalmente
em amostras de tecidos, pois a micobactéria é de natureza intracelular
(ABRAHÃO, 1998; ROXO et al., 2002).
2.5.6 Tuberculinização
A prova tuberculínica, é um método que mede a imunidade celular contra
as micobactérias causadoras de tuberculose por uma reação de
hipersensibilidade retardada (tipo IV), indicando contato prévio com estas, é um
exame complementar que pode ser utilizado no homem e em bovinos,
principalmente nestes pois tem uma grande importância diagnóstica (BRASIL,
2006).
A tuberculina também foi descoberta por Koch, porém Pirquet conseguiu
utilizá-la de forma satisfatória, gerando uma resposta inflamatória no local de
25
aplicação na pele, sendo indicativo que o organismo estava infectado com o
bacilo da tuberculose (ABRAHÃO, 1998).
Seibert em 1949, depois de algumas purificações da tuberculina obteve
um produto denominado Derivado Protéico Purificado (PPD), a partir de cultura,
filtração e inativação de cepas do bacilo da tuberculose.
Em humanos o teste de tuberculinização utilizando o PPD tem sido, utili-
zado como método auxiliar no diagnóstico da tuberculose devido a sua alta
positividade nos indivíduos com a doença. É usado, também, como método de
triagem para o diagnóstico da tuberculose. É um método capaz de identificar a
infecção pelas micobactérias inclusive na forma latente da tuberculose, porém ele
sozinho não é suficiente para o diagnóstico como doença, onde o método
conclusivo depende da cultura, padrão ouro, para a identificação do agente
causador de tuberculose (TEIXEIRA, et al. 2007).
O método se baseia na reação celular, denominada de “alergia
tuberculínica” (acúmulo de células inflamatórias) desenvolvida na pele, 24 a 72 h
após a inoculação intradérmica do PPD, uma mistura de proteínas de baixo peso
molecular. A tuberculina usada é o PPD-RT23 (preparada pelo Statens Serum
Institute, Copenhague) aplicada por via intradérmica no antebraço, na dose de 0,1
mL. Um endurecimento local de, 5-15 mm, dependendo dos fatores de risco do
indivíduo, é considerado um resultado positivo e indica infecção pelo M.
tuberculosis (TEIXEIRA et al., 2007).
A leitura do resultado em humanos segue a seguinte classificação:
� 0 – 4mm: não reator- indivíduo não infectado pelo bacilo da
tuberculose ou anérgico;
� 5 – 9mm: reator fraco- indivíduo infectado pelo bacilo da tuberculose
ou por outras micobactérias, ou ainda vacinados com BCG;
� 10mm ou mais: reator forte: indivíduo infectado pelo bacilo da
tuberculose, que pode estar doente ou não, ou vacinados com BCB.
(ABRAHÃO, 1998).
Apesar de sua importância, o teste PPD não tem 100% de sensibilidade
(porcentagem de indivíduos doentes com teste positivo) ou especificidade
(porcentagem de indivíduos sadios que apresentam teste negativo). Em média, 10
a 25% de pacientes com tuberculose ativa não reagem ao PPD, e sua
26
especificidade também é variável. Levantamentos populacionais em áreas com
diferente risco de infecção por M. tuberculosis mostraram larga variação no
tamanho das reações, com acentuadas diferenças entre diferentes áreas
geográficas (TEIXEIRA et al., 2007).
O teste do PPD tem sensibilidade diminuída em populações de pacientes
imunocomprometidos como os portadores do HIV, pessoas recentemente
infectadas e crianças muito jovens. A especificidade é baixa pois o PPD contém
diversos antígenos amplamente compartilhados entre diferentes espécies de
micobactérias, como as micobactérias do ambiente, M. tuberculosis, M. bovis
(Não conseguindo diferenciar os infectados com o bacilo humano do bacilo
bovino) e M. bovis (BCG). Vários estudos têm demonstrado que o PPD não
distingue, com segurança, pessoas vacinadas com BCG daquelas expostas a
micobactérias do ambiente ou infectadas com M. tuberculosis. Diante destes
motivos o teste de tuberculinização em humanos é utilizado somente como
método de triagem (ANDERSEN et al., 2000).
O diagnostico in vivo da tuberculose bovina, feito pela prova da
tuberculina, é a principal forma empregada na discriminação das fontes de
infecção, sendo a base do diagnóstico da tuberculose bovina, e pela avaliação
dos sinais clínicos. O diagnóstico indireto pelo uso do PPD em bovinos apresenta
algumas limitações, onde as reações inespecíficas pelo contato prévio com outras
micobactérias ambientais resultam em falsos positivos, não reatividade levando a
falso negativos decorrentes de infecção recente, mau estado geral de saúde,
imunossupressão pós parto, anergia e reações cruzadas também com outros
patógenos não relacionados não relacionados como Corynebacterium e Nocardia
spp (MONOGHAN et al., 1994, ROMERO et al., 1999)
O controle da tuberculose bovina e os programas de erradicação são
baseados nos teste de tuberculina e sacrificio dos animais positivos. O teste
imunológico indireto de tuberculinização é o método diagnóstico padrão para
identificar animais tuberculosos e consiste na avaliação de uma reação de
hipersensibilidade tardia deflagrada em animais previamente expostos ao bacilo
da tuberculose, provocada em resposta à injeção intradérmica de tuberculina,
avaliado após 72 horas (BRASIL, 2006).
27
Para os bovinos há três formas de utilização da tuberculina em busca do
diagnóstico:
1) o teste cervical simples é a prova de rotina em gado de leite devido à
sua boa sensibilidade;
2) o teste da prega ano-caudal pode ser utilizado como prova de triagem,
porém, exclusivamente em gado de corte;
3) o teste cervical comparativo é a prova confirmatória para animais
reagentes ao teste da prega ano-caudal ou ao teste cervical simples; todavia,
também pode ser empregado como única prova diagnóstica em rebanhos com
histórico de reações inespecíficas (BRASIL, 2006).
No Brasil, a prova tuberculínica é realizada com o PPD bovino, produzido
a partir da amostra AN5 de M. bovis, contendo 1 mg de proteína por mL (32.500
UI). No teste cervical comparativo, utiliza-se também o PPD aviário, produzido a
partir da amostra D4 de M. avium, contendo 0,5 mg de proteína por mL (25.000
UI) (BRASIL, 2006).
Considera-se a reação positiva, quando a diferença do espessamento
(espessura da dobra 72 horas após a inoculação intradérmica menos espessura
da dobra no dia da inoculação) for de 4mm ou mais, ou quando houver sinais
clínicos como edema, exudação, necrose ou dor no local. De 1 a 4 mm, sem
sinais clínicos no local da aplicação, é um resultado inconclusivo (ABRAHÃO,
1998).
A sensibilidade do teste de tuberculinização varia entre 68% a 95%,
enquanto sua especificidade foi estimada entre 95% a 99%. CORREA &
CORREA (1992) diz que a variação da sensibilidade é de 32% a 99% e a
especificidade é estimado em 75,5 a 99,9%. A sensibilidade pode ser afetada por
fatores iatrogênicos tais como dessensibilização, imunossupressão pós-parto,
intervalo pós-infecção, assim como por variação da dose e potência da
tuberculina utilizada e da variabilidade na avaliação do edema pelo observador. A
especificidade, é influenciada pela sensibilização que pode ocorrer pela exposição
do animal ao M. avium, M. paratuberculosis ou por micobactérias do meio
ambiente. Essas variações podem dar resultados falsos positivos ou falsos
negativos.
28
A execução do teste, somada à eutanásia dos bovinos positivos, têm sido
o esteio dos principais programas de erradicação ao redor do mundo há anos,
inclusive no Brasil com o Programa Nacional de Controle e Erradicação da
Brucelose e Tuberculose Animal (PNCEBT). Novas ferramentos, incluindo novos
métodos diagnósticos e até mesmo vacinas, são requeridas nos países nos quais
o teste intradérmico seguido de abate não gera resultados satisfatórios no sentido
da erradicação do problema (POLLOCK et al., 2005).
29
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O agente causador da tuberculose está na terra a mais tempo que a
própria humanidade, foi uma das primeiras doenças a serem estudadas, já
vitimou milhões de pessoas, provoca grandes perdas na pecuária e gera muitos
gastos à saúde e mesmo assim ainda é um enigma aos pesquisadores.
A tuberculose é uma doença de grande importância ocupacional, onde os
manipuladores de animais em geral como trabalhadores de frigoríficos e laticínios,
possuem um maior risco de adquirir a doença.
O Ministério da Agricultura pretende erradicar a tuberculose bovina, o
índice oficial de prevalência da tuberculose em bovinos está muito defasado,
havendo a necessidade de novos dados oficiais, pois o programa que pretende o
controle e erradicação da mesma está vigorando a anos e não foram divulgados
novos dados sobre o andamento do mesmo.
O diagnóstico é demorado, chegando a 40 dias, e a doença é difundida
mais facilmente entre os portadores de HIV, que muitas vezes não tem a
possibilidade de esperar um tempo tão longo para a obtenção de um resultado.
Sendo assim, outras técnicas vem sendo desenvolvidas para um diagnóstico mais
rápido e seguro, apesar de toda dificuldade encontrada dentro das técnica e as
dificuldade impostas pelas características intrínsecas das micobactérias.
30
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