FRECUENCIA DE GENES DE RESISTENCIA ANTIBIÓTICA blaTEM y blaSHV EN BACILOS

ENTÉRICOS AISLADOS DE CAVIDAD ORAL.

Carlos Mauricio Julio Pitta

Manuela Alejandra Zárate Rodríguez

UNIVERSIDAD EL BOSQUE

PROGRAMA DE ODONTOLOGÍA - FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

BOGOTÁ DC.- JUNIO 2021

HOJA DE IDENTIFICACIÓN

Universidad El Bosque

Facultad Odontología.

Programa Odontología.

Título: Frecuencia de genes de resistencia antibiótica blaTEM y blaSVH en bacilos entéricos aislados de cavidad oral.

Grupo de investigación

Unidad de Investigación Básica Oral- UIBO.

Línea de investigación: Microbiología Oral.

Tipo de investigación: Pregrado / grupo

Estudiantes: Carlos Mauricio Julio Pitta Manuela Alejandra Zarate Rodríguez

Director: Dra. Yineth Neuta Poveda

Codirector: Dra. Diana Marcela Castillo Perdomo

Asesor metodológico Dra. Gloria Inés Lafaurie Villamil

Análisis y Asesor estadístico Dra. Gloria Inés Lafaurie Villamil

DIRECTIVOS UNIVERSIDAD EL BOSQUE

OTTO BAUTISTA GAMBO Presidente del Claustro

JUAN CARLOS LÓPEZ TRUJILLO Presidente Consejo Directivo

A MARIA CLARA RANGEL GALVIS Rector(a)

RITA CECILIA PLATA DE SILVA Vicerrector(a) Académico

FRANCISCO JOSÉ FALLA CARRASCO Vicerrector Administrativo

MIGUEL OTERO CADENA Vicerrectoría de Investigaciones

CRISTINA MATIZ MEJIA Secretaria General

JUAN CARLOS SANCHEZ PARIS División Postgrados

MARIA ROSA BUENAHORA TOVAR Decana Facultad de Odontología

MARTHA LILILIANA GOMEZ RANGEL Secretaria Académica

DIANA MARIA ESCOBAR JIMENEZ Director Área Bioclínica

ALEJANDRO PERDOMO RUBIO Director Área Comunitaria

JUAN GUILLERMO AVILA ALCALÁ Coordinador Área Psicosocial

INGRID ISABEL MORA DIAZ Coordinador de Investigaciones Facultad de Odontología

IVAN ARMANDO SANTACRUZ CHAVES Coordinador Postgrados Facultad de Odontología

“La Universidad El Bosque, no se hace responsable de los conceptos emitidos por

los investigadores en su trabajo, solo velará por el rigor científico, metodológico y

ético del mismo en aras de la búsqueda de la verdad y la justicia”.

Guía de contenido

Resumen

Abstract

Pág.

Introducción

2. Marco teórico 3

2.1 Bacilos entéricos 3

2.2 Importancia de las enterobacterias en cavidad oral 4

2.3 Resistencia antibiótica en enterobacterias 4

2.4 Mecanismos de acción de los antibióticos 6

2.4.1 Amoxicilina 6

2.5 Mecanismos de resistencia de las enterobacterias a antibióticos

betalactámicos 7

2.6 Genes de resistencia antibiótica en enterobacterias 8

2.6.1 Genes de resistencia a betalactamicos (blaTEM y blaSHV) 8

2.6.1.1 blaTEM 9

2.6.1.2 blaSHV 10

3. Planteamiento del problema 11

3.1 Descripción del problema 11

3.2 Pregunta de investigación 13

4. Justificación 14

5. Situación Actual 15

6. Objetivos 17

6.1 Objetivo general 17

6.2 Objetivos específicos 17

7. Metodología del Proyecto 18

7.1. Tipo de estudio 18

7.2. Población y muestra 18

7.3. Métodos y técnicas para la recolección de la información 18

7.3.1 Procesamiento microbiológico 18

7.3.2 Extracción de ADN 18

7.3.3 Detección de genes de resistencia antibiótica por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

19

7.3.4 Electroforesis 20

7.4 Plan de tabulación y análisis. 20

8. Consideraciones éticas. 21

8.1 Sustento legal 21

8.2 Consentimiento y asentimiento informado 21

9.. Resultados 22

9.1 Frecuencia de bacterias entéricas 22

9.2 Frecuencia de genes de resistencia en bacterias entéricas 23

10. Discusión 25

11. Conclusiones 28

12. Referencias bibliográficas 29

LISTADO DE TABLAS

Págs.

Tabla 1

Secuencias de primers utilizados para la detección de los genes blaTEM y

blaSHV Diseñada por Carlos Mauricio Julio Pitta Análisis

estadístico realizado por Dra. Yineth Neuta Poveda.

19

Tabla 2

Frecuencia de géneros de Enterobacterias aisladas en muestras de

saliva y placa supra y subgingival. Diseñada por Carlos Mauricio

Julio Pitta, Análisis estadístico realizado por Dra. Yineth Neuta

Poveda.

22

Tabla 3

Frecuencia de géneros y especies de Enterobacterias aisladas en

muestras de saliva y placa supra y subgingival. Diseñada por Manuela

Alejandra Zarate Rodríguez Análisis estadístico realizado por

Dra. Yineth Neuta Poveda.

22

Tabla 4

Frecuencia de genes blaTEM y blaSHV en Enterobacterias aisladas en

muestras de saliva y placa supra y subgingival. Diseñada por Manuela

Alejandra Zarate Rodríguez, Análisis estadístico realizado por

Dra. Yineth Neuta Poveda.

23

Tabla 5.

Frecuencia de genes blaTEM y blaSHV en especies de Enterobacterias

aisladas en muestras de saliva y placa supra y subgingival. Diseñada

por Manuela Alejandra Zarate Rodríguez , Análisis estadístico

realizado por Dra. Yineth Neuta Poveda.

24

LISTADO DE FIGURAS

Págs.

Figura 1 Ilustración mecanismo de acción de antibióticos Betalactámicos

Tomado de: Suárez, C., & Gudiol, F. (2009). Antibióticos betalactámicos.

Enfermedades infecciosas y microbiologia clínica, 27(2), 116–129.

7

RESUMEN

FRECUENCIA DE GENES DE RESISTENCIA ANTIBIÓTICA blaTEM Y blaSHV EN BACILOS ENTÉRICOS AISLADOS DE CAVIDAD ORAL.

Antecedentes: Las enterobacterias son una familia de bacterias características del tracto gastrointestinal, en la cavidad oral se comportan como transeúntes, pueden llegar allí por diversos procesos y cobran gran importancia debido a las altas tasas de resistencia que presentan complicando el tratamiento antibiótico convencional en la consulta odontológica. Objetivo: Establecer la frecuencia de los genes de resistencia antibiótica blaTEM y blaSHV en bacilos entéricos aislados de cavidad oral. Materiales y métodos: Se evaluaron 95 aislamientos de bacilos entéricos obtenidos a partir de muestras de placa subgingival y saliva de pacientes que asistieron a las clínicas odontológicas de la Universidad El Bosque. Las bacterias se identificaron por medio de pruebas bioquímicas utilizando las galerías BBL Crystal E/NF. La detección de los genes de interés se realizó por medio de PCR convencional y electroforesis. Resultados: Se observó mayor frecuencia del gen blaTEM, el cual fue detectado en el 27.2% del total de los aislamientos. Este gen fue más frecuente en Enterobacter (7.3 %), seguido por Klebsiella (8.4%), Serratia (6.3 %), Cronobacter (3.1%) y Escherichia coli (2.1 %). Mientras que blaSHV se detectó en el 16.7% de los aislamientos, principalmente en el género Enterobacter (5.2%), Klebsiella (6.3%), Cronobacter (3.1%) y Serratia (2.1%). Conclusiones: Los bacilos entéricos son considerados microbiota transeúnte de cavidad oral, los cuales albergan importantes genes de resistencia como blaTEM y blaSHV,

asociados con resistencia a antibióticos de primera elección en el tratamiento odontológico. Palabras clave: Resistencia antibiótica blaTEM,, blaSHV, Bacilos Entéricos, Amoxicilina, Cavidad oral.

ABSTRACT

FREQUENCY OF ANTIBIOTIC RESISTANT blaTEM , blaSHV GENES IN

ISOLATED ENTERIC BACILLI FROM THE ORAL CAVITY

Background: Enterobacteriaceae are a family of bacteria from the gastrointestinal tract and transient in the oral cavity, reaching it by diverse processes. They are very important due to the high resistance presented which complicate conventional antibiotic treatment. Objective: to establish the frequency of frequency of antibiotic resistant blaTEM y blaSHV genes in isolated enteric bacilli from the oral cavity. Materials and methods: 95 isolations of enteric bacilli from subgingival plaque and saliva were evaluated from patients attending the dental clinics at El Bosque University. Bacteria were identified by means of biochemical tests using BBL Crystal E/NF and gene detection with conventional PCR and electrophoresis. Results: A higher frequency of blaTEM gene of 27.2% was detected in the isolations. The most frequent was the Enterobacter (7.3%), Klebsiella (8.4%), Serratia (6.3 %), Cronobacter (3.1%) and Escherichia coli (2.1 %), blaSHV was detected in 16.7% of isolations, mainly Enterobacter (5.2%), Klebsiella (6.3%), Cronobacter (3.1%) and Serratia (2.1%). Conclusions: enteric bacilli are considered transient microbiota of the oral cavity, which harbor important resistance genes suach as blaTEM y blaSHV associated with resistance to first-choice antibiotics for dental treatments. Key words: antibiotic resistance, blaTEM, blaSHV, enteric bacilli, amoxicillin, oral cavity.

Introducción

Las enterobacterias son una familia de bacterias características del tracto

gastrointestinal, son consideradas microbiota normal en esta zona del cuerpo. A nivel oral

son transeúntes, y se afirma que el uso de prótesis totales, o el desarrollo de periodontitis

pueden crear una condición nutricional sustentable para patógenos, como los bacilos

entéricos Gram negativos, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, los cuales

pueden ser comúnmente asociados también con infecciones nosocomiales (Gaetti et al.,

2010).

En la cavidad oral las bacterias entéricas al comportarse como microbiota transeúnte

pueden llegar allí por diversas causas. Estas bacterias cobran gran importancia debido a

las altas tasas de resistencia que presentan frente a muchos antibióticos, los cuales están

indicados para combatir infecciones exclusivamente de origen bacteriano. Se ha

observado que con el paso del tiempo se presenta mayor resistencia antimicrobiana, lo

cual se considera un grave problema de salud pública. Entre los factores más importantes,

relacionados con la diseminación de bacterias multirresistentes está el uso inapropiado

de antibióticos, y la aplicación insuficiente de las medidas de prevención y control.

Adicionalmente, las bacterias tienen la capacidad de mutar o utilizar mecanismos de

transferencia de genes que incluyen transferencia de plásmidos, transposones e

integrones entre otras (López et al., 2015).

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) las infecciones odontogénicas son las

más prevalentes a nivel mundial y constituyen el primer motivo de consulta en el

consultorio odontológico (OMS, 2007), por tal motivo el uso de antibióticos es altamente

frecuente. Los antibióticos más empleados en la mayoría de los casos de infecciones

odontogénicas o infecciones de cabeza y cuello son los betalactámicos, moléculas

bactericidas activas contra microorganismos Gram positivos y Gram negativos,

facultativos y anaerobios, entre este grupo de antibióticos se encuentran la amoxicilina y

amoxicilina con ácido clavulánico, así como las penicilinas. En algunos casos los pacientes

presentan alergia a agentes betalactámicos, por lo cual se utilizan otros fármacos

alternativos entre los que se encuentran los macrólidos como la azitromicina y

claritromicina (Villagrana et al., 2012). Aunque estas familias de antibióticos no son

específicos para combatir infecciones por bacilos entéricos, estos pueden extenderse a

poblaciones microbianas en infecciones nosocomiales, y cobran gran importancia ya que

las enterobacterias actúan como reservorio de genes de resistencia a estos u otros

antibióticos (Gaetti et al., 2010). Es necesario destacar la importancia de detectar la

presencia de genes de resistencia antibiótica a amoxicilina en bacterias entéricas, puesto

que este tipo de antibióticos son frecuentemente utilizados para el control y manejo de

infecciones odontogénicas, teniendo en cuenta que la mayoría de los estudios realizados

han sido en el ámbito clínico, en otras áreas geográficas diferentes a Colombia. A nivel

local hay muy pocos estudios que evalúen la presencia de genes en bacilos entéricos

aislados de cavidad oral, y por tal motivo aporta información valiosa como mecanismo

importante para el control de resistencia a estos antibióticos., así mismo aporta datos de

interés para hacer una vigilancia epidemiológica de la resistencia bacteriana a estos

antibióticos, y contribuir con el seguimiento de la propagación de estos genes a otras

bacterias, como aquellas que hacen parte de la microbiota normal de cavidad oral.

3

2. Marco teórico o conceptual

2.1 Bacilos entéricos

Las enterobacterias son un grupo de bacterias que pueden estar presentes en diferentes

sitios y de ello depende su función. Las bacterias entéricas constituyen un grupo grande y

heterogéneo que habitan en el intestino, pueden aislarse del suelo, el agua y de la

vegetación, además son bacterias Gram negativas aerobias o anaerobias facultativas no

formadoras de esporas. Entre sus principales características se puede evidenciar que son

negativos a la oxidasa, fermentadores de glucosa y como producto generan ácido, además

tienen la capacidad de reducir nitratos a nitritos. Al ser bacterias Gram negativas, aerobias

o anaerobias facultativas, es posible aislar de ellas el lípido A de los lipopolisacáridos que

actúan como endotoxina, este se considera el antígeno más común enterobacterias

(Negroni, 2009).

Existen otros factores de virulencia, ciertas especies tienen presencia de cápsula, la cual

tiene como función principal la protección de la fagocitosis y junto con esto enmascara los

antígenos de la pared; adicional a esto se ha demostrado que pueden haber variaciones

en la producción de antígenos las cuales pueden expresarse en el antígeno K (capsular) o

el antígeno H (flagelar), antígeno VI, antígeno F (fimbrial), casi todas presentan fimbrias

lo que favorece la adhesión de las bacterias (Negroni, 2009). Finalmente, algunas especies

producen exoenzimas como ureasas, gelatinasa, lipasa, desoxirribonucleasa. Todos estos

factores de virulencia científicamente se ha evidenciado que son capaces de transmitirse

entre las especies, entre los géneros y aun entre las distintas familias. Evidencia científica

confirma que existe relación entre los factores de virulencia que presentan las bacterias y

la resistencia antibiótica, debido a que las bacterias se encuentran sometidas a terapias

antibióticas constantes y repetitivas en un tiempo no prolongado, uso inadecuado o

perfiles antibióticos según su espectro, no aptos para el tratamiento de diversas

bacterias; puesto que la proporción de aislados resistentes a múltiples antimicrobianos,

ha aumentado de forma ininterrumpida, de modo que casi todos los aislados

nosocomiales, y muchos de los aislados adquiridos en la comunidad, son ahora resistentes

4

a varias clases de antimicrobianos. La aparición de resistencia a los antibióticos puede

deberse a una mutación espontánea de los genes cromosómicos. En muchos casos, las

especies bacterianas pueden evolucionar a través de diferentes modificaciones

genómicas que incluyen mutaciones, reordenamientos o genes horizontales transferencia

(HGT), que es un fenómeno dirigido por elementos genéticos móviles como plásmidos,

secuencias de inserción, integrones, transposones, fagos y segmentos de ADN conocidos

como islas genómicas

Las enterobacterias generalmente están implicadas en procesos infecciosos graves,

puesto que son considerados como patógenos oportunistas, que producen infección

cuando salen de su hábitat o hay alteraciones de las defensas locales donde se producen

además sobreinfecciones a nivel oral. Los géneros oportunistas que con mayor frecuencia

se aíslan de muestras clínicas son Escherichia, Klebsiella, Serratia, Enterobacter,

Citrobacter, Proteus, Morganella, Providencia, entre otros (Merino et al., 2008). A nivel oral

el principal hallazgo de enterobacterias se encuentra relacionado con la enfermedad

periodontal, gingivitis, e inclusive con enfermedades infecciosas a causa de enfermedad

endodóntica (Gaetti et al., 2010).

2.2 Importancia de las enterobacterias en cavidad oral

Frecuentemente se ha reportado la presencia de enterobacterias en cavidad oral, dentro

de los principales factores por los que estos patobiontes transeúntes llegan a cavidad oral

se destacan mecanismos directos como la contaminación ano-mano-boca, o a partir de la

localización del cepillo dental dentro del espacio destinado para el sanitario, así como

contaminación indirecta a través de la ingesta de alimentos o agua contaminados

(Negroni et al., 2009). Sin embargo, estas bacterias pueden sobre infectar cuadros

existentes, en ocasiones cuando el balance del sistema inmune del hospedador se ve

suprimido, y estas enfermedades infecciosas orales a su vez han sido frecuentemente

asociadas también con pobre higiene oral, desnutrición y alcoholismo (Ramos et al.,

2010).

5

De las bacterias entéricas aisladas de cavidad oral las especies con una mayor frecuencia

pertenecen a la tribu Klebsiellae, que comprende los géneros Klebsiella, Serratia,

Enterobacter y Hafnia ( Gomez et al., 2019). Diversos estudios han demostrado la cercana

relación entre el progreso de la enfermedad periodontal y el rol de las bacterias entéricas

y Pseudomonas, sin embargo la cavidad oral de los pacientes con periodontitis y gingivitis

y particularmente pacientes edéntulos, y pacientes con prótesis total pueden albergar

microorganismos con marcadores de resistencia antibiótica severa y esos

microorganismos son frecuentemente implicados en multirresistencias sistémica, oral o

infecciones nosocomiales (Gaetti et al., 2010).

En la literatura se ha reportado que en Colombia las especies más comunes fueron

Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae, asociándose la alta prevalencia de estos

microorganismos en algunas regiones debido a que la muestra fue transportada por más

de 36 horas, por su presencia en alimentos, agua contaminada y también debido a mala

higiene personal, además del uso incontrolado de agentes antimicrobianos, ya que en

estudios multicéntricos realizados en Colombia, Chile y España se reportaron

prevalencias entre el 36% y 17,6% (Ardila et al., 2010 ; Herrera et al., 2008). En Bogotá,

Colombia en el estudio realizado por Mayorga et al., (2007), se describió la presencia de

bacilos entéricos, principalmente los pertenecientes a la tribu Klebsiellae (géneros

Klebsiella, Enterobacter, Serratia).

2.3 Resistencia antibiótica en enterobacterias

Los bacilos entéricos cobran gran importancia debido a las altas tasas de resistencia

antibiótica que presentan, lo cual se ha convertido en la mayor preocupación por parte

del personal médico puesto que el mal uso de antibióticos asociados con una pobre

higiene oral podría facilitar la colonización de microorganismos en cavidad oral, también

en la diseminación de genes de resistencia entre microorganismos normales en la cavidad

oral (Ramos et al., 2010). Generalmente el tratamiento de las infecciones asociadas a

cavidad oral se encuentran íntimamente relacionadas con los antibióticos betalactámicos

como las penicilinas, las cuales han sido las más frecuentes prescripciones antibióticas en

todo el mundo (Gaetti et al., 2010), sin embargo, la mayor prescripción de antibiótico para

6

infecciones de cabeza y cuello están íntimamente relacionadas con antibióticos como la

amoxicilina; no obstante cabe resaltar que la genética evolutiva de las bacterias que se

encuentran expuestas a estos medicamentos sin un adecuado seguimiento de las

instrucciones médicas por parte de los pacientes o tal vez por la despreocupación médica

al prescribir antibióticos sin la necesidad de estos, han disparado los índices de

resistencia antibiótica, ejemplo de esto es el caso de los antibióticos betalactámicos ya

antes mencionados, a los cuales las bacterias han adquirido genes de resistencia que

codifican para betalactamasas. La resistencia generada hacia estos medicamentos ha

comprometido la eficacia de esta terapia, y favorecido la diseminación de genes de

resistencia entre microorganismos (Ramos et al., 2010). Basándose en esto se puede

afirmar que, en consecuencia, la resistencia antibiótica creada entre hospedador- bacteria

se supone que representará una característica mayor en el desarrollo de la resistencia

dentro de patógenos bacterianos. Adicional a esto la detección de resistencia bacteriana

en la microbiota del hospedador ha señalado a la cavidad oral como una posible fuente de

reservorio de genes asociados a la resistencia antibiótica en bacterias patógenas (Gaetti

et al., 2010).

2.4 Mecanismos de acción de los antibióticos

2.4.1 Amoxicilina

La amoxicilina es una penicilina semisintética, su mecanismo de acción consiste en la

inhibición de la síntesis de la pared bacteriana, interfiriendo en la síntesis del

peptidoglucano mediante un bloqueo en la última etapa de su producción

(transpeptidación) pero también actúan activando la autolisina bacteriana endógena que

destruye el peptidoglicano. Sin la pared, la bacteria queda expuesta al medio y muere

debido a cambios en la presión oncótica (Gómez et al., 2015). Tras la necesidad de la

comunidad médica la cual necesitaba hallar mecanismos que contrarrestan la codificación

genética que impide la eficacia de los antibióticos betalactámicos se encontró la

asociación entre betalactámicos y ácido clavulánico, el cual es un potente actor que inhibe

la función de las betalactamasas frente a la acción del antibiótico, estas asociaciones

son muy frecuentemente utilizadas en tratamientos de infecciones odontogénicas,

7

particularmente en pacientes quienes ya han tenido una historia previa de uso de

betalactámicos (Gaetti et al., 2010), la expresión de combinaciones resistentes a

ampicilina o amoxicilina/ácido clavulánico han sido frecuentemente hallados en entéricos

Gram negativos y Staphylococcus spp( Gaetti et al., 2010).

Imagen 1. Ilustración mecanismo de acción de antibiótico Betalactamicos

Tomado de: Suárez, C., & Gudiol, F. (2009). Antibióticos betalactámicos. Enfermedades infecciosas y microbiologia

clínica, 27(2), 116–129.

2.5 Mecanismos de resistencia de las enterobacterias a antibióticos betalactámicos

La resistencia antibiótica puede ser puede ser dada por dos caminos: natural o adquirida.

La resistencia natural es propia de cada familia, especie o grupo bacteriano, las bacterias

son capaces de adquirir resistencia en función de su variabilidad genética, mientras que

la resistencia adquirida es la que se estudia en un medio in vitro y se analiza, si la bacteria

adquirió. Nuevos mecanismos de resistencia pueden ser adquiridos mediante mutación o

mediante transferencia de material genético entre células bacterianas de especies

relacionadas o diferentes, estos genes de resistencia pueden estar codificados en el

material genético cromosómico o extra cromosómico (plásmidos) (Bado et al, 2010).

Las bacterias Gram negativas poseen un mecanismo de resistencia conocido como las

betalactamasas, las cuales son capaces de inactivar las penicilinas y las cefalosporinas

8

mediante la hidrólisis. Algunos de estos mecanismos de resistencia se pueden asociar a

tres grupos: el primero es la inactivación enzimática, el principal mecanismo de

inactivación es la hidrólisis, como sucede con los betalactámicos; el segundo corresponde

a las modificaciones en el sitio blanco, y el tercero son la alteraciones de la permeabilidad

asociado con las alteraciones de la membrana bacteriana, lo cual se ve fundamentalmente

en Gram negativos, donde la membrana externa de la envoltura celular rica en lípidos es

impermeable a las sustancias hidrofílicas, alteraciones en la entrada de antibióticos

dependiente de energía, como ocurre en la primera etapa de ingreso de los

aminoglucósidos, y el aumento de la salida de antibióticos: la resistencia por eflujo es un

mecanismo inespecífico, que afecta a diferentes grupos de antibióticos como

betalactámicos, quinolonas, tetraciclinas y cloranfenicol (Bado et al, 2010).

2.6 Genes de resistencia antibiótica en enterobacterias

Los genes de resistencia antibiótica es la capacidad genética que tiene un microorganismo

para expresarlo en rasgos específicos que les han permitido evadir el efecto de los

fármacos, estos genes de resistencia pueden adquirirse a través de mutaciones del ADN,

transformación por incorporación de ADN extraño o transducción mediada por fagos, o

por conjugación (Blair et al.,2015). Términos como adaptación y entrenamiento han sido

utilizados para entender la habilidad de estos microorganismos de adquirir nuevas

características. Por tal motivo, la exposición a antibióticos no solo contribuye a la

selección de mutantes resistentes, sino que además acelera las tasas de mutación (Camou

et al., 2017).

2.6.1 Genes de resistencia a Betalactámicos (blaTEM y blaSHV)

Los genes de resistencia antibiótica en enterobacterias variarán dependiendo la familia

de antibióticos empleada durante el proceso infeccioso; en el caso de los genes que

codifican para la resistencia antibiótica a betalactámicos, se encontró que los antibióticos

más comúnmente prescritos son los de la familia de los betalactámicos debido a su

eficiencia del mecanismo de acción y baja toxicidad (Veras et al., 2015). Como se mencionó

anteriormente, el mecanismo de acción de los betalactámicos radica en conducir a la

degradación bacteriana por medio de la destrucción de la pared celular resultando en una

9

eventual lisis celular (Veras et al., 2015), de este modo las bacterias necesitan un

mecanismo de defensa frente a este ataque, por tal motivo se lleva a cabo la producción de

β-lactamasa, que es el mecanismo más común e importante de resistencia a antibióticos

β-lactámicos, las β-lactamasas clásicas son enzimas capaz de inactivar penicilinas y de

espectro estrecho cefalosporinas antes de alcanzar su objetivo (Veras et al., 2015). Las β-

lactamasas clásicas pueden codificarse mediante genes cromosómicos como blaTEM-1, y

blaSHV-1, o por genes plasmídicos como blaTEM-1, que confieren resistencia a ampicilina,

amoxicilina, carbenicilina, y ticarcilina (Veras et al., 2011).

Las mutaciones genéticas de las β-lactamasas clásicas pueden provocar la sustitución de

uno o más aminoácidos durante la formación de proteínas, aumentando el espectro

hidrolítico de la trans-enzima CTX-M. Estas mutaciones hacen posible la aparición de β-

lactamasas de espectro extendido (ESBLs), las cuales son enzimas que pueden hidrolizar

β-lactámicos de última generación, antibióticos como cefotaxima, ceftazidima,

cefoperazona, y aztreonam. Estas enzimas incluyen familias PER, VEB, GES, TEM y SHV

(Veras et al., 2011).

Los genes de resistencia se transportan en plásmidos que pueden albergar otros genes

que codifican resistencia contra diferentes agentes antimicrobianos. Los plásmidos se

transfieren fácilmente entre diferentes especies bacterianas, lo que lleva a la

diseminación de bacterias resistentes a múltiples antibióticos. Escherichia coli y Klebsiella

spp. Son los productores más comunes de ESBLs y son responsables de muchas

infecciones adquiridas en el hospital y en la comunidad (Asultan et al., 2013).

2.6.1.1 blaTEM

Las β-lactamasas TEM son muy comunes en las bacterias Gram negativas y sus mutantes

emergentes, caracterizado como "de espectro extendido” o ESBLs se sabe que son capaces

de atacar varios antibióticos betalactámicos (Asultan et al., 2013). La secuenciación

extensa de nucleótidos de genes relacionados con blaTEM ha identificado una amplia

variedad de genes estructurales en la nomenclatura del gen TEM, que tiene en cuenta el

nucleótido secuencia del gen estructural y el promotor, también llamado marco de

secuencia, se han descrito siete genes blaTEM-1. (Astudillo et al.,2010).

10

Por ejemplo, TEM-1, β- lactamasas son de mayor frecuencia en bacterias Gram negativas,

es capaz de hidrolizar penicilinas y cefalosporinas. TEM - 2 el primer derivado de TEM-1,

tiene una única sustitución de aminoácido de la betalactamasa original sin cambiar el

perfil de sustratos. TEM- 3 es la primera enzima tipo TEM en exhibir el fenotipo de

espectro extendido. Desde entonces más de 90 derivados se han descrito. Algunas de estas

enzimas son resistentes a los inhibidores de las β-lactamasas (Astudillo et al.,2010).

La mayoría de los genes blaTEM se expresan a partir de P3 (Nelson et al., 2003), el cual está

definido como un elemento fundamental en la edición genética, ya que ésta actúa como

tijeras para facilitar la edición del ADN. Estudios han demostrado que la resistencia a

amoxicilina / ácido clavulánico de las enterobacterias, puede estar asociada con la

sobreproducción de blaTEM-1, generalmente en Escherichia coli, expresando a partir de P5.

Se sabe mucho menos sobre el papel de la sobreproducción de TEM-1 en resistencia a co-

amoxiclav en Klebsiella pneumoniae. (Nelson et al., 2003)

2.6.1.2 blaSHV

Las β-lactamasa del tipo SHV podrían ser del tipo ESBLs más frecuentemente encontradas

en aislamientos. SHV denota una respuesta variable a los inhibidores sulfhidrilo. Han sido

detectadas en un amplio rango de enterobacterias (Astudillo et al., 2010). Se considera

una enzima codificada por plásmidos, sin embargo, esta β-lactamasa se encuentra con

mayor frecuencia (hasta 80 a 90%) en Klebsiella pneumoniae.

Por tanto, el SHV-1 se ha considerado putativamente transmitido por cromosomas

(Chaves et al., 2001). La mayoría de K. pneumoniae son portadores del gen de la clase

cromosómica A SHV-1 β-lactamasa. Este tiene actividad limitada contra ampicilina y no

hidroliza los antibióticos betalactámicos de espectro extendido. La presencia de este gen

ha sido estudiada previamente en cepas de K. pneumoniae procedentes de la microbiota

de individuos sin infección bacteriana (Veras et al., 2015).

11

3. Planteamiento del problema

3.1 Descripción del problema

Las enterobacterias son una familia heterogénea y amplia de bacilos Gram negativos que

residen en el colon del hombre sin causar enfermedad, aunque con frecuencia son

causantes de un número considerable de infecciones. Este tipo de microbiota es normal a

nivel gastrointestinal, sin embargo, estos microorganismos generalmente están

implicados en procesos infecciosos graves, puesto que son considerados como patógenos

oportunistas, que producen infección cuando salen de su hábitat o hay alteraciones de las

defensas locales. Los géneros oportunistas que con mayor frecuencia se aíslan de

muestras clínicas son Escherichia, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Proteus,

Morganella, Providencia, entre otros (Merino et al., 2008).

A nivel oral las enterobacterias son consideradas microbiota transeúnte, y de acuerdo con

Negroni (2009), las principales prácticas por las cuales estas bacterias pueden llegar a la

cavidad oral se asocian con la disposición del implemento como lo es dejar el cepillo de

dientes en el baño, lo que implica una alta probabilidad de autoinoculación por agentes

bacterianos de esta familia, así como contaminación mano ano boca, o consumo de agua

contaminada. Estas bacterias pueden llegar a ser microorganismos sobreinfectantes que

complican el tratamiento antibiótico instaurado frente a una fase infecciosa a nivel oral.

En la práctica clínica odontológica se emplean distintos antibióticos para el tratamiento

de diversas infecciones. La elección del antibiótico es empírica basándose en criterios

epidemiológicos en función del cuadro clínico, las bacterias implicadas en el mismo y su

sensibilidad al antibiótico, además del perfil farmacológico/farmacodinámico del mismo

y las características individuales y clínicas del paciente. Los antibióticos de primera

elección son los betalactámicos como amoxicilina, amoxicilina ácido clavulánico, aunque

en ocasiones como alternativa se usa clindamicina, la cual es una lincosamida (Rodríguez

et al., 2009), o macrólidos como la azitromicina, cuando el paciente presenta alergia a los

betalactámicos.

12

La amoxicilina extiende la actividad antimicrobiana de las penicilinas hacia las bacterias

Gram negativas. Todas las cepas de Pseudomonas y la mayoría de las cepas de Klebsiella y

Enterobacter son resistentes; en el caso de la adición del ácido clavulánico, este no tiene

actividad antibacteriana, pero amplía el espectro de la amoxicilina a cepas productoras de

betalactamasas como Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y las enterobacterias.

De este modo a nivel clínico los betalactámicos no son la mejor opción para el control de

infecciones por bacilos entéricos, debido a que frecuentemente portan genes de

resistencia a antibióticos. Para la Organización Panamericana de la Salud (OPS) (2004) los

protocolos de tratamiento contra bacterias entéricas se encuentran relacionados con el

uso de cefalosporinas de cuarta generación, carbapenémicos como ertapenem, imipenem

y meropenem, o quinolonas, a nivel clínico, a pesar de que las bacterias también pueden

o no presentar resistencia antes estos antibióticos, pero no son antibióticos de elección

para procesos de infecciones de cavidad oral.

Actualmente se ha observado que la resistencia a los antibióticos aumenta año tras año, y

esta resistencia se ha asociado con diversos mecanismos bacterianos, los cuales se

relacionan directamente con la presencia de genes de resistencia, entendidos como las

distintas herramientas con que cuenta una bacteria para evitar la acción del antibiótico

en cuestión. Al referirse al arsenal genético y metabólico, se quiere señalar que no siempre

es suficiente con que el microorganismo posea un gen que codifica un mecanismo de

resistencia en particular, ese gen o esos genes deben ser expresados en cantidad y calidad

suficiente, y muchas veces deben interactuar distintos mecanismos de resistencia para

alcanzar la sobrevida bacteriana (Bado et al., 2010).

Las enterobacterias presentan resistencia a diversos agentes antimicrobianos ya que

poseen diferentes mecanismos para hidrolizar, expulsar o modificar los antibióticos,

sobreviviendo a la presencia y acción de estos (Gaetti et al., 2010), produciendo así

infecciones oportunistas, o dificultando el éxito en el tratamiento. Es importante connotar

la relevancia de las enterobacterias en el organismo para realizar procesos digestivos, sin

embargo, también se encuentran implicadas en provocar repercusiones graves en la salud

oral de las personas. También en la diseminación de genes de resistencia a otros géneros

bacterianos de la microbiota oral (Gaetti et al., 2010). Según Gaetti, estos

13

microorganismos han presentado un perfil muy diverso de susceptibilidad antibiótica en

comparación con los aerobios estrictos. Tal vez estas bacterias pueden participar en las

infecciones de cabeza y cuello, en las cuales su protocolo de manejo clínico incluye la

administración de una terapia antibiótica con amoxicilina o azitromicina en su defecto.

Entre las razones asociadas al aumento de resistencia antibiótica de microorganismos

aislados de cavidad oral, se considera el uso indiscriminado de los antibióticos, dentro de

los cuales es correcto afirmar que el antibiótico de elección para combatir infecciones de

bacterias entéricas no es la amoxicilina o en su defecto la azitromicina, sin embargo es

importante evaluar los genes que han codificado resistencia de enterobacterias a nivel

oral frente a estos antibióticos, los cuales como ya se ha mencionado son la elección para

infecciones de cabeza y cuello; junto con esto se encuentran asociados factores como la

pobre higiene oral, lo cual podría facilitar la colonización de microorganismo en cavidad

oral.

A nivel clínico se ha reportado de manera frecuente la resistencia de bacterias entéricas a

múltiples antibióticos, y ya se encuentran protocolos establecidos para el tratamiento

contra infecciones asociadas, es necesario tener en cuenta que la resistencia antibiótica

puede variar dependiendo de la zona geográfica a evaluar, ya sea por factores sociales,

culturales, políticas públicas y el acceso a la salud, sin embargo, a nivel global existen

estudios realizados en países como Alemania, Reino Unido, España y Brasil relacionados

con el seguimiento epidemiológico de los principales genes de resistencia antibiótica

frente a amoxicilina en bacilos entéricos aislados de la cavidad oral, no obstante a

nivel Colombia, hay poca información asociada o no existe suficiente evidencia, ni

reportes en la literatura donde se evalué o se realice seguimiento epidemiológico a estos

genes de resistencia antibiótica.

3.2 Pregunta de Investigación

¿Cuál es la frecuencia de genes blaSHV y blaTEM codificantes para la resistencia antibiótica a

amoxicilina, en enterobacterias aisladas de cavidad oral?

14

4. Justificación

Los bacilos Gram negativos entéricos se consideran a nivel de la cavidad oral como

microbiota transeúnte, llegando a comportarse como patógenos oportunistas que tienen

la capacidad de exacerbar procesos infecciosos a nivel oral, y cobran gran importancia

debido a las altas tasas de resistencia antibiótica que presentan. Entre los tratamientos de

elección para tratar un proceso infeccioso bacteriano se incluye el uso de antibióticos, sin

embargo, la actual presencia de genes asociados con resistencia antibiótica es un

problema de salud pública. De acuerdo con la OMS las altas y frecuentes tasas de

resistencias antibióticas en la actualidad generan desafíos constantes, sin embargo, estas

problemáticas no solo afectan la salud, sino que tienen un impacto socioeconómico

negativo. Es de gran importancia reconocer todo lo que implica esta situación, ya que al

presentar resistencia antibiótica estos agentes patógenos, implica adecuar espacios e

invertir en medicamentos con mayor grado de eficacia. Su importancia en cavidad oral

radica en que estas bacterias se consideran intrínsecamente resistentes a diversos

antibióticos como las aminopenicilinas, cefalosporinas de primera generación y cefoxitina

debido a la presencia de β-lactamasas, por lo cual se convierten en fuente de genes de

resistencia a antibióticos usados comúnmente en odontología, que pueden encontrarse

con alta frecuencia y ser transmitidos a otras bacterias pertenecientes a la cavidad

oral (Mezzatesta et al., 2012; Carol et al., 2015).

La importancia de identificar la frecuencia de estos genes de resistencia aporta datos de

interés para la vigilancia epidemiológica, controlar la propagación de los

microorganismos y los genes, y con fines de mejoras en los tratamientos de infecciones

bacterianas a nivel odontológico.

15

5. Situación actual en el área de investigación

A nivel mundial las enterobacterias varían entre diferentes regiones, los estudios han

sido encaminados a identificar la prevalencia de bacterias entéricas en diversas

poblaciones y se ha establecido que el porcentaje varía de acuerdo con factores

demográficos, socioeconómicos, culturales, nutricionales, entre otros. A nivel oral los

bacilos Gram negativos entéricos son aislados frecuentemente en pacientes con

enfermedad periodontal. En Brasil se reportó frecuencia de 31,2% de enterobacterias en

pacientes con periodontitis crónica (Barbosa y Mayer, 2001). El porcentaje de pacientes

con periodontitis que presentaron bacterias entéricas en cavidad oral en Estados Unidos

fue 14% (1990), 61.1% en Rumania (1996) 67% en santo domingo. En Colombia durante

el 2002 se evaluó la frecuencia de bacilos entéricos en muestras de placa subgingival,

encontrando una prevalencia de 39,2% en individuos con periodontitis crónica severa y

32% en sujetos con periodontitis agresiva. A nivel de Bogotá se reportó una frecuencia

que oscilaba entre 10% y 15,2% en los grupos de estudio (Mayorga et al., 2007). Otro

estudio realizado por Lafaurie et al., en 2007, reportó una frecuencia del 34.5% de bacilos

entéricos en la microbiota subgingival de 483 pacientes con periodontitis, en 5 regiones

geográficas de Colombia. Estos estudios parecen indicar que la presencia de bacterias

entéricas en cavidad oral se relaciona con el bajo nivel de desarrollo de las poblaciones y

puede ser un importante indicador de desarrollo socioeconómico de las mismas (Barbosa

et al., 2001).

En estudios previos realizados por el grupo de investigación, se reportó que el 51,3 %

de los pacientes evaluados, presentaban bacterias entéricas en por lo menos una

muestra de dos muestras seriadas, se encontró 66% de bacterias entéricas en la saliva

de pacientes con periodontitis agresiva, y un 53% en pacientes con periodontitis crónica,

sin embargo en pacientes con periodontitis no se identificaron los microorganismos

(Lafaurie et al.,2007); lo que podría indicar que la presencia de enfermedad periodontal

podría asociarse con la presencia de enterobacterias en cavidad oral. Un estudio realizado

en el 2012 en la ciudad de Bogotá reporta que E. cloacae y C. sakazakii fueron los

microorganismos más prevalentes en saliva (Durán et al. 2012).

16

La resistencia bacteriana a los antibióticos es un problema de salud mundial que se

encuentra en constante evolución. De manera frecuente se reportan nuevos mecanismos

de resistencia bacteriana a los antibióticos, tanto en bacterias Gram negativas como en

bacterias Gram positivas. En el 2017 se llevó a cabo un estudio epidemiológico

metacéntrico en hospitales mexicanos para conocer la resistencia de los microorganismos

causantes de infecciones de interés epidemiológico. En dicho estudio participaron 20

hospitales, las enterobacterias predominantes, E. coli y K. pneumoniae, presentaron un

porcentaje importante de 39,7% de resistencia a tetraciclinas y fluoroquinolonas (Muñoz

et al., 2017) En Colombia, se hizo un estudio en 8 hospitales y se analizó la prevalencia y

susceptibilidad a antibióticos y fueron aislados de K. pneumoniae y E. coli productoras de

BLEEs (β-lactamasas de espectro extendido), los resultados mostraron una prevalencia

de 34.8% de K. pneumoniae en unidad de cuidados intensivos (Cabrera et al., 2007).

17

6. Objetivos

6.1 Objetivo general:

● Determinar la frecuencia de genes de resistencia antibiótica a amoxicilina en

bacilos entéricos aislados de cavidad oral.

6.2 Objetivos específicos:

● Determinar la frecuencia de los principales géneros y especies de bacilos entéricos

aislados a partir de muestras de cavidad oral.

● Establecer la frecuencia de los genes blaTEM y blaSHV en bacilos entéricos aislados

de cavidad oral.

18

7. Metodología del Proyecto

7.1 Tipo de estudio: Descriptivo observacional in vitro

7.2 Población y muestra: Se seleccionaron 95 aislamientos de bacilos entéricos obtenidos

a partir de muestras de placa subgingival, placa supra gingival y saliva de pacientes que

asistieron a las clínicas odontológicas de la Universidad El Bosque y que se encontraban

almacenadas en el cepario del Laboratorio de Microbiología Oral del Instituto UIBO de la

Universidad El Bosque, conservadas en caldo BHI + 10% de glicerol, a -80°C.

7.3 Métodos y técnicas para la recolección de la información (Materiales y métodos):

7.3.1 Procesamiento microbiológico

Las muestras almacenadas a -80°C fueron descongeladas y sembradas en agar

MacConkey, el cual se incubó durante 24 horas a 37°C, en atmósfera de aerobiosis.

Posteriormente se verificó el crecimiento y pureza del cultivo. Se realizó una

identificación inicial de los géneros y especies bacterianas utilizando la galería bioquímica

BBL Crystal E/NF, la cual se incubó a 37°C, durante 24 horas, y se realizarán pruebas

complementarias de índol y oxidasa. Los aislamientos fueron guardados en agua grado

molecular y se almacenaron a -.20°C para posterior extracción de ADN.

7.3.2 Extracción de ADN

A partir de los aislamientos bacterianos guardados en agua grado molecular se realizó

extracción de ADN mediante choque térmico, técnica en la cual se sometieron las bacterias

a cambios de temperatura. Los aislamientos se llevaron a ebullición en agua destilada

desionizada durante 20 minutos, lo que conduce a la destrucción de las estructuras,

liberando así el ADN bacteriano, posteriormente se centrifugaron a 14000 rpm a 4°C,

durante 10 minutos y se pasó el sobrenadante a un nuevo tubo. El ADN se conservó a -

20°C hasta su uso.

19

7.3.3 Detección de genes de resistencia antibiótica por Reacción en Cadena de la Polimerasa

(PCR)

Se determinó la presencia de los blaTEM y blaSHV de resistencia a amoxicilina por reacción

en cadena de la polimerasa (PCR) convencional con primers y protocolos reportados en

la literatura.

Tabla 1. Secuencias de primers utilizados para la detección de los genes blaTEM y blaSHV

Gen Secuencia de Primers Longitud en pb Autor

blaTEM F: 5’-ATGAGTATTCAACATTTCCG-3’ R: 5’-CCAATGCTTAATCAGTGAGG-3’

858 pb

Ioannidis et al. 2009

blaSHV F:5’- TCGTTATGCGTTATATTCGCC-3’ R:5’- GGTTAGCGTTGCCAGTGCT-3’

868 pb

Ugbo et al., 2020

La detección del gen blaTEM se llevó a cabo según el protocolo descrito por Ioannidis et al.,

2009 con modificaciones. La reacción se produjo en un volumen final de 25 μL, de los

cuales 5 μl corresponden a la muestra y 20 μl a la mezcla de reacción que contenía buffer

de PCR 1X, (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl [pH 9.0 a 25°C], 1 mM MgCl2 y 0.1% de Triton®

X-100), 0.25 UI de Taq DNA polimerasa G2 (Promega), MgCl2 1 mM, 20 mM de cada

desoxirribonucleótido y 2μM de cada Primer. Se completó el volumen con agua grado

molecular. La PCR se realizó en un termociclador T100™ Thermal Cycler (Bio-Rad)

incluyendo un paso inicial de 94°C durante 4 minutos, seguido de 35 ciclos de: 94°C por

1 minuto, 55°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto y un paso final de 72°C durante 7

minuto. Se incluyeron controles positivos y negativos.

La detección del gen blaSHV se llevó a cabo según el protocolo descrito por Ugbo et al., 2020

con modificaciones. La reacción se produjo en un volumen final de 25 μl, de los cuales 5

μl corresponden a la muestra y 20 μl a la mezcla de reacción que contenía buffer de PCR

1X, (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl [pH 9.0 a 25°C], MgCl2 2 mM y 0.1% de Triton® X-100),

0.050 UI de Taq DNA polimerasa (Promega), 0.02 mM de cada desoxirribonucleótido y

0.02μM de cada Primer. Se completó el volumen con agua grado molecular. La PCR se

realizó en un termociclador T100™ Thermal Cycler (Bio-Rad) incluyendo un paso inicial

20

de 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de: 94°C por 30 segundos, 58°C por 1

minuto y 72°C por 1 minuto y un paso final de 72°C durante 10 minutos. Se incluyeron

controles positivos y negativos.

7.3.4 Electroforesis

Los productos obtenidos mediante PCR fueron visualizados en el transiluminador BIO-

RAD, mediante la técnica de electroforesis en un gel del 1,5% de agarosa con buffer TAE

(Tris acetato, EDTA) con 0,5 μg/mL de bromuro de etidio.

7.4 Plan de tabulación y análisis.

Se realizó un análisis descriptivo a partir de la construcción de una base de datos en el

programa Microsoft Excel (versión 2016); para determinar las frecuencias de los

principales géneros y especies bacterianas, y la frecuencia de los genes asociados con

resistencia antibiótica a Amoxicilina en bacterias entéricas aisladas de cavidad oral.

21

8. Consideraciones éticas

Bajo el desarrollo de este proyecto investigativo, no se realizaron experimentos en

humanos y/o animales. Sin embargo, el proyecto se encuentra orientado netamente a la

obtención de aislamientos clínicos de bacilos entéricos obtenidos de pacientes los cuales

accedieron voluntariamente a la donación de una muestra de saliva y/o placa gingival. Sin

embargo, los residuos generados en los procesos experimentales, aun cuando son poco

peligrosos, serán eliminados según la política ambiental de la Universidad El Bosque,

establecida en el programa SIGA Ley 99 de 1993.

8. 1 Sustento legal

La resolución 008430 de 1993, Título IV, Capítulo I en los artículos del 63 al 72, mencionan

el respaldo legal que tiene el proyecto. Pues dentro de este se manipula material biológico

por lo cual debe existir soporte de la bioseguridad empleada en el estudio. Por tal motivo

la investigación puede ser enmarcada y definida como una investigación con un riesgo

mínimo ético, por lo cual no requiere de ningún tipo de aval ético.

8.2 Consentimiento y asentimiento informado

Todas las muestras utilizadas en la investigación cuentan con un consentimiento

informado pre existente ya que en ningún momento se tendrá contacto con el paciente

debido a que son muestras preservadas desde hace varios años.

22

9. Resultados

9.1 Frecuencia de bacterias entéricas

A partir de los 95 aislamientos de bacterias entéricas se realizó la identificación de los

géneros y especies bacterianas. Se encontró en mayor frecuencia el género Enterobacter

en un 28.4%, seguido de Serratia en el 23.1%, Klebsiella en un 32.6%, Cronobacter 11.5%

y Escherichia en un 4.2% (Tabla 2).

Tabla 2. Frecuencia de géneros de Enterobacterias aisladas en muestras de saliva y placa supra y

subgingival

Género Frecuencia (%)

Enterobacter 27 (28,4)

Serratia 22 (23,1)

Klebsiella 31 (32,6)

Cronobacter

Escherichia

11 (11,5)

4 (4,2)

A nivel de especies bacterianas se encontró en mayor frecuencia Klebsiella pneumoniae (20%),

Enterobacter cloacae (18.9%), seguido de Serratia marcescens (18.9%), Cronobacter sakazakii

(11.6%), Klebsiella oxytoca (11.6%), Enterobacter gergoviae (6.3%), Serratia liquefaciens (4.2%),

Escherichia coli (4.2%), y Enterobacter aerogenes (3.1%) (Tabla 3).

Tabla 3. Frecuencia de géneros y especies de Enterobacterias aisladas en muestras de saliva y

placa supra y subgingival

Género y especie Frecuencia

Klebsiella pneumoniae 20 (20%)

Enterobacter cloacae 18 (18.9%)

Serratia marcescens 18 (18.9%)

Cronobacter sakazakii 11 (11.6%)

Klebsiella oxytoca 11 (11.6%)

Enterobacter gergoviae 6 (6.3%)

Serratia liquefaciens 4 (4.2%)

23

Escherichia coli 4 (4.2%)

Enterobacter aerogenes 3 (3.1%)

9.2 Frecuencia de genes de resistencia en bacterias entéricas

A partir de los 95 aislamientos de bacterias entéricas se realizó la detección de los genes

blaTEM y blaSHV. Se encontró mayor frecuencia del gen blaTEM fue detectado en el 27.2% del

total de aislamientos. Fue más frecuente en Enterobacter (7.3 %), seguido por Klebsiella

(8.4%), Serratia (6.3 %), Cronobacter (3.1%) y Escherichia coli (2.1 %); mientras que gen

blaSHV se encontró en el 16.7% de los aislamientos, principalmente en el género

Enterobacter en un 5.2%, seguido de Klebsiella (6.3%), Cronobacter (3.1%) y Serratia

(2.1%)(Tabla 4).

Tabla 4. Frecuencia de genes blaTEM y blaSHV en Enterobacterias aisladas en muestras de saliva y

placa supra y subgingival

Género Frecuencia blaSHV Frecuencia blaTEM

Klebsiella 6 (6.3%) 8 (8.4%)

Enterobacter 5 (5.2%) 7 (7.3%)

Serratia 2 (2.1%) 6 (6.3%)

Cronobacter 3 (3.1%) 3 (3.1%)

Escherichia coli 0 (0%) 2 (2.1%)

Total de aislamientos 16 (16.7%) 26 (27.2%)

A nivel de las especies bacterianas el gen blaTEM se encontró en mayor frecuencia en

Serratia marcensces (6.3%), seguido de Enterobacter cloacae (5.2%), Klebsiella

pneumoniae (5.2%), Cronobacter sakazakii (3.1%) Klebsiella oxytoca (3.1%), Escherichia

coli (2.1%), Enterobacter gergoviae (1%) y Enterobacter aerogenes (1%). Respecto al gen

blaSHV, se observó mayor frecuencia en Klebsiella oxytoca (4.2%), Enterobacter cloacae

(3.1%), Cronobacter sakazakii (3.1%), Klebsiella pneumoniae (2.1%), Serratia marcensces

24

(2.1%), Enterobacter gergoviae (1%) y Enterobacter aerogenes (1%). En Escherichia

coli no se detectó la presencia del gen. (Tabla 5)

Tabla 5. Frecuencia de genes blaTEM y blaSHV en especies de Enterobacterias aisladas en muestras

de saliva y placa supra y subgingival

Género y especie Frecuencia blaSHV Frecuencia blaTEM

Serratia marcescens 2 (2.1%) 6 (6.3%)

Enterobacter cloacae 3 (3.1%) 5 (5.2%)

Klebsiella pneumoniae 2 (2.1%) 5 (5.2%)

Cronobacter sakazakii 3 (3.1%) 3 (3.1%)

Klebsiella oxytoca 4 (4.2%) 3 (3.1%)

Escherichia coli 0 (0%) 2 (2.1%)

Enterobacter Gergoviae 1 (1%) 1 (1%)

Enterobacter aerogenes 1 (1%) 1 (1%)

Total aislamientos 16 (16.6%) 26 (27%)

.

25

10. Discusión

Los bacilos entéricos generalmente están implicados en procesos infecciosos graves,

puesto que son considerados como patógenos oportunistas, en la cavidad oral se

consideran microbiota transeúnte, asociados con infección cuando salen de su hábitat o

hay alteraciones de las defensas locales, los cuales cobran gran importancia debido a que

pueden dificultar el tratamiento antibiótico seleccionado frente a una fase infecciosa oral.

A lo largo del desarrollo de tratamientos de infecciones bacterianas se ha implementado

el uso frecuente de antibióticos, tanto en el ámbito médico y odontológico, sin embargo,

el uso indiscriminado de estos antibióticos a nivel general ya sea por el mal uso de un

protocolo previamente instaurado por parte de los pacientes, o en su defecto del personal

de salud, favorece la persistencia y diseminación de resistencia antibiótica en todo el

mundo; por tal motivo se ha llevado a cabo extensas investigaciones a nivel mundial

evaluando la presencia de genes de resistencia en microorganismos como los bacilos

entéricos.

La resistencia a los antimicrobianos supone una amenaza a la esencia misma de la

medicina moderna y a la sostenibilidad de una respuesta de salud pública mundial eficaz

ante la amenaza persistente de las enfermedades infecciosas. Un grupo importante de

bacterias que fácilmente desarrollan resistencia a los antibióticos lo constituyen los

bacilos Gram negativos de la familia Enterobacteriaceae. Estos microorganismos no son

habituales en la cavidad oral, pero según diversos reportes de la literatura. y los

resultados del presente estudio, se evidencia que los géneros que se presentan con mayor

frecuencia en aislamientos de saliva y placa subgingival y supra gingival son Enterobacter

(40%), seguida de Serratia (32.63%), Klebsiella (23.15%) y Escherichia (4.2%). Autores

como Leão et al., (2015), reportaron la presencia de Enterobacter (46,9%), Klebsiella

(18,8%) y Citrobacter (17,2%) comúnmente en la cavidad oral. (Nelson et al., 2003;

Asultan et al., 2013; Merino et al., 2008)

En Colombia en un estudio de Lafaurie et al., en el año 2007 en donde se incluyeron

diferentes zonas del país (Bogotá, Este, Pacífico oeste, Atlántico Norte y zona central) se

26

evidencio que había gran frecuencia de bacterias entéricas en 29.8% en la mayoría de los

pacientes incluyendo los pacientes control, y en los pacientes con periodontitis se

encontró una prevalencia de 34.8%. En los estudios realizados se ha observado que en

cavidad oral se han encontrado bacilos Gram negativos conformados en su gran mayoría

por bacterias de la familia Enterobacteriaceae como Klebsiella spp., Enterobacter spp. y

Escherichia coli (Betancourth et al., 2006). En otro estudio realizado por Ardila et al.,

(2010) se identificó que Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae son las especies

más prevalentes y, por otro lado, Rodríguez et al., (2012), manifiestan que las especies

con mayor prevalencia en cavidad oral fueron Klebsiella spp., y E. coli en la ciudad de

Bogotá. De acuerdo con los resultados de este estudio se encontró que el género y la

especie más frecuente fue Klebsiella pneumoniae (20%), seguido de Enterobacter cloacae

(18.9%), Serratia marcescens (18.9%), Enterobacter sakazakii (11.6%), Klebsiella oxytoca

(11.6%), Enterobacter Gergoviae (6.3%), Serratia liquefaciens (4.2%), Escherichia coli

(4.2%), Enterobacter aerogenes (3.1%). La presencia de bacterias entéricas en cavidad

oral puede ser debido a contaminación por fuentes exógenas, contaminación mano-ano-

boca, mala higiene oral, ingestión de agua o alimentos contaminados, contaminación de

los cepillos dentales, bajo nivel de desarrollo social, económico y cultura. (Negroni et al.,

2009; Durán et al., 2012).

En cuanto a la detección de los genes de resistencia de interés y lo reportado en la

literatura se evidenció que la producción de betalactamasas es uno de los más eficientes

mecanismos de resistencia a betalactámicos en aislamientos clínicos de la familia

Enterobacteriaceae (Veras et al., 2010). Las betalactamasas clásicas pueden codificarse

por genes cromosómicos como lo son blaTEM y blaSHV (Veras et al., 2010). El gen más

prevalente en los géneros de enterobacterias aisladas de cavidad oral en el estudio fue

blaTEM, específicamente en el género Klebsiella spp. y Enterobacter ssp, respectivamente.

El gen blaTEM que codifica para la hidrólisis de β-lactamas, considerado como el

mecanismo más común para que las bacterias adquieran resistencia a los antibióticos β-

lactámicos, además de ser el más investigado en la literatura (Yu et al., 2018), ha sido

mayormente reportado en bacilos entéricos como en Klebsiella pneumoniae y en

Escherichia coli (Stange et al., 2019). Se observa relación con base al estudio presencia en

27

bacterias pertenecientes a la microbiota oral como Klebsiella spp se considera un

precursor de las β -lactamasas de espectro extendido; un mecanismo de resistencia

importante que impide el tratamiento antimicrobiano por lo cual cobra importancia su

presencia al evitar el correcto mecanismo de acción de los antibióticos β-lactámicos, de

uso habitual en infecciones bacteriana frecuentes en la práctica odontológica.

En el estudio el gen blaTEM se encontró una frecuencia de 27.2 %, semejante a los hallazgos

de Rôças y Siqueira en el 2012 donde era el gen de resistencia a antibióticos más

prevalente entre los aislamientos estudiados, se encontró una prevalencia del 17% de los

aislamientos. Además, se reportó a blaTEM en otro estudio como el más frecuente detectado

en el 53% de las muestras. (Nelson et al., 2003).

El gen blaSHV en aislamiento provenientes de la cavidad oral pocos estudios han evaluado

la presencia de este gen en aislamientos de bacilos entéricos provenientes de cavidad oral,

sin embargo, en la literatura se reporta que, a nivel médico, el gen blaSHV fue reportado en

el 66% de 52 aislamientos de K. pneumoniae. Aunque la frecuencia encontrada de este gen

no es tan alta, en comparación con el ámbito clínico, su frecuencia es considerable, ya que

puede estar contribuyendo al problema de salud pública actual, por lo que el

conocimiento de su incidencia juega un papel importante en la selección del tratamiento

apropiado (Veras et al.2010).

En aislamientos de K. pneumoniae se halló que las bacterias llevan genes de resistencia

importantes, como blaTEM, blaSHV, blaKPC y blaCTX-M. (Veras et al., 2015). Sin embargo, autores

como Veras han reportado más de 180 variantes del gen blaSHV y más de 210 del gen blaTEM

ya han sido registrados y se encuentran ampliamente en la familia Enterobacteriaceae y

Klebsiella pneumoniae (Leal et al., 2015) a nivel odontológico. Sin embargo, el

conocimiento sobre los efectos causados por antibióticos β-lactámicos sobre la estructura

celular bacteriana de Gram negativos resistente a múltiples fármacos (MDR) en los

aislamientos de K. pneumoniae aún son escasos. Por tal motivo es de suma importancia

aumentar la investigación con el paso del tiempo.

28

11. Conclusiones

Los bacilos entéricos son considerados microbiota transeúnte de cavidad oral, los cuales

albergan importantes genes de resistencia como blaTEM y blaSHV, asociados con resistencia

a antibióticos de primera elección en el tratamiento odontológico.

La frecuencia de genes de resistencia como blaTEM y blaSHV en enterobacterias aisladas de

cavidad oral es baja en comparación con lo reportado en aislamientos clínicos de origen

médico, sin embargo, los bacilos entéricos se consideran un importante reservorio de

estos y otros genes los cuales pueden ser compartidos a microorganismos nativos de la

cavidad oral complicando el tratamiento.

29

12. Referencias:

1. Ardila Medina, C. M., Álzate Vega, J., & Guzmán Zuluaga, I. C. (2014). Correlation of

gram-negative enteric rods with clinical and demographic parameters of chronic

periodontitis patients. Avances En Periodoncia e Implantología Oral, 26(2), 77–82.

2. Ardila Medina, C. M. (2010). Efecto de las enterobacterias en pacientes con

periodontitis crónica. Avances En Periodoncia e Implantología Oral, 22(1), 27–35.

3. Astudillo, C., Pacheco, M., (2010). Epidemilogia de las infecciones por

microorganismosproductores de BLEE en el Hospital Vonzadez Quito entre los

años 2005 y 2009.

4. Bado, I., García, V., Robino, L., Cordeiro, N., Seija, V. y Vignoli, R. (nd). Principales

mecanismos de resistencia antibiótica.

5. Betancourth, M. B., Rce, R. A., D., O., Otero, J. B., D., O., Aramillo, A. J., … D., O. (2006).

Microorganismos inusuales en surcos y bolsas periodontales.

6. Blair, J. M. A., Webber, M. A., Baylay, A. J., Ogbolu, D. O., & Piddock, L. J. V. (2015).

Molecular mechanisms of antibiotic resistance. Nature Reviews. Microbiology,

13(1), 42–51.

7. Camou, T., Zunino, P., & Hortal, M. (2017). Alarma por la resistencia a

antimicrobianos: situación actual y desafíos. La Revista Médica Del Uruguay,

33(4), 104–127.

8. Chaves, J., Ladona, M. G., Segura, C., Coira, A., Reig, R., & Ampurdanés, C. (2001).

SHV-1 beta-lactamase is mainly a chromosomally encoded species-specific

enzyme in Klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,

45(10), 2856–2861.

9. Duran j, (2012) bacterias entéricas en cavidad oral y fuentes de contaminación

exógenas Bogotá, trabajo de grado D.C (1) 2 45.

30

10. Gaetti-Jardim, E. C., Marqueti, A. C., Faverani, L. P., & Gaetti-Jardim, E., Jr. (2010).

Antimicrobial resistance of aerobes and facultative anaerobes isolated from the

oral cavity. Journal of Applied Oral Science, 18(6), 551–559.

11. Gómez, N. L. (n.d.). susceptibilidad antimicrobiana a doxiciclina y ciprofloxacina

por concentración mínima inhibitoria en aislamientos de bacilos entéricos

provenientes de cavidad oral.

12. Gómez, Vázquez J., García E, Hernández A. (2015). Los betalactámicos en la

práctica clínica. -Universidad de Murcia. Revista Española de quimioterapia 28, 1-

9.

13. Hernández-Ramírez, K. C., Reyes-Gallegos, R. I., Chávez-Jacobo, V. M., Díaz-Magaña,

A., Meza-Carmen, V., & Ramírez-Díaz, M. I. (2018). A plasmid-encoded mobile

genetic element from Pseudomonas aeruginosa that confers heavy metal

resistance and virulence. Plasmid, 98, 15–21.

14. Herrera, D., Contreras, A., Gamonal, J., Oteo, A., Jaramillo, A., Silva, N., … León, R.

(2008). Subgingival microbial profiles in chronic periodontitis patients from Chile,

Colombia and Spain: Geographic microbiological differences in periodontitis.

Journal of Clinical Periodontology, 35(2), 106–113.

15. Lafaurie, G. I., Contreras, A., Barón, A., Botero, J., Mayorga-Fayad, I., Jaramillo, A., …

Arce, R. (2007). Demographic, clinical, and microbial aspects of chronic and

aggressive periodontitis in Colombia: a multicenter study. Journal of

Periodontology, 78(4), 629–639.

16. Leão-Vasconcelos, LSN de O., Lima, ABM, Costa, D. de M., Rocha-Vilefort, LO,

Oliveira, ACA de, Gonçalves, NF, Prado-Palos, MA (2015). Aislamientos de

enterobacterias de la cavidad bucal de trabajadores de un hospital oncológico

brasileño. Revista Do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 57 (2), 121–

127.

31

17. López Velandia, D. P., Torres Caycedo, M. I., & Prada Quiroga, C. F. (2016). Genes

de resistencia en bacilos Gram negativos: Impacto en la salud pública en Colombia.

Universidad y salud, 18(1), 190.

18. Magdeldin, S. (2012). Gel Electrophoresis - Principles and Basics (S. Magdeldin,

Ed.). InTech. páginas 3-6.

19. Merino L., et al- (2019) Familia Enterobacteriaceae. Universidad Nacional del

Nordeste.

20. Mezzatesta, ML, Gona, F. y Stefani, S. (2012). Complejo de Enterobacter cloacae:

impacto clínico y resistencia emergente a los antibióticos. Future Microbiology, 7

(7), 887–902.

21. Muñoz, JG, Corona, AMR, Bustamante, MEM, de Jesús Coria Lorenzo, J., Gallegos,

LA, Franco, ++ Juan Ramón Cuenca, JAS. (2017) Estudio multicéntrico de

resistencias bacterianas nosocomiales en México.

22. Negroni, M. (2009). Microbiologia estomatológica. Editorial Medica

Panamericana. p. 375.

23. Nelson, EC, Segal, H. y Elisha, BG (2003). Alteraciones de las proteínas de la

membrana externa y variantes de blaTEM-1: su papel en la resistencia a los

betalactámicos en Klebsiella pneumoniae. The Journal of Antimicrobial

Chemotherapy , 52 (6), 899–903.

24. OMS - Organización Mundial de la Salud. Oral Health. 2007. Resistencia a los

antimicrobianos. (Dakota del Norte).

25. Rôças, IN y Siqueira, JF, Jr. (2012). Genes de resistencia a antibióticos en bacterias

anaeróbicas aisladas de infecciones primarias del conducto radicular dental.

Anaerobe , 18 (6), 576–580.

32

26. Rodríguez Alonso E,. et Rodríguez Monje M. (2009) Tratamiento antibiótico de la

infección odontogénica. Sistema Nacional de Salud. Revista terapeutica Volumen

33, Nº 3. 67-79.

27. Rodríguez I, Calixto O, Cuervo W, Vásquez J, Ojeda J, Barinas D. (2012)

Microorganismos presentes en fonendoscopios, manos, cavidad oral y nasal de

estudiantes de una facultad de medicina. Rev.Fac.Med.; 20(1) pp.90-100.

28. Stange, C., Yin, D., Xu, T., Guo, X., Schäfer, C., & Tiehm, A. 2019. Distribution of

clinically relevant antibiotic resistance genes in Lake Tai, China. Science of The

Total Environment, 655, 337-346.

29. Suárez, C., & Gudiol, F. (2009). Antibióticos betalactámicos. Enfermedades

infecciosas y microbiologia clinica, 27(2), 116–129.

30. Veras, D. L., Alves, L. C., Brayner, F. A., Guedes, D. R. D., Maciel, M. A. V., Rocha, C. R.

C., & de Souza Lopes, A. C. (2011). Prevalence of the bla (SHV) gene in Klebsiella

pneumoniae isolates obtained from hospital and community infections and from

the microbiota of healthy individuals in Recife, Brazil. Current Microbiology,

62(5), 1610–1616.

31. Veras, D. L., Lopes, A. C. de S., da Silva, G. V., Gonçalves, G. G. A., de Freitas, C. F., de

Lima, F. C. G., … Brayner, F. A. (2015). Ultrastructural Changes in Clinical and

Microbiota Isolates of Klebsiella pneumoniae Carriers of Genes bla SHV, bla TEM,

bla CTX-M, or bla KPC When Subject to β-Lactam Antibiotics.

TheScientificWorldJournal, 2015, 572128.

32. Villagrana Moreno, A., Gómez Clavel, J., (2012). Antibiotic therapy in general

practice dentistry. Revista adm /vol. lxix no. 4 p.p. 168-175

33. Yu, X., Zhang, M., Zuo, J., Shi, X., Tang, X., Chen, L., & Li, Z. (2018). Evaluation of

antibiotic resistant lactose fermentative opportunistic pathogenic

33

Enterobacteriaceae bacteria and blaTEM-2 gene in cephalosporin wastewater and

its discharge receiving river. Journal of Environmental Management, 228, 458–

465.