FRECUENCIA DE Listeria spp., EN QUESOS

RESUMEN

Objetivo. Determinar la frecuencia de Listeria spp., en quesos frescos costeños,distribuidos en plazas de mercado populares de las ciudades de Montería y Cereté.Materiales y métodos. Teniendo en cuenta la importancia económica de esta zonaganadera para Colombia se tomaron 217 muestras entre Junio y Agosto de 2005, losaislamientos obtenidos fueron identificados por pruebas bioquímicas presuntivas, PCR-Múltiple (L1-U1/LF-LR) y pruebas bioquímicas para confirmación de especie.Adicionalmente, se determinó la frecuencia de las especies del género y se caracterizóla resistencia antimicrobiana de las cepas de mayor frecuencia. Resultados. Las pruebasbioquímicas y la PCR detectaron 49 aislamientos positivos para Listeria (22.58%), de loscuales 16.33% (8/49) correspondieron a Montería y 24.40% (41/168) a Cereté. Lafrecuencia por especies fue 14.75% para L. ivanovii, 2.30% para L. innocua, 1.84% paraL. welshimeri y 1.38% para L. seeligeri, no se detectó L. monocytogenes. Sólo 3/32cepas de L. ivanovvi (9.38%) mostraron resistencia a penicilina, estreptomicina yeritromicina respectivamente. Conclusiones. Los resultados confirman que los quesoscosteños están frecuentemente contaminados con Listeria spp. La presencia de L. ivanovii

patógeno involucrado en algunos casos de infecciones oportunistas en humanos y L.

innocua; microorganismo utilizado en muchas industrias de alimento como indicador delgrado o calidad de sanitización; demuestra que las condiciones de producción y expendiono son adecuadas y que el consumo de queso costeño no es seguro. La resistenciaantimicrobiana aunque baja muestra posibilidades para la transmisión horizontal y/overtical de los genes de resistencia.

Palabras clave: Listeria, frecuencia, quesos, Córdoba.

ORIGINAL

996

Rev.MVZ Córdoba 12(2): 996-1012, 2007

FRECUENCIA DE Listeria spp., EN QUESOSCOLOMBIANOS COSTEÑOS

FREQUENCY OF Listeria spp. IN COASTAL COLOMBIAN CHEESES

Janneth Gallegos1,4, M.Sc, Germán Arrieta2, Microb, Salim Máttar2, Ph.D, RaúlPoutou3*, Ph.D, Alba Trespalacios5, M.Sc, Ana Carrascal4, M.Sc.

1Escuela de Bioquímica y Farmacia. Facultad de Ciencias. Escuela Superior Politécnica deChimborazo, Riobamba. Ecuador. 2Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico,Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.3Laboratorio de Biotecnología Aplicada, 4Laboratorio de Microbiología de Alimentos, Grupode Biotecnología Ambiental e Industr ia l , 5Laborator io de Bacter io logía Especia l .Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana.Bogotá, D.C. Colombia.

Recibido: Agosto 23 de 2007; Aceptado: Noviembre 12 de 2007

ABSTRACT

Objective. To determine the frequency of Listeria spp., in coastal fresh cheeses,distributed in popular market places of Montería and Cereté cities. Materials andmethods. Keeping in mind the economic importance of this cattle area for Colombia,217 samples were collected between June and August of 2005, the obtained isolationswere identified by presumptive biochemical tests, multiple-PCR-(L1-U1/LF-LR) andbiochemical tests for species confirmation. Additionally the frequency of gender specieswas determined and the antimicrobial resistance of more frequency strains wascharacterized. Results. Biochemical tests and PCR detected 49 positive isolations forListeria (22.58%), of which 16.33% (8/49) corresponded to Montería and 24.40% (41/168)to Cereté. Frequency for species was 14.75% for L. ivanovii, 2.30% for L. innocua,1.84% for L. welshimeri and 1.38% for L. seeligeri, L. monocytogenes was not detected.Only 3/32 stumps of L. ivanovvi (9.38%) showed resistance to penicillin, streptomycinand erythromycin respectively. Conclusions. The results confirm that the coastal cheesesare frequently contaminated with Listeria spp. The presence of L. ivanovii pathogeninvolved in some cases by opportunist infections in human and L. innocua microorganismused in many food industries as indicator of the grade or sanitization quality; demonstratesthat the production conditions and marketing are not good and that the consumption ofcoastal cheese is not safe. The antimicrobial resistance although lower shows possibilitiesfor the horizontal and/or vertical transmission of resistance genes.

Key words: Listeria, frecuency, cheeses, Córdoba.

INTRODUCCIÓN

El género Listeria está formado por seisespecies diferentes: L. monocytogenes,

L. innocua, L. welshimeri, L. ivanovii, L.

seeligeri y L. grayi. Sólo dos especies, L.

monocytogenes y L. ivanovi i sonpatógenas y aunque presentan diferenciasen la patogenicidad el ciclo de vida comoparásito intracelular es muy parecido. L.

monocytogenes causa enfermedad severaen humanos y en animales, mientras queL. ivanovii se ha visto más asociada ainfecciones en animales (1).

En humanos L. monocytogenes produceuna enfermedad invasiva que puedeafectar el Sistema Nervioso Central (SNC)y conducir a la muerte, o dejar secuelasneurológicas; la forma no invasiva de laenfermedad ocas iona s índromegrastrointestinal. Aunque la listeriosispuede mani fes tarse en personasaparentemente saludables, existengrupos especialmente sensibles como los

neonatos, las mujeres embarazadas, losancianos y personas inmunosuprimidas engeneral (1). La tasa de mortalidad deesta enfermedad oscila entre 20 y 30%(2). Las formas clínicas de la enfermedadvarían de acuerdo al grupo infectado ylas manifestaciones más comunes sonmening i t i s , men ingoencefa l i t i s ,septicemia, aborto, infección prenatal ygastroenteritis. Se cree que el 99% delos casos de listeriosis son de origenalimentario, el resto obedece a infecciónde recién nacidos a través de la madreinfectada o por contagio en las salas deneonatos. En brotes esporádicos yepidemias una gran variedad de alimentoshan aparecido como vehículos; entreellos la leche, el queso, la mantequilla,el paté, la carne de res, la carne decerdo, las aves, los vegetales, losproductos del mar y particularmente losproductos listos para consumo rápido (3).

Varias especies animales pueden serinfectadas por L. monocytogenes, la

997Gallego - Frecuencia de Listeria spp., en quesos

mayoría de casos de enfermedad ocurreen rumiantes, con menor frecuencia encerdos y las aves por lo general actúancomo portadores sanos. En general lasinfecciones en animales son subclínicaspero la l isteriosis puede producirseesporádicamente o en forma epidémica, loque representa un gran impactoeconómico. Adicionalmente la listeriosis enanimales, evidencia el papel de estos comofuente de infección humana (zoonosis),debido al contacto directo del humano conlos animales infectados, durante el partode vacas u ovejas o al consumo posteriorde productos alimenticios contaminados deorigen animal (4).

L. ivanovii posee un tropismo diferencialespecí f ico hacia los rumiantes, enespecial especies menores, en las queprovoca abortos septicemia enteritis, adiferencia de la encefalitis que es laforma c l ín i ca t íp i ca de rumiantesinfectados por L. monocytogenes ,mientras que L. ivanovii tiene comoórgano blanco el útero grávido (5).

En la literatura se han encontrado pocoscasos de infecciones humanas por L.

ivanovii desde el primer aislamiento deeste microorganismo en Bulgaria en 1955(6). Han existido casos de listeriosis enpacientes con SIDA en los que se hadetectado L. ivanovii (7), también se hadetectado el microorganismo en placentapost-parto (8) entre otros (1).

Sin embargo, la importancia relativa dela transmisión zoonótica de la enfermedadaún no es clara y pareciera ser másrelevante para la salud pública y lacontaminación de los alimentos. Laubicuidad de Listeria spp., le permite laent rada a los ambientes deprocesamiento y en la cadenaalimentaria. A estos factores se suma,la capacidad de la bacteria para crecera temperaturas de refrigeración lo cualincrementa el riesgo de contaminaciónde los alimentos.

En la elaboración de lácteos factorescomo las práct icas de ordeño, lascondiciones de la infraestructura, lahigiene en las salas y equipos de lagranja, pueden contribuir a la presenciade Listeria spp., en la leche y susderivados; no obstante a que se puedenap l i car t ra tamientos como lapasteurización de la leche para destruirlas cepas circulantes de Listeria spp.,es posible que la contaminación ocurrapost-proceso . Var ios métodos dedetecc ión de L is ter ia spp. , handemostrado que la contaminación delproducto final proviene a menudo delambiente, incluyendo suelo, paja omateria fecal (9).

La contaminación humana con cepaspatógenas de Lister ia spp., puedeocurrir a través del consumo de lechecruda, derivados o por la ingestión dealimentos procesados contaminadospost-proceso (1).

En Co lombia desde 1992 se hanreportado algunos casos de infección porL. monocytogenes y un índ ice demorta l idad de l 26% aunque en laactualidad se habla de subregistros. Elfactor más alarmante de la listeriosis noes la inc idenc ia , s ino la tasa dehospitalización (90%) que supera a lamayoría de los patógenos implicados enenfermedades trasmitidas por alimentos(ETA), y sobre todo la tasa de mortalidaden humanos (20 - 30%); la situación paralos animales es muy similar, pese a quehan establecido tratamientos apropiadoscon antimicrobianos en ambos casos (1).

Los quesos son cons iderados losproductos contaminados con mayorfrecuencia, se incluye además el ensiladodestinado a consumo animal (4). EnCo lombia , e l queso, deb ido a sucomposición, nutrientes, valores deactividad de agua, pH, está reconocidocomo un alimento de alto riesgo en saludpública y al igual que en otros países

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del mundo se ha visto asociados a casosde abortos en mujeres embarazadas ymeningitis infantil (1). En este sentido,los análisis microbiológicos de este tipode alimento han reportado prevalenciaspara L. monocytogenes de 78.3%, 15%y 29.6% y el 33,1% en Antioquia (1).Sin embargo, hasta el momento no sehan publicado datos sobre prevalenciade Listeria spp., en quesos de otrasregiones del país.

Desde el punto de vista agropecuario, lalisteriosis genera incrementos en loscostos de producción animal, debido ala enfermedad, a l aumento de lainfertilidad y a las tasas de aborto; sinembargo estos aspectos sonsecundarios, ya que el problema de fondoestá asoc iado con la segur idadalimentaria antes que con las pérdidaseconómicas generadas, lo que nosignifica que estas no sean de granimportancia. En todo caso, la ubicuidadde L is ter ia spp. , l a to leranc ia acondiciones extremas, la proporción altade portadores humanos asintomáticos(6%), las cepas pers i s tentes enambientes de elaboración de alimentoshacen más difícil la posibilidad real deeliminar Listeria spp., de la cadenaalimentaria (10).

En el departamento de Córdoba, zonaganadera por excelencia en Colombia, seest ima que el 70% del total de laproducción lechera se destina a laelaboración de queso, para lo cual seemplean muchos sistemas artesanalescomo industriales (9). La fabricación noestandarizada de quesos constituye unrenglón importante en la economía demuchos pobladores de la zona; siendoun producto de consumo masivo.

El presente estudio estuvo encaminadoa determinar la ocurrencia de Listeria

spp., en quesos f rescos costeñosexpendidos en las plazas de mercado delos municipios de Montería y Cereté.

MATERIALES Y MÉTODOS

Tipo y lugar de estudio. El presenteestudio fue de tipo descriptivo y serea l i zó en los laborator ios de lInstituto de Investigaciones Biológicasdel Trópico, Universidad de Córdoba,Monter ía y en e l Laborator io deMicrob io log ía de A l imentos ,Departamento de Microbiología, Facultadde Ciencias, Ponti f ic ia UniversidadJaveriana, Bogotá D.C.

Muestras empleadas. Un total de 217muestras de queso tipo costeño deproducción artesanal fueron recolectadasaplicando muestreo no probabilísticoentre Junio y Agosto de 2005 en lasplazas de mercado de los Municipios deMontería y Cereté en el Departamentode Córdoba, Colombia. Las muestrasfueron anal izadas para detectar lapresencia de Listeria spp., se tomaronquesos con pesos entre 100 y 200g enlas condiciones normales de venta alpublico y se transportaron refrigeradasal laboratorio, donde fueron procesadasdentro de las 12h siguientes. Se utilizóla técnica recomendada por la FDA (11)para productos lác teos con dosenriquecimientos sucesivos.

Métodos microbiológicos. De cadamuestra de queso se tomaron 25gincluyendo las superficies y parte central.Las muestras se mezclaron por agitaciónmanual durante 2min con 225ml de caldode enriquecimiento listeria (Oxoid Limited,Basingstone, Hampshire, England) y seincubaron a 30ºC durante 4h. Luego seadicionó el agente selectivo SRO (OxoidL imi ted, Bas ingstone, Hampsh i re ,England) (50mg/l cicloheximida, 15mg/lclorhidrato de acriflavina, 40mg/l ácidonalidíxico) y se continuo la incubaciónpor 48h; las muestras sin crecimientoevidente fueron incubadas l68h. A las24h del cultivo anterior, se tomaron 5mly fueron inoculados en 50ml de caldo deenriquecimiento listeria y se incubaron


nuevamente a 30ºC por 24h (primer sub-enriquecimiento). Al término de estetiempo se transfirieron 100µl de cultivoa 10ml de un nuevo ca ldo deenriquecimiento y se incubaron a lasmismas condiciones por 48h.

Aislamiento en agares selectivos.Después de 48h de l pr imerenriquecimiento, se tomaron colonias delcultivo y se subcultivaron en cajas deagar Palcam (Oxoid Limited, Basingstone,Hampshire, England) suplementado conaditivo selectivo 150E (Oxoid Limited,Basingstone, Hampshire, England) (10mg/l polimixina B, 20mg/l ceftazidima) y agarOxford (Oxoid Limited, Basingstone,Hampshire, England) suplementado conadit ivo select ivo SR0 140E (OxoidL imi ted, Bas ingstone, Hampsh i re ,England) (400mg/l cicloheximida, 20mg/lsulfato de colistina, 5mg/l acriflavina,2mg/l cefotetan, 10mg/l fosfomicina) yse incubaron a 36ºC ± 2 por 48h. De loscultivos correspondientes al primer sub-enriquecimiento se subcultivaron encajas con agar Palcam, y del segundosub-enriquecimiento en agar Oxford a36ºC ± 2 por 48h.

Examen presuntivo para Listeria spp.De los cultivos en agares selectivos seseleccionaron colonias con morfologíamacroscópica, típica del género (Tabla1), se sembraron por agotamiento enagar TSYE (Oxoid Limited, Basingstone,Hampshire, England) y se incubaron a36ºC ± 2 por 24h; las colonias seobservaron por el método de iluminaciónde Henry (12). Las colonias presuntivaspara Listeria spp., se examinaron porGram, actividad catalasa, hemólisis ymicro-hemólisis en agar sangre decordero al 5% (v/v) (13), pruebasbioquímicas (TSI/H2S, citrato, urea, rojode metilo, Voges-Proskauer, movilidad a25ºC y producc ión de indo l ) . Losaislamientos presuntivos de Listeria spp.,fueron conf i rmados por PCR. Paraevidenciar la actividad hemolítica, se

inocularon por picadura placas de agarsangre de ovino al 5% (v/v) con losaislamientos puros sembrados en TSYE,se incubaron a 37ºC durante 24 horas,los resultados se registraron de acuerdoa la escala propuesta por Domínguez etal ++++ hemólisis fuerte, +++ y ++hemólisis moderada, + hemólisis débil, ±hemólis cuestionable, - negativa (13).

Cuanti f icación de la act iv idadhemolítica. Los aislamientos fueroncultivados en caldo BHI durante 18h a37ºC, 100µl de cultivo se depositaron ene l pr imer pozo de una p laca demicrohemólisis, en los pozos consecutivosse adicionó 50µl de solución salina(0.85% (p/v) NaCl), a partir del primerpozo se prepararon d i luc iones enproporc iones 1:2. A cada d i luc iónbacteriana se adicionó 100µl de unasuspensión al 3% (v/v) de eritrocitoshumanos previamente lavados con unasolución compuesta por 0.85% (p/v) deNaCl. 0.01% (p/v) de gelatina y 0.43%(p/v) de NaN 3. La microp laca fueincubada a 37ºC durante 4h; comocontrol negativo se empleó L. innocua.Las microplacas se leyeron visualmentey el título de la actividad hemolítica seexpresó en unidades completas dehemólisis (UCH) calculadas como elinverso de la dilución más alta a la cualtuvo lugar el 100% de la hemólisis y lasunidades mínimas de hemólisis (UMH)fueron calculadas como el recíproco dela dilución más alta a la cual se detectóla hemólisis (13).

Extracción de ADN cromosomal. Parala ext racc ión de ADN, las cepaspresuntivas de Listeria spp., fueroncultivadas en caldo BHI durante 12h a37°C y 250 r.p.m. Un mililitro de cultivofue centrifugado por 10 min a 2000g;una vez obtenidas las células, se lavaroncon tampón TE 1X (10mM Tris-HCl, 1mMEDTA, pH 8.0 ± 0.2). Para la lisis celular,el “pellet” resultante fue resuspendidoen 200µl de tampón TE 1X más 2mg/ml


Tabla 1. Aislamiento de cepas presuntivas de Listeria spp., en quesos frescos costeñosen los municipios de Montería y Cereté.

UCH: unidades completas de hemólisis, UMH: unidades mínimas de hemólisis; S: estreptomicina,P: penicilina, E: eritromicina, *: Resistencia antimicrobiana calculada según los puntos de cortepara cepas de origen clínico.


de lisozima y se incubó durante 30’ a37°C. Posteriormente para lograr ladegradac ión de las prote ínas seañadieron 300µl de tampón TE1X más 1%(p/v) de SDS y prote inasa K aconcentración final de 100µg/ml, lamezcla se incubó a 65°C por 1h. Paraeliminar los péptidos y lípidos residualesse adicionaron 84µl de una solución 5Mde NaCl más 60µl de CTAB (10% (p/v)disuelto en 0.7M de NaCl) y se incubónuevamente durante 20min a 65°C. Lasuspensión resultante se trató con unamezcla 24:1 de fenol-cloroformo. Una vezseparadas las fases por centrifugación,la fase acuosa se trató con isopropanol(2-propanol) para lograr la precipitacióndel ADN. El ADN precipitado se lavó conetanol al 70% (v/v), fue secado a 37°Cy resuspendido en tampón TE 1X. Parala determinac ión de la pureza yconcentración de los ADNs obtenidos seempleó un espectrofotómetro Biospec1601 Shimadzu. Las mediciones serealizaron a 260 y 280nm con correcciónde fondo a 320nm (14).

Confirmación del género Listeria y laespecie monocytogenes por PCR. Parala reacción de PCR se emplearon losiniciadores L1 (CTCCATAAAGGTGACCCT),U1 (CAGCMGCCGCGGTAATWC), LF(CAAACGTTAACAACGCAGTA) y LR(TCCAGAGTGATCGATGTTAA). El volumenfinal de la reacción fue 35ml, conteniendotampón de PCR 1X, 2.5mM de MgCl2,0.2mM de cada dNTP, 20pmol de cadainiciador y 2U de TaqADNpol (Promega),más 5ml de ADN o muestra (~120ng deADN). Se empleó un termociclador GeneCyclerTM (BioRad), programado de lasiguiente manera: 1min a 950C, seguidosde 40 ciclos compuestos por 30s a 940C,20s a 510C, 30s a 740C y un paso finalde extensión de 8min a 740C. Comocontrol en la PCR se empleó el ADNpurificado de las cepas L5 (L. innocua)y L8 (L. monocytogenes) (14).

Electroforesis de ADN. Los ADNs

obtenidos en las extracciones y losproductos de PCR fueron visualizados engeles de agarosa al 1% (p/v) en tampónTAE 1X (40mM Tris-acetato, 1mM EDTApH 8 ± 0.2), teñidos con 0.3µg/ml debromuro de etidio, separado a 120V durante1h y fotografiados bajo luz ultravioleta.Como marcador de talla molecular seempleó el 100bp Ladder (Promega) (14).Los aislamientos que por PCR resultarondiferentes a L. monocytognes, fueronsometidos a identificación bioquímica porel sistema API-Listeria, (BioMerieux) y/ofermentación de azúcares (ramnosa,xilosa y manitol).

Susceptibilidad antimicrobiana. Lascepas de mayor ocurrencia fueronempleadas para analizar la susceptibilidadantimicrobiana por ser un importantepatógeno del ganado vacuno. Las cepasdesde su ais lamiento estuvieronconservadas en glicerol al 10% (p/v) ycongeladas a -70ºC. Las cepas fueronrevitalizadas en agar TSYE (Oxoid Limited,Basingstone, Hampshire, England), loscultivos se incubaron a 30ºC durante las24h previas al ensayo. Para determinar lasusceptibilidad a antibióticos se aplicó latécnica de Kirby- Bauer (15). De tres acinco colonias aisladas en TSYE seinocularon en 5ml de Caldo infusióncerebro corazón, BHI (Sharlau), seincubó a 37ºC por 24 horas, se diluyó1:10 en agua de peptona al 0.1% (p/v)hasta obtener una suspens iónequivalente al estándar 0.5 Mac Farland.Se sembró en agar Muller-Hinton y enagar sangre desfibrinada de cordero al5% (v/v), luego se distribuyeron losdiscos antibiót icos (Oxoid Limited,Basingstone, Hampshire, England)conteniendo 10µg de ampilicina (A10),30µg de cloranfenicol (C30), 15µg deeritromicina (E15), 10µg de gentamicina(CN10), 10 unidades de penicilina G (P10),10µg de streptomicina (S10), 30µg devancomicina (VA30). Después de incubarsepor 24h a 37ºC, se midió el diámetro enmm de la zona de inhibición alrededor de


cada disco y se interpretó de acuerdocon la metodología propuesta por Vela,et al (16).

RESULTADOS

De las 217 muestras tomadas, 49 (22.58%)correspondieron al municipio de Monteríay 168 (77.42%) al municipio de Cereté. Elanálisis convencional para la identificaciónde Listeria spp., en estas muestras arrojóuna frecuencia del 22.58% (49/217) parael género. En los quesos provenientesde Montería la proporción de Listeria

spp., fue 16.33% (8/49) y en los quesosde Cereté fue 24.40% (41/168). Las 49cepas identificadas como Listeria spp.,por morfología y pruebas bioquímicaspresuntivas fueron analizadas por PCR,con lo cual 89.80% (44/49) de las cepasfueron confirmadas como miembros delgénero y ninguna produjo la amplificacióncaracterística de L. monocytogenes

(Figura 1).

Las 49 cepas fueron analizadas por API-

L i s ter ia y pruebas b ioqu ímicasconvenc iona les , para lograr lad iscr iminac ión en espec ies; losresultados arrojaron (0/49) cepas de L.

monocytogenes, (32/49) cepas de L.

ivanovii, (5/49) cepas de L. innocua, (4/49) de L. welshimeri, (3/49) cepas deL. welshimeri/seeligeri, y (5/49) cepascuya respuesta atípica a la fermentaciónde azúcares coincidió con la respuestaatípica en la PCR con la amplificación dela banda de 750pb (Tabla 1, Figura 2).

La frecuencia general mostró para L.

ivanovii 14.75% (32/217), L. innocua

con 2.30% (5/217) y L. welshimeri con1.84% (4/217) . E l res to de losaislamientos no fueron identificados comomiembros del género (79.72%), (173/217), o su identificación bioquímica fuedudosa (1.38%), (3/217). En este últimogrupo se identificación por microhemólisis(16UCH) L. seeligeri. La distribución delas diferentes especies se muestra en lafigura 2.

El 100% de las cepas de Listeria spp.,

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) en tampón TAE 1X. Reacciones dePCR para la identificación del género Listeria, especie monocytogenes: carril 1. CepaControl (L6) de Listeria monocytogenes ATCC 4640, carril 2. Blanco de la Reacción de PCR,carril 3. Marcador de Talla Molecular 100bp Ladder (Promega), carril 4. Cepa control (L5)de Listeria innocua (Suiza), carril 5. QC8, carril 6. QC19, carril 7. QC36, carril 8. QM7,carril 9. QM1, carril 10. QM6.


aisladas (49/49) hidrolizaron la esculina,el 38.78% de los aislamientos fueroncatalasa positiva, el 61.22% (30/49)fueron catalasa negativa. Respecto a lamovilidad a 25ºC, algunas cepas 14/49(28.57%), fueron móviles, sin embargono se observó en estas la formacióntípica de sombrilla (Figura 3a, b y c).

La actividad hemolítica de L. ivanovii secalificó entre débil (+) y dudosa (±). Enla determinación cuantitativa L. ivanovii

presentó microhemólisis con valores queoscilaron entre 8 y 16UCH y entre 16 y32UMH, 2 cepas evidenciaron 8UCH,mientras la mayoría de cepas presentó

16UCH, entre estas últimas, una cepamostró 16UMH, otras 18 presentaron32UCH y 13 no mostraron UMH (Tabla 1).

Al comparar los puntos de corte en elanálisis de la resistencia antimicrobianade las cepas de L. ivanovii, se encontróque la mayoría de las cepas 29/32(90.6%) fueron sensibles a todos losantibióticos ensayados y sólo 3/32(9.4%) presentaron res is tenc ia apenicilina 10U (QC27), eritromicina 15µg(QM6), y estreptomicina 10µg (QC12)(Figura 3d). No se encontró ningún casode multiresistencia (Tabla 1).

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Figura 2. Especies de Listeria aisladas en quesos costeños de los municipios deMontería y Cereté, departamento de Córdoba, Colombia.

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Figura 3. a: Caja de agar Oxfor, donde se aprecian colonias del aislamiento QM3 produciendo lahidrólisis de la esculina; b: Prueba de catalasa (b1: aislamiento QC6 catalasa positiva, b2:aislamiento QC12 catalasa positiva, b3: aislamiento QM3 catalasa negativa, b4: aislamientoQM2 catalasa positiva, b5: aislamiento QM5 catalasa positiva, b6: aislamiento QM5 sin adiciónde H2O2); c: Prueba de mobilidad en medio SIM mostrando la mobilidad en forma de sombrilla(c1: aislamiento QC17, c2: aislamiento QM4); d: Prueba de susceptibilidad antimicrobiana. Técnicade Kirby-Bauer en agar sangre de cordero al 5% muestra la resistencia del aislamiento QC12 aestreptomicina 10µg (S10) y la sensibilidad frente a penicilina (P10U), eritromicina (E15µg),ampicillina (A10µg), vancomicina (Va30µg), cloranfenicol (C30µg) y gentamicina (CN 10µg) y e:Proceso artesanal de la fabricación y venta del queso costeño.


DISCUSIÓN

La listeriosis es una enfermedad det ransmis ión a l imentar ia y se hademostrado que los alimentos listos paraconsumo han estado frecuentementeinvolucrados en la transmisión de laenfermedad. En este tipo de alimentoslas cond ic iones inadecuadas deprocesamiento, el manejo post procesoy el almacenamiento pueden favorecerel desarrollo de Listeria spp (1).

En el departamento de Córdoba, se haestimado una producción diaria de1´060.510 l i t ros de leche yaproximadamente el 70% de este volumense destina a la elaboración de quesocosteño deb ido a que la a l taconcentración de sal del mismo favorecela conservación en climas cálidos (17).En estos procesos de fabr i cac iónartesanales por lo general no se emplealeche pasteurizada.

Durante el muestreo realizado en Monteríay Cereté se pudo constatar el modoartesanal de elaboración del queso costeñoy las condiciones antihigiénicas de en lossitios de expendio en las plazas demercado. Estas condiciones promueven lapresencia de patógenos como Listeria spp.,en el producto (Figura 3e).

Los resultados obtenidos en la PCRrevelaron 49 cepas pertenecientes algénero Listeria con la consecuenteamplificación de una banda de 938pbcorrespondiente a la amplificación del unfragmento del rDNA 16S; la ausencia dela especie monocytogenes se demostrócon la ausencia de banda de amplificacióna los 750pb. Esta banda pudo apreciarseen la cepa de L. moncytogenes empleadacomo control, debido a que los “primers”LF/LR amplifican un fragmento del genhlyA codificante de la listeriolisina O(LLO), comprendido entre los nucleótidos577 y 1326; región que no presentahomología con la ivanovilisina O (ILO) de

L. ivanovii (14). Seleccionadas las cepasde Listeria spp., las pruebas bioquímicasdemostraron la presencia de L. ivanovvi

(32/49) y otras especies no patogénicas(F igura 2) . La ausenc ia de L.

monocytogenes en este tipo de queso,coincide con algunos de los resultadosreportados por otros grupos de trabajo(18), en los cuales se han aisladoespecies diferentes a L. monocytogenes,corroborando que el crecimiento demicroorgan ismos patógenos enalimentos, depende en alguna medida dela formulación o composición, del procesoy de las condiciones ambientales (19);factores que ligados determinan loscambios en las características físicas yquímicas de la matriz, favoreciendo eldesarrollo de ciertos patógenos.

E l depar tamento de Córdoba, secaracteriza por ser una zona productorade animales de abasto donde la leche escons iderada un subproducto . Noobstante, se debe prestar atención a lascondiciones higiénicas del ordeño y laelaboración de queso. En esta región latemperatura ambiente promedio oscilaentre 30 y 35ºC; lo que puede afectarel desarrollo de L. monocytogenes porser un organismo psicrófilo, a diferenciade la alta frecuencia observada para estepatógeno en quesos comercializados enzonas de clima frío (20).

En relación a los quesos tipo costeño esimportante cons iderar la a l taconcentración de sal que bien sea confines de preservación o por preferenciassensoriales del consumidor, reduce lacantidad mínima de agua (aw) en elalimento, induciendo el daño bacteriano.En este sentido la selección de un métodoanal í t ico acorde a l t ipo de matr izalimentaria, el tamaño y el número demuestras, son factores determinantesque puede influir en el análisis de ladistribución de las cepas de Listeria spp.,(21). En este trabajo se apl icó lametodología descrita por la FDA (Food


and Drug Administration/AOAC BAM2003). Sin embargo, al observar el altonivel de contaminantes presentes en elalimento se decidió ensayar dos sub-enriquecimientos para aumentar lasensibilidad en la detección.

En la detección de Listeria spp., la fasede pre-enr iquecimiento tuvo comofinalidad evitar que factores relacionadoscon el procesamiento pudieran lesionarlas células viables en las muestras dequeso, la estrategia consistió en unperíodo de incubación de 4 horas, previoa la adición de los agentes inhibidores,para lograr la recuperación de las célulaslesionadas (22). En este trabajo se aplicóun pre-enriquecimientos y dos sub-enriquecimientos sucesivos para tratarde obtener el mayor número posible deL is ter ia spp.; es te dob le sub-enriquecimiento permitió la obtención de20/49 (40.8%) aislamientos a partir delcaldo de enriquecimiento, 33/49 (67.3%)a is lamientos en e l pr imer sub-enriquecimiento y 48/49 (98%) en elsegundo sub-enriquecimiento.

L. monocytogenes puede presentarseconjuntamente con microorganismsocompetidores y otras cepas de Listeria

spp., esta situación hace más difícil elaislamiento del patógeno por el métodoconvencional, además de ser unprocedimiento demorado. Durante elaislamiento, los medios Oxford y Palcamno permitieron distinguir por morfologíamacroscópica las distintas especies delisteria.Por lo cual se recurrió a una técnicamolecular de PCR-múltiple que identificael género Lister ia y la especiemonocytogenes a través de laamplificación de dos fragmentos de 950 y738pb respectivamente (14). Las especiesdiferentes de monocytogenes fueronidentificadas con pruebas fenotípicas ybioquímicas. Los resultados obtenidosmostraron la ausencia de L.

monocytogenes en congruencia total entrela PCR y la fermentación de azúcares.

En re lac ión a los inh ib idores demicroorganismos acompañantes se hanreportado concentraciones de acriflavinaque varían de 10 a 25mg/l y que L.

monocytogenes se mul t ip l i ca enconcentrac iones de hasta 40mg/l ,mientras se suprimen los cocos Gramposit ivos (23). Otros estudios hanindicado que L. monocytogenes esincapaz de crecer en concentracionesde 15mg/l de acriflavina a diferencia delos sucedido frente a concentracionesde ácido nalidíxico entre 20 y 40mg/l,donde hubo poco e fec to sobre e lcrecimiento de Listeria spp., destacandoque a 100mg/l la tasa de crecimiento seredujo para todas las especies (24).

Por otra parte, se sabe que la acriflavinaempleada en el agente selectivo SROpuede ligarse a proteínas del alimento,reduciendo hasta en 60% la concentracióninicial. El tipo de proteína, (disponibilidadde grupos carboxilo), el pH y la estructuradel alimento (fluido, cortado, triturado)determinan la cantidad de antibiótico quepuede ser ligado. Valores de pH inferioresa 5.8 ± 0.2, incrementan la cantidad deacrif lavina l igada, lo que reduce laactividad de la misma, restringiendo elcrecimiento de L. monocytogenes comoconsecuencia de que se ha favorecidoel crecimiento de microorganismoscompetidores (24).

En la detección de Listeria spp., tambiénse debe tener en cuenta el efecto delos agentes se lec t ivos , lasconcentrac iones ind icadas por e lfabricante pueden no ser las de usouniversal para todo tipo de alimento,posiblemente con diferentes niveles demicroorganismos acompañantes, como enlos quesos examinados, los cuales puedenpresentar contaminación natural concepas de Enterococcus spp. , yStreptococcus spp., que exhiben tiemposde duplicación menores y por tantocrecen a mayor velocidad.


Se est ima que en e l ca ldo deenriquecimiento la concentración deacriflavina utilizada pudo oscilar entre 9a 15mg/l, dependiendo de su unión o noa proteínas lácteas, el ácido nalidíxicoalcanzaría una concentración aproximadade 40mg/l, valores que se encuentrandentro de los niveles recomendados paralimitar el desarrollo de microorganismosacompañantes, sin embargo, en todoslos procesos de a is lamientos seencontraron microorganismos diferentesa Listeria spp. Los hongos filamentososfueron inhibidos eficazmente, no siendoasí con las levaduras. A diferencia de loque se ha encontrado de muestras decarne, donde los interferentes han sidolac tobac i los , enterococos ymicroorgan ismos Gram negat ivosinc luyendo Pseudomonas spp.,microorganismos que se desarrollanfác i lmente en esta matr i z por sunaturaleza.

Las diferentes tasas de crecimiento delas cepas de Listeria spp., la producciónde bacteriocinas y las interacciones conel alimento en la fase de enriquecimientoson factores que afectan la ecologíamicrobiana de las distintas especies deL is ter ia , p resentes en la matr i za l imentar ia lo que favorece larecuperac ión de unas espec ies endetrimento de otras. Yokohama et al(25), identificaron una sustancia conactividad similar a las bacteriocinasproducida por L. innocua capaz de inhibirel crecimiento de L. monocytogenes; sinembargo este resultado podría haberestado in f luenc iado por la a l tasensibilidad de L. monocytogenes a laacriflavina (24, 25). L. innocua es laespecie filogenéticamente más cercanaa L. monocytogenes, es de vida libre,con requerimientos atmosféricos menosexigentes que el patógeno intracelularcuya viabi l idad puede ser afectadadependiendo de la presión de oxígenoexistente en el medio (26).

L. innocua comparte el nicho ecológicocon L. monocytogenes y se ha admitidoque L. innocua tiene ventaja competitivafrente a L. monocytogenes por tener unavelocidad específica de crecimientosuperior. En la práctica el crecimientode una especie por encima de la otra semanifiesta como si en la muestra noex is t ie ran las espec ies de menorvelocidad de crecimiento (21), lo quegenera un problema en el diagnóstico delpatógeno y conduce a reportar falsosnegativos con consecuencias directaspara la salud pública.

La ausencia de L. monocytogenes en elqueso puede atribuirse también al posibleefecto inhibitorio de ácidos grasospropios de la leche, pues ensayos “invitro” para estudiar la viabilidad delpatógeno han demostrado que los ácidoslaúrico, linoléico y linolénico a pH 5 ±0.2 son fuertemente bacter ic idas,provocando la ruptura de la membranacelular. La acción tóxica de los ácidosgrasos insaturados se asoc ia a laformac ión de rad ica les l ib res; encontraste, los ácidos grasos saturadospueden provocar lisis bacteriana porcambios en la fluidez de la membranalipídica (27).

En relación a los comportamientosdiferenciales de algunas cepas en lasprueba de catalasa y la movilidad, Rowanha mencionado la existencia de formasrugosas de Listeria spp., estables ensubcultivos; estas formas presentanalgunos cambios morfológicos y fisiológicos,son negativas en la prueba de Henry, nopresentan la movilidad típica (volteretas)y carecen de la enzima N-aceti l-â-glucosamidasa (E.C.3.2.1.52) (28).

La hemólis is es una característ icadiferencial importante entre las especiesde l ister ia y en los ais lamientosambientales, de alimentos o de portadoresasintomáticos, resulta difícil apreciarla portener una act ividad hemol í t i ca


relativamente débil. En este trabajo seencontró que L. ivanovi fue débilmentehemolítica, para corroborar esta actividadse ensayó un método más sensible, conel cual se obtuvieron valores bajos demicrohemólisis. Este comportamientosugiere que las cepas aisladas expresaronla ivanovii-lisina O (ILO), cuya actividadse manifiesta en un halo de lisis estrechoque rodea la periferia de las colonias yque no son capaces de producir laesfingomielinasa; determinante implicadoen la hemólisis típica, amplia y bizonaldel patógeno (29).

Los resu l tados de microhemól i s i sproducidos por las cepas de L. ivanovvi

estuvieron en los rangos de 0 a 96 UCHy de 12 a 384 UMH, lo cual coincide conresu l tados observados con cepasv i ru lentas de L. monocytogenes,

revelando similitud en el comportamientode cepas de origen diferente frente a lamisma prueba (30).

La resistencia antimicrobiana de L.

ivanovii fue baja; igualmente Gellin yBroome (31) señalaron como rara laresistencia ant imicrobiana en estegénero. La resistencia a penici l inacoincidió con los reportes de Charpentiery Courva l in (32) que menc ionanaislamientos resistentes en humanos,alimentos y ambientes. También seconfirmó que desde el primer reporte deresistencia antimicrobiana en Listeria

spp., se han aislado cepas resistentes auno o más antibióticos, a partir delambiente, de alimentos y de casosclínicos de listeriosis.

La susceptibilidad de L. ivanovii a lamayoría de los antimicrobianos ensayadosresulta alentadora para la terapéuticaen rumiantes, sin embargo, debido al usoindiscriminado de antibióticos y por latransmisión horizontal y vertical de laresistencia antimicrobiana, es de granimportancia monitorear la resistencia deListeria spp.

La presencia de Listeria spp., en losquesos puede atribuirse a contaminacióndurante el procesamiento (33), lasbacterias serían transferidas desde lassuper f i c ies de t rabajo o s i t ios dealmacenamiento y a partir de la materiaprima o de los locales e instalaciones delas lecherías incluso los operarios puedenser portadores del microorganismo en laindumentar ia , manos y t rac togastrointestinal.

Generalmente se acepta que los quesosno estén libres de Listeria spp., debidoa los métodos de elaboración, en granparte artesanales y a la posibilidad deque en e l post proceso ocurracontaminación cruzada, a esto se añadeun sistema inadecuado de limpieza ydesinfección en los sitios de producción(34), s in descartar las def ic ientescondiciones higiénicas de los sitios deexpendio y el manejo inadecuado delalimento en el hogar.

Desde la perspect iva de h ig ienealimentaria la presencia de Listeria spp.,en los quesos tipo costeño indica que: ie l proceso de producc ión de estealimento propicia la entrada de cepaspatogénicas del género listeria, ii queestas cepas podrían ser residentespotenciales de los locales de elaboracióndel alimento; lo que debe alertar acercadel control y la revisión del proceso deproducción y las condiciones higiénicasen los sitios de expendio y iii la presenciade L. innocua es un indicador de procesosdeficientes de desinfección y pese a noser patógena no significa que no puedaestar involucrada en la transmisión degenes de resistencia a antibióticos.

En conclusión, los resultados de esteestud io conf i rman que los quesoscosteños producidos en las dos zonaseva luadas, es tán f recuentementecontaminados por L ister ia spp. L.

monocytogenes no se logró detectarpero se encontró L. ivanovii; patógeno


REFERENCIAS

de rumiantes que ha sido involucrado enalgunos casos de infecciones en humanos.La presencia de L. innocua, dado su gradode similitud genética con L. monocytogenes

es utilizado en muchas industrias de alimentocomo indicador del grado o calidad desanitización, lo que muestra que lascondiciones de producción y expendio noson las más adecuadas y que el consumode queso costeño no es seguro.

Agradecimientos

A la Escuela Superior Politécnica deChimborazo (Ecuador) por el apoyo a J.Gallegos. Al grupo de investigadores delInstituto de Investigaciones Biológicas delTrópico de la Universidad de Córdoba, porel apoyo logístico al presente estudio. Ala Dra. Ivonne Gutiérrez por la revisióncrítica de este manuscrito.

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FRECUENCIA DE Listeria spp., EN QUESOS