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principais funções das proteínas
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30/05/2012
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Funções não-catalíticas das Proteínas
Armazenamento e transporte de O2
Interações imunológicas
Algumas considerações...• Ligante: molécula/íon que se liga reversivelmente
a uma proteína;– A reversibilidade é importante para que o organismo
possa responder à mudanças ambientais e metabólicas;
– Um segundo ligante pode interferir na ligação doprimeiro ligante, devido à mudança na estruturatridimensional;
Ex: reguladores enzimáticos (ativação/inibição)
• As proteínas não são estáticas....• Flexibilidade: mudanças sutis (respirações) na
conformação das proteínas;– Devido à vibrações moleculares e pequenos movimentos
de resíduos de aminoácidos (rotação em torno dasligações simples com o Cα);
– O desempenho da função das proteínas comumentedepende da flexibilidade;
• Ajuste induzido: flexibilização de uma proteína paraajustar o sítio de ligação ao ligante, proporcionandomaior estabilidade na ligação;
• Em proteínas multiméricas: a mudança deconformação em uma subunidade afeta a conformaçãodas outras subunidades;
Transporte e armazenamento de oxigênio: importância do grupo prostético heme
• O oxigênio não possui alta solubilidade em soluçõesaquosas (ex: plasma sanguíneo);– A difusão do oxigênio entre os tecidos não ultrapassa distâncias maiores que
alguns milímitros;
• Metais de transição, especialmente o ferro, possui fortetendência de se ligar ao oxigênio;
• O ferro não pode ficar livre, pois, promove a formação deespécies de oxigênio altamente reativas;– O ferro é incorporado em um grupo prostético no interior de proteínas,
chamado de grupo “heme”;
• Mioglobina: armazena oxigênio nos músculos;• Hemoglobina: transporta oxigênio e gás carbônico
através da corrente sanguínea;
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- O átomo de ferro possui 6 ligações coordenadas, 4 a átomos de N do grupo planar,e 2 no grupo perpendicular (1 ao N da cadeia lateral de um aminoácido Histidina / 1ligação aberta, onde pode ligar-se ao O2);- Os átomos de N coordenados, possuem caráter doador de elétrons, ajudando aimpedir a oxidação do estado ferroso (Fe2+) em estado férrico (Fe3+), o estadoférrico não liga ao oxigênio;
Grupo prostético Heme
* L. coordenadas: tipo de ligação covalente em que opar de elétrons compartilhado entre dois átomosprovém de apenas um dos átomos.
- Protoporfirina: estrutura orgânicacomplexa, em anel;- A esta estrutura liga-se um único átomode ferro, em estado ferroso (Fe2+);- Cada átomo de N contém uma par deelétrons livres no centro do anel =>formação de ligações coordenadas com oFerro;
• O monóxido de carbono (CO) é uma molécula pequenaque coordena o ferro do grupo heme com maiorafinidade que o O2;– CO liga-se a moléculas do heme 20.000 vezes melhor que o
O2, ou seja, sua Kd (constante de dissociação) é 20.000 vezesmenor que para oxigênio;
– Se o CO liga-se ao grupo heme, exclui o sítio de ligação do O2 asfixia.
• Mas... quando o heme está inserido em uma globina,esse número diminui drasticamente;
• O que ocasiona esta redução?– O fato de o grupo heme estar dentro de uma proteína...
• As globinas adquirem uma conformação tal, que favorece a ligação com o O2 e desfavorece com o CO;
MIOGLOBINA
HisF8: histidina da hélice F que se liga o grupo heme (histidina proximal);
HisE7: histidina da hélice E que fica a uma pequena distância do grupo heme (histidina distal);
Quando o O2 se liga ao ferro há uma pequena mudança no ângulo entre a estrutura planar e a histidina proximal (flexão : respiração)
• O O2 realiza uma ligação angularcom o ferro. Ocorre uma pequena“flexão” do grupo heme,possibilitando uma aproximaçãodo O2 à histidina distal. Resultado:formação de uma ligação de Hcom a His distal (estabiliza);
• O CO tem uma ligação linear como ferro, sendo forçado a uma leveinclinação na formação da pontede H, o que enfraquece sualigação com o grupo heme;
• Ou seja, a conformação daproteína atua seletivamente,favorecendo a ligação com o O2e desfavorecendo com o CO;
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Hemácias e Hemoglobina
• Os eritrócitos (hemácias) perdem algumasorganelas internas em seu processo dematuração; O espaço antes ocupado por taisorganelas passa a ser preenchido pormoléculas de hemoglobina;
• Aproximadamente 34% do peso de umahemácia é composto por hemoglobina;
• Tempo de vida de uma hemácia: 120 dias;
Conformação estrutural da hemoglobina• Ocorrem duas principais conformações:
– Estado R (relaxado): maior afinidade ao O2 (oxi-hemoglobina);– Estado T (tenso): menor afinidade ao O2 (desoxi-hemoglobina);
No estado T a Hb é estabilizada por um grande nº de pares de iônicos nas interfaces αβ; Quando o O2 se liga ao estado T, a conformação da hemoglobina muda para o estado R;
Alguns pares iônicos são desfeitos e outros são formados promovendo umdeslizamento entre os pares αβ e, uma rotação, estreitando o bolsão (espaço) entre assubunidades β;
Na mioglobinaNa Hb estado R
Na hemoglobina (estado T)
Na conformação T da hemoglobina o Ferronão se encontra suficientemente próximo àHisF8 para forma a ligação coordenadacom este aminoácido. Isso só ocorre após aligação com o O2 (conformação R) =>porfirina adquire conformação mais planaraproximando o Fe da HisF8;
A hemoglobina precisa ter afinidade o suficiente para se ligar ao O2 nos alvéolos pulmonares, mas
essa afinidade não pode ser tão grande a ponto de impedir a liberação do O2 nos tecidos...
• Isso em parte é resolvido pela pressão de O2, que nos alvéolos ébem maior que nos tecidos;
• Outra parte, deve-se à transição entre estado T e R, à medidaem que as moléculas de O2 vão sendo ligadas;
• A ligação do O2 à subunidades individuais da hemoglobina écapaz de alterar a afinidade de subunidades adjacentes;– Tal propriedade é chamada de “Alosteria” (a ligação de um ligante a um sítio
afeta as propriedades de ligação em outro sítio na mesma proteína); A primeiramolécula de O2 que interage com a desoxi-Hb (estado T), leva a alterações deconformação (estado R) que são comunicadas às outras subunidades, tornandomais fácil a ligação de O2 aos 3 demais grupos heme da hemoglobina;
• Por último, a influência do pH...
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• A hemoglobina também transporta H e CO2, provenientes darespiração celular (mitocôndrias nas células dos tecidos);
• Ainda nos tecidos, parte do CO2 é hidratado formandobicarbonato e difunde para o sangue, pois, a forma gasosa épouco solúvel em solução aquosa e bolhas poderiam serformadas (embolia);
• Esta reação reversível catalisada pela enzima anidrasecarbônica, resulta também na liberação de H => diminui o pHdos tecidos;
Influência dos produtos da respiração celular Trocas O2 / CO2 nos tecidos e pulmões• O CO2 ainda presente nos tecidos na forma gasosa, liga-se a sítios de ligação na
Hb diferentes do sítio de ligação do O2 (a reação de ligação do CO2 libera H,diminui do pH no sangue);
• Nas hemácias também há a presença da enzima anidrase carbônica, queconverte CO2 à bicarbonato e H (diminui pH sanguíneo);– Tal diminuição de pH nos tecidos e no sangue, promove alterações na estrutura
tridimensional da Hb, enfraquecendo a ligação com o O2 => liberação de O2 nos tecidos;
• O bicarbonato difunde para o plasma e posteriormente para os rins (isso ocorrecom cerca de 75% do C liberado pelos tecidos);
• Cerca de 25% do C permanece na forma de CO2 ligado à Hb e é transportadoaté os pulmões para liberação na expiração (por diferença de pressão - difusãosimples);
• Os H livres na Hb, ligam-se a qualquer um dos aminoácidos da proteína (Hbprotonada). Os H que estavam livres, não estão mais => eleva o pH do sangue;
• Com a elevação do pH a Hb volta a ter afinidade ao O2 => o O2 que entrou nosalvéolos (inspiração) difunde para as Hb das hemácias e é transportado para ostecidos;
e o ciclo continua...
A combinação entre os efeitos do pH e da
concentração de CO2 sobre a ligação/liberação do O2, chama-se efeito de Bohr.
2,3 bifosfoglicerato (BPG)
• Composto presente nas hemácias, formado apartir de um intermediário do metabolismo decarboidratos;
• Importante na regulação da oxigenação dostecidos em casos de mudança de altitude edesenvolvimento fetal;
• BPG reduz a afinidade da Hb pelo O2, através desua ligação a um sítio de ligação diferente do sítiode ligação do O2 ;
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Com BPG – maior estabilidade no estado T Menor afinidade ao O2
Sem BPG – maior facilidade em adquirir o estado RMaior afinidade ao O2
O sítio de ligação para BPG fica na
cavidade entre as subunidades β,
distante dos grupos heme;
- A cavidade é revestida por aminoácidos com cargaspositivas, os quais interagem com as cargas negativasdo BPG;- A ligação de BPG estabiliza o estado T, por isso,diminui a afinidade com o O2;- Na ausência de BPG, a Hb é convertida ao estado R;
Oxigenação em relação à altitude• Ao nível do mar: 40% do oxigênio carregado pelo
sangue é repassado para os tecidos;
• Em grandes altitudes: a diminuição da pressão do O2faz com que esta porcentagem diminua para 30%;– Após algumas horas, ocorre aumento de BPG => diminui
afinidade da Hb pelo O2 => a porcentagem de liberaçãode O2 é re-estabelecida;
• A situação é invertida quando há retorno à baixaaltitude;
• Pessoas com problemas relacionados à deficiência respiratóriaou circulatória, normalmente produzem uma quantidade maiorde BPG;
Hemoglobina αϒ (fetal)
• A Hbαϒ (HbF) possui umaafinidade muito menor aoBPG, logo... possui maiorafinidade ao O2 emcomparação com a Hbαβ(HbA);
• Ao chegar na placenta, umambiente pobre em O2, aHb materna libera o gásque rapidamente é ligadoà Hb fetal;
Sistema Imunológico• Todos os vertebrados possuem um sistema
imunológico capaz de distinguir o “próprio” do “não-próprio” e, destruir o que é identificado como “não-próprio”;
• A resposta imunológica é constituída por um conjunto de interações, complexas e coordenadas, entre diversas classes de proteínas e outras moléculas, além de tipos celulares;
• Na resposta imunológica, um sistema bioquímico altamente sensível e específico é construído com base na interação entre ligantes e proteínas;
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SistemaS ImunológicoS
• Sistema humoral (humor = fluido): dirigido contra infecções extracelulares;
• Sistema celular: dirigido para infecções que ocorrem no interior de células (contra protozoários, helmintos e tecidos transplantados também);
– Anticorpos ou Imunoglobulinas : proteínas com função imunológica;
– Leucócitos: células com função imunológica;
Leucócitos• São originados na medula-óssea;• De maneira geral: percorrem a corrente sanguínea, reconhecem
possíveis invasores, produzem anticorpos que se ligam aos agentes estranhos (sinalizam a infecção => destruição);
Em geral, há pouca quantidade de leucócitos, eles proliferam rapidamente
quando há infecção.
Tc : libera perforina (forma poros na MP da célula-alvo, descontrole de entrada e saída de substâncias); Também induz apoptose (morte celular programada);
Imunoglobulinas (Ig)
• Constituem até 30% do total de proteínas do plasma;
• Produzidas pelos linfócitos B;
• Ligam-se aos invasores e os marcam para serem destruídos;
• Os seres humanos são capazes de produzir mais de 108 anticorpos com diferentes especificidades de ligação;
Antígenos
• Toda molécula ou patógeno capaz de induzir uma resposta imunológica é denominado de antígeno;– Cápsula viral, parede celular bacteriana, toxina, uma
molécula qualquer...
• O sítio de ligação onde o antígeno é ligado aoanticorpo ou a um receptor de um leucócito, échamado de determinante antigênico ou epítopo.– Um antígeno complexo pode ter diferentes
determinantes antigênicos, ou seja, pode interagir com diferentes anticorpos;
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PRINCIPAIS ANTÍGENOS
PRINCIPAIS RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS
BACTÉRIASEXTRACELULARES
- Fagocitose (macrófagos);- Anticorpos (linfócitos B)
- Ativação do sistema complemento;- Neutralização de toxinas liberadas pelas
bactérias;
BACTÉRIAS INTRACELULARES(capacidade de sobreviver dentro dosmacrófagos)
- Sistema MHC II (células T e macrófagos);
VÍRUS(parasitas intracelulares – qualquer célula)
- Sistema MHC I e II (células T e B, macrófagos);
MHC – Complexo de Histocompatibilidade• As propriedades de ligação aos receptores das células T são
extremamente complexas;
• Tais receptores não reconhecem antígenos livres, apenas os queestão ligados à proteínas específicas da superfície celular(MHC);
• MHC: são proteínas transmembrana que se ligam à fragmentosde peptídeos de proteínas (ex: peptídeos provenientes dadigestão de vírus ou de componentes da própria célula) e osexpõe na superfície celular;
• Tais fragmentos ligados às proteínas MHC constituem osantígenos que os linfócitos T reconhecem como “não-próprio’;
• Há duas classes de proteínas MHC...
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MHC classe I• Acredita-se que são encontradas em todas as células dos
vertebrados;• Ligam-se à fragmentos de peptídeos resultantes da digestão de
proteínas que ocorrem ao acaso dentro das células (inclusive quesão provenientes da própria célula);
• Cada linfócito Tc possui receptores específicos para o complexoMHC I-peptídeo (assim qualquer complexo MHC I seria atacado,inclusive de células normais);
• Durante o processo de maturação (no timo), os linfócitos T sãoselecionados, havendo eliminação daqueles que reconheceriam ospeptídeos próprios ligados à MHC I e manutenção daqueles quereconhecem peptídeos estranhos associados às proteínas MHC I;
• Isso leva à destruição especialmente de células infectadas porvírus, além de constituir em um fator de rejeição em casos detransplante de órgãos;
As células T que foram selecionadas para maturação no timo,reconhecem apenas as proteínas MHC com peptídeos “não-próprios”.
Interações moleculares na superfície celular
• Quando a presença de um antígeno é detectada, aspoucas células T e B precisam proliferar rapidamente eseletivamente;
• Exemplo: infecção viral– Uma vez que estejam dentro das células, as moléculas virais
são inacessíveis ao sistema imunológico humoral;– Proteínas MHC I (qualquer célula) podem expor peptídeos
provenientes das proteínas virais na superfície celular =>reconhecimento pelas células Tc;
– Proteínas MHC II presentes em macrófagos que ingerirampartículas virais, também podem expô-los =>reconhecimento por células TH e estímulo da proliferação dascélulas de defesa (e todo o processo conseqüente);
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CD8: co-receptor (intensifica as interações de ligação entre receptores de células Tc e MHC);
CD4: mesma função em TH;
Células TH secretam interleucinas, que são reconhecidas pelas células Tc e B, as quais respondem apresentando proliferação celular; *Estas interleucinas são específicas, induzem a proliferação apenas de células T e B que possuem receptores para elas => seleção clonal;
Células Tc destroem as células-alvo (porfirinas e apoptose);
Células B secretam anticorpos solúveis que se ligam aos antígenos no meio humoral (proteínas complemento, as quais danificam cápsulas virais e paredes bacterianas);
MHC classe II
• Ocorre na superfície de células especializadas em captarantígenos estranhos, os macrófagos e os linfócitos B;
• Esta classe não se liga à peptídeos derivados da digestãointracelular, mas à peptídeos derivados de proteínasexternas ingeridas pelas células;
• São então reconhecidas pelos linfócitos T (Tc e TH);– TH: estimula a produção de citocininas, as quais
estimulam a proliferação das células Tc;– Tc: atuam na destruição dos macrófagos infectados;
Memória Imunológica• Uma vez esgotado o antígeno (agente infeccioso),
a maioria das células imunológicas ativas morrem por apoptose;
• Algumas células B e T amadurecem e se tornam residentes permanentes no sangue;– Como elas já passaram pela seleção clonal (possuem os
receptores específicos para as interleucinas ativadas pelos antígenos), caso estes antígenos voltem a ocorrer no organismo, o desencadeamento da resposta imunológica será mais rápido.
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Classes de Imunoglobulinas• Cada classe possui particularidades em relação à estrutura
tridimensional da proteína, bem como, em relação à função;• IgM: primeiro anticorpo liberado pelas células B (importante
nos estágios iniciais de resposta imunológica primária);• IgG: é a mais abundante no plasma sangüíneo
– Principal anticorpo de resposta imunológica secundária (a partir de células B de memória);
– Ativa proteínas complemento e macrófagos;• IgA: encontradas em secreções (lágrimas, leite, saliva, etc);• IgD: presentes nos linfócitos B;• IgE: relacionada com respostas anti-alérgicas;
– Ativa liberação de histaminas (dilatação e aumento da permeabilidade dos vasos sanguíneos, facilitando a chegada das células e proteínas imunológicas no local da inflamação).
Especificidade antígeno-anticorpo• A especificidade é determinada
pelos aminoácidos presentes no domínio variável da cadeia da imunoglobulina;
• Complementariedade:– Forma, grupos com cargas,
apolaridade...– Manutenção do complexo
antígeno-anticorpo por várias interações fracas;
• Mudanças na conformação facilitam, por ex, a ligação de co-receptores => ajuste induzido;
Representação da cadeia de IgG
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Testes sorológicos• Devido à grande especificidade, os anticorpos são ótimos
reagentes analíticos;
• Para a realização de alguns testes sorológicos éimportante haverem preparações de anticorpos;
• Preparações Monoclonais de anticorpos:
– Através de culturas de células (linfócitos B) é possívelobter inúmeros anticorpos idênticos;
• A seguir: alguns princípios empregados em testessorológicos (e não todos os detalhes dos procedimentos) ...
Coluna cromatográfica de afinidade
• Um anticorpo selecionado é acoplado covalentemente a uma resina;
• A amostra é adicionada à coluna;
• Se houver o antígeno procurado, ele se ligará ao anticorpo presente na coluna;
• A coluna é lavada com uma solução: o antígeno fica retido na coluna e as demais proteínas são eluídas;
• Esta técnica é bastante usada para purificação de proteínas em geral;
Teste ELISA (enzyme-linkedimmunosorbent assay)
Immunoblot
• As proteínas são isoladas em gel através de eletroforese;
• São transferidas para uma membrana de nitrocelulose;
• A membrana passa por um processo de submissão aos anticorpos (semelhante ao teste ELISA);
• Revela-se coloração na proteína de interesse;
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