FUNCTIONAL GENOMICS

FORMÅL

Forstå hvorledes celler fungerer på et molekylært niveau og responderer på fysiologiske ændringer

GENOMET: Nukleotidsekvensen af alt cellulært DNA/RNA

TRANSKRIPTOMET: Et billede af hvilke mRNA der findes i cellen og deres mængde. Kemisk analyse/ikke funktionel

PROTEOMET: Et billede af hvilke proteiner der findes i cellen, deres mængde og kemiske sammensætning (posttranslationelle modifikationer). Kemisk analyse/ikke funktionel

METABOLOMET: En beskrivelse af koncentrationerne af de enkelte metabolitter i cellen. Funktionel analyse/aktivitetsanalyse

DET CENTRALE DOGME

DNA RNA PROTEIN

mRNA mængden kan være reguleret (promotor aktivitet /nedbrydning

mRNA kan være aktivt/inaktivt m.h.t. translation

protein kan være aktivt/inaktivt afhængig af andre proteiners aktivitet (f.x. fosforylering/defosforylering)

protein kan indgå i store multiproteinkomplekser, hvor den samlede aktivitet er afhængig af enkelte nøgle komponenter

aktiviteten af enkelte proteiner der virker i en ”pathway” kan være ligegyldig hvis et kontroltrin ikke fungerer.

GENOMET

Genomsekventering

Fremstilling af genombiblioteker i typisk BAC vektorer

Automatisk sekventering, samling af contigs

Bioinformatisk analyse

Estimerimg af åbne læserammer, intron/exon grænser, promotorer, Kozak sekvenser.

GENOMSEKVENTERING

I dag > 800 sekventerede genomer (mange er små virus)

TRANSKRIPTOMET

2 indgansvinkler:

1) ”kendskab” til sekvensen af alle mRNA molekyler fra (in silicio metoder, bioinformatik)

2) Ingen kendskab til sekvensen af alle mRNA molekyler (sekvens uafhængig)

De traditionelle metoder: Northern blot, RNase protection, differential display, subtractiv kloning

DNA microarray chips (1995)

SAGE analyse (serial analysis of geneexpression) (1995)

DNA microarray

Oligonukletid microarray

Spotted microarray

Oligonukleotid microarray

Indeholder i hundrede tusindvis af sorterede, enkeltstrengede, syntetiske oligonukleotider som er >25 nukleotider lange. Oligoerne syntetiseres enten direkte på glaspladen eller spottes på efter syntesen

Hvert forudsagt gen er representeret med adskillige oligoer (<15), som kan hybridisere til et enkelt mRNA molekyle. For at måle ”speificiteten” i hybridiseringen er der både et perfekt ”match” oligonukleotid og et ”mis-match” oligonukleotid, der indeholder et mis-match midt i de enkelte oligonukleotider

FREMSTILLING AF OLIGOER DIREKTE PÅ GLASPLADEN

> 500.000 probe punkter per 1,28 cm2

Hybridisering med cDNA mærket med to forskellige flouroforer

Hvis mRNA’et kun findes i den ene type væv blive farven rød/grøn. Hvis i begge væv bliver farven gul.

OVERSIGT OVER ARBEJDSGANGEN I AFFYMETRIX CHIP FORSØG

Serial analysis of gene expression (SAGE)

Kræver intet ”fancy” apparatur, kun adgang til sekventeringsfaciliteter

kræver ikke kendskab til ”alle” mRNA molekylers sekvens. Vil således også identificere nye transkripter der ikke er forudsagt ved bioinformatisk analyse.

Serial analysis of gene expression (SAGE)

generering af cDNA

spaltning med ankor enzym (NlaIII)

ligere til to linkere

skære med tagging enzym (FokI som skærer 20 bp nedenstrøms for genkendelsessekvensen)

PCR, kloning og sekventering

Værktøjer til proteom analyse

Separation af proteiner:

2 dimensionel elektroforese, separation efter ladning i første dimension og størrelse i 2. dimension

kromatografisk separation (hydrofob interaktion og ionbytning)

2D elektroforese koblet til massespektrometri

Mærkning af en lille del af

proteinerne med fluorescerende stoffer tillader separation i den samme gel

Derved undgås gel til gel variation

2D-DIGE (two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis)

Identifikation af proteinkomplekser

Det protein der søges partnere til fremstilles in vivo med et ”tag” som letter oprensning

Proteinekstrakt loades på en søjle og alt protein der associerer med det taggede protein renses op.

Efter 2D elektrofores af proteinerne identificeres de ved massespektrometri.

Værktøjer til metabolom analyse

Kromatografiske teknikker koblet til massespektrometri og eller NMR

STØRRELSEN PÅ AFFYMETRIX CHIPS

Princippet i MALDI-TOF massespektrometri

matrix-assisted-laser-desorption-ionization time of flight