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UNIVERSIDAD AUT6NOMA DE NAYARITUNIDAD ACAD~MICADE ODONTOLOG(A
DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION
IDENTIFICACJON MOLECULAR DE Fusobacterium nucleatum EN
PACIENTES DEL POSGRADO DE ENDODONCIA DE LA UNIVERSIDAD
AUTONOMA DE YUCATAN, CON PERIODONTITIS APICAL CRONICA
TESIS
Que para obtener el grado de:
MAESTRO EN ODONTOLOGfA
Presenta:
GABRIEL ALVARADO cARDENAS
DirectoresdeTesis
. M.O. NARDA YADIRA AGUILAR OROZCO
M. EN C. SANDRA ELENA HERNANDEZ SOLis
Tepic, Nayarit, diciembre de 2010
~ ~ u_ni_ve_r_s~~-d~:-;~-,~~-;~-;:-;M-:~-3~:-;;-d:_::_;_.~_~;._:~~U DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADD ~, "' , •• ~." ••"E INVESTIGACION
Tepic, Nay'!ril, 6 dediciembrede 2010OficioNo.139/10
C.D. Gabriel Alvarado CardenasCandidatoa Maestro en OdontologiaPresente.
En virtud de haber recibido informacion de los revisores asignados por eslaComision acerca de que ellrabajo de lesis de Maeslria litulado: Identiflcacionmolecular de Fusobacterium nucleatum en pacientes del posgrado deendodoncia de la Universldad Aut6noma de Yucatan, con periodontitis apicalcr6nica, en la cual participan como Directores M.O. Narda Yadira AguilarOrozco y M.C. Sandra Elena Hernandez Soils, ha side revisada y se hanextendido en forma escrita las recomendaciones que ellos han consideradonecesarias, en nuestra caJidad de cuerpo colegiado, estamos otorgandoautorizaci6nparaqueseprocedaalaimpresiondedichotrabajo.
Una vez concluidos los tramites administralivos correspondientes. Ie serannotificados lugar, fecha y hora, donde se lIevara a cabo el examen de gradedefendiendosu tesis con replica oral
C.c.p.-InteresadoC.c.p.-Archivo
Agradezco ala Universidad Aut6noma de Nayarit por brindarrne la confianza yaceptanne
en su Programade Maestriapennitiendome crecerprofesionalmente.
A la Facultad de Odontologia de la U.A.D.Y. por todo su apoyo durante estos 2 ai'ios, asi
como aI Departamento de Microbiologia de la misma, por el tiempo y asesoria que me
brindarondurantelarealizaci6ndeesteproyecto.
A mis Directoras de tesis, M. en O. Narda Yadira Aguilar Orozco y M. en C. Sandra Elena
Hernandez Solisportodo el apoyo, respaldo ytiempo que dedicaron para elaborareste
trabajode investigaci6n.
A mi esposa Luz y mi hijo Gabriel que siempre fueron mi motivaci6n y fuente de apoyo
duranteestostiltimosai'ios.Graciasporlapacienciaylaconfianzaquemebrindaron.
A mi padre Gabriel y mi madre Addy, por todo el apoyo que me han brindado durante
toda la vida, siempre seran mis ejemplos a seguir.
RESUME
Las patologlas de origen pulpar constituyen uno de los padecimientosde mayor frecuencia
enlacavidadbucal,manifestandoseprincipalmentecomopulpitis,periodontitisoabscesos
periapicales. Una de las bacterias mas frecuentementeasociada a infecciones endod6nticas,
esFwobacteriumnuc/eatum.
ElobjetivodeesteestudiofuedeterminarlaprevalenciadeFwobacteriumnuc/eatumen
pacientesconperiodontitisapicalcr6nicaqueacudieronalPosgradodeEndodonciadela
Facultad de Odontologla de la Universidad Aut6noma de Yucatan.
El estudio fue descriptivo, observacional y transversal. Se tomaron muestras de 92
conductosradicularesydeestasen83fueposibJeextraerelDNA,alasqueselesrealiz61a
tecnica de Reacci6n en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la identificaci6n de F.
CAPITuLO
I. INTRODUCCI6N
II. MATERIAL Y METODOS
III. RESULTADOS
IV. DISCUSI6N
V. CONCLUSIONES
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
pAGINA
I. INTRODUCCI6
Lasbacteriaspresentesenel interior de losconductos radiculares son laprincipal causade
patologlasperlapicales como laperiodontitis apical cr6nica. La periodontitis apica1cr6nica,
es una infecci6n endod6ntica primaria, lacua1 estAcompuestaporunamicrofloramixta
dominadaporbacteriasanaerobiasgram-negativas.Porotrolado.lasbacteriasendod6ntica
podrianestarimplicadasencomplicacionesextra-orales.comolasinusitismaxilarcr6nica,
la celulitis orbitaria, endocarditis infecciosa, la artritis reumatoide y abscesos cerebrales
{Saitoetal.2006).F. nucleatum es una de las bacterias mas frecuentementeasociadaa
infeccionesendod6nticas{Fouadetal.2oo2)yhasidoposiblerecuperarlaeneltorrente
sanguineo despues de 10 minutos del tratamiento endod6ntico (Moromi. 2004). Por otro
lado. tambien se ha visto que su asociaci6n con otras especies bacterianas como P.
gingivalis y P. intermedia en cultivos mixtos puede aumentar la patogenicidad de dichos
microorganismos (Baumgartner et ai, 2002) y que su combinaci6n con Streptococcus spp.
se asocia significativamente con la presencia de sintomas preoperatorios (Fouad et al.
2002).
Existen diversos estudios encaminados a identificar los microorganismos presentes en la
microflora endod6ntica, sin embargo. sus resultados varian considerablemente. esta
variaci6npuededeberse.almenosenparte.aladisminuci6ndelafiabilidadysensibilidad
de las tecnicasde cultivomicrobiol6gicasempleadas.
La tecmca de la Reacci6n en Cadena de la Polimerasa (PCR) es un metoda de diagn6stico
molecular que permite detectartanto amicroorganismo cultivables como los nocultivables.
posee alta especificidad ysensibilidad yperrnitelaidentificaci6nnipiday precisa de una
gran variedadde especiesmicrobianas.
La literatura demuestra que es muy distinta la microflora bacteriana que se encuentra en los
diferentestiposdeinfeccionesendod6nticas,porloqueesdegranimportancialadetecci6n
eidentificaci6ndelosmicroorganismosasociadosaestasinfecciones.
En Mexico no existe a1gUn tipo de estudio mediante el uso de PCR que evidencie la
prevalencia de Fusobacterium nuclearum en dientesconperiodontitisapicalcr6nica.
Conbase en 10 anterior, surgela siguiente pregunta de investigaci6n:
i,cwu sera la prevalencia de Fusobacterium nucleatum en los conductos radiculares deUr/f:l\IMn~,:!lIJl1UL1A.1ll1II
dientesconperiodontitisapicalcr6nica?
Mlcroblologiadelaslnfecclonesendod6ntlcas
La endodoncia se define como la rama de la odontologia que se ocuiWijylR.E~Q1ft~
diagn6stico, prevenci6n y tratarniento de las enfermedades pulpares con 0 sin
complicaciones periapicales (Mondrag6n, 1995).
Entre los principalesobjetivos del tratarniento endod6ntico,estlllaelirninaci6n de todos los
microorganismos que existen en el sistema de conductos radicular y de esta forma eliminar
lainfecci6noprevenirlareinfecci6ndelosespaciospulparesydelostejidosperiapicales
(Cohen y Bums, 2002).
Diferentes estudios. mencionan a las bacterias como el principal enernigo de los
tratamientos endod6nticos, asi como la importancia de las diferentes medidas terapeuticas
para la erradicaci6n de las mismas (Cohen y Burns, 2002).
Los microorganismos que se encuentran en eltejido pulparnecr6tico se han establecido
como la principal causa de inflamaci6n periapical aguda y cr6nica. Sin embargo, pasaron
casi 200ailos antes de que los microorganismos del conductoradicularestuvieranbajo
investigaci6n biol6gica. Un estudio realizado por Miller, dernoslr6 invasi6n bacteriana
tanto en tlibulos dentinarios como en tejido pulpar necr6tico (Cohen yBurns, 2(02).
Lateoriadelainfecci6nfocal,quedatadelosailos 1920-1928,mencionaquelosdientes
infectados podrian causar infecciones en olras partes del cuerpo, asi como tambien
enfermedades sistemicas. Esto trajo consigo extracciones masivas en todo diente
sospechosodeportarinfecci6n, yretras6elorigendellratamientoendod6ntico, peroigual
trajo consigo los principios de tratamientos biol6gicamente sanos, incluyendo la
eliminaci6n de la infecci6n (Cohen y Bums, 2002).
Durante la necrosis pulpar, lasbacterias,susproductosylosmediadoresinflamatoriosse
acumulan en e1 sistema de conductos radiculares y se pueden diseminar mas aliA del
foramen apical yprovocarlesionesen lostejidosperiodontales. Debidoaqueestaslesiones
son denaturaleza inflamatoria, ysiempreestAnlocalizadasenel periApice,las infecciones
deestetiposeconocencomoperiodontitisapical(Molanderelal,1998).
La periodontitis apical posee una funci6n protectora importante y busca prevenir la
diseminaci6ndelasbacleriasysuselementosaOlrosespaciosdelcuerpo,yaquelimitala
infecci6nalespaciodelconductoradicularyprevienequesedisemine. Porlolanto,apesar
dequealaperiodontitisperiapicalseleconsideraunalesi6n,tambiendebeserconsiderada
como una irnportanle zona inflamatoria, amortiguadora y protectora. No obstante, en
ocasiones el proceso puede asociarse con sinlomas clinicos severos y, aunque es raro,
tambien puede ser una condici6n que ponga en riesgo la vida. Casi siempre, la periodontitis
apical permanecesinsintomasyporlotantonoesmuynotorioparaelpaciente, porloque
soloserareveladaporWlexamenradiograficoderutina(Molanderetal,1998).
LaperiodontitisapicalevolucionaprincipalmentecomoWlarespuestaalataquebacleriano
quesurgedeunapulpanecr6ticainfectada.Lasbacteriasinfectanlapulpadespuesdeuna
lesi6n, porlo general caries, trauma denIal 0 lesi6n iatrogernca (Silva etal,2006).
Unavezqueseestablecelainfecci6ndelconducto radicular sin tratar,perrnanececomo un
proceso cr6nico y expone al organismo de forma continua a los elementos bacterianos
(Silvaetal,2006).
En la periodontitis apical cronica el pacienle se encuentra asinlomatico, con lesion
periapicalradiograficamentevisible, confrecuenciael pacientenoreporta historiadedolor
en el diente y las pruebasde vitalidad yde preparacionde lacavidad, confirmanel eslado
necrotico de la pulpa. Ocasionalmenle, puede haber agudizacion de la lesion cronica,
causando inflamacion y dolor del area, comunmente llamado "absceso fenix" 0
exacerbacion aguda de unaperiodontilis apical cr6nica (Hashioka etal. 1992).
Un estudio report6 la presencia de un alto porcentaje de bacterias anaerobias estrictas,
demostrando la necesidad de emplear medios de cultivo adecuados y tecnicas para la
identificacion de microorganismos anaerobios para el avance del conocimiento de la
microbiologiadelsistemadeconductosradiculares(Fabriciusetal.1982).
En general, las especies mas frecuentemente encontradas en una infecci6n primaria
pertenecen al genero Bacteroides. Fusobacterium. Prevotella. Porphyromonas. Treponema.
PeptoestreptococClIS. Eubacterium. Actinomices y Streptococcus (Fabricius et al. 1982).
Existendiferentestiposdeinfeccionesendod6nticasdelsistemadeconductosradiculares.
lascualesusualmenteestAnasociadasacondicionesclinicasdistintas.Sedescribencuatro
tipos:primaria,secundaria,persistenteyextrarradicular(Siqueiraera/.2004).
Lainfecci6nprimariaes aquella causada poria colonizaci6n de microorganismos en el
tejido pulpar necr6tico. Lamicrobiotainvolucradafrecuentementedependedel tiempo de
infccci6n,aunquetarnbiensehasugeridoquepuedediferirseg6neltipodelesi6n
perirradicular asociada Mientras que un amplio rango de microorganismos se asocian a
lesiones perirradiculares cr6nicas, un grupo mas restringido de especies se asocian a
lesiones perirradiculares sintomaticas como la periodontitis apical aguda y el absceso
perirradicularagudo(Hashiokaera/.1992).
Las infecciones secundarias son causadas por microorganismos ausentes duranle la
infecci6nprimariayquehanpenetradoalsistemadeconductosradiculares,yaseaduranle
el tratarniento endod6nlico, entre citas 0 despues de haberculminado. En eslos casos. si
estosrnicroorganismoslogran sobrevivirycolonizarel sistema de conduclos, seeslablecera
lainfecci6nsecundaria(Hashiokaera/.1992).
Otro tipo de infecci6n endod6ntica es la infecci6n intrarradicular persislente. Esla es
causadapormicroorganismosinvolucradosenlainfecci6nprimariaosecundaria(Siqueria
era/,2004).
En cuanto a las infycciones endod6nticasextrarradiculares, estas pueden serprimarias,
secundarias0 persistentes. Laforrnamascomuneselabscesoperirradicularagudoyla
fuentedeinfecci6nesusualmentelainfecci6nintrarradicular.(Silvaera/.2006).
Porotrolado, sehaobservado quealgunasespeciesmicrobianassoncapacesderesistirlos
cambios de ambiente efectuados durante la terapia endod6ntica, y cuando esto sucede se
presentaelfracasodeltratamientodeconductos(Lanaeta/,2001).
Despues de Miller en 1890,sedesarrollaronmultiplesinvestigacionessobrelamicrobiota
de los conductos radiculares las cuales reportaron la presencia de numerosas especies
bacterianas. Dependiendo del medio de cultivo y las tecnicas utilizadas para la
identificaci6n bacteriana, los tipos y el nUmero de organismos aislados variaban
significativamente(Kakehashieta/.1965).
Enlasprimerasinvestigacionessereport6unapequeiiaincidenciadebacteriasanaerobias
en infecciones primarias, mientras que en estudios posteriores se inform6 de una
prevalenciadel 90% de estas bacterias en conductosradiculares infectados(Kakehashiet
a/.1965).
Las pulpas necr6ticas presentan una flora polimicrobiana caracterizada por una amplia
variedad de combinaciones debacterias, un promediode4 a 7 especiesporconducto,
predominantemente anaerobias y aproximadamenle igual proporci6n de bacterias gram-
positivasygram-negativas(Kakehashietal,1965).
Se ha demostrado una correlaci6n entre el tamalio de la lesion periapical y el nUmero de
especiesbacterianaspresentesenelsistemadeconductosradiculares.Dientescongrandes
lesiones usualmente ,alojan mayor nUmero de especies bacterianas y mayor densidad de
bacteriasenelconductoradicularqueaquellosdientesconlesionespequeilas (Kakehashi et
a/,1965).
Existenvariosfactorescapacesdeinfluenciarlacolonizaci6nmicrobianaenelinteriordel
sistema de conductos radiculares. La disponibilidad de nutrientes, la baja tensi6n de
oxlgeno molecular en pulpas necr6ticas y las interacciones microbianas pueden ser
determinantesen la ecologia del sistema de conductos radiculares (Lanaetal,2001 ).
En un estudio con ratas, se demostr6 la funci6n esencial de los microorganismos en la
patogenesis de las lesiones periapicales. Cuando las pulpas dentales de ratas gnobi6ticas
eranexpuestasalacavidadoral,laspulpaspermanecianvitaiesyningunapatologia
periapical era detectada radiognlficamente. Sin embargo, cuando los animales eran
expuestos a la flora bacteriana normal de otros animales, la pulpa se necrosaba y se
desarrollaban lesiones periapicales (Kakehashi etal, 1965).
Sundqvistdemostr6,que la periodontitis apical solo era detectable en piezas dentales que
contenian bacterias en el conducto radicular, mientras que las piezas con conductos
necr6ticosperoesterilesnopresentabanradiognlficamentesignosdepatosisperiapicalyasi
mismo encontr6 que la bacteria mas rrecuentemente aislada en conductos
Fusobacteriumnucieatum(Sundqvistetal,1989).
Lana et al. analizaron las especies involucradas en las infecciones endod6nticas. Sus
resultados mostraron el aislamiento de 308 microorganismos en 27 (87.1%) conductos
radicularesestudiados,lograndoidentificaren278(90.3%)elgeneroyespecie. Porotro
lado, tambien se observ6 que el 81.5% de los conductos mostraron infecciones
polimicrobianas,elnlimerodeespeciesaisladasencadaconductoinfectadofuedel all
especies,conunpromediode5especiesporconducto. En 88.9% de losconductos fueron
aisladosmicroorganismosanaerobiosestrictos,en51.8%anaerobiosfacultativos, en 18.5%
microaerofilicosyen7.4%delosconductosseaislaronhongos.Losautoreshacenenfasis
en la calidad polimicrobiana de 1a flora endod6ntica predominantemente mixta, con
predominiodebacilos anaerobiosgrarn-negativos (Lana el al. 2001).
EI desarrollo de tecnieas microbiol6gicas ha hecho posible el cultivo, aislamiento e
identificaci6n bacteriana. En las lesiones periapieales generalmente se presentan
infeccionespolimicrobianas,dominadasporbaeteriasanaer6biasobligadas. EI nUmerode
especiesdiferentesporeada easo es relativarnentepequeno, normalmente entredos yoeho
y praeticamente nunea mayor de veinte especies en un solo condueto (Rolph el al. 2001).
Los microorganismos presentes en conduetos infectados eomprenden un nUmero
restringido de especies eomparadas con el total delamieroflorabueal. La mayoria de las
especiesencontradasenconduetosradieularestarnbienhansidoaisladasdebolsas
periodontales, sin embargo, la microbiota endod6ntica no es tan compleja como la
periodontal(Rolphelal,2001).
Paraqueunmieroorganismopuedaestablecerseenel sistema de conductos radieulares y
consecuentementepartieiparenlaetiopatogeniadelaslesionesperirradieularesrequierede
I. El microorganismo debe presentarse en un nUmero suficiente para iniciar y
mantenerlalesi6nperirradicular.
2. EI microorgarnsmo debe poseerunamatriz de factoresdevirulencia, lacualdebe
expresarsedurantelainfecci6ndelconductoradicular.
3. EI microorganismo debe estar localizado espacialmente en el sistema de conductos
radicularesde tal maneraque sus factores de virulenciapuedan ganaracceso a los
tejidosperirradiculares.
4. EI ambiente del sistema de conductos radiculares debe permitir la supervivencia y
crecimientodeimicroorganismoyproveersei\aJesqueestimuienlaexpresi6nde
5. Los microorganismos inhibidoresdeben estarpresentes en bajo nfunero 0 ausentes
en el microambiente del sistema de conductos radiculares.
6. EI hospedero debe desarrollar una estrategia de defensa a nivel de los tejidos
perirradiculares, con la finaJidad de inhibir la diseminaci6n de la infecci6n. Este
proceso dani como resultado undaiio tisutar (Siqueira etal. 2004).
F. nucleatum, es un bacilo anaerobio estricto, Gram negativo, inm6vil, no formador de
esporas, perteneciente aJphylum Fusobacteria, que habitualmente sepresentaenlacavidad
bucaJ y ha sido frecuentemente aislado en conduclos radiculares infectados asi como
tambienenabscesosendod6nticos(Sundqvistetal.1989).
Se reportan siete tipos de Fusobacteria, sin embargo los mas comimmente aislados en
infecciones humanas son el Fusobacterium nucleatum y el Fusobacterium necrophorum
(Rogerioetal.2008).
F. nucleatum ha sido reportada como la especie encontrada con mayor frecuencia en
conductos necr6ticos y ha sido asociado a casos con sintomatologfa dolorosa y
agudizacionesendod6nticas(Fouadetal,2002).
Sehan lIevado a cabo diversosestudiosquereportan laprevaJenciade F. nue/eatum en
infecciones endod6nticas. Kantz y Henry en 1974, lIevaron a cabo una evaluaci6n
bacteriana de piezas no vitales, presumiblemente infectadas y cuya camara pulpar se
encontraba fuera de contacto con lacavidad oral. De 104 especiesanaerobias aisladas, 41
(39%) pertenecieron a Fusobacterium spp.
Sundqvist,enl976,IIev6acaboestudiosbacteriologicosenpiezasconpuipasnecroticas.
De 18 piezas investigadas, Fusobacterium nue/eatum estuvo presente en 7 (33%). Fabricius
eta/enl982,evaluaronlacomplejidaddelatlorabacterianaenabscesosagudos de origen
endodontico, mediante la identificaci6n y enumeracion de las especies predominantes. Del
total debacterias aisladas, los bacilos anaerobios grarnnegativos fueron el mayor grupo
aislado (37%). De estos, el Fusobacterium nue/eatum fue la segunda especie mas
prevaJenteconun 14%,encontrandoseen6delos 10 casos estudiados. Heimdahl,enl985,
reporto una de prevaJencia del 34% de F.nue/eatum y que su presencia pudiera estar
asociadaconlaseveridaddeinfeccionesendodonticasagudas. HaapasaJo,en 1986,realiz6
unestudio para examinarlacomposici6n de la microtlora anaerobia de cavidadespulpares
infectadas.DeuntotaldeI9casos,fueronhalladosanaerobiosestrictosen 14 (74%) yF.
nue/eatum fueencontradoen3 (16%).
Sundqvisten1994,lIevoacabounarecopilaciondelosresultadosdevariosestudios
realizados y menciona a F. nue/eatum como la bacteria mas prevalente de la micro flora de
los conductosradicuJares infectados. Lo seilala con una prevalencia del 48%.Siqueiraen
1995,report6uncasoclinicoquepresent6sintomatologiapersistente,inclusiveluegodela
instrumentaci6nymedicacionintraconducto.Elanlllisismicrobiol6gicoreve161apresencia
de F. nue/eatum como el principal agente etio16gico. En otro estudio, encontraron una
prevalencia del 26% (Siqueira y Rocas, 2004) Y Fouad en conductos radiculares
infectados con pulpa necrosada enconlr6 una prevalencia del 82% (Fouad etaf. 2002).
Porolrolado,sehavistoqueestaespecieescapazdeagruparseconOlrasbacteriasoralesy
endod6nticas yquetambienesresponsableen las etapas iniciales y finales de la formaci6n
del biofilm (Rogerio etaf. 2008).
La asociaci6n sinCTgetica del F. nucfeatum con Prevoteffa intermedia. Porphyromonas
gingiva/is y Peptostreptococcus micros puede incret:nentar su potencial patogenico
(Rogerioetaf.2oo8).
De igual forma se ha reportado que infecciones sistemicas de Fusobacterium nucfeatum en
abscesoshepaticosyartritisseptica,fuCTondeorigendental(Rogerioetaf.2oo8).
Aunque las tecnicas de cultivo para el aislamiento e identificaci6n de microorganismos
anaCTobioshamejoradosignificativamenteenlas Ultimas3 decadas, los hallazgos de los
laboratoriossondifCTentesenlreunpaisyolro(BawngartnCTetaf.2004).
Aunque estas difCTencias pueden SCT atribuidas a las difCTentes variaciones en 1a
metodologiadeidentificaci6n,sesospechadelainfluenciageograficadelacomposici6nde
la microbiota del conducto radicular, ya que F. nucfeatum ha sido enconlrado con una
prevalenciadel73%enEstadosunidosmienlrasqueenBrasildichaprevalencia es del 4%,
(Bawngartneretaf.2004).
Estoshallazgossugieren que la composici6n de lamicrobiota endod6nticaesresultadode
lainfluenciageografica(Bawngartneretaf.2004).
Unamultituddefactorespuedeinfluiren lacolonizaci6nexitosadelacavidadoral por
determinadotipodeespeciesmicrobianas, loscuales incluyenmecanismosdedefensadel
huesped,predisposici6ngeneticayfactoresambientalestalescomotipodesuminislrode
aguadelacomunidad,porcentajedepersonasdentrodelapoblaci6ninfectadasconla
misma especie, estres fisiol6gico, tabaquismo, frecuencia de visitas al dentista y
enfermedadesinfecciosas.Enadici6nlascondicionesclimatol6gicasyhllbitosalimenticios
son otras variables que pueden influir en la composici6n de la microbiota (Baumgartner el
a/,2004).
La microflora de las pulpas necr6ticas ha sido estudiada por mas de 100 aiios,
principalmente pormicroscopia directa y cultivos, de tal manera que se ticne un amplio
conocimientoacercadelacomposici6n,ecologiaypotencial patol6gicodelamicroflora
(Cohen y Bums, 2002).
Laidentificaci6ndelamicrobiotadelosconductosradicularesesimportanteparaconocer
eltipodebacteriaogrupodebacteriasquejueganunpapeldecisivoenelprogresodela
enfermedad, si son resistentes a la terapia convencional 0 bien, estar implicadas en el
fracaso endod6ntico (Petcrselal. 2002).
La introducci6n de las tecnicas de cultivo anaer6bico permiti6 conocer que las bacterias
anaerobiasestrictaseranlasquedominabanenlosconductosradicularesinfectadosyque
estaspodrianabarcarhastae190%deltotaldelaflora(Siqueiraela/.2004).
Actualmenteel usodetecnicasgenl!ticasparaladetecci6ndeestosmicroorganismosha
mostradoqueseencuenlraneneI60%dedientesnecr6ticos(Petersela/.2002).
Enlapr8cticaclinica,loscultivosdelosconductosradicularespuedenutil~para
detenninar el estado rnicrobiol6gico y para evaluar la eficacia del tratamiento antes de
obturarelconductoradicular. Sin embargo, existendiversosproblernasmetodol6gicos por
superarenelmuestreodel cultivodebidoalalocalizaci6ndelosmicroorganismosya Ia
complejidad de larnicroflora (Lana et ai, 2001).
Durante mucho tiempo, los metodos de muestreo, transporte, cultivo e identificaci6n eran
inadecuadosparalosmicroorganismosanaerobiosfacultativosyestrictos.Portanto,eran
comunesloscultivosfalsosnegativos(Lanaetal.2001).
Entrelaslirnitacionesdelcultivomicrobiol6gico,seencuentranlassiguientes:
• lmposibilidad decultivartodo tipo de bacterias, especialmente anaerobios, en un solo
mediodecultivo.Sibienlapresenciadeanaerobiosestrictosenconductosinfectados
hasidoconfirrnada, su presencia no es significativadesdeel puntodevista clinicopues
sondestruidosalserexpuestosalaireunavezquesehapenetradoenelconductoy
probablernentetambien son destruidos con lasoluci6ndehipocloritodesodiodurante
lainstrumentaci6neirrigaci6ndelconductoradicular.
• Consume mucho tiernpo. Adernas del cultivo primario se necesitan realizar olto tipo de
pruebas microbiol6gicas enzimAticas para completar la identificaci6n de los
microorganismos.Estaspruebasincluyen,elernpleodemediosdecultivosenriquecidos
ypruebasdefermentaci6ndeazueares.
Como medios de cultivos primarios para el aislamiento se recomiendan: Agar base
Shaeldler, Agar Base Wilkins Chanlgren, Agar Base Columbia entre oltos.
Noobstante,debidoaladificultaddecultivaryrecuperartodoslosmicroorganismos en
los medios de cultivo y al tiempo prolongado de las pruebas (3 semanas) para obtener
resultados,variosautoresrecomiendanel uso de tecnicas moleculares como la Reacci6n
en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Monbelli et al, 1991).
La teeniea de PCR facilita la identificaci6n de especies bacterianas dificiles de aislar
mediantetecnicasdecultivoconvencionalesyalavez,permiteevidenciaraquellascepas
bacterianas que muestran diferencias fenotipicas que se traducen en comportamientos
clinicos diversos. Otras ventajas de la PCR sobre las tecnicas de cultivQ, radican en su
rapidez, altaespecificidad ye"actitud de los resultados (Perea, 2004).
Los primeros estudios sobre la microbiologia endod6ntica, sugerian que la microflora
bacterianasepresentabaconunpredominiodeespeciesaerobiasyanaerobiasfacultativas
sobreanaerobiasestrictas (Kakehashi etal. 1965).
Tambien se seiialaba un predominio debacterias sobrehongos, de cocos sobrebacilos y
espirilos, y predominio de gram positivos sobre gram negativos, reportlindose la presencia
de Streptococcus ssp., cocos gram negativos y lactobacilos junto a una variedad de
anaerobios (que varian en su resistencia al ox.igeno atrnosferico) en un n6mero que se
suponiaeramenordel50%deltotaidemicroorganismosaislados(Linetal.1992).
LosestudiosdeSundqvist,marcanpautaenlatipificaci6ndemicroorganismosanaerobios
estrictosyanaerobiqs facultativos involucrados en las lesiones pulpares yperiapicales, con
laintroducci6ndelastecnicasdeanaerobiosis(Sundqvisl,1992).
La genetica molecular, mas recientemente empleada para la identificaci6n de pat6genos
bucales,hapermitidolatipificaci6ndecadavezmasespeciesrelacionadasalainfecci6n
endod6ntica, asl como ha conllevado a variaciones en la taxonomia microbiol6gica,
provocando cambios serios en la definici6n de la microbiota predominante en el sistema de
conductosradiculares(SundqviSI,1992).
Recientemente, han sido reportados nuevos pat6genos en infecciones endod6nticas,
posterioresalaintroducci6n de los melodos degenetica molecular (Perea, 2004).
La informaci6nobtenidaporlas multiples investigaciones ltevadas a cabo en infecciones
primarias de conductos radiculares conileva a seiialar el caractermixtoycomplejo de la
microbiota del sistema de conductos radiculares. Con el continuo avance en las tecnicas
microbiol6gicas, cada vez mas sehaceinminentelaidentificaci6ndeespeciesinvolucradas
en las infeccionespulpares yperirradiculares,asi como surepercusi6n enel mejoramiento
de laterapeutica endod6ntica (Fouad etal. 2002).
A pesarde que laperiodontitis apical cr6nica es una de las patologias periapicales mas
frecuentes, en Mexico no se tienen datos que reporten la prevalencia de Fusobacterium
nucieatumenestetipodeinfecciones.Porloquelosresultadosdeesteestudiocontribuiran
a establecer la epidemiologia de Fusobacterium nucleatum en dientes con conduclos
radiculares con periodontitis apical cr6nica de pacientes de la ciudad de Merida, Yucatan.
La identificaci6n de este microorganismo se realizara mediante la tecnica de PCR, tecnica
quedebidoasurapidez,altaespecificidad yexactitudresultauna utiI herramientapara la
identificaci6n de especies bacterianas de muy dificil 0 imposible aislamiento mediante
tecnicasdecultivoconvencionales.
Estudios de estetipo son de importanciaclinica ya que proveen bases para lainvestigaci6n
de sustancias antimicrobianas efectivas, asi como tarnbien el desarrollo de estrategias
apropiadas para a1canzar y eliminar los componentes de la microbiota del sistema de
conductosradiculares.
Objetivo
Identificar Fusobacterium nucleatum en conductos radiculares con periodontitis apical
cr6nicadepacientesatendidosenPosgradodeEndodonciadelaUniversidadAul6nomade
Yucatan empleando la teenica de Reacci6n en cadena de la polimerasa.
II. MATERIAL Y METODOS
Descriptivo,observacionalytransversal.
Defmici6n del universo
Pacientes del Posgrado de Endodoncia de la Facultad de Odontologia de la Universidad
AutonomadeYucatancondiagnosticodeperiodontitisapicaicronica.
I. Dientesperrnanentescon fonnacionradicularcompleta.
2. Pacientesque dieronsuconsentimientopara pmiciparen elestudio.
3. Tododientequepudoseraisladoadecuadamente.
Criteriosde exclusl6n
I. Pacientes con tratamiento deantibi6ticos durante los U1timostres meses
2. Pacientes con discapacidad fisicao mental.
3. Dientescon fracturaradicular.
4. Dientesconbolsasperiodontales.
5. Dientesobliterados0 con calcificaciones.
Criteriosde eliminaci6n
I.Conductosconfracturadeinstrurnentosduranteelprocesodeexploraci6n.
2. Contaminaci6n del campo operatorio durante la toma de la muestra.
Noventa y dos pacientes que acudieron aI Posgrado de Endodoncia de la Facultad de
Odontologfa de la UADY de mayo de 2009 a mano de 2010 y que presentaron piezas
dentalesalascualesselesdiagnostic6periodontitisapicalcr6nica.
Preceptosl\tlcosyrlesgos
EI paciente firm6 carta de consentimiento informado (Anexo 2). No existieron riesgos ni
paraelpacienteniparaelinvesligador.
Procedimleotoexperimental
Cultivomlcrobiaoodelacepadereferencia
Se utiliz61a cepa de referencia de F. nucleatum ATCC 25586,Ia cual fue cultivada en el
medio Agar Sangre Schaedler en condiciones de anaerobiosis a 37°C duranle48 horas
(Anexo 3, foto I). Posteriormenle se congelo para su conservacion en caldo Soya
Tripticaseinaconglicerinaal5%a-82°C.
Tomademuestradeconductosradlculares
I.Seadminislr6lalecnicadeaneslesianecesariayseaisl6eldientecondiquede hule.
2.Secoloc6malerialdeobturaci6nprovisionalprovisilparaevilarlafiltracionde saliva a
lraves del dique al area de lrabajo.
3.Paraelareadeltabajosedesinfect6eldique,lagrapaylacoronadeldiente con
per6xidodehidr6genoal30%ytinturadeyodoal5%,posterioraestoselimpi6con
hipocloritodesodioaI5.25%.
4. Se acceso ala camara pulpar con fresas de alta velocidad de fisura no.701 esteriles, sin
empleode refrigerante.
5. Sedetermin6 la longitud de trabajo con un iocalizador electr6nico apical ysecomprob6
radiogr.ificameotequeesta fueralacorrecta
6. Seinstrurnent6 sinutilizaralgunasoiuci6nirrigadora, a iongitud de trabajo hasta una
lirnamanualn6mer025tipoK.
7.Sielconductoseencontr6seco,sedeposit6soluci6nsalinaesterilparaevitarla
contaminaci6n proveniente de lacamara pulpar.
8. Las muestras seobtuvieron colocando 3 conosdepapel esteril No. 20 durante I minuto
cadaunoenelinteriordelconducto(enelmasamplio,encasodesermultirradicular)para
absorber el contenido del mismo Las puntas de papel esteriles fueron transferidas
inmediatamente a un tuba de ensayo con Tris-EDTA ImM, el cual se sello hermeticamente.
9. Losvialesconlasmuestrassecongelarona-70°Chastaelmomentodelaextraccion del
La extraccion de DNA se Ilevo a cabo mediante la tecnica de caientamiento-congelamiento.
Ei vial con las puntas de papel se descongelo a temperatura ambiente, y la mueslra se
resuspendioenelbu~erTEagitandoenelv6rtexduranteunminuto. Paraellavadodela
muestra,lasuspensionmicrobianaselransfirioauntubodeependorffysecentrifug6a
2500g(6000 rpm) durante 5 minutos. Enseguidaelprecipitadoseresuspendi6 en 200liL de
aguainyectableesteril yse centrifug6 en las mismas condiciones, estepasoserealiz6tres
veces. Despues del Ultimo lavado, el precipitado se resuspendi6 en 200IlL de agua
inyectableyseca1ent6 a 95°C pordiezminulos, inmediatamenledespues seenfri6 por
cinco minutos a -80°C. EI vial se centrifug6 a 10,000 rpm a 4°C durante 3 minutos; para
removerlosdesechoscelularesasicomolascelulasquenosehayanrolo.Elsobrenadante
fue recoJectado y se midi6 la cantidad de DNA extraido por espectrofolometria para
posteriormente ser usado como templado para la arnplificaci6n por PCR.
Identificaci6nporeimetododePCR
Seutiliz6e1pardeoJigonucleotidosespecificoparaF. nucleatum,elcual arnplificauna
secuenciade500pb:
PRIMER: FN 5047-1 (DNA) - CAA ATG CIT GTG TCA ATA ATA CT
PRIMER: FN 5047- 2 (DNA) - TIT AGA AAT GGT AGA ATA AT
Se prepar6 una mezcla de reacci6n a un volumen total de 25 Ill: 2.5 pi de buffer PCR lOX,
I pI de cada 0ligonucle6tido (0.4 pM), 0.5 pi de dNTPs (0.2 pM), 0.1 pi de Taq DNA
poJimerasa (0.5 pM), I pi dellemplado de DNA (lOng) y 18.9 pI de agua inyeclable.
Laarnplificaci6n sellev6 a cabo deacuerdo al siguienteprolocolo: Calentarnienloa94°C
por 5 minutos, 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a nOc y un cicio de
extensi6n final de noc durante 5 minulos. En cadaarnplificaci6n se incluy6 un control
posilivo y uno negativo que no conlenia el tempiado de DNA.
Electroforesisengeideagarosa
Las muestras arnplificadas se colocaron en un gel de agarosa al 1% en Buffer TBE IX
(Tris-EDTA-Borato de sodio) y corri6 a un voltaje conslanle de 70 volts durante 2.5 horas.
En cada gel se utiliz6 un marcador de peso molecular de 100 pb. Al cabo de este liempo, el
gel setiii6conbromurodeetidioyseobserv6 con laayuda de una Illmpara de luz UV
(Anexo3,foto2).
Seestudiaronuntotalde92muestrasobtenidasdeconductosradicularesconperiodontilis
apicalcr6nica.
Dellotal de muestras estudiadas, en 83 fue posible aislar DNA y de eslas en 4 (4.81 %) se
obtuvieron arnplificados correspondienles a los oligonuc1e6lidos especificos de
Fusobacterium nuc/eatum (Anexo 4).
IV. DlSCUSI6N
La microbiota relacionada a la periodontitis apical cr6nica no ha sido ampliamente
estudiadacomolainvolucradaenpulpasnecr6ticas,sinembargo,sehanlogradoestablecer
diferenciassignificativasensucomposici6n.
La peR, es una tecnica microbiana de alta sensibilidad, usada para la detecci6n e
identificaci6n de microorganismos diflciles de cultivar como 10 son los de origen
En este estudio la prevalencia de F. nucleatum fue de14.81%, porcentaje muy similar aI
encontrado por Baumgartner en Brasil, donde mediante peR identific6 4% de la misma
Por otro lado, comparado con estudios realizados en Europa 0 Estados Unidos, el
porcentajeencontrado en estainvestigaci6n resulta ser menor, ya que en estos paisesseha
lIegado a reportar una prevalencia del 73% (Baurngartneretal. 2004). Fouad, de igual
manera,reportaunaprevalenciade deF.nucieatum.
Otrosestudioshanreportadodiferentesprevalencias,taleselcasodeKantzyHenry,que
en 1974, encontraron unaprevalencia del 39%; Sundqvist,en 1992, del 33%; Heimdahl,en
1985, del 34%; SiqueirayRocas, en 2004, prevalenciadel 26%; HaapasaJ0, en 1986, del
16% yporultimo Fabricius, en 1982, del 14%. Enestainvestigaci6n,en2010, sereporta
prevaJenciade F. nuc,leatum del 4.81%, resultando bajaencomparaci6ncon los autores
citados.
En este estudio, en 9 muestras no fue posible extraer el DNA, esto probablemente se haya
debidoaquelamuestratomadadelosconductosradicularesnofuesuficienteoaltiempo
transcunidoentrelatomadelamuestrayeltrasladoallaboratorioparasucongelamientoa
-70·C,loquetalvezpudoocasionarqueeIDNAsedegradara.
Esta investigaci6n, constituye el primer reporte en Mexico de F. nucleatum mediante una
tecn.icamolecularcomolaPCR.
Esimportantequesellevenacaboestudiosdeestetipo,utilizandoelmismo protocolo de
identificaci6n, para establecer con mas precisi6n la epidemiologfa de F. nucleatum en
Una de las ventajas del PCResiadetecci6nrapidayespecificadeiosacidosnucleicosde
microorganismos pat6genos en una muestra, con la caracteristica de tener una alta
especificidadysensibilidad.Lapruebapermiteunaobtenci6nrapidaderesultadosyse
pueden examinar varias muestras en corto tiempo.
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Anno 1. OPERACIONALlZACION DE VARIABLES
Nombrcdelavariabl.
MicroorganismoPresenciadc anaer6bicogram negativo.F.nuclearum preseotec:ninfecciones
c:ndod6nticasprimarias
Idt.ndfladO.moIKUlar dt FlI.IONderillM ,."dntJUrt u p.dtntes aiD periodODdtb .p~l crOnla dd Po.,..do dt [ndodo.d.dtl.UaJ'IenldadAutOftOmlldtYueatb.
A quiencorresponda:
Por este medio, bago constar que he sido cabalmente informado (a) y doy mi
consentimientoparaquesemerealiceunamuestrabacterianaendod6ntica,asi como tomas
radiograficasperiapicales.
Semehainformadoquealparticiparenestainvestigaci6n,noexisleriesgoparamisalud
nirniinlegridadfisica.
EI resultado de los datos oblenidos, radiografias y fOlografias que se lomen, podnin ser
utilizadas para los fines que la invesligaci6n del C. D. Gabriel Alvarado Cardenas requiera
parasuesludioypublicaci6n.
Firma de consenlimienlo
Testigo
Merida, Yucalan,Mexlco__de de20_.
Fotograffa I. Colocaci6n de la muestm amplificada para laelectroforesis en gel de
agarosaall%
(Laboralorio de Microbiologia Oral y Biologia Molecular. FOUADY)
Fotograffa 2. Cepa de referencia ATCC 25586 de Fusobacterium nucleatum
(Laboralorio de Microbiologla Oral y Biologla Molecular. FOUADY)
Anexo4
Figura I. F.nucleatum aislada en condu:t0s con ~ri~~~~~pical cr6nica.
Fuente: Trabajode investigaci6n: Identificaci6n molecular de Fusobacterium nucltarumen pacienlesconperiodoRlitisapicalcr6nicadeiPosgradodeEndodonciadelaUniversidadAutonomadeYuc8t.4n
IlIMIISlWWUIAIiM•S/mMADE MIMUGffW