Upload
gaspard-hardy
View
115
Download
5
Embed Size (px)
Citation preview
Gain de fonction, perte de fonction
hypothesis-driven research
Ce gène active la division cellulaire
Puce à ADN
Discovery-driven research
Comparaison ARNm de cellules à division rapide Vs ARNm de cellules à division lente
gène x= candidat
Sur-expression
Gain de fonction
Sous-expression
Perte de fonction
expressionphysiologique
24 h après
Produit de gène x
Gain de fonction
Organisme
Cellule
perte de fonction
sous-expression
Knock Out
sur-expression
Transgénique
Sur-expression
expressionphysiologique
Produit de gene x = protéine x
ARNm codant protéine x
ADN codant protéine x
Approche : Gain de fonction
protéine x
macromolécule informationnelle
protéine x
ARNm codant protéine x
ADN codant protéine x
transcription
traduction
? - Source de la macromolécule informationnelle
? - Introduction dans la cellule
Source de la macromolécule informationnelle
Purifiée à partird’une source biologiqueProtéine recombinante
ADN
ARN
Protéine
PCR, Clonage
Transcription in vitro
Transcription in vitro
Plasmide
Promoteur d’ARN polymérasede bactériophage
recombinant
ADN codant protéine x
recombinant
Transcription in vitro
Plasmide
ARN polymérasede bactériophage
ARN
Protéine recombinante
Escherichia coli
Transfection
Extraction et purification
Protéine x
Plasmide
ADN codant protéine x
recombinant
Promoteur bactérien
Introduction dans la cellule
Transfection*
Transformation*
Transduction*Transfert de matériel génétique d'une bactérie à une autre ou d'une cellule à une autre par l'intermédiaire d'un virus.
Transfert de matériel génétique exogène dans une cellule.
Acquisition par un organisme de caractères héréditaires nouveaux après pénétration dans ses cellules de matériel génétique exogène.
La membrane plasmique est une barrièrephysique à la transfection de protéines
et acides nucléiques
Lipopolysaccharides
peptidoglycan
MembranePlasmiqueintérieurpeptidoglyca
n
MembranePlasmiqueextérieur
Périplasme
lipoprotéine
Porine(protéine)
Transporteur (protéine)
Paroi bactérien (gram -)
Paroi de lévure
Paroi d’une cellule végétale
Paroipectocellulosique
Membraneplasmique
Digestionenzymatique
protoplaste
Cellulevégétale
Production de protoplastes
Digestionenzymatique
Production de sphéroplastes
levure
sphéroplaste
Micro-rupture de la membrane plasmique
Endocytose
Comment faire pénétrer une macromoléculeInformationelle à l’intérieure d’une cellule ?
Fusion membranaire
- Micro-rupture de la membrane plasmique
- Micro-injection
- Choc-osmotique/choc-thermique
- éléctroporation
- Biolistique
- Onde de choc
- Endocytose
- Fusion membranaire
Micro-rupture de la membrane plasmique
- Micro-injection
- artificielle
- biologique
- Choc-osmotique/choc-thermique
- éléctroporation
- Biolistique
- Onde de choc
Micro-injection : artificielle
Micro-injection : artificielle
Avantages : transfection très efficace
Inconvénients : lourdeur technique
transfection de populations de cellules impossible
Micro-injection : biologique : bactéries
Pilus F
Bactériophage M13
M13
T7
Bactériophage T7
Agrobacterium tumefaciens
galles
Micro-injection : biologique : cellules végétales
Agrobacterium :cycle de vie
Micro-rupture de la membrane plasmique
- Micro-injection
- Choc-osmotique/choc-thermique
- éléctroporation
- Biolistique
- Onde de choc
CaCl2
Cl-
Ca++
LiCH3CO2
Li+
CH3CO2-
Choc-osmotique/choc-thermique
bactérielevure
37°C 42°C
perméabilisation perméabilisation
ADN
H2Oturgescence turgescence
Avantage :
Inconvenients :
Peu onéreuse
transfection de populations de cellules
toxicité
échanges non-spécifiquesd’autres molécules
Choc-osmotique/choc-thermique
faible efficacité
Micro-rupture de la membrane plasmique
- Micro-injection
- Choc-osmotique/choc-thermique
- éléctroporation
- Biolistique
- Onde de choc
- ++++
++
+
--
-
---
10 - 100 kV/cm
10 - 1000 s
Electroporation
Electroporation
Interrupteur # 1
Interrupteur # 2
résistance alimentation
capacitance
Electroporation
Avantage :
Inconvenients :
efficacité de transfection
transfection de populations de cellules
toxicité
échanges non-spécifiquesd’autres molécules
transfectées
....
....
....
....
....
....
....
Rupture de la
hélium
Onde de choc
Biolistique
…………
membrane calibrée
Capsule à microbilles
Grille de rétention
cellules
microbilles en or
hélium
Biolistique
Biolistique
Avantage :
Inconvenients :
Utilisation avec cellules à paroi
transfection de populations de cellules
Endommage les cellules
Transfection peu uniforme
Nanosecond pulsed laser-induced stress wave
Nanosecond pulsed laser-induced stress wave
Avantage :
Inconvenients :
Technique trop récente
?
?
Agrolistique
Micro-rupture de la membrane plasmique
Endocytose
Comment faire pénétrer une macromoléculeInformationelle à l’intérieure d’une cellule ?
Fusion membranaire
Endocytose
L’endocytose implique la
capture spécifique de
macromolécules ou
nanoparticules par la
membrane plasmique
Nanoparticules
- molécules amphipathiques
- peptides cationiques
- phosphate de calcium
- polymères ramifiés
Endocytose
- lipides- peptides
Macromolécules cationiques
- hydrophobes - liposomes
- cationiques
- ligands membranaires - virus
Nanoparticules
- molécules amphipathiques
- peptides cationiques
- phosphate de calcium
- polymères ramifiés
Endocytose
- lipides- peptides
Macromolécules cationiques
- hydrophobes - liposomes
- cationiques
- ligands membranaires - virus
Peptides passe-membranes(cell-penetrating peptides : CPP)
-de la protéineantennapaedia
-de la protéinetat de VIH
- oligo arginine
R Q I K I W F Q N R R M K W K K+++ + + ++
G R K K R R Q R R R P P Q C+++ ++ + ++
R R R R R R R R R+++ ++ + +++
Peptides cationiquesEndocytose :
cargo
CPP (conjugaison chimique)
CPP(peptide de synthèse)
conjugaison chimique(liaison covalente)
ProtéineARNADN
G R K K R R Q R R R P P Q C
ADN codant protéine x
ADN codant CPP
Transfection dans E.coli
RQIKIWFQNRRMKWKK- Protéine x
Plasmiderecombinant
CPP (protéine de fusion recombinante)
Nanoparticules
- molécules amphipathiques
- peptides cationiques
- phosphate de calcium
- polymères ramifiés
Endocytose
- lipides- peptides
Macromolécules cationiques
- hydrophobes - liposomes
- cationiques
- ligands membranaires - virus
Phosphate de calcium
3 CaCl2 + 2 Na3PO4 Ca3PO4 + 6NaCl
nanoparticules
endosome
Précipitée Ca3PO4 / ADNnanoparticulaire
Membrane plasmique
ADNARNProtéine ?
Endocytose :
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
-
-
-
-
-
--
-
-
-
-
-
Nanoparticules
- molécules amphipathiques
- peptides cationiques
- phosphate de calcium
- polymères ramifiés
Endocytose
- lipides- peptides
Macromolécules cationiques
- hydrophobes - liposomes
- cationiques
- ligands membranaires - virus
Polymères ramifiés
Polyéthylénimine (PEI)
Complexe PEI / ADNnanoparticulaire
+
++
++
+
+
+
ADNARNProtéine ?
Endocytose :
Nanoparticules
- molécules amphipathiques
- peptides cationiques
- phosphate de calcium
- polymères ramifiés
Endocytose
- lipides- peptides
Macromolécules cationiques
- hydrophobes - liposomes
- cationiques
- ligands membranaires - virus
lipides amphipathiques
régioncationique
région lipidique(hydrophobe)
+
+
++
+
+
+
+
++
++
++
Lipoplexe (nanoparticule)
example : L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)
Endocytose :
Nanoparticules
- molécules amphipathiques
- peptides cationiques
- phosphate de calcium
- polymères ramifiés
Endocytose
- lipides- peptides
Macromolécules cationiques
- hydrophobes - liposomes
- cationiques
- ligands membranaires - virus
+ - +p ++++- -p pp p
K E T W W E T W W T E W S Q P K K K R K V Cp
Pep-1
Endocytose :peptides amphipathiques
N
O
O
O
O
C
C
régioncationique
régionhydrophobe
+++++++
+++
+++++
+++++
+++++
+++++
+++++
Nanoparticule de Pep-1/cargo (protéine)
Endocytose :peptides amphipathiques
Nanoparticules
- molécules amphipathiques
- peptides cationiques
- phosphate de calcium
- polymères ramifiés
Endocytose
- lipides- peptides
Macromolécules cationiques
- hydrophobes - liposomes
- cationiques
- ligands membranaires - virus
ADNARNProtéine
Endocytose :nanoparticules hydrophobes
Lipofection
Nanoparticules
- molécules amphipathiques
- peptides cationiques
- phosphate de calcium
- polymères ramifiés
Endocytose
- lipides- peptides
Macromolécules cationiques
- hydrophobes - liposomes
- cationiques
- ligands membranaires - virus
recepteur membranaire
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
virus
virus
Les virusGénome
ADN
ARN
db
sb
Famille
sb+
sb-
PoxviridaeHerpesviridae
Rhabdoviridae
Coronaviridae
Adenoviridae
Picornaviridae
Parvoviridae
Filoviridae
Retroviridae
Réoviridae
Les virusGénome
ADN
ARN
db
sb
Famille
sb+
sb-
PoxviridaeHerpesviridae
Rhabdoviridae
Coronaviridae
Adenoviridae
Picornaviridae
Parvoviridae
Filoviridae
Retroviridae
Réoviridae
Adenoviridae
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
Ligands de protéines membranaires :
Adenoviridae
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
Adenoviridae
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
Adenoviridae
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
= réplication incompétente
E1 déleté
Adenoviridae
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
transgène
Cellules transformées par E1
promoteur E1 genome avec transgène
plasmide
réplication incompétente transgènique virus
transfection
Adenoviridae
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
Avantages : transduction très efficace
grande tropisme
Inconvénients : Expression transitoire
Sécurité
Les virusGénome
ADN
ARN
db
sb
Famille
sb+
sb-
PoxviridaeHerpesviridae
Rhabdoviridae
Coronaviridae
Adenoviridae
Picornaviridae
Parvoviridae
Filoviridae
Retroviridae
Réoviridae
Genres :
* Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus
Retroviridae
Genres :
* Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus
Retroviridae
retroviridae
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
Avantages : transduction très efficace
Expression stable (intégration)
Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose
faible tropisme
sécurité
retroviridae
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
Avantages : transduction très efficace
Expression stable (intégration)
Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose
faible tropisme
sécurité
Genres :
* Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus
Retroviridae
retroviridae
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
Avantages : transduction très efficace
Expression stable (intégration)
Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose
faible tropisme
sécurité
rétrovirus : défective pour la réplication
retroviridae
nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus
Plasmide
LTR
LTR
Plasmide
Plasmide
gag/pol
env
transfection
Cellule productrice
Recombinaison pendant transcription inverse
U3 R U5 U3 R U5
transgene
3’ LTR inactive
U3 R U5 U3 R U5
transgene
5’ LTR auto-inactivé
promoteur
promoteur
Comment savoir si les cellules transfectées/transduites
expriment la protéine x
- anticorps spécifique
- western blot
- immunofluorescence
- anticorps contre étiquette (epitope tag)
- western blot
- immunofluorescence
- protéine de fusion (fluorescente)
Comment savoir si les cellules transfectées/transduites
expriment la protéine x
- anticorps spécifique
- western blot
- immunofluorescence
- anticorps contre étiquette (epitope tag)
- western blot
- immunofluorescence
- protéine de fusion (fluorescente)
HIS HHHHHH
c-MYC EQKLISEEDL
HA YPYDVPDYA
VSV-G YTDIEMNRLGK
HSV QPELAPEDPED
V5 GKPIPNPLLGLDST
FLAG DYKDDDDK
étiquetage (epitope tagging)
Plasmide
ADN codant
étiquette
ADN codant
Protéine x
promoteur
Comment savoir si les cellules transfectées/transduites
expriment la protéine x
- anticorps spécifique
- western blot
- immunofluorescence
- anticorps contre étiquette (epitope tag)
- western blot
- immunofluorescence
- protéine de fusion (fluorescente)
Etiquetage
Green Fluorescent Protéine (GFP) dsRED
Co-marquageco-transfectionco-traduction (IRES)
mTrim17Pcmv his6 SV40 polyA
ires YFP
his6
YFP
expression transitoire
ou
expression stable
expression transitoire
expression stable
Nécessite une intégration génomique
rétrovirus intégration fortuite
Événement rare
sélection
promoteur 1 promoteur 2
ADN x polyA
polyA
Gene de résistanceantibiotique
expression inductible
tTA-NLSP CMV
SV40 polyA
P CMVmintetO tetOtetO tetO tetO tetO Gene x
Tet repressor/TA
doxycycline
expression inductible
rtTA-NLSP CMV
SV40 polyA
P CMVmintetO tetOtetO tetO tetO tetO Gene x
Reverse Tet repressor/TA
doxycycline