Gen Eukariotyczny II Rok 2008

"

Gen eukariotyczny Działanie i regulacja

Geny eukariotyczne

Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie

Każdy gen ma własny promotor, nie występują operony

Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów

Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne

Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) – złożoność proteomu przekracza złożoność genomu

Po co regulacja?

Większa liczba genów wymusza bardziej złożoną/ścisłą regulację

Homeostaza komórki

Odpowiedź na zmienne środowisko

Komunikacja między komórkami i utrzymanie funkcji organizmu u wielokomórkowców

Rozwój

Etapy ekspresji/poziomy regulacji

struktura chromatyny

transkrypcja

obróbka i kontrola jakości RNA

transport RNA

degradacja RNA

translacja

modyfikacje post-translacyjne

degradacja białka

Losy mRNA w komórce

• Transkrypcja

• Dodanie „czapeczki” na końcu 5’

• Składanie (splicing)

• Poliadenylacja na końcu 3’

• Transport do cytoplazmy

• Translacja

• Degradacja

Transkrypcja

Kluczowym etapem regulacyjnym większości genów jest transkrypcja

Regulacja z reguły na poziomie inicjacji transkrypcji

Czynniki cis – sekwencje regulatorowe w obrębie promotorów i enhancerów (wzmacniaczy)

Czynniki trans – białka wiążące się z sekwencjami regulatorowymi (elementami cis)

Czynniki cis

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Czynniki trans


3 (+1) główne polimerazy RNA Eukaryota

Polimeraza I – geny rRNA

Polimeraza II – geny kodujące białka, większość snRNA, miRNA

Polimeraza III – małe RNA: tRNA, snoRNA, 5S rRNA, U6 snRNA

Polimeraza mitochondrialna

Polimeraza I i rRNA


Polimeraza III i małe RNA


Polimeraza II


Promotor i czynniki podstawowe


Podstawowe czynniki tworzą platformę, do której wiąże się polimeraza

Enhancer i aktywatory

Aktywatory ułatwiają przejście polimerazy do kompleksu otwartego i start transkrypcji


Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory

Podstawowe – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora

Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach

Koaktywatory –uczestniczą w aktywacji transkrypcji, ale nie wiążą się z DNA. Działają przez oddziaływania z białkami kompleksu transkrypcyjnego Kompleks mediatora jest ogólnym koaktywatorem

polimerazy II

Kompleks transkrypcyjny

Czynniki transkrypcyjne

Struktura domenowa: domena wiążąca DNA (specyficznie) domena aktywująca transkrypcję


Domeny wiążące DNA

Palce cynkowe

Helisa-skręt-helisa (H-T-H) – np. homeodomena, domena HMG, domena PAU

Helisa-pętla-helisa (H-L-H)

i wiele innych

Domeny wiążące DNA

Homeodomena Palec cynkowy

Dimeryzacja czynników transkrypcyjnych

Suwak leucynowy

Np. protoonkogeny rodziny c-Fos i c-Jun

System Myc-Max


Komórki nie dzielące się Homodimer Max – brak aktywacji

Komórki dzielące się Heterodimer Myc-Max – aktywacja

Represory


Podstawowe elementy cis

Promotor rdzeniowy – wiąże czynniki podstawowe kompleksu polimerazy II element TATA (wiązanie TBP) miejsce inicjacji

Elementy promotora podstawowego – wiążą czynniki wspólne dla wielu różnych promotorów i zapewniające podstawowy poziom transkrypcji element CAAT –czynniki NF-1 i NF-Y element GC – czynnik Sp1 oktamer – czynnik Oct1

Specyficzne elementy cis promotorów i enhancerów

Moduły odpowiedzi na sygnał np. moduł CRE – odpowiedź na cAMP (czynnik

transkrypcyjny CREB)

Moduły specyficzne dla komórek i tkanek np. moduł mioblastowy rozpoznawany przez czynnik

MyoD; moduł limfoblastoidalny – czynnik NF-κB

Moduły rozwojowe np. moduły Bicoid i Antennapedia D. melanogaster

Regulacja kombinatoryczna

W sekwencjach regulatorowych występują różne kombinacje elementów cis wiążących różne czynniki trans, co daje bardzo wiele możliwości regulacji przy udziale stosunkowo niewielkiej liczby regulatorów – kombinatoryka

Promotor ludzkiego genu insuliny

Alternatywny start transkrypcji

Wiele genów wyższych eukariontów posiada wiele alternatywnych miejsc startu transkrypcji (promotorów), specyficznych tkankowo

Dzięki temu z jednego powstają różne transkrypty i białka w różnych komórkach i tkankach

Gen dystrofiny człowieka

móżdżek mięśnie siatkówka kom. Schwanna pozostałe tkanki kora

Struktura chromatyny

Wiele poziomów organizacji

Heterochromatyna – skondensowana, nieaktywna. Powstawanie heterochromatyny jest jednym z mechanizmów wyciszania genów i całych chromosomów Stała (np. centromery, telomery, część Y) Fakultatywna

Euchromatyna – może być aktywna transkrypcyjnie

Nukleosomy a regulacja

Występowanie nukleosomów decyduje o dostępności promotora i jest elementem regulacji inicjacji

Modyfikacje histonów i DNA są mechanizmami regulacyjnymi

Podczas elongacji konieczne jest usuwanie nukleosomów przez specjalne czynniki elongacyjne

Regulacja dostępności chromatyny


Remodelowanie chromatyny


Domeny strukturalne euchromatyny

Pętle DNA – domeny strukturalne

Obszary wiązania macierzy jądrowej

Domeny funkcjonalne i izolatory

Izolatory oddzielają domeny funkcjonalne w chromatynie

Białka wiążące się z izolatorami uniemożliwiają interferencję regulatorów z sąsiedniej domeny (innych genów)

Izolator

Izolator

Obszary kontrolujące loci

LCR (locus control regions) – utrzymują domeny funkcjonalne otwarte, czyli aktywne transkrypcyjnie

Modyfikacje histonów i DNA

Modyfikacje histonów (“kod histonowy”) Acetylacja (aktywacja) i deacetylacja (inaktywacja)

histonów Metylacja – efekty długoterminowe Fosforylacja Ubikwitynacja, SUMOilacja

Metylacja DNA – wyciszenie

Metylacja DNA

Metylacja prowadzi do wyciszenia ekspresji przez upakowanie chromatyny

Rzadka u niższych eukariontów, powszechna u kręgowców (do 10% C)

Powstaje 5-metylocytozyna


Metylacja DNA

Inaktywacja jednej kopii X u samic

Piętno genomowe

Piętno genomowe

Stwierdzone u ssaków, podobne procesy mogą występować u D. melanogaster i roślin, niezbędne do prawidłowego rozwoju zarodka

Ekspresja wyłącznie jednego z pary alleli genu, odziedziczonego po konkretnym rodzicu (matce lub ojcu)

Przykład – gen Igf2 – aktywna wyłącznie kopia odziedziczona po ojcu

Metylacja DNA utrzymuje się podczas mitozy, ale w procesie mejozy jest usuwana

Piętno genomowe

Mejoza


Piętno genomowe i choroby genetyczne

W przypadku genów podlegających piętnowaniu efekt może być różny przy dziedziczeniu od ojca lub matki

Np. delecje na chromosomie 15 (15q11-q13) U matki – zespół Angelmana U ojca – zespół Prader-Willi

Obróbka RNA

Czapeczka na końcu 5’

Poliadenylacja końca 3’

Wycinanie intronów – składanie (splicing)

Transport z jądra do cytoplazmy

Degradacja

Czapeczka 5’

Synteza tuż po inicjacji transkrypcji

Istotna dla eksportu i translacji mRNA

Terminacja i poliadenylacja

Terminacja i poliadenylacja

Poliadenylacja

Kontroluje (zwiększa) stabilność mRNA

Dotyczy większości mRNA, wyjątkiem są mRNA kodujące histony

Składanie

Introny – fragmenty pierwotnego transkryptu, które są wycinane i nie występują w dojrzałym transkrypcie

Większość genów wyższych eukariontów zawiera introny, w przeciętnym genie stanowią przeważającą większość sekwencji transkrybowanej

Alternatywne składanie – różne kombinacje eksonów dają różne ostateczne transkrypty tego samego genu

Składanie mRNA

Mechanizm składania

Składanie mRNA

W składaniu uczestniczą kompleksy białek i snRNA: snRNP

Alternatywne składanie

Wybór różnych miejsc łączenia (tzw. miejsca kryptyczne)

Składanie różnych kombinacji eksonów

Jeden gen – wiele białek

Często tkankowo-specyficzne

Alternatywne składanie - przykłady

Bardzo wiele genów człowieka

Amylaza śliniankowa i wątrobowa

Tachykininy: neurotransmitery w narządach zmysłów neuropeptyd P w układzie nerwowym neuropeptyd K w tarczycy i jelicie

Determinacja płci Drosophila

Redagowanie (editing)

Zmiana konkretnego nukleotydu w RNA po transkrypcji

Częste w organellach niższych eukariontów

Np. apolipoproteina B człowieka

Wątroba, białko 4563 aa

Jelito, białko 2153 aa

Kontrola jakości RNA

Tylko w pełni obrobione (czapeczka, poliadenylacja, składanie) transkrypty są eksportowane z jądra

Transkrypty nieprawidłowo obrobione są degradowane

Degradacja transkryptów z przedwczesnym kodonem STOP (NMD – nonsense mediated decay) – wykrywane nieprawidłowe położenie STOP względem miejsc styku intron/ekson

Degradacja RNA

Czas życia mRNA jest krótki (średnio 10-20 min. drożdże, kilka godzin ssaki)

Różne ścieżki degradacji 3’-> 5’ (egzosom) deadenylacja, usunięcie czapeczki, egzonukleaza 5’->3’

Na stabilność wpływają sekwencję nie podlegające translacji (UTR) i poliA

Może podlegać regulacji przez czynniki trans

Regulowana degradacja RNA


Translacja

Regulowany może być każdy etap translacji Wybór kodonu AUG Inicjacja Elongacja Terminacja

Np. zahamowanie translacji i indukcja GCN4 w odpowiedzi na głodzenie u drożdży

Białka też podlegają złożonym modyfikacjom

Fałdowanie – wspomagane przez białka opiekuńcze

Modyfikacje chemiczne (fosforylacja, glikozylacja itp.)

Ubikwitynacja i degradacja Naturalna Degradacja źle sfałdowanych białek

Odkrycie roku 2002 – regulacyjna rola małych RNA

Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

Nowe role RNA

Interferencja RNA

Wyciszanie ekspresji genów przez krótkie dwuniciowe RNA homologiczne do sekwencji genu

Może działać na różnych etapach PTGS – posttranskrypcyjne wyciszanie genów

hamowanie translacji degradacja RNA

TGS – transkrypcyjne wyciszanie genów wpływ na strukturę chromatyny zmiana aktywności czynników transkrypcyjnych

siRNA, miRNA, stRNA...

siRNA (short interfering RNA) – pochodzą z dwuniciowych cząsteczek, głównie egzogenne (np. wirusy RNA)

miRNA (micro RNA) – pochodzą z cząsteczek o strukturze szpilki do włosów, kodowane w genomie

stRNA (small temporally regulated RNA) – miRNA regulujące rozwój (odkryte u nicieni)

smRNA (small modulatory RNA) – reguluje działanie genów w neuronach przez zmianę funkcji białka regulującego transkrypcję (represor → aktywator)

siRNA a miRNA

siRNA – egzogenny dsRNA (np. wirusa) miRNA – endogenny dsRNA

siRNA - jak to działa?

Hannon G.J.: ‘RNA interference’, Nature 418, July 11, 2002

dsRNA jest egzogenny

Efekt – degradacja mRNA

miRNA – jak to działa?

dsRNA kodowany w genomie

Efekt – degradacja mRNA lub hamowanie translacji

Regulacyjne RNA działają też na transkrypcję

Efekt – zmiana struktury chromatyny

RNA też może modyfikowac ekspresję chromosomu

Wyciszanie jednej kopii chromosomu X u kobiet przez RNA XIST

Zastosowania

Badanie funkcji genów (“odwrotna genetyka”) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin

Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów)

RNA a terapia genowa

siRNA skierowane przeciwko: wirusom (HIV, HCV) zmutowanym genom (np. pląsawica Huntingtona) onkogenom obniżenie poziomu cholesterolu LDL u myszy przez siRNA

przeciwko apolipoproteinie B

Podsumowanie

Eukaryota mogą regulować każdy z licznych i złożonych etapów ekspresji

Złożoność mechanizmów regulacyjnych wzrasta ze wzrostem złożoności organizmu

Obok białek regulatorowych istnieją też liczne regulatorowe RNA, których istnienie poznaliśmy niedawno

"

Dziękuję za uwagę dr Paweł Golik

[email protected]

Documents

Gen Eukariotyczny II Rok 2008