Gene Expression

נופר יורן

אביטל קליין

מנחה: פרופ' ניר פרידמן

האתגר הראשי:

להבין את רמת הביטוי

של גנים שונים במצבים וזמנים שונים.

כיצד נבחר את הכלי המחקרי

מה אנחנו מחפשים?

כמה צריך?

?mRNAאיך נזהה

אז מה עושים?

Microarray:המרכיבים -

– DNAמערך מסיליקון או זכוכית המכיל קטעי •oligonucleotides.

– פרופיל מייצג של גנים המבוטאים RNAמאגר •בתאים מדגימות שונות.

(.cy3 cy5סמנים פלורסנטיים )•

microarray

תת אתגר

הוא קבלת microarrayהאתגר העולה משימוש בכמות גדולה מאוד של מידע, המקשה על

היכולת שלנו להסיק מסקנות.

לייצוג בעזרת דנדוגרמה microarrayמ

לייצוג בעזרת דנדוגרמה: microarrayמ

o o o o o

מצב ייחוס o o o

o o

Upregulated downregulated

- clusteringהרעיון המרכזי

זיהוי תבניות ביטוי ויצירת קבוצות

גנים על פי רמות הביטוי.

למה?גנים המסווגים לאותה קבוצה ככל הנראה •

חולקים:תפקידים

מוטיבים בפרומוטור ופקטורי שעתוק

משותפים."כל אחד הוא אור קטן וכולנו אור איתן"•

אחרילפני

מרחב הביטוי

וקטור ביטוי

(x,y,z), 3למשל- במימד

ניתן להציג גרפית.

(log2) 1ניסוי

(log2) 2ניסוי

(log2) 3ניסוי

clustering

היררכי

Divisive )חלוקה(

supervised

היררכי לא

unsupervised

agglomerative)צבירה(

התוצאה- קבוצות מקוננות )מזכיר מיון פילוגנטי(.

unsupervisedשיטת צבירה,

איך מחליטים אם קבוצות דומות?Average linkage

Complete linkageSingle linkage

היררכי

average linkage complete linkage single linkage

"כל עוד הנר דולק אפשר לתקן"•מידע מוקדם על מספר הצברים הסופי.•.unsupervisedזו שיטה לא היררכית, ••K.קבוצות דומות מבפנים אך שונות מבחוץ

K-means clustering

AVG

AVG AVG

מסקנות:

דרוש ידע ביולוגי קודם לקבלת החלטות •)לעבודה!(

אין דרך אחת נכונה.•

שיטות שונות מתאימות למטרות שונות.•

שילוב שיטות עשוי להועיל.•

ניתן לקבל מבטmicroarrayמשימוש ב

על ביטוי גנים :

בזמנים שונים1.

. במצבים שונים2

תבניות ביטוי גנים בתגובה לשינוי סביבה

בתאי שמרתאור התופעה:•

Saccharomyces cerevisiaeשמרים מסוג

השורדים במגוון שינויים סביבתיים.

מטרת הניסוי: •

לבדוק מה הם השינויים ברמת ביטוי הגניםבתגובה לשינויים סביבתיים

ולהבין מה המכניזם המאפשר את ההסתגלות לשינוי ומההן ההשפעות הפיזיולוגיות של

השינוי.

?microarrayלמה

השוואת מצבים.•

רשת שלמה של בקרים )כולל סיגנלים •שמבקרים אותם והמטרות אותן הם מבקרים(.

תמונה רחבה יותר של התהליך•

מהלך הניסוי

שמרים שגודלו בתנאים סטנדרטיים•חשיפה לשינויים סביבתיים שונים.•חשיפה לעוצמות שונות של השינויים.•מעקב בזמנים שונים.• מערכים.142שימוש ב-• גנים מוכרים .6200המערכים מכילים כ•מחסור ומציאת תבניות.clusteringביצוע •

בחומצות אמינו

מזון

חומציו'טמפת

תנאים סטנדרטים

איזה קבוצה עוברת רגולציה ביחד

תפקיד באותו תהליך

מה רצף התהליכים שקרו

המצב הפיזיולוגי של התא

מה אפשר ללמוד

מהכתמים?

ESR

ESR תוכנית ביטוי משותפת – בתגובה למגוון שינויים

סביבתיים . ESR ~900

Repressed ~600 Induced ~300

תהליכים הקשורים

לגדילה

מקודדים לחלבונים ריבוזומלים

Induced ESR

מטבוליזם של פחמימות

חמצון חיזור

קיפול חלבונים

דגרדציית חלבונים

תיקון נזקי דנ"א

סיגנאלים תוך תאיים

: התא הסבר אפשרי

מכין מאגר תעתיקים

.זמין משני התפקידים

פרדוקס – א. איזוזימים מבוטאים

בצורה שונה

: הבדלים הסבר אפשרי

דקים בין האיזוזימים )ספציפיות הסובסטראט,

מיקום בתא(

ב. גנים מנוגדים הוגברו יחד.

)דוגמה: סינתזת ופירוק פחמימות

. תשמורת(

מה עוצמת הביטוי?

כמה זמן הביטוי נמשך?

25 ⁰ 37 ⁰

29 ⁰ 33⁰

מסקנות:לא כתגובה לכל •

שינוי סביבתי נצפיםESRמאפייני •ביצירת מצב עקה ולא

בהפחתתו

25 ⁰ 37 ⁰

37 ⁰25 ⁰

ESRהבקרה על

האם זו מערכת רגולטורית אחת לכל

המטרות או הרבה מערכות?

:מסקנה

בקרה מערכות

ספציפיות

לכל מצב ולכל גן

ESRמסקנות

ESR למגוון עקות - מכונהתגובה כללית•.גנים מוגברים וגנים מושתקים

.מהירה וחולפתהיא ESR הדלקת ה• בין עצמת שינוי התנאים לבין עצמת התאמה•

.ומשך התגובה. מערכות שונות המתאימות בקרה לא אחידה•

.למצבים השונים

בקרת ביטוי גנים במחזור התא בתאי שמר Hcm1בדגש על

מטרת הניסוי: •

הבנת הבקרה ברמת

השעתוק של גנים

במחזור התא.

למה נרצה לבדוק את רמות השעתוק?

רמות שעתוק מחזוריות בשלב מסוים עשויות •להצביע על פעילות מחזורית של תוצרי

השעתוק בשלב מאוחר יותרהבנת התהליכים הספציפיים במחזור התא •

וזיהוי פקטורי שעתוק החשובים לבקרתו.

1שלב

microarrayשימוש בנתונים מ•

בשלבים שונים בשילוב עם נתונים

שנאספו בעבר.

זיהוי מאות תעתיקים המופיעים•

באופן מחזורי במחזור התא.

.חישוב זמן שיא ממוצע לכל גן•

התעתיקים המחזוריים ביותר1000

2שלב חיפוש אחר•

רצף שמורבפרומוטורים של הגנים

.Sהמשועתקים בשלב

•TAAACAAגנים40 – ב .1000מתוך ה

עריכת חיפוש ביתר הגנום.

Hcm1גילוי •.Sהמאקטב את שלב

האם הרצף השמור הכרחי לבקרת ?Sהשיעתוק בשלב

LacZWHI5

3שלב

Hcm1 (TF) של targetsחקירת ה•

Hcm1מחזוריים כתלות בנוכחות •

מעורב בתהליכים שונים S בשלב

4שלב

Hcm1חקירת פקטור השיעתוק •

Mמתפקד גם בשלב •

?Hcm1מה יתרחש בהעדר

מסקנות

•TF.ספציפי למחזור התא

.S ותחילת G1מבוטא בסוף •הגנים המאוקטבים על ידיו מראים ביטוי שיא •

.Sבסוף חיוני גם לשלבים נוספים.•

אז מה ראינו?

.microarrayהכרנו את הכי המחקרי •ראינו שיטות לעיבוד וניתוח המידע המתקבל.•ראינו שני ניסויים המבוססים על תוצאות שהתקבלו משימוש •

להשוואת מצבים ושלבים שונים.microarrayב

לסיכום:

מאפשרת הסקת ידע מעשי מנתונים בסדר גודל גנומי רחב.microarrayאנליזת רמות ביטוי על ידי

לא מדובר במדע מדוייק – לכן חשוב לבצע החלטות זהירות.

המאמרים:

1 .Quackenbush J (2001) Computational analysis of microarray data. Nature Reviews Genetics 2:418-27.

2 .Gasch AP et al. (2000) Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 11(12):4241-4257.

3 .Parmila T et al. (2006) The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Gene & Development

20:2266-78 .