Generierung von gesättigten N-Heterozyklen mit Iminreduktasen...2019/12/14 · Generierung von gesättigten N-Heterozyklen mit Iminreduktasen Von der Fakultät 4: Energie-, Verfahrens-

Generierung von gesättigten N-Heterozyklen

mit Iminreduktasen

Von der Fakultät 4: Energie-, Verfahrens- und Biotechnik der Universität Stuttgart genehmigte Abhandlung zur Erlangung der Würde eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Vorgelegt von

Niels Borlinghaus

aus Wuppertal

Hauptberichter: Prof. Dr. Bernhard Hauer

Mitberichter: Prof. Dr. Albert Jeltsch

Vorsitzender: Prof. Dr.-Ing. Ralf Takors

Tag der mündlichen Prüfung:

12.12.2019

Institut für Biochemie und Technische Biochemie

Abteilung Technische Biochemie

2019

III

Folgende Fachartikel wurden im Rahmen dieser Arbeit veröffentlicht:

M. Lenz, N. Borlinghaus, L. Weinmann, B. M. Nestl „Recent advances in imine reductase

catalyzed reactions.“ World J. Microbiol. Biotechnol. 2017, 33, 199.

N. Borlinghaus, B. M. Nestl „Switching the Cofactor Specificity of an Imine Reductase.“

ChemCatChem 2018, 10, 183–187.

N. Borlinghaus, S. Gergel, B. M. Nestl „Biocatalytic Access to Piperazines from Diamines

and Dicarbonyls.” ACS Catal. 2018, 8, 3727–3732.

A. Al-Shameri, N. Borlinghaus, L. Weinmann, P. N. Scheller, B. M. Nestl, L. Lauterbach

„Synthesis of N-heterocycles from diamines via H2-driven NADPH recycling in the presence

of O2.“ Green Chem. 2019, 21, 1396–1400.

N. Borlinghaus, L. Weinmann, F. Krimpzer, P. Scheller, A. Al-Shameri, L. Lauterbach,

A.-S. Coquel, C. Lattemann, B. Hauer, B. Nestl „Cascade biotransformation to access 3-

methylpiperidine in whole cells.“ ChemCatChem. 2019, 11, 5738– 5742.

N. Borlinghaus, S. Gergel, Bettina M. Nestl, F. Thol, H. Penders “Preparation of imine

reductases at 15L scale and their application in asymmetric piperazine synthesis”,

accepted book chapter for „Practical methods for Biocatalysis and Biotransformations 3”,

edited by J. Whittall and P. W. Sutton, published by Wiley-VCH.

N. Borlinghaus, B. M. Nestl „Reductive Hydrazinations with Imine Reductases”

Manuscript in preparation.

V

I. Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit mit dem Titel „Generierung von

gesättigten N-Heterozyklen mit Iminreduktasen“ selbstständig verfasst habe, und dass

ich keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Alle

wörtlich oder sinngemäß aus anderen Werken übernommenen Aussagen sind als solche

gekennzeichnet worden. Des Weiteren bestätige ich, dass die vorgelegte Arbeit nicht in

gleicher oder ähnlicher Form bei einer anderen Institution zur Erlangung eines

akademischen Grades eingereicht wurde

I. Declaration of Authorship:

I hereby declare that the present thesis entitled “Generation of saturated N-Heterocycles

with imine reductases” is the result of my own work, that all sources used or quoted

have been indicated, and that I have not used any illegitimate means. I further declare

that I have not submitted this thesis for a degree in some form or another.

Korntal, 05.07.2019

Niels Borlinghaus

VI

II. Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei Herr Prof. Dr. Bernhard Hauer bedanken, der

mich als Doktorand in seinen Arbeitskreis aufgenommen hat und mir die Bearbeitung

dieses spannenden Themas überlassen hat. Weiterhin möchte ich mich für die

Unterstützung und die Ermutigung während meiner Arbeit bedanken. Auch für die

vielen Freiheiten, die ich in meiner Forschung hatte, und das damit verbundene

Vertrauen, möchte ich mich bedanken.

Herrn Prof. Dr. Albert Jeltsch und Herrn Prof. Dr.-Ing. Ralf Takors danke ich herzlich

für die Übernahme des Zweitgutachters, bzw. für die Übernahme des

Prüfungsvorsitzenden.

Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei Dr. Bettina Nestl für die hervorragende

Betreuung während meiner gesamten Zeit als Doktorand. Vor allem für die fachliche

Unterstützung und den Austausch über theoretische und praktische Fragestellungen,

sowie für die Überarbeitung von Manuskripten und die Überarbeitung dieser Arbeit

möchte ich mich herzlich bedanken. Danken möchte ich auch für deine ständige und

unermüdliche Motivation in allen Phasen dieses Projektes.

Ein weiterer Dank gilt Dr. Bernd Nebel für die fachliche Unterstützung bei analytischen

Fragestellungen, sowie für die Sicherstellung einer funktionierenden Analytik.

Bedanken möchte ich mich auch bei meinen Kooperationspartnern Dr. Oliver Lenz,

Dr. Lars Lauterbach und Ammar Al-Shameri an der TU Berlin. Hierbei möchte ich

mich vor allem für die enge und produktive Zusammenarbeit bedanken, sowie für den

fachlichen Austausch. Auch für die herzliche Aufnahme bei meinen Aufenthalten in

Berlin möchte ich mich bedanken.

Ein weiterer Dank geht an meine Kollegen aus dem IRED-Team (Maike Lenz, Philipp

Scheller, Leonie Weinmann und Bettina Nestl). Dies war eine sehr lehrreiche und

produktive Zusammenarbeit für mich.

Auch möchte ich mich bei den Kollegen des Rosalind-Franklin-Labors (Sebastian

Gergel, Benjamin Aberle, Ludwig Bengel, Maike Lenz, Julia Halder, Sara Hoffman,

Lars Hinner) für die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre und die vielen fachlichen

Diskussionen bedanken.

VII

Darüber hinaus möchte ich mich bei allen Kolleginnen und Kollegen bedanken, mit

denen ich in den letzten drei Jahren zusammen arbeiten durfte. Bei euch bedanke ich

mich vor allem für die angenehme Atmosphäre und die Hilfsbereitschaft im Laboralltag,

sowie für die Bereitschaft sich jederzeit über fachliche und technische

Problemstellungen auszutauschen.

Bedanken möchte ich mich auch bei den Studenten Sebastian Gergel, Andreas Reichl,

Phillip Jegl und Steffen Bernhard, welche in verschieden Bereichen dieses Projektes

beteiligt waren und von mir betreut wurden.

Auch bedanken möchte ich mich bei der Deutschen Forschungsgesellschaft (DFG) für

die finanzielle Unterstützung dieses Projektes.

Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner großartigen Frau Mareike bedanken, die mich

stets voll und ganz bei meiner Arbeit unterstützte.

VIII

III. Inhaltsverzeichnis

I. Eidesstattliche Erklärung ......................................................................................................................... V

II. Danksagung ................................................................................................................................................ VI

III. Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................................... VIII

IV. Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................................... XIII

V. Zusammenfassung ................................................................................................................................. XIV

V. Abstract .................................................................................................................................................... XVII

1. Einleitung ................................................................................................................................................. 1

1.1. Biokatalyse ....................................................................................................................................... 1

1.2. N-Heterozyklen .............................................................................................................................. 2

1.2.1. N-Heterozyklen als Pharmabausteine ............................................................................... 3

1.2.2. Piperazine .................................................................................................................................... 4

1.3. Enzymatische Bildung von chiralen N-Heterozyklen ...................................................... 6

1.4. Iminreduktasen .............................................................................................................................. 7

1.4.1. Reaktionsmechanismus .......................................................................................................... 9

1.4.2. IRED katalysierte Reaktionen............................................................................................ 11

1.4.3. Promiskuitive, iminreduzierende Enzymaktivitäten ............................................... 13

1.4.4. Enzymkaskaden mit Iminreduktasen ............................................................................ 14

2. Motivation ............................................................................................................................................ 16

3. Material und Methoden ................................................................................................................. 17

3.1. Materialien .................................................................................................................................... 17

3.1.1. Chemikalien .............................................................................................................................. 17

3.1.2. Vewendete Enzyme ............................................................................................................... 17

3.1.3. Verwendete Kits ..................................................................................................................... 18

3.1.4. Verwendete Plasmide ........................................................................................................... 18

3.1.5. Verwendete Mutagenese-Primer ..................................................................................... 19

IX

3.1.6. Verwendete E. coli Stämme ................................................................................................. 21

3.1.7. Verwendete Puffer und Lösungen .................................................................................... 22

3.2. Molekularbiologische Methoden ........................................................................................... 24

3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................................... 24

3.2.2. Klonierung mittels Gibson assembly ................................................................................ 25

3.2.3. Ortsgerichtete Mutagenese mittels Gibson assembly ................................................ 25

3.2.4. Ortsgerichtete Mutagenese mittels QuikChangeTM .................................................... 26

3.2.5. Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................................ 26

3.2.6. Herstellung chemisch kompetenter Zellen ................................................................... 27

3.2.7. Hitzeschocktransformation von E. coli Zellen ............................................................. 27

3.2.8. Plasmidisolierung aus E. coli .............................................................................................. 28

3.2.9. DNA-Sequenzierung ............................................................................................................... 29

3.3. Kultivierung und Protein-Expression ................................................................................. 29

3.3.1. Verwendete Kulturmedien .................................................................................................. 29

3.3.2. Expression von IREDs im Schüttelkolben ..................................................................... 30

3.3.3. Expression von PuOs im Schüttelkolben ....................................................................... 31

3.3.4. Toxizitätsstudie in E. coli JW5510 .................................................................................... 31

3.4. Proteinreinigung und Validierung ........................................................................................ 32

3.4.1. Zellaufschluss ........................................................................................................................... 32

3.4.2. Co2+-basierte Affinitätschromatographie ...................................................................... 32

3.4.3. Proteinkonzentrationsbestimmung ................................................................................ 34

3.4.4. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ................................................. 34

3.5. Bestimmung der Enzymaktivität........................................................................................... 35

3.5.1. Photometrischer NAD(P)H-Assay für IREDs ................................................................ 35

3.5.2. Photometrische Analyse kinetischer Parameter für IREDs .................................... 37

3.5.3. Photometrischer NAD(P)H -Assay für Alkoholdehydrogenasen .......................... 38

3.5.4. Photometrischer H2O2-basierter Assay für Oxidasen ............................................... 39

X

3.5.5. In vitro Biotransformationen mit IREDs ....................................................................... 40

3.5.6. In vitro Biotransformationen mit kontinuierlicher Substratzugabe .................. 43

3.5.7. In vitro Biotransformationen mit Enzymkaskaden ................................................... 44

3.6. In vivo Biotransformation in E.coli JW5510 ..................................................................... 46

3.7. Probenaufarbeitung (Extraktion und Derivatisierung) ............................................... 46

3.8. Screening-Systeme ..................................................................................................................... 50

3.8.1. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter

Kofaktorspezifität .................................................................................................................................... 50

3.8.2. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit erhöhter

Aktivität für Substrate mit niedriger Anfangsaktivität ............................................................. 52

3.8.3. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter

Stereoselektivität ..................................................................................................................................... 54

3.9. Analytische Methoden .............................................................................................................. 55

3.9.1. Gaschromatographie (GC) .................................................................................................. 56

3.9.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ................................................ 59

3.10. Bioinformatische Methoden ............................................................................................... 60

3.10.1. Erstellung eines Homologiemodells ........................................................................... 60

3.10.2. Docking, Energieminimierung und MD-refinements mit Yasara .................... 60

3.10.3. Multisequenzalignments ................................................................................................. 60

3.10.4. Strukturalignments ........................................................................................................... 61

4. Ergebnisse ............................................................................................................................................ 62

4.1. Asymmetrische Reduktion von zyklischen Iminen ....................................................... 62

4.1.1. Vergleich der kinetischen Parameter von R-IRED_Ms mit R-IRED_Sr für

Modellsubstrate........................................................................................................................................ 62

4.1.2. Testen neuer Iminsubstrate ............................................................................................... 63

4.2. Reduktive Aminierung .............................................................................................................. 64

4.2.1. Reduktive Aminierung mit ausgewählten Beispielsubstraten ............................. 65

4.2.2. Erweiterung des Substratspektrums durch Verwendung von Hydrazinen .... 66

XI

4.3. Doppelte reduktive Aminierung ............................................................................................ 69

4.3.1. Studien zur Aufklärung des Reaktionsweges ............................................................... 72

4.3.2. Aktivitätsvergleich mit R-IRED_Sr und S-IRED_Pe ..................................................... 74

4.3.3. Untersuchung des Substratspektrums ........................................................................... 75

4.3.4. Quantifizierung, Upscaling und Produktisolierung ................................................... 77

4.3.5. Aktivitätssteigerung durch Verwendung von Additiven ......................................... 79

4.3.6. Toxizitätsstudie ....................................................................................................................... 81

4.3.7. In vivo Biotransformationen ............................................................................................... 83

4.3.8. Verwendung von α-Ketosäureester an Stelle von Dicarbonylen ......................... 85

4.3.9. Verwendung von α-Hydroxycarbonylen an Stelle von Dicarbonylen ................ 86

4.3.10. Doppelte reduktive Hydrazinierung ........................................................................... 89

4.4. Bildung von N-Heterzyklen mithilfe von Enzymkaskaden ......................................... 91

4.4.1. Enzymkaskade mit Putrescinoxidase und IRED ......................................................... 91

4.4.2. Enzymkaskade mit Alkoholdehydrogenasen oder Alkoholoxidasen und

R-IRED_Ms ................................................................................................................................................... 95

4.5. Entwicklung von NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Varianten ...................................... 98

4.5.1. Weiterführende Untersuchung von Varianten V8 und V10 ................................ 100

4.5.2. Kristallstruktur von R-IRED_Ms-WT und R-IRED_Ms-V8 ..................................... 103

4.6. Mutationsstudie zur Identifizierung von Stereoselektivitäts-bestimmenden

Aminosäurepositionen ........................................................................................................................ 104

5. Diskussion .......................................................................................................................................... 111

5.1. Charakterisierung von R-IRED_Ms..................................................................................... 111

5.2. Reduktive Hydrazinierung.................................................................................................... 113

5.3. Doppelte reduktive Aminierung ......................................................................................... 115

5.4. Doppelte reduktive Hydrazinierung ................................................................................. 119

5.5. Verwendung von Additiven zur Steigerung der Enzymaktivität ........................... 119

5.6. IRED katalysierte Reaktion von α-Hydroxycarbonylen mit Diaminen ............... 120

XII

5.7. Änderung der Kofaktorspezifität ........................................................................................ 121

5.8. Änderung der Stereoselektivität......................................................................................... 126

6. Ausblick ............................................................................................................................................... 131

7. Anhang .................................................................................................................................................. 133

7.1. Archivierte Plasmide ............................................................................................................... 133

7.2. Aminosäure- und DNA-Sequenzen .................................................................................... 133

7.2.1. DNA-Sequenz der R-selektiven Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus .... 133

7.2.2. Aminosäure-Sequenz der R-selektiven Iminreduktase aus Myxococcus

stipitatus (WT) ........................................................................................................................................ 134

7.2.3. Aminosäure-Sequenz der NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Variante V8 .......... 134

7.2.4. Aminosäure-Sequenz der NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Variante V10 ........ 134

7.2.5. Aminosäure-Sequenz von R-IRED_Ms-Variante 44A2 (veränderte

Stereoselektivität) ................................................................................................................................. 135

7.2.6. Plasmidkarte von pBAD33_R-IRED_Ms-His6 ............................................................ 135

7.3. Beispielhafte SDS-Gele ............................................................................................................ 136

7.4. Beispielhafte Chromatogramme ......................................................................................... 137

7.5. Mögliche Substratorientierungen für die Bildung von enantiokomlementären

Produkten ................................................................................................................................................. 140

8. Literaturverzeichnis ..................................................................................................................... 141

9. CURRICULUM VITAE ...................................................................................................................... 152

XIII

IV. Abkürzungsverzeichnis

Å Ångström 1 Å = 10−10 m HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatograohie

ABTS 2,2-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)

HRP horseradish peroxidase

ACN Acetonitril IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

ADH Alkoholdehydrogenase IRED Iminreduktase

ADP Adenosindiphosphat kb Kilobasen

AO Alkoholoxidase KBE Koloniebildende Einheiten

APS Ammoniumpersulfat kDa Kilodalton

ATP Adenosintriphosphat Kpi Kaliumphosphat

AU Absorptionseinheiten LB lysogeny broth

β-HAD β-Hydroxysäuredehydrogenase M Molar (mol L-1)

BCA Bicinchoninsäure MeOH Methanol

BSA bovine serum albumin MD molecular dynamics

C Kohlenstoff MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure

CMC Kritische Mizellbildungskonzentration MS Massenspektrometrie(-Detektor)

Co Cobalt MTBE tert-Butyl-Methylether

CV Säulenvolumen N Stickstoff

DAD Diodenarray-Detektor NAD(P)H Nikotinamidadenindinukleotid(phosphat)

DCM Dichlormethan NH3 Amoniak

ddH2O Doppelt deionisiertes Wasser NMR Kernspinresonanz(-Messung)

de Diastereomerenüberschuss O2 Molekularer Sauerstoff

DHFR Dihydrofolatreduktase OD600 Optische Dichte bei λ = 600 nm

DMSO Dimethylsulfoxid P2CR Pyrrolin-2-carboxylatreduktase

DNA Desoxyribonukleinsäure PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat PCR Polymerasenkettenreaktion

dr Diastereomerenverhältnis PDB Proteindatenbank

DRR Dihydroreticulinreduktase PEG Polyethylenglycol

DTT Dithiothreitol PP Pyrophosphat

E. coli Escherichia coli PuO Putrescinoxidase

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure rr Regioisomerenverhältnis

ee Enantiomerenüberschuss RT Raumtemperatur

ELAA Ethyl-4-chloroacetoacetat SDS Natriumdodecylsulfat

EtOH Ethanol SDR short chain dehydrogenase/reductase

F420 Koenzym F420 SH Lösliche Hydrogenase

FDH Formiatdehydrogenase TAE TRIS-Acetat-EDTA

FE Flächeneinheiten TB Terrific Broth

FID Flammenionisationsdetektor TIRED Thiazolinyl Iminreduktase

G6P Glukose-6-phosphat TOF turnover frequency

G6PDH Glukose-6-phosphatdehydrogenase TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethan

GC Gaschromatograph(ie) U Unit (1 U ≙ 1µmol min-1)

H2 Molekularer Wasserstoff WT Wildtyp

H2O2 Wasserstoffperoxid

XIV

V. Zusammenfassung

Gesättigte N-Heterozyklen sind sehr gefragte Verbindungen, die als Bausteine für die

Synthese von Pharmazeutika und Agrochemikalien eingesetzt werden. Insbesondere die

Bereitstellung von chiralen Vorstufen gilt in der organischen Chemie als sehr

herausfordernd. Immer häufiger setzt man deshalb Biokatalysatoren ein, welche sich

durch ihre exzellente Stereo-, Regio- und Chemoselektivität auszeichnen. Für die

enzymvermittelte Generierung von chiralen, gesättigten N-Heterozyklen sind nur

wenige Enzyme bekannt, von denen die meisten zu spezifisch sind, um sie abseits ihrer

natürlichen Funktion einzusetzen. Iminreduktasen (IREDs) hingegen erwiesen sich in

letzter Zeit als sehr vielversprechende Biokatalysatoren mit vergleichsweise breitem

Substratspektrum. Die Entwicklung von neuen und bereits bestehenden IRED-basierten

Biotransformationen zur Herstellung chiraler N-Heterozyklen ist deshalb ein

Forschungsgebiet mit großem Potenzial.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Reaktions- und Produktspektrum von IREDs

erheblich erweitert werden. Die Entwicklung von neuen Methoden und die Erschließung

neuer Substratfamilien ermöglichte die Bildung von N-Heterozyklen, welche zuvor

enzymatisch nicht zugänglich waren. Erstmals wurde eine IRED katalysierte, doppelte

reduktive Aminierung angewendet, bei welcher Diamine und Dicarbonyle zu Piperazin

Heterozyklen oder Piperazin-ähnlichen Produkten umgesetzt wurden. Die verwendeten

Substratgruppen stellen hochreaktive Substanzen dar, welche ohne die Anwesenheit

von IREDs rasch zu diversen Nebenprodukten abreagieren. Durch die Verwendung von

IREDs konnte die Nebenproduktbildung hingegen fast vollständig unterdrückt werden,

da die Substrate kontrolliert und mit hoher Aktivität umgesetzt wurden. Dabei konnten

ausgezeichnete Produktbildungen von bis zu > 99%, sowie Stereoselektivitäten von bis

zu > 99% und Regioselektivitäten von bis zu > 99% erreicht werden. Die Durchführung

von spezifischen Kontrollexperimenten führte außerdem zu ersten Hinweisen bezüglich

der Abfolge der einzelnen Katalyseschritte. Eine besonders hohe Aktivität und ein sehr

breites Substratspektrum gegenüber dieser neuartigen Applikation wurde bei der

R-selektiven IRED aus Myxococcus stipitatus (R-IRED_Ms) festgestellt. So konnten 84

verschiedene Produkte gebildet werden. Neben Piperazinen konnten auch

Homopiperazine (Diazepane), sowie bi- und trizyklische Produkte gebildet werden.

Dabei war es möglich an allen sechs Positionen des Piperazinrings unterschiedliche

XV

Substituenten einzuführen. In Up-Scaling Experimenten mit 50 mM Substrat konnten bis

zu 8,1 g L-1 Produkt gebildet und eine isolierte Ausbeute von bis zu 87% erreicht

werden.

Durch die Kombination von α-Hydroxycarbonylen mit Diaminen, sowie durch die

Verwendung von Hydrazinen anstelle von Diaminen, konnte das Substrat- und

Produktspektrum zusätzlich erweitert werden. So konnte beispielsweise erstmals

(S)-2-Hydroxymethylpiperazin ausgehend von Dihydroxyaceton und Ethylendiamin

gebildet werden. Des Weiteren gelang die Bildung von Hexahydropyridazinen und

1,2-Diazepanen mit Hilfe von Hydrazinen und Dicarbonylen.

Weitere sehr bedeutsame N-Heterozyklen sind Pyrrolidine und Piperidine. Durch die

Anwendung einer Enzymkaskade mit einer Putrescinoxidase und einer IRED konnten

verschiedene 1‘-, 2‘- und 3‘-substituierte Pyrrolidine und Piperidine ausgehend von

Diaminen gebildet werden. Dabei konnten Produktbildungen von bis zu 99% und

Stereoselektivitäten von bis zu 93% (ee) erreicht werden. Auf diesem Weg gelang auch

die Bildung von N-Methylpyrrolidin, welches ein tertiäres, zyklisches Aminprodukt ist

und durch andere alternative Enzymkaskaden bislang nicht zugänglich war.

Ein weiterer Schritt zur Verbesserung der Anwendbarkeit von IREDs war die

Generierung einer NADH-abhängigen IRED-Variante. Bislang sind nur NADPH-

abhängige IREDs bekannt, jedoch hat die Verwendung von NADH gegenüber NADPH

einige Vorteile. So ist NADH deutlich günstiger und stabiler als NADPH. Außerdem

stehen effizientere und kostengünstigere Kofaktor-Regenerationssysteme zur

Verfügung.

Durch die Mutagenese der Aminosäurereste an den Positionen N32, R33, T34, K37, L67

und T71 in R-IRED_Ms, sowie durch die photometrische Untersuchung von über 1800

Kolonien konnten einige vielversprechende Varianten identifiziert werden. Die besten

Varianten V8, V9 und V10 zeigten eine bis zu 2900-fach gesteigerte NADH/NADPH

Spezifität, sowie bis zu 100% Aktivität mit NADH verglichen mit dem Wildtypenzym und

NADPH.

Die durchgeführten Studien mit R-IRED_Ms zeigen ein einzigartiges Reaktions- und

Substratspektrum. Für einige Pharmabausteine wird jedoch eine enantiokomplementäre

IRED benötigt, um das gefragte Produktenantiomer zu bilden. Eine S-selektive IRED mit

XVI

ähnlichen Eigenschaften zu finden könnte jedoch sehr aufwendig sein. Es wurde deshalb

versucht die Stereoselektivität von R-IRED_Ms durch enzyme engineering zu ändern, in

der Hoffnung, dass die Eigenschaften gegenüber dem Substrat- und Reaktionsspektrum

erhalten bleiben. In einem enantio-sensitiven Screening mit über 3000 Kolonien konnte

eine neue Region identifiziert werden, welche einen starken Einfluss auf die

Stereoselektivität des Enzyms hat. Die Variante 44A2 mit fünf Mutationen in dieser

Region zeigte einen Enantiomerenüberschuss von 91% (S) gegenüber der Bildung von

2-Methylpyrrolidin. Im Vergleich zum Wildtyp (>99% R) wurde die Stereoselektivität

somit fast vollständig umgekehrt. Es zeigte sich, dass die eingeführten Aminosäurereste

in Variante 44A2 eine substratspezifische Stereoselektivitätsänderung bewirken. Es

konnte jedoch noch nicht geklärt werden, welche Interaktionen letztendlich für die

substratabhängige Änderung der Selektivität verantwortlich sind.

Insgesamt konnte durch diese Arbeit die Anwendbarkeit und das Verständnis gegenüber

IREDs verbessert werden. Die Entwicklung von neuen Methoden und Reaktionen, sowie

die Mutagenesestudien zeigen, dass IREDs sehr vielseitige Biokatalysatoren mit

erstaunlichen Fähigkeiten sind. Vor allem für die Bildung von N-Heterozyklen weisen sie

ein großartiges Potenzial auf, das im Bereich der Biokatalyse bislang einzigartig ist und

in Zukunft stark an Bedeutung gewinnen könnte.

XVII

V. Abstract

Saturated N-heterocycles are highly demanded compounds that are used as building

blocks for the synthesis of pharmaceuticals and agrochemicals. In particular, the

provision of chiral precursors is very challenging in organic chemistry. Therefore,

biocatalysts with excellent stereo-, regio- and chemoselectivity are increasingly used.

Only a few enzymes are known for the enzyme-mediated generation of chiral, saturated

N-heterocycles. Most of them are very specific demonstrating activity towards the

natural substrates. In contrast, imine reductases (IREDs) have recently proven to be

very promising biocatalysts with a broad substrate scope. Therefore, the development of

new and existing IREDs for the production of chiral N-heterocycles is a field of research

with great potential.

In this work, the reaction and product spectrum of IREDs could be considerably

expanded. The development of new methods and the use of new substrate families

enabled the formation of N-heterocycles, which were previously not accessible by

biocatalytic approaches. For the first time, an IRED-catalyzed double reductive

amination was applied, in which diamines and dicarbonyls were directly converted to

piperazine heterocycles or piperazine-like products. The used substrates represent

highly reactive substances which rapidly react, without the presence of IREDs, to various

by-products. By using IREDs, however, the by-product formation could be almost

completely suppressed because the substrates were controlled and reacted with high

activity. Excellent product formations of up to > 99%, stereoselectivities of up to > 99%

as well as regioselectivities of up to > 99% were achieved. The performance of specific

control experiments also led to initial indications regarding the sequence of the

individual catalysis steps. Particularly high activity and a broad substrate spectrum were

observed for the R-selective IRED from Myxococcus stipitatus (R-IRED_Ms). Thus 84

different products could be formed. In addition to piperazines and homopiperazines

(diazepanes), bi- and tricyclic products could also be generated. Thereby, it was possible

to introduce different substituents at all six positions of the piperazine moiety. In up-

scaling experiments with 50 mM substrate, up to 8.1 g L-1 product could be formed, and

an isolated yield of up to 87% could be achieved.

XVIII

The combination of α-hydroxycarbonyls with diamines, as well as the use of hydrazines

instead of diamines, further expanded the substrate and product spectrum. For example,

(S)-2-hydroxymethyl piperazine could be formed for the first time from

dihydroxyacetone and ethylenediamine. Furthermore, hexahydropyridazines and

1,2-diazepanes were formed from hydrazines and dicarbonyls.

Other very important N-heterocycles are pyrrolidines and piperidines. By applying an

enzyme cascade combining a putrescine oxidase with an IRED, different 1'-, 2'- and 3'-

substituted pyrrolidines and piperidines could be formed from diamines. Product

formations of up to 99% and stereoselectivities of up to 93% (ee) could be achieved. In

this way, the formation of N-methyl pyrrolidine, which is a tertiary cyclic amine product

and has not been accessible through other alternative enzyme cascades, was also

successfully generated.

A further step to improve the applicability of IREDs was the generation of an NADH-

dependent IRED variant. So far only NADPH-dependent IREDs are known, but the use of

NADH has some advantages over NADPH. NADH is much cheaper and more stable than

NADPH. Besides, more efficient and cost-effective cofactor regeneration systems are

available.

By mutagenesis of amino acid residues at positions N32, R33, T34, K37, L67 and T71 in

R-IRED_Ms, and by photometric analysis of over 1800 colonies, promising variants could

be identified. The best variants V8, V9, and V10 showed up to 2900-fold increased

NADH/NADPH specificity and up to 100% activity with NADH compared to wild type

enzyme and NADPH.

The studies performed with R-IRED_Ms show a remarkable reaction and substrate

spectrum. However, for some pharmaceutical building blocks, enantiocomplementary

IREDs are required to form the desired S- as well as R-product enantiomers. In this light,

finding an S-selective IRED with similar properties remains challenging. As an

alternative, the stereoselectivity of R-IRED_Ms was changed with enzyme engineering. In

an enantio-sensitive screening with over 3000 colonies, a new region could be

identified, which has a strong influence on the stereoselectivity. The variant 44A2 with

five mutations in this region showed an enantiomeric excess of 91% (S) for the

formation of 2-methylpyrrolidine. Thus, the stereoselectivity was almost completely

reversed compared to the wild type (> 99% R). By further experiments, it was shown

XIX

that the amino acid residues introduced in variant 44A2 caused a substrate-specific

change in stereoselectivity. However, it has not yet been clarified, which specific

interactions are responsible for the substrate-dependent change in selectivity.

Overall, this work improved the applicability and understanding of IREDs. The

development of new methods and reactions as well as the mutagenesis studies show

that IREDs are very versatile biocatalysts with incredible capabilities. Especially for the

formation of N-heterocycles, they show great potential, which is unique in the field of

biocatalysis and could gain more and more importance in the future.

Einleitung

1

1. Einleitung

Der weltweite Bedarf an Feinchemikalien ist enorm. Insbesondere in der

pharmazeutischen Industrie werden ständig neue komplexe chemische Bausteine

benötigt, sodass auch neue Herstellungsverfahren entwickelt werden müssen.[1]

Besonders herausfordernd ist dabei der Umstieg auf nachwachsende Rohstoffe, da die

meisten etablierten chemischen Prozesse auf fossilen Ressourcen basieren.[2,3]

Außerdem müssen für die Herstellung von komplexen Feinchemikalien oft zahlreiche

Prozessschritte mit teils niedriger Effizienz und hohem Energiebedarf angewendet

werden, was die Nachhaltigkeit zusätzlich verschlechtert.[4] Die Nachfrage für

alternative, bioökonomische Prozesse ist deshalb sehr hoch, sodass chemische

Verfahren zunehmend durch biotechnologische Ansätze ersetzt werden.[5–7] Die

Verwendung von Enzymen oder ganzen Zellen als Biokatalysatoren gewinnt deshalb in

den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung.[8–15]

1.1. Biokatalyse

Im Fokus der Biokatalyse stehen Enzyme und deren Fähigkeit spezifische Reaktionen

katalysieren zu können.[16,17] Es handelt sich somit um ein naturwissenschaftliches Feld,

das die Fachbereiche Biotechnologie und Chemie verbindet. Der größte Vorteil von

enzymvermittelten Reaktionen gegenüber chemischen Reaktionen ist die meist hohe

natürliche Selektivität von Enzymen. So können chemo-, regio- und stereoselektive

Biotransformationen gewährleistet werden.[18–21] Des Weiteren bietet eine

biokatalytische Applikation die Möglichkeit zu nachhaltigeren und

umweltfreundlicheren Prozessen.[7,22,23] Weitere Vorteile sind die Evolvierbarkeit und

Kombinierbarkeit von Enzymen.[18,24] Dennoch gibt es auch einige Nachteile von

Biokatalysatoren gegenüber chemischen Katalysatoren. Die Verfügbarkeit von Enzymen

ist beschränkt und häufig weisen sie ein vergleichsweise schmales Substratspektrum

auf.[17] Auch die Stabilität und Aktivität von Enzymen unter nicht natürlichen

Gegebenheiten ist oft ein limitierender Faktor.[25] Einige Enzyme sind außerdem

abhängig von teuren Kofaktoren, sodass diese in einem Prozess bereitgestellt werden

müssen.[17] Durch den Einsatz von Ganzzellsystemen oder enzymatischen Kofaktor-

Regenerationssystemen kann die Bereitstellung von Kofaktoren zwar deutlich reduziert

werden,[26–29] jedoch ist dies nicht immer erfolgreich.

Einleitung

2

Weltweit arbeiten Forschergruppen an der Verbesserung von biokatalytischen

Systemen um die Anwendbarkeit von Enzymen zu verbessern. Durch ein sogenanntes

„enzyme engineering“ können einige der erwähnten Schwachstellen adressiert werden.

Die zur Verfügung stehenden Technologien für die Entwicklung von Enzymen haben

sich in den letzten Jahren maßgeblich verbessert, was zuletzt sogar zur Verleihung des

Chemienobelpreis an Prof. Frances H. Arnold geführt hat.[30] Das Prinzip beim enzyme

engineering ist die zyklische Anwendung von Mutagenese, Genexpression und Selektion,

um die Eigenschaften von Enzymen gezielt zu verändern.[31–34] Zahlreiche Studien

zeigen, dass beispielsweise Stabilität und Aktivität deutlich verbessert werden

können.[35,36] Auch das Substratspektrum und die Selektivität von Enzymen kann über

ein enzyme engineering verändert und erweitert werden.[37–41] Zusätzlich sorgt die

Identifizierung neuer natürlich vorkommender Enzyme für eine stetig steigende

Verfügbarkeit von Biokatalysatoren. Auch die Entwicklung nicht natürlicher

Enzymaktivitäten,[42–44] sowie die Entwicklung von artifiziellen Enzymen (denovo

design)[45] tragen dazu bei, dass immer mehr neue und verbesserte Enzymsysteme für

industrielle Applikationen zur Verfügung stehen.[13]

1.2. N-Heterozyklen

N-Heterozyklen sind zyklische organische Verbindungen, deren Ringsysteme neben

Kohlenstoffen aus mindestens einem Stickstoffatom bestehen. Solche Verbindungen sind

in der Natur weit verbreitet und für Organismen jeglicher Art lebensnotwendig.[46] Das

Vorkommen von N-Heterozyklen in Lebewesen ist breit gefächert. Essentielle

Komponenten sind z.B. die Pyrimidin- und Purinbasen der DNA, die Aminosäuren Prolin,

Histidin und Tryptophan, sowie verschiedene Porphyrine und andere Kofaktoren.

Daneben gibt es eine Vielzahl an komplexen Sekundärmetaboliten, bei denen

N-Heterozyklen als Grundbausteine auftreten.[47] Solche Verbindungen machen einen

Großteil der sogenannten Alkaloide aus und haben typischerweise sehr spezifische

biologische Wirkungen.[48,49] Besonders bekannt sind beispielsweise einige Opioide,

welche durch ihre spezifische Bindung an verschiedenen Rezeptoren des

Nervensystems eine schmerzlindernde Wirkung erzeugen.[50] Über 20.000 Alkaloide

sind bereits beschrieben worden.[51] Die meisten dieser Verbindungen enthalten die im

Folgenden abgebildeten N-Heterozyklen (Abb.1).[49,52]

Einleitung

3

Abbildung 1: Häufig auftretende N-Heterozyklen in Alkaloiden. Die wichtigsten Alkaloid-Gruppen wurden anhand der strukturellen Verwandtschaft (ohne Berücksichtigung des Biosynthesewegs) zugeordnet. Weitere wichtige Alkaloid-Gruppen sind die Phenylethylamino-Alkaloide, welche in der Regel keinen N-Heterozyklus enthalten, sowie die Terpenoid- und Stereoid-Alkaloide, welche nicht zu einem bestimmten N-Heterozyklus zugeordnet werden können.

1.2.1. N-Heterozyklen als Pharmabausteine

Auch in der Entwicklung von pharmazeutischen Wirkstoffen macht man sich die

biologische Wirksamkeit von N-Heterozyklen zu Nutze. So enthalten drei Viertel der 120

umsatzstärksten niedermolekularen Pharmazeutika aus 2018 einen N-Heterozyklus.[53]

Ein wichtiger Ausgangspunkt für nachfolgende Syntheseschritte in der Herstellung von

pharmazeutischen Wirkstoffen ist deshalb die Bildung eines N-Heterozyklus. Hierfür

existieren teilweise gut etablierte chemische Verfahren. Häufig werden vor allem fünf-

und sechsgliedrige Heterozyklen mit unterschiedlichen Sättigungsgraden benötigt

(Abb.2).[54] Die chemische Herstellung aromatischer N-Heterozyklen kann z.B. über eine

Paal-Knorr- Synthese[55] oder eine Michael-Addition[56] erfolgen. Für nicht aromatische

N-Heterozyklen existieren andere chemische Verfahren, die häufig miteinander

kombiniert werden müssen. Der mehrstufige Prozess beinhaltet dabei zum Beispiel

Metall katalysierte Zyklisierungen, C-H-Aminierungen, Hydroaminierungen, Ring-

Transformationen, oder Imin- bzw. Enamin- Reduktionen.[57–59]

Einleitung

4

Abbildung 2: Die fünf häufigsten N-Heterozyklen bezogen auf 640 N-heterozyklische Pharmazeutika (modifiziert nach E. Vitaku et al.).[54] Neben Pyridinen (blau, aromatisch) zählen vier nicht aromatische N-Heterozyklen (Piperidine, Piperazine, Cepheme, Pyrrolidine, rot) zu den fünf häufigsten Vertretern. Der angegebene prozentuale Anteil bezieht sich auf die 640 analysierten N-heterozyklischen Pharmazeutika (zugelassen in den USA).

Eine zusätzliche Herausforderung sind C-substituierte gesättigte Heterozyklen, da bei

diesen Verbindungen Stereozentren existieren. Somit müssen stereoselektive Verfahren

eingesetzt werden um ein pharmazeutisches Endprodukt mit möglichst hoher

Enantiomerenreinheit zu erhalten.[60] Dies ist jedoch in einem rein chemischen Prozess

meist aufwendig und nur mit Hilfe von aufwendigen Verfahren oder teuren

Katalysatoren realisierbar.[57,58,61,62] Die Identifizierung und Entwicklung von Enzymen

zur biokatalytischen Herstellung von chiralen N-Heterozyklen ist daher eine

vielversprechende Alternative.

1.2.2. Piperazine

Piperazine sind privilegierte Bausteine der Pharmaindustrie, welche in über 6% aller

oral verabreichten Medikamente enthalten sind.[63,64] Damit gilt Piperazin als der dritt

häufigste Heterozyklus in allen Pharmazeutika.[54,65] Umso erstaunlicher ist es, dass

Piperazine in der Natur quasi nicht vorkommen. Nur eine Hand voll Piperazin-haltiger

Naturstoffe konnten bislang gefunden werden.[66–71] Die Biosynthese dieser Stoffe lässt

sich nach derzeitigem Wissensstand auf die Dimerisierung von Aminoaldehyden bzw.

Aminosäuren zurückführen.[66,68,70] Hierfür spricht vor allem eine symmetrische

Anordnung der Substituenten an Position 2 und 5 des Piperazinrings, sowie die

Aufklärung des Biosynthesewegs von Herquilin A in Penicillium herquei.[66] Im Gegensatz

zur natürlichen Bildung von Piperazin gibt es zahlreiche chemische Verfahren zur

Bildung von Piperazinen, welche sich aufgrund der hohen Nachfrage etabliert haben.

Einleitung

5

Neben der Reduktion von Pyrazinen oder Diketopiperazinen werden auch Metall-

vermittelte oder Metall-katalysierte Zyklisierungsreaktionen angewendet.[64,72–79]

Bekannte Beispiele für Piperazin-haltige Pharmazeutika sind das Bruskrebs-

Medikament Palbociclib, die Leukämie-Medikamente Dasatinib und Imatinib, die

Schizophrenie-Medikamente Aripiprazol und Brexpiprazol, das Herzmedikament

Ranolazin oder das Potenzmittel Sildenafil.[53] Besonders häufig weisen Piperazin-

haltige Verbindungen psychoaktive Wirkungen auf, sodass einige Piperazinvorstufen

auch für die Herstellung von verschiedenen Drogen missbraucht werden.[80]

Meistens werden Piperazine ohne C-Substituenten als Vorstufe benötigt. Doch auch

chiral substituierte Piperazine werden immer häufiger in der Entwicklung von

Pharmazeutika eingesetzt.[81–86] Bekannte Beispiele sind die HIV-Medikamente Indinavir

und Vicriciroc, das Antidepressivum Mirtazapin, das Beruhigungsmittel Vestipiant oder

das Antibiotikum Sparfloxacin (Abb.3).[87–91] Hier werden chirale C-substituierte

Piperazine als Pharmabausteine benötigt, deren chemische Bereitstellung sehr

herausfordernd ist.[73,92]

Abbildung 3: Beispiele für bekannte Pharmazeutika, bei welchen chirale C-substituierte Piperazine (rot markiert) als Vorstufe benötigt werden.

Einleitung

6

1.3. Enzymatische Bildung von chiralen N-Heterozyklen

Aufgrund der signifikanten Präsenz von N-Heterozyklen in Lebewesen, gibt es

zahlreiche Enzyme die bei deren Biosynthese beteiligt sind. Dabei sind für eine

biotechnologische Applikation vor allem solche Enzyme interessant, die die Bildung von

chiralen N-Heterozyklen ermöglichen. In den meisten bekannten Biosynthesewegen

werden hierfür Reduktasen eingesetzt, welche die stereoselektive Reduktion eines

prochiralen zyklischen Imins katalysieren. Ein sehr bekanntes Beispiel hierfür findet

man im Primärstoffwechsel in der Biosynthese von L-Prolin.[93–95] Wie alle

proteinogenen Aminosäuren wird auch L-Prolin mit einer exzellenten

Enantiomerenreinheit gebildet. In manchen Biosynthesewegen wird das Stereozentrum

schon durch die Vorstufe L-Ornithin oder L-Glutaminsäure vorgegeben. Besonders

interessant ist jedoch die Biosynthese mittels Pyrrolidin-2-carboxylatreduktase (P2CR).

Dieses Enzym ist in der Lage eine prochirale zyklische Imin-Zwischenstufe

stereoselektiv zu reduzieren, sodass ausschließlich L-Prolin entsteht (Abb.4, A).[96] Die

P2CR gehört zu der Familie der Ketimin-Reduktasen, welche auch für die Reduktion von

weiteren zyklischen Iminen genutzt werden können. Jedoch sind sie auf Substrate mit

einem 2‘-Carboxylsubstituent angewiesen.[97,98]

Daneben sind ein paar Enzyme des Sekundärstoffwechsels bekannt, welche ebenfalls die

Reduktion von zyklischen Iminen katalysieren. Ein Beispiel ist die

Dihydrofolatreduktase (DHFR), welche die selektive Reduktion von 7,8-Dihydrofolat zu

(S)-5,6,7,8-Tetrahydrofolat katalysiert (Abb.4, B).[99] Die Thiazolinyl Iminreduktase

(TIRED) katalysiert die Reduktion eines Thiazolinrings in der Biosynthese der

Siderophore Pyochelin und Yersiniabactin (Abb.4, C).[100,101] Auch in der Biosynthese

von Morphin wird ein zyklisches Imin reduziert. Hier katalysiert die

Dihydroreticulinreduktase (DRR) die Reduktion eines Dihydroquinolinrings

(Abb.4, D).[102,103] Ein weiteres Enzym, das an dieser Stelle zu erwähnen ist, ist die F420-

abhängige Reduktase (TomJ) im Biosyntheseweg von Tomaymycin, welche eine

Pyrrolin-ähnliche Struktur reduziert (Abb.4, E).[104] Jedoch wird bei diesem Schritt kein

Stereozentrum erzeugt.

Im Gegensatz zu diesen sehr spezifischen Enzymen (A-E) weisen Iminreduktasen

(IREDs) ein deutlich breiteres Substratspektrum auf, sodass eine Vielzahl zyklischer

Iminsubstrate selektiv reduziert werden können (Abb.4, F).[105] Die natürliche Funktion

Einleitung

7

dieser Enzymfamilie ist bislang nicht bekannt. Aufgrund des breiten Substratspektrums

ist die Beteiligung in einem einzigen spezifischen Biosyntheseweg eher

unwahrscheinlich.

Abbildung 4: Die Abbildung zeigt verschiedene bekannte Enzyme, welche die stereoselektive Reduktion von zyklischen Iminen katalysieren können und damit zur Bildung von chiralen N-Heterozyklen beitragen.

1.4. Iminreduktasen

Lange Zeit gab es kaum biokatalytische Möglichkeiten um chirale gesättigte

N-Heterozyklen herzustellen, da entsprechende Enzyme noch nicht beschrieben

Einleitung

8

wurden. Erst 2010 wurde die Enzymfamilie der Iminreduktasen (IREDs) entdeckt,

sodass neue enzymatische Ansätze möglich waren.[106] 2011 wurden die ersten IREDs

aus Streptomyces-Stämmen erfolgreich isoliert und charakterisiert.[107] Seit 2013 kennt

man außerdem die ersten Röntgenstrukturen von IREDs (Abb. 5).[108] IREDs sind

homodimere Proteine mit je einem N-terminalen NADPH-Bindemotiv

(Rossmannfaltung). Eine Besonderheit ist, dass die beiden Monomere sehr stark

ineinander verschränkt sind. Nach der N-terminalen Domäne durchdringt eine lange

α-Helix die C-terminale Domäne des jeweils anderen Monomers. Anschließend folgt der

C-terminale Teil, welcher wiederum von der langen α-Helix des anderen Monomers

durchdrungen wird. Es handelt sich also nicht um zwei Monomere, die über eine

Oberflächeninteraktion miteinander verbunden sind. Stattdessen sind die Monomere so

sehr ineinander verflochten, dass eine Dissoziation unter Beibehaltung der

Proteinfaltung kaum möglich scheint.

Abbildung 5: Darstellung der Röntgenstruktur der R-selektiven IRED aus Streptomyces kanamyceticus, welche 2013 gelöst wurde (pdb-ID = 3zhb).[108] Gezeigt ist sowohl die Sekundärstrukturdarstellung (A) als auch die Oberflächendarstellung (B). Die beiden (Homo-)Monomere sind in Grau und Beige dargestellt. Die beiden gebundenen NADP+-Moleküle sind ebenfalls gezeigt. Die Darstellung erfolgte mit Pymol.

Einleitung

9

Das aktive Zentrum wird jeweils aus der N-terminalen Domäne des einen Monomers

und der C-terminalen Domäne des anderen Monomers gebildet. Erste Hinweise weisen

darauf hin, dass es einen „offenen“ und „geschlossenen“ Zustand des aktiven Zentrums

gibt, bei welchen sich die beiden Domänen in einem unterschiedlichen Abstand

zueinander befinden.[109] Dies hängt auch davon ab, ob NADPH gebunden ist oder nicht.

Die Kristallstrukturen von unterschiedlichen Enzymkonformationen bestätigen, dass

das aktive Zentrum einer starken Dynamik unterliegt.[109]

Die Funktionen der konservierten Aminosäurereste im aktiven Zentrum sind bislang

weitestgehend ungeklärt. Die Position 171 (Nummerierung bezogen auf die R-selektive

IRED aus Myxococcus stipitatus, R-IRED_Ms) wurde bereits mehrfach als katalytisch

aktive Aminosäure beschrieben. Sie befindet sich auf der gleichen Domäne wie die

NADPH Bindetasche. Hier ist in den meisten R-selektiven IREDs eine Asparaginsäure

(D-Typ) und in den meisten S-selektiven IREDs ein Tyrosin (Y-Typ) konserviert.[110]

Aufgrund der Ausrichtung und der Konservierung dieser Position, vermutet man eine

Beteiligung an der Protonierung des Substrates.[108,111] Allerdings könnte die

Protonierung auch über ein aktiviertes Wassermolekül ablaufen.[105,111] Bei

Negativkontrollen mit einer Mutation an dieser Stelle wurden unterschiedliche

Beobachtungen gemacht. Häufig zeigte sich eine drastisch reduzierte Aktivität.[112]

Teilweise wurden jedoch auch erhebliche Restaktivitäten detektiert.[113] Es könnte sein,

dass die katalytische Beteiligung von Position 171 nur auf einen Teil der IREDs zutrifft.

Hierfür spricht auch die Tatsache, dass manche IREDs an dieser Stelle Aminosäuren

aufweisen, welche keine Protonierung übernehmen können (z.B. Phenylalanin, Alanin

oder Asparagin).[114]

1.4.1. Reaktionsmechanismus

Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass der Katalysemechanismus von

Iminreduktasen (Abb. 6) ähnlich wie bei den Ketoreduktasen, bzw. wie bei der

Reduktionsreaktion von Alkoholdehydrogenasen abläuft.[109,115–117]

Der entscheidende Schritt im Reaktionsmechanismus von IREDs ist der nukleophile

Angriff des Hydrids von NADPH auf den positiv teilgeladenen und damit elektrophilen

Kohlenstoff der Iminbindung. Bei diesem Schritt wird außerdem die Stereoselektivität

Einleitung

10

determiniert. Abhängig davon, ob der Angriff des Hydrids von der Re- oder Si-Seite

erfolgt, entsteht das S- oder R-Enantiomer.[118] Mit diesem Schritt verbunden ist eine

Elektronenumlagerung im Nikotinamid-Teil, sodass NADP+ entsteht. Das

π-Elektronenpaar der Imin-Doppelbindung klappt zum Stickstoff. Dieser wird

protoniert, sodass aus dem Iminsubstrat schließlich ein Aminprodukt gebildet wird.

Falls die Protonierung durch einen Aminosäurerest erfolgt, muss dieser anschließend

wieder regeneriert werden. Bevor ein weiterer Katalysezyklus durchlaufen werden

kann, muss der verbrauchte Kofaktor (NADP+) diffusiv durch NADPH ersetzt werden.

Außerdem muss das Produkt aus dem aktiven Zentrum entlassen werden, um die

Aufnahme eines neuen Substrates zu ermöglichen.

Abbildung 6: Vorgeschlagener Katalysezyklus für Iminreduktasen am Beispiel der Reduktion von 2-Methylpyrrolin zu (R)- oder (S)-2-Methylprrolidin. 1) Hydridtransfer und Protonierung; 2) Gegebenenfalls Regenerierung der katalytischen Aminosäure durch Protonierung.

Einleitung

11

1.4.2. IRED katalysierte Reaktionen

Die Reduktion von Iminen ist der namensgebende Reaktionstyp welcher durch IREDs

katalysiert wird (Abb. 7). Die Herausforderung bei Iminen ist, dass sie Hydrolyse-labil

sind und in eine Carbonyl- und Aminkomponente zerfallen können.[119] Im wässrigen

Milieu stellt sich ein pH-abhängiges Gleichgewicht zwischen dem Imin und dem

Hydrolyseprodukt ein, wobei die Hydrolyse bei hohen pH-Werten vermindert

stattfindet.[120] Azyklische Imine sind im Vergleich zu zyklischen Iminen meist deutlich

instabiler. Durch Substituenten mit einem +I- oder +M-Effekt kann die Imingruppe

stabilisiert werden.[119,121]

Die IRED katalysierte Reduktion des Imins zum Amin hat ebenfalls einen Einfluss auf

das Hydrolysegleichgewicht. Das Imin wird dem Gleichgewicht entzogen, sodass sich

dieses zu Gunsten der IRED verschiebt.

Abbildung 7: IRED katalysierte Reduktion von zyklischen bzw. azyklischen Iminen, sowie das Hydrolysegleichgewicht des Iminsubstrats. Als Beispiele wurden die Substrate 2-Methylpyrrolin (zyklisches Imin) und N-Benzylidenmethylamin (azyklisches Imin) dargestellt.

Um die Stabilität des Iminsubstrats zu gewährleisten wurden zunächst nur zyklische

Imine oder durch Phenylgruppen stabilisierte azyklische Imine eingesetzt.[107,113,122–124]

So wurden mit IREDs anfangs hauptsächlich Pyrrolidine, Piperidine,

Tetrahydroisoquinoline, Indoline oder Hexahydro-β-carboline gebildet.[112,125–127] Dabei

wurden neben zyklischen Iminen auch zyklische Iminium-Ionen eingesetzt. Später

Einleitung

12

stellte man fest, dass auch instabile Imine von IREDs umgesetzt werden können. Hierfür

setzt man jedoch nicht das Imin sondern das Carbonyl- und Aminsubstrat ein.[98,128]

Beide Substrate stehen in einem Gleichgewicht mit dem Imin, welches durch die IRED

reduziert werden kann (Abb. 8). Diese Art der Anwendung wird als reduktive

Aminierung bezeichnet und bietet extrem viele Möglichkeiten im Vergleich zur

normalen Imin Reduktion.[98,109,128–131] Im Gegensatz zu Iminsubstraten stehen

vielzählige stabile und kostengünstige Substrate zur Verfügung, welche miteinander

kombiniert werden können.[132,133]

Abbildung 8: Reaktionsschema der IRED katalysierten Iminreduktion (blau) ausgehend vom Iminsubstrat, sowie die reduktive Aminierung (orange) ausgehend vom Carbonyl- und Aminsubstrat.

Eine interessante Thematik bezüglich der reduktiven Aminierung ist auch die

Fragestellung, ob IREDs einen Einfluss auf die Kondensationsreaktion haben. Erste

Hinweise deuten darauf hin, dass zumindest manche IREDs die Fähigkeit besitzen, die

Kondensation katalytisch zu beschleunigen. Anhand von Kristallstrukturen von Enzym-

Substrat-Komplexen wurde eine Tyrosinrest-vermittelte Aktivierung der

Carbonylgruppe bei einer IRED aus Aspergillus terreus postuliert.[109] Es wird deshalb

angenommen, dass auch die Kondensationsreaktion enzymatisch beschleunigt wird,

sodass beide Reaktionsschritte der reduktiven Aminierung unter dem Einfluss der

Iminreduktase stehen. In diesem Zusammenhang wird deshalb auch die Bezeichnung

„reduktive Aminase“ anstelle von Iminreduktase verwendet.[109,132]

Auch die Rückreaktion, also die Oxidation eines Amins zu einem Imin, kann durch IREDs

katalysiert werden, wobei hierfür höhere pH-Werte (

Einleitung

13

werden. Jedoch konnte dies bislang nur für ein Substrat (2,2,2-Trifluoroacetophenon)

gezeigt werden, welches stereoselektiv zum entsprechenden Akloholprodukt umgesetzt

wurde.[135]

1.4.3. Promiskuitive, iminreduzierende Enzymaktivitäten

Abseits der IREDs wurden mittlerweile in weiteren Enzymfamilien Imin-reduzierende

Aktivitäten detektiert. Hierbei handelt es sich jedoch nicht um die natürliche Funktion,

sondern um eine promiskuitive Aktivität, welche in der Regel auch nicht sehr stark

ausgeprägt ist. Eine nah verwandte Enzymfamilie der IREDs sind die

β-Hydroxysäuredehydrogenasen.[114] Sie katalysieren normalerweise die Oxidation von

Hydroxygruppen oder die Reduktion von Carbonylgruppen. Jedoch weisen sie zusätzlich

eine, wenn auch schwache, promiskuitive Aktivität für die Reduktion von zyklischen

Iminen auf. Dies konnte am Beispiel von 2-Methylpyrrolin gezeigt werden.[115] Durch

einen gezielten Austausch einer Aminosäure im aktiven Zentrum von β-HADs konnte

diese Anfangsaktivität außerdem um das 12-fache gesteigert werden.[115]

Des Weiteren zeigt die Glutamatdehydrogenase eine reduzierende Aktivität gegenüber

Pyrrolin-2-carboxylat und Piperidin-2-carboxylat. Dabei wird ähnlich wie bei der P2CR

die stereoselektive Bildung von L-Prolin bzw. L-Pipecolinsäure beobachtet.[136] Eine

weitere promiskuitive Aktivität wurde bei der Glukosedehydrogenase gegenüber

Dihydroisoquinolin-Derivaten festgestellt.[137] Die Glukosedehydrogenase gehört zu der

großen Enzymfamilie der kurzkettigen Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs) mit über

168 000 bekannten Proteinen.[138] Es ist also wahrscheinlich, dass noch weitere Enzyme

dieser Familie existieren, die eine ähnliche promiskuitive Aktivität aufweisen.

Neben promiskuitiven Aktivitäten konnten auch schon artifizielle Enzymaktivitäten für

die Reduktion von zyklischen Iminen erzeugt werden. Dies gelang mit Hilfe von

artifiziellen Metalloenzymen.[139–141] Hierbei konnten jedoch nur moderate

Stereoselektivitäten erreicht werden.[141]

Auch für die reduktive Aminierung wurden bereits weitere Enzymfamilien gefunden,

welche diese Reaktion promiskuitiv katalysieren können. Hierzu gehört die

Opinsäuredehydrogenase, sowie die Ketiminreduktasen und die Amin

Einleitung

14

Dehydrogenasen.[142–146] Die Möglichkeiten sind im Vergleich zu IREDs jedoch deutlich

beschränkter, vor allem in der Wahl des Aminsubstrates.

1.4.4. Enzymkaskaden mit Iminreduktasen

Eine wichtige Voraussetzung für eine wirtschaftliche Anwendung von

Biotransformationen ist die Zugänglichkeit der Ausgangsverbindungen. In diesem

Zusammenhang sind Multienzymsysteme sehr förderlich.[147] So können komplexe

Strukturen schrittweise ausgehend von einfachen Verbindungen aufgebaut werden. Die

Aneinanderreihung von mehreren biokatalytischen Schritten wird dabei als

Enzymkaskade bezeichnet. Auch für die Generierung von gesättigten N-Heterozyklen

wurden bereits einige Enzymkaskaden mit IREDs entwickelt (Abb. 9).[148–151] Die

Anwendung von zusätzlichen Enzymen ermöglicht die Verwendung von sehr einfachen

linearen Ausgangsverbindungen.

Abbildung 9: Verschiedene Enzymkaskaden zur Bildung von gesättigten N-Heterozyklen ausgehend von einfachen linearen Verbindungen. Als Ausgangsverbindung können Diamine (A,B), Dicarbonyle (C) oder Ketosäuren (D) verwendet werden.

Einleitung

15

Ausgehend von Diaminen (A, B), Dicarbonylen (C) oder Ketosäuren (D) können

Aminoaldehyde in ein oder zwei Schritten enzymatisch gebildet werden. Die

Aminoaldehyde reagieren spontan unter Abspaltung von Wasser zu zyklischen Iminen,

welche schließlich durch eine IRED reduziert werden können, sodass gesättigte

N-Heterozyklen entstehen. Die abgebildeten Enzymkaskaden A, C und D konnten

außerdem auch im Ganzzell-System (E. coli) durchgeführt werden.

Die angewendete Route über eine Aminoaldehyd Zwischenstufe erinnert stark an die

natürlichen Biosynthesewege von gesättigten N-Heterozyklen. Auch hier verläuft die

Synthese in der Regel über ein Aminoaldehyd.[93,94,152–156]

Motivation

16

2. Motivation

Die Untersuchung und Entwicklung von Iminreduktasen (IREDs) führte in den letzten

neun Jahren zu beeindruckenden Ergebnissen. Vor allem durch die reduktive

Aminierung konnte die Anwendbarkeit von IREDs erheblich gesteigert werden, sodass

nun die Bildung von vielzähligen chiralen primären, sekundären und tertiären Aminen

möglich ist. Der Zugang zu N-Heterozyklen ist jedoch immer noch sehr beschränkt. Zwar

können einige zyklische Imine stereoselektiv reduziert werden, jedoch sind für viele

wichtige N-Heterozyklen entsprechende Iminvorstufen nicht verfügbar. Piperazin ist

beispielsweise der zweithäufigste gesättigte N-Heterozyklus in Pharmazeutika. Dennoch

gibt es (abseits dieser Arbeit) bislang keine biokatalytischen Methoden um Piperazine

mit unterschiedlichem Substituierungsmuster aufzubauen.

Ziel dieser Arbeit war es, den enzymatischen Zugang zu neuen N-Heterozyklen zu

schaffen. Hierfür sollten insbesondere IREDs sowie IRED-basierte Enzymkaskaden

eingesetzt werden.

Für die Anwendung von Enzymkaskaden sollten unter anderem unterschiedliche

Kofaktorregenerationssysteme in Betracht gezogen werden. Hierbei ist jedoch die

strikte NADPH Abhängigkeit von IREDs eine große Einschränkung. Um dies zu umgehen

sollte eine NADH abhängige IRED mittels ortsgerichteter Mutagenese entwickelt

werden, sodass neue Möglichkeiten eröffnet werden.

Neben Enzymkaskaden sollten auch neue Substrate und Reaktionen mit IREDs getestet

werden. Ein besonderes Augenmerk sollte dabei dem Aufbau von Piperazingerüsten

gelten, da dies sehr gefragte Pharmabausteine sind. Des Weiteren sollten analog zu

Aminen auch Hydrazine als neuartige IRED-Substrate getestet werden. Auch sollte

geprüft werden, ob sich diese für die IRED katalysierte Bildung von N-Heterozyklen

eignen.

Zuletzt sollten außerdem Aminosäurepositionen in der aktiven Tasche identifiziert

werden, welche zur Stereoselektivität von IREDs beitragen. Die identifizierten

Positionen sollten schließlich für ein beispielhaftes enzyme engineering herangezogen

werden, um die Stereoselektivität einer ausgewählten Iminreduktase vollständig

umzukehren. So sollte auch das Verständnis über die Funktion verschiedener

selektivitätsbestimmender Aminosäuren im aktiven Zentrum verbessert werden.

Material und Methoden

17

3. Material und Methoden

3.1. Materialien

3.1.1. Chemikalien

Alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben,

von den Firmen Sigma Aldrich und Fluka (Steinheim, DE), abcr GmbH (Karlsruhe, DE),

VWR (Darmstadt, DE), Thermo Fisher (Braunschweig, DE), Alfa Aesar (Karlsruhe, DE),

Fluorochem (Hadfield, UK) und Prozomix (Haltwhistle, UK) bezogen.

3.1.2. Vewendete Enzyme

Neben den selbst hergestellten Enzymen kamen auch einige kommerziell erhältliche

Enzyme zum Einsatz (Tab. 1).

Tabelle 1: Verwendete Enzyme und deren Verwendung.

Enzym Herkunft Verwendung

PfuUltraII Fusion HS DNA-Polymerase

Agilent (Santa Clara, US) PCR, QuikChange-PCR

Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase

NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly

T5-Exonuclease NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly

Taq DNA-Ligase NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly

Dpn1 NEB (Frankfurt, DE) Verdau von DNA-Templat

DNAseI (Rind) Sigma Aldrich (Steinheim, DE)

Enzymatischer Zellaufschluss

Lysozym aus Hühnereiweiß AppliChem GmbH (Darmstadt, DE)

Enzymatischer Zellaufschluss

Peroxidase (Meerrettich) AppliChem GmbH (Darmstadt, DE)

Aktivitäts-Assay für Oxidasen

Glukose-6-P-Dehydrogenase aus Leuconostoc mesenteroides

Alfa Aesar (Karlsruhe, DE) Regeneration von NADPH und NADH

Formiat-Dehydrogenase aus Candida boidinii

Sigma Aldrich (Steinheim, DE)

Regeneration von NADH


18

3.1.3. Verwendete Kits

Für verschiedene molekular- und mikrobiologische Techniken wurden

Anwendungsspezifische Kits verwendet, welche im Folgenden aufgeführt sind (Tab. 2).

Tabelle 2: Verwendete Kits und deren Verwendung.

Kit Herkunft Verwendung

ZyppyTM Plasmid Miniprep Kit

Zymo Research (Irvine, US)

Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

DNA Clean and ConcentratorTM


DNA-Reinigung

ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit


Extraktion von DNA aus einem Agarosegel

PierceTM BCATM Protein Assay Kit

Thermo Fisher (Braunschweig, DE)

Bestimmung der Gesamt-Proteinkonzentration

3.1.4. Verwendete Plasmide

Für die heterologe Expression und Herstellung von Iminreduktasen (IREDs) und

Putrescinoxidasen (PuOs) wurden drei verschiedene Expressionssysteme verwendet,

sodass auch drei verschiedene Plasmide eingesetzt wurden (Tab 3).

Tabelle 3: Verwendete Plasmide.

Plasmid Empfänger-stamm

Resistenz-marker Operon

Verwendeter Induktor

An-wendung

pET28a(+) E. coli DH5α / E. coli BL21(DE3)

Kanamycin-Resistenz

Lactose-Operon

IPTG IREDs

pBAD18[157] E. coli JW5510 Ampicillin-Resistenz

Arabinose-Operon

L(+)-Arabinose

PuOs

pBAD33[157] E. coli JW5510 Chlor-amphenicol-Resistenz

Arabinose-Operon

L(+)-Arabinose

IREDs


19

3.1.5. Verwendete Mutagenese-Primer

Für das Einfügen von zielgerichteten Mutationen wurden verschiedene Techniken

angewendet, wobei spezifische Oligonukleotide (Primer) eingesetzt wurden (Tab 4,5).

Alle Primer wurden von Metabion International AG (Planegg, DE) bezogen.

Tabelle 4: Verwendete Primer zur Generierung von R-IRED_Ms Enzymvarianten mit geänderter Kofaktorspezifität.

Ziel- Mutation

Verwen-detes Templat

Muta-genese Strategiea

Ange-wendete Technikb

Sequenz (5‘->3‘) V = vorwärts, R = rückwärts

R33X, T34X, K37X

WT 3 B V: GTGGAACHVCRMKAAAGCCDAKAGCGAACCGCTGGCAAAACTG R: GTTCGCTMTHGGCTTTMKYGBDGTTCCACACCGTGGTCGTGTAG

N32X V1 2 A V: CACGACCACGGTGTGGNNKTACGAGAAAGCC R: GGCTTTCTCGTAMNNCCACACCGTGGTCGTG

K37X V1 2 A V: GAACTACGAGAAAGCCNNKAGCGAACCGCTGGC R: GCCAGCGGTTCGCTMNNGGCTTTCTCGTAGTTC

L67X V5 2 A V: CGTGGTTAATGTGNNKGATTATGACACCTCTGATC R: GATCAGAGGTGTCATAATCMNNCACATTAACCACG

T71X V5 2 A V: GTGCTGGATTATGACNNKTCTGATCAGCTGCTGC R: GCAGCAGCTGATCAGAMNNGTCATAATCCAGCAC

L75X V8 2 A V: GACACCTCTGATCAGNNKCTGCGCCAAGACGAAG R: CTTCGTCTTGGCGCAGMNNCTGATCAGAGGTGTC

N32E V3 1 A V: CACGACCACGGTGTGGGAATACGAGAAAGCC R: GGCTTTCTCGTATTCCCACACCGTGGTCGTG

R33Y WT 1 A V: CCACGGTGTGGAACTACACCAAAGCCAAAAGCG R: CGCTTTTGGCTTTGGTGTAGTTCCACACCGTGG

R37A V8 1 A V: GAATACGAGAAAGCCGCGAGCGAACCGCTGGC R: GCCAGCGGTTCGCTCGCGGCTTTCTCGTATTC

L67I V7 1 A V: CGTGGTTAATGTGATTGATTATGACGTGTCTGATC R: GATCAGACACGTCATAATCAATCACATTAACCACG

T71V WT 1 A V: GTGCTGGATTATGACGTGTCTGATCAGCTGCTGC R: GCAGCAGCTGATCAGACACGTCATAATCCAGCAC

T71V V6 1 A V: CGTGGTTAATGTGATTGATTATGACGTGTCTGATC R: GATCAGACACGTCATAATCAATCACATTAACCACG a Folgende Mutagenesestrategien kamen zum Einsatz: 1) Punktmutation(en); 2) Sättigungsmutagenese an einer Position; 3) Kombinatorische Teilsättigungsmutagenese

an drei Positionen gleichzeitig. b Folgende Techniken zum Einführen von Mutationen wurden angewendet:

A) QuikChange™-PCR; B) Gibson assembly.

Tabelle 5: Verwendete Primer zur Generierung von R-IRED_Ms Enzymvarianten mit geänderter Stereoselektivität. Die Mutationsstelle im Primer ist grau markiert.

Ziel- Mutation

Verwen-detes Templat

Muta-genese Strategiea

Ange-wendete Technikb

Sequenz (5‘->3‘) V = vorwärts, R = rückwärts

A122V, T123P, P124A

V8 1 A V: CGGTGCGATCATG GTT CCG GCG GATTTTATTGGCCAG R: CTGGCCAATAAAATC CGC CGG AAC CATGATCGCACCG

D171Y V8 1 A V: CATGCCTCAGCACTG TAT AGCGCCCTGCTGTTTCAG R: CTGAAACAGCAGGGCGCT ATA CAGTGCTGAGGCATG

M178F V8 1 A V: CCTGCTGTTTCAG TTC TGGGGCACCCTGTTC R: GAACAGGGTGCCCCA GAA CTGAAACAGCAGG


20

Q234D, T235V, L236D

V8 1 A V: CTGACCGCAGACGCT GAT GTG GAT GCAAGTCTGGAAGG R: CCTTCCAGACTTGC ATC CAC ATC AGCGTCTGCGGTCAG

H242G V8 1 A V: CAAGTCTGGAAGCT GGT AACGTGGCGTTC R: GAACGCCACGTT ACC AGCTTCCAGACTTG

S95X, D171X

V8 3 B V: CAGCTGACC KHT GGTTCTCCGGCACTGGC R: CAGGGCGCT ADM CAGTGCTGAGGCATGACC V: CTCAGCACTG KHT AGCGCCCTGCTGTTTCAG R: CGGAGAACC ADM GGTCAGCTGAACCAGCAG

I120X, M121X

V8 3 A V: CTGGACGGTGCG KHT KHT GCCACCCCGGATTTTATTG R: CAATAAAATCCGGGGTGGC ADM ADM CGCACCGTCCAG

A122X, T123X

V8 3 A V: GACGGTGCGATCATG KHT KHT CCGGATTTTATTGGC R: GCCAATAAAATCCGG ADM ADM CATGATCGCACCGTC

L175X, M178X

V8 3 A V: GACAGCGCCCTG KHC TTTCAG KHT TGGGGCACCCTG R: CAGGGTGCCCCA ADM CTGAAA GDM CAGGGCGCTGTC

A241X, H242X

V8 3 A V: CTGGCAAGTCTGGAA KHT KHT AACGTGGCGTTCC R: GGAACGCCACGTT ADM ADM TTCCAGACTTGCCAG

V212X V8 2 A V: CTGACCGAACCG NNK ACCCAGGGTGCCGTTG R: CGGCACCCTGGGT MNN CGGTTCGGTCAGTTTG

A237X V8 2 A V: GACGCTCAGACGCTG NNK AGTCTGGAAGCTCATAAC R: GAGCTTCCAGACT MNN CAGCGTCTGAGCGTCTG

M13X V8 2 A V: GTTATTGGCGCTGGCCGT NNK GGCTCCGCACTG R: CAGTGCGGAGCC MNN ACGGCCAGCGCCAATAAC

P124X V8 2 A V: CGATCATGGCCACC NNK GATTTTATTGGCCAGGC R: GCCTGGCCAATAAAATC MNN GGTGGCCATGATCG

A245X V8 2 A V: GGAAGCTCATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTG R: CAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTATGAGCTTCC

L170X, D171Y, S172Q

V8 1+2 A V: CATGCCTCAGCACTG NNK TAC CAG GCCCTGCTGTTTCAG R: CTGAAACAGCAGGGC CTG GTA MNN CAGTGCTGAGGCATG

A245X 15B7 2 A V: GGAAGTTTATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTG R: CAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTCAAATATTCC

A241X, H242X

110D2 3 A V: CTGGCAAGTCTGGAA KHT KHT AACGTGTTGTTCC GGAACAACACGTT ADM ADM TTCCAGACTTGCCAG

A241X 15B7 2 C

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA NDT TATAACGTGGCGTTCCAACACCTGC V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA VHG TATAACGTGGCGTTCCAACACCTGC V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA TGG TATAACGTGGCGTTCCAACACCTGC R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

H242X 15B7 2 C

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT NDT AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT VHG AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT TGG AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

A241M, H242X

V8 1+2 C

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG NDT AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG VHG AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG TGG AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

E240X, N243X

15B7 3 B V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTG KHT GTTTAT KHT GTGGCGTTCCAACACCTGCTGGCC R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

V244X, F246X

110C2 3 A V: GTCTGGAAGCTCATAAC KHT TGT KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM ACA ADM GTTATGAGCTTCCAGAC

V244X, 15B7 1+3 A V: GTCTGGAAGTTTATAAC KHT TGT KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM ACA ADM GTTATAAACTTCCAGAC


21

A245C, F246X

V244X, F246X

110D2 3 A V: GTCTGGAAGCTCATAAC KHT TTG KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM CAA ADM GTTATGAGCTTCCAGAC

V244X, A245L, F246X

24E4 1+3 A V: GTCTGGAAATTTATAAC KHT TTG KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM CAA ADM GTTATAAATTTCCAGAC

A245L D171Y 1 A V: GGAAGCTCATAACGTG TTG TTCCAACACCTGCTGG R: CCAGCAGGTGTTGGAA CAA CACGTTATGAGCTTCC

A245X 24E4 2 A V: GTCTGGAAATTTATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTGG R: CCAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTATAAATTTCCAGAC

G96D, S79X

V8 1+2 A V: GTTCAGCTGACCAGC GAT NNK CCGGCACTGGCTC R: GAGCCAGTGCCGG MNN ATC GCTGGTCAGCTGAAC

T94X, G96D, S79X

V8 1+3 A V: CTGGTTCAGCTG KHT AGCGAT KHT CCGGCACTGGCTG R: CAGCCAGTGCCGG ADM ATCGCT ADM CAGCTGAACCAG

F246X 110D2 2 A V: GAAGCTCATAACGTG TTG NNK CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG MNN CAA CACGTTATGAGCTTC

A241X 23B3 2 A V: GCTGGCAAGTCTGGAA NNK TATAACGTGTTGTTCC R: GGAACAACACGTTATA MNN TTCCAGACTTGCCAGC

H242X 23B3 2 A V: GGCAAGTCTGGAAGTT NNK AACGTGTTGTTCCAAC R: GTTGGAACAACACGTT MNN AACTTCCAGACTTGCC

N243X 23B3 2 A V: CAAGTCTGGAAGTTTAT NNK GTGTTGTTCCAACACC R: GGTGTTGGAACAACAC MNN ATAAACTTCCAGACTTG

N243X V244X

23B3 3 A V: CAAGTCTGGAAGTTTAT KHT KHT TTGTTCCAACACCTGC R: GCAGGTGTTGGAACAA ADM ADM ATAAACTTCCAGACTTG

a Folgende Mutagenesestrategien kamen zum Einsatz: 1) Punktmutation(en); 2) Sättigungsmutagenese an einer Position; 3) Kombinatorische Teilsättigungsmutagenese an zwei Positionen gleichzeitig. b Folgende Techniken zum Einführen von Mutationen wurden angewendet:

A) QuikChange™-PCR; B) Gibson assembly; C) Gibson assembly kombiniert mit „22c-trick”.[158]

3.1.6. Verwendete E. coli Stämme

Das Gen für R-IRED_Ms wurde im Rahmen eines früheren Projektes von GenSkript

(Piscataway, US) synthetisiert und in einem pET28a(+)-Vektor geliefert. Deshalb wurde

zunächst mit einem passenden Expressionsstamm (E. coli BL21(DE3)) gearbeitet,

welcher das Gen für die nötige T7-Polymerase trägt. Für die Klonierungsarbeiten mit

pET28a(+) wurde außerdem der Klonierungsstamm E. coli DH5α verwendet. Im

weiteren Verlauf wurde das Gen in einen pBAD33-Vektor überführt. In diesem Plasmid

standen auch weitere IREDs zur Verfügung, welche bereits in Vorarbeiten kloniert

wurden. Für pBAD-Plasmide wurde der Stamm E. coli JW5510 aus der Keio-

Collection[159] herangezogen, bei welchem die Gene der Abbauenzyme von

L(+)-Arabinose ausgeschaltet sind. Auch für die Arbeiten mit PuOs, welche in einem


22

pBAD18-Vektor integriert waren, wurde E. coli JW5510 verwendet. Neben der

Expression von IREDs und PuOs wurden auch sämtliche Klonierungsarbeiten in diesem

Stamm durchgeführt. Tabelle 6 zeigt den Genotyp der verwendeten Stämme.

Tabelle 6: Genotypen der verwendeten E. coli Stämme.

Stamm Genotyp

E. coli DH5α F- fhuA2 lac(del)U169 phoA glnV44 Φ80' lacZ(del)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17

E. coli BL21(DE3) F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

E. coli JW5510 F- Δ(araD-araB)567 ΔlacZ4787(::rrnB-3)λ-ΔygjG763::kann rph-1 Δ(rhaD-rhaB)568 hsdR514

3.1.7. Verwendete Puffer und Lösungen

3.1.7.1. Puffer zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen (RbCl-Methode)

Tabelle 7: Puffer zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen.

TFBI-Puffer TFBII-Puffer

Kaliumacetat 0,59 g MOPS 0,21 g

RbCl 2,42 g RbCl 0,12 g

CaCl2 0,29 g CaCl2 1,1 g

MgCl2·4H2O 2,0 g Glycerin 37,8 g

Glycerin 37,8 g ddH2O 200 mL

ddH2O 200 mL pH 6,5 mit NaOH

pH 5,8 mit Essigsäure

3.1.7.2. Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese

Tabelle 8: Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese.

DNA-Ladepuffer 50x TAE-Puffer 0,7%ige Agaroselösung

Saccharose 4 g TRIS 0,21 g Agarose 3,5 g

Orange G 20 mg Essigsäure 57,1 mL 1x TAE-Puffer Ad 500 mL

ddH2O 10 mL EDTA 18,6 g

ddH2O ad 1 L


23

3.1.7.3. Puffer und Lösungen für die Proteinreinigung

Tabelle 9: Puffer und Lösungen für die Proteinreinigung.

Bindepuffer Waschpuffer (5 mM Imidazol)

Elutionspuffer (500 mM Imidazol)

KCl 22,4 g KCl 22,4 g KCl 22,4 g

Kpi-Puffer (50 mM)

ad 1 L

Imidazol 342 mg

Imidazol 34,2 g

Kpi-Puffer

(50 mM) ad 1 L

Kpi-Puffer (50 mM)

ad 1 L

3.1.7.4. Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE

Tabelle 10: Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE

6x SDS-Ladepuffer Coomassie Färbelösung

Coomassie Entfärbelösung

DTT 926 mg Ethanol 300 mL Ethanol 300 mL

Glycerin 3,78 g Essigsäure 100 mL Essigsäure 100 mL

SDS 1 g Coomassie 1 g ddH2O 600 mL

Bromphenol-blau 12 mg ddH2O 600 mL

TRIS-HCl Puffer pH 8,0 (350 mM)

10 mL


24

3.2. Molekularbiologische Methoden

3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Zur Amplifikation linearer DNA-Fragmente wurden PCR-Methoden angewendet. Hierbei

wird die DNA zunächst thermisch in die Einzelstränge aufgetrennt. Durch Absenken der

Temperatur erfolgt anschließend die Anlagerung von Oligonukleotiden (Primer) an die

Einzelstränge. Im nächsten Schritt wird die Temperatur wieder erhöht, sodass das

Temperaturoptimum der DNA-Polymerase erreicht wird. Diese bindet an das 3‘-Ende

des Primers und beginnt den fehlenden Strang in 5‘->3‘ Richtung zu vervollständigen.

Durch periodische Wiederholung dieser drei Schritte mit einem passenden

Temperaturprogram kann das DNA-Fragment exponentiell vervielfältigt werden. Im

Folgenden sind die Komponenten eines PCR-Ansatzes (Tab 11), sowie das allgemeine

Temperaturprogram gezeigt, (Tab 12).

Tabelle 11: Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes (Endvolumen 50 µl).

Komponente Volumen / µl

10x PfuUltraII-Puffer 5

DMSO 1

dNTPs (10 mM) 1,25

DNA-Templat (50-100 ng µl-1) 0,5-1

Vorwärts-Primer (10 µM) 1

Vorwärts-Primer (10 µM) 1

PfuUltraII Fusion HS Polymerase 0,75

ddH2O 39-39,5

Tabelle 12: Temperaturprogram für eine PCR.

Schritt Temperatur Dauer Zyklen

Hot-start PfuUltraII Denaturierung Primer-Anlagerung Elongation Auffüllreaktion

95°C 95°C 55°C 72°C 72°C

2 min 30 s 45 s 20s / kb 4 min

1 30 1


25

3.2.2. Klonierung mittels Gibson assembly

Die Durchführung des Gibson assembly erfolgte nach Gibson et al.[160] Zunächst wurden

geeignete Primer designt, welche für die PCR eingesetzt wurden. Die gewonnenen

linearen DNA-Fragmente wurden anschließend mit einem präparativen Agarosegel

getrennt, ausgeschnitten und mit dem ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit gereinigt.

Schließlich wurden 5 µl der DNA-Fragmente mit 15 µl eines 1,33-fach konzentrierten

Gibson-Mastermix vermischt. Die enthaltenen Komponenten sind in Tabelle 13

aufgeführt. Abhängig von Anzahl und Größe der Fragmente wurde ein bestimmtes

Mischungsverhältnis gewählt. Meistens wurden ein großes und ein kleines Fragment

vermischt. Hierbei wurde ein Verhältnis von 1 (großes Fragment) zu 3 (kleines

Fragment) bezogen auf die Stoffmengenkonzentration gewählt.

Tabelle 13: Auflistung aller im Gibson-Mix enthaltenen Komponenten, sowie die resultierenden Endkonzentrationen.

Komponente Endkonzentration

TRIS-HCl Puffer (pH 7,5) 100 mM

PEG-800 5% (w/v)

MgCl2a 10 mM

DTT 10 mM

dNTPs je 0,05 mM

NAD+ 1 mM

T5 Exonuklease 4 U mL-1

Phusion® High-Fidelity Polymerase 25 U mL-1

Taq DNA Ligase 4000 U mL-1

a hydratisiertes Salz wurden verwendet

3.2.3. Ortsgerichtete Mutagenese mittels Gibson assembly

Neben der Klonierung von DNA-Fragmenten können auch Mutationen über Gibson

assembly in ein Gen eingeführt werden. Ähnlich wie bei der QuikChange™-Methode

(Kap. 3.2.4) wird auch hier die Mutation über Primer eingefügt. Der Hauptvorteil hierbei

besteht jedoch darin, dass mehrere Mutationen an sehr unterschiedlichen Stellen

gleichzeitig eingefügt werden können. Weitere Vorteile gegenüber der QuikChange™


26

Methode sind die exponentielle Amplifikat-Bildung und eine höhere Effizienz bei der

anschließenden Transformation von E. coli Zellen.

3.2.4. Ortsgerichtete Mutagenese mittels QuikChangeTM

Bei dem von Stratagene (La Jolla, US) entwickelten QuikChangeTM-Protokoll können eine

oder mehrere nebeneinanderliegende Mutationen mit Hilfe von mutagenen Primern in

ein Gen eingefügt werden. Im Vergleich zur ortsgerichteten Mutagenese mittels Gibson

assembly ist die QuikChange™-Methode etwas schneller, außerdem sind die benötigten

Primer kleiner und damit günstiger. Die QuikChange™-Primer sind etwa 30-35

Nukleotide lang und sind (abgesehen von der Mutationsstelle in der Mitte des Primers)

komplementär zur Templat-DNA. Bei jedem PCR-Zyklus wird das ganze Plasmid

amplifiziert. Die amplifizierten DNA-Stränge tragen die gewünschte Mutation, jedoch

können sie nicht für weitere Zyklen als Templat dienen, da der nun komplementäre

Primer in die falsche Richtung zeigt. Aus diesem Grund ist die Amplifikatbildung nicht

exponentiell sondern nur linear ansteigend, sodass nach 30 Zyklen das Verhältnis von

Amplifikat zu Templat maximal 30:1 beträgt. Aus diesem Grund ist der anschließende

Verdau der Templat-DNA mit Dpn1 sehr wichtig. Um einen maximal wirksamen Verdau

zu erreichen, wurden 2 µl Dpn1 zu 50 µl PCR-Produkt gegeben und für 1-2 h bei 37°C

inkubiert.

3.2.5. Agarose-Gelelektrophorese

45 mL Agaroselösung (0,7% w/v, 70°C) wurden mit 2,5 µl Midori Green (Nippon

Genetics Europe GmbH, Düren, DE) vermischt und zum Aushärten in eine

Agarosegelkammer gegossen. Nach Überschichtung mit TAE-Puffer und Beladung der

Geltaschen erfolgte die Elektrophorese (100 Volt, 45-60 min). Als Marker wurde der

1kbp plus DNA Marker (Fermentas, St. Leon-Rot, DE) verwendet. Die aufgetrennten

DNA-Fragmente wurden anschließend unter UV-Licht (λ = 365 nm) analysiert und

gegebenenfalls aus dem Gel ausgeschnitten.


27

3.2.6. Herstellung chemisch kompetenter Zellen

Die Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen erfolgte nach der RCl-Methode.

Hierfür wurden 100 mL vorgewärmtes LB-Medium mit 500 µl Zellsuspension

(Vorkultur) angeimpft und in einem 250 ml Erlenmeyerkolben bei 37°C und 180 rpm

inkubiert. Nach etwa 2,5-3,5 h wurden die Zellen bei einer OD600 von 0,5-0,7 geerntet

(10 min, 3220 g, 4°C). Das Zellpellet wurde anschließend mit 40 mL gekühltem TFBI-

Puffer resuspendiert und 15 min auf Eis gelagert. Anschließend wurden die Zellen

erneut zentrifugiert (10 min, 3220 g, 4°C). Das Pellet wurde nun mit 5 mL TFBII-Puffer

resuspendiert und erneut für 15 min auf Eis gelagert. Anschließend wurden die Zellen

auf vorgekühlte Plastik-Tubes verteilt (je 25 µl) und zügig bei -80°C tiefgefroren.

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