Genetica batterica MEDICINA - genetica... · Generalmente, la traslocazione avviene all’interno della STESSA cellula (a differenza dei meccanismi ... tra cellule F+ e F- e, in tal

Genetica batterica

Giovanni Di Bonaventura, PhD

CI «Microbiologia e Microbiologia Clinica»

CdS Medicina e Chirurgia

AA 2015-2016

Genoma batterico

Il genoma batterico (o nucleoìde) consta di due componenti:

- Cromosoma (contiene i geni “housekeeping”, essenziali per la sopravvivenza)

- Elementi extracromosomici “mobili” (contengono geni non essenziali ma accessori: determinanti

di virulenza, geni responsabili del trasferimento genetico orizzontale o verticale):

plasmidi

elementi trasponibili

o sequenze di inserzione

o trasposoni

o elementi invertibili

Cromosoma batterico

Singolo (microrganismi aploidi)

DNA bicatenario e circolare (lineare in Streptomyces coelicolor e Borrelia burgdorferi)

Privo di istoni

«Mosaico» in natura: contiene geni di diversa provenienza, a seguito di fenomeni di trasferimento

genetico orizzontale (trasferimento genico tra cellule diverse)

Dimensioni variabili (0.2-9.0 Mb; 1100-1400 µm), proporzionali al livello di interazione del

microrganismo con l’ambiente

intracellulari obbligati - Mycoplasma genitalium: 480 kbp;

ambientali - Pseudomonas spp: 6.3 Mbp)

Per poter essere contenuto nella cellula batterica, il cromosma è superavvolto.

Replicazione bidirezionale, da una singola origine. Richiede despiralizzazione (DNA-girasi).

Cromosoma batterico

Escherichia coli: cromosoma rilasciato a

seguito di lisi batterica

Replicazione del DNA batterico

Plasmidi

Elementi genetici extracromosomici di piccole dimensioni (1-150 kpb), in grado di replicarsi autonomamente

DNA bicatenario e circolare (lineare in Streptomyces spp)

Possono trovarsi liberi nel citoplasma oppure «integrati» nel cromosoma batterico (episoma)

Non confinati nel singolo ospite: possono essere trasferiti e replicati in diversi ospiti +/- strettamente correlati.

Numerosità e tipologia di plasmidi in funzione della specie batterica:

gruppi di compatibilità: dimensioni = 1/k n copie

Qualità dell’informazione genetica

scarsa omologia con il cromosoma e raramente indispensabili per la sopravvivenza/moltiplicazione batterica in

condizioni “ottimali”

codificano per fattori di virulenza batterica:

produzione di pili, tossine (enterotossine, emolisine), adesine, siderofori, batteriocine

fattori R: determinanti dell’antibiotico-resistenza

Plasmidi: F (sessuali o coniugativi), F’ (Hfr): integrati nel cromosoma

plasmidi “criptici”: funzionalità non nota

Un batterio può perdere (“curarsi”) un plasmide, in assenza di una pressione selettiva (es. batterio con plasmide

antibiotico-R cresciuto per varie generazioni in assenza di antibiotico)

Plasmidi

Elementi trasponibili

Tipologia:

sequenze di inserzione

trasposoni

elementi invertibili

Caratteristica traslocazione tra “elementi” diversi (cromosoma, plasmidi) del genoma batterico

Generalmente, la traslocazione avviene all’interno della STESSA cellula (a differenza dei meccanismi

di trasferimento di materiale genetico)

eccezione: trasposoni coniugativi (coniugazione)

Due meccanismi di trasposizione:

conservativa – nessuna duplicazione di elemento

replicativa – duplicazione di elemento

La trasposizione induce un effetto “mutageno”:

mutazione letale

mutazione non letale


Sequenze di Inserzione (IS) – piccole dimensioni (800-

2.000 bp), integrazione sito-specifica mediante sequenze

invertite e ripetute, “core” codificante solo per

trasposizione (solo effetto mutageno).

Trasposoni – rilevanti dimensioni (> 2.000 bp),

integrazione sito-specifica mediante IS, “core” contenente

uno o più geni (es. geni per farmaco-resistenza).

Trasposoni coniugativi (possono essere trasferiti da una

cellula all’altra). Possibile fusione di diversi trasposoni


Elementi invertibili – oltre a geni codificatori per la trasposizione, presenza di “DNA-invertasi”

capace di invertire l’elemento di 180° (rispetto ad un asse centrale virtuale) nella sua locazione

cromosomica (“variazione di fase flagellare” H1/H2 in Salmonella, fase fimbriale in E. coli)

Isole genomiche – integrate nel cromosoma mediante fago,

veicolano geni per la patogenicità (pathogenicity island) e per

la vita simbiontica. Caratterizzano la patogenicità (invasività,

adesività, sopravvivenza intracellulare, iron-uptake, etc.) di

batteri di una stessa specie differenziandoli da batteri non

patogeni.

Meccanismi di variabilità genetica

La variabilità genetica consente al batterio una maggiore fitness, ossia la capacità di potersi adattare a

differenti ambienti.

I cambiamenti a carico del genoma avvengono mediante:

Mutazione genica

Trasferimento genico orizzontale:

Coniugazione

Trasformazione

Trasduzione

Ricombinazione genetica

Conversione lisogenica

Fusione del protoplasto

Mutazioni

Mutazione = modificazione, più o meno estesa, della sequenza nucleotidica (genotipo), con

possibili effetti sulle caratteristiche macroscopiche (fenotipo).

Considerato il tempo di generazione medio di una cellula batterica, l’effetto di una mutazione sul

fenotipo si esprime in tempi brevissimi (20-30 min).

Ceppo mutante vs ceppo selvaggio (wild-type, wt).

Una mutazione viene selezionata se conferisce un vantaggio selettivo (es. antibiotico-R).

Possono essere, talvolta, letali per la cellula.

Mutazioni spontanee (10-7- 10-11 bp / generazione) insorte durante la duplicazione/riparazione del

DNA, a seguito di integrazione/perdita di elementi mobili, per azione fagica.

Mutazioni indotte da agenti mutageni chimici (ag. alchilanti, ac. nitrico, 5-bromouracile), fisici (raggi

X, U.V.) o biologici (virus). Elevata frequenza.

Reversione della mutazione: può avvenire nel sito mutato originario od in un sito differente. Annulla

la mutazione ristabilendo il fenotipo originario (ceppo revertante).

Mutazioni microlesionali: effetti sul fenotipo

Puntiformi, interessano 1 sola base:

Inserzione – aggiunta di una base (frameshift)

Delezione – perdita di una base (frameshift)

Sostituzione

Transizione - sostituzione tra basi puriniche/pirimidiniche.

Transversione - sostituzione base pur/pirim con base pirim/pur.

Effetti sul fenotipo:

sequenza aa invariata per degenerazione del codice genetico - proteina

funzionale (mutazioni SILENTI).

sequenza aa mutata – proteina incompleta, probabilmente non funzionale

(mutazioni MISSENSE).

produzione di un codone di STOP: arresto sintesi proteina, non funzionale

(mutazioni NONSENSE).

Mutazioni macrolesionali: effetti sul fenotipo

Interessano più basi (sequenze):

Delezione - comporta l’eliminazione completa di un segmento di DNA.

Inserzione - introduzione di un nuovo segmento di DNA all’interno di una sequenza preesistente.

Duplicazione - ripetizione in tandem di un segmento di DNA.

Inversione - rotazione di 180° di un segmento di DNA.

Traslocazione - inserimento di un segmento di DNA in un’altra posizione del genoma.

Effetti sul fenotipo:

inattivazione del gene interessato

Meccanismi di trasferimento genico orizzontale

I meccanismi di trasferimento genico consentono la mobilizzazione di

sequenze di DNA (plasmidi, parte del cromosoma, trasposoni

coniugativi) tra cellule differenti, appartenenti alla stessa specie od a

specie differenti:

Coniugazione

Trasformazione

Trasduzione

La sequenza di DNA trasferita potrà integrarsi nel cromosoma della

cellula accettrice a seguito di ricombinazione genetica.


Coniugazione

Coniugazione = trasferimento genico unidirezionale mediato da plasmide che richiede un

contatto “fisico” tra due cellule batteriche («donatrice» e «accettrice»).

Avviene sia nei Gram+ che Gram- ma con meccanismi differenti:

pilo sessuale (Gram-negativi)

ferormoni (Gram-positivi)

Plasmidi coniugativi: plasmidi che possono essere trasferiti tra cellule

mediante coniugazione

Plasmide F – plasmide della “fertilità” (F – fertility)

geni rep – codificano per la replicazione

geni tra - codificano per il trasferimento

geni mob - codificano per la mobilizzazione

4 elementi IS – mediano l’integrazione nell’endogenote


Coniugazione: tipi cellulari

Pilo sessuale (pilo F): codificato dal plasmide F, è una struttura

superficiale prodotta da cellule F+ che riconoscendo un recettore

sulla cellula F-, consente la formazione di una “coppia coniugativa”

tra cellule F+ e F- e, in tal modo, il trasferimento del plasmide.

Sulla base della presenza o meno del pilo, si riconoscono 3 tipi

cellulari:

Cellula F+ : cellula contenente un plasmide F (cellula donatrice o

“maschile”)

Cellula F- : cellula non contenente un plasmide F (cellula ricevente

o “femminile”)

Cellula Hfr (high frequency of recombination): cellula contenente

un plasmide F integrato nel cromosoma (cellula donatrice o

“maschile”)


Coniugazione: F+ x F-

Nella coniugazione F+ x F- non si assiste a trasferimento di DNA cromosomico


Coniugazione: F+ x F-


Coniugazione: Hfr x F-

Nella coniugazione Hfr x F-:

viene trasferito un segmento di DNA

cromosomico. Questo potrà andare

incontro a:

- Degradazione (nessun effetto)

- Circolarizzazione (plasm. coniugativo)

- Integrazione (nuovi caratteri)

la cellula accettrice rimane F-


Coniugazione: Hfr x F-


Coniugazione nei Gram-positivi

Enterococcus faecalis

Produzione e rilascio di ferormoni da parte della cellula “accettrice” (femminile)

I ferormoni inducono la produzione di una sostanza «aggregante» alla superficie della cellula

“donatrice” (maschile)

Formazione di aggregati cellulari con trasferimento del plasmide coniugativo


Coniugazione: significato

Significato clinico:

Principale meccanismo di trasferimento di geni per l’antibiotico-resistenza

Trasferimento di geni codificanti per fattori di virulenza (enterotossine,

adesine, siderofori)

Significato ambientale:

Trasferimento della resistenza ad erbicidi, idrocarburi aromatici, metalli

pesanti

Trasferimento di geni per la fissazione dell’azoto tra Rhizobia

Significato tecnico:

Coniugazione con batteri Hfr in vitro può essere interrotta in tempi diversi

con trasferimento di un progressivo di geni (mappatura dei genomi batterici)

Significato evoluzionistico:

Principale meccanismo evolutivo/adattativo batterico


Trasformazione

Meccanismo di trasferimento genetico “evoluto” da una primitiva esigenza nutrizionale

Assunzione di frammenti di DNA solubile dall’ambiente circostante da parte di cellule batteriche

“competenti” (Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Pneumococcus)

Osservato sia nei Gram+ che nei Gram-

Influenzato da:

• dimensioni DNA

• sensibilità DNA a nucleasi

• “competenza” della cellula accettrice (naturale od indotta artificialmente)


Trasformazione: scoperta

Avery, McCarty e McLeod (1944) identificarono nel DNA

la “sostanza trasformante”


Trasformazione: scoperta

Avery, McCarty e McLeod (1944) identificarono nel DNA

la “sostanza trasformante”


Trasformazione: competenza

La cellula accettrice deve, per poter essere trasformata, trovarsi in una particolare condizione che

prende il nome di competenza.

Competenza: capacità cellulare di “catturare” il DNA.

Il raggiungimento di un livello soglia nella densità cellulare attiva la sintesi ed il rilascio di un

“fattore di competenza” (Gram+) che, agendo a livello di membrana, induce:

modificazioni di parete cellulare (autolisina)

sintesi/attivazione di proteine (DNA-binding, nucleasi, sistema RecA)

La competenza può essere:

naturale (Bacillus, Streptococcus, Neisseria, Haemophilus)

indotta artificialmente (P. aeruginosa, E. coli, S. typhimurium), mediante trattamento “a freddo” con CaCl2(bassa efficienza, utilizzato di routine nel clonaggio di DNA in E. coli) oppure elettroporazione.

Nei Gram- : mancanza del “fattore di competenza”, sostituito da particolari condizioni del mezzo

colturale. Ad esempio, 100% competenza in Haemophilus spp. in condizioni permissive per la sintesi

proteica ma non per la crescita completa.


Trasformazione

1. Morte e degradazione del batterio “donatore”.

2. Un frammento di DNA bicatenario (ds) interagisce con

specifiche proteine (DNA-binding protein) alla superficie della

cellula “competente”. Il DNA è reso monocatenario (ss) da una

nucleasi.

3. La proteina Rec A promuove la ricombinazione omologa tra il

DNA ss donatore e quello ss recipiente.

4. Il trasferimento è completato.


Trasformazione


Trasformazione: significato

Significato clinico:

meccanismo di trasferimento di geni per l’antibiotico-resistenza

trasferimento di geni codificanti per fattori di virulenza

(enterotossine, adesine, siderofori)

Significato biotecnologico:

clonaggio di geni “utili”

Significato evoluzionistico:

meccanismo di evoluzione/adattamento batterico


Trasduzione

La trasduzione consiste nel trasferimento di frammenti di DNA cromosomale tra due cellule

batteriche mediante un batteriofago (virus batterico).

Esistono 2 tipi di trasduzione:

Trasduzione generalizzata: qualsiasi gene può, in teoria, essere trasferito

Trasduzione specializzata: specifici geni possono essere trasferiti con maggiore probabilità


Trasduzione

La trasduzione consiste nel trasferimento di frammenti di

DNA cromosomale tra due cellule batteriche mediante un

batteriofago (o fago).

Il fago è un virus in grado di infettare elettivamente le

cellula batteriche.

Ha generalmente forma di spillo in cui si riconoscono più

parti: la testa, contenente l'acido nucleico; essa sormonta

un collare, cui è attaccata una coda, la quale si sfrangia

all'estremità in 5 o 6 fibre affatto libere.


Fago: ciclo biologico

Il riconoscimento dell’ospite da parte del fago avviene attraverso un legame che

si stabilisce fra le proteine del capside e specifici recettori siti sulla parete del

batterio.

Nella coda del fago è presente un complesso molecolare in grado di iniettare

l’acido nucleico del fago attraverso la parete del batterio ospite. Una volta che

l’acido nucleico è penetrato nella cellula, a seconda del tipo di fago si potrà

osservare:

un ciclo litico: il virus si riproduce immediatamente, uccidendo la cellula

ospite che va incontro a lisi, liberando la progenie fagica. Un virus che si

riproduce esclusivamente attraverso il ciclo litico viene definito virulento.

un ciclo lisogeno: il virus integra il proprio acido nucleico nel genoma della

cellula ospite (profago). I batteri che ospitano particelle virali non litiche sono

detti lisogeni ed i virus vengono definiti temperati. Il profago può rimanere

silente per molto tempo, fino a quando verrà attivato e, abbandonando il

cromosoma batterico, innescherà un ciclo litico.

La capacità di passare dal ciclo lisogeno a quello litico è di grande vantaggio

evolutivo per il fago. Quando la cellula ospite è in fase di rapida crescita e

riproduzione, il profago rimane nello stato lisogeno. Quando, invece, la cellula

ospite viene danneggiata (es. agenti mutageni), il profago interrompe lo stato

quiescente «integrato» ed attiva il ciclo litico per disseminare la propria progenie.


Trasduzione

A seconda del tipo fagico coinvolto (virulento o temperato), il meccanismo di trasduzione può

avvenire secondo due differenti modalità:

Trasduzione generalizzata: in cui qualsiasi gene può (teoricamente) essere trasferito

Trasduzione specializzata: in cui solo specifici geni possono essere trasferiti


Trasduzione generalizzata

1. Adsorbimento del fago litico alla superficie del batterio sensibile.

2. Penetrazione del genoma fagico nel batterio. Utilizzo dei sistemi

metabolici cellulari per la sintesi e l’assemblaggio delle componenti

virali.

3. In alcuni casi, un frammento di DNA batterico od un plasmide

possono essere erroneamente inseriti in alcuni capsidi virali

(particelle trasducenti).

4. Rilascio dei fagi batterici a seguito di lisi batterica.

5. Il fago trasduttore adsorbe ad un batterio sensibile.

6. Penetrazione del DNA fagico.

7. Il fago trasducente non è in grado di innescare un ciclo litico ma

può permettere al DNA fagico di ricombinare con il DNA della

cellula accettrice.

Nella trasduzione generalizzata, la selezione dei geni trasdotti è

randomizzata. Ogni gene ha la stessa probabilità di essere trasdotto.


Trasduzione generalizzata


Trasduzione specializzata

Un fago temperato adsorbe al batterio sensibile e vi inietta il

suo genoma.

Il genoma fagico ricombina con il nucleoide batterico divenendo

un profago.

In presenza di stimoli adeguati, un frammento del DNA batterico

viene escisso come parte del genoma fagico.

Durante la replicazione fagica il DNA batterico viene inserito nel

genoma fagico. Tutti i fagi veicolano il frammento di DNA

batterico.

Il fago adsorbe ad una batterio sensibile iniettandovi il suo

genoma.

Il genoma fagico contenente il DNA trasdotto ricombina con il

nucleoide della cellula accettrice.

1 2

3 4

5 6

7

Nella trasduzione specializzata, i geni batterici «fiancheggianti» il profago

sono quelli a più alta probabilità di trasduzione.


Trasduzione specializzata

Ricombinazione genica

Ciascuno dei tre meccanismi di trasferimento genico (coniugazione,

trasformazione, trasduzione) può concludersi con la integrazione del DNA

donatore in quello della cellula accettrice. Questo fenomeno è noto come

ricombinazione genica.

Sono coinvolti enzimi responsabili della sintesi e del riparo del DNA.

Possono ricombinare sia singoli geni che gruppi di geni.

La ricombinazione genica è coinvolta in ogni fenomeno generante variabilità

genica: è un processo di riarrangiamento del DNA che porta alla fusione di

frammenti appartenenti a molecole di DNA differenti.

Importante processo evolutivo in quanto promuove la diversità genetica

(formazione di nuove combinazioni di geni), permettendo un rapido

adattamento.

Due tipologie di ricombinazione genetica:

omologa, richiede elevata omologia tra sequenze estese

sito-specifica, riconosce omologia tra sequenze brevi

Ricombinazione tra DNA lineare (a) e plasmidico (b)

Ricombinazione genica OMOLOGA (crossing over)

Necessita di estese regioni di omologia tra DNA ricevente e donatore. Molto

complessa (in E. coli richiede oltre 25 geni).

1. Taglio di una elica del DNA donatore ad opera di una endonucleasi.

2. Separazione del filamento tagliato da quello integro ad opera di una

elicasi e sua associazione a proteine stabilizzatrici (Single-Strand Binding

protein – SSB protein).

3. Legame con proteina RecA che rende possibile l’invasione di catena ed il

conseguente appaiamento del filamento donatore con sequenze

omologhe del DNA ricevente.

4. Formazione di una struttura chiamata heteroduplex, ossia l’intermedio di

ricombinazione.

5. Risoluzione dell’heteroduplex: rottura e successiva risaldatura dei filamenti

mediante DNA-ligasi, con formazione di molecole di DNA ibride.

Ricombinazione genica SITO-SPECIFICA

Avviene in particolari punti del DNA aventi una particolare sequenza

riconosciuta da trasposasi e ricombinasi sito-specifiche.

Necessita di corte sequenze (qualche base) di omologia tra DNA bersaglio e

DNA sequenze invertite e ripetute (IR).

Consente la trasposizione, ossia la traslocazione di sequenze da un sito ad

un altro dello stesso genoma o tra genomi differenti:

integrazione del fago

inversione degli elementi invertibili (es. variazione di fase flagellare H1/H2 in S.

typhimurium)

trasposizione di elementi trasponibili

Conversione lisogenica

Integrazione del genoma fagico mediante ricombinazione sito-specifica

DNA profagico “silente” (anche per lunghi periodi)

Particolari condizioni ambientali (carenza ionica, essiccamento, U.V., radiazioni

ionizzanti, agenti mutageni) inducono la derepressione di parte del DNA profagico

La conversione lisogenica può accrescere la virulenza (patogenicità) di un batterio:

adesine ed antigeni di superficie (antigene O di Salmonella)

produzione di tossine

Adattamento ed evoluzione batterica

Mutazione e selezione “classiche” (selezione naturale ed evoluzione)

Acquisizione di geni da altri batteri:

Trasferimento genico ORIZZONTALE:

Coniugazione

Trasformazione

Trasduzione

Trasferimento genico VERTICALE

Ricombinazione genica (omologa o sito-specifica)

Adattamento ed evoluzione batterica

Quantità (valori percentuali) di DNA “atipico” (trasferito) nei genomi batterici. Circa il 13% del

genoma di E. coli K12 è stato acquisito mediante trasferimento genico orizzontale.

Espressione genica

La maggior parte (>98%) dei geni viene trascritta in mRNA che

viene poi tradotto in proteine. Alcuni geni codificano per le diverse

specie di RNA ribosomale (5S, 16S, 23S); altri in RNA transfer (tRNA) che,

insieme con il ribosoma, partecipano alla decodificazione di mRNA in

proteine funzionali.

La trascrizione inizia a partire dai promotori, sequenze in grado di

legare RNA-pol, che modulano la frequenza di inizio del fenomeno. La

attività dei promotori può essere alterata da proteine regolatrici.

La trascrizione termina con specifici siti di terminazione:

sequenza IR seguita da un poli-Uracile; formano «stem-loop»

incompatibile con attività della RNA-pol

proteina di terminazione (rho)

In alcuni casi, i geni sono disposti singolarmente sul cromosoma: da

questi geni viene trascritta una singola specie di mRNA che è tradotta in

un singolo tipo di proteina (arrangiamento monocistronico)

Espressione genica

In altri casi, più geni che codificano per funzioni correlate possono

trovarsi adiacenti sul cromosoma («clusters») e vengono trascritti, a

partire da un singolo promotore, su una singola molecola di mRNA, dalla

cui traduzione verranno poi formate tante proteine quanti sono i geni

che fanno parte del gruppo. Tale gruppo di geni costituisce un operone

(arrangiamento policistronico).

L’arrangiamento in operoni dei geni è tipico di molti batteri e

vantaggioso perché permette di economizzare sui meccanismi di

regolazione: il raggruppamento in operoni di geni con funzioni

correlate, che richiedono quindi una regolazione dell’espressione simile,

riduce il numero di sistemi di regolazione richiesti.

Molte delle proteine responsabili della virulenza batterica sono codificate

da operoni:

tossina colerica (V. cholerae)

fimbrie (pili) di E. coli uropatogeni

Regolazione dell’espressione genica

I batteri possono regolare in maniera «fine» la

espressione dei propri geni. La capacità di «attivare»

o «disattivare» geni selezionati consente loro di:

adattarsi facilmente ai cambiamenti dell’ambiente

(ricerca di nuove sorgenti di C/N; sintesi de novo di

una molecola)

regolare il proprio livello di virulenza. Esempio:

batteri enteropatogeni: passaggio dall’ambiente

«acqua» (25°C, carenza di elementi nutritivi)

all’ospite (37°C, carenza di O2, riduzione di Fe libero).

Geni ed operatori controllati da uno stesso regolatore

costituiscono un regolone

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