GENTICA MICROBIANA

Cualquier organismo est determinado por su material gentico y su interaccin con el medio ambiente queselecciona, activa, reprime o cambia el material gentico.

Las bacterias poseen un genotipo que transmiten por herencia y un fenotipo que depende de las circunstancias que les rodean. Las bacterias sufren variaciones en sus caracteres y son de dos tipos;fenotpicas o adaptacionesygenotpicas(mutaciones, fenmenos de transferencia, elementos transponibles, integrones).El estudio de la gentica bacteriana, atendiendo a los dos aspectos anteriores, permite entender mejor las funciones esenciales de su material gentico y las caractersticas que rigen su comportamiento, su capacidad de adaptacin al medio ambiente, la expresin de mecanismos de virulencia que les permite colonizar, invadir, y daar clulas eucariotas, y como consecuencia, el desarrollo de un gran espectro de enfermedades clnicas.7.1 El genoma microbiano

El genoma bacteriano est compuesto por un nico cromosoma de ADN circular cerrado. Adems poseen estructuras denominadas plsmidos constituidas tambin por ADN, que se encuentran en nmero variable en la clula bacteriana. Su conocimiento permite una mejor comprensin de la patogenia, con aplicaciones en la prevencin, en el diagnstico y en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.Conocidas la dinmica de los mecanismos de invasin, produccin de toxinas, capacidad de adaptacin a ecosistemas adversos y otras mltiples posibilidades de variacin, pueden disearse nuevas vacunas ms especficas, as como establecer combinaciones interespecies, o utilizarse bacterias avirulentas de muy fcil cultivo para producir en forma industrial antgenos de grmenes de crecimiento fastidioso.En el campo de los antibiticos, se abren perspectivas hacia lneas absolutamente distintas, con drogas capaces de bloquear determinados pasos en cadenas metablicas vitales.Ya existen mltiples aplicaciones de la gentica en diagnstico microbiolgico, con tcnicas que indudablemente se irn simplificando y perfeccionando con el conocimiento de la entera secuencia del genoma bacteriano: hibridacin, reaccin de polimeras en cadena, etc.Por ltimo, el conocimiento del genoma tambin permitir la utilizacin benfica, a escala industrial, de algunos microorganismos en la produccin de hormonas, vitaminas, aminocidos y antibiticos.7.1.1 Organizacin de los genes diferencias entre procariotas y eucariotas

Los procesos de deteccin y modelado de genes son aquellos mediante los que se identifican, en el ADN, regiones codificantes y elementos reguladores asociados,, con los objetivos de deducir la organizacin o estructura de los genes y predecir la secuencia de los productos gnicos correspondientes, sean ARNs o protenas, y los mecanismos controladores de su expresin.

PROCARIOTAS ADN localizado en una regin: Nucleoide, no rodeada por una membrana. Clulas pequeas 1-10 m Divisin celular directa, principalmente por fisin binaria. No hay centrolos, huso mittico ni microtbulos. Sistemas sexuales escasos, si existe intercambio sexual se da por transferencia de un donador a un receptor. Escasas formas multicelulares Ausencia de desarrollo de tejidos Formas anaerobias estrictas, facultativas, microareroflicas y aerobias Ausencia de mitocondrias: las enzimas para la oxidacin de molculas orgnicas estn ligadas a las membranas Flagelos simples formados por la protena flagelina. En especies fotosintticas, las enzimas necesarias estn ligadas a las membranas. Exitencia de fotosntesis aerobia y anaerobia, con productos finales como azufre, sulfato y Oxgeno.

EUCARIOTAS Ncleo rodeado por una membrana. Material gentico fragmentado en cromosomas formados por ADN y protenas. Por lo general clulas grandes, (10-100 m), Algunos son microbios, la mayora son organismos grandes. Divisin celular por mitosis, presenta huso mittico, o alguna forma de ordenacin de microtbulos. Sistemas sexuales frecuentes. Alternancia de fases haploides y diploides mediante Meiosis y Fecundacin. Los organismos multicelulares muestran desarrollo de tejidos Casi exclusivamente aerobias. Las enzimas estn en las mitocondrias. Las enzimas para la fotosntesis se empaquetan en los cloroplastos. Flagelos compuestos, (9+2) formados por tubulina y otras protenas.7.1.2 Plsmidos: tipos y funciones

Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosmico. Estn presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamao vara desde 1 a 250 kb. El nmero de plsmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por clula.Una forma de agrupar plsmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria. Los plsmidos conjugativos contienen tra-genes, los cuales ejecutan complejos procesos de conjugacin, como la transferencia sexual de plsmidos a otra bacteria. Los plsmidos no-conjugativos, son incapaces de iniciar una conjugacin, de all que ellos pueden transferirse nicamente con la asistencia de los plsmidos conjugativos y lo hacen por accidente.Una clase intermedia de plsmidos son los movilizables los cuales llevan solo un subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden parasitar un plsmido conjugativo, transfirindose a una alta frecuencia solo en su presencia.Es posible para plsmidos de diferentes tipos el coexistir en una celular simple.Siete tipos diferentes de plsmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero normalmente plsmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos sobrevive en la lnea celular, debido a la regulacin de las funciones vitales de los plsmidos. Por lo tanto, los plsmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de compatibilidad.Algunos plsmidos determinan resistencia antibitica, se le han denominado "plsmidos R".Bacterifagos. Son elementos que pueden invadir bacterias y llevar material gentico exatrcromosmico. Son agentes infecciosos que se replican como parsitos intracelulares obligados dentro de las bacterias. El genoma del fago codifica para funciones necesarias para su replicacin intracelular, pero tambin codifican para la sntesis de las protenas necesarias para el ensamblaje del fago. El genoma del fago puede codificar para caractersticas bacterianas no relacionadas a su replicacin, fenmeno conocido como CONVERSIN, el cual es responsable de algunas caractersticas de virulencia bacteriana como la produccin de toxinas.Transposones.Son secuencias de ADN que llevan informacin para una transposasa y en los extremos secuencias repetidas conocidas como de Insercin, y en medio de esta secuencia puede encontrarse la insercin de genes de virulencia, como toxinas o genes de resistencia a antibiticos.stos se pueden integrar en el cromosoma de las bacterias o insertarse en fagos.

Integrones.Son elementos de ADN mviles que pueden capturar genes de resistencia o virulencia , los cuales estn en "casates" y como acarrean una integrasa, pueden introducirse en el cormosoma, los transposones y los plsmidos de bacterias; de esta manera , pueden replicarse y expresar la informacin que llevan.7.2 Variabilidad gentica en microorganismos

La variabilidad gentica es interesante desde el punto de vista de que muchas de estos cambios genticos aportan resistencia a estas bacterias a ciertos medios, antibiticos.La mutacin; es un cambio transmisible en el genoma bacteriano, que es transmisible. Estas mutaciones pueden ser puntuales y suficientes para dar lugar, por ejemplo, a una resistencia por el cambio en la transduccin de una protena. Pueden ser mutaciones de segmentos del DNA, sustituciones de nucletidos, y micro inserciones, o por el contrario provocar alteraciones en regiones ms grandes (inserciones y deleciones). El requisito indispensable para llevar a cabo cualquier anlisis gentico es la existencia de variabilidad gentica, la mutacin es la fuente primaria de variabilidad gentica. Otra caracterstica importante del material hereditario es la recombinacin. La recombinacin consiste en la produccin de nuevas combinaciones genticas a partir de las generadas inicialmente por la mutacin. Dos molculas de ADN que posean distintas mutaciones pueden intercambiar segmentos y dar lugar a la aparicin de nuevas combinaciones genticas. Las bacterias y los virus, al igual que los organismos eurcariticos tambin tienen mecanismos de recombinacin. En el caso de las bacterias existen tres mecanismos de recombinacin: transformacin, conjugacin y transduccin. La existencia de estos mecanismos permite la construccin de mapas genticos en bacterias.Los mecanismos de transmisin horizontal; transformacin, conjugacin, y transduccin.

7.2.1 Mutacin.Durante la replicacin del genoma bacteriano, a veces ocurren cambios, ya sea en forma espontnea o artificial. Estos cambios heredables en la secuencia de bases del ADN, se denominan mutaciones. El organismo resultante de una mutacin tendr una constitucin gentica diferente a la de la cepa progenitora y se denomina cepa mutante.Las mutaciones pueden implicar solamente el cambio en un solo par de bases en el ADN de la clula o pueden producir un cambio que se extiende a un cierto nmero de pares de bases o hasta genes completos.El cambio en genoma bacteriano puede modificar, o no, la apariencia o funcionalidad de la cepa mutante respecto de su progenitora. En la mayora de los casos las mutaciones producen individuos que no pueden adaptarse y desaparecen.Una mutacin puede tener efectos diferentes segn cmo se produzca. Por ejemplo:La sustitucin de una base por otra en la cadena de ADN, no significa necesariamente un cambio en el aminocido que codificar dicha porcin del genoma y por lo tanto no producir ningn cambio en la apariencia o funcin.Las mutaciones producidas por deleciones o inserciones de fragmentos de ADN pueden afectar la capacidad de formar una protena y por lo tanto producir una alteracin en la apariencia o funcionalidad de la clula.Las mutaciones se dan en forma espontnea con una frecuencia muy baja. Normalmente una de cada 108 clulas de una poblacin contiene una mutacin detectable en un gen determinado. Sin embargo esta frecuencia puede aumentar notablemente por accin de agentes denominados mutgenos o mutagnicos. Estos agentes pueden ser qumicos, fsicos o biolgicos.Los mutgenos qumicos son sustancias semejantes a las bases pricas o pirimidnicas y las reemplazan originando el cambio en la secuencia de ADN. Dentro de los mutgenos fsicos se encuentran las radiaciones ionizantes (rayos x, rayos gamma y csmicos) y las no ionizantes (radiacin ultravioleta).

7.2.2 RecombinacinLa recombinacin consiste en la creacin de nuevas molculas de DNA, tanto en eucariotas como en procariotas, por intercambio de secuencias ms o menos largas entre dos molculas preexistentes. La recombinacin es especialmente frecuente en presencia de dos cromosomas o molculas de DNA homlogas, es decir, las que contienen genes semejantes en la misma posicin. Los seres que se producen sexualmente poseen una dotacin gentica duplicada (diploide), pues poseen parejas de cromosomas homlogos, de procedencia paterna y materna respectivamente. Entre esas parejas, se dan numerosos procesos de recombinacin durante la formacin de los gametos o clulas germinales, en la meiosis. En estos casos, la recombinacin se observa al microscopio ptico como sobrecruzamiento o entrecruzamiento (crossing-over) de cromosomas. La ventaja definitiva de la produccin sexual se debe a la facilidad de obtencin de nuevos genomas por recombinacin. A escala molecular, la recombinacin requiere:a) La hidrolisis de los dplex de DNA homlogosb) El emparejamiento de hebras terminalesc) La reposicin de las bases adecuadas en los (huecos), por la DNA polimerasa Id) La soldadura de las hebras por la DNA ligasa.

Recombinacin homloga A travs de la recombinacin las bacterias pueden adquirir varias caractersticas a un tiempo y evolucionar as ms rpido que mediante mutaciones. Para hacer posible la recombinacin homloga previamente han de transferirse los fragmentos de una bacteria donadora al citoplasma de la receptora que se convierte en parcialmente diploide.

En todo caso estas recombinaciones son la excepcin y no la regla porque cada especie posee sus sistemas de seguridad para protegerse de la entrada de fagos y plsmidos y mantener as su identidad. Se trata de enzimas que introducen modificaciones qumicas para marcar y proteger el ADN propio y destruyen toda molcula ajena que no est marcada por ellas. Estos sistemas restringen el rango de transferencias o intercambios de informacin entre especies y se denominan enzimas de restriccin.

7.2.3 Secuencias de insercin, transposones e integrotesLos elementos de secuencias de insercin (IS) son segmentos de DNA que pueden moverse de una posicin cromosmica a otra del mismo cromosoma o a otro cromosoma diferente. Cuando los IS se insertan en medio de los genes, pueden interrumpir la secuencia codificante e inactivar la expresin del gen. Fueron descubiertos por primera vez en E.Coli en el operon gal y son los transposones ms simples. Tienen entre 700 y 1500 pb y se han encontrado en eubacterias y arqueo bacterias. Tambin son frecuentes en bacterifagos y plsmidos.

Las secuencias de insercin tienen un gen codificante para la transposasa y estn flanqueadas por repeticiones invertidas. Las repeticiones directas se originan cuando se insertan en el hospeda

Transposicin:Cambio de posicin de un elemento mvil en el genoma Existentes en todos los organismos Sus duplicaciones es hacen que su representatividad en el genoma aumente muchos de ellos han perdido su capacidad de moverse movimiento guiado por enz

TRANSPOSONES BACTERIANOSAparecen tanto en el cromosoma principal de bacterias como en los plsmidos o plasmidios.

Estos elementos pueden transponerse dentro del cromosoma principal o pasar a los plsmidos.

7.3 Transmisin de caracteres genticos entre bacterias

Se denomina transferencia gentica al intercambio de genes entre dos molculas de ADN, para formar nuevas combinaciones de genes en un cromosoma.Si llamamos a dos bacterias A y B y consideramos cromosomas, para identificar; si estos dos cromosomas se rompen y se vuelven a unir, algunos de los genes que portan se mezclaran. Los cromosomas originales se han recombinado, de modo que ahora cada uno lleva una porcin de los genes del otro.Para comprender ms sobre mecanismos de transferencia gentica primero tendremos que definir algunos trminos bsicos, como los que presentamos a continuacin:- Gentica: Estudio de los genes, de la informacin que estos llevan y como se replica dicha informacin.- Gen: Es un segmento de ADN que tiene una codificacin, es decir lleva informacin para la formacin de macromolculas, generalmente protenas.Los procesos genticos requieren de 3 polmeros (ADN, ARN, Protenas), el material gentico de las bacterias se encuentra en el citoplasma, por lo cual habr algunos mecanismos para la transmisin de caracteres genticos en bacterias, los cuales nombraremos a continuacin: Transformacin Transduccin Conjugacin

7.3.1 Restriccin y modificacin del DNAEl mecanismo de corte de DNA se realiza a travs de la ruptura de dos enlaces fosfodister en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. stos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos ltimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercana (Apareamiento de Watson & Crick).Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas.Las enzimas de restriccin que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas isoesquizmeros. Por ejemplo, estn los isoesquizmeros Asp718 y KpnI.El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbilogos Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin lo que condujo al desarrollo de la tecnologa de ADN recombinante. El primer uso prctico de su trabajo fue la manipulacin de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabticos.

Uno de los campos en los que las enzimas de restriccin han tenido mayor implicacin ha sido el diagnstico de enfermedades genticas relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si stas se producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restriccin, al producirse eliminarn o agregarn nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberan observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.

El sistema de restriccin-modificacin (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exgenos (normalmente vricos) que ingresen en la bacteria, eliminando las secuencias ajenas al genoma de estas. El ADN propio no sufre delecin por parte de las enzimas de restriccin del organismo que las produce, puesto que previamente ha sido modificado por metilacin a travs de la accin de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases especficas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infeccin del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas K12 y B). Este sistema consta de dos partes:Restriccin: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exgenos para evitar la promiscuidad en los intercambios genticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacterifagos que pudieran poner en peligro la individualidad gentica o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a travs de cortes mediante endonucleasas de restriccin a los DNA exgenos que ingresen a la bacteria.Modificacin: Consiste en la introduccin de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual est catalizado por una metilasa especfica.Existen varios mecanismos de accin generales de estos sistemas, de los cuales destacan el tipo I y el tipo II:M-R tipo I: Fueron los primeros en ser descritos. Lo caracterstico de los sistemas M-R de tipo I es que las actividades de modificacin y las de restriccin estn producidas por un complejo multiproteico, que realiza los dos tipos de actividades.

Algunas caractersticas son:Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetras.La actividad de restriccin (de las subunidades R) corta lejos del sitio de reconocimiento (del orden de unos 1000 pb), y en lugares inespecficos.La restriccin requiere de ATP.La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como donador de los grupos metilo.M-R tipo II: Aqu cada subunidad del dmero reconoce la misma secuencia, presente en cada una de las partes especulares del palndromo, y realiza un corte en un lugar especfico, que obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena de la otra mitad del palndromo. Ms de la tercera parte de las cepas bacterianas presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas de ellas son codificadas a partir de genes situados en plsmidos. Algunas caractersticas que tiene este mecanismo son:Las dos actividades las realizan dos protenas distintas que no forman complejos multiproteicos.No utilizan ATP. Slo necesitan iones Mg++ para funcionar. La metilasa usa SAM como donador de metilos.Cada miembro de la pareja de modificacin y restriccin reconoce la misma secuencia especfica de ADN.El sitio de reconocimiento consta de 4 6 pb que constituyen una secuencia palindrmica.La metilasa suele ser una protena monomrica, que introduce grupos metilo en una A o en una G (segn la metilasa en cuestin), en ambas cadenas, dentro del sitio de reconocimiento.La enzima de restriccin suele ser una protena formada por dos subunidades del mismo tipo, ensambladas simtricamente. Pueden dejar extremos cohesivos o extremos romos. Algunas enzimas de restriccin dejan extremos sobresalientes, mientras que otras dejan extremos sobresalientes.

7.3.2 Transformacin: incorporacin del DNA

TRANSFORMACINEs un proceso por medio del cual las bacterias adquieren informacin gentica. Se produce una incorporacin por parte de una bacteria viva de fragmentos de ADN (desnudo) extracelulares, lo cual causa una recombinacin del fragmento nuevo con el genoma bacteriano. Este proceso se lleva a cabo en la bacteria receptora. El ADN logra entrar a la clula a travs de receptores de superficie, para lo cual se requiere de energa, como el ADN tiene doble cadena cuando este entra, una de las cadenas es digerida por endonucleasas, la otra se alinea con el cromosoma bacteriano. Tras la replicacin uno de los cromosomas adquiere la informacin original y la otra contiene los genes transformados. Para que la transformacin sea evidente el ADN transformante debe provenir de una bacteria diferente a la receptora.Existen dos formas distintas de competencia las cuales con: 1) Natural 2) Artificial.

7.3.3 Transduccin: generalizada y especializada

TRANSDUCCINLa transduccin se refiere a un proceso en el cual se transfiere el material gentico de una bacteria (ADN) a otra, mediante la participacin de un bacterifago (virus que infecta bacterias) [figura 1]. El bacterifago posee un cubierta que protege al DNA del medio ambiente, y de esta manera, la transduccin a diferencia de la transformacin, no se ve afectada por las nucleasas en el exterior. No todos los bacterifagos pueden mediar la transduccin. La capacidad del fago para mediar la transduccin, est relacionada con el ciclo de vida del mismo.Este proceso fue desubierto por Ledeberg y Zinder al estudiar la recombinacin de cepas distintas de Salmonella typhimurium.

Cuando el profago pasa al ciclo litico, los virus son capaces de lisar e infectar otras bacterias. En una infeccin, el ADN de la bacteria, se degrada en pequeos fragmentos, y asi el ADN virico se replica.Existe ocaciones en que en lugar de que se empaquete el ADN virico en la capside, se empaquetan los fragmentos del ADN bacteriano. Despus de que ocurre la lisis, los fagos que contienen el ADN bacteriano, son liberados al medio, lo que incita a la infeccin de otras clulas. Cuando el ADN foraneo no se inserta en el cromosoma de la clula receptora, se da una transduccin abortiva, este ADN foraneo slo se transmite a una clula hija. Por el contrario, si el ADN, se inserta con su homlogo en la clula receptora, los genes transducidos se replican, con el cromosoma y pasan a todas las clulas hijas. Todo este proceso requiere de un par de entrecruzamientos para que se lleve a cabo la recombinacin, el mismo que lleva el nombre de transduccin completa. Las transducciones abortivas y completas son dos subtipos de la transduccin generalizada, aunque la mayor parte de transducciones generalizadas son abortivas. La transduccin generalizada se caracteriza por la naturaleza aleatoria, de los genes que sufren la transduccin, ya que cada fragmento tiene probabilidad limitada de ser empaquetado en la capside del fago.

Transduccin Generalizada: La transduccin generalizada es el mecanismo por el cual potencialmente cualquier gen bacteriano de la donadora puede ser transferido a la clula receptora.

Transduccin especializada o restringida: La transduccin especializada es la transduccin en la cual solo ciertos genes del donador pueden ser transferidos al receptor. Diferentes fagos pueden transferir diferentes genes pero un fago individual solamente puede transferir unos pocos genes. La transduccin especializada est mediada por fagos lisognicos o fagos temperados y los genes que se llegan a transferir dependern del lugar donde el profago queda insertado en el cromosoma.Durante la escisin (separacin) del profago, un error llega a ocurrir ocasionalmente en el cual un poco del DNA del husped escinde (se separa del cromosoma) junto con el DNA del fago. Solo puede ser transferido el DNA del husped que est flanqueando cada lado del sitio donde el profago se ha insertado, (ej. transduccin especializada). Despus de la replicacin y la liberacin del fago y a travs de la infeccin de la clula receptora, puede ocurrir una lisogenizacin de la receptora dando como resultado la transferencia estable de los genes de la donadora. La receptora ahora tendr dos copias de los genes que le fueron transferidos. Tambin es posible que se lleve a cabo una recombinacin legtima entre los genes de la donadora y de la receptora.

7.4 Conjugacin bacteriana: plsmidos conjugativos y transferencia de genes cromosmicos

Para conjugar tiene que existir contacto fsico entre la bacteria donadora de ADN y la receptora. La capacidad de donar la proporciona el poseer un plsmido conjugativo que tambin se denomina factor de fertilidad o plsmido sexual.

La conjugacin entre bacterias Gram negativas suele ocurrir a travs de pili sexuales codificados por el plsmido conjugativo (figura 2.4.). Entre stos el mejor estudiado es el plsmido F de Escherichia coli. Las bacterias que lo poseen (F+) sintetizan 2 o 3 pili con los que contactan con bacterias receptoras y se acercan a ellas. Entonces el plsmido F se rompe por un lugar fijo (el origen de transferencia), y una de sus cadenas pasa a travs del puente citoplsmico creado por el Pili, hasta el citoplasma de la clula receptora. Mientras tanto la otra gira en el citoplasma de la donadora (mecanismo del crculo rodante). En ambos citoplasmas se van sintetizando las cadenas complementarias de forma que al final del proceso ambas bacterias poseen un plsmido F completo.Por tanto la conjugacin convierte a la bacteria receptora (F-) a su vez en donadora (F+), lo que acelera el proceso de extensin del plsmido, y puede ocurrir entre bacterias de la misma o de diferentes especies relacionadas. Por eso cuando los genes que proporcionan resistencia a los antibiticos estn en plsmidos conjugativos se extienden muy rpidamente a travs de diversas especies patgenas.

El plsmido F, como otros plsmidos conjugativos, puede integrarse en el cromosoma en forma de episoma Hfr (high frequency of recombination). Si estando integrado se inicia un proceso de conjugacin, el episoma se abre por su origen de transferencia y comienza a pasar a travs del Pili sexual arrastrando a su vez los genes cromosmicos prximos a su punto de integracin. Como estos puntos (integracin y transferencia) no coinciden, pasan primero una parte del plsmido y para que este se complete en la bacteria receptora debera pasar antes el cromosoma completo, lo que tardara unos 100 minutos en ocurrir. Los puentes citoplsmicos suelen romperse mucho antes por lo que cuando una bacteria Hfr conjuga con una F- no suele convertirla en F+. Sin embargo las donadoras Hfr transfieren genes cromosmicos, con mayor frecuencia cuanto ms cerca estn del punto de integracin. Este hecho ha permitido realizar mapas cromosmicos basados en experimentos de conjugacin interrumpidos en diferentes tiempos. Cuando un episoma Hfr se libera del cromosoma a veces el proceso es impreciso e incluye algn gen cromosmico prximo al punto de integracin del plsmido. As se forman los denominados plsmidos F' que en procesos de conjugacin se auto transfieren y transfieren siempre los genes cromosmicos arrastrados.

7.5 Manipulacin gentica de microorganismos y mejora de cepas industriales

Manipulacin gentica de seres vivos se crean nuevas especies. En el caso de los microorganismos se podran estar construyendo nuevos patgenos y con ello nuevas enfermedades.Proliferacin de nuevos microorganismos con caractersticas peculiares y los consecuentes peligros para la especia human. Entre ellos figura la introduccin de genes productores de neoplasias malignas. Es previsible la formacin de microorganismos de una virulencia extraordinaria y resistente a la teraputica conocida.La fuente inicial de un microorganismo es el ambiente y en general, estas cepas producen sus metabolitos en niveles muy bajos, por lo tanto, se hace necesario incrementar estos rendimientos para lograr una mayor rentabilidad de los procesos.

Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimizacin del medio de cultivo y de las condiciones de operacin, pero esto est limitado por la capacidad de sntesis mxima del producto deseado que tiene el microorganismo. La otra posibilidad es el mejoramiento gentico de la cepa.La productividad potencial de un organismo es controlada por su genoma, pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendimientos. Con el organismo modificado, se reexaminan las condiciones del cultivo para lograr nuevamente la mxima productividad.

Por lo tanto los programas de desarrollo involucran una continua modificacin gentica del microorganismo, seguida por una readaptacin del medio de cultivo a los nuevos requerimientos, mejoras de las condiciones de operacin y tambin de los procesos de extraccin y purificacin. La obtencin de cepas modificadas genticamente se puede realizar por:

7.5.1 Mtodos clsicos

7.5.1.1 Mutagnesis: aislamiento de mutantes

Cada vez que una clula microbiana se divide existe una pequea probabilidad de que se produzca un cambio heredable. Una cepa que manifiesta un cambio caracterstico se denomina mutante y el proceso que lo ha ocasionado mutacin.La probabilidad de que esto ocurra puede incrementarse exponiendo el cultivo a agentes mutagenticos fsicos como la luz UV radiacin ionizante o a agentes qumicos como la nitrosoguanidina y cido nitroso.Habitualmente el procedimiento de mutacin mediante el empleo de un agente determinado implica someter a la poblacin a una dosis de mutgeno elegido que ocasiona la muerte para la mayora de las clulas.Posteriormente se realiza el aislamiento de los mutantes (supervivientes) para su posterior ensayo y seleccin de los mutantes adecuados que presentan superior capacidad de produccin.

7.5.1.2 Recombinacin

La recombinacin se define, como el proceso que contribuye a originar nuevas combinaciones de genes que ya estn presentes, al principio, en individuaos distintos. In vitro, la recombinacin puede lograrse en los hongos asexuales, como Penicillum chrysogenum, utilizando el ciclo parasexual.En este procedimiento se involucran los protoplastos, que son clulas carentes de pared, las cuales son sometidas a la accin de enzimas (lisozima) degradantes especficas en soluciones isotnicas.Posteriormente, de los cultivos que se desea fusionar, que de otro modo no se fusionaran, se mezclan y fusionan en presencia de un agente inductor (polietilenglicol 50%) y de dimetil sulfxido en algunos casos, luego se siembran rpidamente en un medio completo para regenerar las clulas.

La incubacin de protoplastos resulta en regeneracin de la pared celular y reversin a una clula de morfologa normal, lo cual es una propiedad crtica, ya que despus de la fusin se desea recuperar un organismo, el cual pueda ser cultivado normalmente en pequea y gran escala.

La fusin celular es seguida por fusin nuclear y protoplastos mixtos resultantes pueden regenerar la pared celular y crecer como una clula normal.

7.5.1.3 Seleccin

Se debe tener en cuenta que en cada divisin celular hay una pequea probabilidad de que ocurra un cambio gentico, por lo cual no es sorprendente que en una gran masa celular la poblacin sea heterognea.Estos cambios definitivos (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones fenotpicas que dependen de las condiciones ambientales y que tienen lugar en todas las clulas de la poblacin que expresan la misma modificacin fisiolgica, dentro de las variaciones permitidas por su genotipo.En las mutaciones espontneas el elemento responsable de la mutacin no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor mutagnico se conoce) son estables y hereditarias y tienen una frecuencia estadsticamente medible (tasa de mutacin).El ejemplo ms espectacular, es el de la penicilina, el antibitico producido por el hongo filamentosos Penicillum chrysogenum. Cuando se produjo por primera vez a gran escala se obtuvieron 1-10 g/ml.A los largo de los aos, como resultado de la mejora de las cepas acopladas a los cambios en el medio y en las condiciones de cultivo, el rendimiento de penicilina aument hasta 50.000 veces. Fenmeno atribuido a la mutacin y seleccin; no estuvo implicada ninguna manipulacin gentica.