GENETIČKO INŽENJERSTVO

5/26/2018 GENETI KO IN ENJERSTVO

1/121

1

GENETIKO INENJERSTVO

genetiko inenjerstvo = in vitromanipulacija genima = tehnologija i analiza

sekvencije rekombinantne DNA (rDNA tehnologija) = biotehnologija == niz postupaka i tehnika koje omoguavaju izolaciju (sintezu) nasljednogmaterijala, njegovu analizu i modifikacije, te ponovo uvoenje i ekspresiju u ivojstanici

brojne i duboke implikacije na:a) temeljne znanosti biologija, kemija (biokemija)b) primijenjene znanosti medicina (dijagnostika), biotehnoloka proizvodnja,

agronomija i proizvodnja hrane, veterina, zatita okolia...c) drutvene i humanistike znanosti pravo, politika, ekonomija, etika, filozofija...

PROIZVODNJA REKOMBINANTNOG HORMONA RASTA jedan od prvih znaajnih koraka u praktinoj primjeni dostignua tehnologije

rekombinantne DNA i upotrebe plazmida pBR322 bio je kloniranje gena za hormonsomatostatin u bakteriju E. coli1977. godine

somatostatin je inhibitor somatotropina (oligopeptid od 14 aminokiselina), hormonaprednjeg renja hipofize koji regulira rast organizma

prije nego to se poeo proizvoditi biotehnoloki iz kloniranog mikroorganizma,somatostatin se dobivao izolacijom iz hipofize goveda ili ljudi, pri emu je bilo potrebnooko 100 kg suhe hipofize da bi se nakon nekoliko stupnjeva proiavanja izoliralo 23.1mg somatostatina za lijeenje ljudi

HUMANI FAKTOR VIII gen veliine 186 kb (!) sadri 25 introna 2 polipeptida (2351 AK) 17 SH mostova

sloena glikozilacija


2/121

2

GENETIKE MANIPULACIJE U BIOTEHNOLOGIJI

replikacija transkripcija translacijaDNA DNA RNA protein

modifikacija eljena promjenau metabolizmu stanice

genetike manipulacije:A) klasine

selekcija spontanih mutacija (prirodna genetika varijabilnost) indukcija mutacija + selekcija

Morgan prvi inducirao mutacije X-zrakama kod Drosophila melanogaster

Demerec prvi mutirao mikroorganizam u biotehnoloke svrhe UV zraenjemmutirao Penicillium notatumtako da je plijesan mogla rasti submerzno utekuem mediju

rekombinacija/krianje + selekcija (klasino oplemenjivanje)B) rDNA tehnologija (rekombinantna DNA)C) kombinacija A) i B)

GENETIKE PROMJENE PROIZVODNIH ORGANIZAMA1. mutacije

A. mutacije u strukturnim genimaa) promijenjena svojstva genskog produkta

npr. kinetika ili stabilnost enzima, otpornost na inhibitore, tehnolokekarakteristike soja...

b) inaktivacija gena npr. nakupljanje ili spreavanje nakupljanja nekog metabolita, sporulacija,

tehnoloke karakteristike soja...B. regulacijski mutanti

mutanti u cis- i trans- djelujuim sekvencijama (represija, derepresija, promjenau regulaciji...)

2. rekombinacije (shuffling)A. nove kombinacije gena i alelaB. rekombinacije izmeu heteroalela novi aleli (rijetko)

3. promjene ploiditeta poljoprivredno biljeA. aneuploidije i poliploidije (alopoliploidi i autopoliploidi)

broj kopija i nove kombinacije genaB. heteropoliploidi

hibridi bliskih vrsta vrlo sloene interakcije


3/121

3

osnovni postupci koji se koriste u genetikom inenjerstvu

konstrukcija proizvodnih sojeva u biotehnologiji:1. promjena ekspresije gena ukljuenih u normalni metabolizam stanice2. proizvodnja heterolognih proteina ekspresijom transgena3. modifikacija postojeih metabolikih puteva sintezom heterolognog enzima

metaboliko inenjerstvo4. modifikacija / sinteza gena za dobivanje novih proteina proteinsko inenjerstvo


4/121

4

vektor = DNA molekula koja se moe replicirati u domainu ili samostalno (replikon)ili se ugradi u DNA domaina

neka podruja primjene genetikog inenjerstva u biotehnologiji genetiki i fizioloki pristup proizvodnji aminokiselina fiziologija i genetika kvasca konstrukcija novih biokatalizatora genetika stabilnost konstruiranih sojeva ekstremofili nitrifikacija / denitrifikacija imunodijagnostika

biotehnologija mlijenih bakterija i micelijskih gljiva genetiki modificirani mikroorganizmi u fermentaciji bioreceptori i antitijela genetika dijagnostika genetiko inenjerstvo i proizvodnja antibiotika analiza genoma od interesa za biotehnologiju nove tehnike rDNA koritenje genetiki izmijenjenih mikroorganizama u obradi agroindustrijskog otpada ekspresija proteina u transgenih ivotinja

ekspresija gena u kulturama stanica taksonomski aspekti u biotehnologiji transgene biljke u proizvodnji molekularni markeri kod ivotinja i biljaka nove vakcine biotehnoloke aplikacije antisense oligonukleotida ekspresija heterolognih gena kod kvasca fiziologija i genetika anaeroba regulacija ekspresije gena fiziologija i genetika streptomiceta ekspresija heterolognih gena kod bakterija


5/121

5

razvoj tehnologije rekombinantne DNA (od 1970.-ih godina) endonukleaze koje reu DNA unutar specifine sekvencije in vitrorekombinacija fragmenata DNA kloniranje / umnoavanje segmenata DNA (gena ili transgena) cilj: proizvodnja u

neogranienoj koliini sekvencioniranje i analiza sekvencije DNA (biokemijska i bioloka karakterizacija

sekvencije DNA) bioinformatika monoklonska antitijela (koriste se u dijagnostici) lanana reakcija polimeraze (PCR) transgene biljke i ivotinje sekvencioniranje cijelih genoma genomika kloniranje sisavaca iz somatskih stanica napraviti genetiki identian organizam DNA ipovi (microarrays) iz boje tokica moe se znati da li se gen pojaano

(plavo) ili smanjeno (crveno) eksprimira sekvencioniranje humanog genoma (individualni genomi!)

RESTRIKCIJSKE ENDONUKLEAZE

RESTRIKCIJSKO-MODIFIKACIJSKI SUSTAV otkrie restrikcijskih endonukleaza

P.E. = plating efficiency = efikasnost nacjepljivanja (1 = 100%)


6/121

6

2 soja E. coli: soj K i soj B soj K inficiran bakteriofagom lambda pripremljena otopina stock = osnovna

suspenzija bakterija i virusa tim stock-om ponovo se inficira soj K i odredi se titar, tj. koncentracija faga (broj

infektivnih estica/mL) dobivena vrijednost oznai se kao P.E. = 1 (100%) tim stock-om inficira se i soj B (oekuje se da e jedna virusna estica jednako

efikasno inficirati oba soja) dobije se vrlo slian broj faga, tj. P.E. = 1 dakle, fagjednako dobro inficira oba soja E. coli

odredi se titar za stock E. colisoj B + virus kad se tim stock-om inficira soj B efikasnost bude P.E. = 1, a kad se inficira soj K

efikasnost bude P.E. = 10-4 ( samo 1 od 10000 faga inficira soj K E. coli) dakle, suspenzija faga izolirana iz soja B E. colidobro inificira soj B, ali slabo inficira

soj K objanjenje: u soju K dolazi do restrikcije, tj. do masovne degradacije virusne DNA jer soj K E.

coliproizvodi jednu endonukleazu koja degradira virusnu DNA

uloga te endonukleaze je da zatiti bakterijsku stanicu od virusa i stranih DNA kojemogu ui u bakteriju

taj fenomen je nazvan restrikcija, a enzimi restrikcijskim enzimima soj B E. colinema restrikcijsko-modifikacijski sustav

pitanje: kako restrikcijske endonukleaze ne degradiraju i DNA E. coli? zato to se E. colisamozatiti pomou metilaze modifikacijom ima specifino

obiljeene neke baze u DNA soj K: P.E. = 10-4 plakova je malo, ali ipak ih ima, jer metilaza djeluje na unesenu DNA

prije restrikcijske endonukleaze

restrikcijsko-modifikacijski sustav: modifikacija se sastoji u metilaciji adenina (N6-metiladenin) i/ili citozina (5-

metilcitozin ili N4-metilcitozin), u sekvenciji koju prepoznaje restrikcijski enzim baze modificira modifikacijski enzim metilaza

do metilacije dolazi nakon replikacije DNA najbolji supstrat za modifikacijsku metilazu je hemimetilirana DNA stanica moe imati modifikacijski sustav a da nema restrikcijski, ali stanica koja ima

restrikcijske enzime mora imati i modifikacijske enzime jer bi inae degradiralavlastitu DNA restrikcijsko-modifikacijski sustav

fizioloka uloga R-M sustava: prepoznavanje i degradacija/razgradnja strane DNA(time se automatski smanjuje horizontalni prijenos gena)

zato se kao domaini za transformaciju koriste sojevi E. colikoji nemaju R-M sustav


7/121

7

RESTRIKCIJSKE ENDONUKLEAZE specifine endonukleaze bakterijskih restrikcijsko/modifikacijskih sustava koji imaju

ulogu zatite genetikog integriteta stranice od strane DNA (nema ih kod eukariota) prepoznaju tono odreene specifine sekvence u DNA i u njoj ili blizu nje uvode

specifine dvolanane lomove najvaniji enzimi koji se koriste u genetikom inenjerstvu njihovo otkrie je

omoguilo razvoj genetikog inenjerstva restrikcija DNA degradacija, "inaktivacija" DNA modifikacija DNA zatita od restrikcije

3 skupine restrikcijskih endonukleaza razliiti mehanizmi reakcije i vanost:1. I skupina

reu nespecifino 100-1000 bp od sekvencije prepoznavanja 3 gena: hsdM + hsdS i hsdRjedan kompleks (enzim) i za modifikaciju i za

restrikciju M metilira, S prepoznaje, a R cijepa specifinu sekvenciju

potrebno: SAM ( S-adenozil-metionin univerzalni donor metilne skupine zametilacijske procese u stanici), ATP, Mg2

+

nemaju komercijalnu vanost, tj. vie se ne koriste jer uvode lomove nanespecifina mjesta

2. II skupina prepoznaju specifinu "palindromsku" sekvenciju = isti redoslijed nukleotida u

oba lanca (ali u istom smjeru polarnosti 5'3'!) palindromska sekvencija moe biti tetra, penta, heksa, hepta ili oktanukleotid

(veina restrikcijskih enzima prepoznaje heksanukleotidne sekvencije)

restrikcijski enzimi mogu rezati palindrom:a) unutar sekvencije (Mg2

+!) - 2 gena, odvojene aktivnostib) na odreenom mjestu pokraj sekvencije prepoznavanja

3. III skupina slini I skupini, ne koriste se reu na udaljenosti od 25-27 bp od mjesta prepoznavanja, asimetrina sekvencija

(Mg2+, ATP)

2 gena, jedan kompleks (Res i Mod)4. (IV. skupina Mcr/Mrr - reu modificiranu DNA, tj. tite bakterije od modificiranih

faga jer neki fagi imaju svoje vlastite modifikacijske sustave, ali ovi ih enzimiprepoznaju!)

meganukleaze npr. I-Scel poseban tip restrikcijskih enzima koji prepoznaje niz od 18 bp unutar kojeg cijepa

DNA ostavljajui 3 izduene krajeve

budui da je vjerojatnost takvog rasporeda baza u DNA mala, ovaj enzim se koristi

za kloniranje i mapiranje gena vjerojatnost pojave ovakvog rasporeda od 18 bp je jednom u 6,9x1010 bp (ili jednom u

svakih 20 humanih genoma)


8/121

8

OSNOVNE KARAKTERISTIKE RESTRIKCIJSKIH ENZIMA1. utjecaj metilacije DNA

metilacija esto inhibira aktivnost restrikcijskih enzima zato se u laboratorijukoriste sojevi bakterija koje nemaju restrikcijsko-modifikacijski sustav

GATC GA*TC

MboI, NdeI + -

Sau3A + +

DpnI - +

2. nomenklatura npr. EcoRV ili EcoR V prvo slovo imena je prvo slovo roda, a drugo i tree slovo imena su prvo i drugo slovo

vrste iz koje je izoliran dotini restrikcijski enzim

3. palindrom!4. krajevi - naini rezanja restrikcijskih enzima

a) po simetrali, tako da nastanu ravni / blunt krajevib) tako da ostane po nekoliko nesparenih nukleotida ili na 5' (5' fosforil) ili na 3' (3'

hidroksil) kraju (velika razlika, jer ako je 3' kraj uvuen, rupa se moe popuniti)c) kohezivni kompatibilni krajevi npr. SalI i XhoI prepoznaju razliite sekvence, ali

daju kompatibilne krajeve koji mogu meusobno hibridizirati

5. izoshizomeri (npr. SmaI i XmaI) = restrikcijski enzimi iz razliitih mikroorganizama koji

prepoznaju istu sekvenciju, ali ju zarezuju na razliit nainstriktni izoshizomeri = restrikcijski enzimi koji reu istu sekvenciju na potpuno istinain, tako da nastaju isti krajevi

restrikcijski enzimi - primjer


9/121

9

PRAKTINI ASPEKTI1. jedinica aktivnosti restrikcijskih enzima

1 unit = ona aktivnost, tj. koliina enzima potrebna da se pri optimalnimuvjetima za jedan sat potpuno poree 1g DNA bakteriofaga lambda u volumenuod 50 l

2. puferi za restrikcijske enzime regulator pH: najee Tris-HCl (10 mM) (pH = 7-9) (Tris = 2-amino-2-hidroksimetil-

1,3-propandiol hidroklorid ili Tris (hidroksimetil) aminometan)

dvovalentni kation: MgCl2 - 10 mM monovalentni kation: NaCl ili KCl, 0-150 mM

reducens za disulfidne veze - stabilnost enzima: -merkaptoetanol ili ditiotreitol(DTT)

pripremaju se koncentrirane otopine pufera (10x) i uvaju se u friideru3. temperatura

za veinu restrikcijskih enzima optimalna temperatura je 37C (rijetki trae niu T,ali ima onih koji trae i viu) (25-65C)

4. najee se radi s volumenima od 10-50 L (1 kap = 50 L)5. zaustavljanje reakcije - stabilnost, inaktivacija toplinom ili pomou EDTA

zagrijavanje 20 minuta/65C (ne na puno viu temperaturu jer bi se mogla

denaturirati DNA, a i sami restrikcijski enzimi su termolabilni, osim nekih iznimnihkoji su termostabilni)

kompleksiranje Mg2+ iona (potrebni za aktivnost restrikcijskih enzima) pomou EDTA

(etilendiamintetraoctena kiselina kelatni agens) stabilnost pri produenoj inkubaciji? cijena (najskuplji : najjeftiniji do 1 : 1000 !)

vie od 600 restrikcijskih enzima komercijalizirano (2007.)!

TALOENJE DNA1. podesiti koncentraciju monovalentnih kationa (da se neutraliziraju negativni naboji od

fosfata na DNA) (NaAc 0,25M ili NaCl - 0,1M ili NH4Ac - 2,0 M)2. dodati dva volumena etanola (jedan volumen izopropanola)3. ohladiti (1 sat na -20C)4. centrifugirati (15 minuta / 10.000 g)5. isprati talog (70% etanol), osuiti, otopiti u TE puferu (TE = 10 mM Tris-HCl, pH=7,6; 1

mM EDTA)


10/121

10

OSTALI ENZIMI ZA MANIPULACIJU DNA1. NUKLEAZE upotreba:

dobivanje linearne DNA kao kalupa za DNA polimerazu priprava specifine sonde za odreeni lanac DNA priprava stupnjevito skraenih fragmenata DNA za sekvencioniranje

1.1.RNaze jako su termorezistentne teko se inaktiviraju RNaza A (govei pankreas) - cijepa fosfodiestersku vezu u RNA ostavljajui kod

pirimidinskih nukleotida 3 fosfatnu skupinu

RNaza H (E. coli) cijepa RNA u RNA/DNA hibridima do kratkih oligoribonukleotida

1.2.nukleaza S1 (Aspergillus orysae) degradira jednolananu DNA do 5 fosforil mono- ili oligonukleotida napada i prekide u DNA, a u velikoj koliini i dvolananu DNA, dok je najrezistentniji

DNA/RNA hibrid djeluje na niskom pH (4,5) i treba Zn2+

upotreba:

S1 mapiranje uklanjanje ssDNA krajeva u dsDNA uklanjanje ukosnica nastalih pri sintezi cDNA

1.3.nukleaza Bal31 (Alteromonas espeijana) slino kao i S1, ali degradira i krajeve dvolananih molekula delecije u DNA, progresivno skraivanje DNA

1.4.DNaza I (govei pankreas) degradira i jednolananu i dvolananu DNA ostavljajui 5 fosforil krajeve

u prisutnosti Mg

2+

nasumice uvodi lomove, a u prisutnosti Mn

2+

na jednom mjestu, nakomplementarnim lancima (kao nespecifini restrikcijski enzim)

1.5.egzonukleaza III (E. coli) 35 egzonukleaza, potreban slobodan kraj za stvaranje delecija, zajedno s S1 nukleazom

2. FOSFATAZA I POLINUKLEOTID KINAZA fosfataza uklanja 5 fosfat s jednolanane i dvolanane DNA, RNA i nukleotida

spreavanje neeljene ligacije (recirkularizacija plazmida razgraenog jednim

restrikcijskim enzimom) polinukleotid kinaza katalizira prijenos fosfata s ATP-a na 5-OH kraj u DNA ili RNA

primjena: obiljeavanje 5 kraja u DNA zamjenom s radioaktivnim 32P


11/121

11

3. DNA POLIMERAZE

Kornberg i suradnici - 32P ili 14C dNTPs + ekstrakt stanica

H radioaktivni talog

(DNA) + supernatant (dNTPs) DNA polimeraza I 3 karakteristine aktivnosti:

1. 53 polimerazna aktivnost

za sintezu potrebni: kalup, klica sa slobodnim 3 OH krajem, Mg

2+

, dNTPs

2. egzonukleazna aktivnosta) 35 egzonukleazna / proof-reading (korektivna, lektorirajua) aktivnost

stimulirana zadnjim nesparenim nukleotidom

b) 53 egzonukleazna aktivnost stimulirana jednolananim prekidima u DNA

enzimskom hidrolizom DNA polimeraze I mogu se odvojiti aktivnosti na 2 podjedinice:a) 53 egzonukleazna (Mr = 45.000)b) Klenow fragment (Mr = 68.000)

= 53 polimerazna aktivnost + 35 egzonukleazna aktivnost

POLIMERAZA egzo 35 egzo 53 procesivnost

E. coliPolimeraza I + ++ +

Klenow fragment* + - +

T4 DNA polimeraza +++ - +

T7 DNA polimeraza +++ - +++

T4 DNA polimeraza** - - +++

Taq polimeraza*** - - +++

VentTM polimeraza + - +++


12/121

12

* 70% PolI (C-terminalni dio)** genetiki modificirana, kako bi se mogli polimerizirati i analozi normalnih baza*** optimalna temperatura 75-80C, Thermus aquaticusi Thermococcus litoralisprocesivnost = oznaava vrijeme koliko dugo neki enzim ostaje vezan za supstrat (DNA),

odnosno nakon koliko dugo vremena e neki enzim disocirati s DNA

DNA polimeraze koriste se za: sintezu DNA prema nekom kalupu pretvaranje 5 i 3 krajeva u ravne krajeve amplifikaciju gena (PCR) in vitromutagenezu obiljeavanje DNA (radioaktivni nukleotidi (-32P dNTPs), analozi) razliite polimeraze za specifinu upotrebu

na tritu danas ima oko 10ak polimeraza

3.1. NEKE SPECIFINE POLIMERAZE3.1.1. terminalna deoksinukleotidil transferaza (terminalna transferaza iz goveeg

timusa) ne treba kalup nego nasumino polimerizira nukleotide dodaje deoksinukleotide na 3 OH slobodan kraj ss ili ds DNA upotreba:

banke gena npr. ako su fragmenti DNA dobiveni mehaniki, na vektor se moedodati poli-dA, a na fragmente poli-dT

obiljeavanje DNA na 3 kraju

3.1.2. RNA-ovisna DNA polimeraza = reverzna transkriptaza (iz retrovirusa,rekombinantna iz E. coli)

sinteza DNA na RNA kalupu upotreba: konstrukcija cDNA biblioteka (iz mRNA; u vektore se stavlja samo kodirajua

DNA) postupak:


13/121

13

3.1.3. RNA polimeraze za sintezu velikih koliina mRNA in vitro RNA polimeraze virusa SP6, T7, T3 - vrlo jaki promotori neki plazmidni vektori imaju jake viralne promotore, pa se ove polimeraze koriste za

transkripciju s tih jakih promotora jake radioaktivne probe

4. DNA LIGAZE slue za povezivanje linearnih molekula DNA kataliziraju stvaranje fosfodiesterske veze izmeu 5-fosforil skupine jednog

nukleotida i 3-hidroksil skupine susjednog nukleotida najbolji supstrat je dvolanana DNA s prekidima fosfodiesterske veze (nickovi)

osim nickova u DNA, dobar supstrat su i linearne molekule s kompatibilnim(kohezivnim, ljepljivim) krajevima (koji su nastali djelovanjem restrikcijskih enzima), amogu se povezivati i neke DNA s ravnim (blunt) krajevima, iako puno tee

komercijalno vane DNA ligaze: T4 DNA ligaza

porijeklom iz bakteriofaga T4 povezuje tupe/ravne krajeve (blunt ends) koristi ATP kao koenzim

DNA ligaza iz E. coli povezuje ljepljive krajeve (sticky ends) ne moe povezivati ravne krajeve

koristi NAD

+

kao koenzim


14/121

14

LANANA REAKCIJA POLIMERAZOMPCR = Polymerase Chain Reaction

revolucionarna metoda koja je omoguila praktiki neogranieno dobivanje fragmenataDNA te kloniranje gena in vitro(Kary Mullis, Nobelova nagrada 1993. godine)

koristi se za amplifikaciju / umnoavanje bilo kojeg fragmenta iz nekog uzorkaDNA ciljana/target DNA cell-free metoda kloniranja DNA termocikler = aparat za PCR nuan uvjet: potrebno poznavati slijed rubnih oligonukleotida fragmenta DNA koji

se eli umnoiti (da bi se mogli sintetizirati primeri) za reakciju potrebno:

1. odgovarajui oligonukleotidni primeri duljina: 15-30 nukleotida

konstruirani tako da budu udaljeni 200-2000 bp komplementarni 3 krajevima ciljane sekvence DNA jedan se vee za jedan lanac DNA, a drugi za drugi lanac DNA i to orijentirani

tako da su njihovi 3 krajevi usmjereni jedan prema drugome supstrati za DNA polimerazu

2. termorezistentna DNA polimeraza (Taq)3. odgovarajue otopine (dNTPs, Mg2+, pH ...)

postupak - faze:1) denaturacija

prvo se izolira cijela dsDNA i zagrije 20-30 sekundi na 95C da se razdvoje dvalanca uzvojnice denaturacija DNA

2) hibridizacija klice reakcijska smjesa postupno se ohladi na temperaturu hibridizacije (50-55C, 90

sekundi) u prisutnosti suvika dva oligonukleotidna primera dolazi do hibridizacije

komplementarno povezivanje primera s komplementarnim dijelovima dvarazdvojena lanca DNA

3) sinteza DNA ekstenzija klice

nakon toga se reakcijska smjesa zagrijava na optimalnu temperaturu za sintezuDNA (70-75C), tj. za aktivnost DNA polimeraze koja se vee na primere i vrisintezu komplementarnih lanaca DNA od primera (dodaje nukleotide na 3 krajsvakog primera vezanog na DNA; 1000 nt/min)

time je zavren prvi ciklus nakon kojeg se u reakcijskoj smjesi nalaze dvije kopijeciljane dsDNA

ponovnim zagrijavanjem reakcijske smjese na 95C prekida se daljnjeproduljivanje primera, dolazi do razdvajanja lanaca dvostruke uzvojnice DNA izapoinje sljedei ciklus

kako se ovaj postupak viestruko ponavlja, novosintetizirani fragmenti DNA sluekao kalupi za daljnju amplifikaciju, te se u kratkom vremenu moe sintetiziratimnogo kopija originalne ciljane sekvence DNA


15/121

15

nakon zadnjeg ciklusa uzorak se zagrije 5-10 minuta na 70C da se osigurazavretak produljenja svih primera

na ovaj nain u svakom se ciklusu udvostrui broj DNA molekula, pa se ciljnifragment DNA nakuplja eksponencijalno 2n, n = broj ciklusa (nakon 2. ciklusa ureakcijskoj smjesi se nalaze 4 kopije ciljane dsDNA, nakon 3. ciklusa u 8 kopijaciljane dsDNA...)


16/121

16


17/121

17

umnoeni fragmenti DNA mogu se odvojiti elektroforezom od ostatka reakcijskesmjese i nakon toga izolirati iz gela

reakcija se najee ponavlja 25-35 ciklusa (225 230 fragmenata) pojedinani ciklus traje due, zbog usporenog prijelaza topline (ovisno o ureaju - danas

i kapilarni ureaji s vruim zrakom!) u prvih 22 ciklusa amplifikacija 106x

efikasnost reakcije smanjuje se porastom broja ciklusa vrlo je vaan izbor optimalnih klica! hot start protokol: DNA polimeraza se dodaje nakon stupnja toplinske denaturacije u

prvom ciklusu i to na temperaturi hibridizacije, kako bi se sprijeilo nespecifinozapoinjanje reakcije (parazitski fragmenti)

u poetku se PCR provodio s Klenowim fragmentom nedostatak: morao se dodavati u reakcijsku smjesu tijekom svakog ciklusa nakon

svakog stupnja denaturacije jer se razgraivao na visokoj temperaturi potrebnoj zarazdvajanje lanaca DNA

prednost: vjernost replikacije vea nego kod Taq polimeraze do ugradnje krivognukleotida dolazi 10 puta rjee

danas se koristi termorezistentna Taq polimeraza (izolirana iz termofilne bakterijeThermus aquaticus) prednost: termorezistentna je, tj. provodi produljivanje lanaca pri visokoj

temperaturi nedostatak: nema 3'5' proofreading egzonukleaznu aktivnost niska vjernost

replikacije mutacije! (posebne polimeraze s lektorirajuom 3 5 egzonukleaznomaktivnou); meutim te se pogreke mogu zanemariti s obzirom na koliinu tonoumnoenih fragmenata eljene DNA

amplifikacija fragmenata do 4-5 kb, za vee fragmente posebni protokoli (do 20 kb long range PCR)

prednosti: puno bre nego upotreba vektora potrebna mala koliina ciljane DNA lako se mogu otkriti neke mutacije slui za otkrivanje HIVa u krvi

nedostaci: potrebno znati sekvence nukleotida na krajevima ciljane DNA da bi se moglosintetizirati primere

ne mogu se amplificirati fragmenti DNA dui od 5 kb upotreba:

dijagnostike metode za otkrivanje genskih poremeaja umnoavanjempotencijalno mutiranog gena i njegovom hibridizacijom sa specifinim probama(nemutirani gen) mogue je razlikovanje normalnih od mutiranih gena

kriminalistika

otkrivanje infekcije virusom, posebno HIVom, nakon njegove ugradnje u DNAdomaina


18/121

18

KVANTITATIVNI / REAL-TIME PCR koristi se za amplifikaciju ciljane DNA i kvantifikaciju, tj. istovremeno odreivanje

koncentracije DNA (PCR produkta) u uzorku teoretski postoji kvantitativni odnos izmeu koliine poetnog materijala (target

sequence) i koliine PCR produkta u bilo kojem ciklusu

amplificirana DNA se kvantificira kako se nakuplja u reakciji u real time, tj. stvarnomvremenu nakon svakog amplifikacijskog ciklusa

koriste se fluorescentne boje koje interkaliraju u dsDNA, tako da se u realnom vremenuprati inkorporacija fluorescentnog prekursora u DNA

poveanje koliine DNA produkta tijekom PCR dovodi do poveanja intenzitetafluorescencije koja se mjeri u svakom ciklusu, to omoguava kvantifikacijukoncentracije DNA

pomou standarda odreuje se koncentracija ciljne molekule

Cn = C0 x En

Cn = koliina ciljne sekvencijenakon nciklusa ako je C0 poetna

koncentracija ciljne DNA

E = efikasnost amplifikacije(teoretski: E = 2)

prati se porast fluorescencijenakon neke kritine vrijednosti to je via C0 ranije se postignekritina vrijednost

interna kontrola, ako se eliodrediti omjer dviju poetnihkoncentracija odreivanje GMO unamirnicama


19/121

19

VEKTORI I DOMAINI U GENETIKOM INENJERSTVU

DOMAIN BAKTERIJA Escherichia coli bakterija Escherichia coli univerzalni domain za kloniranje; izuzetno se koriste i neki

drugi mikroorganizmi

u opisu geotipa navode se samo geni koji su mutirani (Demerec 1966. uveo nomenklaturu) geni se oznaavaju s 3 mala slova kojima se moe dodati jedno veliko, u kurzivu ilipodcrtano (npr. recAili recA)

oznake - i + mogu se navesti da se naglasi prisutnost divljeg tipa ili mutiranog alela, astavljaju se i uz oznaku fenotipa (npr. Lac-)

specifini alel nekog gena oznaava se brojem (npr.pyrF3) prisutnost profaga i plazmida oznaava se zagradama prisutnost ili odsutnost F faktora (i njegovih derivata) moe se navesti na poetku opisa

genotipa

oznaava deleciju, iza ega se u zagradi navodi koji je dio deletiran neke uobiajene mutacije u laboratorijskim sojevima E. colikoji se koriste u genetikom

inenjerstvu dam metilacija GATC sekvencije dcm metilacija CCWGG sekvencije hsdR- restrikcija u hsd RM sustavu (r-m+) hsdS- restrikcija i modifikacija u hsd RM sustavu (r-m-) mcrA; mcrBC restrikcija sekvencija s modificiranim citozinom mrr restrikcija sekvencija s modificiranim citozinom i adeninom

lacZ strukturni gen za galaktozidazu (lac-proAB) delecija fragmenta od lacoperona doproABoperona recA homologna rekombinacija endA1 egzonukleaza1 recFi recJ homololgna rekombinacija meu plazmidima ung uracil N-glikozidaza

najee koriteni sojevi E. coli


20/121

20

VEKTORI vektori (prijenosnici) = DNA molekule u koje se jednostavno moe integrirati strana

DNA da bi se takva rekombinantna molekula uvela u stanicu domaina i tamo seumnoila

bifunkcionalni / shuttle vektori = vektori ija konstrukcija omoguava razmjenugenetikog materijala izmeu dva razliita organizma (svi vektori se repliciraju u E.coli, ali shuttle vektori se mogu replicirati i u E. colii u nekom drugom organizmu, npr.Saccharomyces cerevisiae)

osnovna svojstva dobrog vektora samostalna replikacija u bakteriji E. coli pravilna segregacija stabilnost inserta male dimenzije veliki broj kopija po stanici jednostavna izolacija iz E. coli

to vei broj jedinstvenih mjesta za djelovanje restrikcijskih enzima selektivni biljezi:

jednostavna selekcija stanica koje sadre vektor (veina stanica se netransformira, pa treba moi lagano izolirati transformante)

jednostavna selekcija vektora koji sadre insert svi vektori koji se danas rutinski koriste potjeu od prirodnih replikona (plazmidi ili

virusi), ali su doivjeli znaajne promjene in vitromanipulacijama podjela vektora prema porijeklu:

1. plazmidni vektori2. virusni vektori3. kombinacija plazmidnih i virusnih vektora (kozmidi)4. umjetni kromosomi (YAC, BAC, PAC, MAC = mammalian artificial chromosome ?)

PLAZMIDI ekstrakromosomalni samoreplicirajui genetiki elementi replikoni! vrlo esti kod bakterija, ali postoje i kod nekih niih eukariota

repliciraju se nezavisno o replikaciji kromosoma domaina, jer imaju vlastitoishodite replikacije ori pojavljuju se u 3 oblika:

1) kruna dsDNA - najee2) linearna dsDNA3) kruna ssDNA

veliina: od 1.5 do vie od 300 kb mogu nositi razliite gene koji utjeu na fenotip domaina: rezistencija na

antibiotike i/ili teke metale, produkcija toksina (npr. kolicin), faktor virulencije

(virulentnost Agrobacterium tumefaciensovisi o postojanju Ti konjugativnog plazmida(Ti = tumor-inducing)), sposobnost razgradnje odreenih supstrata (laktoze, toluena iksilena)


21/121

21

konjugacijski plazmidi imaju sposobnost prelaska iz jedne stanice u drugu, nose veibroj gena, nalaze se u stanici u manjem broju kopija i repliciraju se usklaeno sbakterijskim kromosomom

kriptiki plazmidi ne uzrokuju promjenu fenotipa stanica moe sadravati razliite plazmide samo ako su kompatibilni (srodni plazmidi

esto su inkompatibilni, pa tijekom rasta dolazi do eliminacije jedne vrste plazmida)

REGULACIJA BROJA KOPIJA PLAZMIDA S ISHODITEM REPLIKACIJE IZ ColE1 broj kopija plazmida regulira se pomou antisense RNAI


22/121

22

replikacija zapoinje sintezom RNAII 550 pb uzvodno od oriV replikacija se odvija i preko ishodita, nakon ega RNaza H zarezuje RNAII transkript

u RNA/DNA hibridu, ime nastaje klica za replikaciju plazmida (na slici pod A) daljnja sinteza DNA odvija se dodavanjem deoksiribonukleotida na 3 OH kraj RNAII

klice pomou DNA polimeraze III RNAI je transkript suprotnog (antisense) lanca DNA i komplementarna je s prvih 108

pb RNA II vezanjem antisense RNAI na poetak RNAII formira se specifina sekundarna

struktura ime nastaje stabilan RNA/RNA kompleks

s obzirom da Rnaza H zarezuje RNA samo u RNA/DNA kompleksu, ovime je sprijeenonjeno djelovanje, pa ne nastaje klica nema replikacije plazmida (na slici pod B)

RNAI/RNAII kompleks je stabiliziran prisutnou proteina Rop ravnotea se postie kad u stanici bude 20 kopija plazmida mutacije u genima RNAI, RNAII ili Rop dovode do poveanog broja kopija plazmida

SEGREGACIJSKA NESTABILNOST PLAZMIDA segregacijska nestabilnost plazmida = gubitak plazmida tijekom diobe stanice


23/121

23

STRUKTURNA NESTABILNOST PLAZMIDA strukturna nestabilnost plazmida nastaje delecijom, insercijom ili preraspodjelom

dijelova plazmidne DNA u stanici este su spontane delecije, koje mogu biti rezultat homologne rekombinacije izmeu

kratkih ponavljajuih sljedova u plazmidu

UTJECAJ RAZLIITE BRZINE RASTA NA GUBITAK PLAZMIDA


24/121

24

PLAZMIDNI VEKTORI KONSTRUIRANI in vitro veliina inserta: 10-15 kb

1. plazmidni vektori 1. generacije pBR313, pBR322, pBR328... mali broj kopija po stanici samo 20ak amplifikacija pomou kloramfenikola u kasnoj log fazi rasta

kloramfenikol spreava de novosintezu proteina, pa nema inicijacije replikacijekromosoma kultura se zaustavi u eksponencijalnoj fazi rasta, ali je mogua replikacija plazmida

do 200 kopija! genetiki biljezi za selekciju plazmida i inserta nose rezistenciju na neki antibiotik:

kanamicin (sinteza proteina): KmR (aph, aminofosfotransferaza fosforilacija) tetraciklin (sinteza proteina): TetR (tetA, iznosi tetraciklin iz stanice antiporter) ampicilin (sinteza peptidoglikana): AmpR (bla, -laktamaza)

kako poveati efikasnost transformacije:

1) insert u suviku u odnosu na vektor (7-8 inserata na jedan vektor)2) dodatak fosfataze

nakon to se vektor poree restrikcijskim enzimom, doda mu se fosfataza kojaodcijepi fosfatne skupine s 5 kraja, ime je sprijeena cirkularizacija samogvektora sa sobom ili s drugim takvim vektorom, odnosno cirkularizacija je moguajedino s insertom koji ima fosfatnu skupinu

pBR322 prvi in vitrokonstruirani plazmid jedan od najee koritenih

plazmida u kloniranju veliina: 4361 bp vie od 20 jedinstvenih mjesta za

restrikcijske enzime kako je sekvencioniran, njegovi

fragmenti dobiveni djelovanjemrestrikcijskih enzima slue kaostandard pri gel elektroforezi


25/121

25

2. plazmidni vektori 2. generacije pUC8, pUC9, pUC18, pUC19... mutacije u genu za RNAI ili RNAII reguliraju broj kopija plazmida u stanici

500-700 kopija po stanici pri uzgoju na 37C 20-tak kopija po stanici pri uzgoju na 30C (smanjeni broj kopija poeljan je kad

klonirani gen kodira za produkt koji je toksian za domaina u velikim koliinama) sadre dio lacoperona koji kodira za-fragment (N-terminalni dio) -galaktozidaze

polilinker = MCS = multiple cloniong site = viestruko mjesto za kloniranje =sintetski oligonukleotid koji sadri 10-20 mjesta koja prepoznaju restrikcijski enzimi insertirano 54 pb u sam N-terminalni dio LacZgena insercija 18 aminokiselina ne

utjee na aktivnost! male dimenzije (< 3 kb!) selekcija inserta: lacZ -komplementacija (domain!)

- KOMPLEMENTACIJA

domain: E. colikoja ima deletiran N-terminalni -fragment lacZgena (delecija lac-proAB; F lacIq(lacZ) M15proA+proB+) plazmid: sadri dio lacoperona koji kodira za N-terminalni -fragment -

galaktozidaze Xgal (5-bromo-4-kloro-indoil--D-galaktozid) je supstrat za -galaktozidazu, ijim

cijepanjem nastaje plavo obojani produkt IPTG (izopropilD-tiogalaktozid) je induktor ekspresije lacZoperona (inhibitor lac

represora) u prisutnosti IPTG bakterija sintetizira N-terminalni -fragment koji je kodiran

genom lacZiz vektora i C-terminalni -fragment koji je kodiranim genomomdomaina, ime nastaje funkcionalna -galaktozidaza -komplementacija nastala -galaktozidaza cijepa Xgal zbog ega E. colitvori plave kolonije


26/121

26

insercijska inaktivacija insercijom fragmenta DNA u MCS unutar lacZgenadolazi do inaktivacije N-terminalnog -fragmenta -galaktozidaze, zbog ega nedolazi do komplementacije, odnosno ne nastaje funkcionalna -galaktozidaza, pabakterije s rekombinantnim plazmidom tvore bijele kolonije


27/121

27

3. plazmidni vektori 3. generacije pTZ18, pTZ19, pEMBL, pGEM, pBluescript imaju IG (intergenu) regiju bakteriofaga M13 ili f1 koja omoguava izolaciju plazmida u

jednolananom obliku fagmid = fag + plazmid plazmidi s malim brojem kopija imaju ugraena 2 razliita promotora kraj polilinkerajaki promotori T7, T3 i SP6

bakteriofaga potrebno za in vitrotranskripciju dobije se velika koliina transkripta promotori za viralnu RNA polimerazu obino se nalaze jedan lijevo, a drugi desno od

mjesta za kloniranje orijentacija smjera prepisivanja promotora jedna nasuprot drugoj

ekspresijski vektori mnogi vektori imaju promotore koje prepoznaju RNA polimeraze domaina tako da se

klonirani fragment odmah moe eksprimirati kako bi se dobila jaka in vivoekspresija

VIRUSNI VEKTORI NA OSNOVI BAKTERIOFAGA na osnovi:

bakteriofaga lambda jednolananih filamentoznih virusa P1virusa (M13, fd, f1)

BAKTERIOFAG LAMBDA linearna dsDNA 48.514 bp, 60-ak gena cossekvencije = jednolanani komplemetarni kohezivni krajevi od 12 nukleotida

ljepljivi krajevi/ sticky ends nastaju cijepanjem u cossekvenciji pomou enzima

terminaze nakon infekcije se ljepljivi krajevi povezuju DNA ligazom cirkularizacija genoma 2 tipa replikacije: najprije theta, a zatim rolling circle replikacija kojom nastaju

konkatameri (multimeri) virusnog genoma sekvencijalna ekspresija gena:

1. rani geni2. odgoeni rani geni3. kasni geni

temperirani virus moe ui u lizogeni ciklus

vrlo dobro karakteriziran, veliki broj mutanata neke velike delecije vijabilne


28/121

28

da bi nastala infektivna estica, glava virusa mora biti puna infektivna estica nastaje kada se u kapsidu upakira 3951 kb izmeu dviju cos

sekvencija kad bi se u virusni genom ubacio neki insert, cijeli genom faga s insertom ne bi se mogao

upakirati u kapsidu, jer u nju ne stane vie od 50 kb zato se iz virusnog genoma ukloni fragment genoma od 11 kb dio za regulaciju

odgovoran za lizogeni ciklus, tako da se u ovakav vektor mogu uklonirati fragmentimaksimalne duljine 11 kb (5% duljine genoma faga) supstitucijski vektor

wt lambda fag sadri nekoliko restrikcijskih mjesta za svaki od najee koritenihrestrikcijskih enzima, pa kao takav nije dobar vektor

konstruirani su derivati wt faga lambda koji imaju mnogo jedinstvenih restrikcijskihmjesta

takoer su konstruirani derivati faga lambda kod kojih se moe deletirati i do 25%

genoma a da se ne izgubi sposobnost stvaranja plakova mogu se insertirati veifragmenti DNA


29/121

29

POSTUPAK KLONIRANJA POMOU BAKTERIOFAGA LAMBDA1) cijepanje vektora restrikcijskim enzimom (npr. EcoR I)

a) insercijski vektori u MCS se insertira fragment DNA duljine do 12 kbb) supstitucijski vektori neesencijalni dio genoma (11 kb) se izrezuje i zamjenjuje

fragmentom DNA duljine 9-23 kb

2) eliminacija sredine kod supstitucijskog vektora (gel elektroforeza)3) dodavanje fragmenata genomske DNA s komplementarnim krajevima4) ligacija pomou DNA ligaze5) in vitropakiranje = DNA + glava + rep

inserti kod insercijskog vektora do 11 kb, a kod supstitucijskog od 8 do 22 kb ukupna veliina DNA od 39 do 51 kb, s cossekvencijama na krajevima!

6) infekcija bakterije E. coli7) selekcija plakova s insertom (boja - plavo/bijelo (-galaktozidaza); bistri plakovi zbog

inaktivacije gena cI)

prednost: efikasnost transformacije 1000 puta vea nego kad se koriste plazmidnivektori

nedostatak: DNA se mora izolirati iz plakova poeljno kloniranje jo veih fragmenata upotreba kozmida

in vitroPAKIRANJE princip: osigurati visoku koncentraciju kapsida, repova i proteina za pakiranje

rekombinantne DNA sklapanje infektivnih virusnih estica in vitrokomplementacijom:

1) 2 lizogena soja faga: jedan soj ima mutaciju u genu D koji kodira enzim potreban za pakiranje ovi

mutanti proizvode kapside, ali ne mogu u nju upakirati DNA, to dovodi donakupljanja praznih kapsida

drugi soj ima mutaciju u genu E koji kodira glavni protein kapside ovi mutantine mogu proizvesti kapside, ali mogu proizvesti sve ostale komponente faga,to dovodi do njihovog nakupljanja, kao i nakupljanja ostalih proteina i enzima

potrebnih za pakiranje2) indukcija litikog ciklusa - priprema lizata stanica oba soja


30/121

30

3) lizatima se doda DNA: protein A (terminaza) prepoznaje cossekvencije i u njima uvodi lom kako su bakterijski sojevi blokirani u razliitim fazama nastanka virusne estice,

u smjesi dolazi do komplementacije i pakiranja DNA uz utroak ATP-a dosljedee cossekvencije

infektivne estice nastaju samo ako se pakira DNA duine 39-51 kb

4) infekcija E. coli, plakovi

KOZMIDI kozmidi = plazmidi koji sadre cossekvencije bakteriofaga lambda

(GGGCGGCGACCT) postojanje cossekvencija omoguava pakiranje rekombinantne kozmidne DNA in vitro

u kapside bakteriofaga lambda, ime nastaju infektivne estice nakon infekcije domaina i ulaska kozmidne DNA, ona cirkularizira (poput DNA faga

lambda), te se dalje replicira kao normalni plazmid ne nastaju plakovi, nego kolonije!

prednosti: veliina inserta: 34-46 kb (normalni plazmidi: 10-15 kb, lambda fag: do 25 kb) visoka efikasnost transformacije

upotreba: banke gena bakterijskih genoma ili subkloniranje iz umjetnih kromosoma

postupak kloniranja u kozmidima1) cijepanje kozmida i genomske DNA u polilinkeru odgovarajuim restrikcijskim

enzimima (npr. kozmid se poree s BglII, a genomska DNA se parcijalno poree saSau3A(parcijalnom digestijom sa Sau3Aporee se svaka 5-6 GATC sekvencija tako

da se dobiju veliki fragmenti) kompatibilni krajevi)2) ligacija - nastaju dugake molekule povezane genomske i kozmidne DNA


31/121

31

3) in vitropakiranje - selekcija fragmenata kod kojih su cosmjesta udaljena 39 do 51kb (insert 34 do 46 kb)

4) infekcija E. coli- selekcija TetR kolonija

fazmidi plazmidni vektori koji imaju attmjesto za prihvaanje iz faga lambda zahvaljujui tome mogu se integrirati, tj. rekombinacijom ugraditi u genom faga (ili

E. coli???), to moe uzrokovati da genom faga ima jednu ili vie molekula plazmida imaju ishodite replikacije plazmida i faga, pa se mogu razmnoavati i kao plazmidi ikao fag lambda

IVOTNI CIKLUS JEDNOLANANIH FILAMENTOZNIH DNA BAKTERIOFAGA M13, f1, fd bakteriofag M13

filamentozni ne-litiki fag E. coli

kruna jednolanana (+) DNA 6 407 baza, 9 gena specifian za muke F+ bakterije prihvaa se na vrhove pilusa koje kodirakonjugacijski plazmid F, te inficira stanice

f1, fd razliiti izolati faga M13 ivotni ciklus jednolananih filamentoznih DNA virusa M13, f1, fd

1. nakon to fag ue u bakterijsku stanicu preko pilusa, dolazi do oslobaanja viralnoggenoma

2. na krunu (+) ssDNA veu se SSB proteini koji ju tite od degradacije3. SSB se ne veu na jedan dio ssDNA koji formira sekundarnu strukturu ukosnice

tzv. intergena (IG) regija (508 bp)4. IG regija slui kao ishodite replikacije na tom mjestu RNA polimeraza E. coli

sintetizira klicu, a daljnju replikaciju nastavlja DNA polimeraza III5. replikacijom (+) (sense) DNA lanca nastaje (-) DNA lanac koji slui kao kalup za

sintezu mRNA6. dvolanani oblik viralnog genoma naziva se replikativna forma RF7. RF se replicira rolling circle mehanizmom8. istovremeno se u stanici odvija sinteza viralnih strukturalnih proteina i proteina

potrebnih za pakiranje, ukljuujui gpII protein i protein kapside

9. gpII endonukleaza koju kodira gen II zarezuje (+) lanac u IG regiji i inicirareplikaciju kotrljajueg kruga, kojom nastaju konkatameri genoma faga


32/121

32

10. gpII endonukleaza zatim zarezuje povezane jednolanane (+) DNA u IG regijama itako nastaju monomeri (+) jkDNA faga M13 koji cirkulariziraju

11. omota se formira polimerizacijom podjedinica12. pakiranje DNA u proteinske omotae odvija se na staninoj membrani

13. s povrine stanice bude izbaeno oko 1000 estica faga po stanici egzocitoza(budding)

14. izlaskom faga ne dolazi do lize domaina nego samo do usporavanja njegovog rasta

FAGMIDI jednolanani DNA virusi koriste se kao vektori jer se klonirana DNA moe izolirati bilo

u dvolananoj (RF) bilo u jednolananoj formi ((+) lanac) za kloniranje se iz stanica izolira RF (na isti nain kako se izoliraju plazmidi), obradi

restrikcijskim enzimom i ugradi strana DNA, a kompetentne stanice prime hibridnemolekule transformacijom

jednolanana DNA koristi se pri odreivanju slijeda nukleotida (sekvencioniranjedideoksi metodom), pripremi jakih i specifinih radioaktivnih proba, pri postupkumutageneze in vitroi u hibridizacijskim eksperimentima

veliina inserta nije ograniena veliinom kapside, ali je primijeeno da su vee molekulenestabilne ???

nedostatak je i nizak prinos RF oblika virusa zbog toga se jednolanani DNA virusi danas ne koriste esto, nego su ih zamijenili

fagmidi fagmid = fag + plazmid


33/121

33

fagmidi = plazmidi koji sadre viralnu IG (intergenu) (ori) regiju virusa M13 ili f1koja omoguava izolaciju plazmida u jednolananom obliku; oko 500 bp

fagmidi imaju sva svojstva i plazmidnog vektora i viralnog genoma u E. coliserepliciraju kao plazmidi jer imaju oriiz ColE1, a u jednolananom obliku mogu se izoliratisuperinfekcijom helper virusom jer se nakon infekcije fagmid ponaa kao genom tog

faga superinfekcija bakterijske stanice koja sadri fagmid helper virusom

genom helper faga osigurava enzime potrebne za replikaciju fagmida kao ssDNA injegovo pakiranje u virusne estice

gpII endonukleaza koju kodira gen II na genomu helper faga prepoznaje IG regijuna fagmidu i inicira replikaciju kotrljajueg kruga fagmida, ime nastaju konkatamerifagmidne DNA fagmid se replicira kao genom filamentoznog faga

gpII endonukleaza zatim zarezuje jednolanane kopije fagmidne DNA u IG regijama,ime nastaju monomeri fagmida koji se cirkulariziraju i pakiraju u estice faga

nakon centrifugiranja u supernatantu se nalazi mjeavina virusnih estica kojesadre genom faga i estica fagmida pakiranih u kapsidu

helper fagi su najee konstruirani tako da se u kapside ee upakirava fagmidnaDNA nego DNA helper virusa

supernatant se tretira polietilenglikolom, to uzrokuje taloenje virusa i fagmida, azatim kloramfenikolom, to uzrokuje ekstrakciju proteina i taloenje DNA

helper fag M13K07 rezistencija na kanamicin mutacija u IG regiji zbog koje je smanjen afinitet gpII za IG regiju virusa, pa se

preferencijalno replicira fagmid, a ne genom helper virusa pBR322, pUC118/119 (izveden iz pUC18/19) i pBluescript su fagmidi

EKSPRESIJSKI VEKTORI mnogi proteini su in vivoeksprimirani u malim koliinama velike koliine genskog produkta potrebne su u biokemiji, biotehnologiji... da bi se proizvele velike koliine nekog proteina, gen za taj protein insertira se

downstream od dobro reguliranog jakog promotora indukcijom transkripcije od reguliranog jakog promotora dolazi do poveane ekspresijedownstream gena

gen takoer moe biti kloniran i downstream od promotora faga kojeg ne prepoznajeRNA polimeraza domaina, nego RNA polimeraza koju kodira sam fag npr. promotorifaga T7, T3 i SP6 visok stupanj transkripcije, tj. visoka ekspresija nekog gena je korisna za sintezu

velikih koliina nekog proteina, ali te velike koliine proteina mogu biti toksine zadomaina

zato se koriste promotori faga koje ne prepoznaje RNA polimeraza domaina da bise overekspresija tog gena mogla inducirati samo kad je poeljna


34/121

34

jake RNA probe in vitro viralni, bakterijski, animalni promotori i promotori za biljne stanice jaki promotori virusa T7, T3 ili SP6 ugrauju se s lijeve i s desne strane MCS-a kako bi

se transkripcijom in vitromogao sintetizirati jedan ili drugi lanac kloniranog fragmenta konstruirani i bakterijski sojevi koji eksprimiraju viralne RNA polimeraze

za ekspresiju in vivoposebno su pogodni inducibilni promotori sintetski trcpromotor (trp+ lac); indukcija IPTG-om PL promotor bakteriofaga lambda pod kontrolom cI represora koji je pod kontrolom

trppromotora dodatkom triptofana reprimira se sinteza cI represora i dolazi doindukcije

promotor araBADoperona ekspresija kontrolirana odnosom glukoze i arabinoze uhranjivoj podlozi

kod ekspresijskih vektora moe se na C-terminalni ili N-terminalni dio proteina dodatipolipeptid koji e olakati izolaciju i purifikaciju tog proteina od ostalih proteina ustanici domaina, a kasnije e se odvojiti hidrolizom esto se koristi dodatak/oznaka (tag) od 6 histidina zajedno s mjestom za

proteolitiko cijepanje:His-His-His-His-His-His-Lys-Asp- P R O T E I N

nakon izdvajanja histidinom obiljeenog proteina na kolonama s Ni2+ ionima, tag seodvaja djelovanjem enterokinaze (tj. enteropeptidaze nije kinaza!)

3 vektora s pomakom inserta od jedne baze kako bi se osigurao pravilni okvir itanja sekvencija terminatora posebne sekvencije koje pospjeuju topivost proteina i sekreciju izvan stanice

posebni vektori koji koriste in vitrorekombinaciju za konstrukciju plazmida: integraza /attbakteriofaga lambda; Flp rekombinaza / FRT kvasca; Cre rekombinaza / loxP

POKRIVENOST BANKE / KNJINICE GENA genetika mapa daje relativnu i pretpostavljenu udaljenost izmeu dva markera

zasnovanu na uestalosti pojavljivanja rekombinacija za stvaranje fizike mape sa stvarnim udaljenostima potrebna je banka gena

banka ili knjinica gena (gene library) = skup klonova koji sadri cjelokupni genomnekog organizma u plazmidnom, kozmidnom ili virusnom vektoru u bankama gena nalaze se veliki fragmenti DNA, to je potrebno ako se ele

sekvencionirati veliki eukariotski genomi poput ljudskog (3000 MB) kako bi se osiguralo da se svaki fragment genoma nalazi zastupljen u banci gena s

velikom vjerojatnou, mora se osigurati viestruka zastupljenost genoma, odnosnoukupna koliina DNA u insertima mora viestruko premaiti veliinu genoma kako bi sepoveala vjerojatnost da sadri i eljeni fragment

pokrivenost knjinice gena = odnos ukupne koliine DNA sadrane u banci i veliine

genoma; oznaava koliko je puta prisutan neki genom


35/121

35

broj klonova N potreban da se dobije zastupljenost neke sekvencije u knjinici svjerojatnou P rauna se na osnovi izraza:

N = ln (1 P) / ln (1 - f)f = prosjean udio genoma u pojedinom klonu

PrimjerKoliko nezavisnih klonova treba sadravati banka humanog genoma prosjene veliineinserta od 17 kb da bi se s 99%-tnom vjerojatnou postigla prisutnost svakog fragmenta?

f = 1,7 x 104 pb / 3 x 109 pb = 5,6 x 10-6

N = ln (1 0,99) / ln (1 5,6 x 10-6) = 8,1 x 105

Pokrivenost takve banke je:8,1 x 105 x 1,7 x 104 pb / 3 x 109 pb = 4,59 puta

UMJETNI KROMOSOMI = VEKTORI ZA KLONIRANJE VELIKIH FRAGMENATA1. YAC2. PAC3. BAC

1. UMJETNI KROMOSOM KVASCA YAC = YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOME za kloniranje vrlo velikih fragmenata 100-2000 kb obino su inserti u YAC-ovima 500-1000 kb, a ako su manji od 50 kb YAC se vjerojatno

nee propagirati stabilnost se poveava s veliinom inserta u odsutnosti strane DNA repliciraju se kao plazmidi u E. coli YAC je shuttle vektor umnoava se u cirkularnom obliku u E. coli, a u linearnom

obliku se koristi za kloniranje u kvascu, gdje se replicira kao eukariotski kromosom strukturni elementi kvaevog umjetnog kromosoma:

strukturni elementi eukariotskog kromosoma: 2 kvaeve telomere okrenute u obrnutom smjeru kvaeva cetromera ishodite replikacije kvasca ARS = autonomously replicating sequence (svakih

~40 kb) ishodite replikacije oriza umnoavanje u E. coli


36/121

36

selektivni markeri za E. coli(ampR)i kvasac (TRP1, URA3) ampR = gen za rezistenciju na ampicilin da bi se mogle selekcionirati kolonije

transformiranih stanica E. coli geniTRP1iURA3 za selekciju transformiranih stanica kvasca gen HIS4

nalazi se izmeu dvije identine telomerne sekvencije okrenute u obrnutom smjeru,zbog ega mogu meusobno rekombinirati

slui kao dokaz da nije dolo do rekombinacije izmeu telomernih sekvencija tijekomrasta E. coli u kojoj se uvaju vektori

dakle, dok god na podlozi bez histidina rastu kolonije E. coli, to je dokaz da seplazmid nalazi u E. coli i da je stabilan

gen SUP4 gen za tRNA; informacijski supresor za ade2mutaciju kod kvasca ade2mutanti tvore kolonije crvene boje, a ako supresor reprimira ade2mutaciju,

kolonije su bijele boje u gen SUP4ubaen MCS unutar kojeg se insertira eljeni fragment DNA nakon insercije fragmenta supresor vie ne reprimira mutaciju u genu ade2, pa

stanice tvore kolonije crvene boje

kloniranje

YAC se prvo amplificira u E. coli, te se nakon izolacije podvrgne djelovanjurestrikcijske endonukleaze (najee BamHI) koja izrezuje HIS4kazetu tako se

YAC linearizira in vitro linearni YAC zatim se ree u MCS (multiple cloning site) time se dobivaju lijeva

(TRP1) i desna (URA3) ruka kromosoma, te se dodaju fragmenti DNA koji se eleklonirati i ligaza i time se transformira kvasac

kvasac koji se transformira je trp-ura-i ima mutaciju u ade2genu, zbog koje sukolonije crvene boje, a moe se reprimirati SUP4supresorom

transformanti se selekcioniraju na podlozi s ampicilinom, na kojoj osim crvenih

kolonija moe doi i do porasta bijelih kolonija crvene kolonije u stanicama koje tvore crvene kolonije nema supresije ade2

mutacije, jer je unutar SUP4gena je ubaen neki insert


37/121

37

bijele kolonije u stanicama koje tvore bijele kolonije dolazi do supresije ade2mutacije funkcionalnim informacijskim supresorom, jer unutar SUP4gena nijeubaen insert, nego je dolo direktnog povezivanja lijeve i desne ruke kromosoma

problemi: niska efikasnost transformacije nestabilnost

teka manipulacija u kvascu moe doi do rekombinacije prirodnog kvaevog kromosoma s umjetnim

kimerizam (kod divljeg tipa kvasca postotak kimerizma je 40-60% zato se koristemutanti za rekombinaciju)

purifikacija YAC-a od prirodnih kromosoma kvasca esto je prilino teka jer semoe dogoditi da su sline veliine zato se koristi gel elektroforeza upulsirajuem polju

2. PAC = P1 pfage derived Artificial Chromosome umjetni kromosom izveden iz bakteriofaga P1 (P1 fag najvei fag koji inficira E. coli) ne smatra se pravim umjetnim kromosomom u uem smislu rijei PAC je plazmid koji sadri ishodite replikacije P1 faga replicira se kao autonomni izvankromosomski element slian kozmidima (analogan princip) veliina inserta: do 100 kb pacmjesto (packaging site)

potrebno za in vitropakiranje rekombinantne DNA u virusne estice 2 loxPmjesta za cirkularizaciju pakirane DNA nakon ulaska u E. coli, koja prepoznaje

Cre rekombinaza (gen cre) sustav mjesno-specifine rekombinacije Cre/loxP loxPje sekvencija od 34 bp koja se sastoji od dva obrnuta ponavljanja (2x13bp)

odijeljena sekvencijom od 8 bp (spacer regija) Cre rekombinaza prepoznaje loxPmjesta i tu zarezuje DNA, te dolazi do reciprone

rekombinacije izmeu loxPsekvencija rezultat rekombinacije ovisi o orijentaciji loxPsekvencija: ako su loxPsekvencije

okrenute u istom smjeru (direct repeat) doi e do delecije,tj. cirkularizacijefragmenta DNA omeenog loxPsekvencijama, a ako su okrenute u suprotnom smjeru

(inverted repeat) doi e do inverzije tog fragmenta DNA


38/121

38

nakon pakiranja in vitroinficiraju se cre+stanice E. colikoje proizvode Crerekombinazu

u bakterijskoj stanici pomou rekombinaze Cre dolazi do mjesno-specifinerekombinacije izmeu sekvencija loxP, odnosno do cirkularizacije transducirajueDNA nastaju veliki kruni plazmidi koji se dalje repliciraju u stanicama E. coli


39/121

39

sustavu mjesno-specifine rekombinacije Cre/loxPslian je i sustav FLP/FRT kodkvasca oba sustava imaju znaajnu ulogu u genetikim manipulacijama

3. UMJETNI BAKTERIJSKI KROMOSOM BAC = Bacterial Artificial Chromosome sintetiki vektor izveden iz konjugacijskog F plazmida E. coli F plazmidi veliki su, relativno laka izolacija, replikacija koordinirana s replikacijom

bakterijskog kromosoma

nisko kopijski vektor: 1-2 kopije po stanici da se izbjegne toksinost velikihfragmenata strane DNA i rekombinacija s DNA domaina ne smatra se pravim umjetnim kromosomom u uem smislu rijei


40/121

40

veliina inserta: prosjeno oko 100 kb (100-300 kb) prednosti:

jednostavan postupak nema problema rekombinacije, jer u jednoj stanici moe biti samo jedna kopija BAC

oriSi repE jednosmjerna replikacija vektora i kontrola broja kopija parAiparB pravilna segregacija

CMR- rezistencija na kloramfenikol selektivni marker CosN in vitro: jedinstveno mjesto za linearizaciju ( terminaza)

- in vivo: inserti DNA 40 kb (F-kozmid = fazmid !) loxP, NotI olakavaju subkloniranje insercija u lacZili sacBradi identifikacije transformanata koji sadre insert za transformaciju se koriste rec-mutanti, pa je nizak postotak kimerizma (3%) i

poveana stabilnost klonirane DNA visoka frekvencija transformanata jednostavna purifikacija (slino plazmidima)

upotreba: za mapiranje i analizu kompleksnih genoma

prednosti BAC i PAC: jednostavni za manipulaciju, vea uinkovitost transformacije odYAC, velika stabilnost, nema kimerizma

YAC, BAC i PAC se koriste za izradu banke gena, jer eliminiraju male inserte

VELIINA INSERATA KOD VEKTORA KOJI SE KORISTE ZA GENOMSKE BANKE


41/121

41

VEKTOR DOMAIN VELIINA INSERTA

lambda fag E. coli 5 25 kb

lambda kozmid E. coli 34 45 kb

P1 fag E. coli 70 100 kb

PAC E. coli do 300 kb

BAC E. coli do 300 kb

YAC S. cerevisiae 200 2000 kb

PRETRAIVANJE KNJINICE GENA

identifikacija eljenog klona strategije:1. komplementacija mutacije

selekcija na temelju fenotipa transformirane stanice mogue za relativno mali broj gena mora doi do ekspresije gena

2. amplifikacija pomou PCR-a PCR se moe koristiti za kloniranje jednog fragmenta DNA koji e se koristiti kao

radioaktivna sonda za pretraivanje banke gena, tj. za hibridizaciju kolonija

potrebno poznavanje barem dijela sekvencije traenog gena najprije se pretrauju skupine zdruenih klonova kad se identificira pozitivan uzorak, podijeli se na podskupine u kojima se ponovo

trai pozitivan uzorak3. imunoloka detekcija

mora doi do ekspresije gena stanice se liziraju kloroformom ili se liza inducira pomou faga specifina (radioaktivna) antitijela na epitop proteina koji se trai alternativno, na primarno antitijelo vee se sekundarno antitijelo koje ima

specifinu enzimsku aktivnost koja dovodi do kolorne reakcije (peroksidaza,alkalna fosfataza...)

4. hibridizacija s obiljeenom probom potrebno poznavanje barem dijela sekvencije traenog gena

SELEKCIJA KOMPLEMENTACIJOM MUTACIJE KLONIRANJE LEU2GENAKVASCA Saccharomyces cerevisiaeU BAKTERIJI Escherichia coli pretpostavka: neki fragment iz genoma kvasca moe komplementirati mutaciju u genu

LEUB E. coli


42/121

42

PRETRAIVANJE BANKE GENA HIBIRIDIZACIJOM KOLONIJA hibridizacija kolonija = metoda koja se koristi da se pronae u kojem klonu, tj.

koloniji transformanata se nalazi neka specifina sekvencija DNA hibridizacijom kolonija se u banci gena moe pronai tono odreeni gen proba / sonda

fragment ssDNA (ili RNA) specifine sekvencije (duljina 100-1000 bp) koji sekoristi da bi se hibridizacijom detektirala njemu komplementarna sekvencijaDNA ija se prisutnost u uzorku provjerava

da bi se mogla identificirati, proba se oznaava radioaktivno (hibridizirana DNA sedetektira autoradiografski) ili neradioaktivno (npr. fluorescentno ili digoksigeninom)

zajedno se inkubiraju uzorak i proba ako se nae homologna sekvenca dolazi do komplementarnog sparivanja hibridizacija zatim se vri ispiranje da se ispere sva proba osim one koja se vezala za DNA iz uzorka

detekcija ovisno o tome kako je proba bila obiljeena: radioaktivno uzorak se izloi autoradiografskom filmu ako je postojalahomologija, film e se zacrniti

digoksigeninom doda se antidigoksigenin s kiselom fosfatazom i supstrat akoje postojala homologija, doi e do pojave plavo-ljubiastog obojenja

nedostatak: potrebno poznavati istu ili slinu sekvenciju traenog gena (trik: urazliitim organizmima trai se slian gen)


43/121

43

1) prijenos plakova na membranu membrane su nekad bile od nitroceluloze nedostaci: starenjem postaju krte i

suhe, pa popucaju, a kod suenja u termostatu su se znale zapaliti zato se danas koriste najlonske membrane koje su osim toga i pozitivno nabijene da

se na njih DNA moe vezati bez posebnog fiksiranja membrana se stavi na plou s plakovima ili poraslim kolonijama, te se ploa

termostatira da kolonije urastu u membranu2) denaturacija DNA i vezivanje

prvo se dodaje SDS za otapanje stanine membrane liza stanice fiksacija DNA na membranu kovalentno vezanje (ireverzibilno!)

u praksi se koristi 0,5 M NaOH jer hidrolizira RNA, a DNA ostaje intaktna (kiselinabi fragmentirala i DNA)

DNA se nakon lize zalijepi na membranu ako membrana nije pozitivno nabijena, postoje razliite metode za crosslinking

kovalentno vezanje DNA i membrane (npr. zagrijavanje na 120C, zraenje UV-om)3) hibridizacija s probom

najdelikatnija faza ugrauje se radioaktivni nukleotid (moe i neradioaktivno obiljeavanje) hibridizacija se radi tako da se denaturirana membrana na koju je vezana DNA stavi

u pufer prethibridizacija zasiivanje nespecifinih veza


44/121

44

prije nego to se doda na hibridizaciju, proba se mora denaturirati zagrijavanjem uvodenoj kupelji 1-2 min i zatim se stavi u led

proba se zatim dodaje membrani koja je u puferu, to se stavi u plastinu vreicu izatali, te stavi u vodenu kupelj na tresilicu preko noi na temperaturi 10C nioj odtoke taljenja hibrida temperatura hibridizacije

hibridizacija se radi u neutralnom pH

ispiranje nekoliko puta i na razliite naine (razliite temperature i razliiti puferi)da se ispere membrana

4) autoradiografija membrana se stavi na autoradiografski film (-70C) uvjet da rezultati budu valjani: na svakoj ploi treba biti pozitivna i negativna proba,

tj. kontrola na pozitivnoj kontroli treba biti zacrnjenje, a na negativnoj ne smije

RADIOAKTIVNO OBILJEAVANJE DNA (UGRADNJA RADIOAKTIVNIH IZOTOPA UDNA) I PRIPREMA DNA PROBA u biologiji i biokemiji esto se koriste spojevi koji sadre radioaktivne izotope 125I, 3H,

35S, 32P nukleinske kiseline obiljeavaju se ugradnjom radioaktivnog fosfora 32P u fosfatu ili

radioaktivnog sumpora 35S u tiofosfatu -32P, -32P,-35S, -35S dNTPs ili NTP ()

radioaktivni nukleotidi dodaju se kao prekursori za sintezu komplementarnog lanca ilikao donori fosfatne skupine prilikom fosforilacije [-32P] ATP

radioaktivni fosfor i sumpor su izvor zraenja (elektroni) za 32P vrijeme poluraspada je samo 14 dana, a za 35S 88 dana jedinica za radioaktivno zraenje je 1 raspad po sekundi = 1 Bq (bequerel) u upotrebi je i jedinica curie (Ci): 1 Ci = 2.22 x 1012 dpm (disintegrations per minute)

1 Bq = 2,703 x 10-11

Ci = 2,703 x 10-8

mCi

METODE ZA RADIOAKTIVNO OBILJEAVANJE DNA I RNA

A. OBILJEAVANJE KRAJEVA - probe niske specifine radioaktivnosti (< 0,1 mCi/g)

A) POLIMERAZE ugradnja radioaktivnog nukleotida na 3 kraju1. Klenow fragment popunjava 3 uvueni kraj dobiven djelovanjem restrikcijskog

enzima u ravni kraj2. Taq polimeraza na ravnom kraju dodaje [-32P] dATP3. T4 DNA polimeraza zbog jake 35 egzonukleazne aktivnosti dolazi do zamjene

neradioaktivnog nukleotida radioaktivnim (DNA s uvuenim 5 krajem)4. terminalna (deoksiribonukleotidil) transferaza dodaje nukleotide na 3 kraj

jednolanane i dvolanane DNA


45/121

45

B) FOSFATAZA/KINAZA ugradnja radioaktivnog nukleotida (-32P ili -35S) na 5kraju najprije se hidrolizira fosfatna skupina pomou fosfataze, pa se nakon toga 5 kraj

fosforilira kinazom u prisutnosti [-32P] ATP (zamjena fosfata) supstrati: jednolanana DNA i RNA, dvolanana DNA (bolje ako je 3 kraj uvuen)

B. JEDNOLIKO OBILJEAVANJE - probe visoke specifine radioaktivnosti (oko 1mCi/g)

1) POMAK ZAREZA / NICK TRANSLATION DNaza I + PolI djelovanjem Dnaze I na dsDNA na oba lanca na razliitim mjestima nastaju jednolanani

prekidi (nick) na prekide se vee DNA polimeraza I koja katalizira 2 reakcije:

1) egzonukleaznom aktivnou uklanja nukleotide u 53 smjeru2) polimeraznom aktivnou dodaje nukleotide u 53 smjeru, ime dolazi do pomicanja

zareza

ugradnjom radioaktivnih nukleotida (npr. 32P ili 35S-dNTP) DNA postaje obiljeena budui da reakcija ide u neprekinutom nizu, ako su u reakcijskoj smjesi svi nukleotidi

radioaktivni, DNA e biti ravnomjerno obiljeena, a ako je samo jedan nukleotidradioaktivan, DNA e biti neravnomjerno obiljeena i to samo na mjestima gdje senalazi taj nukleotid


46/121

46

2) NASUMINO ZAPOINJANJE SINTEZE / RANDOM PRIMING ssDNA + heksanukleotidi + Klenow + dNTP ...

supstrat je jednolanana (fagmidi!) ili dvolanana denaturirana DNA za zapoinjanje sinteze koristi se smjesa svih moguih kombinacija heksa i/ili

heptanukleotida (46=4096 ili 47=16384 razliitih kombinacija) koristi se Klenow fragment ili neka druga polimeraza kod koje je inaktivirana 35

egzonukleazna funkcija, da ne bi dolo do degradacije primera u otopinu se dodaje jedan radioaktivni nukleotid (npr. [-32P] dCTP) i tri neradioaktivna probe vrlo visoke specifine aktivnosti, moe se obiljeiti samo jedan lanac!

3) PCR istovremena amplifikacija ciljne sekvencije i ugradnja radioaktivnih nukleotida nije potrebno izolirati DNA potrebno je poznavati sekvenciju potrebno je pripremiti specifine klice mogue je koristiti samo jednu klicu ili jednu klicu u velikom suviku (asimetrini

PCR)

4) TRANSKRIPCIJA in vitro mnogi vektori sadre inserte izmeu promotora za RNA polimeraze virusa T7, T4 ili

SP6 izborom odgovarajue polimeraze jedan ili drugi lanac koristi se kao kalup plazmidna DNA treba se prije reakcije pocijepati odgovarajuim enzimom na 3 kraju

kako bi se odredila duina transkripta DNA se nakon sinteze degradira pomou Dnaze DNA/RNA hibridi stabilniji su od DNA/DNA hibrida


47/121

47

DETEKCIJA RADIOAKTIVITETA1. Geiger - Mllerov broja

energiju radiaktivnog raspada pretvara u zvune signale2. autoradiografija vizualizacija

izlaganje rendgenskog filma na kojem se dobije zacrnjenje na mjestima gdje je dolodo radioaktivnog raspada

3. scintilacijski broja vrlo precizno kvantitativno odreivanje uzorak se otapa u scintilacijskom koktelu iji je najvaniji sastojak fluor ili neka

druga fluorescirajua tvar energija radioaktivnog raspada pretvara se u svjetlosnu energiju koju fotoelije

scintilacijskog brojaa pretvaraju u elektrine pulseve koji se broje koliina svjetlosne energije proporcionalna je energiji radioaktivnog raspada (koliini

radioaktiviteta)4. phosphorimage vizualizacija i kvantifikacija

NERADIOAKTIVNO OBILJEAVANJE DNA radioaktivne probe nastoje se zamijeniti neradioaktivnim iz niza razloga, kao to su npr.

zatita osoblja i okolia, sloenost rukovanja, cijena, administracija... nukleinske kiseline kemijski se modificiraju ili se u njih ugrauju modificirani nukleotidi

koritenjem istih postupaka kao i prilikom ugradnje radioaktivnih nukleotida tako pripremljena proba moe se detektirati neposredno (najee fluorescencijom) ili

posredno posredna detekcija - princip:

primjeri:a) obiljeavanje DNA biotinom

biotin je hapten = mala molekula koja moe potaknuti imunoloki odgovor kad jevezana na neki nosa (npr. protein)

biotin se ugrauje u DNA (vee se kovalentno) i specifino reagira s avidinom(protein iz bjelanjka jajeta)b) obiljeavanje DNA digoksigeninom (Boehringer)

digoksigenin je steroid izoliran iz cvjetova i listova biljaka Digitalis purpureaiDigitalis lanata(takoer hapten)

umjesto timina u DNA se ugrauje analog uracila sa steroidnim radikalom(digoksigenin-11-deoksiuridin-5-trifosfat (DIG 11-dUTP)):

ssDNA + heksanukleotidi + dNTPs + dig-dUTP + Klenow detekcija:

- antidigoksigenin vezan na kiselu fosfatazu- dodaje se supstrat za fosfatazu (X-fosfat, 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat) ikolorni indikator NBT (nitroblue tetrazolium salt) plavo obojenje


48/121

48

openito u neradioaktivnom obiljeavanju DNA specifine reakcije vezanja antitijelo-antigen slue za lokalizaciju enzima na nekom mjestu, a kasnije se za pojaavanjesignala koristi enzimska reakcija (pojava boje, fotokemijska reakcija ...)

ELEKTROFORETSKE METODE

GEL ELEKTROFOREZA gel elektroforeza slui za analizu, separaciju, proiavanje i izolaciju nukleinskih

kiselina (ali i proteina) koristi se i kao analitika i kao preparativna metoda

migriranje nabijenih makromolekula u elektrinom polju kroz neki nosa kao nosai za razdvajanje nukleinskih kiselina (dsDNA, ssDNA, RNA, DNA/RNAhibridi, oligonukleotidi) koriste se agaroza ili poliakrilamid

ove polimerne molekule imaju svojstvo stvaranja kompleksnih umreenih struktura u takvoj umreenoj strukturi, pod utjecajem elektrinog polja, negativno nabijena

DNA (zbog fosfatnih skupina) putuje prema pozitivnoj elektrodi makromolekule se razdvajaju na temelju veliinejer brzina probijanja nabijenih

molekula kroz umreeni gel ovisi o njihovoj veliini i konformaciji molekule, ali i ogustoi gela

migracija se provodi u odgovarajuem puferu koji slui kao elektrolit elektrode: Pt-ica; prikljuene na istosmjenu struju uzorak se nanosi u jaice u gelu pomou mikropipete prije toga se gel i cijeli ureaj prekriju s puferom prikljui se na izvor struje i DNA se kree kroz nosa prema anodi male molekule putuju kroz gel bre od velikih, a ssDNA putuje bre od dsDNA iste

duljine

koristi se za praenje rezanja i spajanja DNA molekula prije se za to koristila brzina sedimentacije u gradijentu saharoze


49/121

49

agarozni gel za elektorforezu za velike fragmente visokopurificirana agaroza (puno ia i skuplja od agaroze u biokemiji, jer ne smije

sadravati nukleaze (jer bi razgradile DNA) niti nikakve inhibitore enzima) prirodni polimer sastavljen od D- i L galaktoze jednostavniji, vertikalni i horizontalni ureaji od 0,5 do 2% agaroze (5%!) o koncentraciji agaroze ovisi veliina pora razdvajanje fragmenata od 0,1 do 25 kb podruje linearnosti odnosa veliine fragmenta i brzine putovanja kroz gel razliito

je za razliite koncentracije agaroze

prosjena duina lanaca je oko 800 monomera galaktoze agaroza se izolira iz morskih algi (rodovi Gelidiumi Gracilaria) pa moe sadravativezane i druge eere, soli, proteine i druga oneienja

ova oneienja mogu uzrokovati degradaciju nukleinskih kiselina (DNAze, RNAze),inhibiciju drugih enzimskih reakcija (ligacija, restrikcija...), slabiju separaciju ili teuidentifikaciju

poseban problem predstavljaju sulfatne skupine vezane uz polisaharid jer dovode doelektroendoosmoze koriste se visoko proiene agaroze na kojima je naznaenolow EEO (= niska elektroendoosmoza)

agaroza niskog talita (low melting point) - kemijski modificirana agaroza kod kojeje talite snieno na oko 65C

posebne agaroze za posebne namjene u praksi se to vie nastoje koristiti agarozni gelovi jer su praktiniji, jednostavniji i

jeftiniji

poliakrilamidni gel za elektorforezu za male fragmente polimer propenamida CH2=CHCONH2 sloeniji za rad jer se ne izlijevaju u horizontalne ploice, nego su ureaji vertikalni

kapilarna elektroforeza razdvajanje fragmenata manjih od 1 kb, a u posebnim uvjetima i polinukleotidnihlanaca koji se razlikuju u veliini za jedan nukleotid! koristi se za sekvencioniranje


50/121

50

do polimerizacije dolazi u prisutnosti slobodnih radikala (nastaju redukcijomamonijevog persulfata pomou TEMED-a (N,N,N,N-tetrametilen diamin), aumreenje lanaca se postie dodatkom N,N-metilen bisakrilamid (29 : 1)

koncentracija akrilamida od 3,5 do 20% bolja separacija (jednolananih) nukleinskih kiselina

kod dvolananih molekula na migraciju utjee i primarna struktura! vea istoa izolirane DNA vei kapacitet (do 10 g / po uzorku!)

vrlo esto se koristi denaturirajua elektroforeza, kod koje se odvajajukomplementarni lanci i sprjeava povezivanje komplementarnih baza upolinukleotidnim lancima

akrilamid je toksian! (neurotoksin)

brzina migracije DNA u gelu ovisi o:1. konformaciji molekule2. koncentraciji nosaa vea koncentracija, manja brzina3. naponu vei napon, vea brzina4. elektrolitu puferu5. veliini fragmenata

1. KONFORMACIJA MOLEKULE

konformacija molekule znatno utjee na brzinu migracije (linearna, kruna,superzavijena, jednolanana, dvolanana, specifine strukture...) nativna kruna plazmidna DNA izolirana iz bakterija ima konformaciju superzavojnice

(supercoiled DNA), ali tijekom izolacije dolazi do uvoenja jednolananih i dvolananihlomova, ime superzavojnica prelazi u relaksiranu (open circle) konformaciju, kojaputuje znatno sporije


51/121

51

najbre migrira superzavojnica (jer je najkompaktnija), a o uvjetima elektroforezeovisi da li e bre migrirati linearna ili kruna relaksirana DNA

visoki udio relaksirane i linearne DNA ukazuje na enzimsku/mehaniku degradacijuprilikom izolacije

velike plazmide (> 10 kb) teko je izolirati u obliku superzavojnice

2. KONCENTRACIJA NOSAA vea koncentracija gui matriks, tj. manji promjer pora u nosau vei otporkretanju molekula manja brzina migracije

u praksi se koriste koncentracije od 0,5-2,0% vee koncentracije se koriste za separaciju manjih fragmenata koncentracija nosaa odreuje se prema oekivanoj veliini fragmenata:

AGAROZA POLIAKRILAMID

koncentracija(%) podrujeseparacije (kb)* koncentracija(%) podrujeseparacije (nt)*

0,3 ** 50 60 3,5 1000 2000

0,6 1 20 5,0 80 500

0,7 0,8 10 8,0 60 400

0,9 0,5 7 12,0 40 - 200

1,2 0,4 6 15,0 25 150

1,5 0,2 3 20,0 6 - 100

2,0 0,1 2

* odnosi se na linearne dvolanane molekule DNA** elektroforeza se mora provoditi na +4C

3. NAPON vei napon vea brzina migracije vei napon uzrokuje zagrijavanje gela, zbog ega je separacija loija i dolazi do

deformacija bendova (smile-ovi - )

u praksi: agarozni i poliakrilamidni gelovi pri naponu 2 - 10 V/cm denaturirajui gelovi u poliakrilamidu pri naponu od 1700 V (400 V/cm)

4. PUFER (elektrolit) razliiti pH, vodljivost, kapacitet najee se koriste acetatni (TAE), boratni (TBE) ili fosfatni (TPE) pufer i sadre

odgovarajuu kiselinu, Tris i EDTA, a konana pH vrijednost pufera je 8,0 u acetatnom puferu je migracija neto bra, a separacija bolja, ali je kapacitet tog

pufera najnii, pa je poeljno cirkulirati pufer pomou pumpe

svi se puferi uvaju kao koncentrirane otopine koje se razrjeuju neposredno prijeupotrebe


52/121

52

5. VELIINA FRAGMENTA brzina pokretljivosti, odnosno veliina fragmenta proporcionalna je recipronoj

vrijednosti logaritma veliine (mase) fragmenta DNA vea molekula manjabrzina migracije:

V = k / logLL = veliina molekule (bp)

vrijedi samo za linearne dvolanane molekule! (takve se najee i analiziraju) veliina nepoznatog fragmenta DNA odreuje se usporedbom s molekulama poznate

veliine standardi zbog toga to brzina migracije ovisi o nizu parametara, na svaki gel potrebno je nanijeti

i standard veliine najei standard: DNA bakteriofaga porezana restrikcijskim enzimom HindIII u jednu jaicu se stavi uzorak, a otopina standarda u jaicu lijevo i desno od te jaice nakon bojanja gela, nakon to je provedena elektroforeza, ravnalom se mjeri koliko je

cm neki fragment migrirao od vrha gela

na temelju tih podataka izradi se badarni dijagram iz kojeg se oita veliinanepoznatog fragmenta DNA

odreivanje veliine fragmenta DNA pomou gel elektroforeze

NANOENJE UZORKA NA GEL koliina od 10 ng do nekoliko g DNA u uzorku volumena od 2-100 L (1 kap = 50 L) uzorak se pomijea s puferom koji sadri:

1. saharozu, glicerol ili Ficoll (polimer) zbog njih je uzorak tei od pufera za elektroforezu pa padne na dno jaice

(saharoza nije idealna jer na njoj mogu rasti mikroorganizmi, pa njihove nukleazemogu razgraditi DNA iz uzorka)

2. Tris x HCl i EDTA stabilnost


53/121

53

3. boju bromfenol plavo (putuje kao fragment od 0,5 kb) xylene cyanol (putuje kao fragment od oko 5 kb) boja se koristi:

1) da bi se uzorak vidio kad se nanosi u jaice2) kao oznaiva fronte pokretljivosti uzoraka, tj. da se elektroforeza moe

vizualno pratiti jer se male molekule plave boje najbre kreu kroz gel i videkad se kreu kroz gel

VIZUALIZACIJA UZORAKA DNA NA GELU najee bojanje etidijevim bromidom koji interkalira u DNA, apsorbira UV svjetlo

(260, 300 ili 360 nm) i emitira naranasto-crveno na 590 nm

etidijev bromid

bojanje se vri nakon elektroforeze (1 g/ml, 1530 min) ili se etidij bromid dodaje prijeelektroforeze u gel ili u pufer za elektroforezu (tada DNA putuje due utjecaj na

migraciju!) zbog mutagenog djelovanja etidijev bromid nastoji se zamijeniti drugim bojama (SYBR

Gold) obojani gel poloi se na transiluminator s UV 260, 300 ili 360 nm, pri emu etidijev

bromid emitira na 590 nm (naranasto-crveno) (zatita od UV-a!) DNA najbolje apsorbira na 260 nm, ali se pri toj valnoj duljini napravi najvie

pirimidinskih dimera zato se, ako je gel elektroforeza bila preparativna, gel ozraujes 300 ili 360 nm

fotografiranje gela


54/121

54

ELEKTROFOREZA U PULSIRAJUEM POLJU(PFGE = Pulsed-Field Gel Electrophoresis) kod gel elektroforeze s koncentracijom agaroze 0,5-0,6% fragmenti vei od 20 kb

zaostaju u jaicama rjeenje ovog problema: pulsirajua gel elektroforeza naizmjenine promjene smjera elektrinog polja omoguavaju razdvajanje veih

molekula DNA dok DNA putuje u gelu, na kratko se izmijeni polaritet, tako da DNAkrene naprijed, pa malo natrag, pa onda opet naprijed itd. zbog reorijentacije DNAne dolazi do zaepljenja pora gela

radi promjene smjera struje tijekom elektroforeze molekule DNA ne kreu se linijskiprema suprotnom polu nego u cik-cak liniji, to omoguava bolje razdvajanje

mogu se razdvojiti molekule do 5 Mb! DNA se izolira neposredno u jaicama kako bi se izbjeglo uvoenje lomova cirkulacija pufera, hlaenje, vrlo kvalitetna agaroza! razliite izvedbe:

PREPARATIVNA GEL ELEKTROFOREZA IZDVAJANJE DNA IZ GELA vie metoda za izolaciju DNA iz gela:

1. elektroforeza prema pozitivno nabijenim membranama DEAE-celuloza (DEAE =dietil-aminoetil) posebno aktivirana celuloza (papirii) koja reverzibilno vee DNA gel od preparativne gel elektroforeze zaree se iza benda u kojem se nalazi

eljeni fragment DNA, tj. napravi se utor u gelu u kojeg se umetne DEAE-celuloza

dio gela s bendovima koji se nalaze ispred benda sa eljenim fragmentom DNA seodree i baci, da se ne bi i DNA iz tih bendova sluajno vezala na celulozu

zatim se pusti struja, tj. nastavi s elektroforezom da fragment DNA izae iz

gela i ue u celulozu kad se DNA vezala za membranu, membrana se najprije ispere otopinom niske

ionske jakosti, a zatim se DNA eluira otopinom visoke ionske jakosti


55/121

55

2. elektroelucija u membrane za dijalizu sterilnim skalpelom izree se komad gela koji sadri eljeni fragment DNA i stavi

se u vreicu za dijalizu u kojoj je pufer vreica se stavi u ureaj za elektroforezu kako bi fragment DNA izaao iz gela,

tj. preao u pufer i zaustavio se na stijenkama membrane DNA se istaloi i z tekue faze

3. ekstrakcija iz agaroze niskog talita LMP = low melting point agaroza specijalne agaroze koje se tale na nioj temperaturi (65C) komadi agaroznog gela se razrijedi puferom i zagrije na 65C da se agaroza

otopi agar se ukloni ekstrakcijom s fenolom, a DNA istaloi etanolom ne moe se koristiti obina agaroza jer se tali na vioj temperaturi, pa bi dolo do

denaturacije DNA

4. apsorpcija na staklene kuglice (gene clean)

iz gela se izree bend koji sadri eljeni fragment DNA agaroza se otopi pomou natrijevog ili kalijevog jodida dodaju se staklene kuglice ija je povrina posebno aktivirana tako da se na njih

reverzibilno vee (adsorbira elektrostatskim silama) DNA nakon toga se kuglice istaloe centrifugiranjem te isperu, a zatim se eluira DNA s

kuglica

5. agaraza agaroza se moe ukloniti razgradnjom pomou agaraze DNA se taloi pomou fenol/kloroform smjese

za izolaciju velikih fragmenata DNA

SOUTHERN BLOTTING

metoda koja se koristi za provjeru prisutnosti odreene sekvencije DNA u nekomuzorku DNA

tehnika koja kombinira agaroznu gel elektroforezu, kojom se fragmenti DNArazdvajaju po veliini, s metodama prijenosa razdvojenih fragmenata DNA namembranu za hibridizaciju s probom

metoda se temelji na formiranju DNA/DNA hibrida izmeu dva komplementarnalanca DNA koji dolaze iz razliitih izvora zbog toga DNA treba biti jednolanana(denaturirana)

tehnika slina hibridizaciji, ali se na membranu ne prebacuje DNA iz kolonija negoDNA iz gela nakon elektroforeze

ovom metodom provjerava se prisutnost gena hibridizacija genomske DNA s

obiljeenom probom uzorak DNA poree se restrikcijskim endonukleazama na manje fragmente, koji se

zatim agaroznom gel elektroforezom razdvoje po veliini


56/121

56

prije nego to se provede blotting, gel za elektroforezu prvo se stani u HCl da se DNAfragmentira (da svi fragmenti budu jednaki pa da bude uniformni prijenos), a zatim sestavi u NaOH da se DNA denaturira da bi se mogla vezati na membranu i kasnijehibridizirati s probom (tretman s NaOH takoer razgradi rezidualnu RNA)

na gel se stavi nitrocelulozna membrana, na nju slojevi suhog filtar papira, te uteg da se

osigura dobar i jednolik kontakt izmeu gela i membrane pufer za transfer prolazi kroz gel i nitroceluloznu membranu, jer suhi filtar papir iznad

membrane upija pufer jednolanani fragmenti negativno nabijene DNA izlaze iz gela s puferom i veu se na

pozitivno nabijenu membranu ionskim vezama nakon blottinga membrana se ispire i oisti, a zatim se zatali u vreicu s puferom koja

sadri probu, te slijedi hibridizacija s probom proba je fragment ssDNA specifine sekvencije koja je komplementarna s fragmentom

DNA ija se prisutnost u uzorku provjerava

da bi se mogla detektirati, proba se oznaava radioaktivno ili neradioaktivno da bi se izbjeglo nespecifino vezanje obiljeene DNA sonde na nitrocelulozu,

membrana na kojoj se nalaze vezane vrpce DNA se prethibridizira s predhibridiza-cijskom otopinom u kojoj se nalazi nespecifina nukleinska kiselina koja se vee naslobodna mjesta na membrani

ispiranje suvika probe detekcija: autoradiografski ako je koritena radioaktivna proba nitrocelulozna

membrana stavi se na osjetljivi fotografski film koji nakon razvijanja pokazuje mjestahibridizacije

rezultat: hibridizacija probe sa specifinim fragmentom DNA na membrani dokaz je dadotini fragment DNA sadri sekvencu DNA komplementarnu probi

1. restrikcija i gel-elektroforeza DNA

2. prijenos DNA na

membranu3. hibridizacija sobiljeenom probom

4. detekcija homologneDNAautoradiografija


57/121

57

Southern blotting - protokol koritenjem neradioaktivnog DIG 11-dUTP-aA. prijenos denaturirane DNA na membranu1) - nakon gel elektroforeze gel staviti na bojanje u etidij bromid

- dok se gel boja izrezati membranu (najlonsku, pozitivno nabijenu) 2-3 mm veu od gelai poloiti je vodu

2) - gel isprati u vodi, fotografirati i oznaiti, te poloiti u kadicu s 0,25 M HCl na 10 min

- tretman s HCl fragmentira DNA (dolazi do depurinacije) kako bi se olakao prijenos3) - isprati gel, te ga prebaciti u kadicu s 1M NH4Ac / 0,4 M NaOH na 10 min tretman s

NaOH uzrokuje razdvajanje lanaca (denaturacija DNA)- za to vrijeme pripremiti membranu za prijenos pod snienim tlakom (osim prijenosa

pod snienim tlakom (vacuum blotting) moe se koristiti i prijenos pod poveanimtlakom, kapilarni prijenos ili prijenos pomou istosmjerne struje (electroblotting))

4) - preko membrane poloiti gel i preliti ga s 0.4 M NaOH (alkalni prijenos!)- prijenos traje oko 60 min

5) poloiti membranu u 1M NH4Ac na 15 minuta6) fiksirati DNA zagrijavanjem na 120C / 30 min ili pomou UV-a (cross link vezanje

kovalentnim vezama na membranu)

B. hibridizacija1) - membranu zataliti u vreicu s predhibridizacijskom otopinom i inkubirati 2-3 sata na

68C (soli, SDS, nespecifina DNA... - nespecifino vezanje na povrinu membrane,kako se ne bi vezala proba)

2) probu* denaturirati 10 min na 95C, pa naglo ohladiti u ledu* neradioaktivna proba se priprema jednako kao i radioaktivna, ali se umjesto

radioaktivnog nukleotida doda analog uracila (digoksigenin-11-deoksiuridin-5-trifosfat (DIG 11-dUTP)) koji se ugrauje nasuprot adenina3) - ohlaenu probu dodati u predhibridizacijsku otopinu

- inkubirati preko noi u zataljenoj vreici na 68C (ako proba nije potpuno homologna,temperatura se mora sniziti)

C. detekcija1) - viekratno ispiranje membrane: najprije na sobnoj temperaturi otopinom visoke ionske

jakosti, pa na 68C otopinom niske ionske jakosti2) - dodati:

antidigoksigenin vezan uz kiselu fosfatazu supstrat za fosfatazu: X-fosfat (5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat) indikator (NBT nitroblue tetrasolium salt) reducira se dajui ljubiasto

obojenje na mjestima na kojima je dolo do hibridizacije3) - zataliti u vreicu i inkubirati na 37C do pojave vrpci na membrani

- prekinuti reakciju, oprati i osuiti membranu


58/121

58

CHEF (contour-clamped homogeneous electric field) elektroforeza cijelih kromosomakvasca (A) i Southern blot analiza nakon hibridizacije sa specifinom probom (B)

NORTHERN ANALIZA HIBRIDIZACIJA mRNA

hibridizacija mRNA s radioaktivnom probom DNA Southern blotting se nije mogao koristiti za prijenos RNA molekula razdvojenih gel

elektroforezom na nitroceluloznu membranu jer se RNA nije mogla vezati nanitrocelulozu (kasnije je otkriveno da se moe vezati u odgovarajuim uvjetima)

koristi se za odreivanje razine ekspresije gena i odreivanje veliine i koliinemRNA u stanici

vri se prijenos RNA s gela na kemijski aktivirani papir kad se kovalentno vezala, RNA moe hibridizirati s radioaktivno obiljeenim DNA

probama bendovi koji su hibridizirali lociraju se autoradiografski

oprez: rad s RNA teak jer su Rnaze svugdje prisutne (ak i na koi na rukama), one sujedne od najotpornijih enzima (teko se denaturiraju, nije dovoljna ak ni sterilizacija),ne trebaju dvovalentni kation za aktivnost!

postupak:1) izolacija mRNA vezanje eukariotske mRNA, koja ima na 3' kraju poliA, na

oligo(dT)celulozu2) denaturirajua agarozna gel elektroforeza - odjeljivanje molekula mRNA po veliini3) prijenos na membranu4) hibridizacija s obiljeenom probom DNA/RNA hibrid

5) detekcija, kvantifikacija (interni standard!)


59/121

59

ne treba raditi s restrikcijskim enzimima! moe se odrediti koji su geni i koliko eksprimirani u stanici (prilino kvantitativno) kao standard koristi se neki gen koji se konstitutivno eksprimira i ija je razina

ekspresije poznata usporedbom sa standardom odreuje se relativna razina ekspresije ispitivanog gena npr. ako imamo neku transgenu biljku i Southern blottingom smo dokazali da je

transgena, tj. da ima odreeni gen, ali ne znamo da li se taj gen eksprimira, pa se to

dokazuje Northern blottingom primjena: u medicinskoj dijagnostici

RT-PCR = Reverse transcription PCR

amplifikacija molekula cDNA (= komplementarna DNA) dobivenih iz mRNA pomoureverzne transkriptaze

PCR osnova za DNA ipove iz stanice se izolira mRNA koja slui kao kalup za sintezu komplementarna cDNA

pomou reverzne transkriptaze i dNTP kao klica za reverznu transkripciju koristi se poli-dT (jer mRNA na 3 kraju ima poli-A

rep) ili neka klica specifina za mRNA nakon zavrene reakcije reverzne transkripcije provodi se standardni PCR postupak,

odnosno amplifikacija s drugom specifinom klicom pomou Taq polimeraze koliina amplificiranog materijala proporcionalna je koliini RNA na poetku

Documents

GENETIČKO INŽENJERSTVO