GEN VE PSODOGENLERN mRNA LARI KODLAMADAN BAIMSIZ OLARAK TMR BYOLOJSN DZENLER

Tanmlanmas gereken kavramlar; Psdogen miRNA siRNA Tmr basklayc genler

PSDOGEN Psdogenler ilevsel genlerin almayan evrimsel akrabalardr, bunlar protein kodlama yeteneklerini kaybetmi veya bir ekilde artk hcre iinde ifade edilmemektedir. Bazlarnn intron veya promtorlar yoksa da (bunlar mRNA' dan kopyalanp kromozoma dahil edilmilerdir ve bu yzden ilenmi psdogen olarak adlandrlrlar), ounun gen-benzeri baz zellikleri vardr (promotrler, CpG adalar ve ubirletirme noktalar gibi), bunlar, protein veya RNA kodlamalarna engel olan eitli tip mutasyonlardan dolay ilevsizdir. Her psdogenin ilevsel bir geninkine benzer bir DNA dizisi varsa da, bunlar ilevsel bir son rn retemezler. Genomdaki bir DNA dizisinin psdogen olduunun anlalmas kolay deildir nk homoloji ve ilevsizlik artlar biyolojik olarak kantlanmaz.

Psdogenlerin snflandrmas yledir: lenmi (veya retrotranspoze) psdogenler. karyotlarda, zellikle memelilerde, retrotranspozisyon yaps zerinde muazzam etki eden ve sk sk olan bir Retranspozisyonu srecinde, mRNA ters transkripsiyon DNA'ya evrilir ve kromozom DNA snn iine eklenir. Yksek genom olaydr. yoluyla

Retrotranspozonlar genelde kendi kopyalarn yaratsalar dahi, deneylerle gsterilmitir ki, kromozomdaki rastgele genlerin de ters transkripsiyonunu yapabilirler. Bu psdogenler genomun iine eklendikten sonra genelde bir poli-A kuyruuna sahip olurlar ve ounlukla intronlar kartlm olur. Ancak, bunlar olgun bir mRNA rnden tredikleri iin, ilenmi psdogenler normal genlerin sahip olduu promotrlerden yoksundur; bu yzden bunlar retrotranspozisyon srecinin sonucu olarak ilevsiz psdogen haline gelmilerdir. lenmi psdogenlerin bir dier zellii, asl diziye kyasla 5' ucun kesik olmasdr, bunun nedeni retrotranspozisyon mekanizmasnn yeterince sresel olmamasdr.

lenmemi (veya ikilenmi) psdogenler. Gen ikilenmesi, genomlarn evrimindeki bir dier yaygn ve nemli sretir. levsel bir genin bir kopyas gen ikilenmesinin bir sonucu olarak meydana gelebilir ve bunu takiben mutasyonlar edinerek ilevsiz hle gelebilir. kilenmi psdogenler genelde genlerin tm zelliklerine sahiptir, ekson-intron yaps ve promotr dizileri dahil olmak zere.

mikroRNA (miRNA) yaklak 21-23 nkleotit uzunluunda tek iplikli RNA molekl trdr, gen ifadesinin dzenlenmesinde rol oynar. miRNA lar kodlamayan RNA'lardandr, yani DNA'dan transkripsiyonu yaplan ama proteine evirisi yaplmayan genler tarafndan kodlanrlar.miRNA nn ilevinin gen dzenlemesi olduu anlalmaktadr. Bu amala bir miRNA bir veya daha ok mRNA' y tamamlaycdr (komplemanterdir). Hayvan miRNA' lar genelde 3' UTR blgesine tamamlaycdr. miRNA' nn mRNA ile elemesi bazen protein evirisini engeller ve bazen de mRNA' nn kesilmesini (RNA interferansa benzer bir srele) kolaylatrr. ou hayvan miRNA' s protein evirisini engeller. miRNA karyotik hcrelerin normal ilevinde yer ald gibi, miRNAnn bozuk almas da hastala neden olur.

miRNA

siRNA ift iplikli, 20-25 nkleotid uzunluunda ve hcrede ok deiik fonksiyonlar olan ksa interfering RNA interferaz mekanizmasnda rol alr.

9

miRNA ile siRNA arasndaki farkllk nedir? Her iki tr de gen ekspresyonunun dzenlenmesinde rol alr. siRNA dsRNAdan orijinlenir. siRNA byk lde yabanc RNAya (genellikle viral) etki gsterir ve hedefine %100 olarak balanr. miRNA sa tokas eklinde ssRNAdan orijinlenir, endojen kaynakl miRNA, posttranskripsiyonel gen ekspresyonunu dzenler, %100lk bir komplementerlik salamaz (biraz mismatch) miRNA, mRNAy ortadan kaldrmak yerine mRNAnn translasyonunu modle eder.

TMR SUPRESSOR GENLER; 1-Hcre proliferasyonunu kontrol ederler, fren grevi yaparlar. 2-Fonksiyon kayb iin her iki allelinde inaktive olmas gerekir. 3-Bymeyi inhibe eden antionkogenler(kanser supressor genler).Bu grup genler resessiv onkogenler olarak da adlandrlr nk hcre transformasyonu iin her iki allelde de hasar olumaldr. Yani tmr spressr genlerin mutasyonlar hcresel dzeyde resesiftir.

AMA; mRNA lar ribozomlara genlerin kodlarn tamaktadrlar. miRNA lar ise eitli blgelerinden bu mRNA lara balanrlar. Bizim hipotezimiz udur ki miRNA larn balanmas mRNA lara protein kodlama zelliinden bamsz olarak ileyen bir reglator zellik katabilir. Bu sorunun cevabn aratrmak iin model olarak PTEN ve psdogen PTENP1 kullanlm ve bu genlerin kodlarn tayan mRNA lar karlatrlarak incelenmitir.

PTEN (fosfotaz ve tensin homologu) Bu protein 10. kromozomda yer alan PTEN geni tarafndan kodlanr bu genin mutasyonu kanser oluumuna zemin hazrlar. PTEN, fosfotaz protein rn nedeniyle tmr basklayc gen gibi ilev grr.Hcre siklusunda yer alan bu fosfataz hcreleri ok hzl bymekten ve ok hzl blnmekten korumaktadr. PTEN de meydana gelen mutasyonlar ve delesyonlar sonucu enzimatik aktivite inaktif hale gelir. Hcre proliferasyonunda art ve hcre lmnde d gzlenir. PTEN inaktivasyonu sonucu glioblastoma,endometriyal kanser,prostat kanseri oluur ve bu genin dk miktarda ekspresyonuna akcier ve gs kanserinde rastlanmtr.

PTEN bir tmr suppresr gen olup miktarndaki azalma sonucu bir ok hastalk zellikle kanser olumaktadr. PTEN kodlayan mRNA y hedef alan bir ok miRNA nn varl tespit edilmitir. Bunun sonucu postranskripsiyonel reglasyon kanser hcrelerindeki PTEN miktarnn deimesinde ok nemli bir yer almaktadr. Hcrelerin PTEN miktarndaki en farkedilemez orandaki azalmalarda bile ok hassas olduu dnldnde miRNA kaynakl PTEN reglasyonu kanserde nem kazanmaktadr. nk; miRNA nn ar ekspresyonunun insan hastalklaryla ve kanserle ilikili olduu bilinmektedir.

PTENP1/PTH2/PTEN; (fosfotaz ve tensin homolog psdogen1) PTENP1 ilenmi bir psdogen olup 9. kromozomda yer alr. PTEN ile yksek homoloji gsterir sadece 18 tane mismatch vardr.

PTENP1in 3UTR blgesi PTEN ninkinden yaklak 1 kilobaz ksadr. Bu iki genin 5UTR blgeleri yaklak %95, 3UTR ise %50den az homoloji gsterir.

PTENi hedef alan miRNAlar PTENP1ide hedef almaktadr

miRNA larn PTEN ve PTENP1 ekspresyonu zerindeki etkisini anlayabilmek iin homolog olmayan 3UTR blgelerine zg PCR primer setleri dizayn edilmi.DU145 ve PC3 PROSTAT KANSER HCRE HATTI

PC3 hcre hatt PTEN mutasyonuna sahip olduu iin PTEN eksprese edemiyor ayrca PTENP1 de bir xbal kesim blgesi var bu da rnlerimizi (PTEN ve PTEN1 ) birbirinden ayrmamz kolaylatryor.

DU145 prostat kanser hcrelerinde mi RNA 19b ve 20a PTEN ve PTENP1 miktarn basklyor.

Imix miRNA 17 ve 19 inhibitr ortama eklendiinde PTEN1 miktar artmakta sadaki PTEN ise pozitif kontrol olarak kullanlm. IC ise miRNA inhibitr negatif kontrol

Hcreler yabanl ve mutant reporter plazmidlere infekte edildikten 24 saat sonra mutant plazmiddeki lusiferaz aktifitesinde art belirlenmitir. Mutasyonlar miRNA larn PTEN 3UTR blgesine tam balamasn engelledii iin lusiferazn translasyonu artmtr.

PTENP1 geninin 3UTR blgesi tmr supresif aktiviteye sahiptir. PTENP1 3UTR blgesinin aktarld plasmit ile infekte olan hrcelerde 24saat sonra yaplan PCR lmlerinde PTENP1 3utr blgesini PTEN ekspresyonun arttrd ve hcre bymesini engelledii tespit edilmitir

DICER enzimi olmayan kolon kanser hcrelerinde PTENP1 3UTR blgesinin ekspresyonunun olmad belirlenmi. Bu sonu bize PTENP1 3UTR blgesinin PTEN zerindeki etkisi iin olgun miRNA ya ihtiyac olduunu gstermitir.

PTENP1 in basklanmasnn fenotipik sonularn aratrmak iin, PTENP1 yada PTEN ekspresyonunu spesifik olarak hedefleyen siRNA havuzlar (Dharmacon) tasarlamlar. nk; PTEN iin piyasada varolan siRNA havuzlar PTEN ve PTENP1in her ikisininde dizisine yaygn olarak balanmakta idi.

Hcre proliferasyonu hzlandrlm si-PTENP1 transfeksiyonunda, PTENP1dk seviyelerde eksprese olmasna ramen DU145 hcre hattnda biyolojik olarak varln srdrmtr.Hem PTEN hem de PTENP1 i susturan si- PTEN/PTENP1, PTEN ve onun psdogeninin bymeyi basklamada katklarnn olabileceini gsterdi. PTENP1 in susturulmas sonucu PTEN mRNA ve protein varl azalacak ekilde sonuland. PTENP1 3 UTR blgesinin ar ekspresyonunun salad sonularla da desteklenmitir.

DU145 hcrelerinde PTENP1 3UTR PTENe gre gl bymeyi basklayc zellikte olduu belirlenmi. Bunun nedeni ise PTENP1 e balanan miRNA lar ayn zamanda baka tmr supressif genlerin mRNAlarna da balanmaktadr mesela miRNA 17 E2F2 ve p21 hedef almaktadr

PTEN retimi olmayan PC3 hcrelerinde miRNA 17 ve miRNA21 proliferasyonu arttrd ve bunu PTEN PTENP1den bamsz olarak yapt tespit edilmitir.

siPTENP1 sadece PTEN deil ayn zamanda P21 ide downregle etmitir. Hem siPTENP1 hem siPTEN/PTENP1 PTENP1 oluumunu basklam ve PTEN retemeyen PC3 hcrelerinde proliferasyonu arttrmtr.

nsan kanserlerinde PTENP1 in ekspresyonu ve kayb PTEN ve PTENP1 ekspresyonu Taqman problar kullanlarak normal insan dokusunda ve prostat tmrl dokuda aratrlm.

PTEN ve PTENP1 ekspresyonu arasndaki direkt korelasyon bunlarn birlikte dzenlendiini dndrm. Ve bu bulgu PTENP1 in PTEN in ekspresyonu ile dzenlendiini gsterdikleri molekler almalarn destekledi. Hatta; PTENP1 bol deiken ve baz durumlarda PTEN den de daha fazla eksprese olduu bulundu.

PTENP1 genomik lokusundaki deiikliklerin belirlenmesi iin the cancer workbench ve NCBI Geo gibi array tabanl veri tabanlar aratrlmtr.

Sporadik kolon kanseri veri setinde PTENP1 lokusunda spesifik olarak meydana gelen kopya saysndaki kayp cluster analizi ile saptand.

Bu kopya saysndaki kayp lokaldir, 9.kromozomdaki kaypla ilgili deildir ve CDKN2A lokusundaki kayptan bamszdr. Bu veri seti PTENP1 lokusundaki genomik kopya saysndan bamsz gsterildi ve bu PTENP1 in tmr basklayc fonksiyonu olduunu destekledi.

PTENP1 kopya says ve PTEN ekspresyonu arasndaki direkt iliki aratrmaclarn hipotezini desteklemitir. Hipotez: PTENP1 transkript seviyesi PTEN ekspresyonunu dzenler. Bu bulgular; PTENP1 in onko supressive aktivitesi iin ana at oluturmaktadr.

Ayn rnek setinde cluster analizine gre normal kolon rnekleriyle karlatrldnda PTEN ekspresyonu dktr.

A general model for endogenous m-RNA mediated biology Dier kanserlerle ilikili psdogen Aratrmaclar, PTEN 3 UTR blgesinin biyolojik aktiviteye sahip olduunu umarken aslnda bu blgenin PTENP1 bolluunda basklanmadn bulmulardr. ve genleride aratrmlar. Gen ve psdogen dizileri gstermi ki miRNA bal blgeler iyi korunmular ve bunlar rneklendirmiler. Ayn mekanizmann KRAS ve onun psdogeni KRAS1P arasnda da olduunu dnmler.

Sonu ve Tartma; Psdogenler iin miRNA nn yem olma fonksiyon kefi biyolojik olarak aktif niteler olan bu transkriptleri belirledi. PTENP1 ve KRAS1P kendi ana genlerinin seviyesini etkilemektedirler ve hastalk patogenezinde yer alrlar. PTENP1 gibi psdogenler dk seviyede eksprese olan kendi ana genlerini basklamazlar. Psdogenlerin saysndaki iyileme protein kodlayan bir genin miRNA lardan daha fazla korunduunu syleyebiliriz. PTENP1, PTEN seviyesini pozitif olarak dzenler. PTENP1 lokusu insan kanserlerinde kopya saysnda kayba urar ve bu PTEN deki bir dle koreledir.