GENETIKA BAKTERIJA

Na temelju stanine organizacije ive organizme dijelimo u prokariote i eukariote

Eukarioti imaju pravu jezgru obavijenu jezgrinom ovojnicom, a u citoplazmi stanice brojni organeli sa vlastitom membranom; u jezgri se nalazi nekoliko parova kromosoma koji su graeni od DNA i proteina, a jezgra se dijeli mitozom i/ili mejozom

Prokarioti (pro-prije, karyon-jezgra) su organizmi (stanice) bez prave jezgre; cijanobakterije, bakterije i mikoplazme

Prokarioti imaju samo jedan kromosom, a to je gola, prstenasta molekula DNA; dijele se binarnom diobom nakon replikacije DNA

Sve do 1950. malo se znalo o genetici bakterija, jer je bilo velikih potekoa u eksperimentalnom radu (uzgoj, krianje, prepoznavanje na temelju fenotipa)

Biljna stanica

Mikoplazme

Nakon to su tehnike potekoe oko uzgoja prevladane, prokarioti su postali neizostavni eksperimentalni objekti u genetici, posebno u molekularnoj genetici (pretea je biokemijska genetika): otkrivanje strukture i funkcije gena, regulacija i mutacije gena; razjanjavanje genetikog koda ...

Danas mikroorganizmi (bakterije i virusi) imaju kljunu ulogu u kloniranju gena i genetikom inenjerstvu

Bakterije su mali jednostanini organizmi koje je mogue vidjeti pomou svjetlosnog i elektronskog mikroskopa

U prirodi ih ima u velikom broju, a pokazuju veliku raznolikost oblika

Stanina struktura je vrlo jednostavna; prstenasta DNA (nukleoid), ribosomi, plazma membrana, stanina stijenka (ali ne celulozna kao u biljaka) i u nekih polisaharidna kapsula

Vrlo su pogodni za genetika istraivanja: jednostavna graa, kratak ivotni ciklus (dijele se svakih 30-40 minuta), jednostavan uzgoj u laboratoriju, raznolikost fenotipa (u smislu funkcije)

Najpopularniji objekt genetikih istraivanja bakteriju E. coliotkrio je 1885. Theodor Escherich

BAKTERIJSKA SVOJSTVA (FENOTIP)

Oblik bakterijske stanice moe biti sferian (koki), tapiast (bacili) ili spiralan (spirili)

Oblik bakterijske kolonije je vano svojstvo koje je vidljivo na krutoj hranjivoj podlozi (agarskoj ploi)

Kolonija na agarskoj ploi predstavlja mnotvo genetiki istovjetnih stanica (klon) koje su nastale iz jedne stanice binarnom diobom

U nekih vrsta bakterija stanice su obavijene polisaharidnom kapsulom to kolonije ini glatkima (S) za razliku od hrapavih (R) kolonija koje stvaraju bakterije bez polisaharidne kapsule

Drugo vidljivo fenotipsko svojstvo je prisutnost ili odsutnost bieva na povrini stanice (ako su stanice pokretne, kolonije na agarskoj ploi izgledaju raireno; ako su nepokretne stanice kolonije su tokaste)

Najea svojstva koja istrauju bakterijski genetiari ukljuuju biokemijske mutacije (mutacije gena iji produkti enzimi kontroliraju biosintetske putove)

Otpornost na antibiotike (Penr), fage, faktore iz okolia ...

Bakterije su s obzirom na prehrambene potrebe PROTOTROFI ili AUKSOTROFI

PROTOTROFI divlji tip bakterija koji moe rasti na MINIMALNOJ PODLOZI (voda, izvor ugljika; glukoza ili saharoza, mjeavina anorganskih soli)

Genske mutacije uzrokuju zastoj u biokemijskim putovima -biokemijske mutante

Biokemijske mutante ne mogu sintetizirati odreene supstance kaoaminokiseline, nukleotide ili vitamine i stoga se te supstance moraju dodavati u podlogu kako bi bakterije mogle rasti

Mutante koje zahtijevaju razliite dodatke minimalnoj podlozi nazivamo AUKSOTROFNIM MUTANTAMA (npr. auksotrofna mutanta za metionin zahtijeva metionin u podlozi: Met-)

Auksotrofne mutante mogu rasti na kompletnoj podlozi (sadri ekstrakt kvasca i hidrolizat proteina) koja sadri sve supstance potrebne za rast

Auksotrofi mogu rasti na selektivnim podlogama: MP uz dodatak odreenih supstanci koje bakterija ne moe sintetizirati

Tehnika uz pomo koje se moe brzo utvrditi da li je odreeni soj bakterije auksotrofan za odreeni metabolit je tehnika otiska ili replica-plating tehnika (Joshua Lederberg)

KROMOSOMSKA ORGANIZACIJA

Geni bakterije organizirani su u jednu grupu vezanih gena (haploidni organizmi)

Kromosom bakterija je prstenasta, gola, dvolanana molekula DNA nazivamo ga nukleoid (koristi se jotermin GENOFOR = genetiki materijal prokariota i virusa)

Uz bakterijski kromosom u stanici se mogu nalaziti PLAZMIDI, male krune molekule DNA

Plazmid je nezavisna samoreplicirajua estica (Lederberg)

Plazmidi se repliciraju neovisno o bakterijskom kromosomu, a svaki plazmid ima mali broj gena

Bakterijska stanica dijeli se binarnom diobom nakon replikacije DNA

U povoljnim uvjetima bakterije se vrlo brzo razmnoavaju, primjerice E. coli se u optimalnim uvjetima dijeli svakih 20 minuta; tijekom kultiviranja preko noi (12 sati) iz jedne stanice nastane kolonija od 107 do 108 stanica

U prirodnom stanitu (debelo crijevo sisavaca) to ide jo bre Zbog nespolnog razmnoavanja sve bakterije u jednoj koloniji

nastale iz jedne stanice su genetiki istovjetne Ipak neke se stanice razlikuju zbog mutacija; za odreeni gen u

E. coli vjerojatnost mutacije je oko 1x10-7 po staninoj diobi; budui da se u crijevu svakodnevno stvara 2x1010 novih stanica E. coli broj mutanata bit e 2000 (2x1010/1x10-7)

Mutacije su dakle jedini izvor genetike varijabilnosti u bakterija

Uz mutacije i genetika rekombinacija pridonosi varijabilnosti, ali na razini populacije

Binarna dioba

REKOMBINACIJA U BAKTERIJA

Rekombinacija je ujedinjavanje (kombiniranje) genetikog materijala dviju jedinki u genom jedne jedinke

Nasljedna tvar jedne bakterije ili virusa moe se ugraditi u nasljednu tvar druge bakterije ili virusa ime nastaju rekombinantni potomci

Genetiku rekombinaciju u bakteriji E. coli prvi su uoili i objasnili Lederberg i Tatum 1946.

Mehanizmi rekombinacije u bakterija su: transformacija, konjugacija i transdukcija

TRANSFORMACIJA

Izmjena genetike informacije izmeu gole DNA (donor) i DNA stanice recipijenta

Transformirajui princip otkrio je Griffith 1928. Gola DNA je kompetentna za transformaciju ako je dvolanana i

relativno velika Stanice kompetentne za transformaciju moraju na povrini imati

protein faktor kompeticije koji se vee za stranu DNA (vezanje zahtijeva energiju)

Bakterije koje nisu prirodno kompetentne moemo tretirati npr. CaCl2; tada stanica postaje kompetentna

Prilikom transformacije u stanicu recipijenta ulazi samo jedan lanac dvolanane DNA, te se ugrauje u genom domaina uz pomo dva krosing-overa

Preostala jednolanana DNA (dio originalnog bakterijskog kromosoma) razgradit e enzimi egzonukleaze

KONJUGACIJA

Konjugacija je indirektni prijenos genetikog materijala iz stanice DONORA u stanicu RECIPIJENTA tijekom spolnog razmnoavanja

Stanice koje konjugiraju moraju biti razliitih tipova parenja to ovisi o prisustvu F plazmida ili spolnog faktora u citoplazmi

F plazmid nosi gene za stvaranje F pilusa (sex pili) i gene za prijenos DNA iz donora u recipijenta (najmanje 22 gena)

Stanica koja ima slobodan F plazmid je F+ stanica ili DONOR, a stanica koja ga nema je F- stanica ili RECIPIJENT

Uvijek konjugiraju F+ i F- stanice i prilikom toga se F faktor donora replicira i njegova kopija prelazi u F- stanicu preko konjugacijskog mostia

Konjugacija

F plazmid se, osim to moe biti slobodan u citoplazmi, moe ugraditi u bakterijski kromosom i pri tom nastaje Hfr soj (high frequency of recombination)

F plazmid ugrauje se u bakterijski kromosom jednim krosing-overom

Hfr soj konjugira s F- sojem i pri tome Hfr je donor koji daje kopiju svog kromosoma F- stanici (recipijent)

Prijenos ide uvijek u jednom smjeru preko konjugacijskog mostia

Bakterijski kromosom se prenosi kao linearna molekula nakon pucanja na odreenom mjestu unutar integriranog F plazmida; stoga preko mostia prvo prelazi jedan dio F plazmida koji za sobom vue bakterijski kromosom

Vrlo rijetko uspije prijei itav bakterijski kromosom; u tom sluaju posljednji ulazi dio plazmida

Najee prijee samo dio bakterijskog kromosoma, jer je konjugacijski mosti vrlo nestabilna struktura koja lagano puca

U rekombinaciju je ukljuen samo dio kromosoma donora koji je uao u stanicu recipijenta; takva stanica je parcijalni diploid ili merozigota

Rekombinante se mogu detektirati pomou selektivnih podloga

MAPIRANJE (KARTIRANJE) BAKTERIJSKIH GENA

Za mapiranje se mogu koristiti svi mehanizmi rekombinacije: transformacija, konjugacija i transdukcija

Konjugacija i mapiranje Jacob i Wollman - razvili tehniku prekinutog parenja

(konjugacije) kojom su dokazali da je prijenos genetikog materijala donora u recipijenta za vrijeme konjugacije linearan proces

Pomijeali soj F- i Hfr u mikseru; svakih nekoliko minuta ukljuivali mikser kako bi razdvojili stanice u konjugaciji; stanice se nacijepljuju na podlogu koja sadri antibiotik koji ubija Hfr stanice koje su prirodno osjetljive na njega

Zatim se preostale stanice nacijepe na minimalne podloge s razliitim dodacima (npr. na podlozi bez leucina moe rasti samo prototrofna rekombinanta koja nastaje prijenosom gena za Leu iz Hfr u F- i njegovom ugradnjom u genom F- soja)

Poredak gena odreuje se na osnovu vremena koje je potrebno da odreeni gen prijee iz donora u recipijenta (prekinuta konjugacija minute) te na osnovu broja prototrofnih rekombinanata koje nastaju prijenosom gena i njihovom ugradnjom u kromosom recipijenta

Karta bakterijskog kromosoma je kruna karta, a jedinice karte su minute koje dobivamo tehnikom prekinute konjugacije

TRANSDUKCIJA

Prijenos nasljedne tvari iz jedne bakterije u drugu pomou bakterijskih virusa

Otkrili su je Lederberg i Zinder 1951. U-cijev ije su strane odvojene filterom sa veliinom

pora manjom od veliine bakterijske stanice; 2 razliita auksotrofna soja bakterije Salmonella typhimurium

Iako je izmeu sojeva barijera (filter) dolo je do rekombinacijei pri tome je nastao prototrofan soj koji raste na minimalnoj podlozi

Mogunost transformacije je iskljuena jer su podlozi dodali enzime koji razgrauju golu DNA

U podlozi su nali estice virusa P22 koji je dovoljno malen da proe kroz pore bakterijskog filtra

SAETAK

Prokarioti su jednostavni, jednostanini organizmi bez prave jezgre; nasljedna uputa je u nukleoidu prstenastoj dvolananoj molekuli DNA (haploidni organizmi!)

U prokariota ubrajamo bakterije, cijanobakterije i mikoplazme

Bakterije se razmnoavaju binarnom diobom nakon replikacije DNA pri emu nastaju genetiki identini produkti

u bakterija dolazi do genetike rekombinacije konjugacijom, transformacijom i transdukcijom

VIRUSI

Virusi su obligatni paraziti to znai da su izvan ive stanice inertne molekule

Rad s bakterijama i virusima omoguio je razvitak molekularne biologije

Zajednike znaajke bakterija i virusa za genetika istraivanja:

- kratko generacijsko vrijeme - jednostavna graa i organizacija nasljedne tvari - lako se uzgajaju u laboratoriju

Virusi su vrlo jednostavo graeni: svaki virus sastoji se od molekule DNA ili RNA i proteinskog omotaa

Genom virusa ini: DNA ili RNA (dvolanana ili jednolanana) pa ih prema tome i klasificiramo na DNA, odnosno RNA viruse

Najmanji virusni genom ima samo tri gena (RNA fag) Fagi T2 ili T4 su DNA fagi s do 130 gena Viruse moemo klasificirati i prema strukturnim znaajkama

proteinskog omotaa (KAPSIDA) kao to su vrsta ili simetrija, zatim prema broju proteinskih podjedinica (KAPSOMERA) u kapsidi i veliini kapside

Kapsida je u nekih virusa vrlo jednostavna (samo jedna vrsta proteina), dok je u drugih sloenije grae (nekoliko slojeva proteina na koje su vezani lipidi i ugljikohidrati)

Kapside nekih bakterijskih virusa (bakteriofaga) mogu biti vrlo sloene grae i sastoje se od glave i repa na kojem se nalaze fibrile za prihvaanje za stanicu domaina

Neki virusi osim kapside imaju i ovojnicu

Veliina virusa kree se od 20 nm u promjeru (manji od ribosoma) do 200 nm (veliina najmanje bakterije)

Genomi DNA i RNA virusa se razlikuju u veliini: DNA 3-200 kb; RNA 2-20 kb

Veina DNA virusa se replicira u jezgri gdje im je dostupna DNA-polimeraza i ostali potrebni enzimi; replikacija je vezana uz S fazu staninog ciklusa stanice domaina

RNA virusi ne ovise o jezgri stanice domaina; npr. cijeli ciklus umnoavanja ljudskog polio virusa odvija se u citoplazmi (izuzetak ini virus gripe koji se replicira u jezgri stanice domaina)

UZGOJ U LABORATORIJU

Uzgoj virusa razlikuje se od uzgoja bakterija Virusi kao obligatni paraziti mogu rasti samo u ivoj stanici Bakterijski virusi uzgajaju se na agarskim ploama

prekrivenima livadom bakterijskih stanica Napad virusa rezultira puknuem ili lizom bakterijskih

stanica, a pritom nastaju istine ili plaq-ovi na agarskoj ploi

Graa bakterijskog virusa

glava : DNA proteinski omota

rep i repne fibrile

IVOTNI CIKLUS BAKTERIOFAGABakterijski virusi razmnoavaju se ubrizgavanjem svoje DNA u bakterijsku stanicu. U stanici se virusna DNA umnaa koristei stanine elemente domaina. Repne fibrile omoguavaju virusu prihvaanje za bakterijsku stijenku.

1. LITIKI CIKLUS:fag se prihvaa za posebno receptorsko mjesto na povrini bakterijske stijenke, te enzimom lizozimom razara stijenku i ubacuje svoj genetiki materijal u bakteriju, te preuzima njen metabolizamprvo se sintetizira mRNA za sintezu enzima koji e razgraditi bakterijsku DNA to e virus koristiti za izgradnju (replikaciju) vlastitog genomadolazi do razgradnje bakterijskog kromosoma (5-10 min nakon ubacivanja genetikog materijala), dok se istovremeno genetiki materijal virusa replicira u vie kopija

viralni genetiki materijal kontrolira proizvodnju proteinskih komponenti omotaa (glava, rep i repne fibrile)

pakiranje virusnog genetikog materijala u proteinski omota nove virusne estice (20-30 minuta nakon poetka infekcije)

stanica domaina puca (liza) djelovanjem enzima lizozima iz repa viriona i oslobaaju se stotine novih virusnih estica (lizat) koje zaraavaju druge bakterije

litiki ciklus imaju virulentni fagi

LITIKI CIKLUS

2. LIZOGENI CIKLUS

imaju ga temperirani ili umjereni fagi

fag moe ugraditi svoju DNA u kromosom domaina to nazivamo PROFAG

profag se dalje pasivno replicira kao dio bakterijskog kromosoma, te se prilikom dijeljenja prenosi zajedno s bakterijskim kromosomom na stanice kerke

bakterija koja nosi profag otporna je na svaku daljnju infekciju i nazivamo je LIZOGENOM bakterijom

u nepovoljnim uvjetima moe doi do indukcije profaga, dakle izlaska fagne DNA iz bakterijskog kromosoma, te fagna DNA ulazi u litiki ciklus

indukcija profaga moe se izazvati eksperimentalno X-zraenjem ili UV-zraenjem

TRANSDUKCIJA

Prijenos genetikog materijala iz jedne bakterije u drugu pomou virusa (bakteriofaga)U procesu transdukcije rekombiniraju se geni bakterija, a ne geni virusaOvisno o nainu razmnoavanja bakteriofagatransdukcija moe biti:

OPASPECIJALNA ILI OGRANIENA

OPA TRANSDUKCIJA

Otkrili su je Zinder i Lederberg (bakterija Salmonellatyphimurium i fag P22), 1952.Prilikom razmnoavanja virulentnog faga dogaa se da novosintetizirani proteinski omota zapakira sasvim sluajno mali komadi bakterijskog kromosoma umjesto viralne DNARijedak dogaaj (1/100.000)Defektni fag (transducirajua estica) moe inficirati drugu bakteriju te prenijeti bakterijsku DNA u drugu stanicu domaina u kojoj dolazi do rekombinacijeTransducirajui fag moe nositi oko 2 do 2,5% kromosoma domaina Geni koji su vrlo blizu mogu biti transducirani zajedno (kotransdukcija) Kotransdukcija se koristi u mapiranju bakterijskih genaTransducirajui segment parit e se s homolognom regijom bakterijskog kromosoma domaina te e doi do rekombinacije

SPECIJALNA (OGRANIENA) TRANSDUKCIJA

Otkrivena je u faga (Lederberg) i E. coliAnalogna je spolnoj dukciji, to znai da ovisi o greci prilikom izrezivanja (indukcije) profagaUmjereni (temperirani) fagi imaju lizogeni ciklus (virusna DNA je ugraena u kromosom domaina profag)Prilikom indukcije profaga, dakle izlaska iz bakterijskog kromosoma dolazi do grekeProfag zahvaa dio bakterijskog kromosoma te takav izlazi van i ulazi u litiki ciklusTakav defektni fag moe zaraziti druge bakterijske stanice i prilikom toga prenosi i bakterijske gene stanici domaina pa dolazi do rekombinacije

Profag se ugrauje uvijek na isto mjesto u bakterijski kromosom; stoga prilikom indukcije profag prenosi samo ogranieni broj bakterijskih gena razlog zbog ega ova vrsta transdukcije nije pogodna za mapiranje bakterijskih gena

SAETAK

Nasljeivanje i varijabilnost u prokariota i virusa razlikuje se od istih u viih biljaka i ivotinja zbog specifine organizacije genomaProkarioti i virusi nemaju jezgru, niti se dijele mitozom i mejozomkromosom prokariota i virusa ini gola DNA (ili RNA)Zbog jednostavne grae, lakog uzgoja i kratkog ivotnog ciklusa prokarioti i virusi su idealni organizmi za istraivanje biokemijskih i molekularnih aspekata genetikeU prokariota i virusa nema nezavisne segregacije (jedna grupa vezanih gena)Mehanizmi rekombinacije u bakterija: konjugacijom, transformacijom ili transdukcijomVirusi nisu samo asocijacija nukleinske kiseline i proteina njihova sposobnost da koriste staninu maineriju za sloene procese potrebne za njihovu reprodukciju ukazuje na visoki stupanj specijalizacijeDo rekombinacije u virusa dolazi kada 2 virusa inficiraju istu bakterijsku stanicu

GENETIKA BAKTERIJABAKTERIJSKA SVOJSTVA (FENOTIP)KROMOSOMSKA ORGANIZACIJAREKOMBINACIJA U BAKTERIJATRANSFORMACIJAKONJUGACIJAMAPIRANJE (KARTIRANJE) BAKTERIJSKIH GENATRANSDUKCIJASAETAK