Genetska diagnostika

prirojenih bolezni

Katarina Trebušak Podkrajšek

Osnove preiskovalnih metod (3. letnik MF UL)Tretji sklop: Molekularno genetske metode za diagno stiko v medicini

Huntingtonova bolezen

� nevrodegenerativna, progresivna bolezen� prevalenca: 1/ 20.000 (120 bolnikov v Sloveniji)� začetek bolezni v starosti 30-50 let

� Simptomi: 1. Motorične disfunkcije (horea)

2. Psihiatrični (demenca, čustvene motnje, razdražljivost, anksioznost, depresija…)

3. Kognitivni (prizadeta zmožnost načrtovanja, organizacije, pomnjenja…)

Huntingtonova bolezen - etiologija

� autosomno dominantno� gen IT-15 (huntingtin) � povečano št. CAG ponovitev

(N: 10-26 ponovitev)

� mutiran huntingtin bolj odporen na proteolitično razgradnjo, zato se kopiči v citoplazmi in jedru

Nestabilno število ponovitev (dinami čne mutacije)

� Večje število ponovitev vzrok za zgodnejši začetek bolezni.

� Anticipacija: težja oblika bolezni v naslednjih generacijah.

Shelbourne et al, Hum Mol Genet 1999

Definicija genetskega testiranja

Preiskava človeške DNA, RNA, kromosomov z namenom ugotoviti dedne, z boleznimi povezane genotipe, mutacije ali kariotipe za klinične namene. Vključuje tudi ugotavljanje genetskih sprememb, ki niso nujno ključne za opredelitev posamezne bolezni.

European commission, STRATA group on genetic testin g: 25 Recommendations on Ethical, Legal and Social Implications of Genetic Testing

Sequeiros J et al. The wide variation of definitions of genetic testin g in international recommendations, guidelines and repor ts. J Community Genet. 2012 ;3(2):113-24.

Genetske spremembe …… so spremembe na nivoju DNA

Genske spremembe so spremembe znotraj enega gena.

Kromosomske spremembe spremenijo strukturo ali število kromosomov.

Prirojene genetske spremembe se prenašajo v naslednjo generacijo.

Pridobljene genetske spremembe se ne podedujejo, do njih pride v telesnih celicah.

Genotip: genetska zgradba organizma.

Genetska sprememba

je priporočen nevtralni izraz, ki zajema pojma

1. Mutacija patološka sprememba

2. Polimorfizem sprememba, prisotna v >1% populacije

http://www.genomenewsnetwork.org/

Vrste genskih in /ali kromosomskih sprememb

� Substitucija : zamenjava nukleotida z drugim

� Delecija : izguba nukleotidov� Insercija : vrinek nukleotidov� Inverzija : zamenjava smeri odseka DNA

� Translokacija : sprememba položaja segmenta kromosoma� Sprememba v številu kromosomov

drugačnosmiselne zamenjava aminokisline

nesmiselne STOP kodon

tihe nov kodon za isto aminokislino

Kako se izra žajo genetske spremembe?

� Fenotipske razlike med posamezniki

� Dedne bolezni� Nagnjenost k bolezni� Spremenjen odziv na zdravila, vplive okolja

Fenotip je manifestacija genetske lastnosti; določajo ga genotip in okolje.

http://c2workshop.typepad.com/weblog/culture-training

Genetske bolezni

1. Monogenske bolezni: okvara enega gena.

2. Multifaktorske in poligenske boleznisodelovanje več genov z različnim vplivom okoljskih dejavnikov (astma, diabetes, debelost, rakava obolenja...)

3. Genetske bolezni zaradi kromosomskih aberacijspremembe v št. kromosomov, velike strukturne preureditve, delecije, translokacije

Heterogena skupina bolezni, ki so posledica sprememb v genetskem materialu, DNA ali RNA.

Namen genetske preiskave

� potrditev suma na genetsko obolenje (npr. CF)� identifikacija prenašalcev obolenja � prenatalna diagnostika� testiranje nagnjenosti (npr. Crohnova bolezen)� asimptomatsko testiranje (npr. imunodeficience)� sledenje nenormalnih presejalnih izvidov pri

novorojenčku (npr. prirojena izguba sluha)� farmakogenetika (optimizacija zdravljenja z zdravili

glede na genotip bolnika)

Podatki, pomembni zagenetsko diagnostiko

Podatki o preiskovancu

Napotna diagnoza, zdravnik

Razumna privolitev

Tip vzorca

Namen preiskave

Vrsta preiskave

http://www4.kclj.si/index.php?m=6&s=15&odd=0&id=478&o=2

Razumna privolitev:

Obveščenost?

Odvzem, genetska preiskava?

Hranjenje v DNA banki?

Uporaba v raziskov. namene?

Objava rezultatov v znanstvene namene?

Kadarkoli možnost preklica privolitve!

I. Molekularno genetske

preiskave

Struktura humanega gena

5'UTR ekson 1 2 3 4 3'UTR

ATG STOP

promotor intron poliA signal

Metode molekularno genetskih preiskav

izolacija DNA, RNA: periferna kri, bris ustne sluznice, horionske resice…

PCR pomnoževanjedolo čanje znanih mutacij (RFLP, OLA, alelno specifični PCR…)presejalne metode (dHPLC, SSCP, HRM…)dolo čanje velikih delecij, duplikacij (MLPA)dolo čanje nukleotidnega zaporedjaanaliza RNA

analiza in interpretacija rezultatov

PCR pomno ževanje odseka DNA, RNA

� par primerjev, ki zajema celotno regijo, ki nas zanima.

� termostabila DNA polimeraza

� PCR aparat (primeren temperaturni profil, število

ciklov).

verižna reakcija s polimerazo, angl. Polymerase Cha in Reaction (PCR)

Presejalna metoda -denaturacijska tekočinska kromatografija visoke lo čljivosti (dHPLC)

� Deluje po principu HPLC z reverzno fazo (nepolarna stacionarna faza in polarna mobilna faza)

Uporaba dHPLC� Presejalna (screening) metoda za dolo čanje mutacij

� Wild type (WT) � daljši retenzijski čas in druga oblika krivulje� Mutanta � krajši retenzijski čas in druga oblika krivulje

� Določanje velikosti fragmentovDaljši fragment � daljši retenzijski čas

Določanje nukleotidnega zaporedja po Sangerju

G

A C G T

A C G TA C G T

AG

C

AT

labeled products

annealingdenaturation

rxn. mixture

extension

Interpretacija rezultatov sekven čne analize

� Sekvence primerjamo s sekvencami normalnih zaporedij iz GeneBank

� Preverimo ali so že opisane v HGMD ali v SNP podatkovni bazi

� Neopisane mutacije identificiramo in poimenujemo. Preverimo prisotnost mutacije pri zdravih kontrolah.

� Dvojno poimenovanje mutacij (http://www.hgvs.org/mutnomen/)

p.Pro568Arg (P568R), štetje od 1 Met

c.1704C>T, štetje: 1 je A iz ATG (1Met)

Negativni rezultat (mutacija ni prisotna) se nanaša samo na pregledano regijo, ki je navedena na izvidu

Določanje nukleotidnega zaporedja vseh kodirajo čih zaporedij celotnega genoma (eksom)

Ku CS et al. Exome sequencing: dual role as a discov ery and diagnostic tool. Ann Neurol 2012;71(1):5-14 .

Cisti čna fibroza

� autosomno recesivno dedovanje� mutacije v genu CFTR (7q31)� incidenca cca. 1:3300

Simptomi:1. Visoka koncentracija kloridnih ionov v znoju. 2. Kronična bolezen dihalnih poti: gosta sluz, infekcije.3. Odpoved pankreasa (zmanjšano izločanje alkalne tekočine)4. Prizadetost prebavil (sindrom intestinalne obstrukcije), jeter.5. Nerazvitost semenovoda

Protein CFTR

� 1480 ak, ~170 kDa� Ekspresija : epitelne celice (dihala, prebavila, trebušna slinavka,

žolčnik, rodila, ledvica, žleze slinavke in znojnice)

ne-epitelne celice (eritrociti, endotelne celice, srčni miociti)

� Struktura: 2 transmembr. domeni2 ATP-vezavni domeniregulatorna domena

� Vloga : kloridni kanalčekregul. transporta drugih ionov

Mutacije v genu CFTR

� več kot 1800 znanih mutacij (baza mutacij CF www3.genet.sickkids.on.ca/cft r)

� najpogostejša p.Phe508del

Poimenovanje mutacij� Tradicionalno poimenovanje ni priporo čeno (∆∆∆∆F508)� Nomenklatura HGVS (http://www.hgvs.org/rec.html)

na nivoju proteina: p.Phe508del na nivoju cDNA : c.1521_1523delCTT

Mutacija p.Phe508del ( ∆∆∆∆F508)

Normalno zaporedje eksona 10

Mutacija ∆F508

∆F508 v heterozigotni obliki

CAA

Prisotna pri 62,7% slovenskih bolnikov s cistično fibrozo.(Vouk K et al. Pflugers Arch 2000)

Metode v genetski diagnostiki CF

Ciljana opredelitev dolo čene mutacije � Analiza dolžine restrikcijskih fragmentov RFLP� Sekvenčno-specifočno PCR pomnoževanje s sistemom ARMS (Tepnel) � Metoda ligacije oligonukleotidov (Abbott Molecular)� hibridizacija točkovnega odtisa (dot blot) (Innogenetics)

Iskanje neznane mutacije � denaturacijska HPLC� denaturacijska gradientna gelska elektroforeza (DGGE)� analiza konformacijskih polimorfizmov enoverižnih DNA (SSCP)� direktno sekvenciranje� od ligacije odvisno hkratno pomnoževanje sond MLPA

Interpretacija rezultatov

Ostale pogoste mutacije?

∆∆∆∆F508

2 mutaciji

cistična fibroza?

potrjena CFpotrjena CFpotrjena CF

2 mutaciji

0-1 mutacija

? klinična slika CF

0-1 mutacija

0 mutacij

NE

Verjetno ni CF

Nosilec mutacije

1 mutacijaSekveniranje kod. regijeDelecija eksonov 2 in 3

• sekveniranje kod. regije• dolo čitev velikih delecij

DA1 mutacija

Atipi čna CF?Mut. na drugih regijah?Mutacija ni zaznana?

Verjetno ni CFVerjetno ni CFVerjetno ni CFVerjetno ni CF 0 mutacij

Witt H Gut 2003;52:ii31-ii41Copyright © BMJ Publishing Group Ltd & British Society of Gastroenterology. All rights reserved.

Delitev mutacij glede na vpliv na nastanek in funkcijo proteina

Delitev mutacij glede na klini čni pomen

A. Mutacije, ki povzro čajo CF:� nesmiselne mutacije in spremembe bralnega okvirja: ∆F508� drugačno-smiselne mutacije (p.Asn1303Lys) in mutacije, ki vplivajo

na izrezovanje (c.3272-26A>G), in resno vplivajo na nastanek in funkcijo proteina

B. Mutacije povezane z boleznimi povezanimi s CF

C. nukleotidne spremembe brez klini čnega pomena� tihe mutacije � intronske spremembe izven konsenzusnega področja: � nukleotidne spremembe pogoste v zdravi populaciji: p.Met470Val

D. Nukleotidne spremembe z neznanim klini čnim pomenom: funcionalno neopredeljene intronske (c.406-6T>C) in drugačno-smiselne mutacije (p.Gly662Asp)

Dequeker et al. Best practice guidelines for molecular genetic diagnosis of cystic fibrosis and CFTR-related disorders--updated European recommendations. Eur J Hum Genet 2009: 17(1):51-65.

Namen analize gena CFTR

� diagnostično testiranje pri bolnikih s tipi čno kl. sliko � diagnostično testiranje pri bolnikih z netipi čno klini čno

sliko ali mejnimi vrednostmi kloridnih ionov v znoju� diagnostično testiranje neplodnosti pri moškem kot

posledice azoospermije (congenital bilateral absence of vas deferens-CBAVD)

� prenatalna diagnostika� opredelitev nosilcev mutacije pri sorodnikih bolnika s CF� v nekaterih primerih tudi opredelitev nosilstva mutacije pri

posameznikih z negativno družinsko anamnezo

Hemofilija - kraljevska bolezen

QueenVictoria

Albert

Alice Louis

Alexandra CzarNicholas IIof Russia

Alexis

http://www.humanillnesses.com/original/Gas-Hep/Hemophilia.html

Hemofilija A

� X-vezana recesivna bolezen � pogostost 1-5 /10.000 rojenih dečkov� prirojena motnja strjevanja krvi zaradi pomanjkanja,

odsotnosti ali neaktivnosti koagulacijskega faktorja VIII, kot posledica mutacij v genu za faktor VIII

� glede na aktivnost faktorja ločimo:

� težko (< 1%), � srednje težko (1-5%) in � lahko obliko bolezni (>5-30%).

Gitscher J et al, Nature 1984

Inverzija introna 22� 50% težkih hemofilij A� Intrakromosomska rekombinacija med F8A (int 22) in

telomernim identičnim genom

qter

qter

Faktor VIII gen

26

F8Adist.

F8Aproks.

qter

F8Aznotraj introna 22

1 26

22 1 23 26

1

F8Adist.

F8Aproks.

F8Aznotraj introna 22

Težka<1%

Srednje težka1-5%

Lahka>5%

Prenašalka30 - 50%

presejalne metodePCR/SSCP, DGGE, dHPLC

sekvenciranje F8(kodirajoča regija, 5'UTR, 3'UTR, promotorji, odseki izrezovanja

Inverzija int 22 (50%)

InverzijaInt

1(5%)

+ -

-

PRENATALNA DIAGNOSTIKA

neznana znanamutacija mutacija

+

II. Citogenetske preiskave

Kromosomske spremembe

1. Števil čne nepravilnostimonosomija: izguba 1 od 2 homolognih kromosomovtrisomija: 1 dodatni kromosom

2. Strukturne nepravilnostidelecija : izguba večjih odsekov DNAinsercija : vrinek večjih odsekov DNAinverzija : zamenjava smeri odseka DNAtranslokacija : sprememba položaja segmenta kromosoma

Kariotip

Kariogram, mikroskopska slika obarvanih metafaznih kromosomov razporejenih po velikosti.

� je garnitura kromosomov neke celic

� človeški: 46 kromosomov, 22 parov avtosomov, dva spolna kr.

FISH = Fluorescentna In Situ Hibridizacija

Osnovni princip: hibridizacija specifičnih DNA sond na predele genomske DNA s komplementarnim zaporedjem.

http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327

Primerjalna genomska hibridizacija na mikromrežah (aCGH)

DNA mikromreža je zbirka mikroskopskih DNA točk, vezane na trdo podlago.

Trisomija 21

Downov sindrom

http://www.parkavefertility.com/pre-implantation_genetic_diagnosis.html

Downov sindrom

� trisomija 21 kromosoma� incidenca 1/800, raste s starostjo matere

Klini čne značilnosti� duševna zaostalost� ploščat obraz in okcipitalni del � epikantus (prirojena navpična kožna guba na notranjih

straneh očesnih rež) � prirojene srčne okvare � nižja postava, krajše okončine, široke in kratke dlani

Turnerjev sindrom 45,X

� 1:2000 do 1:5000 živorojenih deklic� različne kromosomske aberacije

(strukturne in številčne), najpogostejša45,X in mozaicizem

s

Turnerjev sindrom (45,X)

Simptomi:

nizka rast; debelostrazvojni zaostanekgonadna disgenezakongenitalni limfedem

kardiološke anomalijeanomalije ledvicnaglušnostgonadoblastom

Mikrodelecijski sindromi

� strukturne kromosomske nepravilnosti � fenotipske posledice so odvisne od velikosti

manjkajočega dela in genov v tem delu kromosoma

http://www.thefullwiki.org/Genetic_deletion

Skupne fenotipske zna čilnosti ve čine sindromov� zaostanek v rasti� nevrološka okvara� duševna manjrazvitost / učne težave / epilepsija / mikrocefalija /

hipotonija/ čustvene motnje� obrazni dismorfizmi� razvojne nepravilnosti

mikrodelecijski sindromi delecijaWilliamsov sindromWAGR sindromAngelmanov sindrom (70%) Prader-Willijev sindrom (70%) Velocardiofacialni/DiGeorgev sindrom

7q11.211p1315q11.2 (mat) 15q11.2 (pat) 22q11.2

DiGeorge sindrom

Kl. značilnosti posledica nepravilnosti v razvoju škržnih lokov � srčno-žilne okvare� hipoparatiroidizem� imunodeficience zaradi aplazije timusa� razcep ustnic oz neba…

Incidencacca 1/4000

Najpogostejši vzrokdelecija TUPLE1 22q11.2 (117kb)