Genotipificación de Cepas de Mycobacterium Tuberculosis Aisladas de Pacientes Con Vihsida, Mediante Mirus-Vntr. 507780

V Congreso Internacional de Ingeniera Bioqumica XVI Congreso Nacional de Ingeniera Bioqumica

VI Jornadas Cientficas de Biomedicina y Biotecnologa Molecular

Mar del Norte No. 5, Col. San lvaro Azcapotzalco C. P. 02090, Mxico, D. F. Tel. y Fax: 5623 3088 email: [email protected], [email protected]

Clave: 507780

TITULO: GENOTIPIFICACIN DE CEPAS DE Mycobacterium tuberculosis AISLADAS DE PACIENTES CON VIH/SIDA, MEDIANTE MIRUS-VNTR. AUTORES: Rivera-Gutirrez, Sandra; Castillo-Ramrez, Ivn; Cerna-Corts, Jorge; Gonzlez y Merchand, Jorge. DIRECCION: Laboratorio de Microbiologa Molecular. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. Instituto Politcnico Nacional. Prol. de Carpio y Plan de Ayala s/n 11340. D.F. Mxico. CORREO ELECTRONICO: [email protected], [email protected]




INTRODUCCIN

La tuberculosis (TB) es una enfermedad causada por los miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis, el cual se encuentra formado por M. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. pinepedi y M. tuberculosis, siendo este ultimo el principal el agente causal de la infeccin (Pasqualato y Ferreira, 2001). A travs de la historia del hombre, la TB ha sido responsable de millones de muertes alrededor del mundo; la introduccin de diferentes antibiticos como la estreptomicina, la isoniacida, la rifampicina y el etambutol, as como diferentes medidas profilcticas establecidas principalmente como programas de control, permitieron la reduccin drstica de la incidencia de la TB hacia finales de 1970 (Ducati y col., 2006). Sin embargo, desde 1985 se ha presentado un resurgimiento de este padecimiento lo cual, llev a la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) en 1993, a declarar a esta enfermedad como una emergencia global de salud pblica (Hopewell y col., 2005).

Actualmente, los principales factores que han ocasionado el aumento en la incidencia de este patgeno son el creciente nmero de cepas de M. tuberculosis multifrmaco resistentes (MDR) a dos o ms drogas antituberculosas de primera lnea como rifampicina e isoniacida, y el aumento de personas que presentan al Virus de la Inmunodeficiencia Humana/Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (VIH/SIDA) (Aaron y col., 2004). De hecho, de acuerdo al reporte global emitido por la OMS, 740 000 casos de TB se presentaron en adultos infectados con VIH (URL 1).

La infeccin por VIH representa uno de los principales riesgos para la evolucin de la TB latente a la enfermedad activa. Adems, la TB induce el desarrollo de SIDA en pacientes VIH positivos debido a la produccin de citocinas estimulantes y la disminucin de clulas CD4+. Por ello, la co-infeccin VIH- M. tuberculosis representa un problema importante de salud pblica tanto para los pacientes infectados como la poblacin en general. De hecho, es tanta la relacin que existe entre estas dos infecciones que: La TB es la enfermedad ms importante en la evolucin de SIDA. La TB es la principal causa de mortalidad entre pacientes con VIH/SIDA. La incidencia de TB coincide dentro del periodo estacional, regin geogrfica y tipo de poblacin con la incidencia de SIDA. La TB activa es ms comn en pacientes VIH positivos.

La existencia del VIH/SIDA ha cambiado drsticamente la epidemiologa de la TB, causando un aumento en la transmisin dinmica, morbilidad y mortalidad de esta ltima enfermedad. Adems, el diagnstico de TB entre pacientes VIH positivos es ms complicado debido a diferentes factores como: falsos negativos en la prueba de tuberculina, baciloscopias negativas en muestras de esputo, esquemas pulmonares atpicos obtenidos mediante rayos X, as como TB extrapulmonar. As mismo, la epidemia de VIH/SIDA



favorece la aparicin de cepas MDR, consecuencia del alto ndice de tratamientos interrumpidos. Los ndices de mortalidad entre pacientes VIH positivos infectados con TB-MDR la muerte del pa

ltimacaract marcarestricestndhabershan dimporpolimcol. 2nucle

de laepidemcomo variabla asiencon

es mayor del 80% con un periodo de 6 a 14 semanas entre el diagnstico yciente (Ftkenheuer y col., 1999). Mar del Norte No. 5, Col. San lvaro Azcapotzalco C. P. 02090, Mxico, D. F. Tel. y Fax: 5623 3088 email: [email protected], [email protected]

Debido a la gran importancia que ha desarrollado M. tuberculosis durante las s dcadas, se han establecido una serie de tcnicas que proporcionan esquemas de erizacin y clasificacin intraespecie conocidos como mtodos de tipificacin.

Varios estudios sealan que M. tuberculosis puede ser tipificado usando varios dores genticos; sin embargo, el poliformismo de la longitud de fragmentos de cin (RFLP) de la secuencia de insercin 6110 (IS6110) ha sido considerado como el ar internacional para la tipificacin molecular de M. tuberculosis. Despus de e secuenciado el genoma de varios miembros del complejo de M. tuberculosis, se esarrollado otras tcnicas moleculares para la epidemiologa molecular de este tante patgeno, tal como el nmero variable de repetidos contiguos (VNTR), el orfismo de la longitud de fragmentos amplificados fluorescentes (FAFLP) (Ahmed y 003), la espoligotipificacin (Kamerbeek y col. 1997), el polimorfismo de un solo tido (SNPs) y el polimorfismo de secuencias largas (Kremer y col., 2005).

Recientemente se desarroll una tcnica molecular basada en la reaccin en cadena polimerasa (PCR), que parece ser la ms prometedora en los estudios de

iologa molecular de M. tuberculosis. (Supply y col., 2001). Esta tcnica conocida MIRUs VNTR (unidades micobacterianas de repeticin ntergnica- nmero

le de repetidos contiguos), consiste en la amplificacin de 12 locus independientes y gnacin de un cdigo numrico de acuerdo al nmero de repetidos contiguos trados en cada locus (Fig. 1).

Fig. 1 Composicin molecular de las unidades micobacterianas de repeticin ntergnica (MIRUs)




En M. tuberculosis y otros organismos procariotes recientemente se han caracterizado estructuras tipo microsatlites y minisatlites. En M. tuberculosis H37Rv, estas estructuras estn compuestas por unidades repetidas contiguas de 40 a 100pb llamadas unidades micobacterianas de repeticin ntergnica (MIRUs) (Supply y col., 2000).

A la fecha, se conocen 41 MIRUs dispersos en el cromosoma de M. tuberculosis, los cuales flanquean diversos genes involucrados en el metabolismo bacteriano incluyendo la biosntesis o la degradacin de lpidos, cidos nucleicos y protenas; as como la produccin de energa y la transduccin de seales. De estos, solo 12 MIRUs muestran polimorfismos en el nmero de copias contiguas entre diferentes aislados (Supply y col., 2000).

Los MIRUs pueden ser fcilmente analizados por su amplificacin mediante una novedosa tcnica de PCR, la cual ha sido ampliamente recomendada para la tipificacin molecular de cepas del complejo M. tuberculosis, ya que es una tcnica rpida, con gran reproducibilidad y con un alto poder de discriminacin en comparacin con las otras tcnicas moleculares (Kremer y col., 2005). Adems, la tcnica de MIRUs-VNTR es considerada una herramienta til para detectar variantes clonales en una sola muestra, incluso en situaciones extremas donde las variantes se encuentran en escasa proporcin dentro de la poblacin bacteriana (Garca de Viedma y col., 2005).

A la fecha, existen pocos estudios acerca de la prevalencia de las diferentes especies de micobacterias en pacientes con VIH/SIDA (Comaru y col., 2003) y a pesar de que diferentes estudios han empleado las tcnicas de MIRUs-VNTR en la epidemiologa molecular de M. tuberculosis, no existen reportes del estudio de la epidemiologa molecular mediante MIRUs-VNTR en cepas aisladas de pacientes con VIH-SIDA. En nuestro pas, son muy pocos los estudios que se han realizado con micobacterias aisladas de pacientes con VIH/SIDA; entre ellos, destaca el trabajo de Santos-Montero en el 2003, Molina-Gamboa y col. en 1996 y Vzquez y col., en 1994, en los que se describen algunas de las especies de micobacterias presentes en pacientes con VIH/SIDA.

Lpez lvarez en el ao de 2006 realiz un estudio molecular que establece las diferencias genticas que existen entre diferentes aislados de micobacterias en pacientes con VIH/SIDA. En este estudio, se analizaron un total de 80 cepas de micobacterias aisladas de pacientes con VIH/SIDA de las cuales, 86.3% correspondieron al Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT) y 13.7% se identificaron como micobacterias no tuberculosas (MNT) (Lpez A. M., 2006).

Entre estos resultados se encontraron una gran diversidad gentica de las cepas

encontrndose 32 patrones de RFLP y 22 espoligotipos para 56 cepas de M. tuberculosis, as como 9 espoligotipos para las 10 cepas de M. bovis incluso, uno de los espoligos encontrados en M. bovis fue reportado a la base de datos internacional como un nuevo espoligotipo (Lpez lvarez M. 2006).




Por lo tanto, dada la gran diversidad que se ha encontrado en cepas del complejo de M. tuberculosis en pacientes con VIH/SIDA, es importante continuar con el estudio de estas cepas mediante otra tcnica de genotipificacin molecular que nos permita analizar an ms las caractersticas genotpicas entre las cepas aisladas en pacientes de VIH/SIDA. As como tambin es muy importante evaluar aquellas cepas que presentan resistencia a diferentes frmacos para de esta manera, contribuir al mejor manejo de los pacientes y al control de la tuberculosis en nuestro pas. Debido a lo anterior el objetivo del presente trabajo es genotipificar mediante MIRUs-VNTR diferentes cepas del complejo Mycobacterium tuberculosis obtenidas de pacientes con VIH/SIDA y determinar molecularmente su resistencia a la rifampicina y a la isoniacida.




MATERIALES Y MTODOS

Propagacin y Obtencin del DNA genmico. Cada cepa se descongel y propag en 200 ml de caldo Dubos (Difco), enriquecido

con OADC, el cual se incub a 37C de 15 a 30 das. Una vez concluido el tiempo de incubacin se realiz un frotis el cual, se ti por la tcnica de Ziehl-Neelsen para verificar la pureza del cultivo. La obtencin de DNA se realiz de acuerdo a la metodologa establecida por Gonzlez y Merchand y col. (1996) utilizando cloruro de guanididnio como regulador de lisis. Amplificacin de MIRUs-VNTR.

La amplificacin de los MIRUs-VNTR se realiz utilizando 12 pares de iniciadores que amplifican cada uno de los 12 locus gnicos MIRUs (Tabla I). Cada reaccin se llev en un volumen final de 50 l (Tabla II), donde la concentracin de magnesio vari de acuerdo al locus MIRUS: La mezcla 1 corresponde a los MIRUs 2, 4, 10, 16, 16, 31 y 40 La mezcla 2 corresponde a los MIRUs 23 y 39 La mezcla 3 corresponde a los MIRUs 20, 24, 26 y 27.

De esta manera se llevaron a cabo 12 reacciones de PCR para cada una de las cepas de acuerdo con la siguiente programacin en el temociclador:

Desnaturalizacin inicial durante 15min a 95C . 40 ciclos: Desnaturalizacin durante 1min a 94C, alineamiento de los

iniciadores a 59C durante 1min y extensin durante 1.5min a 72C. Extensin final durante 10min a 72C.

Una vez concluida la PCR, los fragmentos amplificados se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 3% durante 5 horas a 100 V, para posteriormente teir el gel con bromuro de etidio a una concentracin de 0.7 g/ml. Posteriormente el gel se visualiz en un transiluminador de luz UV a una longitud de onda () de 302nm, digitalizando la imagen obtenida. Adicionalmente, los fragmentos obtenidos se separaron mediante el uso del bionalizador marca Aligent Technologies




Tabla I. Secuencia de los iniciadores empleados en la amplificacin de los diferentes locus del MIRUs-VNTR.

INICIADOR SECUENCIA 5--> 3 MIRUS 2 2F- TGGACTTGCAGCAATGGACCAACT

2R- TACTCGGACGCCGGCTCAAAAT MURIS 4 4F- GCGCGAGAGCCCGAACTGC

4R- GCGCAGCAGAAACGTCAGC MURIS 10 10F-GTTCTTGACCAACTGCAGTCGTCC

10R-GCCACCTTGGTGATCAGCTACCT MIRUS 16 16F-TCGGTGATCGGTCCAGTCCAAGTA

16R-CCCGTCGTGCAGCCCTGGTAC MIRUS 20 20F-TCGGAGACATGCCCTTCGAGTTAG

20RGGAGACCGCGACCAGGTACTTGTA MIRU 23 23F CTGTCGATGGCCGCAACAAAACG

23R-AGCTCAACGGGTICGCCCTTTTGTC MIRU 24 24R CGACCAAGATGTGCAGGAATACAT

24F GGGCGAGTTGAGCTCACAGAA MIRU 26 26F TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC

26R- CATAGGCGACCAGGCGAATAG MIRU 27 27F- TCGAAAGCCTCTGCGTGCCAGTAA

27R- GCGATGTGAGCGTGCCACTCAA MIRU 31 31F- ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA

31R- GTGCCGACGTGGTCTTGAT MIRU 39 39F- CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC

39R- CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT MIRU 40 40F- GGGTTGCTGGATGACAACGTGT

40R- GGGTGATCTCGGCGAAATCAGATA Tabla II. Condiciones de la PCR para la amplificacin de los MIRUs-VNTR.

Reactivos Mezcla tipo 1 MgCl2 2 mM

Mezcla tipo 2 MgCl2 2.5 mM

Mezcla tipo 3 MgCl2 1.5 mM

Concentracin final

H2O 25.8 l 24.8 l 26.8 l - Taq Buffer 10X 5 l 5 l 5 l 1x

Sol Q 5X 10 l 10 l 10 l 1x MgCl2 25 mM 1 l 2 l - De acuerdo al

MIRU dNTPs (5 mM)

1 l 1 l 1 l 100 mM iniciadores (20

mM) 1 l 1 l 1 l 0.1 mM

Taq 5U 0.2 l 0.2 l 0.2 l 1U DNA 5 l 5 l 5 l --




RESULTADOS

Genotipificacin mediante MIRUs-VNTR Los productos de amplificacin de cada uno de los 12 locus gnicos fueron

separados mediante tanto en electroforesis en gel de agarosa con un tiempo de corrimiento de 5 horas a 100 V, as como mediante el bioanalizer. Al calcular el tamao de cada una de las bandas obtenidas en cada locus gnico y al analizar estos tamaos con el numero de copias correspondiente encontramos que el cdigo MIRUs para la cepa testigo M. tuberculosis H37Rv es 233236133332, cdigo que corresponde al MIRUs reportado por Supply y col. (2000) (Fig. 2).

500pb

300pb

650pb

Fig. 2 Electroferogrmas del MIRUs de M tuberculosis H37Rv. A) Electroferogrma del MIRUs de M. tuberculosis H37Rv en gel de agarosa al

3%. B) Electroferogrma del MIRUs de M. tuberculosis H37Rv en el bioanalizador.

De esta manera se obtuvo el MIRUs de 56 cepas de M. tuberculosis aislados de pacientes con VIH/SIDA. Los ms representativos se encuentran representados en las figuras 3 y 4.

En el total de las cepas analizadas hasta ahora, nicamente encontramos 3 cepas que tiene el mismo cdigo de MIRUs que la cepa testigo de M. tuberculosis H37Rv. El resto de las cepas, muestran una amplia variedad entre los cdigos numricos obtenidos. Estos cdigos mostraron un mayor polimorfismo en los MIRUs 10, 16, 20, 23, 26 y 40 obteniendo un nmero variable de copias para cada uno de ellos entre las distintas cepas. Por otro lado, los MIRUs 2, 4, 24, 27, 31 y 39 presentaron un polimorfismo ms bajo en los cuales, se obtuvo una alta homologa en el nmero de copias de entre las diferentes cepas.




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Cepa: 29 cdigo MIRUs: 220326153322 Cepa: 17 cdigo MIRUs: 22322613322


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Fig. 3. M. tuberculosis aisladas

separados y analizados mediante el bioanalizador Aligent

MIRUs representativos de las diferentes cepas dede pacientes con VIH/SIDA. Los productos de PCR fueron Technologies . Carril 1 MIRU02, Carril 2 MIRU04, Carril 3 MIRU10, Carril 4 MIRU16, Carril 5 MIRU20, Carril 6 MIRU23, Carril 7 MIRU24, Carril 8 MIRU26, Carril 9 MIRU27, Carril 10 MIRU31, Carril 11 MIRU39, Carril 12 MIRU40.





Cepa: 16 cdigo MIRUs: 223326133321


Cepa: 32 cdigo MIRUs: 225225153323

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Fig. las difere adas

arados y analizados mediante el bioanalizador marca Aligent

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ntes cepas de M. tuberculosis aisl 4. MIRUs representativos dede pacientes con VIH/SIDA. Los productos de PCR fueron sepTechnologies . Carril 1 MIRU02, Carril 2 MIRU04, Carril 3 MIRU10, Carril 4 MIRU16, Carril 5 MIRU20, Carril 6 MIRU23, Carril 7 MIRU24, Carril 8 MIRU26, Carril 9 MIRU27, Carril 10 MIRU31, Carril 11 MIRU39, Carril 12 MIRU40.




Estos resultados muestran una diferencia en los estudios realizados con otras poblaci

Tabla III. Comparacin del polimorfismo de cada uno de los MIRUs entre la

ones donde se ha observado que los MIRUs con una mayor variabilidad en el numero de copias son los MIRUs 4, 10, 16, 26, 40 y 31, mientras que el restos de los MIRUs presentan un polimorfismo mas bajo. Esto significa que en nuestro estudio 4 MIRUs presentan una variabilidad diferente en el nmero de copias en comparacin con otros estudios (Tabla III). poblacin de M. tuberculosis aisladas de pacientes con VIH/SIDA y otras poblaciones. Locus MIRUS Polimorfismo encontrado en la Polimorfismo reportado por

poblacin de VIH/SIDA. otros estudios 2 Bajo Bajo 4* Bajo Alto 10 Alto Alto 16 Alto Alto 20* Alto Bajo 23* Alto Bajo 24 Bajo Bajo 26 Alto Alto 27 Bajo Bajo 31* Bajo Alto 39 Bajo Bajo 40 Alto Alto




DISCUSIN

En el presente trabajo se realiz la genotipificacin mediante MIRU-VNTR de cepas de M tuberculosis aisladas de pacientes con VIH/SIDA en la ciudad de Mxico. A la fecha no existen datos de la epidemiologa molecular de M. tuberculosis en este tipo de pacientes que representan uno de los factores ms importantes en el aumento de la enfermedad a niveles mundial. Nosotros estudiamos la epidemiologa molecular de las cepas mediante el uso de 12 locus gnicos basados en MIRUs-VNTR en una poblacin de 56 cepas, las cuales mostraron una alta diversidad gentica mostrando diferentes patrones de MIRUS-VNTR. Interesantemente encontramos 3 cepas con el mismo cdigo de M. tuberculosis H37Rv. Por otro lado se obtuvo cdigos muy semejantes para el caso de las cepas de M bovis. Al comparar nuestros resultados con otros estudios encontramos que en la poblacin de pacientes con VIH/SIDA, cuatro MIRUs muestran un polimorfismo diferente al que se presentan en pacientes de poblacin abierta (4, 20, 23 y 31) lo cual puede ser debido a la similitud intrnseca de las cepas que afectan a este tipo de pacientes o puede ser reflejo de la relacin entre cepas encontradas en una regin geogrfica en particular.

La alta diversidad gentica observada mediante MIRU-VNTR fue tambin observada previamente mediante el RFLP y la espoligotipificacin (Lpez, 2006). Esta alta diversidad puede bien ser atribuida al continuo aporte de cepas provenientes de otras regiones endmicas del pas o de pases endmicos vecinos. O bien podra ser tambin ocasionada a la presencia de regiones hipervariables en las cepas circulantes en esta regin.




CONCLUSIONES

La genotipificacin mediante MIRU-VNTR una alta diversidad gentica en cepas de M. tuberculosis en pacientes con VIH/SIDA.

Los MIRUs 4, 20, 23 y 31 mostraron un polimorfismo diferente en la poblacin con VIN/SIDA en comparacin con poblacin abierta.

La mayor parte de las cepas de M bovis mostraron patrones similares en la genotipificacin mediante MIRUs VNTR.




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REFERENCIAS INFORMTICAS

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