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VARIAÇÃO TEMPORAL DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA DA
TILÁPIA DO NILO EM AMOSTRAS REFRIGERADAS E ATIVADAS
GEORGE SHIGUEKI YASUI
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
MARÇO - 2007
ii
VARIAÇÃO TEMPORAL DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA DA TILÁPIA
DO NILO EM AMOSTRAS REFRIGERADAS E ATIVADAS
GEORGE SHIGUEKI YASUI
Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Aprovada em 08 de março de 2007
Comissão Examinadora
_____________________________________________ Prof. Dalcio Ricardo de Andrade
_____________________________________________
Prof. José Frederico Straggiotti Silva
_____________________________________________ Prof. Eduardo Shimoda
_____________________________________________
Prof. Manuel Vazquez Vidal Júnior Orientador
iii
“Buscar o conhecimento é apenas uma forma de descobrir o quanto o ser humano é limitado”
iv
DEDICATÓRIA
A minha esposa Thauanna, minha mãe Noriko, minhas irmãs Érika e Anne pelo apoio
incondicional.
Ao meu pai Makoto e meu irmão Ralph pelo incentivo e por terem despertado minha fascinação
pelos peixes através da pesca esportiva e do aquarismo.
v
AGRADECIMENTOS
A formação de um indivíduo é o resultado de uma inter-relação de fatores, dentre os quais se destaca o convívio tanto pessoal quanto profissional, onde ocorre uma interação de amizade, profissionalismo, dedicação, bem como momentos de alegrias e de tristezas. Nesse contexto, gostaria de expressar minha imensa gratidão às diversas pessoas e instituições, que direta ou indiretamente contribuíram tanto para minha formação acadêmica quanto pessoal. Em especial, agradeço: A FAPERJ/UENF, pela concessão da bolsa de estudos. Aos meus familiares, aos quais não tenho palavras em meu vocabulário para expressar tamanha gratidão. Ao meu orientador, Manuel Vazquez Vidal Júnior, pela eficiente orientação e amizade. Ao professor, Dalcio Ricardo de Andrade, pela orientação dentro e fora do meio acadêmico. Ao professor e amigo, Eduardo Shimoda, pela ajuda na coleta de dados e indispensáveis sugestões deste trabalho, bem como os momentos de descontração. Ao professor José Frederico Stragiotti Silva, pelas sugestões e pela constante disponibilidade em contribuir. Ao companheiro André Veloso, pela amizade e pela contribuição nas correções finais deste documento. À Pós-graduação em Produção Animal da Universidade Estadual do Norte Fluminense e ao Laboratório de Zootecnia e Nutrição Animal, pela oportunidade, pelo inestimável apoio durante a realização deste trabalho, em especial à professora Celia Raquel Quirino. Aos meus mestres da Universidade Federal de Viçosa, Luiz Carlos dos Santos e Oswaldo Pinto Ribeiro Filho, pela eficiente orientação durante a graduação e pela amizade. Aos funcionários da Estação de Piscicultura e Hidrobiologia-UFV e Ranário Experimental, João Pindóia, Paulo, Donizete, José Antônio, Inácio, Carlos, Alvaro, Everaldo e Raimundo, pelos ensinamentos e pela amizade. Aos professores da UENF, Francisco Aloízio Fonseca, Rita Trindade, José Brandão Fonseca, Ricardo Vieira, Humberto Couto, Rony Ferreira, Luis Castillo e Alberto Fernandes, pelo convívio diário e prazeroso e pelo aprendizado. Aos escudeiros da UENF Lombardi, Etiene, Elenita, Jovana, Simone, Jorge, Jonas, José, Bia e Mauricio. A todos os amigos (são muitos e felizmente não caberiam nesta página) de Viçosa-MG, Campos dos Goytacazes-RJ e Mogi das Cruzes-SP.
vi
BIOGRAFIA
George Shigueki Yasui, filho de Makoto Yasui e Noriko Yasui, nascido em 1º de janeiro
de 1979, em Mogi das Cruzes, São Paulo.
Em setembro de 2002, graduou-se no curso de Zootecnia pela Universidade Federal de
Viçosa – UFV, onde foi contemplado com bolsa de extensão, MEC/UFV, trabalhando com cultivo
de tilápias.
De outubro de 2002 a julho de 2004, foi bolsista de apoio técnico do TECNORTE, na
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, na área de biotecnologia de tilápias.
Em Agosto de 2004, ingressou no Curso de Pós-graduação em Produção Animal, nível
de mestrado, na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.
Em 8 de março de 2007, submeteu-se aos exames finais de defesa de tese.
vii
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................................... viii
ABSTRACT ................................................................................................................................ ix
CAPÍTULO I: ASPECTOS GERAIS DA TILAPICULTURA E TECNOLOGIA DO SÊMEN
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 02
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................................. 05
2.1. A tilápia........................................................................................................................... 05
2.2. Histórico da tilapicultura nacional................................................................................... 07
2.3 Importância da qualidade seminal na produção de peixes ............................................. 09
2.4 Coleta de sêmen ............................................................................................................. 10
2.5 Parâmetros espermáticos ............................................................................................... 11
2.5.1 Volume seminal, concentração espermática e espermatócrito................................. 11
2.5.2 Motilidade espermática.............................................................................................. 12
2.5.2.1 Visualização e avaliação da motilidade ............................................................. 13
2.5.2.2 Tempo de motilidade ......................................................................................... 14
2.6 Fatores que afetam a qualidade seminal ........................................................................ 16
2.6.1 Indução hormonal e período de coleta ...................................................................... 17
2.6.2 Contaminação do sêmen........................................................................................... 18
2.6.3 Efeito da salinidade na qualidade seminal ................................................................ 20
2.7.Conservação do sêmen .................................................................................................. 21
2.7.1 Refrigeração .............................................................................................................. 21
2.7.2 Outras técnicas.......................................................................................................... 24
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................... 26
CAPÍTULO II: VARIAÇÃO TEMPORAL DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA DA TILÁPIA DO NILO
EM AMOSTRAS REFRIGERADAS E ATIVADAS
(“Brazilian Archives of Biology and Technology”, protocolo BD-1693)
ABSTRACT ........................................................................................................................... 39
INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 40
MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................................... 41
Experimento 1: Motilidade espermática do sêmen refrigerado........................................ 41
Experimento 2: Motilidade espermática do sêmen fresco ............................................... 42
Estatística......................................................................................................................... 42
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 42
Experimento 1 .................................................................................................................. 42
Experimento 2 .................................................................................................................. 45
CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 50
viii
AGRADECIMENTOS ............................................................................................................ 50
RESUMO............................................................................................................................... 50
REFERÊNCIAS..................................................................................................................... 51
ix
RESUMO
YASUI, GEORGE SHIGUEKI. M.Sc. Universidade Estadual do Norte Fluminense. Março/2007. Variação temporal da qualidade seminal de tilápia do Nilo em amostras refrigeradas e ativadas. Manuel Vazquez Vidal Júnior (orientador), Dalcio Ricardo de Andrade, José Frederico Straggiotti Silva e Eduardo Shimoda.
O presente trabalho objetiva avaliar parâmetros seminais de tilápia do Nilo, em amostras
refrigeradas e pós-ativadas. Primeiramente, amostras seminais foram mantidas a 4ºC em caixas
isotérmicas, tendo a motilidade mensurada a cada 30 minutos, por meio de Analisador
Espermático Computadorizado (CASA), até que as células se tornassem imóveis. Similarmente,
outra amostra seminal foi avaliada a cada 15 segundos após a ativação, para observar o
decréscimo da qualidade seminal. Em cada avaliação foram mensurados os seguintes parâmetros:
motilidade total e progressiva, freqüência de batimentos flagelares e percentual de células rápidas,
lentas e estáticas. Os resultados demonstram que amostras refrigeradas se mantém móveis até
10,59 horas, enquanto o sêmen ativado teve a motilidade prolongada até 300 segundos. Por outro
lado, a motilidade progressiva se manteve por apenas 9,1 horas para amostras refrigeradas e 90
segundos para amostras ativadas, o que enfatiza a otimização de amostras seminais antes dos
períodos mencionados.
x
ABSTRACT
YASUI, GEORGE SHIGUEKI. M.Sc. Universidade Estadual do Norte Fluminense. March/2007. Temporal variation of sperm motility of Nile tilapia in activated and stored samples. Manuel Vazquez Vidal Júnior (supervisor), Dalcio Ricardo de Andrade, José Frederico Straggiotti Silva and Eduardo Shimoda
The present study aims to evaluate seminal parameters of Nile tilapia, in stored and activated
samples. Firstly, seminal samples were maintained at 4oC in an ice-box, and the motility was
measured each 30 minutes by means of “Computer Assisted Sperm Analyzer” (CASA), until all
cells became immotile. Similarly, another sperm sample was evaluated each 15 seconds after
activation, to observe the decrease in sperm quality. In each evaluation it was measured the
following parameters: total and progressive motility, flagellar beating frequence, and percentage of
fast, slow and static cells. Results demonstrates that stored samples maintained motile until 10,59
hours, while activated sperm prolonged its motility until 300 seconds. On the other hand,
progressive motility maintained only for 9,1 hours for stored, and 90 seconds for post activated
sperm, what emphasizes the optimization of sperm samples before these mentioned periods.
Capítulo I:
Aspectos gerais da tilapicultura e tecnologia do sêmen de peixes
2
1. INTRODUÇÃO
A piscicultura é uma atividade econômica em fase de consolidação no Brasil,
sendo que, nos últimos anos, tem-se observado maior profissionalização deste setor
com reflexos sobre a diversidade e o preço dos produtos.
A redução do custo de produção em diversas empresas aqüícolas tem sido
decorrente da adoção de novas tecnologias, desenvolvidas principalmente nos países
onde a aqüicultura tem maior destaque. Entretanto, mesmo nestes países, o
desenvolvimento de diversos processos tecnológicos, ainda não está consolidado e,
portanto, as metodologias pertinentes não estão disponíveis aos produtores.
A cadeia produtiva do cultivo de tilápias, atividade também conhecida como
tilapicultura, se encontra entre as principais atividades do setor aqüícola no Brasil.
Entretanto, esta cadeia produtiva necessita do desenvolvimento de tecnologias para a
sua consolidação no aspecto quali-quantitativo, podendo assim se tornar competitiva
no mercado externo. O cultivo de tilápias ocupa atualmente a posição de principal
atividade de cultivo em ambientes aquáticos dulcícolas no mundo (POPMA e
3
LOVSHIN, 1994; FITZSIMMONS, 2000) e é uma atividade considerada estratégica,
pelo Ministério da Agricultura e do Abastecimento no Brasil.
No Brasil, a tilápia foi introduzida na década de 40, mas apenas após o
desenvolvimento das técnicas de inversão sexual, nos anos 80, e a introdução de
linhagens de maior potencial zootécnico, na década de 90, é que a atividade teve
maior impulso (KUBTIZA, 2000; ZIMMERMANN, 2000). Um dos indicativos do
processo de intensificação da tilapicultura é a procura por linhagens de alto
desempenho, tendo em vista a otimização do processo produtivo.
Nos últimos anos, diversas linhagens de tilápia foram introduzidas no país, entre
elas a linhagem vermelha da Flórida, na década de 90 (LOVSHIN, 2000), a linhagem
Thai-Chitralada, introduzida em meados de 1996, que é a principal linhagem cultivada
em todo o país e uma das mais utilizadas em todo o mundo (ZIMMERMANN, 2000;
LOVSHIN, 2000), e a linhagem “Supreme®”, introduzida recentemente e que se mostra
uma linhagem bastante promissora para a nossa região (KUBITZA, 2006).
A disseminação genética dessas linhagens geralmente é feita através da
aquisição de alevinos, os quais passam por um processo de engorda até atingirem a
maturidade sexual, quando então são utilizadas como matrizes. Esse procedimento é
bastante eficaz, no relativo ao custo com o transporte, em função do tamanho reduzido
dos animais.
Entretanto, por serem provenientes do mesmo lote, este procedimento
apresenta como inconveniente o cruzamento sucessivo entre as linhagens, bem como
o cruzamento entre membros consangüíneos, induzindo a uma rápida depreciação
genética por endogamia, já que poucos reprodutores são utilizados como estoque
fundador (HILSDORFF e SANTOS, 1999; CAROSFELD e HARVEY, 1999).
Diversos problemas ligados à endogamia já foram constatados quando as
tilápias foram disseminadas da África para outras partes do mundo, visto que poucos
reprodutores foram utilizados para a propagação genética (CAROSFELD & HARVEY,
1999).
Para que o potencial de cultivo de tilápias no país seja otimizado, devem ser
adotadas práticas que proporcionem melhorias no tocante à sua qualidade genética,
com redução dos custos de produção, para se tornarem cada vez mais competitivos
4
aos mercados consumidores externos e internos, o que implicará em um fortalecimento
da cadeia agroindustrial da tilápia.
Assim sendo, a tendência atual é que ocorra um processo de intensificação na
tilapicultura, incluindo biotécnicas que permitam a otimização do potencial produtivo.
Entre elas, destacam-se técnicas de criopreservação, androgênese, ginogênese,
clonagem e manipulação cromossômica, que são biotécnicas importantes para o
melhoramento genético. Nesses procedimentos, é de fundamental importância o
domínio da reprodução artificial e a avaliação da qualidade dos gametas, e, no caso
dos machos, o estudo de aspectos básicos da qualidade seminal ofereceria
informações importantes para a aplicação de muitas tecnologias. A disseminação
genética utilizando-se de sêmen apresenta vantagens em relação às fêmeas, como a
possibilidade de estocagem sob refrigeração ou congelamento, bem como a
possibilidade de utilizar amostras compostas (“pool”), o que tenderia a aumentar a
heterose.
Para o produtor de alevinos o desenvolvimento destas tecnologias permitiria
disponibilizar no mercado animais com elevado desempenho zootécnico, visto que a
aquisição freqüente de material genético comprovadamente de boa qualidade.
5
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A TILÁPIA
O nome genérico “tilápia” reúne um grande número de espécies de ciclídeos
africanos, provenientes da Bacia do rio Congo, Nilo, Níger e Senegal (NOAKES e
BALON, 1982).
Uma das características mais marcantes no tocante à etologia reprodutiva
dessas espécies é a proteção à prole, podendo ser classificados como peixes
guardadores e ativos (WOYRANOVICH e HORVATH, 1989; VAZOLLER, 1996). Todas
as espécies de tilápia costumam fazer uma escavação no substrato, para que nesse
local seja feita a desova, sendo conhecido popularmente como “ninhos”, e, após a
desova, os progenitores costumam protegê-la. Algumas espécies realizam a incubação
no próprio substrato, defendendo a desova contra possíveis predadores, ao passo que
outras espécies coletam os ovos na boca, aonde irão oxigená-los e protegê-los até a
fase de juvenis. Essas últimas são conhecidas como espécies de incubação oral
(TREWAWAS, 1982a e 1982b; NOAKES e BALON, 1982).
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Fundamentado nessas características reprodutivas e no hábito alimentar, as
espécies de tilápia podem ser classificadas em três principais gêneros (TREWAWAS,
1982a e 1982b; NOAKES e BALON, 1982).
O gênero Tilápia, composto por peixes de hábito alimentar onívoro, com
tendência à herbivoria, e incubam os ovos no substrato. Tanto o macho quanto a
fêmea participam da escavação do ninho e da proteção da prole. São exemplos desse
gênero a tilápia do Congo (T. rendalli), a Tilapia zilli e a tilápia zebra (T. buttikoferi).
O gênero Oreochromis, com peixes de hábito alimentar onívoro, sendo o macho
responsável pela escavação do “ninho” e a fêmea coleta os ovos na boca e realiza a
incubação oral. São exemplos desse gênero a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), a
tilápia de Zanzibar (Oreochromis hornorum) e a tilápia azul (Oreochromis aureus).
O gênero Sarotherodon, representado por tilápias que possuem o hábito
alimentar onívoro e tanto o macho quanto a fêmea ajudam na escavação do ninho e na
incubação oral. São exemplos de tilápias desse gênero a Sarotherodon gallilaeus e S.
melanotheus.
De acordo com YASUI et al. (2006), no Brasil, são encontradas apenas tilápias
do gênero Tilapia (T. rendalli e T. buttikoferi) e Oreochromis (O. niloticus, O. hornorum e
híbridos Oreochromis sp.), sendo que este último gênero possui maior relevância na
piscicultura.
São classificados como peixes r-estrategistas, iteróparos, apresentando alta
prolíficidade, baixa competição intra-específica, postura freqüente de ovos, altas taxas
de crescimento e maturação sexual precoce. Habitam ambientes lênticos, onde podem
desovar naturalmente durante todo o ano (desova múltipla) em temperaturas acima dos
21oC (POPMA e GREEN, 1990), visto que a maturação dos ovócitos ocorre em mais de
dois grupos (VAZZOLER, 1996). A tilápia do Nilo, principal espécie de tilápia cultivada
no país, é considerada uma espécie rústica, tolerando altas densidades de estocagem,
salinidade, variações da qualidade da água, além de apresentar bons índices
zootécnicos de crescimento, conversão alimentar, e também capacidade de filetagem,
gerando filés sem espinhos, excelente qualidade de carne e aceitação no mercado
(YASUI et al., 2006).
7
2.2 HISTÓRICO DA TILAPICULTURA NACIONAL
Os primeiros indícios da tilapicultura no Brasil datam de 1953, quando foram
introduzidos no país alguns exemplares de Tilapia rendalli, peixes de desova natural e
que poderiam reproduzir sem técnicas mais refinadas para obtenção de alevinos
(ANDRADE e YASUI, 2003). Estes animais foram trazidos para a região Nordeste para
povoamento de diversos reservatórios construídos nessa região para geração de
energia elétrica, e, a partir desse ponto, as tilápias foram se disseminando para outras
regiões do país. Contudo, essa espécie de tilápia possui um potencial zootécnico
bastante reduzido, que, associado às técnicas rudimentares utilizadas na época,
acabaram apresentando baixos índices de crescimento (ZIMMERMANN, 2000).
Em dezembro de 1971, foram trazidos pelo DNOCS (Departamento Nacional de
Obras Contra as Secas) vinte exemplares de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) e
vinte exemplares de tilápia de Zanzibar (Oreochromis hornorum), provenientes da
Costa do Marfim. O intuito era povoar açudes e atenuar a deficiência de alimentos na
região (LOVSHIN, 1976). Essas espécies apresentavam potencial de crescimento
bastante superior às anteriores. Por outro lado, o manejo inadequado e a falta de
utilização de populações monossexuais acabaram gerando índices zootécnicos muito
aquém do seu potencial, fato que foi agravado pela falta de controle dos cruzamentos
e ausência de rastreabilidade, ocorrendo uma disseminação exacerbada por todo o
país, bem como grande depreciação genética por endogamia (ZIMMERMANN, 2000).
Desse modo, as tilápias, por muitos anos, foram consideradas como verdadeiras
“pragas”, que causavam superpopulação de diversos ambientes aquáticos, reduzindo o
potencial de crescimento de outras espécies mais promissoras.
Paralelamente, em outras partes do mundo, as técnicas de obtenção de
populações monossexuais foram se desenvolvendo, e POPMA e GREEN (1990)
mostraram que a técnica de inversão sexual poderia ser perfeitamente utilizada em
ambientes contendo alimento autóctone (plâncton), o que possibilitava a aplicação
desta técnica em larga escala, obtendo, assim, populações monossexuais masculinas,
otimizando o potencial de engorda e contornando o entrave da superpopulação.
8
Paralelamente, outros trabalhos também foram se desenvolvendo com o intuito
de melhorar a qualidade genética das tilápias, e inúmeras linhagens e híbridos de alto
potencial zootécnico foram desenvolvidos.
Na década de 90, foi introduzida no país a linhagem vermelha da Flórida, que é
um híbrido de coloração clara (róseo ao vermelho) e bastante resistente à salinidade.
Essa linhagem apresenta bom desempenho zootécnico, bem como a aceitação no
mercado, em função da coloração chamativa, mas apresenta baixa fecundidade e
também altas mortalidades, principalmente em função da predação por pássaros
(LOVSHIN, 2000).
Em 1996, foram trazidos para o país, na região Sul, alguns exemplares de
tilápias do Nilo, da linhagem tailandesa, ou Thai-Chitralada, que apresentavam um
desempenho de crescimento superior às anteriormente encontradas no país
(ZIMMERMANN, 1999).
Essa linhagem é a mais utilizada no país atualmente, e, com o desenvolvimento
de algumas empresas de maior porte, as quais mantém a qualidade genética, e
associada à melhoria das técnicas de cultivo a tilapicultura passou a ser considerada
uma referência nacional na aqüicultura, chegando inclusive ao processo de
industrialização. Assim sendo, ao final da década de 90 e início da década seguinte, a
tilápia se tornou um dos poucos peixes de água doce no Brasil com produção intensiva
e com a cadeia produtiva mais consolidada, fatos estes que apenas aconteciam com a
truticultura, embora em menor escala.
Outra linhagem de tilápia foi introduzida, no ano de 2002, proveniente do
programa GIFT, conhecida como “Supreme Tilapia®”, e vem apresentando bom
desempenho de engorda, segundo relatos de diversos produtores, que encontraram,
inclusive, desempenho superior que o apresentado pela linhagem Thai-Chitralada
(Kubitza, 2006).
Atualmente, existem grandes criações de tilápias nos estados do Sul, Sudeste e
Nordeste, com um grande potencial produtivo, inclusive com vistas ao mercado
internacional (VINATEA, 1998; KUBITZA, 2000).
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2.3 IMPORTÂNCIA DA QUALIDADE SEMINAL NA PRODUÇÃO DE PEIXES
Um dos requisitos básicos para que ocorra a intensificação da produção de
peixes é a produção massal de juvenis destinados à engorda, que assim podem ser
cultivados até o peso de abate. Além de proporcionar sementes para a piscicultura, a
reprodução artificial apresenta certas vantagens, como a aplicação em técnicas de
melhoramento genético, manipulação cromossômica e criobiologia (ARAI, 2000;
YASUI e ANDRADE, 2003).
Diante desta realidade, foram desenvolvidos diversos protocolos de reprodução
induzida (YASUI e ANDRADE, 2003; DONALDSON, 1996), para possibilitar a
obtenção de alevinos em peixes reofílicos (peixes de piracema), visto que este grupo
não atinge o grau de maturação gonadal final em ambientes lênticos.
Dentre esses protocolos, tem-se observado maior interesse no manejo
reprodutivo de fêmeas, visto que o sistema endócrino-fisiológico é mais complexo, e os
gametas são obtidos, na maioria das espécies, exclusivamente mediante indução
reprodutiva (hormonal). Antagonicamente, nos machos, a produção espermática
envolve um processo mais simples, onde não há incorporação de vitelo aos gametas,
dispensando uma série de etapas bioquímicas complexas envolvendo hormônios e
outras substâncias como enzimas. Por esta razão, em machos, a obtenção de
gametas viáveis é mais comum, mesmo omitindo-se a indução reprodutiva. Entretanto,
utilizam-se os indutores com o intuito de potencializar a produção espermática,
obtendo-se, na maioria dos casos, sêmen em quantidade e qualidade suficiente para a
desova.
No tocante ao manejo reprodutivo, é prática rotineira a utilização de excesso de
sêmen para fecundar os ovócitos, muitas vezes empregando-se amostras seminais de
vários machos para fertilização, visando superestimar a relação
espermatozóide/ovócito e assim garantir a fertilização (WOYRANOVICH e HORVATH,
1989).
Todavia, ao passo que ocorre a intensificação dos sistemas de produção, torna-
se cada vez mais relevante a contenção dos custos de produção, aliada a otimização
do processo produtivo. Esses aspectos fazem com que os gastos referentes ao plantel
de matrizes sejam reduzidos, otimizando-se então a eficácia reprodutiva de cada
10
indivíduo. Além destes fatos, com os avanços do melhoramento genético na
piscicultura, a tendência é que se utilize linhagens de alta performance e sêmen
criopreservado, e sejam implementadas as técnicas de rastreabilidade, o que pode
exigir uma utilização mais controlada e racional de sêmen.
2.4 COLETA DE SÊMEN
Geralmente, a coleta de sêmen é realizada mediante massagem abdominal
(extrusão), em sentido crânio-caudal. Antes de iniciar o processo, deve ser feita uma
compressão na região próxima à papila genital, para que seja eliminado o excesso de
urina e fezes, que podem contaminar o sêmen, e então secar a região com pano ou
papel absorvente. No manejo reprodutivo de rotina (grande escala), o sêmen de dois
ou mais machos costuma ser extrusado diretamente sobre os ovos, contidos em um
recipiente plástico. Esse procedimento visa garantir a qualidade seminal e aumentar a
variabilidade genética dos descendentes. Contudo, recomenda-se a verificação da
qualidade seminal antes de sua utilização, visto que mediante esta análise podem ser
detectadas características que comprometem a qualidade seminal, como a baixa
motilidade, bem como outros aspectos negativos como a azoospermia (ausência de
espermatozóides), podendo, inclusive, se apresentar como uma característica
hereditária (SHIMODA, 1999).
Em algumas espécies em que a liberação do sêmen é difícil de ser obtida por
compressão (ex. Clarias gariepinus, Silurus glanis), ou mesmo liberada em pequena
quantidade (ex. Leporinus sp, espécies de pequeno porte), a coleta de sêmen é
realizada mediante o sacrifício dos animais, sucedido de coleta de sêmen testicular
(LINHART et al., 1987; DeGRAAF e JANSSEN, 1996; RIBEIRO e GODINHO, 2003).
Para a coleta, diversos recipientes podem ser utilizados, como tubos tipo
“falcon”, placas de Petri, seringas, ou mesmo tubos para hematócrito, no caso de
espécies de pequeno porte. Porém, recipientes graduados ou seringas costumam
proporcionar maior praticidade para se avaliar o volume no momento da coleta
(GODINHO et al., 2003).
11
As amostras então obtidas são observadas imediatamente ao microscópio para
verificar a motilidade espermática, e, caso seja detectada, as amostras geralmente são
eliminadas.
2.5 PARÂMETROS ESPERMÁTICOS
2.5.1 Volume seminal, concentração espermática e espermatócrito
O volume de sêmen coletado é um parâmetro quantitativo de extrema
importância, pois pequenas quantidades de sêmen podem inviabilizar a fertilização e a
realização de diversas análises espermáticas. Algumas espécies são caracterizadas
por produzirem baixo volume de sêmen, como é o caso do piau-açu (Leporinus
macrocephalus), dos lambaris (Astyanax sp.) e do bagre africano (Clarias gariepinus).
(DeGRAAF e HANSSEN, 1996; RIBEIRO e GODINHO, 2003; YASUI e ANDRADE,
2003). RIBEIRO e GODINHO (2003) encontraram valores de 0,4 ± 0,2mL em piau-açu
de 446,7 ± 165,1g de peso corporal, e VIVEIROS et al. (2003), trabalhando com
Clarias gariepinus induzidos por oxitocina, encontraram valores de 1,0 ± 0,8mL.
Outras espécies, porém, produzem sêmen em grande quantidade, como é o
caso do pacu (Piaractus mesopotamicus), do jundiá (Rhamdia quelen) e das carpas
chinesas. Em algumas ocasiões, em função dessa grande produção seminal, a
indução hormonal, que tende a incentivar a espermiação, é descartada, e poucos
machos podem ser utilizados para fecundar um grande número de ovócitos. SHIMODA
(1999) encontrou valores de 5,4 ± 2,43mL em pacus, ao passo que BELOVA (1981)
encontrou volume de 1 a 9mL em carpa-capim (Ctenopharyngodon idella). CRUZ-
CASALLAS et al. (2005) obtiveram valores de volume seminal de 1,8 ± 1,2 em Brycon
siebenthalae. Conforme pode ser observado nos dados apresentados, esta
característica possui uma grande variação individual, o que pode ser confirmado pelos
altos valores de desvio-padrão.
Variáveis como período de coleta, número e freqüência de coletas, também
influenciam os valores de volume seminal, sendo estas características espécie-
específica (GJERD, 1984; SUQUET et al., 1992 e 1994).
12
A concentração ou densidade espermática é um parâmetro quantitativo que
relaciona o número de espermatozóides em função do volume seminal. A
concentração de espermatozóides em peixes costuma ser elevada quando comparada
com mamíferos, chegando à ordem de bilhões de espermatozóides/mL (CHAO et al.,
1987; BILLARD et al., 1995; CRUZ-CASALAS et al., 2005).
SHIMODA et al. (1999) encontraram concentrações de 37,4 ± 8,05 x 109
espermatozóides/mL em Piaractus mesopotamicus. Em truta arco-íris, GLOGOWSKI et
al. (2000) encontraram concentrações espermáticas de 10,39 ± 2,13 x 109
espermatozóides/mL. Na mesma espécie, KAVAMOTO et al. (1985) encontraram
concentrações de 15,07 a 20,99 x 109 espermatozóides/mL. Além da variação inter-
específica da concentração espermática, ocorre também uma grande variação intra-
específica, já que este parâmetro pode variar em função com o peso e a idade do
animal, época de coleta, tratamento hormonal e porção do ejaculado (GJERD, 1984;
SUQUET et al., 1992 e 1994; CACOT, 2003; VIVEIROS, 2003).
Entre as espécies de peixes teleósteos estudadas, parece haver tendência a
uma relação inversamente proporcional entre o volume seminal e a concentração
espermática (CACOT et al., 2003; MYLONAS e ZOHAR, 2001).
Para a mensuração deste parâmetro, diversas técnicas podem ser utilizadas,
como a câmara de Mackler (TAITSON e GODINHO, 2003), hemocitômetro,
espectrofotometria, citometria de fluxo (HANSEN et al., 2002; CHRISTENSEN et al.,
2004) e, indiretamente, o espermatócrito e a concentração de DNA (FENTON et al.,
1990).
2.5.2 Motilidade espermática
Um dos principais parâmetros que caracterizam a qualidade do sêmen é a
motilidade espermática, sendo um dos aspectos qualitativos de maior relevância. Os
espermatozóides de peixes são estáticos no testículo e no trato genital, em função de
diversas características encontradas no plasma seminal, tais como a osmolaridade,
pH, e concentração de íons de sódio, potássio e cálcio (PADHI e MANDAL, 2000;
ALAVI et al., 2004). A definição mais genérica, conforme adotada por COSSON
(2004), é que os espermatozóides são ativados quando entram em contato com o meio
13
circundante. No caso da tilápia do Nilo, além dos fatores supracitados, existem
também glicoproteínas de alto peso molecular, presentes no plasma seminal, e que
atuam como agente imobilizante (MOCHIDA et al., 1999). Alterações nesses
parâmetros podem iniciar a motilidade espermática, sendo que em peixes de água
doce, a redução da osmolaridade tende a iniciar a motilidade, já em peixes marinhos
ocorre o inverso, uma vez que o ambiente é hiper osmótico em relação ao plasma
seminal (BILLARD, 1978; BENAU, 1980; MORISAWA et al., 1983; MIURA et al., 1992;
BILLARD et al., 1995).
Conforme observado por CHAO et al. (1987), a concentração de cálcio no meio
externo também é um fator crucial na iniciação da motilidade, visto que influencia no
potencial de membrana, que pode então iniciar a motilidade, mesmo que a
osmolaridade no meio externo seja inadequada para a ativação espermática.
2.5.2.1 Visualização e avaliação da motilidade
A visualização de espermatozóides móveis é realizada colocando-se a amostra
em uma lâmina, previamente focalizada em um microscópio óptico, com aumento de
40x, e adicionando quantidade de solução ativadora suficiente para atingir todos os
espermatozóides. Segundo BILLARD e COSSON (1992) as amostras devem ser
ativadas utilizando sêmen diluído, já que a ativação dos espermatozóides é mais
homogênea. Amostras de sêmen fresco, quando ativadas, podem levar a erros
experimentais como a superestimação do tempo de motilidade e do percentual de
células móveis devido à viscosidade do sêmen.
Diante desse fato, os autores recomendam que a avaliação da motilidade seja
realizada mediante a diluição em duas etapas. A primeira, utilizando-se uma solução
diluidora, com osmolaridade alta (no caso de peixes dulcícolas), para que os
espermatozóides não sejam ativados. A segunda, feita com uma solução ativadora,
que no caso de peixes de água doce é realizada com água destilada ou solução de
bicarbonato de sódio.
No que concerne ao aspecto qualitativo do sêmen, diversas técnicas podem ser
empregadas para se avaliar a motilidade espermática. O método mais simples é a
avaliação subjetiva, que consiste em observar o número de células móveis e estáticas.
14
Devido à subjetividade do método e conseqüente erros na avaliação das amostras,
costuma-se estimar a motilidade em percentual, e classificando em quatro grupos:
grupo 1, que denomina motilidade entre 0 (zero) e 2 5 %; grupo 2, para motilidade
variando entre 25 e 50 %; grupo 3, variando de 50 a 75%e grupo 4, variando de 75 a
100%de motilidade (VIVEIROS et al., 2003).
Considerando o curto tempo de motilidade em peixes e a subjetividade do
método, a tendência é que este procedimento seja substituído por metodologias mais
precisas, entretanto, esta é a técnica mais amplamente empregada atualmente em
função de sua simplicidade e do baixo custo.
Outro método, proposto por TRIPPEL e NEILSON, (1992), e posteriormente
validado por IWAMATSU et al. (1993), consiste em avaliar a motilidade através de
imagens de vídeo, obtidas por uma câmera acoplada ao microscópio, e apresenta a
vantagem de se avaliar a motilidade posteriormente, analisando parâmetros como a
progressividade e tempo de motilidade com maior precisão. Outra vantagem do
método é a possibilidade de se utilizar mais de um avaliador para analisar a mesma
amostra.
Este tipo de avaliação apresenta, obviamente, inúmeras vantagens em relação
ao método anterior, entretanto requer equipamentos de maior custo para que a
utilização seja viável (KIME et al., 2001).
O Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA) é atualmente o método mais
preciso para a avaliação dos parâmetros espermáticos e consiste de um software que
capta imagens de amostras seminais analisando diversas características seminais
como percentual de motilidade, movimentos progressivos e movimentos curvilineares,
e vem sendo empregado com mais freqüência nos últimos anos (KIME et al., 2001;
RAVINDER et al., 1997). A principal vantagem é a precisão e a redução da
subjetividade na avaliação, sendo um método limitado em função do custo.
2.5.2.2 Tempo de motilidade
O tempo da motilidade espermática é variável, com tendência espécie-
específica. Em geral, a motilidade em peixes marinhos é maior em relação aos peixes
dulcícolas (SUQUET et al., 2000; DREANNO et al., 1997).
15
Em E. frenatus, a motilidade fica em torno de 30 segundos (VIDAL JR. et al.,
2002), ao passo que em Clarias gariepinus o valor varia de 30 a 40 segundos
(MANSOUR et al., 2002). FRANCISCATTO et al. (2002) observaram um tempo de
motilidade de 96s para Prochilodus lineatus, tempo este superior ao encontrado em
Brycon siebenthalae (41± 7s; CRUZ-CASALLAS et al., 2005).
AMORIM (2002), trabalhando com tilápias do Nilo, linhagem Thai-Chitralada,
encontrou tempos de motilidade variando de 9 ± 22 a 261 ± 91,8 segundos, em
diferentes crioprotetores.
Dentre as variáveis que podem afetar o tempo de motilidade está a solução
utilizada para a ativação dos espermatozóides. Na maioria das pisciculturas
comerciais, a própria água que abastece os laboratórios de reprodução é utilizada para
a ativação espermática. Contudo, conforme observado por MORISAWA et al. (1983), a
utilização de soluções com maior osmolaridade tende a otimizar a motilidade
espermática e sua duração, visto que a diferença em osmolaridade do plasma seminal
e da solução ativadora pode causar injúrias nas células. LAHNSTEINER et al., (2000)
utilizando soluções de NaCl 25 e 50mM observaram maior tempo de motilidade em
comparação à água destilada, sendo que nesta última observaram os piores
resultados. AMORIM (2002) não observou diferença significativa entre água destilada,
bicarbonato de sódio 119mM ou NaCl 25mM para tilápia do Nilo, no tocante à
motilidade total e o tempo de motilidade. LINHART et al. (2005) utilizaram uma solução
ativadora composta por 17mM NaCl e 5mM Tris-HCl para bagre europeu, Silurus
glanis, ao passo que STOSS e HOLTZ (1981) e YAO et al. (2000) observaram
melhores resultados utilizando solução de NaHCO3 a 1%.
16
Tabela 1. Principais soluções ativadoras da motilidade espermática em algumas espécies de peixes teleósteos
Espécie Solução ativadora Referência
Urechis unicintus* Água marinha artificial (ASW) 70-100% KANG et al. (2004a)
Thamnaconus
septentrionalis* Água marinha artificial (ASW) KANG et al. (2004b)
Acipenser sturio 5,3mM NaCl; 3.1 Tris-HCl; 58,3mM sacarose KOPEIKA et al. (1999)
Acipenser rutheneus 20mM NaCl; 2mM CaCl2; 10mM Tris-HCl JAHNICHEN et al. (1999)
Acipenser baerii 50mM Tris-HCl TSVETKOVA et al. (1996)
Pangasius bocourti 34mM NaCl CACOT et al. (2003)
Macrozoarces
americanus NaHCO3 119mM YAO et al. (2000)
Salmo gairdneri NaHCO3 119mM STOSS e HOLTZ (1981)
Oreochromis niloticus dH2O, NaHCO3 119mM, NaCl 25mM GODINHO et al. (2003)
Silurus glanis 17mM NaCl; 5mM Tris-HCl LINHART et al., 2005
*Espécies de água salgada
Visto que a motilidade espermática possui baixa durabilidade e é um parâmetro
quantitativo diretamente proporcional à sua capacidade fecundante, a coleta de sêmen
deve ser feita tendo em vista otimizar essa característica, e a sua ativação deve ser
realizada apenas quando estiver próximo dos gametas femininos (ovócitos) (BILLARD
et al., 1995).
2.6 FATORES QUE AFETAM A QUALIDADE SEMINAL
Apesar de diversos fatores diretos e indiretos afetarem a qualidade seminal, tais
como as condições fisiológicas em função do estado nutricional dos reprodutores,
doenças, idade, estresse, da qualidade da água e de outros agentes externos, os
tópicos seguintes procurarão abordar as características que afetam diretamente a
qualidade seminal, partindo de um pressuposto da sanidade física dos reprodutores.
Entretanto, informações referentes a esses assuntos podem ser encontrados em
RURANGWA et al., (2004).
17
2.6.1 Indução hormonal e período de coleta
De acordo com ANDRADE e YASUI (2003), diversos indutores reprodutivos
podem ser utilizados para a maturação final das gônadas, tais como macerado de
hipófise desidratada de carpa, gonadotropina coriônica humana, hormônios liberadores
de gonadotropinas, entre diversos outros. Em peixes, o uso de indutores é bastante
difundido para a maturação gonadal final, principalmente em fêmeas de espécies
reofílicas, visto que a maturação final dos ovócitos não acontece em ambientes
lênticos (HORVATH e WOYRANIVICH, 1989).
MIRANDA et al. (2005) verificaram incremento no volume seminal em
Odontesthes bonariensis, ao comparar diversos indutores reprodutivos. Utilizando-se
hCG, o incremento em volume foi de 16,7 vezes em relação ao controle, resultado
superior aos demais indutores utilizados, como a hipófise desidratada de carpa
(13,5X); hipófise de salmão (12,8X); GnRHa de salmão (16,7X) e GnRHa de
mamíferos (10,8X).
Em espécies como o bagre africano (Clarias gariepinus), a indução de machos
não provocou diferença significativa no volume seminal (YASUI et al., 2003),
possivelmente em função do indutor utilizado (hipófise de carpa), já que existem outros
indutores que são mais eficientes para essa espécie (VIVEIROS et a., 2003).
AMORIM (2002), utilizando diferentes indutores em machos de tilápia do Nilo,
não encontrou diferença significativa entre aspectos quantitativos e qualitativos do
sêmen, mostrando que a indução reprodutiva pode ser omitida.
LIM et al. (2004) observaram que o uso de implantes de GnRHa incrementaram
significativamente o volume seminal em linguados (Rhombosolea tapirina). Utilizando
técnicas similares de implantes, MYLONAS e ZOHAR (2001) observaram incremento
na produção espermática em peixes do gênero Morone com um máximo de 15mL/kg
após 2 dias, ao passo que no controle os valores oscilaram entre 2 a 3mL/kg.
Em Pangasius bocourti, a aplicação de hCG (2000 UI/kg) e sucedidas 12 horas
após a aplicação, observou-se um incremento de 13 vezes o volume seminal (CACOT
et al., 2003). Os mesmo autores observaram que o uso de GnRH associado à
domperidona induziu uma menor produção espermática.
18
GJERD (1984) observou em salmão do Atlântico e truta arco-íris, uma produção
seminal em intervalo semanais e obteve um volume final de 136,7 ± 59,2mL para
salmão do Atlântico e 22,9 ± 14,5mL para trutas. Em ambos os casos, houve um
decréscimo na produção com o decorrer do tempo.
No referente ao período de coleta, CHRIST et al. (1996) observaram que
parâmetros seminais como a concentração e volume apresentaram variação sazonal,
ao passo que a osmolaridade do plasma seminal e qualidade dos movimentos
espermáticos, tais como a linearidade, pouco foram afetados. Em geral, a qualidade
espermática é incrementada nas estações reprodutivas, acompanhada pelo
desenvolvimento gonadal.
2.6.2 Contaminação do sêmen
Um dos grandes entraves para a coleta de sêmen de qualidade é a
contaminação, que ocorre principalmente no momento da extrusão. Conforme citado
anteriormente, a eliminação de fezes e urina realizada com uma leve compressão na
região peritoneal reduzem os riscos de contaminação, entretanto, em muitas espécies,
observa-se a eliminação do sêmen juntamente com urina, pois ambos são eliminados
por um único poro uro-genital. Nessas espécies, freqüentemente amostras de sêmen
podem apresentar contaminações com urina (SHIMODA, 2004; COSSON, 2004).
É constatado que peixes de água doce são hiper-osmóticos em relação à água
doce e a eliminação de urina é um dos principais mecanismos de osmo-regulação,
compensando a entrada passiva de água. Em tilápia do Nilo, cultivada em ambientes
dulcícolas, observa-se grande produção de urina, dificultando, inclusive, a coleta de
sêmen.
A urina em algumas espécies de peixe possui baixa osmolaridade e acaba
ativando a motilidade espermática, devido à sua baixa concentração osmótica
(PERCHEC-POUPARD et al., 1998; DREANNO et al., 1998). Além disso, parte das
reservas de ATP intracelular pode ser utilizada (PERCHEC-POUPARD et al., 1998), o
que pode resultar em menor sobrevivência de espermatozóides após o processo de
criopreservação (OGIER DE BAULNY, 1997). Os efeitos negativos da contaminação
19
por urina em amostras seminais também são constatados no bagre europeu, Silurus
glanis (BILLARD et al., 1997; LINHART et al., 1987 e 2004a).
Devido aos inconvenientes supra citados, diversas metodologias têm sido
adotadas com o intuito de evitar ou contornar a contaminação do sêmen com urina,
incluindo a técnica de coleta de sêmen com o auxílio de cateteres (GLOGOWSKI et al.,
2000), que são inseridos diretamente no lúmen testicular, como é o caso de
salmonídeos. Entretanto, essa técnica nem sempre é factível visto que em peixes a
morfologia da papila nem sempre é compatível para a inserção de cateteres. No caso
de linguado, é possível a inserção de um cateter para a na uretra e eliminar a parte da
urina presente na bexiga (DREANNO et al., 1998; PERCHEC-POUPARD et al., 1998).
Esta técnica, porém, geralmente aumenta o nível de estresse do animal, além de
causar irritação nas áreas cateterizadas.
Outra técnica mais drástica de obter sêmen isento de contaminação é a coleta
de sêmen testicular precedida do sacrifício dos animais (GRAFF e JANSSEN, 1996;
KOPEIKA et al., 2003; RIBEIRO e GODINHO, 2003). Esta técnica é mais utilizada em
peixes que apresentam testículo de pequeno tamanho (índice gonadossomático < 1%;
ex. Clarias gariepinus; Silurus glanis), ou em peixes de tamanho reduzido, em que a
extrusão para a coleta de sêmen se torna difícil de ser realizada (ex. espécies
ornamentais).
Em tilápias, o poro uro-genital de tamanho reduzido impossibilita a introdução de
cateteres, e, no momento da extrusão, observa-se grande presença de urina. Para
contornar esse inconveniente, HARVEY (1983) realizou a extrusão de machos de
tilápia do Nilo em um recipiente contendo uma solução de alta osmolaridade. Apesar
da re-imobilização dos espermatozóides ser uma técnica factível, ocorre um
decréscimo da quantidade de ATP intracelular (COSSON, 2004). Outro inconveniente
seria a presença da urina juntamente com a amostra de sêmen, o que tenderia a
aumentar o volume (reduzindo a concentração de espermatozóides) e a deteriorar a
qualidade da amostra.
20
2.6.3 Efeito da salinidade na qualidade seminal
Peixes eurialinos cultivados em águas salinas foram estudados por diversos
autores. LABBE e MAISSE (2001), trabalhando com truta marrom (Salmo trutta f.
fario), compararam a qualidade seminal em animais mantidos em água doce e
salgada, observando que a motilidade espermática foi inferior (55 ± 29%) e mais
variável quando comparada com o grupo mantido em água doce (89 ± 7%), entretanto
não encontrou diferenças na composição celular. Não houve também diferença no
processo de criopreservação e os autores concluíram que a salinidade não é um fator
determinante da qualidade espermática.
Em tilápias, LINHART et al. (1999) observaram um acréscimo na concentração
espermática, inversamente proporcional ao volume.
LANDERGREN e VALLIN (1998), realizaram a fertilização e incubação em
diferentes salinidades, observando melhores resultados em salinidades de 0 e 2‰.
LEE et al. (1992), fazendo induções em tainhas (Mugil cephalus) em águas
salgada e salobra, observaram melhores resultados em água salgada (32 - 34‰).
Observaram também que a motilidade não era iniciada em salinidades menores que
13‰ e os melhores resultados foram encontrados em salinidades maiores que 17‰.
HADDY e PANKHURST (2000) trabalhando com Acanthopagrus butcheriem sob
diferentes salinidades observaram que a motilidade espermática era nula em
salinidade 5‰. A 20‰, a motilidade iniciava imediatamente, chegando a mais de 5
minutos. A 35‰, a motilidade iniciava-se rapidamente, entretanto, houve uma queda
brusca de motilidade após 2 minutos. Esses dados indicam que o ponto ótimo de
salinidade gira em torno de 20‰, pois nessa salinidade a taxa de fecundação também
foi otimizada.
21
2.7 CONSERVAÇÃO DO SÊMEN
2.7.1 Refrigeração
O sêmen de peixes pode ser conservado em diversas maneiras, incluindo a
simples refrigeração, a liofilização e criopreservação.
A refrigeração é o processo mais simples e pode ser realizada com a simples
coleta do sêmen e posterior estocagem no refrigerador, ou caixa isotérmica contendo
gelo, mantendo-se a temperatura em torno de 0 a 4ºC. O sêmen coletado pode ser
estocado puro, sem diluição, ou então diluído, utilizando-se solução diluidora ou
“extender”. A diluição aumenta a disponibilidade de oxigênio para as células e também
reduz a concentração de proteínas do plasma seminal que podem degenerar com o
tempo, comprometendo a qualidade seminal (BILLARD e COSSON, 1992; PADHI e
MANDAL, 2000).
Existem várias soluções diluidoras, compostas basicamente por sais e tampões,
conforme pode ser observado na tabela 2. Essa solução diluidora também costuma ser
utilizada como solução imobilizadora para atenuar os efeitos da contaminação por
urina, podendo, inclusive, reimobilizar os espermatozóides natantes devido ao
aumento da osmolaridade (LINHART et al., 2005; BILLARD e ZHANG, 2001).
22
Tabela 2. Principais soluções diluidoras (extender) utilizadas em peixes teleósteos
Solução diluidora Componentes Espécie utilizada Referência
NaCl NaCl 1,2% Brycon insignis SHIMODA (2004)
trealose Trehalose Cyprinus carpio WARNECKE e PLUTA (2003)
Solução de Ringer modificada
7,5g NaCl 0,2g KCl 0,2g MgCl2 0,4g CaCl2
Misgurnus anguillicaudatus*
ARAI et al. (1993)
Solução imobilizadora para Silurus Glanis
200mM NaCl; 30mM Tris-HCl Silurus glanis LINHART et al. (2005)
Solução diluidora de Kurokura
128,4mM NaCl 2,7mM KCl 1,4mM CaCl2 2,4mM NaHCO3
Cyprinus carpio Tinca tinca Ctenopharyngodon idella
KUROKURA et al. (1984); WARNECKE e PLUTA, (2003)
350mM glicose 30mMTris 300mM sacarose 30mMTris 350mM frutose 30mMTris
Soluções diluidoras à base de sais e açúcares
200mM KCl 30mMTris
Cyprinus carpio HORVATH et al. (2003)
Solução diluidora para ciprinídeos
75mM NaCl 70mM KCl 2mM CaCl2 1mM MgSO4 20mM Tris-base 0,5% glicina
Barbus barbus Chondrostoma nasus Ctenopharyngodon idella Cyprinus carpio Hypophtalmichtys molitrix Leuciscus cephalus Rutilus meidingerii Vimba vimba
LAHNSTEINER et al. (2000)
Associado à solução diluidora, pode-se também utilizar aditivos que ajudam a
manter a integridade das células, como oxigênio (MAGYARY et al., 1996, BENCIC et
al., 2000), antibióticos (MANSOUR et al., 2004; BILLARD et al., 2004), e substratos
energéticos (OGIER DE BAULNY et al., 1999).
23
Tabela 3. Alguns protocolos de estocagem de sêmen à curto prazo, sob refrigeração.
Espécie Solução diluidora Tempo de
estocagem Referência
Clarias gariepinus
150mM NaCl; 2,5mM KCl; 1mM
CaCl2; 1mM MgSO4; Tris (pH 8,5)
e 0,5% BSA ou gema de ovo.
>4 dias MANSOUR et al. (2004)
Scophthalmus
maximus
74mM NaCl; 27mM KCl; 1,6mM
NaHCO3; 1,8mM CaCl2 >2 dias CHEREGUINI et al. (1997)
Gadus morhua e M.
aglefinus
Sol. Mounib modif. (1% KHCO3;
0,2% glutationa; 4,27% sucrose) 40 dias DEGRAF e BERLINSKY (2004)
Tilápias Sem diluição 5 dias CHAO et al. (1987)
Urechis unicintus Sem diluição 6 dias KANG et al. (2004ª)
Polyodon spathula 150mM NaCl; 5000 U.I. penicilina;
5 mg/mL streptomicina 56 dias BROWN and MIMS (1995)
P. spathula 100m glicose; 20mM Tris 72h LINHART et al. (1995)
S. platorhynchus 150mM glucose; 20mM Tris 72h LINHART et al. (1995)
Anguilla japonica 1,3mM CaCl2; 139,5mM NaCl;
1,6mM MgCl2; 25mM KCl 28 dias OHTA e IZAWA (1996)
Prochilodus lineatus Sem diluição 20h (30% motilidade) MARQUES e GODINHO (2004)
Leporinus friderici Sem diluição 7h (30% motilidade) MARQUES e GODINHO (2004)
Além dos fatores externos, como a temperatura e a composição da solução
diluidora, o tempo de estocagem varia de acordo com a espécie. Em piabanha, o
tempo de estocagem do sêmen não diluído e conservado em gelo foi de 7,42h, valor
semelhante ao observado por MARQUES e GODINHO (2004) para espécies do
gênero Leporinus. Em Melanogrammus aeglefinus e Gadus morhua, observou-se
motilidade até 20 dias e uma diluição de 1:3 incrementou essa característica para até
40 dias (DeGRAF and Berlisky, 2004). Utilizando-se antibióticos e refrigeração,
BROWN e MIMS (1995) observaram motilidade espermática em “paddlefish” por até
56 dias.
Ainda no tocante à refrigeração, KOTEESWARAN e PANDIAN (2002)
mantiveram sêmen “post-mortem” de Heteropneustes fossilis sob refrigeração (-20ºC)
por até 240 dias, sendo o peixe sacrificado e diretamente conservado em “freezer”,
apresentando, inclusive, motilidade e capacidade fecundante. Resultados semelhantes
foram encontrados em outras espécies tais como Labeo rohita (ROUTRAY et al.,
24
2006), Hemigrammus caudovitattus (DAVID e PANDIAN, 2006), e Puntius conchonius
(KIRANKUMAR e PANDIAN, 2004).
2.7.2 Outras técnicas
A técnica mais difundida para a preservação seminal é a criopreservação em
nitrogênio líquido, visto que apresenta inúmeras vantagens, entre elas a possibilidade
de conservação por tempos mais prolongados, com baixo ou nulo decréscimo em
qualidade ao longo do tempo, o que constitui assim um eficiente meio para a
conservação “ex-situ” de gametas, servindo tanto para a conservação do germoplasma
como para a reprodução de rotina. Aliada à técnica de androgênese, o sêmen
criopreservado pode também articular a reposição de espécies ameaçadas de extinção
ou mesmo extintas, visto que essa técnica apresenta uma herança 100% paternal
(ARAI, 2000 e 2001; BABIAK et al., 2002).
Diante desta realidade, foram desenvolvidos protocolos de criopreservação para
mais de 200 espécies de peixes (BILLARD e ZHANG, 2001), sendo a maioria de
espécies dulcícolas. No caso de tilápias, apesar de ser uma das espécies mais
difundidas no cenário aquacultural, existem poucos estudos no tocante à
criopreservação (HARVEY e KELLEY, 1988; RANA e McANDREW, 1989; GODINHO
et al., 2003).
Embora a maioria dos protocolos de criopreservação de gametas envolva a
coleta por extrusão sucedida da criopreservação, alguns trabalhos abordam a
criopreservação de gônadas inteiras, que, inclusive, podem ser transplantadas para
outros indivíduos (NAGLER et al., 2001; CLOUD , 2003a; 2003b). Entretanto, de
acordo com os mesmo autores, esse tipo de transplante deve ser realizado em
linhagens isogênicas, visto que ocorrem problemas associados à histo-compatibilidade.
Outra técnica importante é a liofilização de sêmen ou “freeze-drying”. Esta
técnica consiste em desidratar as células espermáticas sob baixas temperaturas, e,
após a desidratação, as células podem ser conservadas sob temperatura ambiente,
preferencialmente sob vácuo. A desvantagem é que após a reidratação os
espermatozóides perdem a motilidade, visto que no processo de desidratação
estruturas frágeis como o axonema são danificados, exigindo então uma injeção de
25
esperma intra-citoplasmática (ICSI – intra-cytoplasmatic sperm injection). Esta técnica
apresenta baixa eficácia até o momento, em peixes, sendo realizada em poucas
espécies, como a tilápia (POLEO et al., 2005) e o “zebrafish” (POLEO et al., 2001).
26
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALAVI, S.M.H.; COSSON, J.; KARAMI, M.; AMIRI, B.M.; AKHOUNDZADEH, M.A. (2004) Spermatozoa motility in the Persian sturgeon, Acipenser persicus: Effects of pH, dilution rate, ions and osmolality. Reproduction, 128: 819-828
AMORIM, V.M.C. (2002) Criopreservação do sêmen de tilápia nilótica (Oreochromis niloticus), variedade chitralada. Belo Horizonte-MG. Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais-PUC-MG, 64p. (Dissertação-Mestrado em Zoologia)
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38
Capítulo II:
Temporal variation of sperm motility in activated and stored sperm of
Nile tilapia
(Variação temporal da motilidade espermática da tilápia do Nilo em amostras refrigeradas e ativadas)
Submetida em língua inglesa à revista “Brazilian Archives of Biology and Technology”,
ISSN: 1516-8913, protocolo BD-1693.
39
Variação temporal da motilidade espermática da tilápia do
Nilo em amostras seminais refrigeradas e ativadas
George Shigueki Yasui (1,3), Manuel Vazquez Vidal Jr. (1), Dalcio Ricardo de Andrade(1),
Eduardo Shimoda (2) and José Frederico Stragiotti Silva (1)
1 Universidade Estadual do Norte Fluminense – Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias - Laboratório de
Zootecnia e Nutrição Animal - Avenida Alberto Lamego 2.000 – Parque Califórnia – Campos dos Goytacazes - RJ.
CEP: 28.015-130 2 Faculdade de Castelo– ES - Rua Luiz Ceotto, 57 - Centro - Castelo – ES – CEP 29360-000 –
Castelo – ES
ABSTRACT
The present study aims to evaluate the sperm motility of Nile tilapia, in fresh and stored samples.
Firstly, seminal samples were maintained at 4oC, and the motility was measured each 30 minutes
throughout “Computer Assisted Sperm Analyzer” (CASA), until all cells became immotile.
Similarly, another sperm sample was evaluated each 15 seconds after activation, to observe the
decrease in sperm quality. In each evaluation it was measured the following parameters: total
and progressive motility, flagellar beating frequence, and percentage of fast, slow and static
cells. Results demonstrate that stored samples kept motile until 10.59 hours, while activated
sperm prolonged its motility up to 300 seconds. On the other hand, progressive motility
maintained only for 9.1 hours for stored samples, and 90 seconds for post activated ones, what
emphasizes the optimization of sperm samples before these mentioned periods.
Key words: fish; Oreochromis niloticus, short-term storage, semen, sperm motility, tilapia,
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INTRODUÇÃO
A reprodução artificial é uma ferramenta importante em peixes cultivados, já que essa
técnica torna factível a produção de larvas em grande escala, o controle da reprodução de peixes e
a possibilidade de uma aplicação sinérgica com a biotecnologia (Arai, 2000; Andrade & Yasui,
2003).
Por outro lado, a utilização eficaz dessa manipulação reprodutiva depende da qualidade
dos gametas, o que enfatiza diversos esforços objetivando sua avaliação (Mansour et al., 2002;
Lim et al., 2004). No tocante à qualidade espermática, parâmetros relacionados com a taxa de
fertilização (i.e. motilidade espermática, freqüência de batimentos flagelares e tempo de
motilidade) são amplamente avaliados para a predição de sua eficácia (Cosson et al., 1985; Kime
et al., 2001).
Apesar de algumas características ainda se encontrarem desconhecidas, certos parâmetros
seminais possuem, reconhecidamente, uma variação individual e ambiental (Billard & Zhang,
2001). O espermatozóide de peixes é imóvel no testículo, mas inicia sua motilidade quando em
contato com o meio circundante, seguido por um decréscimo na qualidade seminal, já que o ATP é
rapidamente consumido, o que sugere que as amostras seminais devam ser usadas rapidamente
para que a fertilização seja otimizada (Perchec et al., 1995 e 1998; Dreanno et al., 1998).
Entretanto, após a ativação, poucos esforços têm sido realizados para a avaliar a qualidade seminal
ao longo do tempo.
A manutenção da qualidade espermática por períodos longos e curtos tem sido estudada
em várias espécies de peixe como os salmonídeos (Bencic et al., 2000), carpas (Ravinder et al.,
1997) e outras espécies relevantes na piscicultura (Cheriguini et al., 1997; Padhi & Mandal, 2000;
Billard et al., 2004), já que a estocagem permite uma utilização racional das amostras seminais. A
efetividade dessa técnica também é dependente dos parâmetros seminais para sua avaliação.
Considerando os aspectos mencionados, objetivou-se com o presente trabalho avaliar a
variação temporal da motilidade espermática em amostras refrigeradas e ativadas.
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MATERIAL E MÉTODOS
Os peixes utilizados no presente trabalho foram mantidos no Laboratório de Piscicultura
– UENF e as análises seminais foram realizadas no Laboratório de Reprodução Animal – UENF.
Experimento 1: Motilidade espermática do sêmen refrigerado
Quatro machos adultos de tilápia do Nilo (~700g) (Oreochromis niloticus, linhagem
Thai-Chitralada), foram induzidos à reproduzir (3 mg hipófise desidratada de carpa/kg), e
decorridas 270 horas-grau os animais foram anestesiados utilizando-se Tricaina-metil-sulfato (200
mgL-1
), procedendo-se então a extrusão. A motilidade de cada amostra foi imediatamente avaliada
e 3 dentre 4 amostras foram selecionadas para compor uma amostra composta, baseadas na
motilidade subjetiva (>80 %) e na ausência de contaminação por urina. A amostra resultante foi
estocada sob refrigeração (4oC) em caixas isotérmicas contendo gelo durante o período
experimental.
Para a avaliação da motilidade espermática, foi adotada a técnica de diluição em duas
etapas, conforme descrito por Billard & Cosson (1992). Primeiramente, uma alíquota foi diluída
20X em uma solução de 205,3mM NaCl, sendo uma pequena porção desta amostra colocada em
uma lâmina e observada então ao microscópio óptico, equipado com uma câmera tipo CCD e
conectada ao sistema CEROS – versão 10 (Hamilton Thorne Biosciences, Inc.).
A configuração do software utilizada no presente trabalho apresentou os seguintes
parâmetros: imagens adquiridas (frame acquired):50; taxa de aquisição de imagens (frame rate):
60Hz; contraste mínimo (minimum contrast): 20; tamanho mínimo de célula (minimum cell size):
5; contraste mínimo de célula estática (minimum static contrast): 30; tamanho de cabeça, imóvel
(head size, non-motile): 2 pixels; (limiar mínimo de trajetória linear (straightness–STR, threshold):
80%; intensidade de cabeça imóvel (head intensity, non-motile): 20; tamanho de cabeça estática
(static head size): 0.62 to 2.99; intensidade de cabeça estática (static head intensity): 0.17 até 2.61;
magnificação (magnification): 1.95.
A amostra foi ativada com uma nova diluição (7X) com uma solução de 119mM de
bicarbonato de sódio, sendo avaliada então a motilidade espermática a cada 30 minutos, até que
42
não fosse observado motilidade espermática (inferior a 1%de motilidade). Todas as análises
apresentaram três repetições, obtendo-se então os valores médios.
Experimento 2: Motilidade espermática do sêmen refrigerado
Uma pequena alíquota de sêmen da amostra obtida no experimento 1 foi utilizada para
avaliar a motilidade espermática, similarmente como foi descrito anteriormente. A mensuração foi
realizada a cada 15 segundos após a ativação, até o cessamento da motilidade espermática. Todas
as análises apresentaram três repetições, das quais foram obtidos então os respectivos valores
médios.
Estatística
Os dados obtidos foram avaliados por meio de correlação canônica e ANOVA, seguida de
Análise de regressão. Em todas as análises foi considerado P>0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Experimento 1
A motilidade total em amostras refrigeradas apresentou um decréscimo linear de acordo com a
regressão y = -8,98878x + 95,2635; P<0,05 (figura 1), indicando que as amostras seminais
mantém-se móveis por até 10,59 horas, com um decréscimo de 8,9%a cada hora. Esses dados são
inferiores ao observado por Chao et al. (1987) em tilápias (3 a 5 dias).
43
Figura 1. Duração da motilidade espermática da tilápia do Nilo, em amostras seminais
refrigeradas a 4ºC
Referente à motilidade progressiva, os dados sugerem um decréscimo até próximo a 9,1 horas,
conforme pode ser observado na figura 2, demonstrando que a motilidade total é menos atenuada
ao longo do tempo.
Figura 2. Duração da motilidade progressiva da tilápia do Nilo, em amostras seminais refrigeradas a
4ºC
44
Provavelmente esse decréscimo é decorrente da degeneração da qualidade seminal ao
longo do tempo. A deterioração de células espermáticas e proteínas plasmáticas, associado ao
consumo de oxigênio do plasma, causa a redução do pH, o que é prejudicial para as células,
especialmente para as estruturas mais frágeis como os flagelos, que tem uma função crucial na
motilidade (Linhart et al., 1999; Garner et al., 1994; Ravinder et al., 1997; Inaba et al., 1998).
Em geral, a diluição do esperma utilizando soluções diluidoras tende a incrementar a
capacidade de estocagem, já que essa solução reduz a concentração de compostos com potencial
de degeneração e incrementa também a disponibilidade de oxigênio (Billard & Cosson, 1992;
Padhi & Mandal, 2000). Além disso, componentes importantes como tampões, antibióticos,
açúcares e oxigênio podem ser associados à composição da solução diluidora, contribuindo para a
manutenção do esperma. Contraditoriamente, Chao et al. (1987) observaram maior capacidade de
estocagem em amostras não diluídas, quando comparadas com as diluídas. Esse fato evidencia que
a composição da solução diluidora também pode ser prejudicial ao esperma. A obtenção de uma
solução que simule o plasma seminal não é sempre uma tarefa simples, devido à dificuldade em
analisar diversos componentes plasmáticos. Já que a avaliação do plasma seminal inclui
parâmetros como a osmolaridade e outros componentes básicos como Ca, Mg, Na, K e proteínas
totais, esse procedimento parece não ser suficiente para sintetizar um plasma capaz de manter a
qualidade seminal. No caso da tilápia, a composição do plasma seminal inclui glicoproteínas, que
têm uma relação estrita com a manutenção do sêmen (Mochida et al., 1999).
O tempo de estocagem observado no presente trabalho foi similar ao encontrado por
Shimoda (2004) para Brycon insignis, (7,42h) e Marques & Godinho (2004) em Leporinus
friderici e L. elongatus.(~7 horas). Em “haddock” Melanogrammus aeglefinus e no bacalhau do
Atlântico Gadus morhua, a motilidade espermática do sêmen fresco manteve-se viável por 20 dias
e uma diluição da ordem de 1:3 melhorou o tempo de estocagem para mais de 40 dias (DeGraf and
Berlisky, 2004). Utilizando antibióticos antes da refrigeração, Brown and Mims (1995),
mantiveram o sêmen de “paddlefish” móvel por 56 dias. Esses fatos evidenciam que o tempo de
estocagem parece ser um parâmetro espécie-específico e muitos estudos ainda devem ser
realizados para melhorar a conservação do sêmen de tilápia sob refrigeração.
Dados referentes à freqüência de batimentos flagelares (BCF) não permitiram a obtenção
de um bom modelo para descrever o seu decréscimo, já que não foi possível obter uma regressão
para a predição do BCF. Apesar da percentagem da motilidade ao longo do tempo tenha
45
decrescido com o passar do tempo, como pode ser observado nas figuras 1 e 2, as células
remanescentes parecem estar em boas condições, o que não afetou a média do BCF, já que o
software considera, nas análises, apenas células apresentando motilidade.
Em referência à velocidade das células, o software agrupou os dados em quatro categorias
chamadas “rápida”, média”, “lento” e “estática”. Na categoria “lenta”, poucas células foram
consideradas em todas as leituras e os autores agruparam ambas as categorias, “média” e “lenta”,
em uma única categoria (“lenta”). O percentual de células estáticas incrementou seguido por um
decréscimo de células rápidas e médias (figura 3). Uma relação inversamente proporcional
também foi observada entre células rápidas e lentas. Esses dados indicam uma conversão
sucessiva, de rápida para lenta e então estática, possivelmente devido à exaustão do seu conteúdo
de ATP.
Figura 3. Modelos de motilidade espermática e tilápia do Nilo, em amostras estocadas a 4 ºC. As
células foram classificadas em “rápida”, “lenta” e “estática”.
Experimento 2
O tempo de motilidade espermática observado no presente trabalho foi de
aproximadamente 300 segundos, quando nenhuma motilidade foi observada (figura 4).
Resultados similares foram observados por Godinho et al. (2003) em sêmen criopreservado de
tilápia do Nilo, observado um tempo máximo de motilidade de 241 segundos.
46
Figura 4. Variação de motilidade espermática em amostras seminais frescas de tilápia do Nilo,
mensurado a cada 15 segundos.
Esses dados demonstram maior tempo de motilidade quando comparados com outras
espécies, como a carpa comum (<3 min.; Suzuki, 1959), salmonídeos (60-120 s; Scott & Baynes,
1980; Kobayashi et al., 2004) e bagre africano (45 s; Mansour et al., 2004). Apesar do tempo de
motilidade ter sido maior em comparação com essas espécies, foi observado que a motilidade
progressiva apresentou um rápido decréscimo nos primeiros 80 segundos (figura 5), de acordo
com a regressão y = 0.008x2 - 1.2924x + 52.5 (R
2=0,96), onde a variável dependente representa a
motilidade (%), e a variável independente, o tempo (s). Essa tendência também foi observada em
sêmen de “paddlefish” e esturjão (Cosson et al., 2000). Em “paddlefish”, a motilidade foi
prolongada até 360 – 420 s, ao passo que a motilidade progressiva apresentou um rápido
decréscimo até 60 segundos, acompanhada por um decréscimo da freqüência de batimentos
flagelares, velocidade e amplitude de onda flagelar. Esse último parâmetro citado possui uma
característica propulsiva.
47
Figura 5. Variação da motilidade espermática progressiva em tilápia do Nilo, mensurada a cada 15
segundos após a ativação.
A variação dos modelos de movimentação espermática está explícita na figura 6. A
velocidade das células rápidas decresceu gradualmente, o que foi acompanhado por um
incremento nas células “lentas”. Isso sugere um decréscimo na velocidade espermática, já que as
células “rápidas” foram convertidas em células “lentas”. A mesma tendência foi observada na
categoria “lenta”, que foi gradualmente convertida para a categoria “estática”.
Figura 6. Variação da velocidade espermática em tilápia do Nilo, mensurada a cada 15 segundos.
As células foram agrupadas em três categorias nomeadas “rápido”, “lento” e
“estático”.
48
Os dados explícitos nas figuras 4 a 6 indicam um decréscimo na qualidade espermática
(expressa em percentagem de motilidade e motilidade progressiva). De acordo com Cosson et al.
(1985), a motilidade progressiva se correlaciona positivamente com a taxa de fertilização, o que
evidencia uma rápida deterioração da qualidade espermática no presente trabalho, após a ativação.
A freqüência de batimentos flagelares (BCF) mostrou uma alta correlação com a
linearidade (r=0,52) e trajetória linear (r=0,49). De acordo com Ravinder et al. (1997), em carpas
(Cyprinus carpio), os espermatozóides apresentam motilidade linear dentre um período de
motilidade progressiva, e, após um decréscimo em progressividade, trajetórias circulares foram
predominantes. No presente trabalho, este parâmetro decresceu de acordo com o modelo “linear
response plateau”, de 32,26 Hz à 20,5 Hz (em 87,6 s), e manteve-se constante até 210 segundos
(figura 7). Apesar da motilidade ter sido prolongada até 300 segundos - o que sugere um
prolongamento sincrônico da freqüência de batimentos flagelares - os dados foram considerados
apenas até 210 segundos, já que a partir desse ponto, poucas células podiam ser levadas em
consideração (conforme pode ser observado na percentagem de células móveis, figura 4),
representando uma pequena fração da população de células. Esse fenômeno também foi observado
em outras espécies (Billard et al., 1997; Lahnsteiner et al., 1997; Fauvel et al., 1999). No presente
trabalho, a adoção da diluição em duas etapas para a mensuração da motilidade (Billard e Cosson,
1992) apresentou uma ativação sincrônica da motilidade espermática, o que minimizou a
superestimação deste parâmetro.
49
Figura 7. Variação da freqüência de batimentos flagelares (BCF) em tilápia do Nilo, mensurada a
cada 15 segundos.
A partir de 210 segundos, a motilidade decresceu abruptamente, similarmente como
descrito por Cosson et al. (1985). De acordo com esses autores, em trutas, a freqüência de
batimentos flagelares apresentou um rápido decréscimo abaixo dos 20Hz, mesmo com
disponibilidade de ATP. Resultados similares foram também observados em carpa comum
(Ravinder et al., 1997). Estes dados estão de acordo com o presente trabalho, sugerindo uma
similaridade entre o padrão de motilidade entre trutas, carpas e tilápia do Nilo.
Conforme observado na figura 5, a motilidade progressiva foi cessada aos 80 segundos,
período que coincide com o “plateau” de 20,5 Hz na freqüência de batimentos flagelares (figura 7).
Isso evidencia que a motilidade não-progressiva apresenta uma freqüência de batimentos flagelares
de 20,5 Hz, e que este último parâmetro citado pode também ser utilizado para a predição da
qualidade espermática.
50
CONCLUSÕES
Amostras seminais de tilápia do Nilo possuem um tempo de refrigeração de 10,59 horas a
4oC, apesar da motilidade progressiva ser cessada em 9,1 horas, período em que se recomenda a
sua utilização.
Amostras ativadas se mantém móveis por 300 segundos, mas a qualidade seminal é
otimizada antes dos 90 segundos, já que neste período parâmetros como a motilidade progressiva e
freqüência de batimentos flagelares são maximizadas.
AGRADECIMENTOS
Os autores são gratos à FAPERJ/UENF, pelo suporte financeiro deste trabalho. Nós
também gostaríamos de agradecer a Sra. Alice Emi Imai pela correção da Língua Inglesa dos
autores.
RESUMO
O presente trabalho objetiva avaliar motilidade espermática de tilápia do Nilo, em amostras frescas
e refrigeradas. Primeiramente, amostras seminais foram mantidas a 4ºC, tendo a motilidade
mensurada a cada 30 minutos, por meio de Analisador Espermático Computadorizado (CASA),
até que as células se tornassem imóveis. Similarmente, outra amostra seminal foi avaliada a cada
15 segundos após a ativação, para observar o decréscimo da qualidade seminal. Em cada
avaliação, foram mensurados os seguintes parâmetros: motilidade total e progressiva, freqüência
de batimentos flagelares e percentual de células rápidas, lentas e estáticas. Os resultados
demonstram que amostras refrigeradas se mantém móveis até 10.59 horas, enquanto o sêmen
ativado teve a motilidade prolongada até 300 segundos. Por outro lado, a motilidade progressiva se
manteve por apenas 9.1 horas para amostras refrigeradas e 90 segundos para amostras ativadas, o
que enfatiza a otimização de amostras seminais antes dos períodos mencionados.
51
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