Germinación in vitro de Semillas y Desarrollo de Plántulas de

Germinación in vitro de Semillas y Desarrollo de Plántulas de Orquídeas

Silvestres de Tabasco

Alberto Mayo MosquedaJaime G. Cázares CameroEfraín de la Cruz Lázaro

Alejandro Flores Hernández



Candita Victoria Gil JiménezRectora

Alma Catalina Berumen AlatorreDirectora de la División Académica de Ciencias Agropecuarias



Universidad Juárez Autónoma de TabascoDivisión Académica de Ciencias Agropecuarias

Alberto Mayo MosquedaJaime G. Cázares CameroEfraín de la Cruz Lázaro

Alejandro Flores Hernández

Primera edición, 2010

© Universidad Juárez Autónoma de Tabasco Av. Universidad s/n Zona de la Cultura, Col. Magisterial Villahermosa, Centro. Tab. C.P. 86040

Queda prohibida la reproducción parcial o total del contenidode la presente obra, sin contar previamente con la autorizaciónexpresa y por escrito del titular, en términos de la Ley Federalde Derechos de Autor.

ISBN: 978-607-7557-30-2

Impreso y hecho en Villahermosa, Tabasco. México

Germinación in vitro de Semillas y Desarrollo de Plántulas de Orquí-deas Silvestres de Tabasco / Alberto Mayo Mosqueda…[et al.] – Villa-hermosa, Tabasco: Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, 2010.

32 p.: IL. -- (Colección José N. Rovirosa, Biodiversidad, Desarrollo Sustentable y Trópico Húmedo)

Incluye Referencias Bibliográficas e Índice.

ISBN: 978-607-7557-30-2

1. Semillas – Desarrollo \ 2. Germinación.

I. Mayo Mosqueda, Alberto, Ed. II. Título. III. Serie.

L.C. QK740 G47 2010

Índice

Agradecimientos

Introducción I.Cultivo in vitro de orquídeas Biología de la germinación de semillas de orquídeas Propagación de orquídeas a partir de semillas

II. Medios de cultivo

III. Siembra de semillas Colecta y almacenamiento de las semillas Consideraciones sobre la siembra de cápsulas verdes y cápsulas abiertas Método de siembra de cápsulas verdes Método de siembra a partir de cápsulas abiertas

IV. Inducción de germinación in vitro Crecimiento y emisión de raíces

V. Transplante a condiciones ex vitro

Bibliografía

Índice de Cuadros y Figuras

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Agradecimientos

Agradecemos a las personas que amable y desinteresadamente permitieron el acceso a sus terrenos para realizar las colectas de semillas y plantas de orquídeas. De igual forma a todos los estu-diantes que participaron en los recorridos de campo, como en la realización de experimentos en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales de la División Académica de Ciencias Agropecuarias de la UJAT. Al fondo sectorial SAGARPA-CONACYT por su finan-ciamiento para el desarrollo del proyecto “Conservación y propa-gación de orquídeas de Tabasco” (clave C01 propuesta 12133), así como también del financiamiento para la impresión del presente documento.

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Introducción

Las orquídeas son plantas que pertenecen a la familia Orchida-ceae, con aproximadamente 700 a 800 géneros y 25,000 a 35,000 especies (Arditti, 1979). Taxonómicamente representan una de las familias más evolucionadas entre las monocotiledoneas, en su mayoría presentan flores atractivas y en algunos casos aunque no presenten flores cautivadoras ni de gran tamaño, tienen importan-cia desde el punto de vista ecológico. En general son consideradas como flores exóticas. Es por ello que la industria de flores de corte y macetas se ha convertido en un mercado creciente, tanto para mercados locales como de exportación. Adicionalmente, el desa-rrollo de nuevos híbridos y el cultivo comercial de orquídeas se ha convertido en una industria lucrativa en Europa, Hawaii, Australia, Tailandia, Japón, Singapur, Sri Lanka y Kenia (Luan, et al., 2006).Esta familia aunque es muy numerosa, algunas especies se encuen-tran amenazadas o en peligro de erradicación, debido al saqueo indiscriminado, destrucción de espacios, contaminación ambiental y deforestación, aunado a los problemas de lento crecimiento y baja tasa de germinación en condiciones naturales. En Tabasco, existen algunas especies con potencial orna-mental; sin embargo, hay que diseñar estrategias de reproducción debido a que por métodos convencionales es un proceso lento. La propagación vegetativa a partir de rizomas, separación de brotes generados del tallo o seudobulbos, es muy lenta, además de obte-nerse pocos brotes después de dos a tres años de iniciado el proce-so. Las orquídeas nativas merecen atención para su conserva-ción, dado que se encuentran en peligro debido a la acción extrac-tiva de pobladores locales. La conservación ex situ de los recursos genéticos vegetales se puede lograr mediante el almacenamiento in

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Germinación in vitro de Semillas y Desarrollo

vitro. Esta técnica ofrece la oportunidad de conservar germoplas-ma selecto a corto y mediano plazo. El germoplasma conservado debe ser regenerado a plantas y para ello se necesitan establecer protocolos de micropropagación antes de la conservación.

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I. Cultivo in vitro de orquídeas

La propagación y cultivo de las orquídeas fue revolucionado des-pués del descubrimiento de Knudson (1922) en donde las semi-llas pudieron ser germinadas en un medio simple con azúcar. Este trabajo demostró que la germinación de semillas de orquídeas en condiciones in vitro fue posible sin la asociación con hongos. Pos-teriormente, el mismo autor propuso una nueva solución con la adición de nutrientes para la germinación de semillas de orquí-deas en 1946. A partir de este momento muchas orquídeas se han regenerado y propagado a partir de segmentos de hoja (Murthy Pyati, 2001), segmentos nodales de plántulas provenientes de se-millas germinadas in vitro (Chen et al., 2002) nudos florales (Chen et al., 2002), ápices (Saiprasad y Polisetty, 2003), rizomas (Martin, 2003) y microsecciones apicales (Lakshmanan et al., 1995).

Biología de la germinación de semillas de orquídeasPara que las semillas de orquídeas germinen en un medio natural, se hace necesaria la simbiosis con hongos micorrízicos (Hadley, 1997). Las semillas de orquídeas son pequeñas y contienen po-cas o ninguna reserva para llevar a cabo su germinación (Singh, 1981), adicionalmente presentan pequeñas cantidades de lípidos y proteínas como material de reserva y no presentan endospermo (Savina, 1974) y cotiledones (Arditti y Ernst, 1984). Es por ello, que estratégicamente establecen una relación simbiótica con mi-corrizas, en la que, después de la infección se establece un flujo de carbohidratos, minerales, vitaminas, hormonas y aminoácidos que contribuyen a la germinación de semillas y desarrollo de las plan-tas (Weber y Webster, 2001). Las plántulas de orquídeas epífitas también pueden utilizar la simbiosis con hongos como una fuente de resistencia a la desecación, resultado de su pequeño tamaño y hábito arbóreo (Yoder et al., 2000).

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Aunque las semillas contenidas en una cápsula de orquídea pueden ser numerosas (2-3 millones), se considera que solo un 2-3% de semillas pueden germinar en condiciones naturales (Luan et al., 2006). Debido a las limitaciones anteriores, la germinación y el desarrollo en condiciones in vitro, se plantea como una alternativa que puede ser más eficiente en la regeneración de plantas, ya que se realiza en condiciones controladas y asépticas.

Propagación de orquídeas a partir de semillasDesde el punto de conservación ex situ de los recursos genéticos vegetales, las semillas de orquídeas representan variabilidad gené-tica, lo que las convierte en un material apropiado para ser inclui-do en programas de conservación. La primera propagación exitosa de orquídeas en condicio-nes in vitro a partir de la germinación de semillas fue lograda por Knudson (1922) con especies de Cattleya y más recientemente Lo et al. (2004) con Dendrobium tosaense y Damon et al. (2004) con Cattleya aurantiaca, Encyclia chacoensis y Brassavola nodosa. La germinación in vitro de semillas de orquídeas puede ser efectuada por dos vías:

a) Co-cultivo de las semillas con diversos hongos mico-rrízicos para establecer una relación simbiótica. Para ello es necesario el aislamiento y cultivo del hongo en un me-dio de cultivo específico.

b) Inoculación de las semillas en un medio de cultivo, que en ausencia de hongos simbióticos, proporciona los nutrientes requeridos para el desarrollo de la semilla.

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II. Medios de cultivo

Para la germinación de semillas de orquídeas se reportan en la literatura algunos medios de uso generalizado como Knudson C (Knudson, 1946), MS (Murashigue y Skoog, 1962), Hutner (1953), Dalla Rosa y Laneri (Dalla Rosa y Laneri, 1977), VW (Va-cin y Went, 1949) y Lindemann (1970). Sin embargo, los requeri-mientos pueden ser muy diversos, incluso en especies del mismo género. En el Cuadro 1 se muestra el contenido de elementos de cada medio de cultivo. En resultados obtenidos con especies del estado de Tabas-co (Catasetum integerrimun Hook, Encyclia alata, Encyclia cordigera, Epidendrum flexuosum, Epidendrum chlocorymbos, Epidendrum stamfor-dianum, Myrmecophila sp., Trichocentrum ascendens, Trichocentrum car-thagenense, Oncidium sphacelatum, Prosthechea cochleata, Nidema boo-thii, Trichocentrum lindenii), se han obtenido resultados aceptables con promedios de germinación de semillas de un 70 a 90% em-pleando los medios VW, MS, y MS a la mitad de su concentración, todos ellos adicionados con 0.1% de carbón activado. Para la etapa de desarrollo de las plántulas, se ha utilizado el medio Knudson C (Mayo et al., 2008).

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Cuadro 1. Formulación de medios de cultivo, empleados en el cultivo in vitro de orquídeas

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III. Siembra de semillas

Colecta y almacenamiento de las semillasLas semillas pueden ser colectadas a partir de cápsulas verdes o cápsulas maduras. En una cápsula verde que está en proceso de maduración, debe estimarse la edad promedio para cosecharla (el tiempo requerido para madurar es diferente para cada especie), de lo contrario pudiera ser que se encuentre en un estadio inicial de maduración, lo que afectaría negativamente el proceso de germi-nación. Algunos de los indicadores para determinar si una cápsula presenta semillas maduras, son el cambio de coloración (general-mente inicia la presencia de tonalidades amarillas), la base de la cápsula en el lugar del relicto floral se encuentra seco y cuando se presiona no se deforma debido a que se encuentra llena de semillas (Seaton y Ramsay, 2005). En la Figura 1, se muestran cápsulas maduras de diferen-tes especies, listas para germinar in vitro. Note la tonalidad parda en los bordes de la cápsula y la cicatriz de la flor completamente seca en la parte distal.

Figura 1. Cápsulas maduras. 1) Oncidium Sphacelatum,2) O. luridum, 3) C. integerrimum.

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Una vez abierta la cápsula, se desprenden con facilidad las semillas de las paredes con solo agitar al momento de la inocu-lación en el medio de cultivo. Las cápsulas pueden ser almacena-das por algunas semanas si se envuelven en papel periódico y se colocan en refrigeración a 4°C. Es importante no utilizar bolsas plásticas para almacenar cápsulas o semillas ya que se presentará condensación y consecuentemente pudriciones. En la medida de lo posible, es mejor colectar cápsulas que han estado expuestas a un día seco. Cuando se dispone de suficien-te material y no es posible sembrar la totalidad, se sugiere extraer las semillas en un área estéril y deshidratarlas con sílica gel en un desecador por dos días. Posteriormente, se colectan las semillas en tubos de vidrio con tapa hermética (Figura 2) y se pueden almace-nar en un refrigerador a 4°C por varios meses, siempre y cuando no se abra el contenedor.

Figura 2. Extracción de semillas y deshidrata-ción con sílica gel. a) Deshidratación por dos días; b) Almacenamiento en contenedor de vi-drio con tapa hermética a 4 ºC.

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de Plántulas de Orquídeas Silvestres de Tabasco

Consideraciones sobre la siembra de cápsulas verdes y cápsulas abier-tasSiembra a partir de cápsulas verdes. De forma general se considera que el interior de una cápsula de orquídea conserva las condiciones de asepsia si está intacta. Sin embargo, en la práctica se sugiere que al momento de realizar la disección, se ponga aten-ción en el color y textura del interior, en algunas ocasiones al abrir la cápsula, las semillas pueden estar necróticas o contaminadas de-bido a daños mecánicos que no son visibles a simple vista. Se considera que al esterilizar la parte externa y abrirla en condiciones asépticas, las semillas están estériles listas para inocu-larse en el medio de cultivo, por lo que ya no se requiere esterilizar las semillas. Una consideración a esta opción es que las semillas sembradas a partir de cápsulas que no han madurado lo suficiente podrían germinar lentamente o simplemente no germinar.

Siembra a partir de cápsulas abiertas. Las cápsulas abiertas, contienen en su interior semillas secas, pero como han estado expuestas al ambiente, este material presenta contaminación por hongos y bacterias. Para este material es necesario realizar este-rilización, por lo que con frecuencia se tienen problemas con los protocolos, dado que no existe alguno de forma general, sino que hay que establecer para cada especie las condiciones específicas. La elección de alguna de las opciones anteriores, estará en función de la disponibilidad de material vegetal.

Método de siembra para cápsulas verdesEl método general para sembrar semillas a partir de cápsulas ver-des es el siguiente:

1. Con un bisturí o tijera, cortar cuidadosamente los restos de la flor muerta de la cápsula.2.Lavar la cápsula con una solución de etanol al 70% por un minuto.

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3.Esterilizar la cápsula por 5 minutos en una solución de hipoclorito de sodio al 2.5 %, adicionando una gota de detergente Tween 20® por 100 ml.4. Retirar de la solución de cloro. En condiciones asép-ticas, sumergir en alcohol al 70 % por 30 segundos, y a continuación flamear hasta que el alcohol se queme. Esta operación se puede realizar de una a tres veces depen-diendo del tamaño de la cápsula. En caso de realizar un mayor número se corre el riesgo de dañar las semillas.5. Realizar uno o dos cortes en forma longitudinal y abrir la cápsula con un bisturí, cuidando de no introdu-cirlo demasiado para no tocar el interior. 6. Tomar la mitad de la cápsula y con una espátula o bis-turí golpearla para esparcir las semillas sobre el medio de cultivo. Normalmente, cuando las semillas se en-cuentran maduras se desprenden con facilidad (Figura 3). De no ser así, con un bisturí se deben raspar, cuidan-do de no incluir tejido de las paredes de la cápsula.

Figura 3. Siembra a partir de cápsulas verdes. a) Lavado en solución con jabón b) Inmersión en hipoclorito de sodio, c) Disección de la cápsula y d) Esparcimiento de semillas sobre el medio de cultivo.

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Método de siembra a partir de cápsulas abiertasSe dispone de diferentes métodos para la siembra a partir de se-millas secas. Por destacar, existe el método de la jeringuilla (más empleado), de la funda de papel, dentro de una pipeta o filtración a través de un embudo. Cada técnica varía de acuerdo a la especie, tiempo de esterilización y la concentración de los esterilizantes. En el laboratorio de cultivo de tejidos de la División Aca-démica de Ciencias Agropecuarias de la UJAT, se ha utilizado con buenos resultados la técnica de Dixon (1987). Consiste en la utili-zación de una solución de 5 ml de hipoclorito de sodio al 6%, 5 ml de etanol al 95% y 90 ml de agua destilada. Las semillas se colocan en esta solución por un minuto (agitando vigorosamente) y poste-riormente se enjuagan 2 veces en agua destilada estéril, dando un minuto por cada enjuague. Después del segundo lavado, se dejan sedimentar ligeramente las semillas y con una pipeta estéril se to-man de 0.1 a 0.2 cc, depositando sobre el medio de cultivo con esta técnica una cantidad de 50 a 300 semillas por cada contenedor de cultivo (Figura 4).

Figura 4. Esterilización de semillas secas.

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IV. Inducción de germinación in vitro

Al disponer de semillas (independientemente del origen) se deben cultivar a una temperatura de 27 °C ± 2, con iluminación difusa, y se debe eliminar aquellos cultivos contaminados o que presenten problemas de fenolización. En las especies de Tabasco que se hace referencia anteriormente se observan las semillas germinando des-pués de 2 a 3 meses de iniciado el cultivo. Crecimiento y emisión de raícesUna vez que se ha presentado la germinación, se sugiere realizar una transferencia de las plántulas a un medio de cultivo renovado. En caso de no presentar problemas, puede ser en el mismo medio que el primero; o bien, realizar un cambio a un medio Knudson C. En esta etapa algunos autores recomiendan la utilización de sustan-cias indefinidas como pulpa de banano (Lo et al., 2004) o agua de coco (Arias et al., 2006). Dependiendo del desarrollo del cultivo, se deben utilizar contenedores de cultivo de acuerdo al tamaño de las plántulas, para permitir un adecuado desarrollo. De igual forma debe consi-derarse la utilización de una mayor intensidad lumínica o luz natu-ral, para permitir que se adapten con mayor facilidad a condiciones naturales.

V. Transplante a condiciones ex vitro

Para esta etapa, deben separarse aquellas plantas con presencia de crecimiento radicular, hojas y rizoma (Figura 5). Las condiciones especiales durante el cultivo in vitro trae como resultado modificaciones en la morfología y fisiología de las plantas micropropagadas. Es por ello que deben seguirse algunos

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cuidados durante la transferencia a condiciones ex vitro, para asegu-rar el máximo porcentaje de sobrevivencia. Al extraer las plantas del contenedor de cultivo, deberán lavarse con agua corriente en forma abundante hasta eliminar los restos del medio de cultivo, de igual forma deben eliminarse hojas y raíces dañadas o necrosadas. Tratar las plantas con una solución de fungicida con Mancozeb (Manzate®) a una concentración de 1gl l-1 durante 10 minutos, para tratar de evitar problemas causa-dos por hongos durante el proceso.

Figura 5. Plántulas con presencia de hojas y raíces suficientes para iniciar el proceso de aclimatización.

Respecto al sustrato a utilizar existe a nivel comercial una amplia gama a utilizar, entre los que incluyen corteza de pino, musgo, perlita, tezontle, poliestireno, carbón vegetal, arcilla, etc. El sistema utilizado incluye la utilización de charolas plás-ticas con perforaciones en el fondo (Figura 6). Como primer paso se coloca en el fondo una capa de tepetzil grueso, material de ori-gen volcánico, utilizado para construcción de casas, pero que por su peso liviano y poca retención de agua, se utiliza para permitir un mayor drenaje (Figura 7). Se requiere lavar abundantemente, para no llevar partículas de polvo, que más tarde pueden retener agua.

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Figura 6. Charola plástica con perforaciones.

Figura 7. Tepetzil. Después de cribarlo se separa por tamaños. 1) menor de 0.5 cm; 2) de 0.5 a 1 y 3) mayor de 1 cm.

Después de la primer capa, se coloca la mezcla de sus-trato, que puede ser alguna de las siguientes: corteza de macuilis (Tabebuia rosea) con peat moss 2:1 (v/v), tepetzil grado 1 o fibra de coco.

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Posteriormente de sembrar las plántulas deben cubrirse con un domo plástico (Figura 8) para evitar la desecación y colo-carlas bajo sombra al 50 % con un nivel de luz promedio de 100 a 200 µmol m-2 s-1. Cuando estas condiciones no sean posibles, se debe escoger una temporada donde la temperatura no sea muy elevada (no más de 30 ºC) y con media sombra.

Figura 8. Cobertura de charolas con domos plás-

ticos para evitar la desecación.

Después de dos semanas de iniciar el proceso, se remueve el domo parcialmente y a la siguiente se retira completamente (Fi-gura 9). El riego debe realizarse en forma de spray con intervalos de 2 a tres días, dependiendo de las condiciones. Después de un mes las plántulas pueden ser fertilizadas semanalmente con 150 ppm de fertilizante NPK (Peters® 20- 20- 20, Scotts Company, Marysville, OH) . De esta forma pueden crecer las plantas hasta obtener la talla adecuada para ser transferidas a maceta, lo cual está en función de la velocidad de crecimiento de la especie.

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Figura 9. Plántulas establecidas sobre diferentes sustratos. (a) Tepetzil; (b) Fibra de coco.

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Cuadro 1. Formulación de medios de cultivo, empleados en el cultivo in vitro de orquídeas

Figura 1. Cápsulas maduras

Figura 2. Extracción de semillas y deshidratación en sílica gel

Figura 3. Siembra a partir de cápsulas verdes

Figura 4. Esterilización de semillas secas

Figura 5. Plántulas con presencia de hojas y raíces suficien-tes para iniciar el proceso de aclimatización

Figura 6. Charola plástica con perforaciones

Figura 7. Tepetzil después de cribarlo se separa por tama-ños

Figura 8. Cobertura de charolas con domos plásticos para evitar la desecación

Figura 9. Plántulas establecidas sobre diferentes sustratos

Índice de Cuadros y Figuras

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Germinación in vitro de Semillas y Desarrollo de Plántulas de Orquídeas Silvestres de Tabasco se ter-minó de imprimir en Gráficos Cánovas, Juan Álvarez, 505, Centro, el 25 de febrero de 2010, con un tiraje de 400 ejemplares. En la ciudad de Villahermosa, Tabasco, México. El cuidado de la edición estuvo a cargo de los autores y el Fondo Editorial Universitario.

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