ENZIMA GLICERALDEHDO FOSFATO DESHIDROGENASA (GADPH): REGULACIN DE LA FUNCIN GLUCOLTICA Y DE OTRAS FUNCIONES BIOLGICAS

RESUMEN

La gliceraldehdo 3 fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (EC 1.2.1.12) es una enzima de ~37 kDa que cataliza el sexto paso del proceso de glucolisis, uno de los pasos ms importantes de esta ruta metablica puesto que en l se genera el primer intermediario de elevada energa, y, adems, se genera un par de equivalentes de reduccin (en forma de NADH). La regulacin de la funcin glucoltica de la GAPDH, tiene mucha importancia en el metabolismo aerobio y anaerobio, en este trabajo se describen el papel que tiene esta enzima en dos padecimientos: metabolismo cardiaco e hiperglucemia en diabetes. Adems de la funcin metablica glucoltica de la G3PDH se ha implicado recientemente en muchos procesos no metablicos, incluyendo la activacin de la transcripcin, la iniciacin de la apoptosis, y la transportacin de vesculas del retculo endoplsmica (ER) para el aparato de Golgi.INTRODUCCINLos carbohidratos desempean una gran variedad de funciones en los organismos vivos. De hecho, el principal ciclo energtico de la biosfera depende en gran parte del metabolismo de los hidratos de carbono. Los carbohidratos cumplen dos papeles destacables que son el almacenamiento y la generacin de energa. Gran parte de los carbohidratos. En las plantas, estas biomolculas son producidas a partir del proceso de fotosntesis, y se almacenan en las plantas en forma de almidn o celulosa. As pues, los hidratos de carbono sintetizados por las plantas pasan a ser en ltima instancia las principales fuentes de carbono de todos los tejidos animales, y en estos ltimos se almacena en forma de glucgeno (Mathews et al., 2002). Los carbohidratos son la principal fuente de energa que nuestro organismo necesita, correspondiendo aproximadamente al 60% de la energa total consumida por la dieta. Tanto en clulas vegetales como en animales, se da una reaccin que es esencialmente la inversa de la fotosntesis, mediante la cual se produce de nuevo CO2 y H2O. Este proceso se denomina gluclisis y es la principal ruta de generacin de energa del metabolismo.La gluclisis es la ruta inicial del metabolismo de los carbohidratos, pues parte de la energa potencial almacenada en la estructura de azucares de seis carbonos se libera y se utiliza para la sntesis de ATP (Mathews et al, 2003). Este proceso puede realizarse en condiciones aerobias y anaerobias. Aunque las clulas pueden metabolizar diversas hexosas en la gluclisis, la glucosa es el principal combustible hidrato de carbono para la mayor parte de las clulas.La gliceraldehdo 3 fosfato deshidrogenasa (G3PDH) (EC 1.2.1.12) es una enzima de ~37 kDa que cataliza el sexto paso del proceso de glucolisis, uno de los pasos ms importantes de esta ruta metablica puesto que en l se genera el primer intermediario de elevada energa, y, adems, se genera un par de equivalentes de reduccin (en forma de NADH).El objetivo de este trabajo es la revisin acerca de la enzima gliceraldehdo fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en dicho proceso glucolisis, as tambin los mecanismos de regulacin de la misma. As tambin se pretende describir otras funciones que tiene GAPDH, a parte de su funcin glucoltica.

REVISIN BIBLIOGRFICAGluclisis: Oxidacin de GlucsaEl trmino gluclisis procede de las palabras griegas que significan dulce y romper. Literalmente, la denominacin es correcta, puesto que la gluclisis es la ruta por medio de la cual los azcares de seis carbonos (que son dulces) se rompen La gluclisis es una ruta de diez pasos que convierte una molcula de glucosa en dos molculas de piruvato (2 carbonos), con la generacin de dos molculas de ATP. Este proceso se lleva a cabo en el citosol de clulas eucariotas. La degradacin de polisacridos de almacenamiento y el metabolismo de los oligosacridos da lugar a glucosa, hexosas relacionadas y azcares fosfato, todos ellos se dirigen hacia la ruta glucoltica. Aunque la clula puede metabolizar diversas hexosas en la gluclisis, la glucosa es el principal combustible hidrato de carbono para la mayor parte de las clulas. Este proceso se puede dar tanto en condiciones aerobicas como en anaerobicas.En los organismos aerobios, la gluclisis es el primer paso de la oxidacin completa de la glucosa a CO2 y agua. El segundo paso es la oxidacin del piruvato a acetil-CoA, y el proceso final es la oxidacin de los carbonos del grupo acetilo en el ciclo del cido ctrico. La gluclisis da lugar tambin a intermedios biosintticos. As, la gluclisis es una ruta tanto anablica como catablica, cuya importancia va ms all de la sntesis de ATP y de los sustratos para el ciclo del cido ctrico

Secuencia de Reacciones de la GluclisisLas diez reacciones entre la glucosa y el piruvato pueden considerarse como dos fases distintas. Las cinco primeras reacciones constituyen una fase de inversin de energa, en la que sintetizan azcares fosfato a costa de dos moles de ATP (que se convierten en ADP), y el sustrato de seis carbonos se desdobla en 2 azcares fosfato de tres carbonos. Las cinco ltimas reacciones corresponden a una fase de generacin de energa, en la que las triosas fosfato se convierten en compuestos de gran energa que transfieren 4 moles de fosfato al ADP dando lugar a 4 moles de ATP. El rendimiento neto, por mol de glucosa metabolizada, es de 2 moles de ATP y 2 dos moles de piruvato. Tambin se generan 2 equivalentes reductores, en forma de NADH.Todas las enzimas de la va de la gluclisis se encuentran en la fraccin soluble extramitocondrial de la clula, el citosol. Estas catalizan las reaciones implicadas en la gluclisis de la glucosa, hasta piruvato y lactato.

Caractersticas Generales de Gliceraldehdo Fosfato Deshidrogenasa (GAPDH)La gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa (GAFDH) (EC 1.2.1.12) es una enzima de ~37 kDa, que participa en la ruta de la gluclisis, y es responsable de la conversin de gliceraldehdo 3-fosfato a D-glicerato 1,3-bifosfato. GAFDH es la enzima glucoltica y enzima deshidrogenasa (NADH) ms abundante en el citosol (Srivastava et al., 1987; Svedruzic y Spivey, 2006). La GAFDH existe principalmente en forma tetramrica compuesta por cuatro subunidades idnticas, cada una con un grupo tiol en su respectivo sitio cataltico. En la Figura 1 se muestra su estructura.

Figura 1. Gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) con NAD + y Pi unido al sitio activo.Fuente: Protein Data Bank (PDB)

Aunque GAPDH manifiesta otros efectos sorprendentes en la fisiologa celular que van mucho ms all de su funcin como una enzima glucoltica (Sirover, 1999). La enzima GAPDH est funcionalmente asociada con la agrupacin de microtbulos de la clula, la replicacin y reparacin del ADN, la apoptosis, la exportacin de ARN nuclear, la fusin de membranas, transporte del retculo endoplsmico (ER) al aparato de Golgi, y la actividad fosfotransferasa. Esta enzima tambin se ha implicado en enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Huntington, as como el cncer de prstata y la patognesis viral. GAPDH podra ser un objetivo de xido ntrico y un objetivo de los frmacos desarrollado para tratar la malaria o la enfermedad de Alzheimer (Svedruzic y Spivey, 2006). Funcin Metablica de Gliceraldehdo Fosfato Deshidrogenasa en GluclisisLa enzima gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) cataliza la conversin de gliceraldehdo 3-fosfato a 1,3-bifosfoglicerato. Este ltimo proceso es el sexto paso de la degradacin de glucosa mediante la ruta de la gluclisis, una ruta importante de produccin de energa y molculas de carbono. El gliceraldehdo 3-fosfato es convertido a D-glicerato 1,3 bifosfato en dos pasos acoplados. El primero es favorable y permite que el segundo paso desfavorable se produzca. La reaccin global es la siguiente:D-gliceraldehdo-3-fosfato+ NAD++Pi 1,2-bisfosfoglicerato+NADH+ H+

Figura 2. Reaccin general para la produccin de 1,3-bifosfoglicerato a partir de D-gliceraldehido-3-fosfato mediante catlisis por G3PDH.Fuente: Mathews et al., 2002

Mecanismo de CatlisisDesde el punto de vista de su mecanismo, la reaccin que cataliza la GAPDH, es la de las ms importantes de la gluclisis, debido en parte a que genera el primer intermediario de energa elevada, y porque genera un par de equivalentes reductores en forma de NADH. La reaccin comporta una oxidacin de dos electrones del carbono carbonilo del gliceraldehdo-3-fosfato al nivel carboxilo, una reaccin que normalmente es bastante exergnica. Sin embargo, en condiciones estandar, la reaccin es ligeramente endergnica, pues parte de esta energa queda almacenada en un grupo acil-fosfato, o anhdrido de cido carboxlico-fosfrico del 1,2-bisfosfoglicerato, que posee una energa libre estndar de hidrlisis de G0 = -49,4 kJ/mol. Adems, la enzima requiere la coenzima NAD+ a fin de rescatar los electrones producto de la oxidacin del sustrato (Mathews et al., 2002).En la Figura 3 se muestra los pasos de la reaccin de conversin de gliceraldehdo 3-fosfato a 1,3 bifosfoglicerato catalizada por la enzima gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa. En el primer paso el grupo tiol de una cistena de G3PDH reacciona con el grupo carbonilo de gliceraldehdo 3-fosfato para formar un tiohemiacetal. El segundo paso consiste en la transferencia de un tomo de hidrgeno y dos electrones a NAD+, formando la forma reducida NADH, y simultneamente se oxida el tiohemiacetal para dar lugar a un intermediario acil-enzima o tioster (compuesto de alta energa). Para el tercer paso, ocurre ruptura fosforoltica del enlace tioester en el intermediario acil-enzima para producir 1,3- bifosfoglicerato; el NADH se libera de la superficie de G3PDH, y sta enzima recupera su grupo SH (Lodish et al., 2000).

Figura 3. Mecanismo de accin de la gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasaEl grupo sulfhidrilo (SH) de la cadena lateral de cistena del grupo activo de la enzimas; R simboliza el resto de la molecula de gliceraldehdo 3-fosfato. R es el resto de la molcula de NAD.Fuente: (Lodish et al., 2000)

La estequiometra global de la reaccin comporta la reduccin de 1 mol de NAD+ a NADH + H+. Regulacin de GADPHA continuacin se describirn padecimientos donde se involucre la regulacin de la enzima GADPH.Ejemplo 1: Metabolismo Cardaco Aunque el corazn adulto normalmente consume cidos grasos para su metabolismo, durante el desarrollo y en la hipoxia, su metabolismo depende de glucosa.La gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se la considera un punto muy importante de regulacin en el caso de la isquemia. Durante el ciclo cataltico, en presencia de oxgeno, la GADPH utiliza el NAD y se reduce a NADH, esta coenzima reducida se reoxida nuevamente a travs de otros mecanismos que la pasan a la mitocondria. Al aumentar la gluclisis, el NADH sigue aumentando e inhibe a la enzima, as como el lactato y su producto de reaccin que es el 1,3-difosfoglicerato. Tanto AMP, ADP y Pi estimulan su actividad (King y Opie, 1998).Hipoxia. El corazn pasa de ser dependiente de cidos grasos a carbohidratos para obtencin de energa. Aumenta gluclisis para producir ATP. El aporte de glucosa en sangre baja por la disminucin de flujo sanguneo. Se acumula lactato y protones, lo cual conlleva a acidosis celular. Se disminuye el consumo de oxgeno por parte del corazn. Durante la hipoxia, la deshidrogenasa lctica genera lactato y genera NAD que se vuelve a usar en la reaccin de GADPH (Carb y Guarner, 2003).Isquemia. Durante la isquemia, se incrementa el consumo de glucosa relativo, de manera similar a lo que ocurre en la hipoxia. En la manera en que disminuye el flujo de oxgeno, la demanda celular de ATP permanece constante en la mayora de las clulas y tejidos de los mamferos, dejando un dficit energtico que solamente se puede recuperar activando las fuentes de ATP de la va anaerobia. Se ha propuesto que el flujo glucoltico durante la isquemia se inhibe a nivel de la GADPH por acumulacin de los productos finales de dicha va, especialmente lactato, protones y NADH (Carb y Guarner, 2003).Ejemplo 2: Hiperglucemia y Estrs Oxidativo en DiabetesLa diabetes mellitus es una enfermedad crnica de elevada incidencia y prevalencia a nivel mundial. sta enfermedad es particularmente conocida por su hiperglicemia crnica la cual es considerada como el agente causal de las complicaciones microvasculares y macrovasculares en estas personas. Los mecanismos moleculares propuestos para explicar los daos causados por la hiperglicemia crnica son varios: acumulacin de productos de glicosilacin avanzada, activacin de la va del sorbitol, activacin de diversas vas mediadas por las protenas quinasas C (PQC), activacin de la va de las hexosaminas y el incremento del estrs oxidativo.Debido a la activacin de la va del sorbitol, que es un mecanismo molecular propuesto para explicar los daos que causa la hiperglicemia crnica caracterstica de esta enfermedad, se inhibe la enzima GAPDH.La activacin de la va del sorbitol ocasiona una sobreproduccin de fructosa intracelular, que puede entrar en la ruta glucoltica ya sea como frutosa-6-fosfato o como fructosa-1- fosfato.Sea cual fuese el modo de entrada, el resultado siempre sera un incremento en las cantidades de los intermediarios gliceraldehdo-3-fosfato (G3P) y dihidroxiacetona-fosfato (DHAP) (Fukase et al., 1996).Para esto se debe tener en cuenta que la enzima gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) puede estar inhibida por mltiples mecanismos en los pacientes diabticos con hiperglicemia mantenida (Das et al, 2004; Xue-Liang et al., 2000). Por otro lado es bien reconocido en la literatura que la entrada de fructosa a la ruta glucoltica como fructosa-1-fosfato genera directamente DHAP y gliceraldehdo, evadiendo adems un importante punto de control de esta va metablica dado por la enzima fosfofructo quinasa.

Actividad de GADPH en Funcin del Compartimiento Celular y del EstrsCitoplasmaLa enzima GAPDH en el citosol se encarga de realizar la funcin de la conversin de gliceraldehdo 3-fosfato a D-glicerato 1,3 bifosfato, generando poder reductor en forma de NADH, tal como se ha descrito anteriormente. Hay evidencias de que las modificaciones posteriores a la traduccin de la GAPDH citoslica impulsan a esta molcula en vas funcionales que se desvan de la gluclisis.La GAPDH puede sufrir diferentes modificaciones postraduccionales, que pueden determinar algunas de sus funciones no glucolticas: Tiolacin, S-Nitracin y oxidacin. En condiciones de estrs oxidativo celular, GAPDH puede sufrir una tiolacin (S-S) reversible, un mecanismo para proteger a la enzima glucolitica de inactivacin oxidativa irreversible que consecuentemente se redirecciona al flujo metabolico de la glucolisis a la ruta de las pentosas fosfato para mantener la relacin optima de NADPH/NADP+ (Ralser et al. 2007). La S S-nitrosilacin, una adicin covalente de un xido ntrico de la protena citoslica GOSPEL (altamente expresada en rganos de que requieren altos niveles de GAPDH, como el musculo, el corazn, el cerebro) al grupo de la cadena lateral de tiol de la cistena de la enzima GAPDH postraduccional, generando una interaccin citotxica e indisponiendo la actividad metablica de GAPDH. La exposicin a los oxidantes puede inducir una oxidacin irreversible de residuos de cistena que favorecen los enlaces intermoleculares disulfuro y la subsecuente formacin de agregados citoslicos de GAPDH. Esta protena insoluble en ltima instancia, puede promover la disfuncin celular y la muerte celular (Nakajima et al., 2009).

Citoesqueleto y Transporte VesicularFue una de las primeras enzimas glucoliticas conocida que puede interactuar con las protenas musculares tubulina y actina, facilitando la agrupacin de los microtubulos y la polimerizacin de actina, repsetivamente. La ausencia de suero, est asociada al estrs oxidativo, promueve la asociacin de GAPDH con las fibras tensas (agrupaciones de microfilamentos). Este proceso desempea un papel importante para el trfico de membrana entre el RE y aparato de Golgi sin requisito de la actividad glucoltica GAPDH (Durriew et al., 1997). MitocondriaSe ha localizado la GAPDH en la mitocondria y tiene funciones distintas respecto a la GAPDH citoslica. Los niveles de GAPDH en la mitocondria son bajos en condiciones basales, pero se elevan bajo condiciones de estrs, tales como la privacin de suero y la exposicin a agentes que daan el DNA (Tarze et al, 2007).Cuando la enzima GAPDH se expresa exgenamente, se localiza en la mitocondria y se induce la permeabilizacin pro-apoptotica de la membrana mitocondrial (MMP) por medio de la asociacin del canal dependiente de voltaje 1 de la mitocondria (VDAC1) (Tarze et al., 2007). Lo anterior, puede promover la liberacin de citocromo c (CytC) y factor inductor de apoptosis (AIF), que conduce a la muerte celular apopttica.GAPDH se ha localizado tambin en la mitocondria y tienen funciones distintas. GAPDH puede unirse con el canal de aniones dependiente de voltaje (VDAC), que puede promover la liberacin de citocromo c (CytC) y factor inductor de apoptosis (AIF), que conduce a la muerte celular apopttica. En condiciones de estrs, una disminucin en el potencial de membrana mitocondrial (m) conduce a la muerte celular independiente de caspasas (CICD). Con el fin de lograr la supervivencia celular, se puede proporcionar suficiente ATP para mantener el potencial de membrana mitocondrial a travs de la ATPasa, lo que ayuda a contrarrestar los efectos del colapso energtico por la prdida de la funcin mitocondrial.

NcleoSe inform de que un pequea cantidad de GAPDH se translada al ncleo tras la exposicin de la clula a factores de estrs y participa en la muerte/disfuncin de la clula (Sawa et al., 1997). Esto indica que GAPDH puede actuar como una molcula de retransmisin entre compartimentos celulares durante el estrs celular. La seal es transmitida por GAPDH que es S-nitrosilada por el NO en el sitio activo Cys-150, permitiendo GAPDH para unirse a la Siah (una ubiquitina ligasa E3), que conduce a la translocacin nuclear de GAPDH- al complejo Siah. En general y de manera similar con la GAPDH citoslica se genera una interaccin citotxica que indispone la actividad metablica de GAPDH.Enfermedades Relacionadas con la Actividad de la GADPH La participacin de GAPDH en mltiples vas de regulacin homeosttica indica que esta molcula, cuando es perturbada tambin puede jugar un papel en la manifestacin de ciertas enfermedades. La evidencia acumulada sugiere que GAPDH nuclear puede estar implicado en varias enfermedades neurodegenerativas (Chuang et al., 2005). La enzima GAPDH nuclear, se ha encontrado en fibroblastos y en cerebros postmortem de pacientes con enfermedades de poliglutamina (tales como la enfermedad de Huntington o la atrofia Dentatorubral-pallidoluysian) (Mazzola y Sirover, 2002), la enfermedad de Parkinson (Tatton, 2000) y la enfermedad de Alzheimer (Mazzola y Sirover, 2003). Se observ la acumulacin de GAPDH nuclear en un modelo experimental de insquemia cerebral (Tanaka et al., 2002).

CONCLUSIONESLa gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa juega un papel importante en la generacin de energa mediante glucolisis en el citosol, pues es la nica reaccin donde se da la generacin de poder reductor en forma de NADPH.En el citosol se encuentran factores que indisponen o inhiben la actividad de la GADPH cuando la clula es sometida a algn tipo de estrs, y un comportamiento similar se observa en otros compartimientos celulares (nucleo, mitocondria, entre otros), a los cuales la enzima GADPH migra por respuesta al estrs. La participacin de algunas rutas de regulacin de GADPH, indican que cuando sta molcula es perturbada, se manifiestan algunas enfermedades. El entendimiento de aspectos adicionales relacionados con la GAPDH puede ayudar al desarrollo de nuevas estrategias teraputicas para muchos de estos desrdenes. REFERENCIASMathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. 2002. Bioqumica. Pearson Adxison Wesley. Pp 1333.Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. 2000. Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H. Freeman. Srivastava DK, Bernhard SA. Biophysical chemistry of metabolic reaction sequences in concentrated enzyme solution and in the cell. Annu Rev Biophys Biophys Chem 1987;16:175204.Svedruzic ZM, Spivey HO. 2006. Interaction between Mammalian Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase and L-Lactate Dehydrogenase from Heart and Muscle. PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics 63:501511.Sirover MA. New insights into an old protein: the functional diversity of mammalian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochim Biophys Acta 1999;1432:159 184.Ravichandran V, Seres T, Moriguchi T, Thomas JA, Johnston RB., Jr. 1994. S-thiolation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase induced by the phagocytosis-associated respiratory burst in blood monocytes. J Biol Chem.; 269:25010.Ralser M, Wamelink MM, Kowald A, Gerisch B, Heeren G, Struys EA, Klipp E, Jakobs C, Breitenbach M, Lehrach H, Krobitsch S.Dynamic rerouting of the carbohydrate flux is key to counteracting oxidative stress. J Biol.2007;6:10.Nakajima H, Amano W, Kubo T, Fukuhara A, Ihara H, Azuma YT, Tajima H, Inui T, Sawa A, Takeuchi T.2009. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase aggregate formation participates in oxidative stress-induced cell death. J Biol Chem. 284:34331.Tarze A, Deniaud A, Le Bras M, Maillier E, Molle D, Larochette N, Zamzami N, Jan G, Kroemer G, Brenner C Oncogene. 2007. GAPDH, a novel regulator of the pro-apoptotic mitochondrial membrane permeabilization. Apr 19; 26(18):2606-20.

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