This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

49 GLUCURONIDIERUNG VON IIYDROXY-TESTOSTERON UND -ANDROSTENDION

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13 J. S. LITTLER, J. diem. Soc. [London] 1962. 2190. 14 Unpublished work.

Glucuronidierung von Hydroxy-testosteron- und Hydroxy-andro-stendion-Verbindungen durch die mikrosomale UDP-Glucuronyl-

Transferase der Rattenleber Glucuronidation of Hydroxy-compounds of Testosterone and Androstenedione by the

Microsomal UDP Glucuronyl Transferase of Rat Liver

HERBERT SCHRIEFERS, RÜDIGER GHRAF und BIRGIT LEHNEN

Abteilung für Biochemie der Universität Ulm

(Z. Naturforsch. 27 b, 49—52 [1972] ; eingegangen am 13. August 1971. revidiert am 7. November 1971)

Hydroxy-testosteron, Hydroxy-androstendion, Glucuronidierung UDP-Glucuronyl-Transferase, Substratspezifität

The microsomal UDP glucuronyl transferase exhibits activities against hydroxy derivatives of androstenedione (hydroxyl groups in the positions 2/?, 6ß or 16a) between 5% and 21% of the extent shown against testosterone. 2ß-, 6ß- and 16a-hydroxyl groups are much less efficient in ac-cepting the glucuronic acid than the 17/Miydroxyl group.

However, the acceptor function of the 17/?-hydroxyl group is restricted by other hydroxy sub-stituents in the testosterone molecule to an increasing extent represented by the following sequence: 2a, 6ß, 6a, 16a, and 7a. A special case is represented by 2/?-hydroxy-testosterone. The transferase displays a higher activity against this compound than against testosterone.

Apparently the transferase approaches the steroid molecule from the a-side (with the /?-side there is also contact at the C-6 atom) requires the 17/?-hydroxyl group and the 3-oxo-4-ene system to display full activity.

Thus the very high specificity of the transferase for testosterone explains the selective action of this enzyme on testosterone metabolism in the liver. This action is expressed by the fact, that in liver perfusates the percentage of testosterone in the glucuronide fraction is twice as large as the percentage of testosterone in the free steroid fraction.

Enzyme: UDP-Glucuronyl-Transferase, UDP-Glucuronat-Glu-curonyl-Transferase (Acceptor-unispezif.; EC 2.4.1.17) ; Zl4-5a-(bzw. ß-) Hydrogenase, Cortison-a-(bzw. ß-) Reduk-tase, 4.5a-(bzw. 4.5/?-)Dihydrocortison: NADP-ZI4-Oxido-reduktase (EC 1.3.1.4 bzw. 1.3.1.3) ; Steroid-Hydroxyla-sen, Steroid, N A D P H : Sauerstoff-Oxidoreduktasen (EC 1.14.1.6 — 8) . Steroide: Testosteron = 17/?-Hydroxy-4-androsten-3-on; Androstendion = 4-Androsten-3.17-dion; Ätiocholanolon = 3a-Hydroxy-5/?-androstan-3-on; Östriol = 3.16a. • 17/?-Trihydroxy-1.3.5 (10) -östratrien.

Der Stoffwechsel von Testosteron in der isoliert perfundierten Rattenleber ist gekennzeichnet durch sexualspezifische Metabolitmuster in der Fraktion der freien Steroide 2 wie in der Fraktion der Ste-roidglucuronide 3' 4. In beiden Fraktionen ist für die Leber männlicher Tiere das Auftreten hydroxylier-

Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. H. SCHRIEFERS, Abteilung für Biochemie der Universität Ulm. D-7900 Ulm, Neubau Oberer Eselsberg.

ter Derivate (Hydroxylgruppen in den Positionen 2, 6, 7, 16) von Testosteron und Androstendion kennzeichnend.

Als Ursache für das Auftreten freier hydroxylier-ler 3-Oxo-4-en-Steroide in den Leberperfusaten männlicher Tiere läßt sich zweierlei anführen: Ge-genüber weiblichen Tieren hat die Leber männlicher Ratten eine sehr viel geringere /l4-5a-Hydrogenase-und eine bedeutend höhere Hydroxylasen-Aktivi-tät5. Die Folge ist eine Mehrproduktion an hydro-xylierten 3-Oxo-4-en-Steroiden. Ihr Anteil an der Fraktion der freien Steroide ist beträchtlich in der Glucuronidfraktion sind sie jedoch weit weniger stark vertreten 4. Damit ist die Frage aufgeworfen, ob dies auf eine schlechtere Acceptorfunktion der hydroxylierten Testosteron- und Androstendion-Derivate für die UDP-Glucuronyl-Transferase zu-rückzuführen sei. Wir haben deshalb eine Reihe

5 0 H. SCHRIEFERS, R. GHRAF UND B. LEHNEN

hydroxylierter C19-Steroide vom Typ 3-Oxo-4-en, wie sie in der Fraktion der freien Steroide aus Per-fusaten männlicher Rattenleber anzutreffen sind, auf ihre Acceptorfunktion gegenüber dem Glucuron-säure-Transfer durch die mikrosomale UDP-Glucu-ronyl-Transferase der männlichen Rattenleber ge-prüft und damit zugleich unseren früheren Beitrag 6

zur Frage der Substratspezifität dieses Enzyms er-weitert.

Methodik

M i k r o s o m e n p r ä p a r a t i o n Aus der Leber geschlechtsreifer männlicher SpD/Ul-

Ratten (Zentrale Tierversuchsanlage der Universität Ulm) wurde nach dem Verfahren von POGELL und LELOIR 7 die das Glucuronsäure transferierende Enzym enthaltende Mikrosomenfraktion durch fraktio-nierte Zentrifugation isoliert. Ausgegangen wird von einem Homogenat, das 7 g Leber in 21ml 0,154 M KCl-Lösung enthält (Einzelheiten zur Zellfraktionie-rung s. 1. c.6). Zum Versuch kam eine Mikrosomen-suspension in Wasser, die je ml die Mikrosomen von 1,1 g Leber enthielt.

S u b s t r a t e Aus der Steroid-Reference-Collection (Prof. Dr. W.

KLYNE, Chemistry Department, Westfield College, Hampstead/London) wurden uns die folgenden Verbin-dungen zur Verfügung gestellt: 2ß-, 6ß-, 16a-Hydroxy-testosteron, 6ß- und 16a-Hydroxy-androstendion; von Herrn Dr. K . IRMSCHER (Merck AG, Darmstadt) er-hielten wir 7a-Hydroxy-testosteron. Östriol war ein Handelspräparat. Die übrigen Verbindungen wurden chemisch-präparativ dargestellt.

2ß-Hydroxy-androstendion: Androstendion wurde acetoxyliert 8 und das Gemisch aus 2a- und 2/?-Acetoxy-androstendion anschließend mit methanolischer KOH bei 30 °C in N2-Atmosphäre verseift (Einzelheiten zur Verseifung s. 1. c.9) . Die Trennung der beiden iso-meren Verseifungsprodukte (2a- und 2/S-Hydroxy-androstendion) erfolgte durch Adsorptionschromatogra-phie an Silicagel; Eluens: Benzol mit steigenden Zu-sätzen an Äthanol (0,1; 0,2; 0,3% usw.). Charakteri-sierung des Endproduktes s. 1. c.1.

2a-Hydroxy-testosteron: Das nach Acetoxylierung8

von Testosteronacetat entstandene Gemisch von 2a- und 2/?-Hydroxy-testosteron-2.17-diacetat wurde mit metha-nolischer Kaliumhydrogencarbonat-Lösung (4 Stdn. bei 100 °C in No-Atmosphäre; Einzelheiten s. I.e.8) ver-seift. Durch Adsorptionschromatographie an der Silica-gelsäule (Eluens: Benzol mit steigenden Zusätzen Äthanol, s. oben) wurde 2a-Hydroxy-testosteron aus dem Gemisch der Verseifungsprodukte isoliert. Die mehrmals aus Methanol/Wasser umkristallisierte Ver-bindung weist die in der Literatur 8 angegebenen Cha-rakteristika auf.

2-Oxo-Testosteron: Ein durch Acetoxylierung8 von Testosteronacetat entstandenes Gemisch von 2a- und 2ß-Hydroxy-testosteron-2.17-diacetat wurde mit verdünn-ter methanolischer KOH (s oben) verseift. Auf diese Weise erhält man 2a- und 2/?-Hydroxy-testosteron-17-monoacetat, die zur 2-Oxo-Verbindung oxydiert wur-den: Unter Eiskühlung wurden 40 mg Monoacetat in 1 ml 90-proz. Eisessig gelöst und mit 0,4 ml Chrom-trioxyd in 90-proz. Eisessig (20 mg/ml) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann 45 min bei Raumtem-peratur im Dunkeln belassen. Nach Zusatz von 20 ml Wasser wurde 3-mal mit je 50 ml Dichlormethan ex-trahiert, der Extrakt mit Hydrogencarbonat und Was-ser gewaschen und schließlich eingedampft. Nach Ver-seifung 10 und Chromatographie an Silicagel (Eluens: s. oben) wurden 10 mg Reinsubstanz erhalten, die, aus Äthylacetat/n-Hexan und Aceton/n-Hexan mehrfach kristallisiert, sich in verschiedenen papier- und dünn-schichtchromatographischen Systemen als mit authenti-schem 2-Oxo-testosteron identisch erwiesen. In Lösung liegt die Verbindung als 2/?,17/?-Dihydroxy-1.4-andro-stadien-3-on vor ( Ä 0 H =254nm; vgl. I.e.11).

6a-Hydroxy-testosteron: Es wurde aus 6-Oxo-andro-stendion (Darstellung s. 1. c. 12) durch Hydrierung 13

mit Hilfe von Natriumborhydrid dargestellt. Die ver-schiedenen Reduktionsprodukte wurden durch Vertei-lungschromatographie an einer Celitesäule voneinander getrennt (60 g Celite 545 imprägniert mit 30 ml unte-rer Phase des Systems Benzol/Methanol/Wasser, 100: 50:50; Säulendurchmesser 2 cm; Fraktionierung: 15ml je Fraktion). Aus dem Eindampfrückstand der Fraktionen 19 — 31 wurde eine einheitliche Substanz erhalten, die in verschiedenen papier- und dünnschicht-chromatographischen Systemen mit 6a-Hydroxy-testo-steron identisch war und sich durch ihr UV-Absorp-tionsmaximum (AmÜx°H =241 nm; vgl. I.e.14) und den Extinktionskoeffizienten (e = 15078) einwandfrei von dem 6/Msomeren unterschied. Nach Einwirkung von Alkali (0,1 N methanol. KOH, 3 Stdn., 60 °C) zeigt die Verbindung zwei neue Absorptionsmaxima bei 260 und 380 nm, wie sie typischerweise unter diesen Bedingungen bei 6-hydroxylierten 3-Oxo-4-en-Verbin-dungen auftreten 12.

D u r c h f ü h r u n g der V e r s u c h e In jeder von insgesamt 10 Versuchsreihen wurde die

Aktivität der mikrosomalen UDP-Glucuronyl-Trans-ferase gegenüber Testosteron als Acceptor mit der gegenüber einem der 10 zur Verfügung stehenden hydroxylierten Testosteron- bzw. Androstendion-Deri-vate verglichen. Das Ausmaß der Glucuronidierung von Testosteron diente somit in jeder Versuchsreihe als Bezugsgröße zur Bestimmung der relativen Aktivi-tät des Enzyms gegenüber den Hydroxy-Derivaten. Jede Versuchsreihe bestand aus 6 oder 8 Einzel-ansätzen, von denen die eine Hälfte zur Messung der Glucuronidierung von Testosteron, die andere zur Mes-sung der Glucuronidierung eines der Hydroxy-Derivate von Testosteron oder Androstendion diente.

Jeder Einzelansatz enthielt in einem Endvolumen von 3,0 ml 0,8 ml Wasser, 0,9 ml Phosphatpuffer

51 GLUCURONIDIERUNG VON IIYDROXY-TESTOSTERON UND -ANDROSTENDION

(0,05M Na2HP04 mit HCl auf pH 7,4 eingestellt), 1,2 ml Mikrosomensuspension und 693 nMol (~200 jug) Steroid-Substrat in 0,1 ml Methanol sowie folgende Zu-sätze (^Mol/Ansatz): UDP-Glucuronsäure 1,1; ATP 2,0; UDP-A-Acetyl-glucosamin 2,0. Gestartet wurde die Reaktion durch Zugabe des Steroid-Substrates; die Inkubationszeit betrug 30 min (37 °C).

Bei der Aufarbeitung der Inkubationsansätze, der chromatographischen Trennung der entstandenen Ste-roidglucuronide vom verbliebenen freien Steroid und der quantitativen Bestimmung des chromatographisch isolierten Syntheseproduktes wurde in allen Einzelhei-ten nach 1. c. 6 verfahren. In 6 Versuchen mit authen-tischem Ätiocholanolon-glucuronid betrug die Wieder-findung für das gesamte Aufarbeitungs- und Bestim-mungsverfahren 74 + 3 Prozent.

Ergebnisse und Diskussion

Die Ergebnisse unserer Untersuchungen zur Frage der Aktivität der UDP-Glucuronyl-Transferase gegenüber verschiedenen Hydroxylierungsprodukten von Testosteron und Androstendion sind in den Tabn. 1 und 2 niedergelegt.

Substrat Relative Aktivität

Testosteron 100 16a-Hydroxy-androstendion 27,3 ± 1 , 2

2/?-Hydroxy-androstendion 17,3 ± 2 , 0 6/?-Hydroxy-androstendion 4,5 ± 0 , 2

Tab. 1. Hydroxy-Derivate von Androstendion als Acceptoren für die mikrosomale UDP-Glucuronyl-Transferase der Ratten-leber. Relative Aktivität: 217,7 ± 10,5 nMol Testosteron-glu-curonid/(Ansatz-30 min) = 100. Mittelwerte + Standard-

abweichung.

Substrat Relative Aktivität

Testosteron 100 2/?-Hydroxy-testosteron 131,8±2,6 2-Oxo-testosteron 75,3 ± 3 , 7 2a-Hydroxy-testosteron 68,1 ± 5 , 1 6/?-Hydroxy-testosteron 22,4 ± 1 , 0 6a-Hydroxy-testosteron 19,7 ± 1 , 3

16a-Hydroxy-testosteron 17,3 ± 0 , 9 7a-Hydroxy-testosteron 9,7 ± 2 , 2

Östriol 15,2 ± 1 , 1

Tab. 2. Zur Frage der Substratspezifität der mikrosomalen UDP-Glucuronyl-Transferase der Rattenleber gegenüber Hy-droxy-Derivaten von Testosteron und gegenüber Östriol. Rela-tive Aktivität: 217,7 nMol Testosteron-glucuronid/(Ansatz-

30 min) = 100. Mittelwerte ± Standardabweichung.

Tab. 1 vergleicht die Acceptorfunktion verschiede-ner Hydroxy-Substituenten in einem C1902-Steroid des Typs 3-Oxo-4-en. Ob die Hydroxylgruppe in 2ß,

in 6ß oder 16a steht, die Ausbeute an entsprechen-dem Glucuronid liegt in jedem Fall weit unter der an 17/?-Glucuronid.

Dieser Befund stellt eine Parallele zu den Ergeb-nissen einer früheren Untersuchung6 dar, wonach auch bei den gesättigten C1902-Steroiden die 17/?-Hydroxy-Funktion als Glucuronsäure-Acceptor andersständigen Hydroxylgruppen (3a- oder 3ß-) weit überlegen ist.

Seine volle transferierende Aktivität zeigt das mikrosomale Enzym der Rattenleber nur dann, wenn im Acceptor-Molekül die 17/?-Hydroxy-Gruppe in Kombination mit der 3-Oxo-4-en-Gruppierung in Ring A auftritt.

Schon die Hydrierung nur der J4-Doppelbindung führt zu einem Molekül mit geringerer Acceptor-qualität6 (17/?-Hydroxy-5a-androstan-3-on). Tritt nun auch noch an die Stelle der Carbonylfunktion in C-3 eine Hydroxylgruppe (wie in 3a,17/?-Dihydro-xy-5a-androstan), so sinkt die Aktivität der Trans-ferase gegenüber diesem Substrat auf weniger als die Hälfte der Aktivität, die sie gegenüber der intak-ten 3-Oxo-4-en-Verbindung mit 17/?-ständiger Hy-droxylgruppe, also gegenüber Testosteron, hat.

Die in der Mikrosomenfraktion der Rattenleber lokalisierte UDP-Glucuronyl-Transferase ist somit ein Enzym, das eine hohe Substratspezifität für Testosteron besitzt. Diese Aussage wird durch die Daten der Tab. 2 bestätigt und dahingehend erwei-tert, daß, von einer Ausnahme abgesehen, Hydroxy-Substituenten im Testosteron-Molekül dessen Glu-curonidierung hemmen. Es liegt nahe, hier an eine sterische Behinderung des Enzyms zu denken, bei der die Hydroxylgruppen in der Reihenfolge 2a, 6ß, 6a, 16a und 7a einen zunehmend hemmenden Einfluß auf den Glucuronsäure-Transfer ausüben.

Einen Sonderfall stellt 2/?-Hydroxy-<testosteron dar. Das Enzym zeigt diesem Substrat gegenüber eine um den Faktor 1,3 höhere transferierende Akti-vität als gegenüber Testosteron. Die 2/?-Hydroxy-Gruppe behindert nicht die Glucuronsäure-Übertra-gung, sondern verbessert sie. Das kann elektronisch bedingt sein.

Nach den Untersuchungen von RINGOLD et al.15

(sie studierten den Einfluß von Halogen-Substituen-ten) hat ein elektronegativer Substituent am C-Atom 2 einen destabilisierenden Effekt auf das a.ß-ungesättigte Keton-System in Ring A. Möglicher-weise ist diese Destabilisierung (Hemmung der Po-larisation von C-3-Carbonylgruppe und zl4-Doppel-

5 2 GLUCURONIDIERUNG VON IIYDROXY-TESTOSTERON UND -ANDROSTENDION

bindung durch die 2/?-Hydroxy-Gruppe) für eine bessere Substrathaftung verantwortlich zu machen.

Einer solchen Überlegung muß man jedoch ent-gegenhalten, daß elektronegative Substituenten in den Positionen 2a, 6a oder 6ß eine mindestens ebenso große destabilisierende Wirkung auf die 3-Oxo-4-en-Gruppierung ausüben 15 wie die 2/?-Hy-droxy-Gruppe, in diesen Fällen aber dem Molekül nicht bessere, sondern eindeutig schlechtere Accep-tor-Eigenschaften verleihen. Hier scheint wie auch beim 7a- und 16a-Hydroxy-testosteron die sterische Behinderung der ausschlaggebende Faktor zu sein.

Anteil Testosteron

or

in /o Hydroxy-testosteron

Fraktion der freien Steroide 24 37 Fraktion der Steroidglucuronide 47 7

Tab. 3. Größe des Anteils von Testosteron und des Anteils von Hydroxy-testosteron an der Fraktion der freien Steroide und der Fraktion der Steroidglucuronide in Leberperfusaten männlicher Ratten. Den Daten liegen die Arbeiten 1. c. 4

zugrunde.

Die hohe Spezifität der Transferase für Testo-steron äußert sich sehr deutlich auch im Stoffwechsel-versuch an der isoliert perfundierten Leber. Das zeigt Tab. 3: Wenn der Anteil von Testosteron an

der Glucuronidfraktion doppelt so groß ist wie sein Anteil an der Fraktion der freien Steroide, dann ist dies Ausdruck einer „Selektionierung" von Testo-steron durch die UDP-Glucuronyl-Transferase. Ein Negativbild dieser Aussage liegt in der Tatsache, daß unter den gleichen Bedingungen des Perfusions-experimentes der Anteil der hydroxylierten C19-3-Oxo-4-en-Steroide an der Fraktion der Steroidglu-curonide um den Faktor 5 kleiner ist als ihr Anteil an der Fraktion der freien Steroide.

Im übrigen ist die in dieser Arbeit in Rede stehende UDP-Glucuronyl-Transferase der Ratten-leber der von D A H M et al.16 charakterisierten, in der Mikrosomenfraktion des Dünndarms vom Menschen lokalisierten Transferase in ihren Eigenschaften offensichtlich sehr ähnlich; man vergleiche Ky\-Werte6-16 und Substratspezifität6'16. Von der im Cytosol des Dünndarms 17 und der im Cytosol der Leber 18 des Menschen befindlichen unterscheidet sie sich grundlegend, was unter anderem auch daraus hervorgeht, daß das mikrosomale Rattenleberenzym im Gegensatz zum Enzym aus Dünndarm- und Leber-Cytosol Ostriol nur äußerst schwach glucuro-niert (Tab. 2) .

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wir für ihre Sachbeihilfe, Herrn Prof. Dr. W. K L Y N E (Lon-don) und Herrn Dr. K . IRMSCHER für die Überlassung von Steroiden. Fräulein M. BRODESSER sei für die wir-kungsvolle Mitarbeit gedankt.

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