Gram Stain Main Approve

Fakultas Farmasi Universitas Surabaya LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

BAB I

PENDAHULUAN

Pewarnaan adalah teknik tambahan yang digunakan dalam teknik

mikroskopis untuk meningkatkan kejelasan gambar mikroskopis. Pewarnaan

banyak digunakan dalam bidang ilmiah untuk mengamati struktur biologis

spesimen, sel, jaringan dan lain-lain.

Pewarnaan yang paling banyak digunakan dalam mikrobiologi adalah

pewarnaan gram, ditemukan oleh ilmuan Denmark dan dokter Hans Christian

Joachim Gram pada tahun 1884. Pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan

diferensial yang membedakan bakteri ke dalam dua kelompok: Gram-positif dan

Gram-negatif. Prosedur ini didasarkan pada kemampuan mikroorganisme untuk

mempertahankan noda dari pewarna yang digunakan selama reaksi Pewarnaan

Gram. Bakteri gram-negatif terdekolorisasi oleh alkohol, sehingga warna ungu dari

pewarna pertama menghilang, Bakteri gram-positif tidak terdekolorisasi oleh

alkohol dan akan tetap berwarna ungu. Setelah tahap dekolorisasi, pewarna

tandingan (counterstain) digunakan untuk memberikan warna pink untuk

organisme gram-negatif yang terdekolorisasi.

1.1 Pentingnya Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram merupakan langkah awal yang sangat penting dalam

karakterisasi awal dan klasifikasi bakteri. Juga merupakan prosedur penting

dalam identifikasi bakteri berdasarkan karakteristik pewarnaan, yang

memungkinkan bakteri untuk diperiksa menggunakan mikroskop cahaya.

Bakteri berada dalam bentuk tidak terwarnai yang tidak terlihat bila dilihat

dengan menggunakan mikroskop cahaya. Setelah bernoda, morfologi dan

susunan bakteri dapat diamati juga. Selain itu, juga merupakan langkah

PEWARNAAN GRAM | 1


penting dalam penilaian agen infeksius dalam spesimen klinis seperti pap

langsung dari pasien.

Prosedur pewarnaan gram memungkinkan bakteri untuk

mempertahankan warna noda, berdasarkan perbedaan sifat kimia dan fisika

dari dinding sel.

a. Bakteri Gram positif: Noda ungu gelap karena mempertahankan

pewarna utama yaitu Crystal Violet di dinding sel.

Contoh: Staphylococcus aureus

Gambar 1-1 Bakteri Gram Positif

b. Bakteri gram negatif: Noda merah atau pink karena mempertahankan

pewarna tandingan (counterstain) yaitu Safranin.

Contoh: Escherichia coli

Gambar 1-2 Bakteri Gram Negatif

1.2 Morfologi Bakteri

Bakteri adalah mikroorganisme uniseluler yang sangat kecil di alam.

Bakteri memiliki ukuran mikrometer (1μm = 10-6 m). Mereka memiliki

dinding sel yang terdiri dari peptidoglikan dan berkembang biak dengan

pembelahan biner. Bakteri bervariasi dalam bentuk morfologi mereka.

1.2.1 Morfologi Bakteri Secara Umum

a. Coccus (Jamak: Cocci)

Bakteri bentuk bulat; mungkin terdapat berpasangan (diplococci),

dalam kelompok yang terdiri atas empat bakteri (tetracocci), dalam

PEWARNAAN GRAM | 2


kelompok seperti anggur (Staphylococcus), dalam rantai

(Streptococcus) atau dalam bentuk kubus delapan atau lebih

(sarcinae). Sebagai contoh: Staphylococcus aureus, Streptococcus

pyogenes.

b. Bacillus (Jamak: Basilli)

Bakteri bentuk batang, umumnya tunggal, tetapi kadang-kadang

dapat ditemukan berpasangan (diplo-basilli) atau rantai

(streptobacilli). Sebagai contoh: Bacillus cereus, Clostridium tetani

c. Spirillum (Jamak: Spirilla)

Bakteri bentuk spiral. Sebagai contoh: spirillum, vibrio, spesies

spirochete.

1.2.2 Bentuk lain dari Beberapa Bakteri

a. Coccobacilli: bentuk bulat memanjang atau bulat telur.

b. Filamen: Basil yang membentuk rantai panjang atau benang.

c. Fusiform: Basil Tahan yang memiliki ujung meruncing.

Gambar 1-3 Perbedaan Morfologi Bakteri

PEWARNAAN GRAM | 3


1.3 Ciri-ciri Bakteri

1.3.1 Bakteri Gram Negatif

a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 9–15 nm, berlapis tiga atau

multilayer.

b. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%),

peptidoglikan terdapat didalam

c. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat

kering, tidak mengandung asam tekoat.

d. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

e. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya

kristal violet.

f. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

g. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

h. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

i. Peka terhadap streptomisin

j. Toksin yang dibentuk Endotoksin

1.3.2 Bakteri Gram Positif

a. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 20-80 nm, berlapis tunggal atau

monolayer.

b. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),

peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama

merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

c. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

d. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu

kristal.

e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

f. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

g. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

h. Tidak peka terhadap streptomisin

i. Toksin yang dibentuk Eksotoksin dan Endotoksin

PEWARNAAN GRAM | 4


1.4 Mekanisme Pewarnaan Gram

1.4.1 Dinding Sel Bakteri Gram Positif

Bakteri Gram-positif memiliki dinding sel tebal yang terdiri dari

peptidoglikan (50-90% dari dinding sel), yang akan terwarnai ungu.

Peptidoglikan terutama polisakarida terdiri dari dua subunit yaitu N-asetil

glukosamin dan N-asetil asam muramic. Sebagai lapisan yang berdekatan

dimana peptidoglikan terbentuk, kedua polisakarida dihubungkan

bersinggungan satu sama lain oleh rantai pendek peptida dengan

menggunakan enzim transpeptidase, sehingga memberi bentuk dan

kekakuan dari dinding sel. Lapisan peptidoglikan yang tebal dari organisme

Gram-positif memungkinkan organisme ini untuk mempertahankan

kompleks kristal violet-iodine dan memberikan noda ungu pada sel.

Asam lipoteichoic (LTA) merupakan konstituen utama dari dinding

sel bakteri Gram-positif yang berada di lapisan peptidoglikan. LTA terdiri

dari asam teichoic yaitu rantai panjang ribitol fosfat yang menempel pada

lipid bilayer melalui sebuah gliserida. LTA bertindak sebagai pengatur

enzim yang dapat melisis dinding sel secara otomatis (muramidases:. Enzim

bakteri yang terletak di dinding sel yang menyebabkan disintegrasi sel

karena kerusakan atau kematian)

Gambar 1-4 Struktur Dinding Sel Bakteri Gram Positif

Relevansi medis dinding sel bakteri gram positif: LTA juga memiliki

sifat antigenic yang merangsang respon imun spesifik ketika dilepaskan dari

dinding sel setelah kematian sel. Kematian sel terutama karena lisis yang

disebabkan oleh kegiatan lysozym, peptida kationik dari leukosit, atau

antibiotik beta-laktam.

PEWARNAAN GRAM | 5


1.4.2 Dinding Sel Bakteri Gram Negatif

Bakteri Gram-negatif memiliki lapisan tipis dari peptidoglikan (10%

dari dinding sel) dan kehilangan kompleks kristal violet-iodine selama

dekolorisasi dengan bilasan alkohol, tapi mempertahankan pewarna

tandingan (counterstain) Safranin, sehingga muncul kemerahan atau merah

muda. Bakteri gram negatif juga memiliki membran luar tambahan yang

berisi lipid, yang terpisah dari dinding sel oleh ruang periplasmic.

Gambar 1-5 Struktur Dinding Sel Bakteri Gram Negatif

Relevansi medis dinding sel gram negatif: Dinding sel bakteri Gram-

negatif sering merupakan faktor virulensi yang memungkinkan bakteri

patogen menyebabkan penyakit. Virulensi bakteri Gram-negatif sering

dikaitkan dengan komponen-komponen tertentu dari dinding sel,

khususnya, lipopolisakarida (atau dikenal sebagai LPS atau endotoksin).

Pada manusia, LPS memicu respon imun bawaan yang ditandai oleh

produksi sitokin dan aktivasi sistem kekebalan tubuh. Peradangan terjadi

sebagai hasil produksi sitokin, yang juga dapat menghasilkan toksisitas tuan

rumah.

1.5 Reaksi Pewarnaan

Empat langkah dasar dalam pewarnaan gram, antara lain:

a. Perlakuan dengan pewarna primer Kristal Violet (CV) pada preparat

olesan kultur bakteri yang telah difiksasi

CV terdisosiasi dalam larutan menjadi CV+ dan Cl- ion. Kedua ion

kemudian menembus dinding sel dan membran sel baik sel Gram-positif

PEWARNAAN GRAM | 6


dan sel Gram-negatif. Ion CV+ kemudian berinteraksi dengan komponen

bakteri yang bermuatan negatif dan memberi noda ungu pada sel bakteri.

Crystal violet yang berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid

acid pada membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks

mg-Ribonucleid acid- crystal violet. Kompleks ini merupakan senyawa

yang tidak luntur dengan alkohol.

b. Penambahan Gram yodium.

Iodium (I- atau I3-) bertindak sebagai mordant dan sebagai agen

perangkap. Mordan adalah zat yang meningkatkan afinitas dinding sel

terhadap pewarna dengan mengikat pewarna primer, sehingga

membentuk sebuah kompleks yang tidak larut yang terjebak dalam

dinding sel. Dalam reaksi pewarnaan gram, kristal violet dan yodium

membentuk kompleks tidak larut (CV-I) yang berfungsi untuk

mengubah preparat menjadi berwarna ungu gelap. Pada tahap ini,

semua sel akan berubah ungu.

Lugol’s lodin yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada

kompleks mg-Ribonuclead acid.

c. Dekolorisasi dengan alkohol 96%

Alkohol atau aseton melarutkan lipid membran luar bakteri Gram

negatif, sehingga meninggalkan lapisan peptidoglikan terbuka dan

meningkatkan porositas dinding sel. CV-I kompleks kemudian larut

dari lapisan tipis peptidoglikan, menyebabkan bakteri Gram negatif

tidak berwarna.

Di sisi lain, alkohol memiliki efek dehidrasi pada dinding sel

bakteri Gram positif yang menyebabkan pori-pori dinding sel

menyusut. CV-I kompleks akan terikat erat ke dalam lapisan multi

layer, sehingga dinding sel bakteri gram positif berwarna ungu.

Langkah dekolorisasi harus dilakukan dengan hati-hati, jika tidak

over-dekolorisasi mungkin terjadi. Langkah ini sangat penting dan

harus diatur dengan benar jika tidak noda kristal violet akan terhapus

dari sel Gram-positif. Jika agen decolorizing diberikan pada sel untuk

waktu yang terlalu lama, organisme Gram-positif akan menjadi Gram-

PEWARNAAN GRAM | 7


negatif. Under-dekolorisasi terjadi ketika alkohol tidak diberikan cukup

lama untuk mencuci kompleks CV-I dari sel Gram-negatif, sehingga

bakteri Gram-negatif akan tampak menjadi Gram-positif.

d. Pewarna tandingan (counterstain) dengan Safranin

Pewarna tandingan (counterstain) yang cocok, yang biasanya

bermuatan positif safranin, yang akan memberi warna merah atau merah

muda. Warna merah muda yang melekat pada bakteri Gram positif

tertutup oleh ungu violet dari kristal (Basic fuschin kadang-kadang

digunakan sebagai pengganti safranin dalam situasi langka).

Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya

kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri

gram negatif (Pelczar, 2007).

Gambar 1-6 Teknik Pewarnaan Gram

PEWARNAAN GRAM | 8


BAB II

METODE KERJA

2.1 Waktu dan Tempat

Hari/ Tanggal : Rabu/ 19 Maret 2014

Tempat : Laboratorium Mikrobiologi

Fakultas Farmasi Universitas Surabaya

2.2 Bakteri Uji

kultur agar miring mikroorganisme berusia 18 sampai 24 jam:

a. Staphylococcus aureus

b. Bacillus subtilis

c. Escherichia coli

2.3 Peralatan

a. Kaca obyek

b. Kawat inokulasi (ose)

c. Api spiritus

d. Microskop

e. Kertas lensa

f. Minyak imersi

g. Aqua sterile

h. Air Keran

i. Alkohol 70%

j. Tissue

k. Bak penampung

l. Penjepit Kayu

m. Tabung Reaksi

PEWARNAAN GRAM | 9


2.4 Reagen

a. Pewarna primer (Gram I) : Larutan karbolgentian violet

b. Mordant (Gram II) : Larutan lugol

c. Decolourizer (Gram III) : Larutan alkohol 96%

d. Pewarna sekunder (Gram IV) : Larutan Safranin

(Pewarna Tandingan)

2.5 Prosedur Kerja

2.5.1 Persiapan Kaca Obyek

Kaca objek yang akan digunakan untuk pewarnaan gram harus

dibebas lemakkan. Minyak dari jari-jari tangan atau sumber lain pada kaca

objek dihilangkan dengan mencuci kaca objek dengan sabun dan air.

Kemudian lap kaca objek dengan tissue yang terbasahi oleh alkohol 70%.

Setelah dibersihkan, keringkan kaca objek dan letakkan di atas tissue atau

alas lain sampai siap untuk digunakan.

2.5.2 Pelabelan Kaca Obyek

Kaca objek yang siap digunakan, diberi label dengan inisial nama

organisme uji di tepi ujung kaca objek.

a. Staphylococcus aureus : S.A

b. Bacillus subtilis : B.S

c. Escherichia coli : E.C

2.5.3 Pembuatan Preparat Olesan Bakteri Untuk Pewarnaan*

Ambil beberapa ose aqua sterile secara aseptis, kemudian dengan

jarum ose letakkan di tengah-tengah kaca obyek (Posisi jarum ose

horizontal). Ambil satu ose bakteri yang akan dilakukan pewarnaan,

kemudian dengan jarum ose suspensikan ke dalam larutan aqua sterile dan

sebarkan secara merata dari tengah-tengah kaca obyek ke arah luas.

PEWARNAAN GRAM | 10


* Catatan : Hal ini sangat penting untuk tidak membuat preparat yang tebal,

preparat yang tebal mengandung kelebihan dari sampel bakteri.

Preparat yang tebal mengurangi jumlah cahaya yang dapat

melewati preparat, sehingga sulit untuk memvisualisasi

morfologi dari sel tunggal. Preparat sampel bakteri biasanya

hanya membutuhkan sejumlah kecil kultur bakteri. Preparat

yang efektif muncul sebagai lapisan tipis keputih-putihan

setelah difiksasi.

2.5.4 Fiksasi Dengan Pemanasan*

Fiksasi dengan pemanasan membunuh bakteri dalam preparat,

melekatkan bakteri pada kaca objek, dan memungkinkan sampel untuk lebih

muda mengabsorbsi warna.

a. Biarkan olesan bakteri kering di udara, jangan dikeringkan dengan

pemanasan. Bila perlu pengeringan cepat, lewatkan preparat di atas

api spiritus pada ketinggian ± 33 cm di atas api spiritus;

b. Lakukan fiksasi, dengan cara melewatkan olesan yang telah kering

tersebut di atas api spiritus 2-3 kali (bagian yang ada olesan bakteri

menghadap ke atas).

*Catatan : Jaga jangan sampai terjadi overheating pada kaca objek karena

protein dalam sampel bakteri dapat terkoagulasi sehingga

menyebabkan morfologi selular terlihat terdistorsi.

2.5.5 Pewarnaan Gram

a. Tetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa

tetes larutan karbolgentian violet (Gram I), biarkan selama 20 detik.

Bilas dengan air;

b. Tetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes. Biarkan

selama satu menit. Bilas dengan air;

c. Cuci (dekolorisasi) dengan larutan alkohol 96% (Gram III) dengan

cara memiringkan preparat kemudian tetesi perlahan-lahan dengan

Gram III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan;

PEWARNAAN GRAM | 11


d. Bilas preparat secara hati-hati dengan air;

e. Tetesi preparat dengan larutan fuchsin/ safranin (Gram IV) beberapa

tetes, diamkan selama 20 detik;

f. Bilas preparat dengan air. Kemudian keringkan di udara atau dengan

cara menyerap kelebihan air dengan tissue;

g. Amati preparat di mikroskop. Gambar sel-sel dan reaksi gram yang

terlihat pada mikroskop perbesalan 1000 X.

2.6 Skema Kerja

2.6.1 Pembuatan Preparat Olesan Bakteri dan Fiksasi

2.6.2 Pewarnaan Gram

Tetesei dengan Gram I; 20 detik Cuci selama 2 detik

1 2

1 2

4 3

PEWARNAAN GRAM | 12


2.6.3 Pengamatan Mikroskopis

Cuci selama 2 detik Tetesi dengan Gram II; 1 menit

Dekolorisasi dengan Gram III; 10-20 detik Cuci selama 2 detik

Tetesi dengan Gram IV ; 20 detik Cuci selama 2 detik

Keringkan menggunakan tissue

4 3

5 6

8 7

9

PEWARNAAN GRAM | 13


BAB III

HASIL PRAKTIKUM

Tabel 3-1 Gambar sel-sel Staphylococcus aureus (1000 X)

Tabel 3-2 Gambar sel-sel Bacillus subtilis (1000 X)

Bentuk Bakteri

Bulat (Cocci)

Warna Sel

Ungu

Sel termasuk GRAM

Gram Positif

Bentuk Bakteri

Batang (Bacilli)

Warna Sel

Ungu Gelap

Sel termasuk GRAM

Gram Positif

PEWARNAAN GRAM | 14


Tabel 3-3 Gambar sel-sel Escherichia coli (1000 X)

Bentuk Bakteri

Coccobacillus

Warna Sel

Merah

Sel termasuk GRAM

Gram Negatif

PEWARNAAN GRAM | 15


BAB IV

PEMBAHASAN

Pewarnaan gram ini bertujuan untuk melihat bakteri bersifat gram positif

atau negatif berdasarkan sifat biokimia dan perbedaan dinding sel (tebal atau

tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak

pada membran sel) dari bakteri. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen

yaitu :

a. Zat warna utama (violet kristal)

b. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk

mengintensifkan warna utama.

c. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang

digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

d. Zat warna kedua / warna tandingan (safranin) digunakan untuk mewarnai

kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama utama setelah

perlakuan denga alcohol.

Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram

positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan

membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis

yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu

lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat

diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki

selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan

kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol

sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009). Sel bakteri gram

positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.

PEWARNAAN GRAM | 16


Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu

pendek (Fitria, 2009).

Penambahan Kristal violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen

yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang

akan memberi warna pada mikroorganisme uji. Kristal violet bersifat basa sehingga

mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan

perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna

(ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan

warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada

bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri

gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam

persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan

didiamkan selama 20 detik bertujuan agar pewarna ini dapat melekat sempurna

pada dinding sel bakteri.

Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu

pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme

uji atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pewarnaan Gram

dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks

zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram

positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif

dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan

didiamkan selama satu menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi

semakin lebih kuat.

Selanjutnya, didekolorisasi dengan alkohol 96% diteteskan di atas objek

glass tersebut selama 10-20 detik (tidak ada warna yang terlunturkan). Setelah

itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 96% merupakan

solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan

kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna

dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat

mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding

PEWARNAAN GRAM | 17


sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol

pada pewarnaan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu

mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak

berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga

memperbesar permeabilitas dinding sel.

Selanjutnya diteteskan beberapa tetes safranin di atas kaca objek tersebut

kemudian didiamkan selama . Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga

warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder.

Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna

utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan

warna pada mikroorganisme yang tidak berwarna setelah proses dekolorisasi.

Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna

merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding

selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes

dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk

sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna

lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut

dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena

itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama

sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan

terhadap kaca objek dengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk

mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir

pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan pengeringan sebentar agar

air tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah

pembilasan terakhir, kaca objek dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika

terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika

terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram

negatif.

PEWARNAAN GRAM | 18


Hasil praktikum menunjukkan bakteri Bacillus subtillis dan Staphylococcus

aureus tetap berwarna ungu sedangkan bakteri Eschericia coli menjadi berwarna

merah. Dari hasil pewarnaan gram, dapat diketahui bahwa Bacillus subtillis dan

Staphylococcus aureus digolongkan ke dalam Gram Positif dan bakteri Eschericia

coli digolongkan ke dalam Gram Negatif.

Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan Gram negatif disebabkan

oleh adanya perbedaan struktur pada dinding sel nya. Dinding bakteri Gram positif

banyak mengandung peptidoglikan sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak

mengandung lipopolisakarida. Kompleks kristal ungu-iodin yang masuk ke dalam

dinding sel bakteri Gram positif tidak dapat dicuci oleh alkohol karena adanya

lapisan peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel; sedangkan pada bakteri Gram

negatif, alkohol akan merusak lipopolisakarida. Kompleks kristal ungu-iodin yang

pada dinding sel bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri

tampak transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin.

Sebelum pengamatan dengan mikroskop, preparat di tetesi oleh oleum

emersi dahulu. Dari pengamatan yang terlihat bahwa Esterichia coli morfologinya

kokobasil, dan bentuk yang cenderung ke batang panjang. Bakteri ini ada yang

soliter, namun ada juga yang tampak bergerombol atau berpasangan.

Staphylococcus aureus morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini

umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur. Dan Bacillus

subtillis morfologinya basil, ada yang tebal dan yang tipis. Biasanya bentuk rantai atau

terpisah.

PEWARNAAN GRAM | 19


BAB V

KESIMPULAN

1. Bakteri uji yang termasuk ke dalam kelompok Bakteri Gram Positif adalah

Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis karena memberikan warna ungu

pada pada pewarnaan gram.

2. Bakteri uji yang termasuk kedalam kelompok Bakteri Gram Negatif adalah

Escherichia coli karena memberikan warna merah pada pewarnaan gram.

3. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan

warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna

tandingan.

4. Perbedaan pada gram negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada

gram positif berwarna ungu karena dapat mempertahankan zat pewarna

kristal violet sedangkan gram negatif berwarna merah karena pewarna

tandingan safranin serta perbedaan terjadi pada dinding selnya.

PEWARNAAN GRAM | 20

Documents

Gram Stain Main Approve