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Microbiologia
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7/21/2019 Guia de M.A.
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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAOFACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y DE RECURSOS NATURALES
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO
FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y DE RECURSOS
NATURALES
GUÍA DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
CARLOS ODORICO TOME RAMOS
Biólogo con mención en Microiolog!" # $"r"%i&olog!"
C"ll"o'()*+'Per,
Blgo. Carlos Tome Ramos2
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INTRODUCCI-N
En el curso de Microbiología General el alumno aprende a realizar los trabajo básicos en un
laboratorio de Microbiología; para el curso de Microbiología Ambiental debe aprender
algunos análisis microbiológicos, sobre todo los análisis que le permita determinar
contaminación de una muestra determinada; para ello con la finalidad de facilitar ste
aprendizaje es que se presenta sta guía de prácticas, donde se !a considerado los diferentes
mtodos de laboratorio para el análisis microbiológicos, tales como el recuento de aerobios en
placa "A#$% & el de coliformes sea con los mtodos con'encionales como los mtodos
rápidos, &a que son los parámetros frecuentemente requeridos para determinar la
contaminación de una muestras del ambiente(
Esperando cumplir con el objeti'o trazado, dejamos a disposición de los interesados sta obra(
Blgo. Carlos Tome Ramos)
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PRACTICA N. *
COMPOSTA/E
I0' In&ro12cción3
El com$o%&, com$o%&"4e, com$o%& o "ono org5nico es el producto que se obtiene decompuestos que forman o formaron parte de seres 'i'os en un conjunto de productos de origen
animal & 'egetal; constitu&e un *grado medio+ de descomposición de la materia orgánica que
&a es en sí un magnífico abono orgánico para la tierra, logrando reducir enormemente la
basura( e denomina !umus al *grado superior+ de descomposición de la materia orgánica( El
!umus supera al compost en cuanto abono, siendo ambos orgánicos(
El compostaje se forma de desec!os orgánicos como- restos de comida, frutas & 'erduras,
aserrín, cáscaras de !ue'o, restos de caf, trozos de madera, poda de jardín "ramas, csped,
!ojas, raíces, ptalos, etc(%( .a materia orgánica se descompone por 'ía aeróbica o por
'ía anaeróbica( .lamamos *compostaje+ al ciclo aeróbico "con alta presencia de o/ígeno% dedescomposición de la materia orgánica( .lamamos *metanización+ al ciclo anaeróbico "con
nula o mu& poca presencia de o/ígeno% de descomposición de la materia orgánica(
El compost es obtenido de manera natural por descomposición aeróbica "con o/ígeno% de
residuos orgánicos como restos 'egetales, animales, e/crementos & purines "parte líquida
altamente contaminante que rezuma de todo tipo de estircoles animales%, por medio de la
reproducción masi'a de bacterias aeróbicas termófilas que están presentes en forma natural en
cualquier lugar "posteriormente, la fermentación la contin0an otras especies de
bacterias, !ongos & actinomicetos%( 1ormalmente, se trata de e'itar "en lo posible% la
putrefacción de los residuos orgánicos "por e/ceso de agua, que impide la aireación
o/igenación & crea condiciones biológicas anaeróbicas malolientes%, aunque ciertos procesos
industriales de compostaje usan la putrefacción por bacterias anaerobias(
Agen&e% 1e l" 1e%com$o%ición- .a construcción de pilas o silos para el compostaje tiene
como objeti'o la generación de un entorno apropiado para el ecosistema de descomposición(
El entorno no solo mantiene a los agentes de la descomposición, sino tambin a otros que se
alimentan de ellos( .os residuos de todos ellos pasan a formar parte del compost(
Microscópicos- .os agentes más efecti'os de la descomposición son las bacterias &
otros microorganismos( .os microorganismos eficientes son un conjunto de bacterias "caldomicrobiano% que unidas producen a temperaturas fa'orables un apro'ec!amiento de los
componentes de la materia a compostar para optimizar el proceso de compostaje( 3ambin
desempe4an un importante papel los !ongos, protozoos & actinobacterias "o actinomicetos,
aquellas que se obser'an en forma de filamentos blancos en la materia en descomposición%(
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Macroscópicos- 6a a ni'el macroscópico se encuentran las lombrices de
tierra, !ormigas, caracoles, babosas, milpis, coc!inillas, etc(, que consumen & degradan la
materia orgánica(
II0' Me&o1olog!"3
E/isten 'ariadas tcnicas de compostaje, las que se ajustan a diferentes necesidades; la
elección de una tcnica u otra depende, entre otras cosas, de la cantidad & tipo de material a
procesar, in'ersión disponible & disponibilidad de terreno, complejidad operacional & del
producto final que se quiere obtener( .os distintos sistemas están determinados por los
mecanismos de aireación que se utilizan en el proceso, generalmente los podemos agrupar en-
aireación pasi'a, aireación forzada, & aireación por 'olteos del material(
• Com$o%&"4e en $il"% e%&5&ic"%- se forman pilas, en un bote o caja metálica grande
"mínimo 7 m), má/imo 7(8 m)% con tapa, colocando una capa gruesa "apro/imadamente 9
cm% de aserrín o tierra & se deja sin mo'imiento, se 'ierte a!í todos los desec!os orgánicos& se cubren con otra capa de tierra, para que se mantenga la !umedad se rocía con un poco
de agua que resulta indispensable & se espol'orea con cal para e'itar malos olores(
3ermina 'entilándose naturalmente por un proceso de con'ección trmica natural( En este
procedimiento no se tiene temperatura, los procesos son los naturales a temperatura
ambiente(
• Com$o%&"4e en $il"% e%&5&ic"% "ire"1"%- consiste en airear de manera forzada la
materia que se está compostando( .a pila se constru&e sobre una red de tuberías, donde se
suministra o e/trae aire frecuentemente para proporcionar un medio aeróbico( Esta tcnica
es conocida tambin como tcnica acti'a o caliente- se controla la temperatura para permitir el desarrollo de las bacterias más acti'as, matar la ma&oría de patógenos &
grmenes, & así producir compost 0til de forma rápida(• Com$o%&"4e en $il"% 1e 6ol&eo- este sistema de compostaje es el más utilizado, & se
realiza mediante un 'olteo manual o mecánico( En este mtodo se amontona el material, se
mezcla & 'oltea periódicamente, e'itando así la compactación & entregando o/ígeno al
sistema(
.a ma&oría de plantas industriales & comerciales de compostaje utilizan procesos acti'os,
porque garantizan productos de mejor calidad en un plazo menor( El ma&or grado de control &, por tanto, la ma&or calidad, suele conseguirse compostando en un recipiente cerrado con un
control & ajuste continuo de temperatura, flujo de aire & !umedad, entre otros parámetros(
El compostaje casero es más 'ariado, fluctuando entre tcnicas e/tremadamente pasi'as !asta
tcnicas acti'as propias de una industria( #ara ello se escoge un lugar al aire libre &a sea
$"&io o 4"r1!n de preferencia lejos de la casa o la cocina, le debe dar el sol & la sombra
Blgo. Carlos Tome Ramos8
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durante el día( $ada 'ez que se integren nue'os desec!os orgánicos a la composta o una 'ez a
la semana se re'uel'e todo con una 'arilla, este paso es mu& importante para 'entilar los
materiales( En tres o cuatro semanas se obser'ará que es difícil distinguir lo que se fue
depositando a e/cepción de los desperdicios más recientes( e pueden utilizar
productos desodorantes, aunque una pila bien mantenida raramente produce malos olores(:espus de cuatro meses se con'ertirá en !umus "nombre 'egetal de la 3ierra que se forma
por la descomposición de la materia orgánica% & esto resulta en un "ono estupendo con 'ida,
con una gran densidad & 'ariedad de microorganismos que
sintetizan enzimas, 'itaminas, !ormonas, etc( & que repercuten fa'orablemente en el equilibrio
biótico del suelo(
III0' E&"$"% iológic"% 1el com$o%&"4e
En una pila de compostaje !a& ) grupos principales de organismos-
• $onsumidores primarios• $onsumidores secundarios
• $onsumidores terciarios
En un gramo de compost !a& más de 7 millones de consumidores primarios o micro
organismos, la ma&or parte son bacterias, que generan calor como producto de su trabajo & se
clasifican de acuerdo al rango de temperatura en el que operan-
#sicrofílicas- Entre 7<=$ & 7<= $( " & 95 =>%
Mesofílicas- Entre 8= $ & 5)=$ "57 & 7?= >%3ermofílicas- Entre 5 & ?)= $ "75 & 2 =>%
.o deseable es alcanzar en la pila condiciones 3ermofílicas "arriba de los 5= $%, porque esas
bacterias son las que trabajan más rápido & !a& otros microorganismos que solo trabajan a esas
temperaturas, además se destru&en microbios patógenos & malezas( Entre los consumidores
primarios tambin están los actinomicetos que son los que dan al compost un agradable olor a
tierra, los !ongos & los gusanos que agregan material 'alioso al compost & la porosidad creada
contribu&e a la aireación del mismo( $uando !a& poco aire & muc!a !umedad se genera otro
tipo de bacterias, las anaeróbicas, que son las causantes de los malos olores(
.os consumidores secundarios consumen a otros organismos, manteniendo bajo control a
dic!as poblaciones, los nematodos por ejemplo se alimentan de bacterias, protozoarios,
esporas de !ongos & entre sí(
.os consumidores terciarios se alimentan principalmente de consumidores secundarios, por
ejemplo unas ara4as que solo se dedican a comer artrópodos sin tejer telara4as, los ciempis
Blgo. Carlos Tome Ramos9
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que comen in'ertebrados a0n más grandes que ellos & escarabajos que se alimentan de
semillas & otro material 'egetal(
IV0' P"r5me&ro% 1el $roce%o 1e com$o%&"4e
72me1"1( @na pila de compost efecti'a debe tener una !umedad entre el 5 & el 9( Ese
grado de !umedad es suficiente para que e/ista 'ida en la pila de compost & las bacterias
puedan realizar su función( .as bacterias & otros microorganismos se clasifican en grupos en
función de cuál es su temperatura ideal & cuánto calor generan en su metabolismo( .as
bacterias mesofílicas requieren temperaturas moderadas, entre 2 & 5 B$( $onforme
descomponen la materia orgánica generan calor( .ógicamente, es la zona interna de la pila la
que más se calienta( .as pilas de compost deben tener, al menos, 7 m de anc!o por 7 m de alto
& la longitud que sea posible( Así se consigue que el propio material aísle el calor generado(
Ca& sistemas que permiten pilas muc!o más anc!as & más altas( Así se puede !acer compost
de una tonelada de residuos en un metro cuadrado( .a aireación pasi'a se ejecuta por medio de
un piso falso( 3ampoco necesita el re'oloteo del material en degradación(
Tem$er"&2r"( .a temperatura ideal está alrededor de los 9 B$( Así la ma&oría de patógenos
& semillas indeseadas mueren a la par que se genera un ambiente ideal para las bacterias
termofílicas, que son los agentes más rápidos de la descomposición( :e !ec!o, el centro de la
pila debería estar caliente "tanto como para llegar a quemar al tocarlo con la mano%( i esto no
sucede, puede estar pasando alguna de las siguientes cosas-
• Ca& demasiada !umedad en la pila por lo que se reduce la cantidad
de o/ígeno disponible para las bacterias(
• .a pila está mu& seca & las bacterias no disponen de la !umedad necesaria para 'i'ir &
reproducirse(
• 1o !a& suficientes proteínas "material rico en nitrógeno%(
.a solución suele pasar por la adición de material o el 'olteo de la pila para que se airee(
:ependiendo del ritmo de producción de compost deseado, la pila puede ser 'olteada más
'eces para lle'ar a la zona interna el material de las capas e/ternas & 'ice'ersa, a la 'ez que se
airea la mezcla( .a adición de agua puede !acerse en ese mismo momento, contribu&endo a
mantener un ni'el correcto de !umedad( @n indicador de que !a llegado el momento del'olteo es el descenso de la temperatura debido a que las bacterias del centro de la pila "las más
acti'as% !an consumido toda su fuente de alimentación( .lega un momento en que la
temperatura deja de subir incluso inmediatamente despus de que la pila !a&a sido remo'ida(
Eso indica que &a no es necesario 'oltearla más( >inalmente todo el material será !omogneo,
de un color oscuro & sin ning0n parecido con el producto inicial( Entonces está listo para ser
Blgo. Carlos Tome RamosD
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usado( Ca& quien prefiere alargar la maduración durante incluso un a4o más, &a que, aunque
no está demostrado, puede que los beneficios del compost así producido sean más duraderos(
N2&rien&e%- #ara el crecimiento microbiano en la pila de compost, es necesario que !a&a un
balance entre carbono & nitrógeno que son los macronutrientes más importantes, los materiales
ricos en carbono son color caf & seco & los ricos en nitrógeno son 'erdes & !0medos( .osmicronutrientes son el manganeso, cobre, magnesio & cobalto & !a& una categoría intermedia
entre micro & macro nutrientes donde están el fósforo, potasio & calcio( .os microbios usan el
carbono para su o/idación metabólica, parte lo con'ierten en bió/ido de carbono & parte lo
combinan con nitrógeno para sus clulas, cuando el carbono está en lignina o celulosa cuesta
biodegradarlo & !a& que reciclarlo 'arias 'eces( $uando el carbono se quema es cuando se
ele'a la temperatura de la pila & a eso se debe que se reduzca el 'olumen de la pila durante el
compostaje( El nitrógeno es necesario para el crecimiento de las clulas, cuando !a& e/ceso
del mismo se libera como amoniaco & cuando !a& escasez se retarda el compostaje( .a
relación óptima es de *8 " 9) $"r&e% 1e c"rono $or 2n" 1e ni&rógeno, cuando esta relaciónes ma&or se retarda el compostaje & se genera un olor desagradable, pero si la relación es
menor, los microorganismos se terminan el carbono & dejan ir el nitrógeno como amoniaco(
Garantizar esta relación puede ser difícil en la práctica( .as relaciones de carbono nitrógeno
para algunos desec!os son las siguientes-
EF:@ E.A$FH1 $I1
Aserrín 28
$aballo "e/cremento% 28Gallinaza 78
Grama 7278
rina (<
#aja 72<78
#apas "cáscaras% 28
angre )
Jacas "e/cremento% 7<
Jegetales "sin leguminosas% 7772
El resto de nutrientes suele estar presente en las concentraciones adecuadas(
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Fórmula para calcular el balance de carbono de la Carga:
$KL"A(A($ANO(O($O%I 7
$KL $arbono en la carga total "Pg(%
AL #eso del estircol o aserrín
AL en peso de sólidos totales del estircol o aserrín
$AL de carbono en peso seco del estircol o aserrín
OL #eso del residuo de gras
OL en peso de sólidos totales del gras
$OL de carbono en peso seco del gras
Fórmula para calcular el balance de nitrógeno de la carga:
1KL "A(A(1ANO(O(1O%I7 1KL 1itrógeno de la carga total "Pg(%
1AL de nitrógeno en peso seco del estircol o aserrín
1OL de nitrógeno del gras
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PRACTICA N. (
TOMA Y 7OMOGENEI:ACI-N DE LA MUESTRA PARA AN;LISIS
MICROBIOL-GICO
I< In&ro12cción3
.a toma de muestra & su procesamiento adecuado, para realizar un análisis microbiológico
en el laboratorio, es de 'ital importancia para asegurar un resultado 'álido & confiable, de
tal manera que nos permita tomar decisiones( En esta primera práctica de laboratorio del
curso de microbiología ambiental, el alumno debe tener en cuenta las consideraciones
necesarias para asegurar una buena toma de muestra para su respecti'o análisis
microbiológico(
II< Me&o1olog!"3
#ara realizar una buena toma de muestra para análisis microbiológico se debe tener en
cuenta los siguientes lineamientos-
7(.a toma de muestra debe ser en forma asptica(
2( .a muestra debe ser estadísticamente representati'a(
)( .os en'ases de muestreo deben presentar las siguientes características-
• .impios & secos• A prueba de fugas
• Ooca anc!a
• 3ama4o adecuado para la muestra
• $ierre !ermtico
• Estriles
5( iempre que sea posible debe e'itarse el uso de en'ases de 'idrio
8( :ebe tenerse estricto cuidado de no sobresaturar las bolsas(
9( 3odos los instrumentos de muestreo deben estar estriles(
D( iempre que sea posible obtener por lo menos 7 gr( de cada unidad muestreada
<( Fdentificar cada unidad de muestra con una tira de cinta ad!esi'a
?( El transporte de la muestra, en lo posible, debe ser en sus en'ases originales(
Blgo. Carlos Tome Ramos7
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7( .as muestras deben ser entregadas al laboratorio inmediatamente, junto con las
condiciones de almacenamiento original(
E$E#$FH1 :E .A M@E3A- Kuien recepciona la muestra debe tener en cuenta lo
siguiente-
• $ondiciones físicas generales del en'ase
• Etiquetado & registro(
• Almacenamiento- Muestras congeladas a Q2 B$, muestras perecibles- entre a
5B$ , pero no más de )9 !oras(
#$EAMFE13 :E .A M@E3A-
• Emplear la tcnica asptica para manipular el producto(
• Mezcla- @sar 8gr( de muestra & despus a4adir 58 ml( de agua para dilución
"7-7%, !omogeneizar & preparar las diluciones siguientes "7-7, 7-7, etc(% para
los análisis microbiológicos correspondientes(
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P R A C T I C A N. 9
RECUENTO EN PLACA DE AEROBIOS =APC<
INTRODUCCI-N3
El recuento en placas de aerobios es uno de los mtodos que nos permite determinar la
calidad !iginica de una muestra, &a que está destinado a indicar el ni'el de
microorganismos en un producto( El rango óptimo para realizar el recuento de colonias es
de 28 a 28(
MATERIALES Y M>TODOS-
• Agar para recuento en placa(
• Oa4o maría
• Ootellas para dilución estriles(
• $ontador de colonias en registrador de recuento(
• :ilu&ente
• Fncubadora(
• #ipetas de 7,8 & 7 ml( estriles(
• #lacas Estriles
• efrigeradora
• 3ermómetro & #! metro(
METODOLOGÍA-
7% ealizar la primera dilución 7 Q 7 agregando 7 ml de muestra a ? ml de dilu&ente(
.as diluciones siguientes "7 2, 7 8, etc(% se efectuará transfiriendo 7 ml( de la
dilución anterior a un tubo con ? ml( de dilu&ente(
2% embrar 7 ml de cada dilución, por duplicado, por el mtodo de difusión("Fncorporación de medio%
)% Mezclar las diluciones de la muestra con el medio de agar en forma completa &
uniforme, mediante una rotación & mo'iendo las placas de atrás !acia delante de modo
alternado, sobre una superficie plana(
5% :ejar que el agar se solidifique e incubar a )8=$ / 5< !oras( "Jer fig( 7%
Blgo. Carlos Tome Ramos72
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Fig2r" *0' @n recuento en placa es una medida directa & proporciona un recuento de 'iables( En primer lugar, lamuestra se dilu&e seriadamente, transfiriendo 7 ml de la muestra a ? ml de medio estril & se mezclanadecuadamente( Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo, 7-7 "7 8%(#osteriormente se a4ade ,7 ml a una placa de agar nutriti'o, bien e/tendindolo en la superficie de la misma"mtodo de e/tensión en placa% o mezclándolo con el medio "mtodo de 'ertido en placa%( .as placas se incuban
& se recuentan las colonias que se desarrollan( :ebido a razones estadísticas, las placas deben contener entre ) &) colonias( En este ejemplo, la placa tiene 228 colonias(
Blgo. Carlos Tome Ramos7)
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LINEAMIENTO PARA EL C;LCULO =Seg,n l" FDA<(
7( #lacas 1ormales "28 Q 28%
$alcular el A#$ de la siguiente manera- 1 L R $ ( (
S"7 / ni% N "(7 / n2%T / "d%
:onde-
1 L 10mero de colonia por ml o gramo del producto(
R $ L uma de todas las colonias en todas las placas contadas(
ni L 10mero de placas en la primera dilución contada(
n2 L 10mero de placas en la segunda dilución contada(
d L :ilución de la cual se obtu'o los primeros recuentos(
Ejemplo-
7- 7 7- 7
2)2, 255 )), 2<
1 L "2)2 N 255 N )) N 2<% L 8)D L 25,5? ≅ 25,
S"7 / 2% N "(7 / 2%T / 72 (22 egistrar en 2 dígitos
2( 3odas las placas con menos de 28 u(f(c( "unidades formadoras de colonias%
egistrar como- U 28 / 7Id; :onde d es la primera dilución
Ejemplo- 7- 7 7- 7
7< 2
Blgo. Carlos Tome Ramos75
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28 / 7I 72 ≤ 28 u(f(c( I ml
U 28 ufc I ml "gr%
)( 3odas las placas con mas de 28 u(f(c "peso U 7I cm2%
Ejemplo- 7- 7 7- 7
:1$ 95 95( EA#$ I ml "gr%
5( 3odas las placas con un promedio ma&or a 7 u(f(c( Icm2
eportar- 7 / 7Id / área de la placa;
:onde- d es la disolución más alta
Ejemplos- #romedio de 77 colonias Icm2 $on área de la placa 98 cm2
eportar- 7 / 7I 7) / 98 V 98 / 78 EA#$
Blgo. Carlos Tome Ramos78
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P R A C T I C A N. +
M?TODO SIMPLATE PARA DOSIS M@LTIPLES DE RP7
INTRODUCCI-N3
El mtodo im#late para #C se usa para la cuantificación de recuentos de plaquetas
!eterotróficas "#C% en agua( e basa en la tecnología de enzimas m0ltiples de F:E
"Multiple Enz&me 3ec!nolog&W% patentado, que detecta bacterias 'iables en el agua
comprobando la presencia de enzimas cla'e que se sabe e/isten en esos organismos( e 'ale
de sustratos de enzimas m0ltiples que producen una fluorescencia azul al ser metabolizados
por la bacteria que se encuentra en el agua( .a muestra & el medio se a4aden a una placa
im#late, se incuban & luego se e/aminan para determinar la presencia de pocillos
fluorescentes( El n0mero de pocillos fluorescentes de la placa corresponde al 10mero Más
#robable "1M#% de bacteria total en la muestra original( .os 'alores 1M# generados por el
mtodo im#late para #C se correlacionan con el mtodo #our #late utilizando Agar de
recuento de plaquetas totales incubadas a )8B$ durante 5< !oras como se describe en Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater , 7?t! edition " Métodos Estándar para
el Análisis de Agua y Agua de Desecho%(
MATERIAL Y M>TODO37( Cidrate el medio llenando el en'ase para medio !asta la marca de 7 m. con dilu&ente
esterilizado "p( ej( agua declorinada, agua desionizada, tampón de fosfato o ,7 peptona%,
coloque la tapa & agite para disol'er( Jea la imagen 1= 7(
2( #ipetee 7 m. de muestra & luego ? m. de medio re !idratado en el centro de la base de la
placa im#late( Jea la imagen 1 2(
)( $ubra la placa con la tapa & agite sua'emente para distribuir la muestra en todos los
pocillos( Jea la imagen 1 )(
NOA! las burbujas de aire en los pocillos no interfieren con la muestra
5( $oloque la placa en un ángulo de ?B a 72B para 'erter el e/ceso en el pa4o absorbente(
Jea la imagen 1 5(
8( Fn'ierta la placa e incube durante 5< !oras a )8 X ,8B$( Jea la imagen 1 8(
Blgo. Carlos Tome Ramos79
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9( $uente el n0mero de pocillos que tienen fluorescencia- sujete una bombilla de 9 Yats,
)98nm, de luz @J a una distancia de 72(8 cm por encima de la placa( Apunte la bombilla !acia
la muestra( Alternati'amente, usted puede leer los pozos fluorescentes a tra's de la parte
posterior de la base in'ertida del im#late(
D( $onsulte la tabla de 1M# "M#1% proporcionada para determinar el n0mero más probable
de bacteria de recuento de plaqueta !eterotrófica en la muestra original( .a tabla tiene en
cuenta la muestraImedio eliminado en el paso 5(
*
( 9
+
Fig0 N.* Proce1imen&o 1e $r2e"
Blgo. Carlos Tome Ramos7D
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PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD
El siguiente procedimiento se recomienda para cada lote de placas im#late para #C o con
ma&or frecuencia seg0n lo establezcan los reglamentos-
7( iga el *#rocedimiento de prueba+, arriba citada, usando 7 m. de medio re!idratado & sin
muestra(
2( 1ing0n pozo debe mostrar fluorescencia despus de la incubación(
RECOMENDACIONES
7( #roceda con tcnica asptica(
2( .as muestras clorinadas se deben tratar con tiosulfato de sodio antes de !acer la prueba(
)( .os resultados se pueden leer desde 58 !asta D2 !oras despus de iniciada la incubación(
5( efrigere el medio no utilizado & descarte si no lo usa al cabo de 8 días(8( Elimine la muestra & el medio siguiendo buenas prácticas de laboratorio(
9( e pueden utilizar muestras más peque4as siempre que el 'olumen final "muestra más
medio !idratado% sea 7 X ,2 m.( Ajuste el 1M# para reflejar las diluciones( #or ejemplo, si
se ponen a prueba 7 m. de muestra & ? m. de dilu&ente estril "dilución de 7-7%, multiplique
el n0mero de la tabla de 1M# por 7 para encontrar el 1M#Im. correcto(
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PRACTICA N.
M>TODO CONVENCIONAL PARA LA DETERMINACI-N DE COLIFORMES Y
E0 Coli I3
PRUEBA PRESUNTIVA Y PRUEBA CONFIRMATIVA DE COLIFORMES TOTALES
INTRODUCCI-N
:eterminar la calidad !iginica sanitaria, &Io el grado de contaminación microbiana de
una muestra en particular, es de suma importancia para la pre'encion de enfermedades
transmisibles( #ara ello, se utilizan organismos indicadores de la contaminación bacteriana &
de la calidad !iginica a tra's de dos grupos bacterianos- $oliformes
Enterococos
Estos indicadores, seg0n Outtiau/ & Mossel, deben poseer las siguientes propiedades-
7( Cábitat específico del medio intestinal(
2( #resentes en gran cantidad en las !eces, para ser detectados en altas concentraciones(
)( esistentes a las condiciones ambientales e/traintestinales(
5( :etectables de forma fácil & completa(
E( coli & los coliformes son bacterias Gram negati'as "coliformes%, fermentadores de la lactosa
con producción de gas a )8=$ 5< !rs & a 55(8=$ "coliformes fecales & E( coli%(
MATERIALES Y M>TODOS3
Oa4o maría
Fncubadora
Oalanza
#ipetas estriles de
7 ml
>rascos de
muestreo estril
>rascos de
diluciones
$aldo 3riptosa
.auril ".3%
$aldo de Oilis
.actosa Jerde
Orillante "OG.O%
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$aldo E$
Agar EMO
$aldo 3riptano
$aldo M( @#
$aldo de $itrato
Agar #eptanado al
(7
eacti'o de Po'ac
eacti' de Joges
#ros Pouer
eacti'o para
3inción Gram
METODOLOGÍA
I0' PRUEBA PRESUNTIVA PARA DETECCI-N DE BACTERIAS COLIFORMES
TOTALES
7( A4adir 7 ml e muestra de agua a un frasco de dilución con ? ml de agua peptona al
(7, !omogeneizar(2( #reparar las siguientes diluciones a4adiendo 7 ml de la dilución 7-7 a un tubo con ?
ml de agua peptonada "72% & así sucesi'amente "7), 75, etc(%(
)( 3ransferir 7 ml de cada dilución a un juego de 8 tubos con 7 ml( del $aldo 3riptosa
.auril ulfato ".3%(
5( Fncubar a )8=$ por 25 a 5< !rs(
eportar como resultados positi'os la turbidez & presencia de gas en el 'ial de fermentación
"tubos :ur!am%( En caso de agua potable, leer como positi'o la presencia de turbidez(
II0' PRUEBA CONFIRMATIVA PARA DETECCI-N DE COLIFORMES TOTALES
7( :e los tubos positi'os del $aldo 3riptosa .auril ulfato ".3%, transferir un inóculo a
los tubos con 7 ml( de $aldo Oilis .actosa Jerde Orillante "OG.O%(
2( Fncubar a )8=$ por 25 a 5< !rs & proceder a reportar sus resultados(
)( $alcular el n0mero más probable "1M#% con la tabla(
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Fig2r" *0' El mtodo del n0mero más probable "1M#% proporciona un recuento de 'iables( Al aumentar el factor
de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo un organismo & los otros, ninguno( A
partir del n0mero, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesi'as "en este caso 8,
), 7%, puede determinarse el n0mero más probable de clulas estadísticamente "77,% en la primera de las tres
diluciones, mediante una tabla de n0meros más probables "3abla <(9%( Este 'alor, multiplicado por el factor de
dilución nos proporciona el n0mero de clulas 'iables de la muestra(
III0' DETERMINASCION DE COLIFORMES FECALES Y CONFIRMACI-N DE E0
Coli
II0' MATERIALES Y M>TODOS
7( Agitar sua'emente cada tubo de .3 que produce gas $2, puede usarse tambin
tubos de OG.O gas positi'o% & transferir una asada al tubo de caldo E$ e incubar a 55(8
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o 58(8=$ por 25 a 5< !rs( & proceder a realizar su lectura con la a&uda de la tabla del
1M#(
2( embrar por el mtodo del estriado a partir de cada tubo que produce gas sobre el agar
.EMO e incubar por 7< a 25 !rs a )8=$(
)( 3ransferir colonias sospec!osas de cada placa EMO "'er fig(% a caldos de culti'os para
realizar los estudios morfológicos & bioquímicas( Fncubar por 7< a 25 !rs a )8=$(
5( ealizar la tinción de Gram( E/aminar todos los culti'os que aparezcan como bacilos
cortos o cocos Gram negati'os para las siguientes pruebas bioquímicas(
Pro12cción 1e In1ol-
• Fnocular un tubo de $aldo 3riptona e incubar por 25 ± 2 !rs a )8=$(
• :etectar la presencia de Fndol a4adiendo (2 Q () ml de eacti'o de Po'ac(
• .a aparición de un color rojo en la capa superior, significa que el resultado de
prueba es positi'o(
Voge% Pro%"2er =VP<-
• #roducción del A$E3F. ME3F. $AOF1.(
• Fnocular un tubo de caldo M Q J# e incubar por 5< ± 2 !rs a )8=$(
• 3ransferir 7 ml a un tubo de 7) / 7 mm(
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• A4adir (9 ml de solución alfanaftal & (2 ml 5 de PC & agitar(
• A4adir unos cuantos cristales de creatina(
• Agitar & dejar reposar por 2 !rs(
• .a prueba es positi'a si se desarrolla un color rosado de eosina Ro4o 1e Me&ilo =RM<-
• Fncubar el tubo de M Q J# por 5< ± 2 !rs, adicionales a una temperatura de )8=$
despus de la prueba J#(
• A4adir 8 gotas de la solución ojo de Metilo a cada tubo(
• El color rojo indica que la prueba es positi'a; el amarillo que la reacción es
negati'a(
Ci&r"&o-• Fnocular a un tubo de $aldo de $itrato(
• Fncubar a ?9 ± 9 !rs a )8=$(
• El desarrollo de una turbidez distinta significa que la reacción es positi'a(
INTERPRETACI-N
FMJi$- ' ' ó ' ' ' ∴ E( $oli
"Oiotipo 7% "Oiotipo 2%
N N Enterobacter aerógenes
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PRACTICA N.
DETERMINACI-N DEL NMERO M;S PROBABLE
INTRODUCCI-N
E/isten tres mtodos que se usan con ma&or frecuencia para calcular el n0mero de bacterias en
una muestra determinada-
7( ecuento :irecto al Microscopio
2( ecuento en #laca
)( 10mero más #robable
El n0mero más probable es una estimación de la densidad de los microorganismos 'iables enuna muestra, que se obtiene, aplicando a los resultados obtenidos, la teoría de la probabilidad(
.os resultados más fidedignos se obtienen cuando todos los tubos de la dilución más baja son
positi'os "es decir presentan multiplicación microbiana% & todo los tubos de la dilución más
alta son negati'os "o sea no presentan multiplicación microbiana%( .as diluciones de diez
'eces son los más sencillos de efectuar, & el inóculo frecuentemente de uso en series de 1M#
de ), 8, ó 7 tubos( .os límites de confianza del 1M# se estrec!an a medida que aumenta el
n0mero de tubos inoculados para cada dilución(
TABLAS DE NMP Y LÍMITES DE CONFIAN:A DEL 8 =TABLA * ( DE MAN<
.as combinaciones que no figuran en las tablas tienen mu& pocas probabilidades de
presentarse( i los resultados no corresponden con los de la tabla !a& que repetir la prueba con
la muestra original, & si esto no es posible, el 1M# puede obtenerse con la tabla 2( 3ambin
puede utilizarse una ecuación matemática para obtener una apro/imación de combinaciones
del 1M#(
$uando se preparan más de tres diluciones de una muestra, el 1M# debe determinarse
a partir 0nicamente de tres diluciones consecuti'os(
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eleccionar la dilución más alta "que tiene el menor 'olumen de la muestra% con tubos
positi'os & luego utilice las dos diluciones más altas que le siguen(
$uando ninguna de las diluciones sometidas a prueba da todos los tubos positi'os,
seleccionar "si es posible% las tres primeras diluciones consecuti'as cu&a dilución de un
medio !a&a dado positi'o(
$uando todos los tubos sean positi'os, e/presar el 1M# como ma&or del resultado de
la combinación ) Q ) Q 2 ó 8 Q 8 Q 5(
#ara obtener una apro/imación de combinación del 1M#, puede aplicarse la fórmula
de 3!omas-
# L Es el n0mero de tubos positi'os
1 L $antidad total de la muestra a todos
los
tubos negati'os
3 L $antidad total de la muestra en
todos los tubos(
A menudo es necesario calcular el 1M# a partir de 'ol0menes de la muestra inicialdistintos de los enumerados en los cuadros 7 & 2( i el ma&or 'olumen de muestra
usado para la referencia de la tabla es (7 gr( Multiplique por 7 el 1M# que aparece
en la tabla( :e modo análogo, si la porción ma&or usada para la referencia de la tabla
es 7 gr( En 'ez de (7 gr( :i'ídase por 7 el 1M# obtenido de la tabla(
Blgo. Carlos Tome Ramos28
# 1M# I g "ml% L
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PRACTICA N. H
DETERMINACI-N DE COLIFORMES POR M>TODOS R;PIDOS
INTRODUCCI-N3
.a utilización de mtodos rápidos de análisis para $oliformes & E(coli, que nos permitan
cuantificar sin necesidad de confirmaciones bioquímicas, resulta sumamente 'entajosa para la
industria de los alimentos especialmente los alimentos frescos, así como tambin para
muestras de agua & suelos, &a que nos permite liberar rápidamente los productos para el
consumo sabiendo que se cumple con la legislación 'igente, a la 'ez se disminu&en los costos
de almacenamiento & se ganan días del producto en la góndola( .os mtodos tradicionales para
el análisis de $oliformes totales & E( coli comprenden tres pasos sucesi'os de complejidad
creciente & el tiempo del análisis es de 5 a 9 días, dependiendo de los resultados( E/isten
diferentes propuestas de mtodos rápidos en el mercado para el recuento de E( coli &
$oliformes totales, que nos permiten obtener resultados en 25 !s(; tales como el caldo m
$oliOlue 25, $olilert, $M#A$3 :6 E$ etc(
I0' COLIFORMES EN EL MEDIO SOLIDO AGAR BILIS RO/O VIOLETA =VRBA<
MATERIAL Y M>TODO3
ealizar las diluciones seriados de la muestra en agua peptonada "(7%
3ransferir 2 alícuotas de 7 ml de cada dilución a placas de petri(
embrar en placas de la siguiente manera-a% #ara el mtodo con'encional, 'aciar 7 ml de JOA temperado a 5<=$ en las
placas & !omogeneizar( #ara predecir el crecimiento de la superficie & la
propagación de las colonias, cubrir con 8 ml JOA & dejar solidificar(
b% i se necesita la resucitación, 'erter una capa basal de < Q 7 ml de Agar de o&a
3riptica temperada a 5<=$ !omogeneizar e incubar a temperatura ambiente por 2
± (8 !rs( .uego cubrir con < Q 7 ml de JOA temperada & dejar que solidifique(
Fncuba por 7< Q 25 !rs( a )8=$( #ara productos lácteos a )2=$( $ontar colonias rojo p0rpura de (8 mm de diámetro & rodeados por zonas de ácidos
biliares precipitados(
#ara confirmación transferir cada colonia a un tubo con caldo .actosado Jerde
Orillante Oilis( Fncubar a )8=$ / 25 Q 5< !rs(
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eportar como u(f(c( I ml "gr(% de coliformes(
II0' COLIFORMES TOTALES Y E0 coli POR EL M>TODO DE FILTRACI-N POR
MEMBRANA(
MATERIAL Y M>TODO
>iltrar un 'olumen de 2 Q 7 ml muestra de agua en asepsia "'er fig(%(
Enjuagar por 2 ó ) 'eces con 'ol0menes de 2 ml de agua de dilución(
3ransferir la membrana a la superficie de una placa con el medio- Agar Endo les,
Agar m>c o Agar m Q >c Q D! o almo!adillas con el caldo m Q coli blue 25, e'itando
que se formen burbujas entre el medio & la membrana(
Fncubar- )8=$ / 25 !rs( las placas con- Agar Endo les $3 ufc I ml
m coli Olue 25 $3 ufcIml( "colonias rojas &
azules% o E( coli ufc I ml "solo las colonias azules%
55(8=$ / 25 !rs las placas con- Agar m >c
Jerificar 8 colonias del medio Endo les, transfiriendo con la a&uda del asa de siembra a
un tubo con caldo lactosado Jerde Orillante Oilis e incubar a )8=$ / 25 a 5< !rs(
#ara la lectura puede utilizar el microscopio e identificar mejor las colonias( eportar
sus resultados como u(f(c( I 7 ml
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ANEOS
TABLA N. *0' Selección 1el NMP # e%&im"cione% 1e lo% l!mi&e% 1e conJi"nK" 1el 8 $"r"$r2e"% 1e &2o% 1e Jermen&"ción con &2o% 1e $ro$orcione% 1e )* ))* # )))* g0=ml0<
10mero de tubos positi'os,7 ,7 ,7
1M#Ig("ml%
2 7 2 7 27 27 7 57 7 57 2 92 52 7 D2 7 D2 7 7 ?2 2 ?2 2 ?) <) 7 77) 7 77) 7 7 75) 2 75
) 2 7 7D) ) 7D5 7)5 7 7D5 7 7D5 7 7 275 2 225 2 7 295 ) 2D5 ) 7 ))5 5 )5
8 2)8 7 )78 7 ))8 7 7 598 7 2 9)8 2 5?8 2 7 D8 2 2 ?
8 ) D?8 ) 7 778 ) 2 758 5 7)8 5 7 7D8 5 2 228 5 ) 2<8 5 5 )88 8 258 8 7 )88 8 2 858 8 ) ?28 8 5 79
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TABLA N. (0' N,mero m5% $ro"le $or *)) ml0 1e m2e%&r" $l"n&e"n1o $orcione% en&re% 1il2cione% en %erie geom&ric"
10mero detubos positi'os7 7 ,7
1M#
7 7,< 2 ),9 ) 8,5 5 D,2 8 ? 7 7,< 7 7 ),9
7 2 8,8 7 ) D,) 7 5 ?,7 7 8 77 2 ),D 2 7 8,8 2 2 D,5 ) ) ?,2 2 5 77 2 8 7) ) 8,9
) 7 D,5 ) 2 ?,) ) ) 77 ) 5 7)
10mero detubos positi'os7 7 ,7
1M#
) 8 78 5 D,8 5 7 ?,5 5 2 77 5 ) 7) 5 5 78 5 8 7D 8 ?,5
8 7 77 8 2 7) 8 ) 78 8 5 7D 8 8 7?7 27 7 57 2 97 ) <7 5 77 8 72
7 7 57 7 7 9,77 7 2 <,77 7 ) 77 7 5 72
10mero detubos positi'os7 7 ,7
1M#
7 7 8 75
7 2 9,77 2 7 <,27 2 2 77 2 ) 727 2 5 787 2 8 7D7 ) <,)7 ) 7 77 ) 2 7)7 ) ) 787 ) 5 7D7 ) 8 7?7 5 777 5 7 7)7 5 2 787 5 ) 7D7 5 5 7?7 5 8 22
7 8 7)7 8 7 787 8 2 7D7 8 ) 7?7 8 5 227 8 8 25 10mero detubos positi'os7 7 ,7 1M#2 5,82 7 9,<
2 2 ?,72 ) 722 5 752 8 792 7 9,<2 7 7 ?,22 7 2 722 7 ) 752 7 5 7D2 7 8 7?2 2 ?,)
2 2 7 722 2 2 752 2 ) 7D2 2 5 7?2 2 8 222 ) 722 ) 7 752 ) 2 7D2 ) ) 7?2 ) 5 222 ) 8 282 5 782 5 7 7D2 5 2 2
10mero detubos positi'os
1M#
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7 7 ,72 5 ) 2)2 5 5 282 5 8 2<2 8 7D
2 8 7 22 8 2 2)2 8 ) 292 8 5 2?2 8 8 )2) D,<) 7 77) 2 7)) ) 79) 5 2) 8 2)
) 7 77) 7 7 75) 7 2 7D) 7 ) 2) 7 5 2)) 7 8 2D) 2 75) 2 7 7D) 2 2 2) 2 ) 25) 2 5 2D) 2 8 )7
10mero detubos positi'os7 7 ,7
1M#
) ) 7D) ) 7 27) ) 2 25) ) ) 2<
) ) 5 )7) ) 8 )8) 5 27) 5 7 25) 5 2 2<) 5 ) )2) 5 5 )9) 5 8 5
Blgo. Carlos Tome Ramos)
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) 8 28) 8 7 2?) 8 2 )2) 8 ) )D) 8 5 57
) 8 8 585 7)5 7 7D5 2 275 ) 285 5 )5 8 )95 7 7D5 7 7 275 7 2 295 7 ) )7
10mero detubos positi'os7 7 ,7 1M#5 7 5 )95 7 8 525 2 225 2 7 295 2 2 )75 2 ) )<5 2 5 555 2 8 85 ) 2D5 ) 7 ))5 ) 2 )?5 ) ) 585 ) 5 825 ) 8 8?5 5 )55 5 7 55 5 2 5D5 5 ) 85
5 5 5 925 5 8 9?
10mero detubos positi'os
1M#
7 7 ,75 8 575 8 7 5<5 8 2 895 8 ) 95
5 8 5 D25 8 8 <78 2)8 7 )78 2 5)8 ) 8<8 5 D98 8 ?88 7 ))8 7 7 598 7 2 95
8 7 ) <58 7 5 778 7 8 7)8 2 5?8 2 7 D
10mero detubos positi'os
7 7 ,7
1M#
8 2 2 ?88 2 ) 728 2 5 788 2 8 7<8 ) D?8 ) 7 778 ) 2 758 ) ) 7<8 ) 5 27
8 ) 8 288 5 7)8 5 7 7D8 5 2 228 5 ) 2<8 5 5 )88 5 8 5)8 8 25
8 8 7 )88 8 2 858 8 ) ?28 8 5 798 8 8
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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAOFACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y DE RECURSOS NATURALES
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