Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.

Práctica:

Acción de los Agentes Químicos sobre los Microorganismos

Las sustancias químicas pueden actuar sobre los microorganismos en variasformas, dependiendo de la composición físico-química del medio ambiente, laconcentración, la temperatura y el tiempo que dura el contacto.

Pueden actuar mostrando una acción “bactericida” mediante la eliminación totalde los microorganismos, o acción “bacteriostática” mediante inhibición temporal delcrecimiento bacteriano.

Objetivo: Determinar la acción de algunos agentes químicos sobre los microorganismos.

Muestra Biológica: Cultivo bacteriano en caldo de: Escherichia coli, Pseudomonas sp. y

Staphylococcus aureus.

Material y Medio de cultivo: Guantes, Mechero con ron de quemar y fósforo Placas de Petri con Agar Müller-Hinton Discos de papel de filtro estériles en una placa Torundas estériles dentro de un tubo Pinza de metal estéril Plumón de tinta indeleble.

Reactivo: Frascos con agentes químicos: Alcohol al 70 %

Fenol al 1 %Mercurio cromo al 2 %Cristal Violeta 1/1000Merthiolate 1/1000, Lejía 10 %, Tintura de Yodo 10 %, etc.

Procedimiento: Encienda el mechero, protéjase (guantes), acerque los materiales necesarios Introduzca una torunda estéril dentro del cultivo microbiano y al retirar presione el

algodón sobre las paredes del tubo para evitar que salga chorreando Siembre en toda la superficie del medio en la placa Luego de unos 5 minutos, previa señalización de los lugares donde se colocaran los

discos (promedio entre 5 ó 6 por placa) Con la pinza estéril coja un disco de papel de filtro e introduzca en un agente químico

(tenga cuidado de no impregnar los discos demasiado), luego colóquelo sobre el lugarpredestinado y presione suavemente (no reubicar el disco desplazándolo)

Haga lo mismo con los demás desinfectantes o agentes químicos Incube las placas a 37º C por 24 – 48 horas y observe lo obtenido.

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Resultados:Realice la medición del diámetro de los halos de inhibición formados y registre en lasiguiente tabla:

AGENTEQUÍMICO

TAMAÑO DE DIÁMETRO DELHALO DE INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANOEscherichia coli Pseudomonas sp Staphylococcus aureus

Alcohol al 70 %Fenol al 1 %

Mercurio cromo al 2 %Cristal Violeta 1/1000

Merthiolate 1/1000Lejía 10 %

Tintura de Yodo 10 %

Interpretación:Generalmente el agente químico desinfectante que muestre mayor diámetro de halo deinhibición de crecimiento será el que tenga mayor efectividad.

Haga el esquema de lo observado.

Cuestionario: ¿Mencione cual es el mecanismo de acción del Alcohol, Fenol, Mercurio Cromo,

Cristal Violeta y Merthiolate? ¿Mencione 3 sustancias colorantes de acción antibacteriana y 3 antimicótica? ¿Cómo organizaría un enfrentamiento de agentes químicos pero frente a hongos?

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Práctica:

El Antibiograma

En los últimos años se ha observado diferentes comportamientos de resistenciabacteriana a los antibióticos, por ello es necesario establecer programas nacionales einternacionales de vigilancia de la resistencia de las bacterias a los antibióticos,utilizando pruebas de sensibilidad fidedignas que proporcionen datos comparables. Lainformación microbiológica y epidemiológica disponible ayudará a los clínicos aseleccionar el agente antimicrobiano más apropiado para tratar cada infección.

Objetivo: Evaluar la capacidad de los antibióticos para inhibir “in vitro” el desarrollobacteriano, tanto por el método de difusión como por el método de dilución.

Muestra Biológica: Cultivo bacteriano en caldo de: Escherichia coli, Pseudomonas sp. y

Staphylococcus aureus comparables con el Tubo Nº 3 de la escala de Mc. Farland.

Material y Medio de cultivo: Guantes, Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Placas de Petri con Agar Müller-Hinton (con aproximadamente 20 mL de medio) Caldo Nutritivo Discos de sensibilidad impregnados con antibióticos y quimioterápicos. Torundas estériles dentro de un tubo Pinza de metal estéril Tubos de ensayo de 13 x 100 mm estériles (10 tubos por microorganismo) Pipetas de 5 mL Gradillas Plumón de tinta indeleble.

Reactivo: Solución de antibióticos.

MÉTODO DE DIFUSIÓN:El método de disco-difusión en agar es una manera sencilla, práctica y rápida pararealizar el antibiograma. El recomendado es el estandarizado por Kirby-Bauer, con el quese ha logrado uniformizar criterios que toman en cuenta los conceptos de concentraciónmínima inhibitoria (MIC o CIM) y de concentración promedio en sangre de las drogasfrecuentemente usadas.

Procedimiento: Encienda el mechero, protéjase (guantes), acerque los materiales necesarios Introduzca una torunda estéril dentro del cultivo microbiano y al retirar presione el

algodón sobre las paredes del tubo para evitar que salga chorreando Siembre en toda la superficie del medio Müller-Hinton en la placa Luego de unos 5 minutos, previa señalización de los lugares donde se colocaran los

discos (promedio entre 5 ó 6 por placa)

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Con la pinza estéril coja un disco de sensibilidad impregnado con antibiótico, luegocolóquelo sobre el lugar predestinado y presione suavemente (no reubicar el discodesplazándolo)

Haga lo mismo con los demás discos con antibióticos o quimioterápicos Incube las placas a 37º C por 24 horas y observe lo obtenido.

Resultados:Después del periodo de incubación, realice la medición del diámetro de los halos deinhibición formado para cada antibiótico ensayado y compare con la Tabla patrón.

TABLA DE INTERPRETACIÓN DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN

ANTIBIÓTICOCONCENTRACIÓN

DEL DISCO (µg)DIÁMETRO EN mm DE LA ZONA INHIBIT.RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

AMICACINA 10 < 11 12 - 13 14 >AMPICILINAGram – y enterococosEstafilococos y resistentes apenicilina.

1010

< 11< 20

12 - 1321 - 28

14 >29 >

BACITRACINA 10 < 8 9 - 12 13 >CARBENICILINAProteus sp, E. coli P. aeruginosa

5050

< 17< 12

18 - 2213 - 14

23 >15 >

CAFELOTINA 30 < 14 15 - 17 18 >CLORANFENICOL 30 < 12 13 - 17 18 >CLINDAMICINA 2 < 14 15 - 16 17 >COLISTINA 10 < 8 9 - 10 11 >ERITROMICINA 15 <13 14 - 17 18 >GENTAMICINA 10 < 12 13 >KANAMICINA 30 < 13 14 - 17 18 >NEOMICINA 30 < 12 13 - 16 17 >NOVOBIOCINA 30 < 17 18 - 21 22 >PENICILINA GEstafilococosOtros gérmenes

10 < 20< 11

21 - 2812 - 21

29 >22 >

POLIMIXINA B 300 < 8 9 - 11 12 >RIFAMPIN(sólo para N. meningitidis) 5 < 24 25 >

ESTREPTOMICINA 10 < 11 12 - 14 15 >TETRACICLINA 30 < 14 15 - 18 19 >VANCOMICINA 30 < 9 10 - 11 12 >AGENTE QUIMIOTERAPICONITROFURANTOINA * 300 < 14 15 - 16 17 >AC. NALIDIXICO * 30 < 13 14 - 18 19 >AC. OXOLINICOTRIMETROPRIN /SULFAMETOXAZOL

1.25 / 23.75 < 10 11 - 15 16 >

TRIPLE SULFA ** 300 < 12 13 - 16 17 >

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* Solamente para infecciones urinarias** Solamente para infecciones urinarias. Todos los discos de sulfanilamidas de 250 ó 300µg pueden ser interpretados similarmente.

Interpretación:La tabla patrón permitirá considerar al germen como: SENSIBLE, INTERMEDIO oRESISTENTE a la acción del antibiótico según corresponda su medida de halo deinhibición. Se reportan la valoración de los antibióticos si sus medidas han caído en eseorden.

Haga el esquema de lo observado.

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MÉTODO DE DILUCIÓN:Para evaluar cuantitativamente la actividad de un antibiótico puede agregarse dilucionesde este a un caldo de cultivo o a un medio sólido en el que luego se siembra elmicroorganismo problema. La concentración más baja que impide el crecimientobacteriano se considera concentración inhibitoria mínima (CIM o MIC) del fármaco.

Procedimiento: Encienda el mechero, protéjase (guantes), acerque los materiales necesarios Diluir el antibiótico a la concentración adecuada para trabajo (200 unidades por mL ó

500 µg por mL según sea el antibiótico) Colocar 10 tubos de 13 x 100 mm estériles, numerados del 1 al 10 Con una pipeta de 5 mL estéril, colocar 0,5 mL de caldo nutritivo en los tubos

marcados del 2 al 10 Agregar 0,5 mL del antibiótico al tubo 1 y 2, mezcle el contenido del tubo 2 y

trasvasar (transferir) 0,5 mL al tubo 3, continuando hasta el tubo 9. Retirar 0,5 mL deltubo 9 y descartar; el tubo 10 no recibe antibiótico y sirve como control

Agregar a todos los tubos 0,5 mL de la cepa bacteriana (cultivo bacteriano en caldo) Incubar a 37º C por 18 a 24 horas, observar lo sucedido.

Resultados:Realice la lectura e interpretación de los resultados teniendo en cuenta la concentracióndel antibiótico que va desde la mitad de la concentración dispuesta en la diluciónobtenida y en forma decreciente desde el tubo 1 al 10. Observar si hay o no crecimientobacteriano.

BACTERIACRECIMIENTO BACTERIANO

EN EL TUBO Nº (indicar con + ó -)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Interpretación:El tubo con la menor concentración del antibiótico que haya impedido el crecimientobacteriano representará el MIC o CIM (Mínima Concentración Inhibitoria), es decir laconcentración mínima del antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano.

Haga el esquema de lo observado.

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Cuestionario: ¿Citar 5 enfermedades microbianas y el antibiótico utilizado en la actualidad? ¿Los antibióticos muestran actividad eficaz contra infecciones virales, por que? ¿Qué es la hipersensibilidad a la penicilina? ¿Cuál es el mecanismo de acción del ácido nalidixico, cloranfenicol y de las

cefalosporinas?