Embed Size (px)
Citation preview
Dékány Imre MTA r.tagja
MTA SZTE Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok
Kutatócsoport
SZTE AOK Orvosi Vegytani Intézet
Szeged, Dóm tér 8.
Nanoszerkezetek és biomarkerek a
gyógyítás szolgálatában
Tartalmi összefoglaló - SPR 2D technológia alkalmazása az adszorpció
kvantitativ mérésére: aminosavak és proteinek
- Hatóanyagok és toxikius molekulák megkötése funkcioanlizált Au felületeken
- Au nanorészecskék lipid membránokban - Au plazmonikus csatolás biomolekulákkal - Hatóanyagok nanokapszulázása
3
E H
longitudinal oscillation
(LSP) transverse oscillation
(TSP)
Surface plasmon resonance (SPR) These phenomena occur when electromagnetic
field interacts with conduction band electrons and induces the coherent oscillation of
electrons.
Au TSP : λmax1 = 500 – 550 nm ~ 1/r
Ag TSP : λmax1 = 385 – 420 nm ~ 1/r
0
0.25
0.5
0.75
1
300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
No
rmali
zed
ab
so
rban
ce
Plasmon bands of spherical gold and silver
nanoparticles
Au és Ag nanorészecskék optikai tulajdonságai
The prism coupling (Kretschmann-configuration) in SPR technique
Schematic representation of Kretschmann-configuration
Az SPR mérés kísérleti elrendezése
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
25 50 75 100 125
t (min)
Sp
ec
ific
ad
so
rbe
d a
mo
un
t
(nm
ol/c
m2) Dopamine (b)
Ibuprofen (a)
The plasmonic curves of adsorption of (a) ibuprofen and (b) dopamine on gold surface at different concentrations (0.5, 1, 2, 4, 6, 10 mmol/dm3 aqueous solutions)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 2 4 6 8 10
c (mM)
Sp
ec
ific
ad
so
rbe
d a
mo
un
t
(nm
ol/c
m2)
Dopamine (b)
Ibuprofen (a)
The adsorption isotherm of (a) ibuprofen and (b) dopamine from aqueous solution on gold surface
SPR mérések és adszorpciós izotermák
Adszorpció és felületi orientáció
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
90 140 190 240 290 340
t (min)
Sp
ec
ific
ad
so
rbe
d a
mo
un
t (n
mo
l/c
m2)
Gold
L-cysteine
0.5 mM 1mM 2mM 4mM 6mM 10mM Ibuprofen
0.5 1 2 4 6 10mM
The plasmonic curves of adsorption of ibuprofen on L-cysteine functionalized gold surface from aqueous solutions ( at 0.5, 1, 2, 4, 6, 10 mmol/dm3 concentrations )
SPR mérések: Au-cisztein- ibuprofen rendszer
Table 1. The monolayer adsorption capacities (Gmono) and molecular cross section areas (a) on gold surface for different bioconjugated systems as obtained from adsorption isotherms
Molecules
on gold
surface
Monolayer
capacity,
Γm./nmol cm–2
Eq. (5)
Cross
sectional area,
am./nm2 Eq.
(6)
am/am,calc Calculated
cross sectional
area *
am,calc/nm2
Surface
orientation
L-Cysteine 0.325 0.513 1.425 0.360 parallel
L-Glutathion 0.135 1.234 1.505 0.820 parallel
Ibuprofen 0.330 0.505 0.789 0.640 parallel
Dopamine 0.860 0.194 0.359 0.540 perpendicular
Molecules
on
functionali
sed gold
surface
Adsorptio
ncapacity,
Γm./nmol
cm–2
Eq. (5)
Cross
sectional
area,
am./nm2
Eq. (6)
am/am,calc Calculated
cross section
area,
*am,calc/nm2
Surface orientation
L-Cyst-
Ibuprofen
0.325 0.513 0.801 0.640 parallel
L-Glut-
Ibuprofen
0.180 0.926 1.447 0.640 parallel
L-Cyst-
Dopamine
0.640 0.260 0.481 0.540 perpendicular
L-Glut-
Dopamine
0.580 0.287 0.531 0.540 perpendicular
Arany nanoszenzorok aflatoxinok kimutatására
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
350 450 550 650 750 850
l, nm
A, -
Aminodextran reduced AuNPs
NaBH4 reduced AuSHbCD
nanodispersion
Dl= 20 nm
UV-Vis plazmonikus spektrumok
The changes of plasmon bands of aminoldextran reduced gold nanodispersion and
AuSHbCD gold nanodispersions(164 mg/ml; 0.5 mM Au) registered by UV-Vis spectroscopy.
UV-Vis mérések
0.15
0.3
0.45
350 500 650 800
l , nm
A, -
AuSHbCD naodispersion
lmax= 539 nm
1.7 - 3.4 - 8.-3 ng/ml AfB2
0
0.25
0.5
0.75
1
350 500 650 800
l, nm
A, -
0
0.05
0.1
0.15
0.2AuSHbCD naodispersion
lmax= 539 nm
548- 549- 550 nm
3 - 13 - 33 ng/ml AfB1
The changes of
plasmon bands of
AuSHbCD gold
nanodispersions (164
mg/ml; 0.5 mM Au)
added AfB1 (in
concentration range 3-
33 ng/ml AfB1 and
1.7-8.3 ng/ml AfB2) to
the solution are also
registered by UV-Vis
spectroscopy in dilute
acetonitril solution.
Hydrophobic S-H group substituted
g-cyclodextrin
B1-aflatoxin
Attachment of Aflatoxin
B1 molecules to
cyclodextrin modified gold
surface and b-
cyclodextrin on gold
crystal surface (111).
O
CH3
O
OO
O
O
SPR mérések AfB1 molekulával
1) Aflatoxin B1 (AfB1) molecules
Glass surface
Au layer (50 nm)
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
Time
Wavele
ng
th
Ad
so
rpti
on
De
so
rpti
on
Reversible
Irreversible
Weak physical
interactions
Strong physical or
chemical interactions
nSt(otal adsorbed amount) = nS
phys + nSchem
Ad
so
rbe
d
am
ou
nt
AfB1: 0.4 ng/cm2
(0.167-32 ng/ml)
0
1
2
3
4
5
6
0 20 40 60 80 100 120
Time (min)
Sp
ec
ific
ad
so
rbe
d a
mo
un
t
(ng
/cm
2)
Adsorption Desorption
Fig. 7. Results of SPR measurements: AfB1
solution (0.167-32ng/ml) to gold surface.
2)
Glass surface
Au layer (50 nm)
SH modified bCD (bCD-SH) molecules
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 40 80 120 160
Time (min)
Sp
ec
ific
ad
so
rbe
d a
mo
un
t (n
g/c
m2)
SH-b -CD: 169 ng/cm2
(0.5- 3 mg/ml)
Fig. 8. Results of SPR measurements: bCD-SH (0.5-3
mg/ml) to gold surface.
0
50
100
150
200
0 1 2 3
cSHbCD, mg/ml
Ad
so
rbe
d a
mo
un
t (n
g/c
m2)
3) AfB1 to bCD-SH covered surface
Glass surface
Au layer (50 nm)
O
O
O
O
OH
3C O
O
O
O
OH
3C O
O
O
O
OH
3CO
O
O
O
OH
3C
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250 300
Time (min)
Sp
ec
ific
ad
so
rbe
d a
mo
un
t (n
g/c
m2) Au nanodispersion: 87 ng/cm
2
AuSHb CD: 0-10 ng/cm2
Results of SPR measurements: AuSHbCD gold
nanodispersions (0-10 ng/ml Au).
Glass surface
Au layer (50 nm)Au layer (50 nm)
AuNP
4) AfB1 molecules attach to bCDsholes of
bCDAuNPs
Glass surface
Au layer (50 nm)
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
OO
O
O
OH 3
C
O
O
O
O
OH
3C
O
O
O
O
O
H3 C
O
O
O
O
O
H3 C
O
O
O
O
OH
3 C
O
OOO
O
H3C
O
OO O
OH
3 C
O
O
O
O
O H3CO
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
OH 3C
O
O
OO
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
OO
O
O
OH 3
C
O
O
O
O
OH
3C
O
O
O
O
O
H3 C
O
O
O
O
O
H3 C
O
O
O
O
OH
3 C
O
OOO
O
H3C
O
OO O
OH
3 C
O
O
O
O
O H3CO
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
OH 3C
O
O
OO
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
AuNP
AuNPs with bCD-SH (bCDAuNPs)5)
0
20
40
60
80
100
0.00 5.00 10.00
cAu (ng/cm2)
Ad
so
rbe
d a
mo
un
t (n
g/c
m2)
Glass surface
Au layer (50 nm)Au layer (50 nm)
AuNP
4) AfB1 molecules attach to bCDsholes of
bCDAuNPs
Glass surface
Au layer (50 nm)
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
OO
O
O
OH 3
C
O
O
O
O
OH
3C
O
O
O
O
O
H3 C
O
O
O
O
O
H3 C
O
O
O
O
OH
3 C
O
OOO
O
H3C
O
OO O
OH
3 C
O
O
O
O
O H3CO
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
OH 3C
O
O
OO
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
OO
O
O
OH 3
C
O
O
O
O
OH
3C
O
O
O
O
O
H3 C
O
O
O
O
O
H3 C
O
O
O
O
OH
3 C
O
OOO
O
H3C
O
OO O
OH
3 C
O
O
O
O
O H3CO
O
O
O
O
H3C
O
O
O
O
OH 3C
O
O
OO
O
H3C
O
O
O
O
O
H3C
AuNP
AuNPs with bCD-SH (bCDAuNPs)5)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 100 200 300
Time (min)
Sp
ec
ific
ad
so
rbe
d a
mo
un
t (n
g/c
m2)
AfB1: 16.3 ng/cm2
(1-60 pg/ml)
AuSHb CD: 35 ng/cm2
(3.28 mg/ml)
0
5
10
15
20
0 0.02 0.04 0.06
cAfB1 (ng/cm3)
Ad
so
rbe
d a
mo
un
t (n
g/c
m2)
Fig. 11. Results of SPR measurements: in first step Au
nanodisperson and after added AfB1 (in concentration range
0-32 ng/ml AfB1) in dilute acetonitril solution.
Antitest-1
Antitest-2 Antigén-1
Foszfolipid kettősréteg
Membránfehérje
Biomarker Nanorészecske
Az animáció kattintásra indul.
0
2
4
6
8
10
12
0 40 80 120 160 200 240 280
t, min
Dl
, n
m
6
6.2
6.4
6.6
6.8
7
140 180 220 260
t, min
Dl
, n
m
Ab oligomer
100 nM 1 mM
Közeg: PBS puffer oldat Áramlási sebesség: 20 mL/perc 500 mL folyadéktérfogatok kerültek beadagolásra 1. Lépés: Streptavidin 10 mM 2. Lépés: BSA 1% oldata 3. Lépés: Biotinált foldamer 20 mM oldata 4. Lépés: Ab oligomer 100 nM 5. Lépés: Ab oligomer 1 mM
Streptavidin
Biotinált foldamer
Blokkoló oldat
Ab oligomer oldatok
A plazmonikus csatolás lehetőségei
Schematic figures of the prepared AuNP samples (a) AuNP(Trp), (b) AuNP(CysTrp), (c) AuNP(Lys) and (d) the plasmonic coupling effect
Fluoreszcencia spekrtumok Au-lizozim rendszereken
HRTEM images of the (a) AuNP(CysTrp) and (b) AuNP(Lys) samples with the ratio of mLys/mAu = 5
(A) XRD pattern of (a) bulk gold, (b) AuNP(cit), (c) AuNP(Lys) and (d) AuNP(Cys) samples (B) The SAXS curve of (a) AuNP(Lys) sample (cLys=1 mg/ml) and the calculated SAXS curve (GNOM fit)
XRD mérések
(A) The SAXS curve of the AuNP(Lys) nanoparticles in Kratky representation (B) calculated pair distance distribution function of the AuNP(Lys) samples mLys/mAu = 5 (C) the SAXS curves of Porod representation mAu/mLys = 1:5 (a), 1:15 (b), 1:20 (c)
SAXS mérések
Langmuir monoréteg vizsgálatok
Kibron MicroTroughS 0 2000 4000 6000 8000
0
10
20
30
40
50
60
(
mN
/m)
A (mm2)
asolectin
DPPC
Surface pressure – area isotherms of the model membrane materials:
DPPC and asolectin
DPPC: dipalmytoil-phosphatidylcholine
pure phospholipid
asolectin: mixture of phospholipids and fatty acids
1. Preparation of phospholipid monolayer at liquid/air
interface
Au nanorészecskék beépülése a lipid membránba
1. Preparation of phospholipid monolayer at liquid/air
interface
2. Compression
3. Penetration of functionalized nanoparticles into
membrane
Schematic representation of the nanoparticles penetration into lipid membrane
A monomolekulás réteg átvitele szilárd felületre
Langmuir-Blodgett method
Solid supported monolayer
membrane with Au NPs incorporated
SH2C
CHH2N C
O
-O
S CH2
CH C
H2NO-
O
S
Au- cisztein beépülése monoréteges membránba
Au-cys NPs
Δπ
0 1000 2000 3000 40000
5
10
15
20
25
30
(
mN
/m)
time (s)
0 10 20 30 40 500
1
2
3
4
5
Asolectin
DPPC
D, m
N/m
0, mN/m
Change in the surface pressure of the
monolayer during the incorporation
Surface pressure increase (Δπ) as a function of the initial surface pressure
(π0) due to the nanoparticle incorporation
Au-gsh NPs SS
HOC
CH
H2
CCH2
CNH
CHC
HN
O
NH2
O H2CS
O
CH2
COH
O
HOC
CHCH2
H2
CC
HN
CHC
NH
O
NH2
O H2CS
OH2
CC
OH
O
Δπ
0 1000 2000 3000 40000
5
10
15
20
25
30
35
40
(
mN
/m)
time (s)
0 10 20 30 40 50 60 700
1
2
3
4
Asolectin
DPPC
D, m
N/m
0, mN/m
Au - glutation beépülése a monoréteges memránba
Change in the surface pressure of the
monolayer during the incorporation
Surface pressure increase (Δπ) as a function of the initial surface pressure
(π0) due to the nanoparticle incorporation
Biofunkcionalizált Au NR beépülése a DPPC membránba
increase in surface pressure
means the penetration of the
particles into the membrane
composition and initial surface
pressure have marked influence on
the penetrated amount
Penetration of the biofunctionalized Au NPs into the different model membranes at different compactnesses ( eg. initial surface pressures)
0 10 20 30 40 50 60 700
1
2
3
4
5 Au-cys Rod
AR 2.8
Au-gsh
15 nm
Au-cys
15 nm
Au-gsh
10 nm
Au-cys
10 nm
D, m
N/m
0, mN/m
O
O
O
O
O
OO
O- P
O
N+
O
O
O
O
O
O
OO
O- P
O
N+
O
O
O
O
O
O
OO
O- P
O
N+
O
O
O
O
O
O
OO
O- P
O
N+
O
O
O
O
O
O
OO
O- P
O
N+
O
S
H2C
CH
H2N
CO
-O
SCH
2
CH CH
2NO -
O
S
S
H2C
CH
H2N
CO
-O
SCH
2
CH CH
2NO -
O
S
Aqueous subphase
pH 7.4
Au nanoparticles
and DPPC
zwitterionic form
Air
Au Au
Biofunkcionalizált Au NR és a phospholipid monoréteg
DPPC
TEM image of the 10 nm spherical Au NPs andUV-Vis absorbance spectra of different sized, bioconjugated Au NPs.
TEM image of the Au nanorods, UV-Vis absorbance spectra of the aqueous dispersions of the Au NRs.
Maximum insertion pressure (MIP) and synergy values obtained for the different sized, shaped, surface functionalized nanoparticles with DPPC membrane.
ZnO-Au plazmonikus csatolás
Au és ZnO nanohibrid filmek
glass
Au film - 47 nm thickness SPR substrate
quartz
Au nanoparticles – d=10 nm spray coating technique
ZnO (d=3 nm) Langmuir-Blodgett layer
ZnO (d=3 nm) Langmuir-Blodgett layer
stearic acid (SA) Langmuir-Blodgett layers
stearic acid (SA) Langmuir-Blodgett layers
layer numbers:
0, 1, 2, 3, 4, 6
layer numbers:
0, 1, 2
spacer layers
between
Au and ZnO
Schematic representation
of the sample
Schematic representation
of the sample
300 400 500 600 700 800 9000
20
40
60
80
100 exc.: 350 nm ZnO
Au/ZnO
Au/SA1/ZnO
Au/SA2/ZnO
PL
in
ten
sit
y (
a.u
.)
wavelength (nm)
Au-ZnO nanoszerkezetek fotolumineszcenciája
Au NPs based
samples
Visible emission
370 380 390 400 4100
10
20
30
exc.: 350 nm
ZnO
Au/ZnO
Au/SA1/ZnO
Au/SA2/ZnO
PL
in
ten
sit
y (
a.u
.)
wavelength (nm)
UV emission
wavelength
0 1 2 3 4 5552
554
556
558
ZnO on quartz
lm
ax (
nm
)
distance (nm)
intensity
0 1 2 3 4 530
40
50
60
70
80
90
100
ZnO on quartz
inte
gra
ted
in
ten
sit
y (
a.u
.)
distance (nm)
Mag
Hatóanyag leadás
Gyógyszermolekula Negatív töltésű polimer
Pozitív töltésű
polimer
Mag-héj kompozitok
BSA maggal előállított mag-héj kompozitok
BSA/IBU/PSS/Chit TEM képe
BSA, BSA/IBU, BSA/IBU/PSS valamint a
BSA/IBU/PSS/Chit infravörös spektruma,
valamint a másodlagos szerkezet változása az
amid I sáv eltolódása alapján
BSA/IBU/PSS/Chit
fénymikroszkópos képe
1650 1600 1550 1500
Ab
so
rba
nce
Wavenumber (cm-1)
Amid I ( C=O)
Amid II ( CN, NH)
BSA/IBU/PSS/Chit
BSA/IBU
BSA/IBU/PSS
BSA
1642 c
m-1
1639 c
m-1
1649 c
m-1
1648 c
m-1
-helix
Random coil
bsheet
bsheet
bsheet
Random coil
Random coil
Hatóanyag leadás vizsgálata
HANSON cella-
vertikális diffúzió cella
IBUPROFEN meghatározása:
BSA mag jelenlétében: 264 nm, 272 nm
Szilika mag jelenlétében: 222 nm, 264 nm,
272 nm
Mérés:
Foszfát pufferben (PBS, pH=7,4)
Két kamrából áll: donor and
receiving (fogadó) chambers
Membrán :Dialysis tubing cellulose
membrane
Cella térfogata: 4ml, de a pontos
térfogatot meg kell határozni
Keverés sebességet állandó értéken
kell tartani a mérés során.
Elsőrendű Sebességi Modell a kioldódás mechanizmusára
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
t (min)
Rele
ase %
BSA/IBU
BSA/IBU/PSS
BSA/IBU/PSS/Chit
First-order Rate Model
R2=0,9823
kd=0,0016s-1
First-order Rate Model
R2=0,9097
kd=0,0051s-1
First-order Rate Model
R2=0,9822
kd=0,0017s-1
Mezopórusos szilika maggal előállított mag-héj kompozitok
SIL/IBU/PEI TEM képe A szilika, valamint a mag-héj kompozitok
infravörös spektruma
A szilanol csoportok,
valamint az ibuprofen
karboxil csoportjai
közt létrejött H-
kötések a szilika
pórusaiban
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
1065 c
m-1
1054 c
m-1
1069 c
m-1
1051 c
m-1
1712 c
m-1
1547 c
m-1
1452 c
m-1
1170 c
m-1
Abszorb
ancia
Hullámszám (cm-1)
C
=O
N
-H
C
H2
a
sS
O3
-
Si-O-Si
s
SO
3-
a
sS
i-O
C-C (benzol
vázrezgése)
as Si-Os Si-OH
440 c
m-1
437 c
m-1
440 c
m-1
448 c
m-1
SIL
SIL/IBU/PEI
SIL/IBU/PEI/PSS
SIL/IBU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 100 200 300 400 500 600
t (min)
Re
lea
se
ra
te %
SIL/IBU
SIL/IBU/PEI
SIL/IBU/PEI/PSS First-order Rate Model
R2=0,9846
kd=0,0024s-1
First-order Rate Model
R2=0,9902
kd=0,0014s-1
First-order Rate Model
R2=0,9854
kd=0,001s-1
Elsőrendű Sebességi Modell a kioldódás mechanizmusára
•kitozán, alginát - biokompatibilis, biodegradábilis,
-alkalmazhatóságát széleskörűen vizsgálják hatóanyagok és vakcinák szállítására
nyálkahártyán keresztül
•CaCO3 -nem toxikus,
-mérete és morfológiája szabályozható,
-könnyen eltávolítható,
•CMC -összekapcsolódik a Ca+ ionokkal, ezáltal szabályozza a képződő CaCO3 részecskék méretét,
-úgy viselkedik mint egy „ragasztó”, összefogja a nanorészecskéket egymással és gömb alakú
mikrorészecskéket formál.
(a) Kitozán, (b) Na-alginát és (c) karboximetil-cellulóz (CMC) szerkezeti
képlete
„Hollow spheres” előállítása biokompatibilis poliszacharidokból
CaCO3(CMC)
templát
+ kitozán
NaCl közeg,
pH=5
+ alginát
NaCl közeg,
pH=5
+ n × (kitozán, alginát)
+Glutáraldehid + EDTA
Kitozán alginát „hollow spheres” előállítása
CaCO3(CMC) + n ×
0.05% kitozán (0.5M NaCl, pH=5)
0.1% alginát(0.5M NaCl, pH=5)
CaCO3(CMC) templát
(Fénymikroszkópos felvétel)
CaCO3(CMC )-(chit-alg)3
(Fénymikroszkópos felvétel) CaCO3(CMC)-(chit-alg)3 (TEM felvétel)
+ Rhodamin B
CaCO3(CMC)/(Chit-Alg)3 – Rhodamin B
fénymikroszkópos felvétele
+ 1% Glutáraldehid
+ 0.2M EDTA
(chit-alg)3 hollow spheres
fénymikroszkópos felvétele
Munkatársak
MTA-SZTE Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoport
Dr. Benkő Mária
Dr. Majzik Andrea
Garabné Ábrahám Nóra
Juhász Ádám
Varga Viktória
Dr. Sebők Dániel Dr. Janovák László
Szalmáné Ménesi Judit
Varga Noémi
Tallóssy Szabolcs
Juhászné Dr. Csapó Edit
Veres Ágnes
