Alberto Castro Lina

Polo Kevin Vera

Melissa Páez

Universidad del Atlántico

07/06/2013

2013PROCESO BIOTECNOLÓGICO: PRODUCCIÓN DE HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA POR MEDIO DE LA ESCHERICHIA

COLI

PROCESO BIOTECNOLÓGICO: PRODUCCIÓN DE HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA POR MEDIO DE LA ESCHERICHIA COLI

ALBERTO CASTRO

LINA POLO

KEVIN VERA

MELISSA PAEZ

ING. SANTANDER BOLIVAR

BIOPROCESOS

INGENIERÍA QUÍMICA

UNIVERSIDAD DEL ATLÁNTICO

2013

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INTRODUCCION

La producción de bienes y servicios que se realiza por medio de tratamientos de materiales orgánicos e inorgánicos, basándose en los sistemas biológicos y la aplicación de los principios de la ciencia y la ingeniería se conoce como BIOTECNOLOGÍA. Este campo interdisciplinario es una de las áreas de mayor crecimiento y es ampliamente usada en el desarrollo de procesos industriales en cuatro grandes áreas como lo son la salud, el medio ambiente, la agricultura para uso alimentario y la producción de cultivos como materia prima de otros productos (plásticos biodegradables, aceites vegetales, biocombustibles). La biotecnología industrial busca la optimización y aumento de la producción de estos productos importantes para el mercado actual.

Uno de los avances destacados de la biotecnología en el área de la salud es la elaboración de proteínas terapéuticas con la aplicación de técnicas de la ingeniería genética. Generalmente son hormonas que regulan las actividades metabólicas del cuerpo humano, siendo entonces su obtención un proceso funcional y activo debido a su gran valor comercial. La eritropoyetina, insulina, interferón y hormona del crecimiento humana (hGH) son las hormonas de mayor producción en la industria.

Este proceso se realiza por medio de un organismo distinto de su fuente natural, usando la tecnología del ADN recombinante, que permite la clonación del gen responsable de fabricación del producto deseado. Por lo general, se usan bacterias en las cuales se introduce el gen humano (información genética del ADN) clonado que tienen las instrucciones para crear dichas proteínas, de ahí en adelante estas bacterias, modificadas genéticamente, suman ahora una tarea más a su vida cotidiana.

Este trabajo se basará en la producción de hormonas de crecimiento humano creadas por la Escherichia Coli. La Somatotropina u hormona de crecimiento humano (hGH) es una proteína no glicosilada con una estructura molecular que consiste en una secuencia de 191 aminoácidos, secretada de forma natural por las células somatotropos dentro de las alas laterales de la glándula pituitaria anterior; su principal efecto es la estimulación del crecimiento del esqueleto y de todos los demás tejidos del cuerpo mediante la estimulación de la síntesis de proteínas y el rompimiento de ácidos grasos para proveer energía. Químicamente esta hormona estimula el hígado para producir somatomedinas (hormonas secundarias) que poseen un efecto similar al de la insulina. El nivel de hGH se eleva progresivamente durante la niñez y alcanza su pico durante el crecimiento desmedido que ocurre en la pubertad.

La forma recombinante de la hGH es aplicada en el tratamiento del enanismo hipofisario, niños con deficiencia de hormona de crecimiento, las niñas con síndrome de Turner, los niños con insuficiencia renal crónica y adultos con deficiencia de hormona de crecimiento humana o contagiadas por el virus de la inmunodeficiencia humana VIH. Por otra parte, se utiliza en el tratamiento de heridas, fracturas óseas, úlceras sangrantes, quemaduras y para mantener la salud en los ancianos.

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En 1956, la hormona del crecimiento humana se aisló por primera vez a partir de pituitarias humanas y la estructura bioquímica de la proteína se encontró en 1972. Hasta 1979, la hormona se obtuvo mediante la extracción de pituitarias humanas por lo que su disponibilidad es muy limitada. Entonces, la proteína se había tratado de obtener recombinante mediante el uso de diferentes microorganismos. Goeddel y col. (1979) produjo hGH como un resultado de la técnica de ADN recombinante por primera vez en 1979 y la forma nativa de la proteína era obtenido por Gray et al. (1985) mediante el uso de Escherichia coli como microorganismo anfitrión.

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MARCO TEÓRICO

TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE

El objetivo de esta tecnología es la obtención de grandes cantidades de un gen específico. Para ello, se selecciona el gen de interés proveniente de un organismo determinado, y es insertado dentro del material genético de un segundo organismo, el cual tiene las condiciones necesarias para producir a gran escala el producto deseado.

En primer lugar debe seleccionarse un vector, el cual es el medio por el cual se introduce el ADN recombinante en la célula huésped. Los plásmidos son un tipo común de vector y consisten en anillos accesorios y pequeños de ADN de una bacteria. Estos no hacen parte de los cromosomas de dichos microorganismos y por ende se pueden replicar de manera independiente.

A continuación se emplea una enzima de restricción, la cual segmenta el ADN del plásmido. Seguidamente se usa una segunda enzima, el ADN ligasa, la cual sella el gen deseado en el orificio que originó la enzima de restricción.

Las enzimas de restricción se sintetizan de forma natural dentro de las bacterias, donde interrumpen la reproducción viral al cortar el ADN de los virus. Cada una de estas enzimas corta el ADN en un sitio de segmentación específico. Esto quiere decir que una vez realizado el corte, el fragmento de ADN que se quiere insertar puede ser añadido, siempre y cuando termine en las bases complementarias de las que expone la enzima de restricción. Para ello solo es necesario segmentar el gen deseado con el mismo tipo de enzima de restricción empleado en el plásmido.

Una vez que el ADN ligasa termina de sellar el gen deseado, se ha creado una molécula de ADN recombinante (ADNr). Después solo es cuestión de insertar el plásmido en el organismo anfitrión establecido, el cual al reproducirse también lo hará con el vector insertado. Este nuevo gen proveerá las órdenes necesarias dentro de la célula para sintetizar el compuesto deseado, que en este caso en particular es la hormona del crecimiento humano. Dicha hormona es de carácter proteico y por ende cae dentro de la categoría de proteína recombinante (ya que es producida por medio de la tecnología ADNr).

Las proteínas recombinadas han causado un gran impacto en el mundo farmacéutico, de hecho los cinco mercados más grandes mundialmente son los del tratamiento y diagnóstico para el cáncer, diabetes, problemas de crecimiento, hemofilia y hepatitis. La producción de estos va de mano con la demanda, un claro ejemplo de la situación, es que en el 2006 aproximadamente 162 nuevos productos biofarmacéuticos fueron aprobados de los cuales el 70% fueron proteínas recombinantes, y es que, en el 2004 el mercado de biofarmacéutico ya se encontraba estimado en

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4,4 billones de dólares y se proyecta que sea de 70 billones para finales de década, del cual el 15% está representado por proteínas recombinantes.

Las proteínas recombinantes terapéuticas se han agrupado en cinco categorías diferentes de acuerdo a su utilización en factores sanguíneos recombinantes (utilizado como indicadores de hemofilia), trombolíticos y anticoagulantes recombinantes, hormonas recombinantes (por ejemplo, insulina y las hormonas de crecimiento), factores de crecimiento recombinantes (por ejemplo, eritropoyetina), interferones e interleuquinas recombinantes (utilizado por ejemplo en las indicaciones de la hepatitis). En uso terapéutico la dosis de una proteína terapéutica por ejemplo, eritropoyetina o humana hormona del crecimiento, es por lo general unos pocos microgramos de proteína.

En cuanto al sistema de alojamiento, la mayoría de las proteínas para uso terapéutico o diagnostico son producidos o cultivados ya sea en E. Coli, Saccharomyces cerevisiae, o en líneas celulares de mamíferos, como por ejemplo, en ovarios de hámster chino (OCH), riñón de hámster bebe (BHK) y células hibridoma.

Entre los sistemas de alojamiento usados para la producción, el más utilizado es el E. coli, como se puede apreciar a continuación.

Ilustración 1. Organismo huésped en la producción de aprobado terapéutico proteínas (hasta junio 2006)

En el momento de seleccionar el sistema de alojamiento o huésped, para una proteína específica, se puede elegir basándose en la multiplicidad de los distintos sistemas. En el caso de la bacteria Escherichia Coli, usualmente se utiliza como punto de partida para cualquier clonación y expresión de esfuerzo, porque tiene una variedad de sistemas de expresión y es fácil de cultivar. Aunque la E.Coli es el más utilizado no quiere decir que sea obligación utilizar este o que sea el óptimo, por ejemplo aunque el cultivo en células de mamíferos es más complejo y costoso, a menudo es la única opción para producir grandes proteínas que requieren una amplia glicosilación post-traduccional.

Cabe resaltar que al momento de seleccionar el alojamiento idóneo, la glicosilación de los productos debe ser el primer criterio a tener en cuenta, mientras que la producción anual requerida es a menudo el segundo criterio. La glicosilacion es importante ya que este es el primero de los cuatro pasos principales de modificación en la síntesis de las proteínas de las células. Es la modificación tanto en etapa traduccional como postraducción que puede sufrir una proteína y se logra adicionando un glúcido a otra molécula.

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Cada sistema tiene diferentes ventajas y desventajas. Además de la titulación y la capacidad de realizar modificaciones post-traduccionales, en las cuestiones prácticas, las consideraciones incluyen el medio de la actividad de inducción y de la proteasa del huésped; de igual manera para escala industrial también es importante tener en cuenta la carga de regalías de la célula huésped y vector, el costo de las materias primas, subproductos nocivos (por ejemplo, las endotoxinas, la expresión de proteínas asociadas a tumores, contaminantes bacterial), reproducibilidad, escalabilidad, y facilidad de contaminación célula huésped.

Estudios han comparado las propiedades de diferentes sistemas recombinantes (E. coli, P. pastoris y líneas de células de insectos) para la producción de interleuquina-2 humana (hIL-2), los diferentes sistemas de producción se compararon en términos de la productividad y calidades de productos. En la siguiente tabla se puede apreciar en la siguiente tabla.

Tabla 1. Características de los principales sistemas usados para el ADNr

E. coli Levadura Insecto MamíferoÍndice de crecimiento Muy rápido Rápido Despacio Muy lento

Rendimiento de expresión (basado

en peso seco)

Alto (1-5%)Alto (> 1%)

Muy alta (30%)

Muy bajo (<1%)

Productividad Muy alta Alto Alto BajoCosto de Medios Muy bajo Bajo Alto Muy alta

Las técnicas de cultivo Muy fácil Fácil Difícil Muy difícil

El coste de producción Muy bajo Bajo Alto Muy altaEl plegamiento de proteínas Razonable Bueno Muy bueno Muy bueno

Glicosilación simple No Sí Sí SíGlicosilación Compleja No No Sí Sí

Secreción Pobre Muy bueno Muy bueno Muy buenoDisponibilidad de los recursos

genéticosSistemas

Muy bueno BuenoRazonable Razonable

Problema pirógenos Posible No No No

A continuación se presenta las ventajas y desventajas de cada uno de los sistemas de alojamiento mencionados en la anterior tabla:

E. COLI: Como se puede apreciar el costo del cultivo en E. Coli son bastante bajos en comparación con los cultivos en células mamíferas. A pesar de las varias alternativas la E. Coli es la más utilizada mundialmente para cultivos debido a su rapidez, economía de posibilidades de producción, homogeneidad de la proteína recombinante y tiempo de generación corto. Sin embargo, la tendencia a la formación de cuerpos de inclusión puede ser un problema en la producción de proteínas recombinantes, así como también, la incapacidad de la E. Coli para realizar modificaciones luego de la traducción y el hecho de que no hay ningún mecanismo de secreción para la liberación eficiente de las proteínas en

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el medio de cultivo. Mas sin embargo, si no se requieren modificaciones post-traduccionales, la E. coli es una buena opción.

LEVADURAS: (S.cerevisiae) muy recomendado para la producción de insulina y hormonas de crecimiento y en adición la mayoría de las vacunas son producidas en este medio. La Pichia pastoris, se presenta como un huésped bastante atractivo ya que puede llegar a crecer a grandes densidades y es también de fácil manipulación como la E.Coli. En comparación con los sistemas de células de mamíferos, levaduras tienen la tasa de crecimiento más rápido, y generalmente también producen cantidades más altas de la proteína producto. En términos de producción de título, P. pastoris es uno de los huéspedes de expresión más productivos, con los títulos de proteínas recombinantes, incluso hasta 14 g / litro. Una ventaja adicional es la secreción de los productos de proteína en el medio de crecimiento, el cual por lo general hace que el procesamiento de aguas abajo más fácil.En cuanto a las desventajas, la generación de Glicosilación no deseada de la proteína recombinante, aunque el grado de glicosilación depende de la cepa, así como en el sistema de expresión utilizado. En general, el grado de glicosilación en P. pastoris no es tan alto como en S. cerevisiae.

CÉLULAS DE INSECTOS: este sistema ha estado ganando terreno rápidamente, en el 2007, se produjo la primera vacuna (Cervarix ®) utilizando células de insecto, para el cual se uso el baculovirussustem. Hasta la fecha, muchas proteínas recombinantes han sido producidas usando líneas celulares de insecto ya han sido aprobadas para su uso en la medicina veterinaria.En comparación con las células de mamíferos, la facilidad de cultivo, de alta tolerancia de la osmolalidad y las concentraciones de subproductos, así como los niveles de expresión más altos, se consideran como ventajas de los sistemas de células de insectos. Las células de insectos son también capaces de llevar a cabo las modificaciones post-traduccionales algunos sistemas no pueden.

CÉLULAS MAMÍFERAS: Casi todas las proteínas recombinantes que se producen en cultivos de células de mamíferos se producen con CHO y BHK (ovarios y riñones de hamsters), Otras líneas celulares de mamífero utilizadas en producciones biofarmacéuticas son líneas celulares de mieloma murino y de células hibridoma.Los cultivos de células de mamífero son la única forma de producir grandes biomoléculas que requieren glicosilación específica. Las desventajas de las células de mamífero son la lenta tasa de crecimiento y rendimiento de expresión muy bajo, estos factores hacen que el cultivo en la célula de mamífero sea muy costoso.En los últimos 15 años, las tecnologías de expresión y técnicas de cultivo (por ejemplo procesos de perfusión de alimentación por lotes y) han mejorado y dio lugar a mejoras significativas en la productividad.

Por otro lado, en lo referente al bioreactor y la estrategia de producción, las proteínas regeneradas pueden ser producidas en diferentes tipos de birreactores. La elección depende, por ejemplo, el huésped de expresión y la producción escala. A continuación se explicará con mayor detalle.

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BIOREACTORES

BIOREACTORES TIPO BATCH

En este tipo de reactores primero hay una etapa de esterilización. Luego se procede a introducir el inóculo de microorganismos, seleccionados previamente para obtener un resultado específico. Durante el periodo de reacción, la cantidad de células, sustrato y concentración de productos varía con el tiempo. Finalmente, si la reacción es areobia se introduce un flujo de oxígeno de forma semi-continua. De igual manera si existes productos secundarios gaseosos como el CO2, estos se remueven de la misma forma.

Este tipo de bioreactores tienen las siguientes ventajas:

Riesgo mínimo de contaminación o mutación celular debido al periodo de crecimiento relativamente corto.

Menor inversión de capital que en los bioreactores continuos. Mayor flexibilidad en el cambio del sistema producto/microorganismo. Conversiones totales más altas que en el caso continuo

Entre las desventajas están las siguientes:

Los niveles de productividad más bajos debido al tiempo para el llenado, calefacción, esterilización, enfriamiento, vaciar y limpiar el reactor.

Mayor enfoque en la instrumentación debido a la frecuente esterilización. Mayor gasto incurrido en la preparación de varias subculturas para la inoculación. Los riesgos de higiene industrial más grande debido al posible contactocon

microorganismos patógenos o toxinas.

Las aplicaciones más comunes para los biorreactores por lotes incluyen:

Los productos que deben ser producidos con un riesgo mínimo de contaminación o mutación organismo.

Operaciones a baja escala Los procedimientos que utilizan un reactor para hacer varios productos.

BIOREACTORES DE FLUJO CONTINUO

En este caso hay un flujo constante en la entrada de materia prima y la salida de productos.

Estos sistemas proporcionan una serie de ventajas, incluyendo:

Mayor potencial para la automatización del proceso. Reducción del costo de trabajo, debido a la automatización. Menos tiempo improductivo gastado en el vaciado, llenado y la esterilización del reactor. Calidad constante del producto debido a la operación invariable parámetros. Disminución de los riesgos de toxicidad para el personal, debido a la automatización.

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Las desventajas de biorreactores continuos incluyen:

flexibilidad mínima, ya que sólo son permisibles ligeras variaciones en el proceso (rendimiento, composición del medio, concentración de oxígeno y temperatura).

Uniformidad obligatoria de calidad de la materia prima es necesaria para asegurar que el proceso sea continuo.

Mayores costos de inversión en control y automatización de equipos, y el aumento de los gastos para la esterilización continúa del medio.

Mayores costos de procesamiento con reposición continúa de sustratos no solubles, sólidos, tales como paja.

Los bioreactores continuos se utilizan con frecuencia para procesos a gran escala y para procesos que implican microorganismos con alta estabilidad a la mutación.

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PRODUCCIÓN DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO POR FERMENTACIÓN A ALTAS DENSIDADES DE E. COLI RECOMBINANTE 4

Desde 1997, aplicando la tecnología de ADN recombinante, Bio Sidus produce hGH (hormonas de crecimiento) a partir de la fermentación de bacterias que poseen el gen humano para dicha proteína.

En un primer paso se utiliza el cultivo continuo para determinar las características fisiológicas de la cepa como la velocidad de crecimiento y como varía su producción según la fuente de sustrato, que factores de crecimiento son necesarios, y cuáles son las condiciones óptimas de pH y temperatura, entre las características más importantes.

La fermentación de nuestra proteína se produce en un biorreactor de tipo batch, el método se basa en la utilización de E. coli k802 como el lugar de hospedaje para el plásmido recombinante que contenga la información de producción de la hGH (pSSM), en otras palabras nuestro sustrato.

Se hace una inoculación de la misma en un medio LB (polipeptona 10 g/l, extracto de hongo no filamentoso 5 g/l y cloruro de sodio 5 g/l) a un pH ajustado a 7, se le da como fuente de carbono, glicerol en vez de glucosa, para disminuir el tiempo de fermentación y evitar que produzca subproductos como el acetato que inhibe su crecimiento. Las semillas de E. coli cultivadas se transfieren a un tanque que contiene 200 ml del medio LB con 100ðg/ml de concentración de ampicilina donde se hace una incubación durante toda la noche a 37°C y 220 rpm en un agitador orbital, a lo que resulta bajo estas condiciones se le conoce como cultivo primario.

El contenido total de este tanque se utiliza para inocular el fermentador que contiene un medio con 45 g de KH2PO4 (fosfato de potasio monobásico); 256g de NaHPO4 (fosfato de sodio) * 12H2O; 15 g de NH4Cl (Cloruro de amonio); 7.5 g de MgSO4 * 7H2O; 0.5 g de CaCl2; 7.5g de NaCl; 750 g de triptona; 375 g de extracto de hongo no filamentoso y 121 de agua de osmosis inversa que se agregó al medio para un proceso “batch” de duración aproximada de 10 horas a 37°C y pH controlado de 7.2, oxígeno disuelto controlado por medio de la incrementación de la agitación desde 300 rpm hasta 600 rpm, seguidas de adiciones de mezclas de aire y oxígeno puro de 1 vol/vol/min (flujo total) para mantener relativo oxígeno disuelto sobre el 20% de saturación. Todo esto se llevó a cabo con una alimentación “batch” de fermentación de soluciones consistentes de triptona 200 g/l; extracto de hongo no filamentoso 100 g/l; glicerol 21 y 21 de agua de osmosis inversa agregada a la solución. Inicialmente se alimentó a una velocidad de 2ml/min 50% de glicerol, Esto con el objetivo de mantener el medio nutritivo fresco. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento (μ) del microorganismo.

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Es muy útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, o sea cuando el rendimiento celular o la productividad de biomasa o del producto es lo que interesa. Este método evita fenómenos de inhibición por sustrato.

Después de 2 horas se elevó a 5 ml/min y de 6 horas en adelante se mantuvo la velocidad de 5 ml/min pero en vez de glicerol se añadió la solución anteriormente mencionada para mantener la alta densidad de la fermentación. Finalmente, se extrae la hormona de crecimiento acumulada de manera intracelular.

Este método ha sido desarrollado para mejorar la productividad y dar ventajas tales como reducción de volumen, bajos costos de producción y bajos costos de inversión en equipo.

Los mayores beneficios de la biofarmacéutica sobre el cultivo de células (utilización de microorganismos recombinantes) son los bajos costos de producción, y la relativa facilidad de utilizar una escala más grande.

CONTROLES:

Determinación de la densidad celular por densidad óptica a 600nm. El peso seco se estima relacionado linealmente el peso seco y la OD600. La concentración de glucosa (o glicerol) se puede medir con ensayos enzimáticos utilizados en glucemia (o triglicéridos). La concentración de fosfato se determina por un kit de diagnóstico basado en la reacción entre el fosfato y el amonio molibdato para formar ácido fosfomolibdico, que forma un complejo azul con sulfato amónico ferroso. Las proteínas en las muestras se precipitan con ácido tricloroacético antes de analizar el fosfato para evitar interferencia. La proteína recombinante producida se mide con el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) y rutinariamente medido por SDS-PAGE y Western Blot para determinar su presencia. Este último es cualitativo ya que sus valores son mayores comparado con el método ELISA que es más sensible (que es cuantitativo).

PURIFICACIÓN:Para la extracción de la preparación cruda del material de origen se utiliza una centrífuga de discos de tazón abierto, o se realiza una filtración que retenga partículas más pequeñas que no pude separar la centrífuga. Los dos son sistemas cerrados que evitan la formación de aerosoles, lo que los hacen ideal para el manejo de microorganismos patógenos o sustancias tóxicas.Estos equipos deben contar con instalaciones que regulen y controlen los fenómenos de generación de calor, formación de aerosoles y de ruido.La más grave limitación es el taponamiento (fouling) de las membranas, lo que disminuye el flujo.

El taponamiento irreversible puede ocurrir por las siguientes circunstanciasCiertas proteínas se adsorben a la superficie de la membrana.

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Los desechos celulares forman una fina capa sobre la membrana. Los compuestos químicos utilizados normalmente como antiespumantes en una fermentación pueden ocluir irreversiblemente los poros de las membranas.

Existen protocolos de ciclos de lavado para eliminar los depósitos sobre la superficie de las membranas dependiente del tipo de muestra y las características químicas de las membranas.

A medida que aumenta el diámetro de la partícula a separar, el costo de separación por centrifugación decrece mientras que para la filtración no se ve afectado. Con la filtración puede ser que las membranas no sean compatibles con el producto o no se pueda eliminar la interacción con los antiespumantes.

La centrifugación requiere un mayor capital inicial y poco de mantenimiento en cambio en los sistemas de filtración se requiere la compra de cartuchos de membranas periódicamente lo que se lleva el mayor capital.Para la elección de estas técnicas se depende de la escala del proceso, cuando se requieren procesar volúmenes muy grandes la centrifugación se hace mucha más competitiva a la filtración. Pero en este caso se complementan.

En el caso de tratarse de una proteína con destino extracelular, los métodos antes descriptos serían suficientes para entrar en el siguiente paso de purificación, pero lo que ocurre con mayor frecuencia es que las proteínas recombinantes formen cuerpos de inclusión o en menor medida, encontrarse en el citoplasma, de forma soluble.Si se trata de los últimos dos casos, es necesaria la lisis celular para liberar el material proteico.

A escala de laboratorio, esto se logra mediante ruptura con ultrasonido o lisis química. A gran escala lo más común es el uso de homogeneizadores por tener mayor capacidad. El material biológico se coloca bajo una fuerte presión hidrostática (alrededor de 500 atmósferas) y la presión se libera bruscamente permitiendo que el líquido salga por una válvula, lo que ocasiona la lisis celular.Si la proteína es soluble, una vez que se han lisado las células, los restos celulares se retiran bien por centrifugación de gran capacidad a baja velocidad o por filtración en membrana. Al final se obtiene un líquido libre de células que es el que sufre los tratamientos posteriores para aislar y en su caso purificar el producto de interés.

Si la proteína será purificada a partir de los cuerpos de inclusión, el producto de interés es el precipitado de la solución lisada, tras la centrifugación. Este material luego debe ser resuspendido para su purificación.

La purificación final forma parte de las etapas más caras en la recuperación del producto implican el uso de métodos cromatográficos. Tales métodos son de especial valor para la purificación de materiales biológicos sensibles y encuentran un amplio uso en la preparación de materiales farmacéuticos, reactivos de diagnóstico y reactivos para investigación. Los distintos métodos

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cromatográficos que existen según su mecanismo de separación son: filtración en gel (peso molecular), cromatografía de adsorción (interacciones hidrofóbicas), cromatografía de intercambio iónico (carga), cromatografía de afinidad (actividad biológica) y electroenfoque (punto isoeléctrico).

ESQUEMA GENERAL DEL PROCESO (MICROORGANISMO QUE GENERA EL PRODUCTO DE INTERÉS)

Esquema 2: Procesos generales a desarrollar para la obtención de una proteína recombinante en bacterias

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No solo el producto debe ser purificado sino también los insumos del proceso como también las instalaciones, es decir, contar con materias primas y elementos esterilizados libres de potenciales contaminantes del proceso.

Parámetros de evaluación de la purificación.

Durante los procesos de purificación se llevan a cabo controles para determinar su eficiencia y determinar si los métodos utilizados son los óptimos. Este paso es el que determina el tipo de inversión a realizar.

Rendimiento: % = cantidad de producto después de la purificación x 100/cantidad de producto en el material de partida Pureza: Actividad específica (AE) = cantidad de proteínas de interés /cantidad total de proteínas. Factor de purificación = AE luego de la purificación/AE antes de la purificación. Costo del producto = costo del material de partida + expensas /rendimiento. Expensas = f (costo de materiales de purificación, equipamiento, personal, etc.).

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CONCLUSIONES

En este trabajo se estudiaron las condiciones para la producción a escala industrial por medio de reactores tipo Batch empleando E.Coli como huésped. La Escherichia Coli es escogida generalmente debido a la rapidez con la cual lleva a cabo su proceso, su economía y alto rendimiento.

Una vez seleccionado el vector y el huésped, se procede a seleccionar una colonia por medio de un crecimiento primario, en el cual se caracteriza fisiológicamente la sepa y se escoge la línea que mejor desempeño haya tenido (se haya adaptado mejor al medio). Esta cepa pasa entonces a formar el inóculo a insertar en el reactor Batch, en el cual se mantiene un pH alrededor de 7.2 y una temperatura de 37°C. El proceso puede demorar aproximadamente 10 horas y requiere desarrollarse en un medio LB.

Teniendo en cuenta que la hormona del crecimiento humano no es secretada por la E. Coli fuera de la misma, y siendo además no soluble en el citoplasma, sino existiendo como un agregado sólido, se debe llevar a cabo una purificación que consta de filtrado o centrifugado, lisis celular, resuspensión de la proteína y cromatografía. De todos ellos, el último es el que representa los mayores costos operativos.

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REFERENCIAS

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