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0086Préparel'ADNàl'analyseparséquençagesurle
séquenceurIlluminaMiSeq
HOLOTYPEHLA™24/7–CONFIGURATIONA1ET
CE/A2ETCE/A3ETCE/A4ETCEMODED'EMPLOIVERSION9
02/05/2018Réservéàunusagediagnostiqueinvitro
OmixonHolotype24/7–CONFIGURATION|A1etCE/A2etCE/A3etCE/A4&CE|Moded'emploi,version9.Réservéàunusagediagnostiqueinvitro.Copyright©2017,OmixonBiocomputingLtd.Confidentieletexclusif.
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TabledesmatièresINFORMATIONSSURLEFABRICANT...........................................................................................................7
EXPLICATIONDESSYMBOLES.....................................................................................................................7
HOLOTYPEHLA-24/7–CONFIGURATIONA1ETCE/A2ETCE/A3ETCE/A4ETCE–CONTENUDUKIT..........8
COFFRETDECOMPOSANTSD'AMORCES...................................................................................................................8COFFRETCOMPOSANTDEREACTIFSDEPREPARATIONDEBANQUES...............................................................................9PLAQUED'ADAPTATEURSA96PUITS......................................................................................................................9CLASSEUREXCEL.................................................................................................................................................9LOGICIEL–OMIXONHLATWIN..........................................................................................................................10
EXPEDITIONETSTOCKAGE........................................................................................................................10
AVERTISSEMENTSETMISESENGARDE.....................................................................................................10
LIMITATIONSCONNUESDESPRODUITS..................................................................................................................11
INFORMATIONSRELATIVESALASECURITE...............................................................................................11
PARAMETRESDEPERFORMANCE.............................................................................................................11
ASSISTANCETECHNIQUE..........................................................................................................................11
ÉQUIPEMENT,REACTIFSETFOURNITURES...............................................................................................12
RECOMMANDATIONSENMATIERED'EQUIPEMENTTECHNIQUE...................................................................................12RECOMMANDATIONSENMATIEREDEREACTIFSASSOCIES..........................................................................................12
CapacitédukitderéactifsMiSeq.....................................................................................................................13FOURNITURESRECOMMANDEES..........................................................................................................................13
MENTIONLEGALE.....................................................................................................................................14
UTILISATIONPREVUE...............................................................................................................................14
NOTEIMPORTANTEAVANTUTILISATION.................................................................................................15
RECOMMANDATIONENMATIERED'ISOLATIONDEL'ADNGENOMIQUE.......................................................................15
PRINCIPEDELAMETHODE........................................................................................................................16
RESUMEDESETAPES................................................................................................................................17
GLOSSAIRE/DEFINITIONS..........................................................................................................................18
ÉTAPE1–PREPARATIONDUMELANGEDEREFERENCEPOURL'AMPLIFICATIONHLA...............................19
LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................19PROTOCOLE.....................................................................................................................................................19
Mélangederéférence:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1..............................................................................20Mélangederéférence:HLA-DQB1Set3..........................................................................................................20
ÉTAPE2–AMPLIFICATIONDESHLADECLASSEIETII...............................................................................21
LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................21PROTOCOLE.....................................................................................................................................................21
MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1...................................21MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-DQB1Set3...............................................................22AmplificationdeclasseI(HLA-A,BetC)..........................................................................................................22AmplificationdeclasseII(HLA-DRB1,DPB1,DQA1etDQB1)..........................................................................22Taillesattenduesdesamplicons.......................................................................................................................23
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ÉTAPE3–QUANTIFICATIONETNORMALISATIONDESAMPLICONS(AL'AIDED'UNFLUOROMETREDEPLAQUE)...................................................................................................................................................24
LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................24PROTOCOLE.....................................................................................................................................................25
Regroupementdesamplicons..........................................................................................................................26PurificationdesproduitsdePCRavecExoSAP-ITExpress................................................................................26
ÉTAPE4–PREPARATIONDESBANQUES...................................................................................................27
LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................27PROTOCOLE.....................................................................................................................................................27
Mélangederéférencedefragmentation.........................................................................................................28Programmedefragmentation.........................................................................................................................28Mélangederéférencederéparationdesextrémités.......................................................................................29Programmederéparationdesextrémités.......................................................................................................29Mélangederéférencedeligation....................................................................................................................30Programmedeligation....................................................................................................................................30Regroupementetpurificationdesbanques.....................................................................................................31
ÉTAPE5–SELECTIONDELATAILLEDESFRAGMENTSDELABANQUE.......................................................33
LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................33PROTOCOLE.....................................................................................................................................................33
ÉTAPE6–QUANTIFICATIONDELABANQUEAUMOYENDEL'APPAREILQPCR.........................................34
LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................34PROTOCOLE.....................................................................................................................................................34
Mélanged'amorcesqPCR................................................................................................................................34MélangederéférenceqPCR.............................................................................................................................35
ÉTAPE7–SEQUENÇAGESURLESYSTEMEILLUMINAMISEQ.....................................................................37
LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................37CapacitédukitderéactifsMiSeq.....................................................................................................................37
PROTOCOLE.....................................................................................................................................................37
ÉTAPE8–ANALYSEDESDONNEESDESEQUENÇAGEHLA.........................................................................39
PROTOCOLEAUTOMATISE...................................................................................................................................39Paramétrageetconfigurationinformatique....................................................................................................39Protocoleparanalyse.......................................................................................................................................39
PROTOCOLEMANUELSERVEUR............................................................................................................................39Paramétrageetconfigurationinformatique....................................................................................................39Protocoleparanalyse.......................................................................................................................................39
PROTOCOLEMANUELBUREAU............................................................................................................................40Paramétrageetconfigurationinformatique....................................................................................................40Protocoleparanalyse.......................................................................................................................................40
FIGURESSUPPLEMENTAIRES....................................................................................................................41
EXEMPLESDEPLAQUESD'AMPLICONS,D'AMPLIFICATION,DEDILUTION,DEQUANTIFICATIONDESAMPLICONS(POURUNLOCUSINDIVIDUEL)ETDEREACTIONS.............................................................................................................................41EXEMPLEDEPLAQUEDEQUANTIFICATIONDESETALONS...........................................................................................41EXEMPLEDEPLAQUEQPCRDEQUANTIFICATIONDESBANQUESKAPA........................................................................42
ANNEXE1:SELECTEURAUTOMATISEPIPPINPREP...................................................................................43
PROGRAMMATIONDUPIPPINPREP......................................................................................................................43
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UTILISATIONDUSELECTEURAUTOMATISEPIPPINPREP.............................................................................................43
ANNEXE2:QUANTIFICATIONDESAMPLICONSAUMOYEND'UNAPPAREILQPCR...................................46
LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................46PROTOCOLE.....................................................................................................................................................46
ANNEXE3:QUANTIFICATIOND'UNEBANQUEUTILISANTUNMARQUEURCOULEURFLUORESCENTDSDNAINTERCALAIRE..........................................................................................................................................48
LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................48PROTOCOLE.....................................................................................................................................................48
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Historiquedudocument–Notesetmisesàjourimportantes
Version Date Auteur Résumédesmodifications Autorisépar
Dated’emission
V1 05/12/2015 Robert
PollockPremièreversion,ébauche Gergely
Tölgyesi05/12/2015
V2 18/01/2016 RobertPollock
Deuxièmeébauche,correctionsmineures GergelyTölgyesi
18/01/2016
V3 10/02/2016 RobertPollock
Troisièmeébauche,miseàjourdel'explicationdessymboles,miseàjourdelarecommandationdescyclesdecongélation/décongélation,miseàjourdel'utilisationprévue
GergelyTölgyesi
10/02/2016
V4 26/02/2016 RobertPollock
Quatrièmeébauche,miseàjourduchapitrerelatifauxconsignesdesécurité
GergelyTölgyesi
26/02/2016
V5 05/04/2016 RobertPollock
Cinquièmeversion,recommandationalternativerelativeàl'analysequantitativedesamplicons
EfiMelista 05/04/2016
V6 09/04/2016 EfiMelista
Changementmineurdelaformulationde«EnzymeLR-PCR»pour«Taqpolymérase»suiteàlamodificationdeladocumentationdeQiagen
GergelyTölgyesi
09/04/2016
V7 23/04/2016 EfiMelista
MiseàjourdeladéclarationDQB1Set1etSet2 GergelyTölgyesi
23/04/2016
V8 30/05/2016 GergelyTölgyesi
MiseàjourdesindicateursdeperformanceMiseàjourdesvolumesderéactifsdepréparationdesbanquesMiseàjourdesconfigurationsdeproduitpourlesplaquesd'adaptateursindexésA2/A3/A4
EfiMelista 30/05/2016
V9 29/11/2017 TündeVágó
Retraitde«DQB»desadditifsDQB,vérificationdugelaprèsquelaPCRdelongueportéesoitrenduefacultative,simplificationdel'analysequantitativedesamplicons,changementduvolumederegroupementparéchantillondansleskitsde11locus,remplacementdeExoSAP-ITparExoSAP-ITExpress,utilisationdeQubitpourlaquantificationdesbanques,mélanged'amorcesDQB1sets1et2remplacéparDQB1set3,diminutiondutempsderéactionderéparationfinale,diminutiondutempsderéactiondeligation,miseàjourdelaméthodedequantificationdesbanques,fiched'échantillonsuppriméedesannexes
EfiMelista 02/05/2018
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Clausedenon-responsabilité
Omixonamistoutenœuvrepours'assurerdel'exactitudeduprésentmoded'emploi.Omixondécline toute responsabilité en cas d'inexactitudes ou d'omissions qu'il pourrait contenir. Lesinformationsfourniesdanscemoded'emploisontsujettesàmodificationsanspréavis.Omixonn'assumeaucune responsabilité vis-à-vis de toute inexactitudeque leprésentmoded'emploipourraitinclure.
Omixonseréserveledroitd'apporterdesaméliorationsàcemoded'emploiet/ouauxproduitsquiysontdécrits,àtoutmomentetsanspréavis.
Dans le cas où vous trouveriez dans cemanuel des informations incorrectes, trompeuses ouincomplètes, vos commentaires et suggestions seront les bienvenus. Veuillez nous les faireparveniràl'[email protected].
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InformationssurlefabricantRaisonsociale:OmixonBiocomputingLtd
Adressedevisite:Fehérváriút50-52/6
Ville:Budapest
Codepostal:H-1117
Pays:Hongrie
Explicationdessymboles
Numérodelot
Numéroderéférence
Consulterlemoded'emploi
ContientdesréactifspourunnombreNdetests
Fabricantlégal.Ladatejointeapposéeàcôtédecesymboleestladatedefabrication.
Températuredestockagerecommandée
Datedepéremption
Dispositifmédicalpourdiagnosticinvitro
ContientuncomposantderemplacementComposantderemplacement
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HolotypeHLA-24/7–ConfigurationA1etCE/A2etCE/A3etCE/A4etCE–ContenudukitCe chapitre décrit le contenu des différentes configurations disponibles du produit HolotypeHLA24/7commesuit:
Typedeproduit N°DERÉF. RxnsHolotypeHLA24/7–ConfigurationA1etCE
H52 24
HolotypeHLA24/7–ConfigurationA2etCE
H56 24
HolotypeHLA24/7–ConfigurationA3etCE
H59 24
HolotypeHLA24/7–ConfigurationA4etCE
H53 24
Veuillez noter que le coffret Composant d'amorce et le coffret Composant de réactifs depréparation de banques sont identiques dans chaque configuration de produit. Le composantPlaqued'adaptateursindexésà96puitsdiffèreauniveaudelaséquencedesindexesdanschaqueconfiguration. Pour plus d'informations, veuillez consulter le chapitre Plaque d'adaptateursà96puitsci-après.
Coffretdecomposantsd'amorcesLe coffret de composants d'amorces fournit des solutions d'amorce prêtes à l'emploi pourl'amplificationcibléedelaPCRàlongueportéedesgènesHLAA,B,C,DPB1,DQA1etDQB1,etDRB1. De plus, il contient également deux types d'additifs de la PCR (Amplificateur 1 etAmplificateur2).
Mélanged'amorces N°DERÉF. Rxns Vol./tube Nbredetubes CodecouleurHLA-A P013 24 60μl 1 JauneHLA-B P023 24 60μl 1 RougeHLA-C P033 24 60μl 1 OrangeHLA-DRB1 P043 24 60μl 1 VertHLA-DQB1(Set3) P123 24 60μl 1 BleuHLA-DQA1 P073 24 60μl 1 BrunHLA-DPB1 P083 24 60μl 1 MauveAmplificateur1 E01 24 1100μl 1 TransparentAmplificateur2 E02 24 300μl 1 Transparent
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CoffretComposantderéactifsdepréparationdebanquesLe coffret de composants de préparation de banques contient les réactifs permettant lapréparationdebanques(fragmentation,réparationetadénylationdesextrémitésdesampliconsetligationdesséquencesd'adaptateursindexés)depuislesampliconsHLA.
Réactif N°DERÉF. Rxns Vol./tube Nbredetubes CodecouleurEnzymedefragmentation(A) R12 24 70μl 1 JauneTampondefragmentation(B) R22 24 70μl 1 RougeEnzymederéparationdesextrémités(C)
R32 24 41μl 1 Vert
Tamponderéparationdesextrémités(D)
R42 24 82μl 1 Orange
Enzymedeligation(E) R52 24 81μl 1 BleuTampondeligation(F) R62 24 900μl 2 Noir
Plaqued'adaptateursà96puitsLecomposantPlaqued'adaptateursindexésà96puitscontientdesadaptateursNGSindexésprêtsàl'emploi(oligonucléotidesd'ADNdoublebrin)ensolutionde5µl,pourlagénérationdebanquesNGS individuelles. La plaque d'adaptateurs indexés à 96 puits contient un nombre suffisantd'adaptateursindexéspourlagénérationde24banquesNGSindividuellesetpourl'identificationdeséchantillonsenaval.
Typedeproduit Réactifassocié N°DERÉF. Rxns Vol./puits Nbrede
plaquesHolotypeHLA24/7–ConfigurationA1etCE(RÉF.:H52)
Plaqued'adaptateursA1(i1-24) N4 24 5μl 1
HolotypeHLA24/7–ConfigurationA2etCE(RÉF.:H56)
Plaqued'adaptateursA2(i25-48) N7 24 5μl 1
HolotypeHLA24/7–ConfigurationA3etCE(RÉF.:H59)
Plaqued'adaptateursA3(i49-72) N8 24 5μl 1
HolotypeHLA24/7–ConfigurationA4etCE(RÉF.:H53)
Plaqued'adaptateursA4(i73-96) N9 24 5μl 1
ClasseurExcelUnclasseurExcelestfourniafindeprendreenchargelescalculs,lesagencementsdeplaqueetlatenuedesdossiersduprotocoleHolotypeHLA24/7,lacréationdesfichesd'échantillonMiSeqetplusencore.Sivousn'enpossédezpasunexemplaire,[email protected].
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Logiciel–OmixonHLATwinContactez [email protected] pour obtenir les crédits Omixon HLA Twin associés à votreacquisitiondukitHolotypeHLA24/7.
Noteimportante:Utilisez les trois composantsdukitOmixonHolotypeHLA24/7et le logicielOmixonHLATwinconjointement afin de constituer un flux de travail d'utilisation diagnostique in vitro. Veuillezconsulter le chapitre consacré aux avertissements et mises en garde associés aux limitationsd'utilisationdesproduits.
Lescomposantsderemplacementsontdisponiblessurdemandeexpressedesutilisateurs.VeuilleznoterquelesremplacementssontfournisparOmixonpourdescoffretsdecomposants,etnonpourdesflaconsindividuels.Pourplusd'informations,[email protected].
ExpéditionetstockageLesproduitssontexpédiéssurdescryopacksdansdesemballagesenStyrofoametdoiventêtrestockésà-20°Cdèsleurarrivée.Veuillezvaliderleprocessusdecontrôleetdesurveillancedetempératuredevoscongélateursetleréviserrégulièrement.
Leskitsnonouvertssontstablesjusqu'àleurdatedepéremption(indiquéesurl'étiquettedukit)lorsqu'ilssontstockésà-20°C.
Unefoisleproduitouvert,ilestrecommandéderespecterunmaximumde4(quatre)cyclesdecongélation/décongélationafindegarantir la stabilitéduproduit. Leskitsouvertssontstablesjusqu'à3moislorsqu'ilssontstockésà-20°C.
AvertissementsetmisesengardeLimitationsd'utilisationdesproduits
Afin de bénéficier des meilleures performances, veuillez appliquer le flux de travail du kitHolotypeHLA24/7etlelogicielOmixonHLATwinlorsdutypageHLAparNGSaveclesmatériaux,réactifsetéquipementrecommandésauchapitre«Équipementetréactifs».L'utilisationdematériauxautresqueceuxspécifiésauchapitre«Équipementetréactifs»doitêtrevérifiéeetvalidéeparl'utilisateur.Neprocédezpasàlareconstitutionouàladilutiondesréactifsdansdesvolumesautresqueceuxindiquésdansleprésentmoded'emploi.N'utilisezpasunvolumedesréactifs inférieuràceluiindiquédansleprésentmoded'emploi.Lenon-respectdecesindicationspeutconduireàdeserreursdeperformance.Omixon ne saurait fournir une assistance en cas de problèmes résultant du non-respect desétapesduprotocoledécritesdansleprésentmoded'emploi.N'utilisezpas leproduitencasdedommagevisibledesescomposants(flaconscassés,plaquerompue,capuchonsdesserrés,etc.).
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LimitationsconnuesdesproduitsVeuillez vous référer au document intitulé Product Known Limitations Guide (Guide deslimitations connuesdesproduits) afinde connaître les limitationset ambiguïtés logiciellesduproduitHolotypeHLA.Ceguideestdistribuéconjointementaumoded'emploimaissetrouveégalementsurlesiteWebOmixonsousMyHolotype/SupportetServices/HLATwinInstructionsforUse,ouestdisponiblesursimpledemandeàl'[email protected].
InformationsrelativesàlasécuritéAvant de commencer, veuillez lire les paragraphes « Informations relatives à la sécurité » et«Notes importantes » concernant les réactifs ou les kits indiqués au chapitre « Équipement,réactifsetfournitures».Lorsquevousemployezdesproduitschimiques,portezuneblousedelaboratoireadéquate,desgants jetablesetdes lunettesdesécurité.Pourplusd'informations,veuillez consulter lesFDS(Fichesdedonnéesde sécurité)appropriéesmisesàdispositionpar le fournisseurduproduitconcerné.Un descriptif des composants chimiques des réactifs est fourni dans les FDS du kit HolotypeHLA24/7,disponiblessursimpledemande.Procédezàl'éliminationdescomposantsduproduitentantquedéchetsmédicauxgénéraux.
ParamètresdeperformancePrincipauxparamètresdeperformanceétablisconformémentàlavalidationduproduit.
HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1
Sensibilité 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%
Spécificité 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%
Précision 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%
Exactitude 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%
Reproductibilité 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%
Répétabilité 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%
AssistancetechniquePouruneassistancegénéralerelativeàceprotocole,[email protected].
Assistancetéléphonique:
États-Unis|+1(617)5000790Europe|+36(70)5748001Autrespays|+1(617)5000790
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Équipement,réactifsetfournitures
Recommandationsenmatièred'équipementtechnique§ Thermocycleurauformat96puits§ Fluoromètredeplaque(outoutinstrumentcapablededétecterlafluorescencedesplaques
auformat96puits,utilisableaveclesystèmePromegaQuantiFluordsDNA)§ SélecteurautomatiséPippinPrep(RÉF.PIP0001)ouBluePippin(RÉF.BLU0001)deSAGE
Science§ InstrumentqPCRpourplaquesauformat96ou384puits§ FluoromètreQubit(RÉF.Q33216)deThermoFisherScientific(facultatif)§ SéquenceurIlluminaMiSeq(RÉF.SY-410-1003)§ Ordinateuren64bitsavecauminimum4cœurset16GodeRAM§ Supportsdestockagededonnéesàlongterme(approximativement2Todedonnéespar
séquenceurMiSeqetparan)
Recommandationsenmatièrederéactifsassociés§ KitsLongRangePCRdeQiagen(RÉF.206401,206402ou206403)
§ Chaqueéchantillonrequiert3,2μldeTaqpolymérase.§ LekitLongRangePCR(20)RÉF.206401contient8μldeTaqpolymérase.§ LekitLongRangePCR(100)RÉF.206402contient40μldeTaqpolymérase.§ LekitLongRangePCR(250)RÉF.206403contient100μldeTaqpolymérase.
§ ExoSAP-ITdeAffymetrix(RÉF.75001-200,75001-1ML,75001-4X-1MLou75001-10ML)§ Chaqueéchantillongroupérequiert4μld'enzymeExoSAP-IT.§ LeréactifRÉF.75001-200contient200μld'enzymeExoSAP-ITExpress.§ LeréactifRÉF.75001-1-MLcontient1mld'enzymeExoSAP-ITExpress.§ LeréactifRÉF.75001-4X-1MLcontient4mld'enzymeExoSAP-ITExpress.§ LeréactifRÉF.75001-10MLcontient10mld'enzymeExoSAP-ITExpress.
§ KitLibraryQuantification–Illumina/UniversaldeKAPABiosystems(RÉF.KK4824)§ KitdetestQubitdsDNABRAssay(RÉF.Q32850ouQ32853)(facultatif)
§ LekitRÉF.Q32850contient100tests.§ LekitRÉF.Q32853contient500tests.
§ SystèmeQuantiFluordsDNAdePromega(RÉF.E2670)§ KitdebillesAgencourtAMPureXPbeadsdeBeckmanCoulter (RÉF.A63880,A63881ou
A63882)§ ChaqueexécutionHolotypeHLArequiertunmaximumde900μldebillesAMpureXP.§ LekitRÉF.A63880contient5mldebillesAMPureXP.§ LekitRÉF.A63881contient60mldebillesAMPureXP.§ LekitRÉF.A63882contient450mldebillesAMPureXP.
§ Cassettedegelà1,5%d'agarose,sanscolorantavecétaloninterne(MarqueurK/R2),pourle sélecteur automatisé Pippin Prep/Blue Pippin (RÉF. CDF1510 pour le Pippin Prep etRÉF.BDF1510pourleBluePippin)
§ Éthanoldequalitémoléculaire(alcoolanhydre)
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§ Eaudequalitémoléculaire(exemptedeDNaseetRNase)§ Hydroxydedesodium§ TamponTE1×(pH8,0)§ KitderéactifsMiSeqdeIllumina
CapacitédukitderéactifsMiSeq
KitderéactifsIlluminaMiSeq
TempsHeures
Échantillons24/7
Std500Cycle(MS-102-2003) ~39 24
Std300Cycle(MS-102-2002) ~24 24
Micro300Cycle(MS-103-1002) ~19 24
Nano500Cycle(MS-103-1003) ~28 12
Nano300Cycle(MS-103-1001) ~17 6
Fournituresrecommandées§ Tubesdemicrocentrifugationde1,5ml§ Tubesdemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml§ Tubes de microcentrifugation à liaison faible de 2,0 ml (tubes Eppendorf DNA LoBind
RÉF.022431048recommandés)§ Tubes à paroi mince de 0,5 ml pour appareil Qubit (tubes à essai Qubit RÉF. Q32856
recommandés)§ Pipettesàvolumeréglable(capacitéde1,0à1000μl)§ Pipettesàvolumeréglableà8canaux(capacitéde1,0à100μl)§ Plaquesà96puitscompatiblesaveclethermocycleur§ Plaquesoptiquesà96puitscompatiblesaveclefluoromètredeplaque§ Plaquesà96puitscompatiblesavecl'appareilqPCR§ Filmdescellagepourplaqued'usagegénéral§ Filmdescellagepourplaquecompatibleaveclethermocycleur(testépourlaPCRàlongue
portée)§ Filmdescellagepourplaqueoptiquecompatibleavecl'appareilqPCR(facultatif)§ Supportmagnétiquecompatibleaveclestubesdemicrocentrifugationde2ml§ Portoirsderefroidissement96puits(2pièces)§ Tubesconiquesde50ml§ Réservoirsde50ml
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MentionlégaleLemode d'emploi du produit HolotypeHLA 24/7 et son contenu sont la propriété d'OmixonBiocomputing Limited («Omixon»),et sont conçusaux finsdu seulusagecontractuelde sesclientsencequiconcerneleoulesproduit(s)décrit(s)danscedocumentetànulleautrefin.Leprésent document et son contenu ne seront pas utilisés ni distribués à toute autre fin niautrement communiqués, divulgués ou reproduits par quelque moyen que ce soit sans leconsentement écrit préalable d'Omixon. Par le présent document, Omixon n'accorde aucunelicenceenvertudesesbrevet,marquedecommerce,droitd'auteuroudroitsditsde«commonlaw»nidroitssimilairesdetoutetiercepartie.
LelogicielOmixonHLATwin(«logiciel»)estutilisésouslicenceparleclientdanslesconditionsgénéralesdeventedéfiniesdansleCLUFd'OmixonHLATwin(www.omixon.com/hla-twin-eula/).Sivousn'acceptezpaslesprésentesconditionsgénéralesdevente,Omixonnevousaccordepasdelicencedulogiciel,etvousnedevezpasutiliserouinstallerlelogiciel.
Lesinstructionscontenuesdanscedocumentdoiventêtrestrictementetexplicitementsuiviesparunpersonnelqualifiéetdûmentforméafind'assurerl'utilisationsûreetappropriéeduoudesproduit(s)décrit(s)auxprésentes.Lalectureetlabonnecompréhensionducontenudecedocument dans son intégralité préalablement à l'utilisation de ce ou ces produit(s) sontincontournables.
TOUT MANQUEMENT À LA LECTURE INTÉGRALE ET AU STRICT SUIVI DE LA TOTALITÉ DESINSTRUCTIONSCONTENUESDANSLEPRÉSENTDOCUMENTPEUTCONDUIREÀDESDOMMAGESMATÉRIELSDU/DESPRODUIT(S),ÀDESDOMMAGESCORPORELSAUXPERSONNES,NOTAMMENTAUXUTILISATEURSETAUTRESTIERS,AINSIQU'ÀDESDOMMAGESMATÉRIELSÀLAPROPRIÉTÉD'AUTRUI.
OMIXONN'ASSUMEAUCUNERESPONSABILITÉDÉCOULANTDE L'USAGE INAPPROPRIÉDUOUDES PRODUIT(S) DÉCRIT(S) AUX PRÉSENTES (Y COMPRIS LES PIÈCES OU LE LOGICIEL DUDITPRODUIT)OUDETOUTUSAGEDUOUDESDIT(S)PRODUIT(S)HORSDUCHAMPD'APPLICATIONDESLICENCESOUAUTORISATIONSÉCRITESEXPRESSESACCORDÉESPAROMIXONENRELATIONAVECL'ACQUISITIONDETEL(S)PRODUIT(S)PARLECLIENT.
RÉSERVÉÀUNUSAGEDIAGNOSTIQUEINVITRO©2017OmixonBiocomputingLtd.Tousdroitsréservés.
UtilisationprévueLe produitHolotypeHLA24/7 – ConfigurationA1 et CE/A2 et CE/A3 et CE/A4 et CE (ci-aprèsnommé«HolotypeHLA»)estunecombinaisonderéactifspourtestdiagnostiqueinvitroetdulogicield'analysededonnées(OmixonHLATwin™).Ilestconçupourpermettrel'identificationetladéfinitiondesHLA(humanleukocyteantigens,antigènesdesleucocyteshumains)declasseIetII dans le cadre d'un typage HLA utilisant la plateforme Illumina® MiSeq Next Generation
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Sequencing.LeproduitHolotypeHLAfournitdesinformationssurl'histocompatibilitédeslociHLAdeclasseI(A,BetC)etdeclasseII(DPB1,DQA1,DQB1etDRB1)enutilisantl'ADNgénomiquehumain.
LelogicielOmixonHLATwin™inclusdansleproduitHolotypeHLAestconçupourl'interprétationetlacorrélationdesdonnéesdeséquençagegénéréessurlesystèmeIllumina®MiSeqavecpourrésultatuntypageHLAauniveaudesallèlesenuneseulepassedehauteprécision,dotéd'untrèsfaibletauxd'ambiguïtéàunniveaude2décimales.
LeproduitHolotypeHLAestconçupourunusagediagnostiqueinvitroparunpersonnelmédicalprofessionnel,telquedestechniciensdelaboratoireetdesmédecins,dûmentformésautypageHLAdansdeslaboratoiresdediagnosticagréésEFIouASHIoupossédantlacapacitérequisepourtravaillerconformémentauxspécificationsEFIouASHI.
Noteimportanteavantutilisation
Recommandationenmatièred'isolationdel'ADNgénomiqueL'ADNgénomiquehumaindoitêtrepréparéàl'aidedekitsdepréparationdel'ADNcorrectementtestés,disponiblesdanslecommerce,afind'assurerlaconstancedelapréparation.Quellequesoit l'approche, la déterminationprécisede la concentration et de la pureté est requisepourassurerunesolideperformancedutest.
L'ADN doit être exempt de contaminants (p. ex. alcool, sels, détergents, formaldéhyde ethéparine)quipourraientcompromettrel'amplification,lapréparationdesbanquesetlesétapesdeséquençageàunstadeultérieur.Lesangnedoitpasêtreprélevédansdestubeshéparinés,etdeséchantillons sanguinsprélevés chezdespatients traités soushéparine,demêmequedeséchantillonslipémiquesouhémolysésnedoiventpasêtreutilisés.
L'ADN génomique préparé peut être utilisé immédiatement s'il a été préparé dans de l'eauexemptedenucléase,oustocképourdespériodesprolongéesàunetempératurede-20°Coumoins.Nousrecommandonsl'utilisationd'eaupourlapréparationdel'ADNgénomiquecarl'EDTAcontenu dans le tampon TE peut inhiber les réactions de la PCR à longue portée. Lesdécongélationsrépétéesdoiventêtreévitéespourréduirelesrisquesdedégradation.
Uneconcentrationde20à30ng/µldel'ADNestfortementrecommandéepourobtenirunintrantde100à150ngd'ADNgénomiqueparamplificationdePCR.Nous recommandons fortementd'utiliser une méthode de quantification basée sur la fluorescence pour déterminer laconcentrationdugADN.
Unrapportd'absorptiondesvaleurs260nm/280nmet260nm/230nmde1,7à2estfortementrecommandé.
Pourl'amplificationdeHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1etHLA-DQB1,0,8à1,2µgd'ADNgénomiqueestrequis.
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PrincipedelaméthodePendant de nombreuses années, la communauté HLA a travaillé au développement d'uneméthodequi identifierait avecprécision lepolymorphismeextensifdesgènesHLAetde leursproduitsgéniques.L'avènementdelaPCR,combinéeàd'autrestechnologies(séquençageSanger,SSOP, SSP, Luminex), a fourni une formule améliorant sensiblement la détection dupolymorphisme HLA mais plusieurs limitations subsistaient néanmoins, qui continuaientd'entravernotrecapacitéàcaractériserlesgènesHLAdemanièreexhaustive.Lestechnologiesdéveloppées ces dernières années, globalement appelées NGS (Next Generation Sequencing,Séquençage de nouvelle génération), ont ouvert de nouvelles opportunités qui permettent lacaractérisationcomplètedesgènesHLAdefaçonhaploïde.LeNGSpossèdedeuxcaractéristiquesdistinctes,lapremièreétantleséquençageclonaldesfragmentsd'ADNetlaseconde,undébitextrêmementélevé.LeNGSdonnelacapacitédephaserlespolymorphismesetdoncd'éliminertouteslesambiguïtés,etdefourniruntypageHLAàdesniveauxde3à4décimalessansrecouriràdestestsdecontrôle.Parconséquent, ilapporteunesolutionpotentiellementcomplèteàlaproblématiquedutypageHLA.Leprotocoledécriticibénéficiedecettetechnologieetcombinel'amplificationde laPCRà longueportéedesgènesHLAavec leséquençagesur laplateformeIlluminaMiSeq.Plusspécifiquement,lesgènesHLAA,B,C,DQA1etDQB1sontamplifiéssurlatotalité de leur longueur de codage, y compris les éléments des régions non traduites desextrémités5’et3’,tandisqueleDRB1estamplifiédel'intron1àl'intron4etqueleDPB1estamplifié de l'intron 1 à la région non traduite 3’. Les amplicons sont ensuite traités selon laprocéduresuivante:
1. Fragmentationdesampliconsàunetailleappropriéepour leséquençagesur laplateformeIllumina.
2. Réparationetadénylationdesextrémitésdesampliconsfragmentés.
3. Ligationdesséquencesd'adaptateursutiliséesdurantleprocessussurleséquenceurMiSeqpourcapturer,amplifieretséquencerl'ADN.Lesadaptateursincluentégalementunindexquiestunecourteséquence,univoquedechaqueadaptateur,permettantd'identifierlesoriginesdelabanque(échantillon/locus).
Aprèsmiseencommundesbanquesindexées,sélectiondestaillesetquantification,l'échantillonestchargésurleséquenceurMiSeqpourséquençage.L'ensembleduprocessusprendde3à5jours,enfonctiondelasélectiondelacellulededébitsurlaplateformeIllumina.Unrésumédesétapesduprotocoleestillustrédanslediagrammeci-dessous:
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Résumédesétapes
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Glossaire/Définitions§ Plaqued'amplicons–AutrenompourPlaqued'amplification§ Plaquedequantificationd'amplicons–Plaqueà96puitscompatibleaveclefluoromètrede
plaqueoùlesampliconsdiluéssontquantifiés§ Plaqued'amplification–PlaquedePCRà96puitsutiliséepouramplifierlelociHLA§ Banque finale – Banque qui inclut toutes les banques d'échantillons prêtes à être
séquencéesenuneseuleexécutionduséquenceurMiSeq§ Plaque de réactions – Plaque sur laquelle ont lieu les réactions séquentielles de
fragmentation,réparationdesextrémitésetligationdesadaptateursindexésàlabanqued'échantillons
§ Plaque de réactifs – Plaque utilisée pour aliquoter les différents réactifs servant à lapréparationdesbanques
§ Banqued'échantillons–Banquepréparéeencombinant(regroupant)tousleslociHLAd'unéchantillondonné
§ Plaqued'amplicons regroupés–Plaquecontenantunebanqued'échantillons (tous lociscombinés)parpuits
§ Plaquedequantificationd'étalons–Plaqueà96puitscompatibleaveclefluoromètredeplaqueoùlesétalonsd'ADNsontplacésenvuedelaquantificationdesamplicons
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Étape1–Préparationdumélangederéférencepourl'amplificationHLADurée:~45minutesL'objectifdecetteétapeestdepréparerdesmélangesderéférenceparlocus,afind'amplifierchaquelocusHLAcibléindividuellement.LeslociamplifiésparceprotocolesontHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1etHLA-DQB1.
Remarque : Les mélanges de référence préparés à cette étape incluent tous les réactifsnécessairesàl'amplification,exceptéleTaqpolymérase.
ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar
Mélanged'amorcesHLA-A -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-B -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-C -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DRB1 -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DPB1 -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DQA1 -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DQB1Set3 -20°C OmixonAmplificateur1 -20°C OmixonAmplificateur2 -20°C OmixonTamponpourPCRdelongueportée(10×) -20°C QiagendNTP(10mMchacun) -20°C QiagenH2Odequalitémoléculaire -20°C Qiagen
Protocole1.1. –Sortirtouslesmélangesd'amorces,lesamplificateurs1et2,lesdNTPetletamponpour
PCR à longue portée (10×) de leur lieu de stockage et les décongeler à températureambiante.
1.2. –Préparerlacombinaisond'amplificateurs:ajouter132μld'amplificateur2dansletubed'amplificateur1.Remplacer l'étiquetteAmplificateur1paruneétiquetteAmplificateurcombiné.
1.3. –Préparerunmélangederéférencepourchaquemélanged'amorcesconformémentauxtableauxci-dessous:
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Mélangederéférence:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1
Réactif Volume/échantillon/locus Volume/24échantillons/locus
Mélanged'amorces 2μl 51μlTamponpourPCRdelongueportée(10×) 2,5μl 63,8μlMélangedNTP(10mMchacun) 1,25μl 31,9μlH2Odequalitémoléculaire 13,85μl 353,2μlVolumetotal 19,6μl 499,9μl
Mélangederéférence:HLA-DQB1Set3
Réactif Volume/échantillon/locus Volume/24échantillons/locus
Mélanged'amorces 2μl 51μlTamponpourPCRdelongueportée(10×) 2,5μl 63,8μlMélangedNTP(10mMchacun) 1,25μl 31,9μlAmplificateurcombiné 5,6μL 142,8μlH2Odequalitémoléculaire 7,85μl 200,2μlVolumetotal 19,2μl 489,7μl
1.4. –Mélangerauvortexchaquemélangederéférenceetlescentrifugerpendant1seconde.Lesplacersurdelaglace.
1.5. –DiluertouslesADNgénomiquesàuneconcentrationde20à30ng/μl(volumeminimal:45μl).
Remarque:LeHolotypeHLAcontientsuffisammentderéactifspour24réactionsetunvolumesupplémentairepourtenircomptedespertesduesaupipetageetauxéchecsd'amplification.
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Étape2–AmplificationdesHLAdeclasseIetIIDurée:~6heures45minutesL'objectifdel'étape2estd'amplifierleslociHLA.Lesconditionsd’amplificationdesHLAdeclasseIetIIontétéoptimiséesàl'aidededeuxprogrammesdePCRdistincts.UnefoislesréactionsdelaPCRterminées,l’amplificationestvérifiéeparélectrophorèsesurgeld’agarose(facultatif).
Conseilrapide:l'électrophorèsesurgeld’agarose,bienquerecommandée,n'estpas requisepourparfaitementexécuter leprotocoleHolotypeHLA. Lorsque lesampliconssontquantifiés(Étape3),touteconcentrationsupérieureà50ng/µlestconsidéréecommeuneamplificationréussie.L'électrophorèsesurgeld’agaroseestuneétapeimportantedecontrôledelaqualitéetnedoitpasêtreignoréeparunutilisateurquin'auraitpasuneexpériencesuffisanteduprotocoleHolotypeHLAentier.
ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar
MélangederéférenceHLA-A -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-B -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-C -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DRB1 -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DPB1 -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DQA1 -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DQB1Set3 -20°C Étape1Taqpolymérase -20°C QiagengADN 4°C UtilisateurH2Odequalitémoléculaire 20°C Utilisateur
Protocole2.1 –SortirleTaqpolymérasedesonlieudestockage,lecentrifugerbrièvement,puisl'ajouter
à chaquemélange de référence conformément aux tableaux ci-dessous, en rinçant lespointesdepipettesoigneusementàchaquepipetage:
MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1Réactif Volume/échantillon/locus Volume/24échantillons/locus
Mélangederéférencedel'étape1 19,6μl 499,9μlTaqpolymérase 0,4μl 10,2μlTotal 20μl 510,1μl
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MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-DQB1Set3
Réactif Volume/échantillon/locus Volume/24échantillons/locusMélangederéférencedel'étape1 19,2μl 489,7μlTaqpolymérase 0,8μl 20,4μlTotal 20μl 510,1μl
2.2 –Mélangerauvortexpuiscentrifugerbrièvementtouslesmélangesderéférencechargésen Taq polymérase. Aliquoter 20 μl de chaque mélange de référence chargé en TaqpolymérasedansdespuitsséparésdeplaquesdePCRà96puits.
Remarque:LesamplificationsdeclasseIetIIontétéoptimiséesàl'aidededeuxprogrammesdePCRdistincts.Parconséquent,lesmélangesderéférencedeclasseIetIInedoiventpasêtreplacésdanslamêmeplaque.
2.3 –Ajouter5μldechaqueéchantillond'ADNgénomiquediluédanslespuitscorrespondantsdesplaquespréparéesàl’étapeprécédente.Mélangerparpipetage.Scellerlespuitsavecdu film de scellage thermique et inspecter visuellement chaque puits. Centrifugerbrièvementtouteslesplaquesd’amplification.
2.4 –Placerlesplaquesd’amplificationdansdesthermocycleursetexécuterlesprogrammesd’amplificationdeclasseIetIIconformémentauxtableauxci-dessous:
AmplificationdeclasseI(HLA-A,BetC)
Nombredecycles Température Temps1 95°C 3minutes 95°C 15secondes
35 65°C 30secondes 68°C 5minutes1 68°C 10minutes1 4°C ∞
AmplificationdeclasseII(HLA-DRB1,DPB1,DQA1etDQB1)
Nombredecycles Température Temps1 95°C 3minutes 93°C 15secondes
35 60°C 30secondes 68°C 9minutes1 68°C 10minutes1 4°C ∞
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Remarque:Laréussitedel’amplificationpeutêtrevérifiéeenexécutant2μldechaqueampliconsurdugeld’agaroseà2%standard,à250Vpendant30minutes.(Facultatif)
TaillesattenduesdesampliconsLocusHLA Tailleattenduedesamplicons(kb)
HLA-A,BetC ~3HLA-DRB1 ~4,3HLA-DPB1 ~6,6HLA-DQA1 ~5,5
HLA-DQB1(Set3) ~6,5
Point d'arrêt sans altération. Les amplicons peuvent être stockés sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.
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Étape3–Quantificationetnormalisationdesamplicons(àl'aided'unfluoromètredeplaque)Durée:~35minutesLaquantificationetlanormalisationdesampliconssontrecommandéesafind'assureruneentréeprécisedans l'étapedepréparationdebanque(facultatif).LaconcentrationdesampliconsestmesuréeaveclesystèmeQuantiFluordsDNAquicontientunmarqueurfluorescentsefixantsurl’ADNetunétalonADNpermettantunequantificationprécisedepetitesquantitésd’ADNdoublebrin.(dsADN).Seréféreràl’annexe2pourdesinstructionsdequantificationdesampliconssurunappareilqPCR.
Conseilrapide:laquantificationdesamplicons,bienquerecommandée,n'estpasrequisepourparfaitementexécuterleprotocoleHolotypeHLA.Lanormalisationdes amplicons ne requiert pas une mesure précise de la concentration desamplicons. En guise d'alternative, une estimation de la concentration desampliconsfondéesurl'expérienceouuneélectrophorèsesurgeld’agarosepeutêtre utilisée. La quantification des amplicons ne doit pas être ignorée par unutilisateur qui n'aurait pas une solide expérience du protocole Holotype HLAentier.
ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar
Plaqued'amplificationdeclasseI 4°C Étape2Plaqued'amplificationdeclasseII 4°C Étape2ÉtalonADNLambda(100ng/μl) 4°C PromegaMarqueurcouleurQuantiFluordsDNA(200×) 4°C PromegaTamponTE20×(pH7,5) 4°C PromegaH2Odequalitémoléculaire 20à25°C UtilisateurExoSAP-iTExpress -20°C Affymetrix
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Protocole3.1 – Préparer des étalons d’ADNpar dilution sérielle de l’étalonADN LambdaQuantiFluor
(100ng/μl)fournidanslekitQuantiFlor,conformémentautableaudedilutionci-dessous:
Libellédutube ADNutilisé Volumed'ADN(μl) VolumeTE1x(μl) Conc.finale(ng/μl)Étalon1 ADNLambda 7,5μl 492,5μl 1,5ng/μlÉtalon2 Étalon1 250μl 250μl 0,75ng/μlÉtalon3 Étalon2 250μl 250μl 0,38ng/μlÉtalon4 Étalon3 250μl 250μl 0,19ng/μlÉtalon5 Étalon4 250μl 250μl 0,09ng/μlÉtalon6 Étalon5 250μl 250μl 0,05ng/μlVierge Vierge 0μl 250μl 0ng/μl
3.2 –Préparerlesplaquesdequantificationdesamplicons(voirlesfiguressupplémentaires).Aliquoter99μldetamponTE1xTEdanslespuitsd'uneplaqueoptiqueà96puitspourlenombretotald'ampliconsàquantifier.
3.3 –Ajouter1μldesampliconsdespuitscorrespondantsdesplaquesd'amplificationdanslespuitsindividuelsdesplaquesdequantificationdesamplicons.Mélangerparpipetage.
3.4 –Préparerunesolutiondetravailaveclemarqueurcouleur1×QuantiFluorDyeselonlaformulesuivante:0,5μldemarqueurcouleurQuantiFluorDye(200X)+99,5μldetamponTE 1×. Préparer une quantité suffisante de solution de travail demarqueur couleur 1×QuantiFluorDyedesortequechaqueéchantillon(totalitédeséchantillonsdanslesplaquesd'amplification)etchaqueétalon(14autotal)reçoiveunaliquotede100μl.
3.5 –Prépareruneplaquedequantificationdesétalonsetdesplaquesdequantificationdesamplicons.Aliquoter100μldesolutiondetravaildemarqueurcouleur1×QuantiFluorDyedans les puits de la plaque optique à 96 puits, qui sera la plaque de quantification desétalons,etdesplaquesdequantificationdesampliconspréparéesàl'étape3.2.
3.6 – Utiliser les étalons préparés ci-dessus et ajouter 100 μl de chaque étalon, en doubleexemplaire,danslespuitsindividuelsdelaplaquedequantificationdesétalons(14puitsautotal).Mélangerparpipetage.
3.7 –Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.
3.8 –Effectuerunpassagedelaplaquedequantificationdesétalonsdanslefluoromètre,suivid'unpassagedesplaquesdequantificationd’amplicons.
3.9 – Calculer la concentration de l'ADN dans les plaques de quantification d’amplicons enutilisantlesdonnéesdeRFU(Relativefluorescenceunits,Unitésdefluorescencerelative)généréesparlefluoromètredeplaque.Pouruneassistanceenmatièredecalculs,seréféreràl'ongletDilutionduclasseurExcelfourni.
3.10 –Diluerl’ADNdanslesplaquesd’amplificationavecdel’eaudequalitémoléculairepourquelaconcentrationfinaledel’ADNsoitde67ng/μlenviron.
§ Silaconcentrationdel'ADNestégaleousupérieureà150ng/μl,ajouter25μld'eau.
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§ Silaconcentrationdel'ADNestcompriseentre100et150ng/μl,ajouter10μld'eau.§ Silaconcentrationdel'ADNestinférieureà100ng/µl,nepasajouterd'eau.
Regroupementdesamplicons3.11 – Regrouper tous les loci de chaque échantillon dans une seule plaque d'amplicons
regroupés. Combiner les volumes indiqués de chaque locus comme dans le tableau ci-dessouspourobtenirunvolumefinalde35µl:
LocusHLA VolumeregroupéA 5μlB 5μlC 5μl
DRB1 5μlDPB1 5μlDQA1 5μl
DQB1Set3 5μl
3.12 –Ajouter4μld'ExoSAP-iTExpressdanschaquebanqued'échantillons.Rincerlespointesdepipette après chaque pipetage. Sceller la plaque avec du film de scellage thermique etcentrifugerbrièvement.
3.13 –Placerlaplaqued'ampliconsregroupésdansunthermocycleuretexécuterleprogrammesuivant:
PurificationdesproduitsdePCRavecExoSAP-ITExpress
Nombredecycles Température Temps1 37°C 4minutes1 80°C 1minute1 4°C ∞
Point d'arrêt sans altération. Les amplicons peuvent être stockés sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.
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Étape4–PréparationdesbanquesDurée:~3heuresAu cours de cette étape, les amplicons regroupés sont préparés pour le séquençage sur leséquenceur IlluminaMiSeq.Lesampliconssont fragmentésparuneréactionenzymatique, lesextrémitéssontréparéesetadénylatées,etlesadaptateursindexéssontligaturésauxextrémités.Unemiseencommundesbanquesestensuiteeffectuée, suivied'un seulnettoyageetd'uneétapedeconcentrationàl'aidedebillesAMPureXP.
Remarque :Omixon recommandedes volumes plus importants que nécessairepour24échantillonscarbonnombred'enzymesetdetamponssontvisqueux,cequipeutentraîneruneperteexcessivelorsdupipetage.
ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar
Plaqued'ampliconsregroupés 4°C Étape3Enzymedefragmentation(A) -20°C OmixonTampondefragmentation(B) -20°C OmixonEnzymederéparationdesextrémités(C) -20°C OmixonTamponderéparationdesextrémités(D) -20°C OmixonEnzymedeligation(E) -20°C OmixonTampondeligation(F) -20°C OmixonPlaqued'adaptateurs -20°C OmixonBillesAMPureXP 4°C BeckmanCoulterÉthanolà80%(fraîchementpréparé) 20à25°C UtilisateurH2Odequalitémoléculaire 20à25°C Utilisateur
Protocole4.1 –Mettreenmarchelethermocycleur.Vérifierquelecouverclechauffantestencoursde
chauffe.
Remarque:Veilleràmélangervigoureusementauvortexl’enzymedefragmentation(A)avantutilisation.
4.2 –Préparerlemélangederéférencedefragmentationconformémentautableauci-dessous:
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Mélangederéférencedefragmentation
Réactif Volumeparbanque(μl)
Volumesrecommandéspour24banques(µl) Codecouleur
Enzymedefragmentation(A) 2μl 55,2μl JauneTampondefragmentation(B) 2μl 55,2μl RougeVolumetotal 4μl 110,4μl
4.3 –Prépareruneplaquederéactifs:placerunenouvelleplaquepourPCRà96puitssurunportoirderefroidissementdePCRetaliquoterunequantitéégaledemélangederéférencedefragmentationdanschaquepuitsd'uneseulecolonne.
Remarque:Laréactiondefragmentationaétéconçuedesortequel’ADNobtenusoitdelatailleidéalepourleséquençagesurlesystèmeIlluminaMiSeq.Ilestimportantdemaintenirlesréactifsaufraisjusqu’audémarragedelaréactiondanslethermocycleurafind'éviterune fragmentationexcessive. Il est recommandéd’utiliserdespipettesmulticanalpourminimiserlerisquedefragmentationexcessive.
4.4 –Centrifugerlaplaqued'ampliconsregroupéspendant10secondes,puisplacez-lasurdelaglaceouuncryopack.
4.5 –Prépareruneplaquederéactions:placerunenouvelleplaquedePCRà96puitssurunportoirderefroidissementdePCR.
4.6 –Ajouter4μldemélangederéférencedefragmentationdelaplaquederéactifsdanslespuitsdelaplaquederéactions,correspondantauxéchantillonsdelaplaqued'ampliconsregroupés.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.
4.7 –Transférer16μldechaqueamplicondelaplaqued'ampliconsregroupésdanslespuitscorrespondantsdelaplaquederéactionsàl'aided'unepipettemulticanal.Mélangerparpipetage.
4.8 –Scellerlaplaquederéactionsavecdufilmdescellagethermiqueetcentrifugerpendant10secondes.
4.9 –Incuberlaplaquederéactionsdansunthermocycleuravecleprogrammesuivant:
Programmedefragmentation
Nombredecycles Température Temps1 37°C 10minutes1 70°C 15minutes1 4°C ∞
Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.
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4.10 –Préparerlemélangederéférencederéparationdesextrémitésconformémentautableauci-dessous:
Mélangederéférencederéparationdesextrémités
Réactif Volumeparbanque(μl)
Volumesrecommandéspour24banques(µl) Codecouleur
H2Odequalitémoléculaire 1,25μl 34,8μl Enzymederéparationdesextrémités(C) 1,25μl 34,8μl VertTamponderéparationdesextrémités(D) 2,5μl 69,6μl OrangeVolumetotal 5μl 139,2μl
4.11 –Aliquoterunequantitéégaledemélangederéférencedansuneseulecolonnevidedelaplaquederéactifs.
4.12 – Centrifuger la plaque de réactions (contenant les échantillons fragmentés) pendant10 secondes. Ajouter 5 μl demélange de référence de réparation des extrémités de laplaquederéactifsdanschaquepuitsdelaplaquederéactions.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.Mélangerparpipetage.
4.13 –Scellerlaplaquederéactionsavecdufilmdescellagethermiqueetcentrifugerpendant10secondes.
4.14 –Incuberlaplaquederéactionsdansunthermocycleuravecleprogrammesuivant:
Programmederéparationdesextrémités
Nombredecycles Température Temps1 20°C 30minutes1 70°C 5minutes1 4°C ∞
Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.
4.15 –Sortir laplaqued'adaptateurs indexésdeson lieudestockageet la laisserdécongeleràtempératureambianteaprèsledémarrageduprogrammederéparationdesextrémitésdans le thermocycleur. Lorsque la plaque d'aptateurs est à température ambiante, lacentrifugerpendant3minutesà3000tr/min.
4.16 –Retirerdélicatementlefilmdescellagedelaplaqued'adaptateurs.Aprèsleretraitdufilmdescellage,nepasagiterlaplaqued'adaptateursafind’évitertoutrisquedecontaminationcroisée.
4.17 –Transférerlevolumecompletdechaquepuitsdepuislaplaquederéactions(25μl)verslespuitscorrespondantsdelaplaqued'adaptateurs.
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Remarque : Si la totalité de la plaqued'adaptateurs ne sera PASutilisée, il estpossibled’utiliseruniquementlenombrenécessaired'adaptateurs.Couperlefilmde scellage de la plaque entre les puits à utiliser et les puits à garder. Retirerdélicatementlefilmdescellagedelaplaqued'adaptateurs,laissantlefilmenplaceau-dessusdespuitsàgarder.
a. Transférer25μldechaqueéchantillondelaplaquederéactionsversunpuitsnon utilisé de la plaque d'adaptateurs, en mélangeant bien à l’aide d’unepipette.
b. Transférerlatotalitédechaqueéchantillondelaplaqued'adaptateursverslepuitsoriginaldelaplaquederéactions.
c. Scellerdenouveaulaplaqued'adaptateursetlaremettreaucongélateur(-20°C).Utiliserlaplaquederéactionsaulieudelaplaqued'adaptateurspourlesétapesrestantesdécritesdanslemanuel.
4.18 – Préparer lemélange de référence de ligation. Préparer suffisamment demélange deréférencedeligationpourchaqueéchantillon.
Mélangederéférencedeligation
Réactif Volume(μl) Volumesrecommandéspour24banques(µl) Codecouleur
Enzymedeligation(E) 2,5μl 63,2μl BleuTampondeligation(F) 30μl 757,5μl NoirVolumetotal 32,5 820,7μl
4.19 –Aliquoterlemélangederéférencedeligationdansunecolonneinutiliséedelaplaquedesréactifs.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.
4.20 –Ajouter32,5μldemélangederéférencedeligationdanschaquepuitsdelaplaquederéactions.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.Mélangerparpipetage.
4.21 –Scellerlaplaquederéactionsavecdufilmdescellagethermiqueetcentrifugerpendant10secondes.
4.22 –Incuberlaplaquederéactionsdanslethermocycleuravecleprogrammesuivant:
Programmedeligation
Nombredecycles Température Temps1 25°C 10minutes1 70°C 10minutes1 4°C ∞
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Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.
Regroupementetpurificationdesbanques4.23 –LaisserlesbillesAMPureXPatteindrelatempératureambiante.Veilleràcequ'ellessoient
homogènes(dénuéesd'amasoudegrappes).Préparer5mld'éthanolà80%fraîchementpréparé(4mlEtOH+1mlH2O).
4.24 –Créerlabanqueencombinantunaliquotedechaqueampliconregroupé(unebanqueparéchantillonspécifique)dansunseultubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede2,0ml.
I. Pour16échantillonsouplus–Calculerlaquantitédechaquebanqued'échantillonsàmettreencommunpourobteniruneseulebanqued'unvolumetotalde900μl.Diviser900µlparlenombredebanquesd'échantillons.Lerésultatestlevolumedel'aliquoteàpréleverde chaquebanqued'échantillonset àpipeterdans labanquefinale.
II. Pourmoinsde16échantillons–Transférer60μldechaquebanqued'échantillonsdansunebanque.
4.25 –Ajouter900μldebillesAMPureXPdans letubede labanque,maisnepastoucher labanqueaveclapointedelapipette.Mélangervigoureusementauvortex,puiscentrifugerbrièvement.Veilleràcequelesbillesneseséparentpas.Laisserincuberlabanquependant10minutesàtempératureambiante.
Remarque :Si le volumede la banque finale est inférieur à 900μl, ajouter unvolumeéquivalentdebillesAMPureXP.Lerapportentrelabanquefinaleetlesbillesdoitêtrede1:1.
4.26 –Placerletubedelabanquefinalesurlesupportmagnétiqueetlaisserincuberpendant10minutes.
4.27 –Touten laissant le tubesur lesupportmagnétique, retirerdélicatementetéliminer lesurnageantdutubedelabanque,sanstoucherlesbilles.
4.28 –Toutenlaissantletubesurlesupportmagnétique,ajouter1,5à2mld'éthanolà80%fraîchement préparé dans le tube de la banque. Le volume d’éthanol ajouté doit êtresuffisantpourrecouvrirlesbilles.
Remarque:Appliquerl’éthanolsurlecôtédutubedénuédebilles.
4.29 – Laisser incuber la banque à température ambiante pendant 30 secondes, puis retirerdélicatementlesurnageantetl'éliminer.
4.30 –Répéterlesétapes4.28et4.29.
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4.31 –Centrifugerrapidementletubedelabanque,puisleremettresurlesupportmagnétiqueenlelaissantouvert.Retirerl’éthanolrésiduelàl’aided’unepipettesanstoucherlesbilles.
Remarque:S'assurerqueleculotdebillesnecontientpasd’éthanolrésiduel.Ilpeuts'avérernécessairedefairepivoterletubesurlesupportmagnétiquepourenleverl’éthanolsansperturberleculotdebilles.
4.32 –Laisser sécher lesbillesà l’air librependant5à8minutessur le supportmagnétique,jusqu’àcequeleculotdebillessoitsec.
4.33 –Retirerletubedelabanquedusupportmagnétiqueetéluerlabanqueenversant31μld’eaudequalitémoléculaire.Lapointedelapipettenedoitpastoucherlesbillescarcelles-cirisqueraientd’yadhérer.
4.34 –Mélangerlabanqueauvortexpourremettrelesbillesensuspension.Siquelquesgouttesrestentsurlesparoislatérales,centrifugerbrièvement.Veilleràcequelesbillesrestentensuspension.
4.35 –Incuberlabanqueàtempératureambiantependant2minutes.
4.36 –Placerletubedelabanquesurlesupportmagnétiquependant2minutes.
4.37 –Collecterlabanque:toutenmaintenantlabanquefinaledanslesupportmagnétique,collecter31μldusurnageantdansunnouveautubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.
Pointd'arrêtsansaltération.Lesbanquespeuventêtrestockéessansrisqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.
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Étape5–SélectiondelatailledesfragmentsdelabanqueDurée:~1heureL'étape5consisteàutiliserlabanquecollectéeàl'étape4poureffectuerunesélectiondetailledes fragments qu'elle contient à l'aide du sélecteur automatisé Pippin Prep. Le Pippin Prepsélectionneautomatiquementuneplagedetaillesdesfragmentsd'ADNetprocèdeàleurélutiondansunechambredecollecte.Remarque:UnsélecteurautomatiséBluePippinpeutêtreutiliséàlaplaceduPippinPrep.Seréféreràl'annexe1pourdesinstructionsd’utilisationdusélecteurautomatiséPippinPrep.
ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar
Cassettedegeld'agaroseà1,5%,sanscolorant 20à25°C SageScienceMélangedemarqueur/solutiondechargePippin(libelléK) 4°C SageScienceBanqueregroupée 4°C Étape4
Remarque:LePippinPreputilisedumarqueurK,tandisqueleBluePippinutilisedumarqueurR2.
Protocole5.1 –LaisserlasolutiondechargedemarqueurKatteindrelatempératureambiante.
5.2 –Combiner31μlduregroupementavec10μldesolutiondechargedemarqueurK.
5.3 –Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.
5.4 –ConfigurerlePippinPreppourunecollectedesfragmentsd'ADNcomprisentre650et1300pb.Chargerl'échantillonde40µlsurleportd'accèsdeséchantillonsetl'exécuter.Letempsd'exécutionestde45à50minutes.
5.5 –Collectertoutlecontenu(approximativement40μl)danslachambredecollecteduPippinPrepetletransférerdansunnouveautubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.Lecontenuestlabanquedetaillessélectionnées.
Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.
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Étape6–Quantificationdelabanqueaumoyendel'appareilqPCRDurée:~1heure15minutesIlestnécessairedequantifierlabanquedetaillessélectionnéesafind’obtenirunrésultatoptimalsur leséquenceur IlluminaMiSeq.L'appareilqPCRpermetd’enmesurer laconcentrationavecprécision.Pourmesurerlaconcentrationdelabanque,vouspouvezégalementutiliserlekitQubitdsDNABRetunfluoromètreQubit.Poursuivreceprotocole,consultezl'annexe3.
ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar
Prémélanged'amorcesIllumina10× -20°C KAPABiosystemsMélangederéférenceKAPASYBRFASTqPCR2× -20°C KAPABiosystemsStd1(20,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0,20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0,02pM) -20°C KAPABiosystemsÉtalonsADNIllumina -20°C KAPABiosystemsH2Odequalitémoléculaire 20à25°C UtilisateurTamponTE1×(pH8,0) 20à25°C UtilisateurBanquedetaillessélectionnées 4°C Étape5
Protocole1 –Préparerlemélanged'amorcesqPCRàl'aideduprémélanged'amorcesIllumina10×etdu
mélangederéférenceKAPASYBRFASTqPCR2×:
Remarque:LesréactifsdukitKAPASYBRFASTqPCR(mélangederéférenceqPCR,prémélange d'amorces et solutions ROX) sont combinés lors de la premièreutilisation du kit. Ce combiné est stable pendant unminimumde 30 cycles decongélation/décongélation.SuivezladocumentationKAPApourdéterminersi lasolutionROXestrecommandéepourvotreappareildeqPCR.
Mélanged'amorcesqPCR
Réactif Volume(ml)Prémélanged'amorcesIllumina10× 1mlMélangederéférenceKAPASYBRFASTqPCR2× 5mlVolumetotal 6ml
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2 –PréparerlemélangederéférenceqPCR.
MélangederéférenceqPCR
Réactif Volume(μl)Mélanged'amorcesqPCR 228μlH2Odequalitémoléculaire 76μlVolumetotal 304μl
3 –Préparerunedilutionsérielledelabanquedetaillessélectionnées.
a. Préparerunedilutionà1:1000enajoutant1μldebanquedetaillessélectionnéesà999μldetamponTE1×(pH8,0),enrinçantsoigneusementlapointedelapipette.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.
b. Préparerunedilutionà1:2000enajoutant100μldeladilutionà1:1000à100μldetamponTE1×(pH8,0).Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.
4 –PrépareruneplaquedequantificationqPCRdansunenouvelleplaquePCRcompatibleavecvotresystèmeqPCR.
5 –Aliquoter16μldumélangederéférenceqPCRentripleexemplairepourlesétalons1à4,ladilutionà1:1000etladilutionà1:2000(voirlesfigurescomplémentaires).
6 –Aliquoter4μldesétalons1à4,ladilutionà1:1000etladilutionà1:2000danslespuitscorrespondants.
7 – Couvrir hermétiquement la plaque de quantification qPCR et la centrifuger pendant10secondes.
Remarque:ÉviterlaformationdebullesdanslespuitsdelaplaquedequantificationqPCR.Lecaséchéant,centrifugercommenécessairepouréliminerlesbulles.
8 –Définir lestriplesdilutionsà1:1000et1:2000commeéchantillonsciblés,etdéfinir lesétalons(points:4,concentrationinitiale:20pM,dilution:1:10).Exécuterleprogrammesuivantsurl'appareilqPCRdefaçonàdéterminerlaconcentrationenADNdelabanquedetaillessélectionnées:
Nombredecycles Température Temps1 95°C 5minutes25
(pasdecourbedefluidité)95°C 30secondes60°C 90secondes(acquisitiondesdonnées)
9 –PourconvertirlerésultatqPCRdeconcentrationdepMànM,entrerlesrésultatsdelamoyenne quantitative des deux réplicats de banque dans l'onglet du classeur Omixonintitulé«Quantificationdesbanques».
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10 – À partir des volumes indiqués dans le classeur, diluer 10 μl de la banque de taillessélectionnéesàuneconcentrationde2nMavecdel'eaustériledansunnouveautubedemicrocentrifugationà liaison faiblede1,5ml.Stocker labanquede tailles sélectionnéesrestanteà-20°C.
Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.Encasdestockageàlongterme,unenouvellequantificationestrecommandéeavantutilisationsurleséquenceurMiSeq.
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Étape7–SéquençagesurlesystèmeIlluminaMiSeqDurée:~24heuresLesystèmeIlluminaMiSeqestuninstrumentautomatisédeNGSquipeutséquencerlabanquede tailles sélectionnées préparée au cours des étapes précédentes. Un démultiplexage deséchantillonsindexésesteffectuéautomatiquementautermedel'exécutionduséquençage.
Conseil rapide : vous pouvez utiliser un contrôle PhiX à 1 % comme contrôlesupplémentairedelaréactiondeséquençage.Pouruncomplémentd'informationsurlecontrôlePhiX,consultezladocumentationIllumina.
ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar
Cassettederéactif -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaCellulededébitMiSeq 4°C IlluminaBanqueà2nM 4°C Étape6NaOH1Nou2N 20à25°C UtilisateurH2Odequalitémoléculaire 20à25°C Utilisateur
CapacitédukitderéactifsMiSeq
KitderéactifsIlluminaMiSeq
TempsHeures
Échantillons24/7
Std500Cycle(MS-102-2003) ~39 24
Std300Cycle(MS-102-2002) ~24 24
Micro300Cycle(MS-103-1002) ~19 24
Nano500Cycle(MS-103-1003) ~28 12
Nano300Cycle(MS-103-1001) ~17 6
Protocole7.1 –PréparerleséquenceurMiSeqconformémentauxprotocolesstandardsIllumina.
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7.2 –Préparerunebanquedénaturéeà1nM:Combiner10μldeNaOHà0,2Nfraîchementpréparéavec10μldebanquedetaillessélectionnéesdiluéeà2nMdansunnouveautubede microcentrifugation à liaison faible de 1,5 ml. Mélanger au vortex et centrifugerbrièvement. Incuber cette banque dénaturée à 1 nM à température ambiante pendant5minutes.
7.3 –Préparerunebanquedénaturéeà20pM:Ajouter980µldeHT1réfrigéréaux20µldelabanquedénaturéeà1nM.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.
7.4 –Préparerunebanquedénaturéeà9pM:Ajouter550µldeHT1réfrigéréet450µldelabanquedénaturéeà20pMdansunnouveautubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.
7.5 –Transférer600μldelabanquedénaturéeà9pMdansleréservoirdeséchantillonsdechargedelacassettederéactifsMiSeq.
Conseilrapide:ilestsuggéréd'utiliserleclasseurfournipourcréerlafiched'échantillonrequiseparlesystèmeMiSeq.
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Étape8–AnalysedesdonnéesdeséquençageHLALeséquenceurIlluminaMiSeqvatraiterlabanqueregroupéeà9pMetgénérerdesdonnéesdeséquençagesouslaformedefichiers.fastq.Veuillez-vousréféreraumanuelHLATwinpouruneassistance à l'installation correcte du logiciel HLA Twin et des informations en matièred'interprétation de l'analyse du génotypage de vos données de séquençage. Pour lamise enœuvreduprotocoleautomatiséetpourtoutproblèmerelatifàl'installationouàl'analysedesdonnées,[email protected].
Protocoleautomatisé
Paramétrageetconfigurationinformatique1. InstallezlelogicielHLATwinServersurleserveur.
§ Installez le logiciel HLA Twin Client sur un ordinateur client (plusieurs clients HLA Twinpeuventseconnecterauserveur).
§ Contactez l'assistance Omixon ([email protected]) pour obtenir des instructionsd'installationpersonnaliséedel'automatisation.
Protocoleparanalyse1. LancerlelogicielHLATwinClientetseconnecter.
2. Lesdonnéesontdéjàététraitéesousontencoursdetraitement.Examinerlesrésultatsàl'aidedusystèmeTrafficLightdansHLATwin.
3. Exporterlesrésultatsdugénotypageet/oulesséquencesconsensus,selonlesbesoins.
ProtocolemanuelServeur
Paramétrageetconfigurationinformatique§ InstallezlelogicielHLATwinServersurleserveur.§ InstallerlelogicielHLATwinClientsurunordinateurclient.
Protocoleparanalyse§ LancerlelogicielHLATwinClientetseconnecter.§ Sélectionner les donnéesMiSeq au format fastq ou fastq.gz et démarrer l'exécution du
typageHolotypeHLA.§ UnefoisletypageHolotypeHLAterminé,examinerlesrésultatsàl'aidedusystèmeTraffic
LightdansHLATwin.§ Exporterlesrésultatsdugénotypageet/oulesséquencesconsensus,selonlesbesoins.
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ProtocolemanuelBureau
Paramétrageetconfigurationinformatique§ InstallerlelogicielHLATwinDesktop.
Protocoleparanalyse6 LancerlelogicielHLATwinetseconnecter.
7 Sélectionner les donnéesMiSeq au format fastq ou fastq.gz et démarrer l'exécution dutypageHolotypeHLA.
8 UnefoisletypageHolotypeHLAterminé,examinerlesrésultatsàl'aidedusystèmeTrafficLightdansHLATwin.
9 Exporterlesrésultatsdugénotypageet/oulesséquencesconsensus,selonlesbesoins.
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Figuressupplémentaires
Exemples de plaques d'amplicons, d'amplification, de dilution, dequantificationdesamplicons(pourunlocusindividuel)etderéactions
Exempledeplaquedequantificationdesétalons
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ExempledeplaqueqPCRdequantificationdesbanquesKAPA
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Annexe1:SélecteurautomatiséPippinPrep
ProgrammationduPippinPrep1. Cliquez sur l'onglet Protocol Editor (Éditeur de protocole), puis sur le bouton « New »
(Nouveau).
2. Cliquezsurl'icônededossierenregardduchampCassetteetsélectionnez«1.5%DFMarkerK » (Marqueur K 1,5 % sans colorant) pour le Pippin Prep ou « 1.5%DF Marker R2 »(MarqueurR21,5%sanscolorant)pourleBluePippin.
3. Danslabandequevousprogrammez:
a. Mettezensurbrillancelechamp«Range»(Plage).b. Réglez«RefLane» (Bandede référence)pourétablirunecorrespondanceavec le
numérodelabandedanslaquellevoustravaillez.c. Réglezlechamp«Start*»(Début)sur650.d. Réglezlechamp«End*»(Fin)sur1300.
4. DanslechampReferenceLane(Bandederéférence),sélectionnezlabandedanslaquellevoustravaillez.
5. Cliquezsurlebouton«SaveAs»(Enregistrersous)etnommezvotreprogramme.
UtilisationdusélecteurautomatiséPippinPrep1. MettezenmarchelePippinPrepenappuyantsurleboutond'alimentationàl'arrièrede
l'appareil.
2. InspectezvisuellementlePippinPrep.Vérifiezqueles5témoinslumineuxDELsontallumésetquel'intérieurdel'appareilestpropreetsec.
3. CliquezsurlelogoSageSciencesituéaucoininférieurdroitdel'écran.Lafenêtrequis'ouvrevouspermetdesaisirunmotdepasse.Lemotdepassed'usinepardéfautest«pips».
4. Cliquezsurl'ongletFactorySetup(Paramétraged'usine)etvérifiezquelavaleurBase-to-Threshold(BaseàSeuil)estrégléesur0,02.
5. Placezl'outild'étalonnageàl'intérieurduPippinPrep,enveillantàcequelabandefoncéesoitorientéeverslebasetplacéeau-dessusdestémoinslumineuxDEL.
6. Dansl'ongletMain(Principal),cliquezsurlebouton«Calibration»(Étalonnage).
7. DanslafenêtreCalibration(Étalonnage),vérifiezquelechamp«TargetIpHmA»(mApHCibleI)estréglésur0,80(0,60surleBluePippin),puisappuyezsurlebouton«Calibrate»(Étalonner).
8. Accédez à l'onglet Protocols (Protocoles). Cliquez sur le bouton « Load » (Charger) etsélectionnezleprogrammeHolotypeHLAainsiquelabandequevousallezutiliser.Vérifiezlespointssuivants:
a. Labandeadéquateestactivée.
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b. Letémoindesélectiond'unlargespectreestactivé.c. Labandederéférenceestlamêmequelabandequiseraexécutée.
9. Accédezàl'ongletMain(Principal).Vérifiezlespointssuivants:
a. Leprogrammequevousavezchargéestceluiquiestsélectionné.b. Labandederéférenceappropriéeestsélectionnéeetc'estaussilabandedanslaquelle
l'échantillonseraexécuté.
10. Inspectez la cassette. Avant d'enlever le film de scellage des puits, vérifiez la présenceéventuelledebullesderrière l'accèsde lachambred'élution.Lecaséchéant, tapotezetbalancezlégèrementlacassetteentrevosmainspouréliminerlesbulles.
11. Placezlacassette,puitstoujoursscellés,àl'intérieurduPippinPrep.
12. Retirezdélicatementlefilmdescellage,enprenantsoindeleretirerdepuislecôtéinutilisédelacassette(bande5)verslecôtéutilisé(bande1).Veillezàévitertouteéclaboussuredeliquideunefoislefilmretirépouréviteruneéventuellecontamination.
13. Retirezlevolumeentierdetamponduportd'accèsàlachambred'élutiondelabandequevousallezutiliseretajoutez40µldetampond'électrophorèsefraisdansceportd'accès.
14. Recouvrezlesportsd'accèsd'unefinebandedescellage.
15. Touslesréservoirspleinsàmoinsdes3/4deleurvolumedoiventêtrecomplétésavecdutampond'électrophorèse.Néanmoins, lespuitsnedoiventpasdéborder ! Leniveaudutampondoitjusteatteindreleplastiquedupuitspournepasdéborderlorsduglissementducouvercle.Complétezletampondepuislespuitsinutilisés(bande5)verslespuitsutilisés(bande1).
16. Vérifiez que chacun des puits de charge (puits contenant de l'agarose) sont remplis detampond'électrophorèse.Letampondoitjusterecouvrirl'agaroseetprésenterunesurfaceparfaitementplane.
17. Fermez lentement lePippinPrep,enveillantàéviter toutcontactentre le tamponet lecouverclelorsquevousfermezl'appareil.
18. Effectuezletestdecontinuité.Ilarriveparfois, lorsquelescapteurssèchentlégèrement,queletestéchoueaupremieressai.Lecaséchéant,effectuezletestunesecondefois.Unefoisletestdecontinuitéterminé,ouvrezlentementlePippinPrep.Vérifiezquelecouvercledel'appareilnefaitpascoulerleliquidedanslacassette.
19. Mélangez la solution de charge demarqueur K au vortex et centrifugez-la brièvement.Ajoutez10µldecettesolutionaux~30μldelabanque.
20. Mélangezlabanqueauvortexetcentrifugez-labrièvement.
21. Retirez40µldetampondupuitsd'échantillonquevousallezutiliser.
22. Ajoutez~40μldelabanquechargéeenmarqueurKaupuitsd'échantillonquevousallezutiliser.
23. Marquezlabandequevousutilisezeninscrivantlesinitialesdutechnicienetladate.
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24. FermezlePippinPrepetcliquezsurlebouton«Start»(Démarrer).Vérifiezquelabandeappropriéeaétéactivée.L'exécutiondel'échantillondoitdurer45minutesenviron.
25. Une fois l'exécution terminée, ouvrez prudemment le Pippin Prep. Veillez à ce que lecouverclenefassepascoulerdeliquidedanslacassette.
26. Retirez la bande de scellage des ports d'accès à la chambre d'élution, en évitantsoigneusementtoutécoulementdeliquide.
27. Transférezlevolumeentierduportd'accèsàlachambred'élutiondansuntubeàliaisonfaiblede1,5ml.
28. Recouvrez tous lespuitsouvertsà l'aided'undouble filmdescellagedeplaque.Pensezàlaisserunelanguettedefilmducôtéinutilisé,cequifaciliteraleretraitdufilmdescellagedepuislecôtéinutiliséverslecôtéutilisé.
29. Placezlacassettescelléedanssapocheetmettez-ladecôté.
30. Prenezlacassettedelavageetremplissez-lad'eauMiliQ.RefermezdoucementlecouvercleduPippinPrep,enprenant soind'éviter toutécoulementde liquidedans lacassettedelavage.
32. LaissezlePippinPrepfermépendantplusieurssecondes.
33. Ensuite,ouvrez-leenprenantsoind'évitertoutécoulementdeliquidedanslacassettedelavage.
34. Retirezlacassettedelavage,videzsoncontenueneauetlaissez-lasécher.
35. Essuyeztoutetraced'eaudanslePippinPrepetfermezdoucementcedernier.
36. Sélectionnezlebouton«ShutDown»(Fermer)danslemenuPippinPrep.
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Annexe2:Quantificationdesampliconsaumoyend'unappareilqPCRDurée:35minutes
ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar
TamponTE20×(pH7,5) 4°C PromegaÉtalonADNLambda(100ng/μl) 4°C Promega200×marqueurcouleurQuantiFluordsDNA 4°C PromegaH2Ostérile 20à25°C UtilisateurPlaque(s)d'amplificationdeclasseI 4°C Étape2Plaque(s)d'amplificationdeclasseII 4°C Étape2
Protocole1. Créerunedilutionsérielleenutilisantdestubesdemicrocentrifugationde1,5mletl'étalon
QuantiFluorLambdaDNA(100ng/μl).Appliquerlatablededilutionci-dessous:
Libellédutube ADNutilisé Volumed'ADN(μl)
VolumeTE1x(μl)
Conc.finale(ng/μl)
Étalon1 ADNLambda 7,5μl 492,5μl 1,5ng/μlÉtalon2 Étalon1 250μl 250μl 0,75ng/μlÉtalon3 Étalon2 250μl 250μl 0,38ng/μlÉtalon4 Étalon3 250μl 250μl 0,19ng/μlÉtalon5 Étalon4 250μl 250μl 0,09ng/μlÉtalon6 Étalon5 250μl 250μl 0,05ng/μlStandard7,vierge Vierge 0μl 250μl 0ng/μl
2. Préparer les plaques de quantification des amplicons (voir les figures supplémentaires).Aliquoter49,5μldetamponTE1xdanslespuitsd'unenouvelleplaqueà96puitspourlenombretotald'ampliconsàquantifier.
3. Ajouter0,5μld'ampliconsdespuitscorrespondantsdesplaquesd'amplificationdanslespuitsindividuelsdesplaquesdequantificationdesamplicons.Mélangerparpipetage.
4. Préparer une solution de travail demarqueur couleur QuantiFluor 1× selon la formulesuivante :0,25μldemarqueurcouleurQuantiFluor (200X)+49,75μlde tamponTE1×.PréparerunequantitésuffisantedesolutiondetravaildemarqueurcouleurQuantiFluor1×desortequechaqueéchantillon(pourletotaldeséchantillonsdesplaquesd'amplification)etchaqueétalon(14autotal)reçoiveunaliquotede50µl.
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5. Préparer une plaquede quantification des étalons et des plaques de quantification desamplicons.Aliquoter50μldesolutiondetravaildemarqueurcouleurQuantiFluor1×danslespuitsdesplaquesoptiquesà96puitsselonleformatdelaplaquedequantificationdesétalonsetdesplaquesdequantificationdesamplicons(voirlesfiguressupplémentaires).
6. À partir des étalons préparés ci-dessus, ajouter 50 µl de chaque étalon, en doubleexemplaire,danslespuitsindividuelsdelaplaquedequantificationdesétalons(14puitsautotal).
7. Mélangerintégralementauvortexetcentrifugerbrièvement.
8. Placerchaqueplaquedequantificationuneparunedansl'appareildeqPCRetexécuterleprogrammesuivant:
Nombredecycles Température Temps1 25°C 10secondes 25°C 15secondes2 25°C 30secondes(acquisitiondesdonnées)
9. Calculerlaconcentrationdel'ADNdanslesplaquesdequantificationdesampliconsàpartirdesdonnéesbrutesdesunitésde fluorescence relative (RFU)généréespar l'appareildeqPCR.
10. Diluer l'ADN dans les plaques d'amplification avec de l'eau stérile de sorte que laconcentrationfinaledel'ADNsoitde67ng/µlenviron.
§ Silaconcentrationdel'ADNestégaleousupérieureà150ng/μl,ajouter25μld'eau.§ Silaconcentrationdel'ADNestcompriseentre100et150ng/μl,ajouter10μld'eau.§ Silaconcentrationdel'ADNestinférieureà100ng/μl:nepasajouterd'eau.
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Annexe3:Quantificationd'unebanqueutilisantunmarqueurcouleurfluorescentdsDNAintercalaireDurée:~15minutesLa concentration de la banque de tailles sélectionnées peut êtremesurée avec précision enintercalantunmarqueurcouleurfluorescentdsDNAtelquelevertSYBRouunéquivalent.Leskitset instrumentsàcette findisponiblesdans lecommerce incluent,sanstoutefoiss'y limiter, lefluoromètre Qubit de Thermo Fisher (qui utilise le kit de test Qubit Broad-Range dsDNA), lefluoromètreQantusdePromega(quiutiliselemarqueurcouleurfluorescentQuantifluordsDNA).LaméthodeQubitestdécrite icicarelleest lapluscommunémentutilisée.Sivousutilisezunautrekitetunautreinstrument,suivezlesinstructionshabituellesdufabricant.
Remarque:Cetteméthodedefluorométrieestunmoyenrapidemaisprécisdedéterminer la concentration de la banque de tailles sélectionnées finale. EllepermetdemesurerlatotalitédudsADNprésentdanslabanque.
ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar
KitdetestQubitdsDNABR températureambiante ThermoFisherÉtalonsQubitdsDNABR 4°C ThermoFisherBanquedetaillessélectionnées 4°C Étape5
Protocole6.1 – Laisser les étalons Qubit atteindre la température ambiante. Préparer des tubes à
essaiQubit(500μl,paroimince)pourlabanqueendoubleexemplaireetlesdeuxétalons.Mélangerauvortexetcentrifugerlesétalonsetlabanque.
6.2 –Ajouter995μldetamponet5μldemarqueurcouleurdansuntubedecentrifugationde1,5ml.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.
6.3 –Transférer190μldumélangederéactifsdanslestubesQubitdesdeuxétalons.Transférer198μldumélangederéactifsdanslestubesQubitdesdeuxexemplairesdelabanque.
6.4 – Ajouter 10 μl de l'étalon 1 dans le tube Qubit correspondant etmélanger au vortexpendant2secondes.Procéderdelamêmefaçonavecl'étalon2.
6.5 –Ajouter2μldelabanquedanslesdeuxtubesQubitcorrespondantsetmélangerauvortexpendant2secondes.
6.6 –IncuberlestubesQubitàtempératureambiantependant2minutes.
6.7 –Mettreenmarchel'appareilQubitetchoisirunprotocoleBR.
6.8 –PlacerletubeQubitd'étalon1dansl'appareil,puisappuyersurGO.Procéderdelamêmefaçonavecl'étalon2.
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6.9 –Placer letubedelabanquedansl'appareilQubit,puisappuyersurGO.Procéderdelamêmefaçonaveclesecondexemplaire.
6.10 –PourconvertirlerésultatQubitdeconcentrationdeng/μLànM,entrerlesrésultatsdeconcentrationmoyennedesdeuxexemplairesdebanquedansl'ongletduclasseurOmixonintitulé«Quantificationdesbanques».
6.11 –ÀpartirdesrésultatsdelamesureQubit,diluer10μldelabanquedetaillessélectionnéesà une concentration de 2 nM avec de l'eau stérile dans un nouveau tube de micro-centrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.Stockerlabanquedetaillessélectionnéesrestanteà-20°C.
Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.Encasdestockageàlongterme,unenouvellequantificationestrecommandéeavantutilisationsurleséquenceurMiSeq.