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0086 Prépare l'ADN à l'analyse par séquençage sur le séquenceur Illumina MiSeq HOLOTYPE HLA™ 24/7 – CONFIGURATION A1 ET CE/A2 ET CE/A3 ET CE/A4 ET CE MODE D'EMPLOI VERSION 9 02/05/2018 Réservé à un usage diagnostique in vitro

H HLA™ C A1 CE/A2 CE/A3 CE/A4 CE M V - Amazon …CE...V1 05/12/2015 Robert Pollock Première version, ébauche Gergely Tölgyesi 05/12/2015 V2 18/01/2016 Robert Pollock Deuxième

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0086Préparel'ADNàl'analyseparséquençagesurle

séquenceurIlluminaMiSeq

HOLOTYPEHLA™24/7–CONFIGURATIONA1ET

CE/A2ETCE/A3ETCE/A4ETCEMODED'EMPLOIVERSION9

02/05/2018Réservéàunusagediagnostiqueinvitro

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OmixonHolotype24/7–CONFIGURATION|A1etCE/A2etCE/A3etCE/A4&CE|Moded'emploi,version9.Réservéàunusagediagnostiqueinvitro.Copyright©2017,OmixonBiocomputingLtd.Confidentieletexclusif.

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TabledesmatièresINFORMATIONSSURLEFABRICANT...........................................................................................................7

EXPLICATIONDESSYMBOLES.....................................................................................................................7

HOLOTYPEHLA-24/7–CONFIGURATIONA1ETCE/A2ETCE/A3ETCE/A4ETCE–CONTENUDUKIT..........8

COFFRETDECOMPOSANTSD'AMORCES...................................................................................................................8COFFRETCOMPOSANTDEREACTIFSDEPREPARATIONDEBANQUES...............................................................................9PLAQUED'ADAPTATEURSA96PUITS......................................................................................................................9CLASSEUREXCEL.................................................................................................................................................9LOGICIEL–OMIXONHLATWIN..........................................................................................................................10

EXPEDITIONETSTOCKAGE........................................................................................................................10

AVERTISSEMENTSETMISESENGARDE.....................................................................................................10

LIMITATIONSCONNUESDESPRODUITS..................................................................................................................11

INFORMATIONSRELATIVESALASECURITE...............................................................................................11

PARAMETRESDEPERFORMANCE.............................................................................................................11

ASSISTANCETECHNIQUE..........................................................................................................................11

ÉQUIPEMENT,REACTIFSETFOURNITURES...............................................................................................12

RECOMMANDATIONSENMATIERED'EQUIPEMENTTECHNIQUE...................................................................................12RECOMMANDATIONSENMATIEREDEREACTIFSASSOCIES..........................................................................................12

CapacitédukitderéactifsMiSeq.....................................................................................................................13FOURNITURESRECOMMANDEES..........................................................................................................................13

MENTIONLEGALE.....................................................................................................................................14

UTILISATIONPREVUE...............................................................................................................................14

NOTEIMPORTANTEAVANTUTILISATION.................................................................................................15

RECOMMANDATIONENMATIERED'ISOLATIONDEL'ADNGENOMIQUE.......................................................................15

PRINCIPEDELAMETHODE........................................................................................................................16

RESUMEDESETAPES................................................................................................................................17

GLOSSAIRE/DEFINITIONS..........................................................................................................................18

ÉTAPE1–PREPARATIONDUMELANGEDEREFERENCEPOURL'AMPLIFICATIONHLA...............................19

LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................19PROTOCOLE.....................................................................................................................................................19

Mélangederéférence:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1..............................................................................20Mélangederéférence:HLA-DQB1Set3..........................................................................................................20

ÉTAPE2–AMPLIFICATIONDESHLADECLASSEIETII...............................................................................21

LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................21PROTOCOLE.....................................................................................................................................................21

MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1...................................21MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-DQB1Set3...............................................................22AmplificationdeclasseI(HLA-A,BetC)..........................................................................................................22AmplificationdeclasseII(HLA-DRB1,DPB1,DQA1etDQB1)..........................................................................22Taillesattenduesdesamplicons.......................................................................................................................23

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ÉTAPE3–QUANTIFICATIONETNORMALISATIONDESAMPLICONS(AL'AIDED'UNFLUOROMETREDEPLAQUE)...................................................................................................................................................24

LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................24PROTOCOLE.....................................................................................................................................................25

Regroupementdesamplicons..........................................................................................................................26PurificationdesproduitsdePCRavecExoSAP-ITExpress................................................................................26

ÉTAPE4–PREPARATIONDESBANQUES...................................................................................................27

LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................27PROTOCOLE.....................................................................................................................................................27

Mélangederéférencedefragmentation.........................................................................................................28Programmedefragmentation.........................................................................................................................28Mélangederéférencederéparationdesextrémités.......................................................................................29Programmederéparationdesextrémités.......................................................................................................29Mélangederéférencedeligation....................................................................................................................30Programmedeligation....................................................................................................................................30Regroupementetpurificationdesbanques.....................................................................................................31

ÉTAPE5–SELECTIONDELATAILLEDESFRAGMENTSDELABANQUE.......................................................33

LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................33PROTOCOLE.....................................................................................................................................................33

ÉTAPE6–QUANTIFICATIONDELABANQUEAUMOYENDEL'APPAREILQPCR.........................................34

LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................34PROTOCOLE.....................................................................................................................................................34

Mélanged'amorcesqPCR................................................................................................................................34MélangederéférenceqPCR.............................................................................................................................35

ÉTAPE7–SEQUENÇAGESURLESYSTEMEILLUMINAMISEQ.....................................................................37

LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................37CapacitédukitderéactifsMiSeq.....................................................................................................................37

PROTOCOLE.....................................................................................................................................................37

ÉTAPE8–ANALYSEDESDONNEESDESEQUENÇAGEHLA.........................................................................39

PROTOCOLEAUTOMATISE...................................................................................................................................39Paramétrageetconfigurationinformatique....................................................................................................39Protocoleparanalyse.......................................................................................................................................39

PROTOCOLEMANUELSERVEUR............................................................................................................................39Paramétrageetconfigurationinformatique....................................................................................................39Protocoleparanalyse.......................................................................................................................................39

PROTOCOLEMANUELBUREAU............................................................................................................................40Paramétrageetconfigurationinformatique....................................................................................................40Protocoleparanalyse.......................................................................................................................................40

FIGURESSUPPLEMENTAIRES....................................................................................................................41

EXEMPLESDEPLAQUESD'AMPLICONS,D'AMPLIFICATION,DEDILUTION,DEQUANTIFICATIONDESAMPLICONS(POURUNLOCUSINDIVIDUEL)ETDEREACTIONS.............................................................................................................................41EXEMPLEDEPLAQUEDEQUANTIFICATIONDESETALONS...........................................................................................41EXEMPLEDEPLAQUEQPCRDEQUANTIFICATIONDESBANQUESKAPA........................................................................42

ANNEXE1:SELECTEURAUTOMATISEPIPPINPREP...................................................................................43

PROGRAMMATIONDUPIPPINPREP......................................................................................................................43

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UTILISATIONDUSELECTEURAUTOMATISEPIPPINPREP.............................................................................................43

ANNEXE2:QUANTIFICATIONDESAMPLICONSAUMOYEND'UNAPPAREILQPCR...................................46

LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................46PROTOCOLE.....................................................................................................................................................46

ANNEXE3:QUANTIFICATIOND'UNEBANQUEUTILISANTUNMARQUEURCOULEURFLUORESCENTDSDNAINTERCALAIRE..........................................................................................................................................48

LISTEDESREACTIFS...........................................................................................................................................48PROTOCOLE.....................................................................................................................................................48

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Historiquedudocument–Notesetmisesàjourimportantes

Version Date Auteur Résumédesmodifications Autorisépar

Dated’emission

V1 05/12/2015 Robert

PollockPremièreversion,ébauche Gergely

Tölgyesi05/12/2015

V2 18/01/2016 RobertPollock

Deuxièmeébauche,correctionsmineures GergelyTölgyesi

18/01/2016

V3 10/02/2016 RobertPollock

Troisièmeébauche,miseàjourdel'explicationdessymboles,miseàjourdelarecommandationdescyclesdecongélation/décongélation,miseàjourdel'utilisationprévue

GergelyTölgyesi

10/02/2016

V4 26/02/2016 RobertPollock

Quatrièmeébauche,miseàjourduchapitrerelatifauxconsignesdesécurité

GergelyTölgyesi

26/02/2016

V5 05/04/2016 RobertPollock

Cinquièmeversion,recommandationalternativerelativeàl'analysequantitativedesamplicons

EfiMelista 05/04/2016

V6 09/04/2016 EfiMelista

Changementmineurdelaformulationde«EnzymeLR-PCR»pour«Taqpolymérase»suiteàlamodificationdeladocumentationdeQiagen

GergelyTölgyesi

09/04/2016

V7 23/04/2016 EfiMelista

MiseàjourdeladéclarationDQB1Set1etSet2 GergelyTölgyesi

23/04/2016

V8 30/05/2016 GergelyTölgyesi

MiseàjourdesindicateursdeperformanceMiseàjourdesvolumesderéactifsdepréparationdesbanquesMiseàjourdesconfigurationsdeproduitpourlesplaquesd'adaptateursindexésA2/A3/A4

EfiMelista 30/05/2016

V9 29/11/2017 TündeVágó

Retraitde«DQB»desadditifsDQB,vérificationdugelaprèsquelaPCRdelongueportéesoitrenduefacultative,simplificationdel'analysequantitativedesamplicons,changementduvolumederegroupementparéchantillondansleskitsde11locus,remplacementdeExoSAP-ITparExoSAP-ITExpress,utilisationdeQubitpourlaquantificationdesbanques,mélanged'amorcesDQB1sets1et2remplacéparDQB1set3,diminutiondutempsderéactionderéparationfinale,diminutiondutempsderéactiondeligation,miseàjourdelaméthodedequantificationdesbanques,fiched'échantillonsuppriméedesannexes

EfiMelista 02/05/2018

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Clausedenon-responsabilité

Omixonamistoutenœuvrepours'assurerdel'exactitudeduprésentmoded'emploi.Omixondécline toute responsabilité en cas d'inexactitudes ou d'omissions qu'il pourrait contenir. Lesinformationsfourniesdanscemoded'emploisontsujettesàmodificationsanspréavis.Omixonn'assumeaucune responsabilité vis-à-vis de toute inexactitudeque leprésentmoded'emploipourraitinclure.

Omixonseréserveledroitd'apporterdesaméliorationsàcemoded'emploiet/ouauxproduitsquiysontdécrits,àtoutmomentetsanspréavis.

Dans le cas où vous trouveriez dans cemanuel des informations incorrectes, trompeuses ouincomplètes, vos commentaires et suggestions seront les bienvenus. Veuillez nous les faireparveniràl'[email protected].

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InformationssurlefabricantRaisonsociale:OmixonBiocomputingLtd

Adressedevisite:Fehérváriút50-52/6

Ville:Budapest

Codepostal:H-1117

Pays:Hongrie

Explicationdessymboles

Numérodelot

Numéroderéférence

Consulterlemoded'emploi

ContientdesréactifspourunnombreNdetests

Fabricantlégal.Ladatejointeapposéeàcôtédecesymboleestladatedefabrication.

Températuredestockagerecommandée

Datedepéremption

Dispositifmédicalpourdiagnosticinvitro

ContientuncomposantderemplacementComposantderemplacement

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HolotypeHLA-24/7–ConfigurationA1etCE/A2etCE/A3etCE/A4etCE–ContenudukitCe chapitre décrit le contenu des différentes configurations disponibles du produit HolotypeHLA24/7commesuit:

Typedeproduit N°DERÉF. RxnsHolotypeHLA24/7–ConfigurationA1etCE

H52 24

HolotypeHLA24/7–ConfigurationA2etCE

H56 24

HolotypeHLA24/7–ConfigurationA3etCE

H59 24

HolotypeHLA24/7–ConfigurationA4etCE

H53 24

Veuillez noter que le coffret Composant d'amorce et le coffret Composant de réactifs depréparation de banques sont identiques dans chaque configuration de produit. Le composantPlaqued'adaptateursindexésà96puitsdiffèreauniveaudelaséquencedesindexesdanschaqueconfiguration. Pour plus d'informations, veuillez consulter le chapitre Plaque d'adaptateursà96puitsci-après.

Coffretdecomposantsd'amorcesLe coffret de composants d'amorces fournit des solutions d'amorce prêtes à l'emploi pourl'amplificationcibléedelaPCRàlongueportéedesgènesHLAA,B,C,DPB1,DQA1etDQB1,etDRB1. De plus, il contient également deux types d'additifs de la PCR (Amplificateur 1 etAmplificateur2).

Mélanged'amorces N°DERÉF. Rxns Vol./tube Nbredetubes CodecouleurHLA-A P013 24 60μl 1 JauneHLA-B P023 24 60μl 1 RougeHLA-C P033 24 60μl 1 OrangeHLA-DRB1 P043 24 60μl 1 VertHLA-DQB1(Set3) P123 24 60μl 1 BleuHLA-DQA1 P073 24 60μl 1 BrunHLA-DPB1 P083 24 60μl 1 MauveAmplificateur1 E01 24 1100μl 1 TransparentAmplificateur2 E02 24 300μl 1 Transparent

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CoffretComposantderéactifsdepréparationdebanquesLe coffret de composants de préparation de banques contient les réactifs permettant lapréparationdebanques(fragmentation,réparationetadénylationdesextrémitésdesampliconsetligationdesséquencesd'adaptateursindexés)depuislesampliconsHLA.

Réactif N°DERÉF. Rxns Vol./tube Nbredetubes CodecouleurEnzymedefragmentation(A) R12 24 70μl 1 JauneTampondefragmentation(B) R22 24 70μl 1 RougeEnzymederéparationdesextrémités(C)

R32 24 41μl 1 Vert

Tamponderéparationdesextrémités(D)

R42 24 82μl 1 Orange

Enzymedeligation(E) R52 24 81μl 1 BleuTampondeligation(F) R62 24 900μl 2 Noir

Plaqued'adaptateursà96puitsLecomposantPlaqued'adaptateursindexésà96puitscontientdesadaptateursNGSindexésprêtsàl'emploi(oligonucléotidesd'ADNdoublebrin)ensolutionde5µl,pourlagénérationdebanquesNGS individuelles. La plaque d'adaptateurs indexés à 96 puits contient un nombre suffisantd'adaptateursindexéspourlagénérationde24banquesNGSindividuellesetpourl'identificationdeséchantillonsenaval.

Typedeproduit Réactifassocié N°DERÉF. Rxns Vol./puits Nbrede

plaquesHolotypeHLA24/7–ConfigurationA1etCE(RÉF.:H52)

Plaqued'adaptateursA1(i1-24) N4 24 5μl 1

HolotypeHLA24/7–ConfigurationA2etCE(RÉF.:H56)

Plaqued'adaptateursA2(i25-48) N7 24 5μl 1

HolotypeHLA24/7–ConfigurationA3etCE(RÉF.:H59)

Plaqued'adaptateursA3(i49-72) N8 24 5μl 1

HolotypeHLA24/7–ConfigurationA4etCE(RÉF.:H53)

Plaqued'adaptateursA4(i73-96) N9 24 5μl 1

ClasseurExcelUnclasseurExcelestfourniafindeprendreenchargelescalculs,lesagencementsdeplaqueetlatenuedesdossiersduprotocoleHolotypeHLA24/7,lacréationdesfichesd'échantillonMiSeqetplusencore.Sivousn'enpossédezpasunexemplaire,[email protected].

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Logiciel–OmixonHLATwinContactez [email protected] pour obtenir les crédits Omixon HLA Twin associés à votreacquisitiondukitHolotypeHLA24/7.

Noteimportante:Utilisez les trois composantsdukitOmixonHolotypeHLA24/7et le logicielOmixonHLATwinconjointement afin de constituer un flux de travail d'utilisation diagnostique in vitro. Veuillezconsulter le chapitre consacré aux avertissements et mises en garde associés aux limitationsd'utilisationdesproduits.

Lescomposantsderemplacementsontdisponiblessurdemandeexpressedesutilisateurs.VeuilleznoterquelesremplacementssontfournisparOmixonpourdescoffretsdecomposants,etnonpourdesflaconsindividuels.Pourplusd'informations,[email protected].

ExpéditionetstockageLesproduitssontexpédiéssurdescryopacksdansdesemballagesenStyrofoametdoiventêtrestockésà-20°Cdèsleurarrivée.Veuillezvaliderleprocessusdecontrôleetdesurveillancedetempératuredevoscongélateursetleréviserrégulièrement.

Leskitsnonouvertssontstablesjusqu'àleurdatedepéremption(indiquéesurl'étiquettedukit)lorsqu'ilssontstockésà-20°C.

Unefoisleproduitouvert,ilestrecommandéderespecterunmaximumde4(quatre)cyclesdecongélation/décongélationafindegarantir la stabilitéduproduit. Leskitsouvertssontstablesjusqu'à3moislorsqu'ilssontstockésà-20°C.

AvertissementsetmisesengardeLimitationsd'utilisationdesproduits

Afin de bénéficier des meilleures performances, veuillez appliquer le flux de travail du kitHolotypeHLA24/7etlelogicielOmixonHLATwinlorsdutypageHLAparNGSaveclesmatériaux,réactifsetéquipementrecommandésauchapitre«Équipementetréactifs».L'utilisationdematériauxautresqueceuxspécifiésauchapitre«Équipementetréactifs»doitêtrevérifiéeetvalidéeparl'utilisateur.Neprocédezpasàlareconstitutionouàladilutiondesréactifsdansdesvolumesautresqueceuxindiquésdansleprésentmoded'emploi.N'utilisezpasunvolumedesréactifs inférieuràceluiindiquédansleprésentmoded'emploi.Lenon-respectdecesindicationspeutconduireàdeserreursdeperformance.Omixon ne saurait fournir une assistance en cas de problèmes résultant du non-respect desétapesduprotocoledécritesdansleprésentmoded'emploi.N'utilisezpas leproduitencasdedommagevisibledesescomposants(flaconscassés,plaquerompue,capuchonsdesserrés,etc.).

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LimitationsconnuesdesproduitsVeuillez vous référer au document intitulé Product Known Limitations Guide (Guide deslimitations connuesdesproduits) afinde connaître les limitationset ambiguïtés logiciellesduproduitHolotypeHLA.Ceguideestdistribuéconjointementaumoded'emploimaissetrouveégalementsurlesiteWebOmixonsousMyHolotype/SupportetServices/HLATwinInstructionsforUse,ouestdisponiblesursimpledemandeàl'[email protected].

InformationsrelativesàlasécuritéAvant de commencer, veuillez lire les paragraphes « Informations relatives à la sécurité » et«Notes importantes » concernant les réactifs ou les kits indiqués au chapitre « Équipement,réactifsetfournitures».Lorsquevousemployezdesproduitschimiques,portezuneblousedelaboratoireadéquate,desgants jetablesetdes lunettesdesécurité.Pourplusd'informations,veuillez consulter lesFDS(Fichesdedonnéesde sécurité)appropriéesmisesàdispositionpar le fournisseurduproduitconcerné.Un descriptif des composants chimiques des réactifs est fourni dans les FDS du kit HolotypeHLA24/7,disponiblessursimpledemande.Procédezàl'éliminationdescomposantsduproduitentantquedéchetsmédicauxgénéraux.

ParamètresdeperformancePrincipauxparamètresdeperformanceétablisconformémentàlavalidationduproduit.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Sensibilité 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Spécificité 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%

Précision 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Exactitude 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%

Reproductibilité 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%

Répétabilité 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

AssistancetechniquePouruneassistancegénéralerelativeàceprotocole,[email protected].

Assistancetéléphonique:

États-Unis|+1(617)5000790Europe|+36(70)5748001Autrespays|+1(617)5000790

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Équipement,réactifsetfournitures

Recommandationsenmatièred'équipementtechnique§ Thermocycleurauformat96puits§ Fluoromètredeplaque(outoutinstrumentcapablededétecterlafluorescencedesplaques

auformat96puits,utilisableaveclesystèmePromegaQuantiFluordsDNA)§ SélecteurautomatiséPippinPrep(RÉF.PIP0001)ouBluePippin(RÉF.BLU0001)deSAGE

Science§ InstrumentqPCRpourplaquesauformat96ou384puits§ FluoromètreQubit(RÉF.Q33216)deThermoFisherScientific(facultatif)§ SéquenceurIlluminaMiSeq(RÉF.SY-410-1003)§ Ordinateuren64bitsavecauminimum4cœurset16GodeRAM§ Supportsdestockagededonnéesàlongterme(approximativement2Todedonnéespar

séquenceurMiSeqetparan)

Recommandationsenmatièrederéactifsassociés§ KitsLongRangePCRdeQiagen(RÉF.206401,206402ou206403)

§ Chaqueéchantillonrequiert3,2μldeTaqpolymérase.§ LekitLongRangePCR(20)RÉF.206401contient8μldeTaqpolymérase.§ LekitLongRangePCR(100)RÉF.206402contient40μldeTaqpolymérase.§ LekitLongRangePCR(250)RÉF.206403contient100μldeTaqpolymérase.

§ ExoSAP-ITdeAffymetrix(RÉF.75001-200,75001-1ML,75001-4X-1MLou75001-10ML)§ Chaqueéchantillongroupérequiert4μld'enzymeExoSAP-IT.§ LeréactifRÉF.75001-200contient200μld'enzymeExoSAP-ITExpress.§ LeréactifRÉF.75001-1-MLcontient1mld'enzymeExoSAP-ITExpress.§ LeréactifRÉF.75001-4X-1MLcontient4mld'enzymeExoSAP-ITExpress.§ LeréactifRÉF.75001-10MLcontient10mld'enzymeExoSAP-ITExpress.

§ KitLibraryQuantification–Illumina/UniversaldeKAPABiosystems(RÉF.KK4824)§ KitdetestQubitdsDNABRAssay(RÉF.Q32850ouQ32853)(facultatif)

§ LekitRÉF.Q32850contient100tests.§ LekitRÉF.Q32853contient500tests.

§ SystèmeQuantiFluordsDNAdePromega(RÉF.E2670)§ KitdebillesAgencourtAMPureXPbeadsdeBeckmanCoulter (RÉF.A63880,A63881ou

A63882)§ ChaqueexécutionHolotypeHLArequiertunmaximumde900μldebillesAMpureXP.§ LekitRÉF.A63880contient5mldebillesAMPureXP.§ LekitRÉF.A63881contient60mldebillesAMPureXP.§ LekitRÉF.A63882contient450mldebillesAMPureXP.

§ Cassettedegelà1,5%d'agarose,sanscolorantavecétaloninterne(MarqueurK/R2),pourle sélecteur automatisé Pippin Prep/Blue Pippin (RÉF. CDF1510 pour le Pippin Prep etRÉF.BDF1510pourleBluePippin)

§ Éthanoldequalitémoléculaire(alcoolanhydre)

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§ Eaudequalitémoléculaire(exemptedeDNaseetRNase)§ Hydroxydedesodium§ TamponTE1×(pH8,0)§ KitderéactifsMiSeqdeIllumina

CapacitédukitderéactifsMiSeq

KitderéactifsIlluminaMiSeq

TempsHeures

Échantillons24/7

Std500Cycle(MS-102-2003) ~39 24

Std300Cycle(MS-102-2002) ~24 24

Micro300Cycle(MS-103-1002) ~19 24

Nano500Cycle(MS-103-1003) ~28 12

Nano300Cycle(MS-103-1001) ~17 6

Fournituresrecommandées§ Tubesdemicrocentrifugationde1,5ml§ Tubesdemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml§ Tubes de microcentrifugation à liaison faible de 2,0 ml (tubes Eppendorf DNA LoBind

RÉF.022431048recommandés)§ Tubes à paroi mince de 0,5 ml pour appareil Qubit (tubes à essai Qubit RÉF. Q32856

recommandés)§ Pipettesàvolumeréglable(capacitéde1,0à1000μl)§ Pipettesàvolumeréglableà8canaux(capacitéde1,0à100μl)§ Plaquesà96puitscompatiblesaveclethermocycleur§ Plaquesoptiquesà96puitscompatiblesaveclefluoromètredeplaque§ Plaquesà96puitscompatiblesavecl'appareilqPCR§ Filmdescellagepourplaqued'usagegénéral§ Filmdescellagepourplaquecompatibleaveclethermocycleur(testépourlaPCRàlongue

portée)§ Filmdescellagepourplaqueoptiquecompatibleavecl'appareilqPCR(facultatif)§ Supportmagnétiquecompatibleaveclestubesdemicrocentrifugationde2ml§ Portoirsderefroidissement96puits(2pièces)§ Tubesconiquesde50ml§ Réservoirsde50ml

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MentionlégaleLemode d'emploi du produit HolotypeHLA 24/7 et son contenu sont la propriété d'OmixonBiocomputing Limited («Omixon»),et sont conçusaux finsdu seulusagecontractuelde sesclientsencequiconcerneleoulesproduit(s)décrit(s)danscedocumentetànulleautrefin.Leprésent document et son contenu ne seront pas utilisés ni distribués à toute autre fin niautrement communiqués, divulgués ou reproduits par quelque moyen que ce soit sans leconsentement écrit préalable d'Omixon. Par le présent document, Omixon n'accorde aucunelicenceenvertudesesbrevet,marquedecommerce,droitd'auteuroudroitsditsde«commonlaw»nidroitssimilairesdetoutetiercepartie.

LelogicielOmixonHLATwin(«logiciel»)estutilisésouslicenceparleclientdanslesconditionsgénéralesdeventedéfiniesdansleCLUFd'OmixonHLATwin(www.omixon.com/hla-twin-eula/).Sivousn'acceptezpaslesprésentesconditionsgénéralesdevente,Omixonnevousaccordepasdelicencedulogiciel,etvousnedevezpasutiliserouinstallerlelogiciel.

Lesinstructionscontenuesdanscedocumentdoiventêtrestrictementetexplicitementsuiviesparunpersonnelqualifiéetdûmentforméafind'assurerl'utilisationsûreetappropriéeduoudesproduit(s)décrit(s)auxprésentes.Lalectureetlabonnecompréhensionducontenudecedocument dans son intégralité préalablement à l'utilisation de ce ou ces produit(s) sontincontournables.

TOUT MANQUEMENT À LA LECTURE INTÉGRALE ET AU STRICT SUIVI DE LA TOTALITÉ DESINSTRUCTIONSCONTENUESDANSLEPRÉSENTDOCUMENTPEUTCONDUIREÀDESDOMMAGESMATÉRIELSDU/DESPRODUIT(S),ÀDESDOMMAGESCORPORELSAUXPERSONNES,NOTAMMENTAUXUTILISATEURSETAUTRESTIERS,AINSIQU'ÀDESDOMMAGESMATÉRIELSÀLAPROPRIÉTÉD'AUTRUI.

OMIXONN'ASSUMEAUCUNERESPONSABILITÉDÉCOULANTDE L'USAGE INAPPROPRIÉDUOUDES PRODUIT(S) DÉCRIT(S) AUX PRÉSENTES (Y COMPRIS LES PIÈCES OU LE LOGICIEL DUDITPRODUIT)OUDETOUTUSAGEDUOUDESDIT(S)PRODUIT(S)HORSDUCHAMPD'APPLICATIONDESLICENCESOUAUTORISATIONSÉCRITESEXPRESSESACCORDÉESPAROMIXONENRELATIONAVECL'ACQUISITIONDETEL(S)PRODUIT(S)PARLECLIENT.

RÉSERVÉÀUNUSAGEDIAGNOSTIQUEINVITRO©2017OmixonBiocomputingLtd.Tousdroitsréservés.

UtilisationprévueLe produitHolotypeHLA24/7 – ConfigurationA1 et CE/A2 et CE/A3 et CE/A4 et CE (ci-aprèsnommé«HolotypeHLA»)estunecombinaisonderéactifspourtestdiagnostiqueinvitroetdulogicield'analysededonnées(OmixonHLATwin™).Ilestconçupourpermettrel'identificationetladéfinitiondesHLA(humanleukocyteantigens,antigènesdesleucocyteshumains)declasseIetII dans le cadre d'un typage HLA utilisant la plateforme Illumina® MiSeq Next Generation

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Sequencing.LeproduitHolotypeHLAfournitdesinformationssurl'histocompatibilitédeslociHLAdeclasseI(A,BetC)etdeclasseII(DPB1,DQA1,DQB1etDRB1)enutilisantl'ADNgénomiquehumain.

LelogicielOmixonHLATwin™inclusdansleproduitHolotypeHLAestconçupourl'interprétationetlacorrélationdesdonnéesdeséquençagegénéréessurlesystèmeIllumina®MiSeqavecpourrésultatuntypageHLAauniveaudesallèlesenuneseulepassedehauteprécision,dotéd'untrèsfaibletauxd'ambiguïtéàunniveaude2décimales.

LeproduitHolotypeHLAestconçupourunusagediagnostiqueinvitroparunpersonnelmédicalprofessionnel,telquedestechniciensdelaboratoireetdesmédecins,dûmentformésautypageHLAdansdeslaboratoiresdediagnosticagréésEFIouASHIoupossédantlacapacitérequisepourtravaillerconformémentauxspécificationsEFIouASHI.

Noteimportanteavantutilisation

Recommandationenmatièred'isolationdel'ADNgénomiqueL'ADNgénomiquehumaindoitêtrepréparéàl'aidedekitsdepréparationdel'ADNcorrectementtestés,disponiblesdanslecommerce,afind'assurerlaconstancedelapréparation.Quellequesoit l'approche, la déterminationprécisede la concentration et de la pureté est requisepourassurerunesolideperformancedutest.

L'ADN doit être exempt de contaminants (p. ex. alcool, sels, détergents, formaldéhyde ethéparine)quipourraientcompromettrel'amplification,lapréparationdesbanquesetlesétapesdeséquençageàunstadeultérieur.Lesangnedoitpasêtreprélevédansdestubeshéparinés,etdeséchantillons sanguinsprélevés chezdespatients traités soushéparine,demêmequedeséchantillonslipémiquesouhémolysésnedoiventpasêtreutilisés.

L'ADN génomique préparé peut être utilisé immédiatement s'il a été préparé dans de l'eauexemptedenucléase,oustocképourdespériodesprolongéesàunetempératurede-20°Coumoins.Nousrecommandonsl'utilisationd'eaupourlapréparationdel'ADNgénomiquecarl'EDTAcontenu dans le tampon TE peut inhiber les réactions de la PCR à longue portée. Lesdécongélationsrépétéesdoiventêtreévitéespourréduirelesrisquesdedégradation.

Uneconcentrationde20à30ng/µldel'ADNestfortementrecommandéepourobtenirunintrantde100à150ngd'ADNgénomiqueparamplificationdePCR.Nous recommandons fortementd'utiliser une méthode de quantification basée sur la fluorescence pour déterminer laconcentrationdugADN.

Unrapportd'absorptiondesvaleurs260nm/280nmet260nm/230nmde1,7à2estfortementrecommandé.

Pourl'amplificationdeHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1etHLA-DQB1,0,8à1,2µgd'ADNgénomiqueestrequis.

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PrincipedelaméthodePendant de nombreuses années, la communauté HLA a travaillé au développement d'uneméthodequi identifierait avecprécision lepolymorphismeextensifdesgènesHLAetde leursproduitsgéniques.L'avènementdelaPCR,combinéeàd'autrestechnologies(séquençageSanger,SSOP, SSP, Luminex), a fourni une formule améliorant sensiblement la détection dupolymorphisme HLA mais plusieurs limitations subsistaient néanmoins, qui continuaientd'entravernotrecapacitéàcaractériserlesgènesHLAdemanièreexhaustive.Lestechnologiesdéveloppées ces dernières années, globalement appelées NGS (Next Generation Sequencing,Séquençage de nouvelle génération), ont ouvert de nouvelles opportunités qui permettent lacaractérisationcomplètedesgènesHLAdefaçonhaploïde.LeNGSpossèdedeuxcaractéristiquesdistinctes,lapremièreétantleséquençageclonaldesfragmentsd'ADNetlaseconde,undébitextrêmementélevé.LeNGSdonnelacapacitédephaserlespolymorphismesetdoncd'éliminertouteslesambiguïtés,etdefourniruntypageHLAàdesniveauxde3à4décimalessansrecouriràdestestsdecontrôle.Parconséquent, ilapporteunesolutionpotentiellementcomplèteàlaproblématiquedutypageHLA.Leprotocoledécriticibénéficiedecettetechnologieetcombinel'amplificationde laPCRà longueportéedesgènesHLAavec leséquençagesur laplateformeIlluminaMiSeq.Plusspécifiquement,lesgènesHLAA,B,C,DQA1etDQB1sontamplifiéssurlatotalité de leur longueur de codage, y compris les éléments des régions non traduites desextrémités5’et3’,tandisqueleDRB1estamplifiédel'intron1àl'intron4etqueleDPB1estamplifié de l'intron 1 à la région non traduite 3’. Les amplicons sont ensuite traités selon laprocéduresuivante:

1. Fragmentationdesampliconsàunetailleappropriéepour leséquençagesur laplateformeIllumina.

2. Réparationetadénylationdesextrémitésdesampliconsfragmentés.

3. Ligationdesséquencesd'adaptateursutiliséesdurantleprocessussurleséquenceurMiSeqpourcapturer,amplifieretséquencerl'ADN.Lesadaptateursincluentégalementunindexquiestunecourteséquence,univoquedechaqueadaptateur,permettantd'identifierlesoriginesdelabanque(échantillon/locus).

Aprèsmiseencommundesbanquesindexées,sélectiondestaillesetquantification,l'échantillonestchargésurleséquenceurMiSeqpourséquençage.L'ensembleduprocessusprendde3à5jours,enfonctiondelasélectiondelacellulededébitsurlaplateformeIllumina.Unrésumédesétapesduprotocoleestillustrédanslediagrammeci-dessous:

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Résumédesétapes

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Glossaire/Définitions§ Plaqued'amplicons–AutrenompourPlaqued'amplification§ Plaquedequantificationd'amplicons–Plaqueà96puitscompatibleaveclefluoromètrede

plaqueoùlesampliconsdiluéssontquantifiés§ Plaqued'amplification–PlaquedePCRà96puitsutiliséepouramplifierlelociHLA§ Banque finale – Banque qui inclut toutes les banques d'échantillons prêtes à être

séquencéesenuneseuleexécutionduséquenceurMiSeq§ Plaque de réactions – Plaque sur laquelle ont lieu les réactions séquentielles de

fragmentation,réparationdesextrémitésetligationdesadaptateursindexésàlabanqued'échantillons

§ Plaque de réactifs – Plaque utilisée pour aliquoter les différents réactifs servant à lapréparationdesbanques

§ Banqued'échantillons–Banquepréparéeencombinant(regroupant)tousleslociHLAd'unéchantillondonné

§ Plaqued'amplicons regroupés–Plaquecontenantunebanqued'échantillons (tous lociscombinés)parpuits

§ Plaquedequantificationd'étalons–Plaqueà96puitscompatibleaveclefluoromètredeplaqueoùlesétalonsd'ADNsontplacésenvuedelaquantificationdesamplicons

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Étape1–Préparationdumélangederéférencepourl'amplificationHLADurée:~45minutesL'objectifdecetteétapeestdepréparerdesmélangesderéférenceparlocus,afind'amplifierchaquelocusHLAcibléindividuellement.LeslociamplifiésparceprotocolesontHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1etHLA-DQB1.

Remarque : Les mélanges de référence préparés à cette étape incluent tous les réactifsnécessairesàl'amplification,exceptéleTaqpolymérase.

ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar

Mélanged'amorcesHLA-A -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-B -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-C -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DRB1 -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DPB1 -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DQA1 -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DQB1Set3 -20°C OmixonAmplificateur1 -20°C OmixonAmplificateur2 -20°C OmixonTamponpourPCRdelongueportée(10×) -20°C QiagendNTP(10mMchacun) -20°C QiagenH2Odequalitémoléculaire -20°C Qiagen

Protocole1.1. –Sortirtouslesmélangesd'amorces,lesamplificateurs1et2,lesdNTPetletamponpour

PCR à longue portée (10×) de leur lieu de stockage et les décongeler à températureambiante.

1.2. –Préparerlacombinaisond'amplificateurs:ajouter132μld'amplificateur2dansletubed'amplificateur1.Remplacer l'étiquetteAmplificateur1paruneétiquetteAmplificateurcombiné.

1.3. –Préparerunmélangederéférencepourchaquemélanged'amorcesconformémentauxtableauxci-dessous:

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Mélangederéférence:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1

Réactif Volume/échantillon/locus Volume/24échantillons/locus

Mélanged'amorces 2μl 51μlTamponpourPCRdelongueportée(10×) 2,5μl 63,8μlMélangedNTP(10mMchacun) 1,25μl 31,9μlH2Odequalitémoléculaire 13,85μl 353,2μlVolumetotal 19,6μl 499,9μl

Mélangederéférence:HLA-DQB1Set3

Réactif Volume/échantillon/locus Volume/24échantillons/locus

Mélanged'amorces 2μl 51μlTamponpourPCRdelongueportée(10×) 2,5μl 63,8μlMélangedNTP(10mMchacun) 1,25μl 31,9μlAmplificateurcombiné 5,6μL 142,8μlH2Odequalitémoléculaire 7,85μl 200,2μlVolumetotal 19,2μl 489,7μl

1.4. –Mélangerauvortexchaquemélangederéférenceetlescentrifugerpendant1seconde.Lesplacersurdelaglace.

1.5. –DiluertouslesADNgénomiquesàuneconcentrationde20à30ng/μl(volumeminimal:45μl).

Remarque:LeHolotypeHLAcontientsuffisammentderéactifspour24réactionsetunvolumesupplémentairepourtenircomptedespertesduesaupipetageetauxéchecsd'amplification.

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Étape2–AmplificationdesHLAdeclasseIetIIDurée:~6heures45minutesL'objectifdel'étape2estd'amplifierleslociHLA.Lesconditionsd’amplificationdesHLAdeclasseIetIIontétéoptimiséesàl'aidededeuxprogrammesdePCRdistincts.UnefoislesréactionsdelaPCRterminées,l’amplificationestvérifiéeparélectrophorèsesurgeld’agarose(facultatif).

Conseilrapide:l'électrophorèsesurgeld’agarose,bienquerecommandée,n'estpas requisepourparfaitementexécuter leprotocoleHolotypeHLA. Lorsque lesampliconssontquantifiés(Étape3),touteconcentrationsupérieureà50ng/µlestconsidéréecommeuneamplificationréussie.L'électrophorèsesurgeld’agaroseestuneétapeimportantedecontrôledelaqualitéetnedoitpasêtreignoréeparunutilisateurquin'auraitpasuneexpériencesuffisanteduprotocoleHolotypeHLAentier.

ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar

MélangederéférenceHLA-A -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-B -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-C -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DRB1 -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DPB1 -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DQA1 -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DQB1Set3 -20°C Étape1Taqpolymérase -20°C QiagengADN 4°C UtilisateurH2Odequalitémoléculaire 20°C Utilisateur

Protocole2.1 –SortirleTaqpolymérasedesonlieudestockage,lecentrifugerbrièvement,puisl'ajouter

à chaquemélange de référence conformément aux tableaux ci-dessous, en rinçant lespointesdepipettesoigneusementàchaquepipetage:

MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1Réactif Volume/échantillon/locus Volume/24échantillons/locus

Mélangederéférencedel'étape1 19,6μl 499,9μlTaqpolymérase 0,4μl 10,2μlTotal 20μl 510,1μl

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MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-DQB1Set3

Réactif Volume/échantillon/locus Volume/24échantillons/locusMélangederéférencedel'étape1 19,2μl 489,7μlTaqpolymérase 0,8μl 20,4μlTotal 20μl 510,1μl

2.2 –Mélangerauvortexpuiscentrifugerbrièvementtouslesmélangesderéférencechargésen Taq polymérase. Aliquoter 20 μl de chaque mélange de référence chargé en TaqpolymérasedansdespuitsséparésdeplaquesdePCRà96puits.

Remarque:LesamplificationsdeclasseIetIIontétéoptimiséesàl'aidededeuxprogrammesdePCRdistincts.Parconséquent,lesmélangesderéférencedeclasseIetIInedoiventpasêtreplacésdanslamêmeplaque.

2.3 –Ajouter5μldechaqueéchantillond'ADNgénomiquediluédanslespuitscorrespondantsdesplaquespréparéesàl’étapeprécédente.Mélangerparpipetage.Scellerlespuitsavecdu film de scellage thermique et inspecter visuellement chaque puits. Centrifugerbrièvementtouteslesplaquesd’amplification.

2.4 –Placerlesplaquesd’amplificationdansdesthermocycleursetexécuterlesprogrammesd’amplificationdeclasseIetIIconformémentauxtableauxci-dessous:

AmplificationdeclasseI(HLA-A,BetC)

Nombredecycles Température Temps1 95°C 3minutes 95°C 15secondes

35 65°C 30secondes 68°C 5minutes1 68°C 10minutes1 4°C ∞

AmplificationdeclasseII(HLA-DRB1,DPB1,DQA1etDQB1)

Nombredecycles Température Temps1 95°C 3minutes 93°C 15secondes

35 60°C 30secondes 68°C 9minutes1 68°C 10minutes1 4°C ∞

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Remarque:Laréussitedel’amplificationpeutêtrevérifiéeenexécutant2μldechaqueampliconsurdugeld’agaroseà2%standard,à250Vpendant30minutes.(Facultatif)

TaillesattenduesdesampliconsLocusHLA Tailleattenduedesamplicons(kb)

HLA-A,BetC ~3HLA-DRB1 ~4,3HLA-DPB1 ~6,6HLA-DQA1 ~5,5

HLA-DQB1(Set3) ~6,5

Point d'arrêt sans altération. Les amplicons peuvent être stockés sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.

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Étape3–Quantificationetnormalisationdesamplicons(àl'aided'unfluoromètredeplaque)Durée:~35minutesLaquantificationetlanormalisationdesampliconssontrecommandéesafind'assureruneentréeprécisedans l'étapedepréparationdebanque(facultatif).LaconcentrationdesampliconsestmesuréeaveclesystèmeQuantiFluordsDNAquicontientunmarqueurfluorescentsefixantsurl’ADNetunétalonADNpermettantunequantificationprécisedepetitesquantitésd’ADNdoublebrin.(dsADN).Seréféreràl’annexe2pourdesinstructionsdequantificationdesampliconssurunappareilqPCR.

Conseilrapide:laquantificationdesamplicons,bienquerecommandée,n'estpasrequisepourparfaitementexécuterleprotocoleHolotypeHLA.Lanormalisationdes amplicons ne requiert pas une mesure précise de la concentration desamplicons. En guise d'alternative, une estimation de la concentration desampliconsfondéesurl'expérienceouuneélectrophorèsesurgeld’agarosepeutêtre utilisée. La quantification des amplicons ne doit pas être ignorée par unutilisateur qui n'aurait pas une solide expérience du protocole Holotype HLAentier.

ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar

Plaqued'amplificationdeclasseI 4°C Étape2Plaqued'amplificationdeclasseII 4°C Étape2ÉtalonADNLambda(100ng/μl) 4°C PromegaMarqueurcouleurQuantiFluordsDNA(200×) 4°C PromegaTamponTE20×(pH7,5) 4°C PromegaH2Odequalitémoléculaire 20à25°C UtilisateurExoSAP-iTExpress -20°C Affymetrix

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Protocole3.1 – Préparer des étalons d’ADNpar dilution sérielle de l’étalonADN LambdaQuantiFluor

(100ng/μl)fournidanslekitQuantiFlor,conformémentautableaudedilutionci-dessous:

Libellédutube ADNutilisé Volumed'ADN(μl) VolumeTE1x(μl) Conc.finale(ng/μl)Étalon1 ADNLambda 7,5μl 492,5μl 1,5ng/μlÉtalon2 Étalon1 250μl 250μl 0,75ng/μlÉtalon3 Étalon2 250μl 250μl 0,38ng/μlÉtalon4 Étalon3 250μl 250μl 0,19ng/μlÉtalon5 Étalon4 250μl 250μl 0,09ng/μlÉtalon6 Étalon5 250μl 250μl 0,05ng/μlVierge Vierge 0μl 250μl 0ng/μl

3.2 –Préparerlesplaquesdequantificationdesamplicons(voirlesfiguressupplémentaires).Aliquoter99μldetamponTE1xTEdanslespuitsd'uneplaqueoptiqueà96puitspourlenombretotald'ampliconsàquantifier.

3.3 –Ajouter1μldesampliconsdespuitscorrespondantsdesplaquesd'amplificationdanslespuitsindividuelsdesplaquesdequantificationdesamplicons.Mélangerparpipetage.

3.4 –Préparerunesolutiondetravailaveclemarqueurcouleur1×QuantiFluorDyeselonlaformulesuivante:0,5μldemarqueurcouleurQuantiFluorDye(200X)+99,5μldetamponTE 1×. Préparer une quantité suffisante de solution de travail demarqueur couleur 1×QuantiFluorDyedesortequechaqueéchantillon(totalitédeséchantillonsdanslesplaquesd'amplification)etchaqueétalon(14autotal)reçoiveunaliquotede100μl.

3.5 –Prépareruneplaquedequantificationdesétalonsetdesplaquesdequantificationdesamplicons.Aliquoter100μldesolutiondetravaildemarqueurcouleur1×QuantiFluorDyedans les puits de la plaque optique à 96 puits, qui sera la plaque de quantification desétalons,etdesplaquesdequantificationdesampliconspréparéesàl'étape3.2.

3.6 – Utiliser les étalons préparés ci-dessus et ajouter 100 μl de chaque étalon, en doubleexemplaire,danslespuitsindividuelsdelaplaquedequantificationdesétalons(14puitsautotal).Mélangerparpipetage.

3.7 –Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

3.8 –Effectuerunpassagedelaplaquedequantificationdesétalonsdanslefluoromètre,suivid'unpassagedesplaquesdequantificationd’amplicons.

3.9 – Calculer la concentration de l'ADN dans les plaques de quantification d’amplicons enutilisantlesdonnéesdeRFU(Relativefluorescenceunits,Unitésdefluorescencerelative)généréesparlefluoromètredeplaque.Pouruneassistanceenmatièredecalculs,seréféreràl'ongletDilutionduclasseurExcelfourni.

3.10 –Diluerl’ADNdanslesplaquesd’amplificationavecdel’eaudequalitémoléculairepourquelaconcentrationfinaledel’ADNsoitde67ng/μlenviron.

§ Silaconcentrationdel'ADNestégaleousupérieureà150ng/μl,ajouter25μld'eau.

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§ Silaconcentrationdel'ADNestcompriseentre100et150ng/μl,ajouter10μld'eau.§ Silaconcentrationdel'ADNestinférieureà100ng/µl,nepasajouterd'eau.

Regroupementdesamplicons3.11 – Regrouper tous les loci de chaque échantillon dans une seule plaque d'amplicons

regroupés. Combiner les volumes indiqués de chaque locus comme dans le tableau ci-dessouspourobtenirunvolumefinalde35µl:

LocusHLA VolumeregroupéA 5μlB 5μlC 5μl

DRB1 5μlDPB1 5μlDQA1 5μl

DQB1Set3 5μl

3.12 –Ajouter4μld'ExoSAP-iTExpressdanschaquebanqued'échantillons.Rincerlespointesdepipette après chaque pipetage. Sceller la plaque avec du film de scellage thermique etcentrifugerbrièvement.

3.13 –Placerlaplaqued'ampliconsregroupésdansunthermocycleuretexécuterleprogrammesuivant:

PurificationdesproduitsdePCRavecExoSAP-ITExpress

Nombredecycles Température Temps1 37°C 4minutes1 80°C 1minute1 4°C ∞

Point d'arrêt sans altération. Les amplicons peuvent être stockés sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.

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Étape4–PréparationdesbanquesDurée:~3heuresAu cours de cette étape, les amplicons regroupés sont préparés pour le séquençage sur leséquenceur IlluminaMiSeq.Lesampliconssont fragmentésparuneréactionenzymatique, lesextrémitéssontréparéesetadénylatées,etlesadaptateursindexéssontligaturésauxextrémités.Unemiseencommundesbanquesestensuiteeffectuée, suivied'un seulnettoyageetd'uneétapedeconcentrationàl'aidedebillesAMPureXP.

Remarque :Omixon recommandedes volumes plus importants que nécessairepour24échantillonscarbonnombred'enzymesetdetamponssontvisqueux,cequipeutentraîneruneperteexcessivelorsdupipetage.

ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar

Plaqued'ampliconsregroupés 4°C Étape3Enzymedefragmentation(A) -20°C OmixonTampondefragmentation(B) -20°C OmixonEnzymederéparationdesextrémités(C) -20°C OmixonTamponderéparationdesextrémités(D) -20°C OmixonEnzymedeligation(E) -20°C OmixonTampondeligation(F) -20°C OmixonPlaqued'adaptateurs -20°C OmixonBillesAMPureXP 4°C BeckmanCoulterÉthanolà80%(fraîchementpréparé) 20à25°C UtilisateurH2Odequalitémoléculaire 20à25°C Utilisateur

Protocole4.1 –Mettreenmarchelethermocycleur.Vérifierquelecouverclechauffantestencoursde

chauffe.

Remarque:Veilleràmélangervigoureusementauvortexl’enzymedefragmentation(A)avantutilisation.

4.2 –Préparerlemélangederéférencedefragmentationconformémentautableauci-dessous:

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Mélangederéférencedefragmentation

Réactif Volumeparbanque(μl)

Volumesrecommandéspour24banques(µl) Codecouleur

Enzymedefragmentation(A) 2μl 55,2μl JauneTampondefragmentation(B) 2μl 55,2μl RougeVolumetotal 4μl 110,4μl

4.3 –Prépareruneplaquederéactifs:placerunenouvelleplaquepourPCRà96puitssurunportoirderefroidissementdePCRetaliquoterunequantitéégaledemélangederéférencedefragmentationdanschaquepuitsd'uneseulecolonne.

Remarque:Laréactiondefragmentationaétéconçuedesortequel’ADNobtenusoitdelatailleidéalepourleséquençagesurlesystèmeIlluminaMiSeq.Ilestimportantdemaintenirlesréactifsaufraisjusqu’audémarragedelaréactiondanslethermocycleurafind'éviterune fragmentationexcessive. Il est recommandéd’utiliserdespipettesmulticanalpourminimiserlerisquedefragmentationexcessive.

4.4 –Centrifugerlaplaqued'ampliconsregroupéspendant10secondes,puisplacez-lasurdelaglaceouuncryopack.

4.5 –Prépareruneplaquederéactions:placerunenouvelleplaquedePCRà96puitssurunportoirderefroidissementdePCR.

4.6 –Ajouter4μldemélangederéférencedefragmentationdelaplaquederéactifsdanslespuitsdelaplaquederéactions,correspondantauxéchantillonsdelaplaqued'ampliconsregroupés.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.

4.7 –Transférer16μldechaqueamplicondelaplaqued'ampliconsregroupésdanslespuitscorrespondantsdelaplaquederéactionsàl'aided'unepipettemulticanal.Mélangerparpipetage.

4.8 –Scellerlaplaquederéactionsavecdufilmdescellagethermiqueetcentrifugerpendant10secondes.

4.9 –Incuberlaplaquederéactionsdansunthermocycleuravecleprogrammesuivant:

Programmedefragmentation

Nombredecycles Température Temps1 37°C 10minutes1 70°C 15minutes1 4°C ∞

Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.

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4.10 –Préparerlemélangederéférencederéparationdesextrémitésconformémentautableauci-dessous:

Mélangederéférencederéparationdesextrémités

Réactif Volumeparbanque(μl)

Volumesrecommandéspour24banques(µl) Codecouleur

H2Odequalitémoléculaire 1,25μl 34,8μl Enzymederéparationdesextrémités(C) 1,25μl 34,8μl VertTamponderéparationdesextrémités(D) 2,5μl 69,6μl OrangeVolumetotal 5μl 139,2μl

4.11 –Aliquoterunequantitéégaledemélangederéférencedansuneseulecolonnevidedelaplaquederéactifs.

4.12 – Centrifuger la plaque de réactions (contenant les échantillons fragmentés) pendant10 secondes. Ajouter 5 μl demélange de référence de réparation des extrémités de laplaquederéactifsdanschaquepuitsdelaplaquederéactions.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.Mélangerparpipetage.

4.13 –Scellerlaplaquederéactionsavecdufilmdescellagethermiqueetcentrifugerpendant10secondes.

4.14 –Incuberlaplaquederéactionsdansunthermocycleuravecleprogrammesuivant:

Programmederéparationdesextrémités

Nombredecycles Température Temps1 20°C 30minutes1 70°C 5minutes1 4°C ∞

Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.

4.15 –Sortir laplaqued'adaptateurs indexésdeson lieudestockageet la laisserdécongeleràtempératureambianteaprèsledémarrageduprogrammederéparationdesextrémitésdans le thermocycleur. Lorsque la plaque d'aptateurs est à température ambiante, lacentrifugerpendant3minutesà3000tr/min.

4.16 –Retirerdélicatementlefilmdescellagedelaplaqued'adaptateurs.Aprèsleretraitdufilmdescellage,nepasagiterlaplaqued'adaptateursafind’évitertoutrisquedecontaminationcroisée.

4.17 –Transférerlevolumecompletdechaquepuitsdepuislaplaquederéactions(25μl)verslespuitscorrespondantsdelaplaqued'adaptateurs.

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Remarque : Si la totalité de la plaqued'adaptateurs ne sera PASutilisée, il estpossibled’utiliseruniquementlenombrenécessaired'adaptateurs.Couperlefilmde scellage de la plaque entre les puits à utiliser et les puits à garder. Retirerdélicatementlefilmdescellagedelaplaqued'adaptateurs,laissantlefilmenplaceau-dessusdespuitsàgarder.

a. Transférer25μldechaqueéchantillondelaplaquederéactionsversunpuitsnon utilisé de la plaque d'adaptateurs, en mélangeant bien à l’aide d’unepipette.

b. Transférerlatotalitédechaqueéchantillondelaplaqued'adaptateursverslepuitsoriginaldelaplaquederéactions.

c. Scellerdenouveaulaplaqued'adaptateursetlaremettreaucongélateur(-20°C).Utiliserlaplaquederéactionsaulieudelaplaqued'adaptateurspourlesétapesrestantesdécritesdanslemanuel.

4.18 – Préparer lemélange de référence de ligation. Préparer suffisamment demélange deréférencedeligationpourchaqueéchantillon.

Mélangederéférencedeligation

Réactif Volume(μl) Volumesrecommandéspour24banques(µl) Codecouleur

Enzymedeligation(E) 2,5μl 63,2μl BleuTampondeligation(F) 30μl 757,5μl NoirVolumetotal 32,5 820,7μl

4.19 –Aliquoterlemélangederéférencedeligationdansunecolonneinutiliséedelaplaquedesréactifs.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.

4.20 –Ajouter32,5μldemélangederéférencedeligationdanschaquepuitsdelaplaquederéactions.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.Mélangerparpipetage.

4.21 –Scellerlaplaquederéactionsavecdufilmdescellagethermiqueetcentrifugerpendant10secondes.

4.22 –Incuberlaplaquederéactionsdanslethermocycleuravecleprogrammesuivant:

Programmedeligation

Nombredecycles Température Temps1 25°C 10minutes1 70°C 10minutes1 4°C ∞

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Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.

Regroupementetpurificationdesbanques4.23 –LaisserlesbillesAMPureXPatteindrelatempératureambiante.Veilleràcequ'ellessoient

homogènes(dénuéesd'amasoudegrappes).Préparer5mld'éthanolà80%fraîchementpréparé(4mlEtOH+1mlH2O).

4.24 –Créerlabanqueencombinantunaliquotedechaqueampliconregroupé(unebanqueparéchantillonspécifique)dansunseultubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede2,0ml.

I. Pour16échantillonsouplus–Calculerlaquantitédechaquebanqued'échantillonsàmettreencommunpourobteniruneseulebanqued'unvolumetotalde900μl.Diviser900µlparlenombredebanquesd'échantillons.Lerésultatestlevolumedel'aliquoteàpréleverde chaquebanqued'échantillonset àpipeterdans labanquefinale.

II. Pourmoinsde16échantillons–Transférer60μldechaquebanqued'échantillonsdansunebanque.

4.25 –Ajouter900μldebillesAMPureXPdans letubede labanque,maisnepastoucher labanqueaveclapointedelapipette.Mélangervigoureusementauvortex,puiscentrifugerbrièvement.Veilleràcequelesbillesneseséparentpas.Laisserincuberlabanquependant10minutesàtempératureambiante.

Remarque :Si le volumede la banque finale est inférieur à 900μl, ajouter unvolumeéquivalentdebillesAMPureXP.Lerapportentrelabanquefinaleetlesbillesdoitêtrede1:1.

4.26 –Placerletubedelabanquefinalesurlesupportmagnétiqueetlaisserincuberpendant10minutes.

4.27 –Touten laissant le tubesur lesupportmagnétique, retirerdélicatementetéliminer lesurnageantdutubedelabanque,sanstoucherlesbilles.

4.28 –Toutenlaissantletubesurlesupportmagnétique,ajouter1,5à2mld'éthanolà80%fraîchement préparé dans le tube de la banque. Le volume d’éthanol ajouté doit êtresuffisantpourrecouvrirlesbilles.

Remarque:Appliquerl’éthanolsurlecôtédutubedénuédebilles.

4.29 – Laisser incuber la banque à température ambiante pendant 30 secondes, puis retirerdélicatementlesurnageantetl'éliminer.

4.30 –Répéterlesétapes4.28et4.29.

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4.31 –Centrifugerrapidementletubedelabanque,puisleremettresurlesupportmagnétiqueenlelaissantouvert.Retirerl’éthanolrésiduelàl’aided’unepipettesanstoucherlesbilles.

Remarque:S'assurerqueleculotdebillesnecontientpasd’éthanolrésiduel.Ilpeuts'avérernécessairedefairepivoterletubesurlesupportmagnétiquepourenleverl’éthanolsansperturberleculotdebilles.

4.32 –Laisser sécher lesbillesà l’air librependant5à8minutessur le supportmagnétique,jusqu’àcequeleculotdebillessoitsec.

4.33 –Retirerletubedelabanquedusupportmagnétiqueetéluerlabanqueenversant31μld’eaudequalitémoléculaire.Lapointedelapipettenedoitpastoucherlesbillescarcelles-cirisqueraientd’yadhérer.

4.34 –Mélangerlabanqueauvortexpourremettrelesbillesensuspension.Siquelquesgouttesrestentsurlesparoislatérales,centrifugerbrièvement.Veilleràcequelesbillesrestentensuspension.

4.35 –Incuberlabanqueàtempératureambiantependant2minutes.

4.36 –Placerletubedelabanquesurlesupportmagnétiquependant2minutes.

4.37 –Collecterlabanque:toutenmaintenantlabanquefinaledanslesupportmagnétique,collecter31μldusurnageantdansunnouveautubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.

Pointd'arrêtsansaltération.Lesbanquespeuventêtrestockéessansrisqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.

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Étape5–SélectiondelatailledesfragmentsdelabanqueDurée:~1heureL'étape5consisteàutiliserlabanquecollectéeàl'étape4poureffectuerunesélectiondetailledes fragments qu'elle contient à l'aide du sélecteur automatisé Pippin Prep. Le Pippin Prepsélectionneautomatiquementuneplagedetaillesdesfragmentsd'ADNetprocèdeàleurélutiondansunechambredecollecte.Remarque:UnsélecteurautomatiséBluePippinpeutêtreutiliséàlaplaceduPippinPrep.Seréféreràl'annexe1pourdesinstructionsd’utilisationdusélecteurautomatiséPippinPrep.

ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar

Cassettedegeld'agaroseà1,5%,sanscolorant 20à25°C SageScienceMélangedemarqueur/solutiondechargePippin(libelléK) 4°C SageScienceBanqueregroupée 4°C Étape4

Remarque:LePippinPreputilisedumarqueurK,tandisqueleBluePippinutilisedumarqueurR2.

Protocole5.1 –LaisserlasolutiondechargedemarqueurKatteindrelatempératureambiante.

5.2 –Combiner31μlduregroupementavec10μldesolutiondechargedemarqueurK.

5.3 –Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

5.4 –ConfigurerlePippinPreppourunecollectedesfragmentsd'ADNcomprisentre650et1300pb.Chargerl'échantillonde40µlsurleportd'accèsdeséchantillonsetl'exécuter.Letempsd'exécutionestde45à50minutes.

5.5 –Collectertoutlecontenu(approximativement40μl)danslachambredecollecteduPippinPrepetletransférerdansunnouveautubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.Lecontenuestlabanquedetaillessélectionnées.

Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.

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Étape6–Quantificationdelabanqueaumoyendel'appareilqPCRDurée:~1heure15minutesIlestnécessairedequantifierlabanquedetaillessélectionnéesafind’obtenirunrésultatoptimalsur leséquenceur IlluminaMiSeq.L'appareilqPCRpermetd’enmesurer laconcentrationavecprécision.Pourmesurerlaconcentrationdelabanque,vouspouvezégalementutiliserlekitQubitdsDNABRetunfluoromètreQubit.Poursuivreceprotocole,consultezl'annexe3.

ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar

Prémélanged'amorcesIllumina10× -20°C KAPABiosystemsMélangederéférenceKAPASYBRFASTqPCR2× -20°C KAPABiosystemsStd1(20,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0,20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0,02pM) -20°C KAPABiosystemsÉtalonsADNIllumina -20°C KAPABiosystemsH2Odequalitémoléculaire 20à25°C UtilisateurTamponTE1×(pH8,0) 20à25°C UtilisateurBanquedetaillessélectionnées 4°C Étape5

Protocole1 –Préparerlemélanged'amorcesqPCRàl'aideduprémélanged'amorcesIllumina10×etdu

mélangederéférenceKAPASYBRFASTqPCR2×:

Remarque:LesréactifsdukitKAPASYBRFASTqPCR(mélangederéférenceqPCR,prémélange d'amorces et solutions ROX) sont combinés lors de la premièreutilisation du kit. Ce combiné est stable pendant unminimumde 30 cycles decongélation/décongélation.SuivezladocumentationKAPApourdéterminersi lasolutionROXestrecommandéepourvotreappareildeqPCR.

Mélanged'amorcesqPCR

Réactif Volume(ml)Prémélanged'amorcesIllumina10× 1mlMélangederéférenceKAPASYBRFASTqPCR2× 5mlVolumetotal 6ml

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2 –PréparerlemélangederéférenceqPCR.

MélangederéférenceqPCR

Réactif Volume(μl)Mélanged'amorcesqPCR 228μlH2Odequalitémoléculaire 76μlVolumetotal 304μl

3 –Préparerunedilutionsérielledelabanquedetaillessélectionnées.

a. Préparerunedilutionà1:1000enajoutant1μldebanquedetaillessélectionnéesà999μldetamponTE1×(pH8,0),enrinçantsoigneusementlapointedelapipette.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

b. Préparerunedilutionà1:2000enajoutant100μldeladilutionà1:1000à100μldetamponTE1×(pH8,0).Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

4 –PrépareruneplaquedequantificationqPCRdansunenouvelleplaquePCRcompatibleavecvotresystèmeqPCR.

5 –Aliquoter16μldumélangederéférenceqPCRentripleexemplairepourlesétalons1à4,ladilutionà1:1000etladilutionà1:2000(voirlesfigurescomplémentaires).

6 –Aliquoter4μldesétalons1à4,ladilutionà1:1000etladilutionà1:2000danslespuitscorrespondants.

7 – Couvrir hermétiquement la plaque de quantification qPCR et la centrifuger pendant10secondes.

Remarque:ÉviterlaformationdebullesdanslespuitsdelaplaquedequantificationqPCR.Lecaséchéant,centrifugercommenécessairepouréliminerlesbulles.

8 –Définir lestriplesdilutionsà1:1000et1:2000commeéchantillonsciblés,etdéfinir lesétalons(points:4,concentrationinitiale:20pM,dilution:1:10).Exécuterleprogrammesuivantsurl'appareilqPCRdefaçonàdéterminerlaconcentrationenADNdelabanquedetaillessélectionnées:

Nombredecycles Température Temps1 95°C 5minutes25

(pasdecourbedefluidité)95°C 30secondes60°C 90secondes(acquisitiondesdonnées)

9 –PourconvertirlerésultatqPCRdeconcentrationdepMànM,entrerlesrésultatsdelamoyenne quantitative des deux réplicats de banque dans l'onglet du classeur Omixonintitulé«Quantificationdesbanques».

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10 – À partir des volumes indiqués dans le classeur, diluer 10 μl de la banque de taillessélectionnéesàuneconcentrationde2nMavecdel'eaustériledansunnouveautubedemicrocentrifugationà liaison faiblede1,5ml.Stocker labanquede tailles sélectionnéesrestanteà-20°C.

Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.Encasdestockageàlongterme,unenouvellequantificationestrecommandéeavantutilisationsurleséquenceurMiSeq.

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Étape7–SéquençagesurlesystèmeIlluminaMiSeqDurée:~24heuresLesystèmeIlluminaMiSeqestuninstrumentautomatisédeNGSquipeutséquencerlabanquede tailles sélectionnées préparée au cours des étapes précédentes. Un démultiplexage deséchantillonsindexésesteffectuéautomatiquementautermedel'exécutionduséquençage.

Conseil rapide : vous pouvez utiliser un contrôle PhiX à 1 % comme contrôlesupplémentairedelaréactiondeséquençage.Pouruncomplémentd'informationsurlecontrôlePhiX,consultezladocumentationIllumina.

ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar

Cassettederéactif -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaCellulededébitMiSeq 4°C IlluminaBanqueà2nM 4°C Étape6NaOH1Nou2N 20à25°C UtilisateurH2Odequalitémoléculaire 20à25°C Utilisateur

CapacitédukitderéactifsMiSeq

KitderéactifsIlluminaMiSeq

TempsHeures

Échantillons24/7

Std500Cycle(MS-102-2003) ~39 24

Std300Cycle(MS-102-2002) ~24 24

Micro300Cycle(MS-103-1002) ~19 24

Nano500Cycle(MS-103-1003) ~28 12

Nano300Cycle(MS-103-1001) ~17 6

Protocole7.1 –PréparerleséquenceurMiSeqconformémentauxprotocolesstandardsIllumina.

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7.2 –Préparerunebanquedénaturéeà1nM:Combiner10μldeNaOHà0,2Nfraîchementpréparéavec10μldebanquedetaillessélectionnéesdiluéeà2nMdansunnouveautubede microcentrifugation à liaison faible de 1,5 ml. Mélanger au vortex et centrifugerbrièvement. Incuber cette banque dénaturée à 1 nM à température ambiante pendant5minutes.

7.3 –Préparerunebanquedénaturéeà20pM:Ajouter980µldeHT1réfrigéréaux20µldelabanquedénaturéeà1nM.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

7.4 –Préparerunebanquedénaturéeà9pM:Ajouter550µldeHT1réfrigéréet450µldelabanquedénaturéeà20pMdansunnouveautubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

7.5 –Transférer600μldelabanquedénaturéeà9pMdansleréservoirdeséchantillonsdechargedelacassettederéactifsMiSeq.

Conseilrapide:ilestsuggéréd'utiliserleclasseurfournipourcréerlafiched'échantillonrequiseparlesystèmeMiSeq.

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Étape8–AnalysedesdonnéesdeséquençageHLALeséquenceurIlluminaMiSeqvatraiterlabanqueregroupéeà9pMetgénérerdesdonnéesdeséquençagesouslaformedefichiers.fastq.Veuillez-vousréféreraumanuelHLATwinpouruneassistance à l'installation correcte du logiciel HLA Twin et des informations en matièred'interprétation de l'analyse du génotypage de vos données de séquençage. Pour lamise enœuvreduprotocoleautomatiséetpourtoutproblèmerelatifàl'installationouàl'analysedesdonnées,[email protected].

Protocoleautomatisé

Paramétrageetconfigurationinformatique1. InstallezlelogicielHLATwinServersurleserveur.

§ Installez le logiciel HLA Twin Client sur un ordinateur client (plusieurs clients HLA Twinpeuventseconnecterauserveur).

§ Contactez l'assistance Omixon ([email protected]) pour obtenir des instructionsd'installationpersonnaliséedel'automatisation.

Protocoleparanalyse1. LancerlelogicielHLATwinClientetseconnecter.

2. Lesdonnéesontdéjàététraitéesousontencoursdetraitement.Examinerlesrésultatsàl'aidedusystèmeTrafficLightdansHLATwin.

3. Exporterlesrésultatsdugénotypageet/oulesséquencesconsensus,selonlesbesoins.

ProtocolemanuelServeur

Paramétrageetconfigurationinformatique§ InstallezlelogicielHLATwinServersurleserveur.§ InstallerlelogicielHLATwinClientsurunordinateurclient.

Protocoleparanalyse§ LancerlelogicielHLATwinClientetseconnecter.§ Sélectionner les donnéesMiSeq au format fastq ou fastq.gz et démarrer l'exécution du

typageHolotypeHLA.§ UnefoisletypageHolotypeHLAterminé,examinerlesrésultatsàl'aidedusystèmeTraffic

LightdansHLATwin.§ Exporterlesrésultatsdugénotypageet/oulesséquencesconsensus,selonlesbesoins.

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ProtocolemanuelBureau

Paramétrageetconfigurationinformatique§ InstallerlelogicielHLATwinDesktop.

Protocoleparanalyse6 LancerlelogicielHLATwinetseconnecter.

7 Sélectionner les donnéesMiSeq au format fastq ou fastq.gz et démarrer l'exécution dutypageHolotypeHLA.

8 UnefoisletypageHolotypeHLAterminé,examinerlesrésultatsàl'aidedusystèmeTrafficLightdansHLATwin.

9 Exporterlesrésultatsdugénotypageet/oulesséquencesconsensus,selonlesbesoins.

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Figuressupplémentaires

Exemples de plaques d'amplicons, d'amplification, de dilution, dequantificationdesamplicons(pourunlocusindividuel)etderéactions

Exempledeplaquedequantificationdesétalons

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ExempledeplaqueqPCRdequantificationdesbanquesKAPA

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Annexe1:SélecteurautomatiséPippinPrep

ProgrammationduPippinPrep1. Cliquez sur l'onglet Protocol Editor (Éditeur de protocole), puis sur le bouton « New »

(Nouveau).

2. Cliquezsurl'icônededossierenregardduchampCassetteetsélectionnez«1.5%DFMarkerK » (Marqueur K 1,5 % sans colorant) pour le Pippin Prep ou « 1.5%DF Marker R2 »(MarqueurR21,5%sanscolorant)pourleBluePippin.

3. Danslabandequevousprogrammez:

a. Mettezensurbrillancelechamp«Range»(Plage).b. Réglez«RefLane» (Bandede référence)pourétablirunecorrespondanceavec le

numérodelabandedanslaquellevoustravaillez.c. Réglezlechamp«Start*»(Début)sur650.d. Réglezlechamp«End*»(Fin)sur1300.

4. DanslechampReferenceLane(Bandederéférence),sélectionnezlabandedanslaquellevoustravaillez.

5. Cliquezsurlebouton«SaveAs»(Enregistrersous)etnommezvotreprogramme.

UtilisationdusélecteurautomatiséPippinPrep1. MettezenmarchelePippinPrepenappuyantsurleboutond'alimentationàl'arrièrede

l'appareil.

2. InspectezvisuellementlePippinPrep.Vérifiezqueles5témoinslumineuxDELsontallumésetquel'intérieurdel'appareilestpropreetsec.

3. CliquezsurlelogoSageSciencesituéaucoininférieurdroitdel'écran.Lafenêtrequis'ouvrevouspermetdesaisirunmotdepasse.Lemotdepassed'usinepardéfautest«pips».

4. Cliquezsurl'ongletFactorySetup(Paramétraged'usine)etvérifiezquelavaleurBase-to-Threshold(BaseàSeuil)estrégléesur0,02.

5. Placezl'outild'étalonnageàl'intérieurduPippinPrep,enveillantàcequelabandefoncéesoitorientéeverslebasetplacéeau-dessusdestémoinslumineuxDEL.

6. Dansl'ongletMain(Principal),cliquezsurlebouton«Calibration»(Étalonnage).

7. DanslafenêtreCalibration(Étalonnage),vérifiezquelechamp«TargetIpHmA»(mApHCibleI)estréglésur0,80(0,60surleBluePippin),puisappuyezsurlebouton«Calibrate»(Étalonner).

8. Accédez à l'onglet Protocols (Protocoles). Cliquez sur le bouton « Load » (Charger) etsélectionnezleprogrammeHolotypeHLAainsiquelabandequevousallezutiliser.Vérifiezlespointssuivants:

a. Labandeadéquateestactivée.

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b. Letémoindesélectiond'unlargespectreestactivé.c. Labandederéférenceestlamêmequelabandequiseraexécutée.

9. Accédezàl'ongletMain(Principal).Vérifiezlespointssuivants:

a. Leprogrammequevousavezchargéestceluiquiestsélectionné.b. Labandederéférenceappropriéeestsélectionnéeetc'estaussilabandedanslaquelle

l'échantillonseraexécuté.

10. Inspectez la cassette. Avant d'enlever le film de scellage des puits, vérifiez la présenceéventuelledebullesderrière l'accèsde lachambred'élution.Lecaséchéant, tapotezetbalancezlégèrementlacassetteentrevosmainspouréliminerlesbulles.

11. Placezlacassette,puitstoujoursscellés,àl'intérieurduPippinPrep.

12. Retirezdélicatementlefilmdescellage,enprenantsoindeleretirerdepuislecôtéinutilisédelacassette(bande5)verslecôtéutilisé(bande1).Veillezàévitertouteéclaboussuredeliquideunefoislefilmretirépouréviteruneéventuellecontamination.

13. Retirezlevolumeentierdetamponduportd'accèsàlachambred'élutiondelabandequevousallezutiliseretajoutez40µldetampond'électrophorèsefraisdansceportd'accès.

14. Recouvrezlesportsd'accèsd'unefinebandedescellage.

15. Touslesréservoirspleinsàmoinsdes3/4deleurvolumedoiventêtrecomplétésavecdutampond'électrophorèse.Néanmoins, lespuitsnedoiventpasdéborder ! Leniveaudutampondoitjusteatteindreleplastiquedupuitspournepasdéborderlorsduglissementducouvercle.Complétezletampondepuislespuitsinutilisés(bande5)verslespuitsutilisés(bande1).

16. Vérifiez que chacun des puits de charge (puits contenant de l'agarose) sont remplis detampond'électrophorèse.Letampondoitjusterecouvrirl'agaroseetprésenterunesurfaceparfaitementplane.

17. Fermez lentement lePippinPrep,enveillantàéviter toutcontactentre le tamponet lecouverclelorsquevousfermezl'appareil.

18. Effectuezletestdecontinuité.Ilarriveparfois, lorsquelescapteurssèchentlégèrement,queletestéchoueaupremieressai.Lecaséchéant,effectuezletestunesecondefois.Unefoisletestdecontinuitéterminé,ouvrezlentementlePippinPrep.Vérifiezquelecouvercledel'appareilnefaitpascoulerleliquidedanslacassette.

19. Mélangez la solution de charge demarqueur K au vortex et centrifugez-la brièvement.Ajoutez10µldecettesolutionaux~30μldelabanque.

20. Mélangezlabanqueauvortexetcentrifugez-labrièvement.

21. Retirez40µldetampondupuitsd'échantillonquevousallezutiliser.

22. Ajoutez~40μldelabanquechargéeenmarqueurKaupuitsd'échantillonquevousallezutiliser.

23. Marquezlabandequevousutilisezeninscrivantlesinitialesdutechnicienetladate.

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24. FermezlePippinPrepetcliquezsurlebouton«Start»(Démarrer).Vérifiezquelabandeappropriéeaétéactivée.L'exécutiondel'échantillondoitdurer45minutesenviron.

25. Une fois l'exécution terminée, ouvrez prudemment le Pippin Prep. Veillez à ce que lecouverclenefassepascoulerdeliquidedanslacassette.

26. Retirez la bande de scellage des ports d'accès à la chambre d'élution, en évitantsoigneusementtoutécoulementdeliquide.

27. Transférezlevolumeentierduportd'accèsàlachambred'élutiondansuntubeàliaisonfaiblede1,5ml.

28. Recouvrez tous lespuitsouvertsà l'aided'undouble filmdescellagedeplaque.Pensezàlaisserunelanguettedefilmducôtéinutilisé,cequifaciliteraleretraitdufilmdescellagedepuislecôtéinutiliséverslecôtéutilisé.

29. Placezlacassettescelléedanssapocheetmettez-ladecôté.

30. Prenezlacassettedelavageetremplissez-lad'eauMiliQ.RefermezdoucementlecouvercleduPippinPrep,enprenant soind'éviter toutécoulementde liquidedans lacassettedelavage.

32. LaissezlePippinPrepfermépendantplusieurssecondes.

33. Ensuite,ouvrez-leenprenantsoind'évitertoutécoulementdeliquidedanslacassettedelavage.

34. Retirezlacassettedelavage,videzsoncontenueneauetlaissez-lasécher.

35. Essuyeztoutetraced'eaudanslePippinPrepetfermezdoucementcedernier.

36. Sélectionnezlebouton«ShutDown»(Fermer)danslemenuPippinPrep.

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Annexe2:Quantificationdesampliconsaumoyend'unappareilqPCRDurée:35minutes

ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar

TamponTE20×(pH7,5) 4°C PromegaÉtalonADNLambda(100ng/μl) 4°C Promega200×marqueurcouleurQuantiFluordsDNA 4°C PromegaH2Ostérile 20à25°C UtilisateurPlaque(s)d'amplificationdeclasseI 4°C Étape2Plaque(s)d'amplificationdeclasseII 4°C Étape2

Protocole1. Créerunedilutionsérielleenutilisantdestubesdemicrocentrifugationde1,5mletl'étalon

QuantiFluorLambdaDNA(100ng/μl).Appliquerlatablededilutionci-dessous:

Libellédutube ADNutilisé Volumed'ADN(μl)

VolumeTE1x(μl)

Conc.finale(ng/μl)

Étalon1 ADNLambda 7,5μl 492,5μl 1,5ng/μlÉtalon2 Étalon1 250μl 250μl 0,75ng/μlÉtalon3 Étalon2 250μl 250μl 0,38ng/μlÉtalon4 Étalon3 250μl 250μl 0,19ng/μlÉtalon5 Étalon4 250μl 250μl 0,09ng/μlÉtalon6 Étalon5 250μl 250μl 0,05ng/μlStandard7,vierge Vierge 0μl 250μl 0ng/μl

2. Préparer les plaques de quantification des amplicons (voir les figures supplémentaires).Aliquoter49,5μldetamponTE1xdanslespuitsd'unenouvelleplaqueà96puitspourlenombretotald'ampliconsàquantifier.

3. Ajouter0,5μld'ampliconsdespuitscorrespondantsdesplaquesd'amplificationdanslespuitsindividuelsdesplaquesdequantificationdesamplicons.Mélangerparpipetage.

4. Préparer une solution de travail demarqueur couleur QuantiFluor 1× selon la formulesuivante :0,25μldemarqueurcouleurQuantiFluor (200X)+49,75μlde tamponTE1×.PréparerunequantitésuffisantedesolutiondetravaildemarqueurcouleurQuantiFluor1×desortequechaqueéchantillon(pourletotaldeséchantillonsdesplaquesd'amplification)etchaqueétalon(14autotal)reçoiveunaliquotede50µl.

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5. Préparer une plaquede quantification des étalons et des plaques de quantification desamplicons.Aliquoter50μldesolutiondetravaildemarqueurcouleurQuantiFluor1×danslespuitsdesplaquesoptiquesà96puitsselonleformatdelaplaquedequantificationdesétalonsetdesplaquesdequantificationdesamplicons(voirlesfiguressupplémentaires).

6. À partir des étalons préparés ci-dessus, ajouter 50 µl de chaque étalon, en doubleexemplaire,danslespuitsindividuelsdelaplaquedequantificationdesétalons(14puitsautotal).

7. Mélangerintégralementauvortexetcentrifugerbrièvement.

8. Placerchaqueplaquedequantificationuneparunedansl'appareildeqPCRetexécuterleprogrammesuivant:

Nombredecycles Température Temps1 25°C 10secondes 25°C 15secondes2 25°C 30secondes(acquisitiondesdonnées)

9. Calculerlaconcentrationdel'ADNdanslesplaquesdequantificationdesampliconsàpartirdesdonnéesbrutesdesunitésde fluorescence relative (RFU)généréespar l'appareildeqPCR.

10. Diluer l'ADN dans les plaques d'amplification avec de l'eau stérile de sorte que laconcentrationfinaledel'ADNsoitde67ng/µlenviron.

§ Silaconcentrationdel'ADNestégaleousupérieureà150ng/μl,ajouter25μld'eau.§ Silaconcentrationdel'ADNestcompriseentre100et150ng/μl,ajouter10μld'eau.§ Silaconcentrationdel'ADNestinférieureà100ng/μl:nepasajouterd'eau.

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Annexe3:Quantificationd'unebanqueutilisantunmarqueurcouleurfluorescentdsDNAintercalaireDurée:~15minutesLa concentration de la banque de tailles sélectionnées peut êtremesurée avec précision enintercalantunmarqueurcouleurfluorescentdsDNAtelquelevertSYBRouunéquivalent.Leskitset instrumentsàcette findisponiblesdans lecommerce incluent,sanstoutefoiss'y limiter, lefluoromètre Qubit de Thermo Fisher (qui utilise le kit de test Qubit Broad-Range dsDNA), lefluoromètreQantusdePromega(quiutiliselemarqueurcouleurfluorescentQuantifluordsDNA).LaméthodeQubitestdécrite icicarelleest lapluscommunémentutilisée.Sivousutilisezunautrekitetunautreinstrument,suivezlesinstructionshabituellesdufabricant.

Remarque:Cetteméthodedefluorométrieestunmoyenrapidemaisprécisdedéterminer la concentration de la banque de tailles sélectionnées finale. EllepermetdemesurerlatotalitédudsADNprésentdanslabanque.

ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar

KitdetestQubitdsDNABR températureambiante ThermoFisherÉtalonsQubitdsDNABR 4°C ThermoFisherBanquedetaillessélectionnées 4°C Étape5

Protocole6.1 – Laisser les étalons Qubit atteindre la température ambiante. Préparer des tubes à

essaiQubit(500μl,paroimince)pourlabanqueendoubleexemplaireetlesdeuxétalons.Mélangerauvortexetcentrifugerlesétalonsetlabanque.

6.2 –Ajouter995μldetamponet5μldemarqueurcouleurdansuntubedecentrifugationde1,5ml.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

6.3 –Transférer190μldumélangederéactifsdanslestubesQubitdesdeuxétalons.Transférer198μldumélangederéactifsdanslestubesQubitdesdeuxexemplairesdelabanque.

6.4 – Ajouter 10 μl de l'étalon 1 dans le tube Qubit correspondant etmélanger au vortexpendant2secondes.Procéderdelamêmefaçonavecl'étalon2.

6.5 –Ajouter2μldelabanquedanslesdeuxtubesQubitcorrespondantsetmélangerauvortexpendant2secondes.

6.6 –IncuberlestubesQubitàtempératureambiantependant2minutes.

6.7 –Mettreenmarchel'appareilQubitetchoisirunprotocoleBR.

6.8 –PlacerletubeQubitd'étalon1dansl'appareil,puisappuyersurGO.Procéderdelamêmefaçonavecl'étalon2.

Page 49: H HLA™ C A1 CE/A2 CE/A3 CE/A4 CE M V - Amazon …CE...V1 05/12/2015 Robert Pollock Première version, ébauche Gergely Tölgyesi 05/12/2015 V2 18/01/2016 Robert Pollock Deuxième

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6.9 –Placer letubedelabanquedansl'appareilQubit,puisappuyersurGO.Procéderdelamêmefaçonaveclesecondexemplaire.

6.10 –PourconvertirlerésultatQubitdeconcentrationdeng/μLànM,entrerlesrésultatsdeconcentrationmoyennedesdeuxexemplairesdebanquedansl'ongletduclasseurOmixonintitulé«Quantificationdesbanques».

6.11 –ÀpartirdesrésultatsdelamesureQubit,diluer10μldelabanquedetaillessélectionnéesà une concentration de 2 nM avec de l'eau stérile dans un nouveau tube de micro-centrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.Stockerlabanquedetaillessélectionnéesrestanteà-20°C.

Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.Encasdestockageàlongterme,unenouvellequantificationestrecommandéeavantutilisationsurleséquenceurMiSeq.