HAPLOĪDU AUGU IEGŪŠANA IN VITRO POLIPLOIDIZĀCIJA IN VITRO

2005. gada 21. aprīlī11. lekcija

HAPLOĪDU AUGU IEGŪŠANA

IN VITRO

POLIPLOIDIZĀCIJA IN VITRO


11.1. Haploīdu augu iegūšana in vitro

Haploīdus augus, t.i., augus ar pusi no taksonam raksturīgā hromosomu

komplekta, var iegūt no ģeneratīvajām šūnām – vēl nenobriedušiem putekšņiem,

putekšnīcas, olšūnas un ovārija.


Haploīdu augu iegūšanai ir liela nozīme ģenētikā un selekcijā,

jo no haploīdiem ir vieglāk izdalīt un atlasīt vērtīgas mutācijas,

bet ar kolhicīna palīdzību var iegūt pilnībā

homozigotus diploīdus augus.


Izolējot olšūnas vai putekšņus ar ieprogrammētu gametu

izveidošanu, audu kultūrās tie pārslēdzās uz

tādiem procesiem, kas raksturīgi somatiskajām šūnām.


11.1.1. Putekšņu un putekšnīcu kultūras

Pirmo reizi par haploīdu audu iegūšanu no putekšnīcām ar sekojošu haploīdu audu

reģenerāciju ziņoja Guha un Maheshwari 1964.gadā ar Datura innoxia. Metodi tālāk

pilnveidoja Bourgin un Nitsch, kas 1967.gadā publicēja darba rezultātus par

haploīdas tabakas iegūšanu un pavairošanu.


Haploīdus augus, piemēram, no putekšņiem var iegūt divos veidos:

izraisot putekšņu dalīšanos un inducējot embrioģenēzi,

inducējot kallusa veidošanos un tajā savukārt izraisot organoģenēzi.


Abos gadījumos tas notiek pilnīgi atšķirīgi no normāliem procesiem in vivo.

Pēc 1-2 dalīšanās reizēm gametu veidošanās tiek bloķēta,

un tālāk tā iziet it kā somatiskās šūnassomatiskās šūnas stadiju,

bet tālāk šī šūna dalās kā zigotazigota, no kuras veidojas embrijsembrijs.


Vēlamāks ir tiešās androģenēzes ceļšVēlamāks ir tiešās androģenēzes ceļš, kurā mikrospora it kā pārtop par zigotu un

iziet veselu rindu embrioģenēzes etapu;

uz putekšnīcas var veidoties pat vesels audziņš – haploīds reģenerants.

Šis tiešais ceļš, piemēram, aprakstīts četrās Solanaceae dzimtas ģintīs – Datura,

Nicotiana, Atropa un Lycium.


11.1.1.1. Putekšnīcu kultūras

Androģenēzes sekmīga indukcija ir lielā mērā atkarīga no putekšņu stāvokļa,

ievadot in vitro. Lai iegūtu haploīdus audus, rekomendē

putekšņus ievadīt sterilā kultūrā putekšņu pirmās mitozes laikā vai tūlīt pēc tam.

Kā izejmateriāls ir derīgi neatvērušies ziedpumpuri ar putekšnīcām, kas satur

vienšūnas mikrosporas.


Reinert un Bajaj (1977) apraksta šādu metodiku:

Ziedpumpurus atdala un ievieto 2,5-5% Ca hipohlorīta šķīdumā uz 5-10 minūtēm,

tad skalo sterilā destilētā ūdenī. Ziedpumpuru ar skalpeli atver, un, lietojot pinceti ar

tieviem galiem, savāc putekšnīcas un ievieto sterilā Petri platītē.

Tur atdala putekšņu maciņus un pārvieto tos mēģenēs vai mazās Petri platītēs ar barotni.

Ja putekšņu maciņi ir sīki, tad darbu veic, skatoties caur lupu.


Nekādā gadījumā nedrīkst eksplantu ievainot;

bojātos objektus nestāda, bet atmet.

Pretējā gadījumā vai nu eksplants iet bojā, vai arī sāk veidoties kalluss nevis

no putekšņiem, bet no somatiskām diploīdām šūnām.


Kultūru var ievietot arī šķidrā barotnē Erlenmeijera kolbās kratītājā

ar nelielu kustībās ātrumu pa apli.

Kultūru inkubē 24º-27º C un 14 stundu apgaismojumā ar gaismas

intensitāti ~ 2000 lux.


Svarīgi, lai eksplanti būtu ņemti no relatīvi jauniem augiem, kas auguši

normālā apgaismojumā.

Veciem augiem ziedēšanas beigās veidojas sīki pumpuri, kam

putekšnīcas satur nekvalitatīvas mikrosporas, tās var būt ar defektiem.


Lai no putekšņiem in vitro veidotos reģenerants, nepieciešamas

vismaz 3-8 nedēļas.

Sunderland (1973) rekomendē jaunveidojušos sīkos audziņus atdalīt tūlīt atsevišķi un pārstādīt uz jaunas

barotnes.


Putekšnīcu kultivēšanai bieži izmanto kādu no trim barotnēm:

White, 1943 (Ephedra, Ginkgo, Taxus, Torreya, Lolium, Hordeum, Lycopesicum),

Murashige, Skoog, 1962 (Nicotiana),

Nitsch, Nitsch, 1969 (Datura, Brassica).


Liela nozīme šīm kultūrām ir cukuriem un dzelzij.

Parasti izmanto 2-4%2-4% saharozi, bet dažām kultūrām, kā, piemēram, miežiem, kviešiem un tomātiem,

lieto stipri augstākas koncentrācijas – 6-12%.6-12%.


Interesanti ir dati par fitohormonu pielietošanu šīm kultūrām.

Androģenēze dažiem Nicotiana taksoniem un Atropa beladonna noris bez

fitohormonu klātbūtnes; bet ja barotnei pievieno fitohormonus, tad tiek inducēta somatisko šūnu dalīšanās, kā

rezultātā veidojas kalluss, kas sastāv no šūnām ar dažādu ploiditāti.


Datura putekšnīcu kultūrā embrioģenēze no putekšņiem tiek inducēta

tikai ar kinetīnu, kurpretī auksīnu u.c. fizioloģiski aktīvo

savienojumu pievienošana izraisa putekšnīcas diploīdo audu pavairošanos

(Reinert, Bajaj, 1977).


Ar Brassica oleracea, B. oleracea x B. alboglabra un Orysa sativa

iegūti pretēji dati –

embrioģenēzes izraisīšanai putekšņu kultūrā bija nepieciešams tieši auksīns (Vasil,

1973).


Gemesne Juhasz u.c. (2001) darbā ar saldiem pipariem Capsicum annuum L.

no putekšnīcām ieguvuši haploīdus (n – 12).

Tālākajā darbā autori ieguvuši gan spontānos dihaploīdus (2n – 24),

gan ar kolhicīnu inducētos dihaploīdus (2n·) – DH.


Gametoklonālie varianti veidojas meijozē. No putekšnīcām izveidotās DH- līnijas ir

visvairāk piemērotie inbrīdi, piemēram, saldo piparu kultūru hibrīdu attīstībai,

jaunu šķirņu veidošanai ar jaunu augļu formu,

izmēru, krāsu u.c.,

kā arī rezistences veidošanai, īpaši pret vīrusu, tādu kā tabakas mozaīkas vīruss

un baktērija Xantomonas vesicatoria.


Lai veidotos dubultie haploīdi, ungāru zinātnieki haploīdos reģenerantus ievietoja

uz 4-6 dienām barotnē, kas saturēja 50-400 mg.L-1 kolhicīna.

Bet rezultāti parādīja, ka ģenētiskās izmaiņas, kas veidojas kolhicīna inducēto

genomu duplikācijā, nav vairāk, kā izmaiņas, ko izsauc meijotiskās

rekombinācijas.


11.1.1.2. Putekšņu kultūras

Šai metodei ir vairākas priekšrocības, salīdzinot ar putekšnīcu kultūrām:

šīs kultūras attīstību nebremzē putekšnīcā atrodošies inhibitori,

nav konkurences starp putekšņu un somatisko šūnu augšanu un vairošanos.

Savukārt putekšņu kultūras mīnuss ir grūtības izraisīt putekšņu pirmo dalīšanos

in vitro.


Sākotnēji androģenēzi putekšņu kultūrā izdevās izraisīt, izmantojot audus-“aukli”

(līdzīgas metodes aprakstu skat. 9. lekcijā!).

Zināmi panākumi kultivēšanā sasniegti, speciāli apstrādājot ziedpumpurus 2-5 dienas

pirms eksplantu noņemšanas. Viens no tādiem paņēmieniem ir

ziedpumpuru atdalīšana no auga 3 dienas pirms sterilās kultūras uzsākšanas, un

pumpuru uzglabāšana pazeminātā temperatūrā (5º C).


Ir iegūti arī dati, ka androģenēzes iniciācijai dažiem augiem ir svarīgs eksogēni pievienots

auksīns barotnei. Mikrosporu augšana un attīstība var noritēt arī

tad, ja mikrosporas apstrādā ar 0,04-0,05% kolhicīnu.

Bet tādā gadījumā, protams, hromosomu skaits divkāršojas, un tiek iegūtas homozigotas diploīdas šūnas, kas var dot pirmsākumu

fertiliem augiem.


Putekšņu kultivēšana pēc Nitsch metodes (1977)

Vispirms sterilizē neatvērušos pumpurus. Putekšņiem ir jābūt pirmās mitozes etapā.

To pārbauda, krāsojot putekšņus ar acetokarmīnu vai Šiffa reaktīvu.

Tūlīt pēc ziedpumpuru atdalīšanas tos centrifugē pusstundu ar 2000 apgriezieniem

minūtē un 5-10º C temperatūrā.


Tālāk tos saglabā pazeminātā temperatūrā un mitrumā 48 stundas.

Lai iegūtu homozigotus diploīdus augus, ziedpumpurus 24 stundas tur

2%-īgā dimetilsulfoksīdā izšķīdinātā 0,04%-īgā kolhicīnā

vakuumā un pazeminātā temperatūrā.


Pēc 24 stundām kolhicīnu atmazgā, un pumpurus vēl patur aukstumā un mitrumā.

Datura ziedpumpuriem, piemēram, šis nepieciešamais laiks bija 48 stundas; pēc tam

varēja izolēt putekšnīcas, Nicotiana un labībai vajadzēja 3 diennaktis.

Izolētās putekšnīcas uz 72 stundām ievietoja Halperina barotnē ar 2% saharozi un

5 mg.L-1 Fe-EDTA (pH 5,8) tā, lai uz katras putekšnīcas būtu 5 ml barotnes.


Putekšnīcas uzmanīgi pārspiež, piemēram, ar stikla irbulīti, un putekšņus atdala,

filtrējot caur sterilu neilona sietu.

Sieta poru diametram Datura kultūrai jābūt 40 µm,

tomātiem – 25 µm, kukurūzai – 100 µm, utt.

Suspensiju ar putekšņiem pēc tam centrifugē 5 minūtes ar 500-800

apgriezieniem minūtē.


Putekšņus pārvieto svaigā barotnē, ko vairākas reizes nomaina, resp.,

kultūru skalo, lai atbrīvotos no inhibitoriem, un lai

mikrosporas varētu augt un attīstīties.

Attiecībām jābūt tādām, lai 1 ml barotnē būtu 103 – 104 putekšņi.


Kultivēšanu veic Petri platītēs, pie kam šķīduma slānim ir jābūt plānam, lai

nodrošinātu kultūras aerāciju. Kultivēšana jāveic 27-30 C vājā

apgaismojumā vai arī sarkanā gaismā.

Mikrosporas labāk kultivēt šķidrā barotnē, bet var izmantot arī “mīkstu” agarizētu

barotni.


Jaunie embriji var veidoties barotnē apmēram pēc mēneša.

Barotni putekšņiem izmanto vienkāršu, bet embriju attīstībai vajag citu, sarežģītāku

barotnes sastāvu. Kā svarīgas sastāvdaļas tiek minēti

mezoinozīts, glutamīns un serīns.


11.1.2. Olšūnu un ovāriju kultūras

Līdzīga pieeja kā putekšņu un putekšnīcu kultūrām ir arī olšūnu un ovāriju kultūrām.

Kā piemēru var minēt M.Sitbon (1981) publikāciju. Autora uzdevums bijis iegūt haploīdus augus no vairākām Gerbera

jamesonii šķirnēm.


Ziedu kurvīšus noņēma rudenī. Eksplantu izolēšanai izmantoja 4 malējos

riņķus ar mēlziediem. Kultūrā tika ievadītas neapaugļotas

olšūnas. Kalluss veidojās no olšūnu iekšpuses, savukārt no šā kallusa iegūti dzinumi. Šādā veidā tika iegūti vairāk nekā 10

dzinumi no viena eksplanta.


11.1.3. Haploīdu iegūšanas jēga

Haploīdie augi, kas iegūti no putekšņu vai putekšnīcu kultūrām, ir sterili un

nedod sēklas. No šiem augiem var iegūt homozigotus

diploīdus.


Metodes būtība ir pirmkārt, spēja veidot monoploīdu augu

ar vienu hromosomu kompektu,

otrkārt, veidot homozigotas, dubulti haploīdas tīras līnijas (DH) un,

treškārt, iegūt meijotiskus rekombinantus ar unikālu genoma veidojumu

(Caranta et al., 1996).


Kāpēc, piemēram, gerberai ir izdevīgi iegūt šādus DH augus?

Gerbera ir ļoti viegli pavairojama ar sēklām, taču šādā veidā šķirņu īpašības

nesaglabājas. Savukārt pavairošana ar spraudeņiem nav

tik efektīva un ir sarežģītāka, jo speciāli ir jāsagatavo mātes augi.


Gerberu šķirnes mēs pavairojam ar audu kultūru metodi, bet ar sēklām tas būtu krietni lētāk. Tad, lūk, iegūstot kādas

šķirnes haploīdu un no tā savukārt monozigotu diploīdu jeb DH, to iespējams pavairot arī ar sēklām. Tas būtu viens no

piemēriem.


Haploīdus augus izmanto arī atlasei pēc noteiktām īpašībām, teiksim, pēc izturības

pret herbicīdiem. Apskatīsim shēmu, ko attēlojis Chaleff

(1983). Tajā shematiski attēlotas galvenās darbības pozitīvo mutantu atlasei augu

audu kultūrās. Mutaģenēze palielina ģenētisko variabilitāti šūnu populācijā.


Inkubācija sākumā neselektīvos apstākļos ir svarīga, lai dotu iespēju eksperimentos inducēto

mutantu gēnu ekspresijai. Tālāk šūnas tiek pārstādītas herbicīdu saturošā barotnē, lai atlasītu šūnas, kas ir rezistentas pret

šo herbicīdu. Un nobeigumā Chaleff veicis diploidizāciju vai nu ar ķīmisku reaģentu palīdzību, vai notikusi spontāna diploidizācija, kā rezultātā iegūts DH

augs, kas spējīgs veidot fertilas sēklas.


Chaleff shēma


11.2. Poliploidizācija in vitro

Poliploidizācijas izraisīšana dod iespēju krāšņumaugu selekcionāriem iegūt parasti

lielākus vai arī pildītus ziedus.


Konkrēti rododendriem poliploidizācija bija devusi

lielākus ziedus, ilgāku ziedēšanas laiku un

tumšākas krāsas,dubultojoties hromosomām

(Väinölä et al, 2001).


Minētie somu zinātnieki pielietojuši kolhicīnu un orizalīnu (oryzalin).

Viņi secinājuši, ka orizalīnā bijusi sliktāka izdzīvotība nekā kolhicīnā, bet tetraploīdu skaits – lielāks.

Kopumā kolhicīns 0,05% koncentrācijā un orizalīns 0,005% koncentrācijā ar ekspozīcijas laiku 48 stundas devuši rododendru kloniem

~ 12% tetraploīdu.Šeit tomēr jāpiebilst, ka diploīdo klonu lapas eksperimentos uzrādīja labāku izdzīvotību

aukstumā nekā tetraploīdo.


11.3. Daži svarīgi aspekti selekcijā in vitro

Ar šķirnēm diemžēl ir tā, ka augi ar krāšņākiem ziediem un lielākiem un saldākiem augļiem

mēdz būt neizturīgāki pret dažādiem ekoloģiskiem apstākļiem, piemēram,

krāšņās lilijas (Orientālā grupa) pret pastiprinātu nokrišņu daudzumu,

minētie rododendri pret ziemas apstākļiem (sals, temperatūras svārstības), utt.


Tādēļ arī Rietumeiropā un Amerikā parādījies jauns virziens selekcijā: atzīto kultūras šķirņu krustošana ar

sugām, kas ir dabā, kā arī vecajām šķirnēm

(lai “uzlasītu” pazaudētos gēnus).


2000.g. simpozijā Somijā, kas bija veltīts jaunām selekcijas metodēm in vitro,

Kanādas zinātnieki iepazīstināja ar plašu zemeņu selekcijas darbu šajā virzienā.

Viņiem norit sadarbība ar individuāliem fermeriem, kam nosacīti izolētos apstākļos ir

lielas lauku platības ar zemeņu sugu kolekciju.


Savukārt EUCARPIA simpozijā Beļģijā 2001.g. tika stāstīts par modernu rožu selekcijas virzienu, mēģinot

iekrustot dažādas sugas rozes, kā arī 19. un 20. sākumā veidotās šķirnes.

Tad ir jāsaka, ka Latvijas selekcionāre Dzidra Rieksta Nacionālajā botāniskajā dārzā Salaspilī

ar šādu rožu selekcijas virzienu darbojas jau no 20.gs. 60.-ajiem gadiem un ir ieguvusi tādas

parka rožu šķirnes, kādas ārzemnieki cenšas iegūt tikai tagad.


Dzidras Riekstas selekcionētā rožu

šķirne ‘ĀBEĻZIEDS’


Kāpēc šāds darba virziens?Apskatīsim šo pašu piemēru par parka rozēm.

It kā tās nebūtu tik krāšņiem ziediem kā tējhibrīdrozes, bet āra apstākļos tās

veido kompaktu krūmu ar vienmērīgu zarojumu un lapojumu,

ziedi bagātīgi noklāj krūmu, un Dz. Riekstas veidotās šķirnes mūsu mainīgajās ziemās

pārziemo bez segšanas.


Visas šīs uzskaitītās īpašības nepiemīt tējhibīdrozēm.

Līdz ar to parka rozes dārzos un parka apstādījumos kopumā ir daudz

dekoratīvākas un prasa mazāk darbanekā tējhibrīdrozes.

Pie tam no parka rozēm var veidot arī cērpamu dzīvžogu, kas vasarā arī skaisti

ziedēs un smaržos.


Tikai lieta tāda, ka krustošanai derīgās sugas kā mātesaugi nevar dot pietiekamu krūma formu un ziedu krāsu daudzveidību, ja tās krusto ar ģenētiski radniecīgām rozēm.

Savukārt attālā hibridizācijā nevar iegūt fertilas sēklas ar klasiskās selekcijas metodēm.

Un, lūk, tieši šeit ir dažādu in vitro metožu pielietošanas nepieciešamība, kā

izolēto embriju kultūru, protoplastu kultūru, u.c.


Tajā pašā EUCARPIA simpozijā zinātnieki no Izraēlas ziņoja par saviem

mēģinājumiem gēnu inženierijas ceļā iegūt smaržīgas lizantes.

Lizante zied skaistiem, krāšņiem ziediem, bet tie nesmaržo.

Un tad tiek veikti eksperimenti, lai piemeklētu augus, no kuriem izolētie, par

smaržu atbildīgie gēni tiek pieņemti lizantēs.


Detalizētāk selekcija un augu atlase tai tiks apskatīta 12. lekcijā,

kā piemēru ņemot sāļizturīgu formu veidošanu.

Documents

HAPLOĪDU AUGU IEGŪŠANA IN VITRO POLIPLOIDIZĀCIJA IN VITRO