Hbc Biokit

BIOKIT, S.A. - 08186 Lli dAmunt - Barcelona - SPAIN 3000-1102 R10 10.2008 spa.doc

0843

bioelisa bioelisa anti-HBc 3000-1102 96 tests Test de ELISA para la deteccin de anticuerpos totales contra el antgeno core de la hepatitis B (anti-HBc) en suero o plasma humano. Sumario La hepatitis B es una enfermedad causada por una infeccin vrica. A lo largo de la infeccin aparecen varios marcadores serolgicos entre los cuales est el anti-HBc. El antgeno "core" de la hepatitis B (HBcAg) es un componente interno del virus de la hepatitis B antignicamente distinto al antgeno de superficie (HBsAg). Este sistema antgeno-anticuerpo HBcAg/anti-HBc fue descrito por Almeida y col. en 1971.1 El anti-HBc es el primer anticuerpo detectable en el curso de una hepatitis B aguda y puede persistir durante toda la vida. El anti-HBc suele detectarse en sangre inmediatamente despus de la deteccin de HBsAg y justo antes de la aparicin de las manifestaciones clnicas de la enfermedad. En casos de hepatitis B aguda con recuperacin, el anti-HBc es el nico marcador de la infeccin detectable en el perodo entre la desaparicin de HBsAg y la aparicin de anti-HBs. La sangre extrada de un individuo durante este perodo puede ser infectiva y se ha sugerido que el cribado para anti-HBc adems del cribado para HBsAg en donantes, permitira reducir la incidencia de hepatitis B postransfusionales.4 Por otra parte, la deteccin de anti-HBc es til en exmenes prevacunales ya que slo es necesario que se vacunen contra la hepatitis B aquellos individuos negativos para anti-HBc. Varios estudios han demostrado una correlacin entre la presencia de anti-HBc en donaciones sanguneas con la aparicin de hepatitis no A no B (NANBH o hepatitis C) postransfusional.7,8,9 La implementacin del cribado para anti-HBc en donantes de sangre podra prevenir muchos de estos casos. Principio bioelisa anti-HBc es un mtodo inmunoenzimtico competitivo para la determinacin de anticuerpos contra el HBcAg en suero humano. El ensayo est basado en la competencia entre anticuerpos humanos presentes en la muestra y anticuerpos IgG de conejo anti-HBc conjugados con peroxidasa cuando se incuban simultneamente en los pocillos de una microplaca recubierta con HBcAg recombinante. Despus de la incubacin se efecta un lavado para eliminar el material no fijado y a continuacin se aade una solucin de sustrato enzimtico y cromgeno. Esta solucin desarrollar un color azul cuando la muestra sea negativa. El color azul cambia a amarillo despus de parar la reaccin con cido sulfrico La presencia de anti-HBc en la muestra reduce el desarrollo de color de forma proporcional a su concentracin. Componentes 1. MICROPLACA: MCPL 12 x 8 pocillos recubiertos con antgeno recombinante HBcAg (E. coli). Pocillos separables individualmente. 2. CONJUGADO: CONJ 1 x 6 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-HBc conjugados con peroxidasa. Contiene colorante rojo,

protenas estabilizadoras, mertiolato sdico al 0,02% y sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar. 3. WASH SOLN 10x SOLUCIN DE LAVADO: 2 x 50 ml de tampn fosfato concentrado (10x) que contiene Tween 20 al 1% y mertiolato sdico al 0,01%. A

diluir 1/10 con agua destilada o desionizada antes de utilizarse. 4. SUBS BUF TAMPN SUSTRATO: 1 x 14 ml de tampn citrato-acetato que contiene perxido de hidrgeno. 5. SOLN TMB CROMGENO: 1 x 1,5 ml de 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) disuelta en dimetilsulfxido (DMSO). 6. CONTROL + CONTROL POSITIVO: 1 x 2 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-HBc diluidos en tampn fosfato. Contiene protenas estabilizadoras

y sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar. 7. CONTROL CONTROL NEGATIVO: 1 x 3,5 ml de suero humano negativo para todos los marcadores de la hepatitis B. Contiene sulfato de

gentamicina al 0,001%. Listo para usar. 8. SOLUCIN DE PARADA: H2SO4 1N 1 x 12 ml de cido sulfrico 1N. Listo para usar.


0843

bioelisa 9. LMINAS ADHESIVAS: SEALS Para cubrir la microplaca durante las incubaciones. 10. BOLSA DE PLSTICO: BAG Para guardar las tiras sin usar. Precauciones bioelisa anti-HBc es slo para el diagnstico IN VITRO. Para uso exclusivo por profesionales. ATENCIN: MATERIAL DE RIESGO BIOLGICO. Todo el material de origen humano utilizado en la preparacin de este producto ha sido encontrado negativo a la presencia de anticuerpos de los virus HIV-1/HIV-2 y HCV, as como a la del antgeno de superficie de la hepatitis B, utilizando un mtodo comercial autorizado. Sin embargo, dado que ningn mtodo puede ofrecer la total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, este producto debe manejarse con precaucin: - No permitir que los reactivos entren en contacto con la piel o los ojos; si esto ocurre, lavar con abundante

cantidad de agua. - Usar guantes. - No pipetear ningn reactivo con la boca. - No fumar. - Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Los restos

de muestras, controles, reactivos aspirados y puntas desechables deben recogerse en un recipiente destinado al efecto y autoclavarse una hora a 121C, o tratarse con hipoclorito sdico a una concentracin final del 10%, durante 30 minutos. (Los restos que contengan cido deben ser neutralizados antes de aadir el hipoclorito sdico).

- Algunos reactivos de este kit contienen azida sdica como conservante. La azida sdica puede reaccionar con tuberas y desages de plomo o cobre dando lugar a azidas metlicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante.

Precauciones de manejo: - Ajustar el lavador al tipo de placa utilizado (fondo plano), para realizar un buen lavado. - No mezclar reactivos procedentes de diferentes lotes. - No usar los reactivos una vez hayan caducado. - Deben extremarse las precauciones para evitar contaminaciones microbianas y contaminacin cruzada entre

los reactivos. - Utilizar una nueva punta desechable para pipetear cada muestra o reactivo. - Es muy importante preparar la solucin de sustrato-TMB justo 5-10 minutos antes de ser empleada.

Mantenerla en un recipiente bien tapado y al abrigo de la luz. - Restos de jabones y/o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparacin de la solucin

sustrato-TMB, pueden interferir en la reaccin. En caso de que se utilicen recipientes de vidrio, es conveniente lavarlos con cido sulfrico o clorhdrico 1N, enjuagarlos bien con agua destilada y secarlos antes de usarlos. Usar preferiblemente material plstico desechable.

Conservacin y estabilidad Los componentes permanecern inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan entre 2-8C. La bolsa que contiene la microplaca debe llevarse a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar condensacin en los pocillos. Una vez abierta la bolsa, la microplaca es estable por 3 meses guardada a 2-8C en la bolsa de plstico bien cerrada, con la bolsita de silicagel. La solucin de lavado, una vez diluida, es estable durante dos semanas si se conserva entre 2-8C. Guardar el cromgeno al abrigo de la luz. La solucin sustrato-TMB una vez preparada no es estable, por lo que se deben seguir estrictamente las indicaciones para su utilizacin. Material necesario no incluido - Agua destilada o desionizada. - Pipetas multicanal y micropipetas (50 l, 100 l) y puntas desechables. - Incubador a 37C 1C. - Cronmetro. - Lector de microplacas con filtro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 o 630 nm. - Sistema de lavado manual o automtico.


0843

bioelisa Recoleccin de la muestra Usar suero fresco o plasma (citrato/EDTA). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Las muestras pueden ser conservadas durante 3 das entre 2-8C. Si es por un perodo de tiempo ms largo las muestras deben ser congeladas (-20C). Debe evitarse congelar y descongelar las muestras repetidamente. Partculas en suspensin deben eliminarse por centrifugacin. Los sueros o plasmas no deben ser inactivados por calor, ya que puede conducir a resultados incorrectos. No utilizar muestras que contengan azida sdica. Procesamiento automtico Esta prueba permite su uso de modo automtico o semi-automtico en diferentes instrumentos. Es muy importante validar cualquier sistema automtico para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son equivalentes a los obtenidos emplendose el ensayo manual. Se recomienda que el usuario valide peridicamente el instrumento. Si encuentra cualquier dificultad en la programacin y ajuste de los procesadores automticos de Biokit, por favor contacte con su distribuidor. PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento) Operaciones previas Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-25C) antes de empezar el ensayo. Los reactivos lquidos deben homogeneizarse suavemente antes de usarlos. Diluir la solucin de lavado concentrada 1/10 con agua destilada o desionizada. Para una placa mezclar 50 ml de solucin de lavado concentrada con 450 ml de agua. En caso de no utilizar una placa completa preparar el volumen proporcional de solucin. Realizacin de la prueba 1. Utilizar solamente el nmero de tiras necesario para el test. Reservar 7 pocillos para blanco y controles.

Transferir 50 l de control negativo a 4 pocillos y 50 l de control positivo a 2 pocillos. Dejar vaco un pocillo para el blanco de sustrato.

2. Transferir 50 l de cada una de las muestras a analizar a los pocillos correspondientes. 3. Aadir 50 l de conjugado a cada pocillo, a excepcin del pocillo para el blanco de sustrato. 4. Cubrir la placa con una lmina adhesiva, agitarla suavemente e incubar durante 1 hora a 37C. 5. Durante los ltimos 5-10 minutos de esta incubacin, preparar la solucin de sustrato-cromgeno. Para una

placa aadir 280 l de la solucin de cromgeno (TMB) a un vial de tampn sustrato (14 ml) y mezclar bien. Si no se utiliza toda la placa, preparar la cantidad necesaria segn indica la tabla 1. La solucin final debe ser incolora, descartar en caso de que se vuelva azul.

TABLA 1

Tiras requeridas 1 2 4 6 8 10 12 Tampn sustrato ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Cromgeno (TMB) l 20 40 80 120 160 200 240

NOTA: El TMB est disuelto en DMSO. Dado que la temperatura de fusin del DMSO es de 18C, el cromgeno

debe alcanzar una temperatura de 20-25C y agitarse bien antes de usarlo. Es normal que el cromgeno presente un color amarillento.

6. Desechar la lmina adhesiva. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos completamente

(aproximadamente 350 l) con solucin de lavado diluida. Repetir el proceso de aspiracin lavado 3 veces ms. Asegurarse de que cada columna de pocillos est en remojo al menos 15 segundos antes del nuevo ciclo de aspiracin. Despus del ltimo lavado golpear la placa invertida sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de lquido en los pocillos.

7. Aadir 100 l de sustrato-TMB a todos los pocillos, incluso el blanco. 8. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25C). 9. Aadir 100 l de solucin de parada a cada pocillo, guardando la misma secuencia y con los mismos

intervalos observados en la adicin del sustrato-TMB.


0843

bioelisa bioelisa 10. Ajustar el cero del lector con el pocillo del blanco a 450 nm y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos

en el plazo mximo de 30 minutos. Se recomienda hacer lectura bicromtica utilizando filtro de referencia de 620 - 630 nm.

Control de calidad Los resultados de un ensayo son vlidos si se cumplen los siguientes criterios: 1. Blanco del sustrato: el valor de absorbancia debe ser inferior o igual a 0,100. 2. Control negativo: cada uno de los valores individuales de absorbancia no debe variar ms del 20% de la

media de los cuatro valores. La media de las absorbancias deber ser igual o mayor que 0,600 despus de restar el blanco.

3. Control positivo: la media de las absorbancias debe ser igual o menor que 0,100 despus de restar el blanco. Resultados 1. Calcular el valor umbral sumando el valor promedio de absorbancias del control negativo y el del control

positivo y multiplicando el resultado de esta suma por 0,4. Valor umbral = (CNx + CPx) x 0,4 2. Dividir la absorbancia de la muestra por el valor umbral. Positivo: ratio absorbancia/valor umbral 1,0 Negativo: ratio absorbancia/valor umbral > 1,1 Dudoso: ratio absorbancia/valor umbral > 1,0 1,1 Interpretacin de los resultados Un resultado positivo para anti-HBc significa que el paciente ha contrado la hepatitis B alguna vez previamente. No es un marcador de inmunidad. Un resultado negativo significa que la muestra analizada no contiene anti-HBc o lo contiene por debajo del lmite de deteccin del kit. Para evaluar la situacin de un paciente respecto a la hepatitis B deben practicarse los tests para los dems marcadores serolgicos de la hepatitis B. Limitaciones del procedimiento Como ocurre con otras pruebas serolgicas, los resultados obtenidos con el bioelisa anti-HBc sirven solamente como ayuda al diagnstico y deben interpretarse teniendo en cuenta la historia clnica del paciente. Para el correcto funcionamiento del kit debe seguirse estrictamente las instrucciones descritas. Cualquier desviacin puede dar origen a resultados aberrantes. Muestras con una concentracin de anticuerpos anti-HBc inferior a 1,5 U/ml (PEI) pueden no detectarse. Todas las muestras positivas o dudosas se deberan repetir y probarse para otros marcadores serolgicos del HBV. Resultados esperados El anticuerpo anti-HBc es el marcador ms frecuente de infeccin por el virus de la hepatitis B y se detecta tanto en la infeccin aguda como en la crnica y en la infeccin pasada con recuperacin. La prevalencia de anti-HBc y de otros marcadores de la hepatitis B vara ampliamente en el mundo, de alta (70-90%, ej., frica, Asia y Pacfico Oeste) a intermediaria (20-55%, ej., sur y este Europeo) y baja (4-6%, ej., Europa occidental, Amrica del Norte y partes de Amrica del Sur). Diferentes estudios han descrito una prevalencia del 0,53 al 2,16% en donantes de sangre del Reino Unido.2,5,6 Caractersticas funcionales Sensibilidad analtica El lmite de deteccin del bioelisa anti-HBc es 1,5 unidad/ml utilizando el suero de referencia anti-HBc del Paul Ehrlich Institute (PEI), Alemania.


0843

bioelisa Evaluaciones El funcionamiento del bioelisa anti-HBc se evalu en estudios comparativos con otros ensayos comerciales. - En una evaluacin interna se probaron 233 muestras que eran positivas de anti-HBc con otro ensayo comercial

(76 de ellas eran tambin positivas de HBsAg). 227 presentaron resultado positivo (incluso las 76 positivas de HBsAg) y 6 presentaron resultado negativo. Las 6 muestras discrepantes se probaron con un tercero ensayo comercial y los resultados fueron tambin negativos.

- En una evaluacin externa en comparacin con otro ensayo comercial, se probaron 175 muestras. 31 fueron

positivas y 141 fueron negativas con ambos ensayos. Se obtuvo una concordancia global del 98,3% (172/175). Eliminndose 2 muestras dudosas de los clculos, la sensibilidad relativa fue del 100% (31/31) y la especificidad relativa fue del 99,2%.

- En otra evaluacin externa, se probaron 251 muestras positivas de HBsAg. 247 (98,4%) fueron reactivas con el

bioelisa anti-HBc, de las cuales 245 fueron reactivas tambin con el mtodo alternativo utilizado en rutina para anti-HBc. 4 muestras fueron anti-HBc negativas con el bioelisa y con el mtodo en rutina y 2 fueron positivas solamente con el bioelisa. Por tanto, la sensibilidad relativa del bioelisa fue del 100% (245/245) y la concordancia global entre ambos mtodos fue del 99,2% (249/251).

- En una otra evaluacin externa, 5058 muestras consecutivas de donantes de sangre habituales se probaron en

paralelo con el bioelisa y con el mtodo en rutina. De estas muestras, 6 fueron reactivas tanto con el bioelisa como con el mtodo en rutina, 5 de las cuales se confirmaron 5 como de infeccin pasada despus de realizarse tests adicionales para otros marcadores de HBV. mientras que 1 era positiva solamente para anti-HBc. Otras 3 muestras fueron repetidamente positivas con el bioelisa y negativas con el test en rutina siendo 2 de ellas consideradas como falsamente positivas y 1 de resultado inconclusivo despus de realizar tests adicionales. Considerando como positivas verdaderas solamente las muestras confirmadas como de infeccin pasada, la especificidad encontrada fue del 99,92% (5049/5053).

- Otra evaluacin externa de sensibilidad a punto final y funcionamiento comparando con otros ensayos

comerciales se encuentra en la bibliografa.3 Precisin Reproducibilidad intra-ensayo: Los coeficientes de variacin obtenidos para los valores de absorbancia de 48 replicados de una muestra negativa fueron del 4,34%, 4,19% e 3,66% en tres lotes estudiados. Reproducibilidad inter-ensayo: Tres muestras negativas se probaron en 3 ensayos diferentes. Los coeficientes de variacin obtenidos para los ratios absorbancia/valor umbral de las 3 muestras fueron del 4,9%, 7,0% y 8,2% respectivamente. Interferencias Para estudiar posibles interferencias, se probaron muestras con un riesgo potencial de producir reacciones cruzadas, tales como sueros positivos de factor reumatoide (RF), anticuerpos anti-nucleares (ANA), anticuerpos heterfilos, IgM anti-HAV, anti-E. coli y de mujeres embarazadas. No se observaron evidencias de interferencia.


0843

bioelisa

bioelisa: Gua de problemas

Problema Posibles causas Solucin 1a. Temperatura, incubacin

o pipeteo incorrecto. 1. Controles fuera de

validacin. Comprobar procedimiento. Repetir el ensayo.

1b. Preparacin incorrecta de reactivos, error en las diluciones. Reactivos no mezclados correctamente.

Comprobar procedimiento. Repetir el ensayo.

1c. Contaminacin cruzada entre controles.

Pipetear cuidadosamente. No intercambiar los tapones de los viales. Repetir el ensayo.

1d. Filtro de lectura incorrecto.

Comprobar que el filtro de lectura sea de 450 nm. Si no se usa filtro de referencia de 620 o 630 nm, las absorbancias aumentan aproximadamente 50 miliunidades.

1e. Interferencia en el camino ptico.

Comprobar el lector. Limpiar o secar el fondo de los pocillos. Comprobar que no haya burbujas de aire. Repetir la lectura.

1f. Se han utilizado componentes de lotes diferentes.

No utilizar componentes de lotes diferentes puesto que estn ajustados para cada lote en particular.

1g. Reactivos caducados. Comprobar la caducidad del kit. No utilizar un kit caducado.

2a. Uno o ms reactivos no aadidos o aadidos en secuencia equivocada.

2. Sin color o poco color al final del ensayo.

Comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo.

2b. Conjugado inactivo: conservacin incorrecta.

Comprobar si ha habido contaminacin, comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo.

2c. Microplaca inactiva: conservacin incorrecta.

Mantener siempre las tiras no utilizadas en la bolsa minigrip, bien cerrada, con el desecante dentro. Repetir el ensayo.

2d. Sustrato inactivo: conservacin o dilucin incorrecta, el contenedor utilizado afecta la estabilidad del sustrato, contaminacin cruzada con la solucin de parada.

Utilizar siempre una dilucin fresca de TMB en tampn sustrato. Usar contenedores desechables o lavados con cido o etanol y enjuagados con agua desionizada. Comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo.


0843

bioelisa

bioelisa: Gua de problemas

Problema Posibles causas Solucin 3a. Sustrato contaminado,

oxidado o preparado incorrectamente.

3. Demasiado color en todos los pocillos de la microplaca.

Comprobar que el sustrato preparado sea incoloro, descrtelo si est azul. Asegrese que el TMB est completamente lquido antes de utilizarlo. Asegurar la correcta mezcla del TMB en el tampn sustrato. Utilizar viales o contenedores desechables o lavados con solucin cida o etanol. Repetir el ensayo.

3b. Reactivos contaminados o preparados incorrectamente.

Comprobar contaminacin (aspecto turbio). Comprobar diluciones. Repetir el ensayo.

3c. Solucin de lavado (1x) contaminada.

Comprobar la calidad del agua destilada/desionizada utilizada para preparar la dilucin. Repetir el ensayo.

3d. Lavado insuficiente o no consistente: llenado o aspiracin insuficiente o no uniforme, nmero de ciclos de lavado insuficiente. Lavador contaminado.

Comprobar el lavador. Llenar los pocillos hasta el tope y aspirar completamente. Incrementar el nmero de ciclos de lavado. Golpear la placa invertida contra papel absorbente. Repetir el ensayo.

3e. Se ha utilizado solucin de lavado de otro fabricante.

Utilizar slo la solucin de lavado de biokit.

4a. Problemas de lavado. Ver apartados 3c, 3d, 3e. 4. Reproducibilidad pobre o elevado nmero de muestras reactivas que no se repiten.

4b. Pipetas mal calibradas o puntas mal encajadas. Tcnica de pipeteo incorrecta.

Utilizar pipetas calibradas con puntas bien ajustadas. Pipetear cuidadosamente sin burbujas ni salpicaduras. Repetir el ensayo.

4c. Reactivos y muestra no a temperatura ambiente o no correctamente mezclados antes de usar.

Atemperar muestras y reactivos y mezclarlos bien antes de utilizarlos.

4d. Corrientes de aire sobre la microplaca durante las incubaciones.

Mantener la microplaca protegida de las corrientes de aire.

4e. Demasiado tiempo en la adicin de muestras y/o reactivos. Inconsistencia en los intervalos de tiempo, burbujas de aire.

Desarrollar una tcnica uniforme y consistente.

4f. Interferencia en el camino ptico.

Ver 1e.

Sensibilidad analticaEvaluacionesPrecisinInterferencias

Documents

Hbc Biokit