NORMA DE INDICACIN Y TOMA DE MUESTRAS PARA HEMOCULTIVOS. HEMOCULTIVO: Es un examen microbiolgico que permite la deteccin en el laboratorio, de una bacteremia, lo cual contribuye a adecuar la terapia antimicrobiana de acuerdo al microorganismo aislado y a la sensibilidad in vitro que ste presente, ya que la terapia, generalmente se plantea en forma emprica. Hemocultivos positivos pueden indicar : 1.-Bacteremia real por agente patgeno: Bacteremia primaria: sin foco evidente de infeccin en otro sitio. Bacteremia secundaria: existe foco de infeccin primaria con el mismo agente, como : Infeccin del tracto urinario, Infeccin respiratorio, Infeccin de herida operatoria. Otros. 2.-Bacteremia transitoria: Instrumentacin de mucosas contaminadas. Ciruga de reas contaminadas. 3.-Contaminacin: La incidencia de bacteremia, vara de acuerdo al tipo de infeccin que la origina, por ejemplo: Porcentaje de Bacteremia : Endocarditis bacteriana 77-100 % Neumonia Bacteriana 20-30 % Artitis sptica 10-60 % Neutropnicos febriles 20-30 % Meningitis bacteriana 45-55 % Haemophilus influenzae tipo b 80 % Neisseria meningitidis 33 % Streptococcus pneumoniae 52 % Nios febriles menores de 2 aos 6 % La deteccin en el laboratorio de una bacteremia depende de numerosos factores: -Indicacin del examn -Nmero de muestras cultivadas -Volumen de sangre cultivada -Dilucin de cultivo -Aditivos del medio. INDICACION CLINICA DE HEMOCULTIVO: -Infeccin del SNC. -Lactante menor de 03 meses con hipertermia (mayor de 39.5) -Sndrome febril de ms de 04 das de evolucin, sin foco clnico evidente. -Pleuroneumonias. -Paciente inmunodeprimido, con fiebre -Sospecha clnica de septicemia. -Cardiopata, con fiebre, sin foco clnico evidente. -Osteoartritis aguda. -Celulitis facial en nio menor de 05 aos.

NMERO DE MUESTRAS CULTIVADAS: La mayora de las bacteremias, con excepcin de las asociadas a endocarditis bacteriana e infecciones intravasculares y las que se producen en los nios, son intermitentes y de baja magnitud. Se ha demostrado que en un episodio bactermico la positividad de una, dos y tres muestras para hemocultivo es de 91%, 98% y 99% respectivamente, al no existir diferencia significativa al tomar 2 o 3 muestra se indicar: Adultos: 2 muestras. Nios : 2 muestras. Paciente con sospecha de Endocarditis bacteriana: obtener 2 muestras para hemocultivo, si estos van negativos a las 24 horas , obtener un segundo set de 2 hemocultivos ms. En ningn momento est recomendado la obtencin de una muestra de sangre para hemocultivo en forma aislada, disminuye la positividad diagnstica y la evaluacin de contaminacin. VOLUMEN DE MUESTRA: Adultos: Por la baja incidencia de las bacteremias en los adultos, existe una relacin directa entre el volumen de sangre cultivada y el porcentaje de bacteremias detectadas, por lo tanto, se recomienda tomar un volumen total de 20 ml en las 2 muestras, (07-10ml por muestra). Nios: El volumen es variable segn edad: Edad Recin Nacidos Lactantes de 1mes a 2 aos Mayores de 2 aos Adolescentes INTERVALO DE TOMA DE MUESTRA: Se ha documentado que el mejor momento para obtener la muestra de sangre es entre 2 horas a 30 minutos antes del peak febril, lo cual generalmente coincide con un periodo de calofros. Ambas muestras pueden ser obtenidas en el mismo momento, de diferentes sitios de puncin, no siendo necesario fijar plazos determinados entre una muestra y otra. En pacientes con terapia antimicrobiana la muestra debe ser obtenida inmediatamente antes de la prxima dosis de antimicrobiano. Se debe obtener los 2 hemocultivos en un periodo mximo de 24 horas. . EVITAR CONTAMINACION: Debido, a que el aislamiento de microorganismos habituales de la flora bacteriana de piel, puede plantear problemas en la interpretacin del examen, se hace necesario extremar las precauciones en la toma de muestra, para evitar su contaminacin. Volumen 1-2 ml 2 a 3 ml 5ml 10ml

Se recomienda: -Tcnica asptica en la toma de la muestra. -Lavado de piel del paciente con agua y jabn. -Uso de antisptico. Se sabe que los porcentajes de contaminacin se reducen, cuando los frascos que se usan, estn cerrados con tapn de goma a travs del cual se inyecta la sangre. La contaminacin de hemocultivos no debe superar el 3% SISTEMA AUTOMATIZADO DE HEMOCULTIVOS BACTEC 9050 Recepcin de Muestras: La recepcin se realizar las 24 hrs. del da. El mtodo autoanalizador Bactec 9050; est actualmente implementado para los servicio de: Medicina Adulto, Medicina Infantil, Infecciosos y U.C.I.. La implementacin de este mtodo para otros servicios clnicos ser informada oficialmente en el momento que se produzca. Indicaciones: * Infeccin bacteriana del S.N.C. (Meningitis purulenta). * Lactante menor de 03 meses con hipertermia (mayor de 39,5C). * Sndrome febril de ms de 04 das de evolucin, sin foco clnico evidente. * Pleuroneumonias. * Paciente inmunodeprimido, con fiebre. * Sospecha clnica de septicemia. * Cardiopata, con fiebre sin foco clnico evidente. * Osteoartritis aguda. * Celulitis facial en nio menor de 05 aos. * Pielonefritis. Frascos de cultivo: (frascos BACTEC) *Sern entregados a cada servicio por Laboratorio Central. *Conservar entre 2C y 25C, en un lugar seco, fuera de la luz directa del sol. *Se debe examinar cada frasco antes de usarse para ver si presenta indicios de dao, contaminacin o deterioro como: derrames, turbidez, decoloracin u oscurecimiento o el tampn hinchado o hundido, si es as, el frasco se debe devolver a Laboratorio Central. *En el momento de la toma de muestra, el frasco de cultivo debe estar a temperatura ambiente.

Toma de muestras: La muestra debe extraerse utilizando tcnica asptica para reducir la posibilidad de contaminacin, de acuerdo a Norma de toma de muestras para hemocultivos. Para la toma de muestra se puede utilizar sistema de extraccin al vaco.

N MUESTRAS :

Adultos : 02 (I-II) Nios : 02 (I-II)

Volumen x muestra : Volumen x muestra :

Adultos : 08 10 ml De acuerdo a tabla de volumen segn edad.

Los frascos deben identificarse con el nombre del paciente en el lugar sealado en la etiqueta, cuidando no escribir sobre el cdigo de barras. Recepcin de muestras: La recepcin se realizar las 24 hrs. del da. Informe : * Informe final negativo, se enviar al 5 da de cultivo. * Informes positivos, se comunicarn inmediatamente. En general existen 3 tipos de sistemas de hemocultivos: - Manuales o convencionales - Semi-automatizados: Lisis-centrifugacin - Automatizados

Manual: El medio de cultivo debe contener 0,025 a 0,05% de polianetol sulfonato de sodio (SPS) como anticoagulante, este inhibe la actividad bactericida del suero contra muchas bacterias y la fagocitosis, adems inactiva el complemento, neutraliza lisozimas y algunos antibiticos del grupo de aminoglicsidos. Peptostreptococcus, Gardnerella y algunas cepas de Neisseria spp. son inhibidas por el SPS, este efecto puede ser neutralizado suplementando el medio con gelatina 1,2%. En los sistemas manuales la eleccin del medio de cultivo, la temperatura y atmsfera de incubacin es decisin del microbilogo basado en el diagnstico clnico. Una desventaja de este sistema con relacin al automatizado es el mayor riesgo de contaminacin por la manipulacin de las botellas al realizar los procedimientos de tincin y traspasos.

SISTEMAS SEMI AUTOMATIZADOS: LISIS-CENTRIFUGACIN Consiste en un tubo de lisis cuyo contenido es polianetol sulfonato de sodio como anticoagulante, saponina como agente ltico de eritrocitos, leucocitos y macrfagos, polipropilenglicol como antiespumante y un fluoroqumico inerte de alta densidad. Luego se somete a la muestra a una centrifugacin a alta velocidad que permite la concentracin de microorganismos en el sedimento que se siembra en medios de cultivo especficos (9,6). En general, este mtodo permite mejorar en un 25 a 50% la deteccin de hongos levaduriformes y filamentosos, se considera el mtodo de eleccin en bacteriemias por Micobacterias (pacientes HIV) y permite realizar hemocultivos cuantitativos que son tiles para diagnstico de bacteriemia relacionada a Catter Venoso Central (CVC) 2.3 SISTEMAS AUTOMATIZADOS Los sistemas automatizados consisten bsicamente en botellas con diversos medios de cultivo (aerbicos, anaerbicos, hongos, micobacterias y con resinas que captan antibiticos) que se incuban en equipos que agitan constantemente las muestras y que poseen modernos sistemas de deteccin microbiana. Estos se basan en la deteccin de productos del metabolismo bacteriano (CO2) mediante tcnicas radiomtricas, espectrofotomtricas, fluoromtricas y/o colorimtricas. El computador asociado a los equipos relaciona las mediciones con ndices y/o grficas de crecimiento microbiano que dan un aviso cuando la deteccin sobrepasa un punto de corte. Las botellas se descargan, se hace una tincin de Gram y se informan precozmente. 4.0 TOMA DE LA MUESTRA 4.1 MOMENTO DE LA OBTENCIN DE LA MUESTRA Se ha documentado que el mejor momento para obtener la muestra de sangre es entre 2 horas a 30 minutos antes del peak, momento que puede ser precedido por calofros (Figura N3). Sin embargo dado que este momento no se puede predecir, se recomienda en forma arbitraria obtener dos hemocultivos en 24 horas separados por 30 a 90 minutos o bien obtener los dos hemocultivos al mismo tiempo, de diferentes sitios de puncin, si se trata de un paciente que va a requerir inicio inmediato de antimicrobianos. 4.2 MTODO DE OBTENCIN DE LA MUESTRA La muestra debe obtenerse por puncin perifrica (venosa o arterial), siempre por una nueva puncin y debe ser la primera muestra que debe obtenerse si existe indicacin de otros exmenes. La muestra obtenida por catter venoso central esuna muestra inadecuada, ya que estudios de microscopa electrnica revelan que el 100% de los catteres se colonizan con microorganismos de la piel a las 48 horas de instalados (25). Por esto, la recuperacin de microorganismos en el hemocultivo obtenido a travs del catter puede corresponder al arrastre de las bacterias que estn colonizando la superficie interna ms que a la presencia de bacterias en el torrente sanguneo, con un aumento de los falsos positivos de 1,7 a 3,8% (10). 4.3 PREPARACIN DE LA PIEL Este aspecto es esencial si se quiere evitar la contaminacin de los hemocultivos, ya que en la actualidad con los sistemas automatizados de hemocultivos que evitan la manipulacin de los mismos, prcticamente no existe la posibilidad de que los hemocultivos se contaminen en el laboratorio. Despus de la palpacin de la vena, la piel debe ser lavada con povidona yodada, lavador quirrgico, con gluconato de clorhexidina al 2-4% o con agua y jabn. La desinfeccin de la piel se realiza con povidona yodada, tintura de yodo o con clorhexidina alcohlica, segn lo que se haya utilizado como lavador, aplicado en forma excntrica desde el sitio de puncin elegido. Se

debe esperar que el antisptico se seque para que ejerza su accin residual (30). Si se utiliza tintura de yodo, se debe retirar completamente con agua para evitar quemaduras. Siempre la puncin debe ser efectuada con guantes, que deben ser estriles cuando se requiere nuevamente la palpacin de la vena. 4.4 VOLUMEN DE LA MUESTRA Se considera actualmente una de las variables ms crticas en el aumento de la positividad de los hemocultivos. Dado que la mayora de las bacteriemias son de baja magnitud (< 1 a 10 ufc/ml) a mayor volumen de muestra obtenido, mayor es la sensibilidad del hemocultivo. Se sabe que por cada ml adicional de muestra que se inocule en la botella aumenta la positividad entre un 2 a 5%. Por esto es que las recomendaciones son obtener el mximo de volumen que la botella sea capaz de tolerar manteniendo la relacin 1:5 a 1:10 entre la muestra y el volumen de medio de cultivo, esta dilucin permite neutralizar las propiedades bactericidas de la sangre y de los agentes antibacterianos que puedan estar presentes en la muestra. Para la gran mayora de los sistemas automatizados este volumen es de 10 ml para adultos y es variable para los nios segn la edad: 1 a 2 ml para recin nacidos, 2 a 3 ml para lactantes de 1 mes a 2 aos, 3 a 5 ml para nios mayores de 2 aos y 10 ml para adolescentes. 4.5 INOCULACIN DE LAS BOTELLAS En el caso de los sistemas automatizados, se debe descontaminar el tapn de goma antes de puncionar la botella con alcohol y esperar que se seque, ya que el fabricante no garantiza la esterilidad de ste, un meta-anlisis reciente demuestra que el cambio de aguja disminuye el porcentaje de contaminacin (33). En el caso de los sistemas manuales que no son sellados, se debe destapar el frasco para inocular la muestra. Este procedimiento tiene riesgo de contaminacin por lo que se debe tener mxima precaucin en no tocar las paredes exteriores de la botella con la aguja. 4.6 NMERO DE LOS HEMOCULTIVOS La obtencin de 2 hemocultivos en 24 horas, no slo aumenta la probabilidad de recuperar las bacterias a partir de la sangre sino que tambin permite diferenciar una bacteriemia verdadera de una contaminacin. Si se sospecha endocarditis infecciosa, se recomienda obtener el primer set de 2 hemocultivos y si estos van negativos en las primeras 24 horas, obtener un segundo set de 2 hemocultivos ms. En ningn caso se recomienda la obtencin de slo un hemocultivo y en el ltimo tiempo se ha considerado la evaluacin de los hemocultivos solitarios (nicos) como un instrumento para evaluar el control de calidad en microbiologa (29).

5.0 MANTENCIN Y TRANSPORTE DE LAS BOTELLAS Mantener a temperatura ambiente y enviar rpidamente al laboratorio. Nunca refrigerar. Las muestras se transportan a temperatura ambiente. La incubacin a 35C debe realizarse lo antes posible, pudiendo darse como mximo de tiempo 2 horas desde que se tom la muestra. 6.0 PROCEDIMIENTO 6.1 PROCEDIMIENTOS GENERALES Mantener las precauciones de bioseguridad universales para nivel II para el manejo de lquidos corporales, en la toma de muestra y en el transporte (Tomo Bioseguridad). a.- Los hemocultivos corrientes se incuban por 7 das a 35C en atmsfera normal y en endocarditis bacteriana subaguda hasta 14 das. b.- Observar diariamente el aspecto macroscpico en busca de signos que indiquen desarrollo bacteriano: hemlisis, turbidez, presencia de gas, colonias, etc. (Tabla N2). En ese momento hacer tincin de Gram directo de la siguiente forma: homogeneizar el contenido del frasco de hemocultivo por agitacin suave, colocar una gota en el extremo del porta objeto y extender con un cubre objeto en ngulo 45. Subcultivar a una placa de agar chocolate suplementado y a una placa de agar sangre de cordero al 5%.(Tabla N3). c.- Realizar subcultivos ciegos aunque no se observen evidencias de desarrollo a las 24 horas y al 7 da de incubacin, independientemente del aspecto macroscpico que presente la botella.

d.- Observar caractersticas macroscpicas de las colonias y hacer tincin de Gram directo. e.- Efectuar las pruebas bioqumicas y estudio de susceptibilidad antimicrobiana que corresponda al tipo de aislamiento. Algunos medios usados para hemocultivo son: Caldo cerebro corazn, caldo Brucella, caldo Columbia, caldo peptonado suplementado, caldo soya tripticasa. 6.2. PROCEDIMIENTOS ESPECFICOS En sospecha de Brucelosis incubar hasta 30 das en atmsfera con 5-10% CO2. Para hemocultivos anaerbicos si se utilizan medios comerciales especficos, incubar en atmsfera normal por 7 das. Los cultivos para Leptospira deben incubarse en oscuridad a 28-29C por 4-6 semanas, el medio de cultivo es un medio enriquecido que consiste en un caldo adicionado de suero de conejo. Otros medios son: a.- Sistema bifsico (Brucella spp.) b.- Medios especficos para anaerobios: Caldo Tioglicolato, c.- Medios especficos para aislamiento de hongos. d.- Medios especficos para aislamiento de micobacterias. 6.2.1 Streptococcus NUTRICIO-DEFICIENTES Algunas cepas de Streptococcus viridans son dependientes de Piridoxal para su crecimiento. Al parecer el Piridoxal (vitamina B6) presente en la sangre humana permite el desarrollo de estos microorganismos en el medio de hemocultivo, pero como este elemento no se encuentra presente en los medios en que se realiza el subcultivo, estos deben ser suplementados con Piridoxal al 0,001%, o L-cisteina al 0,05-0.1% o ambos. Se debe sospechar la presencia de estos microorganismos cuando se observan al Gram la presencia de cocceas y no se obtiene desarrollo en los subcultivos en diferentes atmsferas (aerobio-anaerobio). a.- Subcultivar hemocultivos positivos en agar sangre cordero al 5% suplementado con Piridoxal al 0,001% o L-cisteina. b- Sembrar cruzando la superficie del agar con Staphylococcus aureus e incubar 18 hrs. a 35C. c.- Observar la presencia de pequeas colonias satlites alrededor de S. aureus. Mtodos alternativos. a.- Inocular una placa de agar sangre con varias gotas del medio suplementado que contiene el microorganismo sospechoso. b.- Colocar aspticamente un disco de Piridoxal (catlogo Remel N21-137) en el rea con mayor inoculo. c.- Incubar la placa por 18 hrs. a 35C. d.- Observar la presencia de colonias satlites alrededor del disco. 6.2.2 MICROORGANISMOS DE PARED DEFICIENTE Se sospecha frente a un paciente con endocarditis bacteriana que presenta hemocultivos negativos. Para efectuar el aislamiento se recomienda incorporar al medio de cultivo sacarosa o manitol al 10%. 6.3 EXAMEN DE LOS CULTIVOS

9.0 INFORME DE RESULTADOS 9.1 PREINFORME Informar de inmediato al mdico si se observan bacterias al Gram, indicando: cantidad, morfologa y agrupacin. Si dispone de sistemas automatizado, informe las horas transcurridas hasta la positividad. 9.2 INFORME DEFINITIVO Indicar el perodo de incubacin durante el cual no se observ desarrollo cuando se emite un informe negativo. Para un hemocultivo positivo informar el microorganismo identificado con su respectiva susceptibilidad a antimicrobianos cuando corresponda. Se debe notificar al clnico todos los resultados, incluidos los presuntos contaminantes. 10.0 ENVO AL LABORATORIO DE REFERENCIA Enviar al Laboratorio de Referencia del Instituto de Salud Pblica en caso de aislamiento debacterias como: Salmonella spp., Brucella, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae provenientes de cuadros invasores, Haemophilus influenzae, Leptospira (solo muestras de suero), para confirmacin y vigilancia epidemiolgica de acuerdo a lo indicado en el reglamento N 712 sobre notificacin de enfermedades transmisibles. HEMOCULTIVOS Profesionales de la Seccin Bacteriologa General, Dra. Patricia Garca C.* y Carlos Prez C.* *Pontificia Universidad Catlica de Chile