• Hemoglobina este o heteroproteină (proteină conjugată)

• Cromoproteină – HEMUL care reprezintă partea neproteică este colorată

• CARACTERISTICI:

- partea proteică – globina ≈ 95-96% din moleculă

- partea neproteică – hemul ≈ 4%

- fierul ≈ 0,34% fier porfirinic

HEMUL – structură tetrapirolică:

- 4 nuclee pirolice I, II, III, și IV, coplanare, legate prin punți metin notate α, β, ɣ, δ

- substituenții: - CH3 în pozițiile 1,3,5,8

- CH=CH2 (vinil) în pozițiile 2,4

- CH2-CH2-COOH (propionil) în pozițiile 6,7

- Fierul în stare de valență +2

HEXACOORDINAT: 4 legături de azotul pirolic:

-1 legătură directă cu His din globină

- 1 legătură cu His din globină prin intermediul H2O sau O2

STRUCTURA HEMOGLOBINEI

LEGĂTURA HEMULUI CU CATENELE POLIPEPTIDICE ALE GLOBINEI

-Se leagă de catenele de tip α ale globinei - Se realizează prin intermediul histidinelor din poziția 58 și 87 - FIERUL – hexacoordinat - este legat diferit:

CH = CH2

N

CH3

N

CH3

CH = CH2

N

CH3

CH3

N Fe2+

COOH

COOH

IV HEM

I

II

III

1 2

3

4

56

7

8

CH2

CH2

CH2

CH2

Globinã

His (87 sau 93)

His (58 sau 63)Globinã

O2 (H2O)

1. DIRECT cu o histidină (legătură proximală) 1. Indirect cu altă histidină (legătură distală) Cu ajutorul unei legături de hidrogen, prin intremediul unei molecule de apă

GLOBINA – Caracteristici structurale

• Proteină bazică- subclasa HISTONE – predomină aminoacizi cu caracter bazic (histidina, arginina)

• Globina funcțională are o structură cuaternară: 4 lanțuri polipeptidice (TETRAMER)

• 574 aminoacizi : 141 aminoacizi în 2 lanțuri de tip α și 146 de aminoacizi în 2 lanțuri de tip β (2 monomeri α și 2 monomeri β)

• La nivelul tetramerilor, legaturile între monomerii α și β sunt mai puternice decât cele între monomerii de același tip

• Structura spațială a catenelor polipeptidice permite înglobarea în interiorul moleculei a 4 structuri heminice; fiecare catenă formează un “buzunar” hidrofob în care este inclusă o moleculă de hem, prin intermediul fierului divalent

• Fiecare protomer are structură primară, secundară, terțiară (globulară)

• Lanțurile polipeptidice sunt legate între ele prin legături labile (punți de hidrogen, forțe Van der Vaals)

GLOBINA – Caracteristici structurale

• Există mai multe tipuri de protomeri:

• Hemoglobina normală: 2 monomeri identici - 2 câte 2: α1α2β1β2

• 2 legături ale fierului se realizează direct cu anumite histidine din structura globinei

2 tipuri de legături

Legăturile dintre protomeri

Legăturile dintre protomeri și HEM

FUNCȚIILE HEMOGLOBINEI

1. Se combină reversibil cu O2

Hb + O2 HbO2 + O2 Hb(O2)2 Hb(O2)3 Hb(O2)4

+O2 +O2

Fe NN

N

N

H2O

GlobinãHis

Fe NN

N

N

O2

HisGlobinã

GlobinãHis

+ O2 + H2O

HisGlobinã

DEZOXIHEMOGLOBINĂ OXIHEMOGLOBINĂ

Proteină alosterică!

FACTORI : 1) Presiunea parțială a O2

2) pH –ul 3) Prezența 2,3-difosfogliceratului

1) La o pO2 mai mare de 100mm Hg, în alveolele pulmonare, echilibrul este deplasat spre dreapta; la pO2 mai mică de 35 mm Hg în capilare, echilibrul deplasat spre stânga

2) La pH acid (în capilare) Hb are afinitate mai mică pentru oxigen pe care î-l cedează usor; la pH alcalin afinitatea Hb pentru oxigen este mai mare

3) cantităţi crescute de acid 2,3 difosfogliceric deplasează echilibrul spre stânga

Factorii care influențează capacitatea hemoglobinei de a lega oxigenul

Forma R În capilarele pulmonare adiacente

alveolelor

Forma T la nivelul țesuturilor

2. Se combină reversibil cu CO2 Prin intermediul grupării –NH2 libere a globinei => carbhemoglobină

FUNCȚIILE HEMOGLOBINEI continuare

Hb – NH2 + CO2 Hb – NH – COO- + H+

3. Se combină ireversibil cu CO => carboxihemoglobină

Hb + CO HbCO afinitate > 300 ori

4. Oxidarea Fe2+ - e- Fe3+ methemoglobină (ireversibilă)

5. Sulfhemoglobina

• Globinele se deosebesc între ele prin

• Importanță practică în studiile de biologie evolutivă

• În cursul evoluției ontogenetice există mai multe variante de hemoglobine normale:

- Hb embrionară – HbE α2ε2

- Hb fetală – HbF α2δ2 (sintetizată în ficat între lunile 3-8 de sarcină)

- Hb juvenilă

- Hb adultului HbA1 α2β2 (este forma majoritara 97-99%); mai există o formă minoră HbA2 (α2 δ 2 1-2%) – începe să fie sintetizată din viața intrauterină. Înlocuiește treptat HbF

• Globinele au speciospecificitate (cristalizează diferit în funcție de specie):

-oxihemoglobina de cal – cristale monoclinice

- oxihemoglobina de cobai – cristale tetraedrice

- oxihemoglobina de câine – cristale ortorombice

- oxihemoglobina umana – bipiramide ortorombice simetrice - Importanță în laboratoarele de criminalistică

Conținutul Proporția Aranjamentul

aminoacizilor

Biosinteza hemoglobinei

BIOSINTEZA HEMOGLOBINEI

Etapele: I. Biosinteza HEMULUI

II. Biosinteza GLOBINEI

III. Cuplarea hemului cu globina

David SHEMIN, David RITTENBERG – 1945

I. Biosinteza HEMULUI. Faze:

1. Sinteza acidului delta – aminolevulinic

2. Biosinteza PORFOBILINOGENULUI

3. Biosinteza PROTOPORFIRINEI – IX

4. Biosinteza HEMULUI

Precursori: - Succinil ~ SCoA

- Glicocol activat cu PLP

Autoexperiment cu 15N-glicină

•Hemoglobinogeneză •Eritropoieză

N

CH2

CH

OH

CH3

O PO3H

2

N CH2

COOHCOOH

CH2

CH2O

~SCoA

COOH

CH2

CH2

O

NH2

COOH

CO2

COOH

CH2

CH2

O

CH2

NH2

+

C

Glicocol activat cu PLP Succinil~SCoA

H2O PLP(se reface)

- ALAS

( - aminolevulinatsintetaza)

C

Acid - amino, - cetoadipic

HC

- ALAS C

Acid - aminolevulinic

( - ALA)

1) Sinteza acidului delta aminolevulinic (δ – ALA)

HSCoA

1. Biosinteza acidului delta aminolevulinic

• Reprezintă prima etapă din biosinteza hemului

• Presupune reacţia între succinil CoA şi glicocol sub acţiunea δ aminolevulinatsintazei

• Este obligatorie prezenţa PLP care activează glicocolul

• Aceasta etapă se desfasoară intramitocondrial, iar δ ALA trece în citoplasmă

• Enzima δ ALA sintaza este enzima determinantă de viteză a întregului proces; hemul acţionează ca inhibitor al activităţii enzimei

• Plumbul inhibă δ ALA sintaza

COOH

CH2

CH2

O

H2C

NH2

COOH

CH2

CH2

O

CH2

NH2

CH2

COOH

N

CH2

CH2

NH2

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

NH2

CH2

N

CH2

COOH

CH2

C

C+

2 H2O

C C

C

PORFOBILINOGEN(PBG)

izomeraza

( - aminolevulinatdehidratataza

H

Acid - aminolevulinic

( - ALA)

2) Biosinteza PORFOBILINOGENULUI

porfobilinogen sintetaza

• Se realizează prin condensarea a 2 molecule de δ ALA sub acţiunea enzimei δ aminolevulinat dehidrataza (porfobilinogen sintetaza)

• Această etapă se desfăşoară în citoplasmă

• Enzima conţine zinc şi este foarte sensibilă la acţiunea inhibitorie a metalelor grele, mai ales a plumbului

2. Biosinteza porfobilinogenului (PBG)

3) Biosinteza PROTOPORFIRINEI – IX

COOH

CH2

NH

CH2

NH2

CH2

CH2

COOH

NH

AP

NH

A

P

NH

A P

NH

NH

AP

NH

A

P

NH

A P

NH

- CH2 - COOH

- CH2 - CH

2 - COOH

PORFOBILINOGEN(4 PBG)

porfobilinogendezaminaza

A

P

H2C

H2C CH2

CH2

I

II

III

IV

A

P

UROPORFIRINOGEN izomer - I

H2C

H2C CH2

CH2

IV

UROPORFIRINOGEN izomer - III

izomeraza

A

P

A

P

4 NH3

- acetil

- propionil

4 molecule

CH3

NH

P

NH

CH3

P

NH

CH3

P

NH

CH3- CH

2 - COOH

- CH2 - CH

2 - COOH

CH3

NH

P

NH

CH3

CH = CH2

NH

CH3

CH = CH2

NH

CH3

CH3

N

P

NH

CH3

CH = CH2

N

CH3

CH = CH2

NH

CH3

O2

H2C

H2C CH2

CH2

IV

COPROPORFIRINOGEN izomer - III

P

A

P

UROPORFIRINOGEN - III

uroporfirinogendecarboxilaza

4 CO2

I

II

III

coproporfirinogen oxidaza

H2C

H2C CH2

CH2

IV

PROTOPORFIRINOGEN izomer - IX

P

I

II

III

HC

HC CH

CH

IV

PROTOPORFIRINÃizomer- IX

P

I

II

III

protoporfirinogen oxidaza

6 H

ferochelataza

2 H2O

2 CO2

3. Biosinteza protoporfirinei IX

Transformarea porfobilinogenului (PBG) în protoporfirina IX are loc în citoplasmă

PBG este transformat iniţial în uroporfirinogen, sub acţiunea a 2 enzime:

– Porfobilinogen deaminaza care determină formarea unor punţi metilenice între inele pirolice

– Uroporfirinogen III sintaza care are proprietatea de a închide ciclul tetrapirolic

Uroporfirinogenul este transformat în coproporfirinogen sub acţiunea uroporfirinogen decarboxilazei

Fe2+

CH = CH2

N

CH3

N

CH3

CH = CH2

N

CH3

CH3

N Fe2+

COOH

COOH

PROTOPORFIRINÃizomer- IX

ferochelataza

4.) Biosinteza HEMULUIIII. Cuplarea hemului cu globina

IV HEM

I

II

III

1 2

3

4

56

7

8

CH2

CH2

CH2

CH2

Globinã

His (87 sau 93)

His (58 sau 63)Globinã

Globinã

O2 (H2O)

2H

4. Biosinteza hemului

• Chelatarea ferului de către protoporfirina IX se desfășoară

intramitocondrial

• Enzima ferochelataza este sensibilă la acţiunea inhibitoare a metalelor grele (mai ales a plumbului)

În paralel, la nivelul ribozomilor are lor sinteza globinei , care se va lega de hem prin intermediul resturilor de Hys din poziţiile 58 si 87, pentru a forma hemoglobina

REGLAREA BIOSINTEZEI HEMULUI

8 GLICINÃ + 8 SUCCINIL~SCoA

- aminolevulinatsintetaza

8 ACID - AMINOLEVULINIC

porfobilinogensintetaza

4 - PORFOBILINOGEN

uroporfirinogenI sintetaza

UROPORFIRINOGEN III

uroporfirinogendecarboxilaza

COPROPORFIRINOGEN III

coproporfirinogenoxidaza

PROTOPORFIRINOGEN IX

protoporfirinogenoxidaza

PROTOPORFIRINÃ IX

ferochelataza

HEMAPOREPRESOR

8 HS-CoA + 8 CO2

8 H2O

4 NH3

Izomerizarea ciclului IV

4 CO2

2 CO2 + 4 H

6 H

Fe2+

Fe3+

feedback (-)

UROPORFIRINOGEN Iuroporfirinogen

III sintetaza

BIOSINTEZA HEMOGLOBINEI - COMENTARII -

=> PRECURSORI = COMPUȘI FOARTE SIMPLI

- Glicocol

- Succinil ~SCoA

- Piridoxal fosfat (PLP)

=> Legătura cu CICLUL KREBS prin Succinil ~SCoA

(ciclul KREBS – SHEMIN)

=> Prima enzimă = δ – aminolevulinat sintetaza – este enzimă limitantă

de viteză → etapă reglatoare a procesului

=> ERITROPOIETINA = hormon ce modulează procesul de biosinteză

=> Proces foarte complex ce se petrece în reticulocite

=> Are loc la nivelul tuturor organitelor subcelulare:

- formarea protoporfirinei IX → MITOCONDRIE

- încorporarea Fe2+ → CITOPLASMĂ

- biosinteza globinei → RIBOZOMI

- cuplarea globinei cu hem → CITOPLASMĂ

Catabolismul hemoglobinei

Eritrocitele au o durată medie de viaţă de 120 de zile; celulele îmbătrânite

sunt recunoscute datorită modificarilor ce au loc la nivel membranar şi

sunt fagocitate de către ţesutul reticuloenditelial extravascular (splina,

ficat, maduva osoasă). Are loc denaturarea globinei şi eliberarea

hemului în citoplasmă. Globina este degradată cu eliberarea

aminoacizilor ce vor intra în fondul metabolic al organismului.

Hemul este degradat prin intervenţia sistemului enzimatic

microzomal; enzima hem-oxigenaza care desface ciclul tetrapirolic este

dependentă de fier şi de NADPH; această enzimă desface una din

punţile α metinice care leagă două inele pirolice, iar C este convertit în

CO, aceasta fiind singura sursă endogenă de CO. Această oxidare se

realizează în prezenţa oxigenului molecular.

Catabolismul hemoglobinei

În urma acţiunii hemoxigenazei se formează biliverdina care se va

transforma sub acţiunea biliverdinreductazei în bilirubină.

Bilirubina nu rezultă numai din degradarea eritrocitelor

îmbătrânite dar şi din catabolismul celorlalte proteine heminice.

Bilirubina este puţin solubilă în mediu apos la pH-ul

fiziologic; ea este transportată în plasmă legată de albumină

(70mg/dL de plasma). În această formă bilirubina este denumită

bilirubină totală/ neconjugată/ indirectă, şi nu dă reacţia de

diazotare. La concentraţii mai mari de 25mg/dL se manifestă

toxicitatea bilirubinei care va determina apariţia icterului nuclear.

Catabolismul hemoglobinei

V

N

M

N

MP

V

N

M

M

N

P

Fe2+

O2

NADPH2

V

N

M

N

MP

V

N

M

M

N

P

OH

Fe3+

O2 CO

Fe3+

V

NH

M

NH

MP

O

V

ONH

M

M

P

N

HEM

Globinã

Globinã

hem oxigenazã

H2O

Globinã

Globinã

I

II

- HIDROXIHEMINÃ

VERDOGLOBINÃ

Globinã

Cit P450

I

II

BILIVERDINÃ

NADP+

III

IV

CATABOLISMUL HEMOGLOBINEI

V

NH

M

NH

MP

O

V

ONH

M

M

P

N

NADPH2

NH

M V

O NH

CH

2

M P

NH

P M

NH

M V

O

I

II

BILIVERDINÃ

III

IV

biliverdin reductazã

NADP+

IIIIIIIV

BILIRUBINÃ

NH

M V

O NH

CH

2

M

NH

P M

NH

M V

O

COOH

COOH

NH

M V

O NH

CH

2

M

NH

M

NH

M V

O

COOH

IIIIIIIV

BILIRUBINÃ

O

OOC

(CH2)2

O

O CO

(CH2)2

IIIIIIIV

O

O CO

(CH2)2

1 1

Bilirubinã - monoglucuronid Bilirubinã - diglucuronid

UDP-GLUCURONILtransferaza

UDP-GLUCURONAT 2 UDP-GLUCURONAT

La FICAT:

Bilirubina glucuronoconjugată (bilirubina directă)

Bilirubina este transportată la ficat unde este separată de albumine, şi

suferă o reacţie de conjugare cu acizii glucuronici; la această reacţie

bilirubina participă prin grupările carboxilice de la resturile propionice

ce substituie inele pirolice. Conjugarea are loc în prezenţa enzimei

bilirubin: UDP glucuronil transferaza.

Bilirubina glucuronoconjugată (bilirubina directă) este

hidrosolubilă, ceea ce permite excreţia sa la nivel biliar. Bilirubina

glucuronoconjugată nu este absorbită in intestinul subţire; la nivelul

intestinului gros, sub acţiunea hidrolazelor bacteriene, se realizează

hidroliza esterilor cu acizii glucuronici şi eliberarea resturilor propionice.

Bilirubina eliberată astfel este redusă la un compus tetrapirolic liniar,

numit urobilinogen (punţile metinice devin metilenice iar inelele

tetrapirolice au duble legături paralele).

Urobilinogenul poate urma mai multe căi:

- o parte este oxidat la urobilină, sau redus la stercobilinogen,

compuşi care se elimină prin fecale

- o parte este reabsorbit la nivel intestinal, revine la nivel

hepatic şi este din nou excretat prin bilă (circuitul

enterohepatic)

-o parte se elimină ca atare prin urină

CICLUL ENTEROHEPATIC

AL PIGMENȚILOR

SANGVINI

HEMOGLOBINA

VERDOGLOBINA

BILIVERDINA

BILIRUBINA

BILIRUBINA LEGATÃ DE ALBUMINE

INDIRECTÃ

PRIMARÃ (NECONJUGATÃ)

BILIRUBINA DIRECTÃ

CONJUGATÃ (DIGLUCURONID)

BILÃ(colecist)

INTESTIN

Reduceri

BILIRUBINÃ

MEZOBILIRUBINÃ

UROBILINOGEN

STERCOBILINOGEN

Reducere

Oxidare

Oxidare

UROBILINÃ

STERCOBILINÃ

FECALE

PLASMÃ

RINICHI

URINÃurobilinogenstercobilinogen

urobilinogenstercobilinogen

FICAT

MÃDUVÃ OSOASÃ

SPLINÃ

CELULE RETICULO-ENDOTELIALE

EXTRAHEPATICE

ruperea puntii

- metinice

Fe2+

globinã

Reduceri

PLASMÃ

{

FICAT

{

{