Hemoglobinas normais e patológicas

Hemoglobinas normais e patológicas

BIO10-329 Biofísica de ProteínasRegente: Célia R. Carlini

Os assuntos abordados nessa aula são:

•Relações estrutura X função: comparação com a mioglobina

•Aspectos ontogenéticos e filogenéticos

•Hemoglobinopatias

Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações

As globinas constituem um bom exemplo para se compreender as relações entre a estrutura e a função das proteínas.

A Hemoglobina é um hetero-tetrâmero formada por 2 tipos de globinas: e .

Max Perutz e John Kendrew resolveram a estrutura 3D da hemoglobina em 1959

O ambiente hidrofóbico em torno do heme é fundamental para a atividade biológica das globinas, que depende de uma interação reversível com oxigênio.

Fe++ Fe++.O2

A mioglobina da baleia cachalote é uma proteína monomérica de 153 aminoácidos composta por 7 segmentos de -hélice, denominados de A a H. As porções da cadeia

polipeptídica entre segmentos de -hélice são chamados cotovelos. As globinas apresentam um bolsão (fenda) hidrofóbico no qual se aloja o grupo prostético heme.

Estrutura 3D do esqueleto covalente da mioglobina.

Comparação das seqüências de aminoácidos da mioglobina (Mb, 153 aa) e dasglobinas (Hb, 141 aa) e (Hb, 146 aa) da hemoglobina de cavalo.

As seqüências começam com o resíduo N-terminal NA1 (à esquerda, em cima), antes da hélice A, composta por 16 aminoácidos. Segue a hélice B, também com 16 resíduos, e assim até a hélice H.

Os aminoácidos idênticos nas três proteínas estão marcados em cinza, e os que interagem com o heme aparecem em rosa. Entre esses últimos estão a His E57 e a His F8 que ocupam a mesma posição espacial nas 3 moléculas, apesar de terem posições diferentes nas seqüências correspondentes.

Observe que o grau de identidade da seqüência entre as três globinas é relativamente baixo, da ordem de 20% (27 resíduos).

mioglobinaglobina globina

hemoglobina

Comparação das estruturas 3D das globinas e da hemoglobina e mioglobina

Observe a semelhança estrutural das 3 globinas, formadas por 7 segmentos de -hélice que delimitam uma fenda, na qual se localiza o heme.

Considerando:

1) que a seqüencia de aminoácidos é o que determina a estrutura 3D de uma proteína,

2) e o baixo grau de identidade das 3 sequëncias globínicas,

Como se explica o fato delas possuírem estrutura 3D tão semelhantes ?

Como visto na aula anterior, os radicais dos aminoácidos não participam das ligações que estabilizam a -hélice.

Assim, pode haver mudanças na seqüência primária de uma proteína sem afetar a estrutura secundária, no caso dessas ocorrerem numa região de -hélice ou de folha .

Como as globinas contêm grande proporção de -hélices, ao longo da evolução acumularam número significativo de mutações pontuais sem alteração de sua forma 3D. .

Outros derivados porfirínicos não hemínicos importantes são a cobalamina ou vitamina B12, que contem Co2+ ao invés de ferro, e clorofilas, que contém Mg2+

O heme das globinas é responsável pela ligação ao oxigênio. O heme, também presente nos citocromos, é sintetizado nas células aeróbicas

através de uma cadeia complexa de enzimas, a via das porfirinas. Na última etapa, um átomo de ferro é introduzido na protoporfirina IX, originando o heme.

Heme sintase

+ Fe2+

Nas globinas, o Fe2+ hemínico faz 6 ligações de coordenação: 4 ligações planares com os nitrogênios dos anéis pirrólicos da protoporfirina, e 2 perpendiculares ao plano do heme. A 5ª. ligação é permanentemente ocupada com um dos N imidazólico da histidina F8 (proximal). A sexta coordenação pode ser ocupada pelo oxigênio, ou pela histidina E7 (distal) nas globinas desoxigenadas.

No desenho ao lado, a globina . Observar os resíduos hidrofóbicos (em preto) que forram o bolsão do heme nas globinas.

Fe

A Hemoglobina, composta por quatro cadeias polipeptídicas (dois dímeros ), é uma proteína transportadora de oxigênio.

apresenta afinidade variável por O2

A estrutura tetramérica da hemoglobina confere à molécula maior controle da afinidade por oxigênio

1 heme = 1 O2

A Mioglobina, composta por uma cadeia polipeptídica, é uma proteína armazenadora de oxigênio presente no tecido muscular de mamíferos. apresenta alta afinidade por O2

• A Mioglobina (Mb) tem a curva hiperbólica, e atinge 50% de saturação (p50) com uma pO2

de ~1 torr.

• A Hemoglobina (Hb) tem a curva sigmóide, indicando alosteria ou cooperativadade entre suas subunidades. Sua pO2 é de ~ 26 torr e sua afinidade pelo O2 varia com o grau de saturação da molécula.

A curva de saturação com O2 mostra diferenças importantes na afinidade da hemoglobina e da mioglobina pelo oxigênio.

A curva de saturação descreve a percentagem de moléculas carregando O2 (eixo y) à medida que se aumenta a pressão parcial do gás (pO2, eixo x).

Observe os valores da pO2 venosa (nos tecidos) e arterial (nos pulmões).

A diferença de afinidade por O2 faz com que nos tecidos, a Mb fique 100% saturada, enquanto que a saturação da Hb diminui a ~55%, liberando de 1 a 2 moléculas de O2.

Essa diferença de comportamento está de acordo com a função de

armazenamento de O2 da Mb e de transporte de O2 pela Hb.

Por que a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio é 26 vezes menor do que a da mioglobina, se as proteínas possuem as estruturas 3D de suas cadeias globínicas (ambiente onde está o complexo heme-Fe2+ ~ O2) tão semelhantes ?

Quais são os mecanismos que fazem a afinidade da hemoglobina variar conforme o grau de saturação em O2 ? Por que isso não ocorre com a miglobina ?

A hemoglobina passa por várias alterações conformacionais na transição do estado desoxigenado para oxigenado.

No estado oxigenado, a cavidade central do tetrâmero diminue.

Vários “loops” se movem.

O2

Observar os movimentos da cadeia em relação ao Heme. A histidina 92 é a

F8 proximal.

Alterações conformacionais da hemoglobina A durante a transição do estado oxigenado para desoxigenado

Observar a expansão da cavidade central do tetrâmero e as mudanças nos contactos entre as subunidades

O estado de oxigenação afeta propriedades físicas da Hemoglobina como a interação com a luz visível.

A hemoglobina desoxigenada interage mais com a luz azul (absorção no comprimento de onda de 600-650 nm), dando ao sangue venoso uma cor acastanhada (não é sangue sujo !),

quando comparado ao sangue arterial.

Alterações conformacionais da hemoglobina A durante a transição do estado oxigenado para desoxigenado

As alterações conformacionais que ocorrem nas cadeias globínicas da hemoglobina na transição oxigenação-desoxigenação são transmitidas de uma cadeia a outra, através de contactos nas interfaces das subunidades.

Esse fenômeno é a base molecular da cooperatividade, uma forma de alosteria característica de proteínas oligoméricas. Por ser monomérica, a mioglobina não tem essa propriedade.

A cooperatividade na hemoglobina é positiva. Isso significa que quando uma cadeia passa do estado oxigenado para o desoxigenado, as alterações conformacionais que essa molécula sofre são “sentidas” pelas cadeias vizinhas. Essas, por sua vez, respondem com uma diminuição de sua afinidade pelo oxigênio, facilitando a desoxigenação da hemoglobina.O mesmo tipo de fenômeno ocorre na oxigenação da molécula, que também acontece de forma positivamente cooperativa.

A cooperatividade na transição oxigenação-desoxigenação da hemoglobina é a causa de sua curva de saturação ter aspecto sigmóide, e uma das razões da afinidade variável da hemoglobina pelo oxigênio.

O efeito Bohr é a modulação da afinidade da Hb por O2 pelo pH do meio, facilitando a desoxige-nação da Hb a nível tecidual.

O sangue venoso é mais ácido do que o arterial, pela presença de CO2 vindo dos tecidos. Esse forma ácido carbônico H2CO3, que se dissocia liberando H+ para o meio.

A curva ao lado mostra como a % de saturação da Hb, em uma pO2 próxima aos valores nos tecidos (20 torr), diminue em função do pH do meio.

Vários mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio. O efeito Bohr é um dos mais importantes em termos fisiológicos.

Para a mesma pO2, a saturação da Hb diminue de 45% em pH 7,6 para 22% em pH 7,2.

HEMÁCIAS PLASMATECIDOS

Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se dão as trocas de gases na Hb, e suas propriedades de tampão.

1. Nos tecidos, a pO2 é de 25 a 40 torr e o pH ligeiramente mais ácido (7,2-7,3). O CO2 produzido difunde-se para o plasma e para as hemácias.

2. Nas hemácias, o CO2 é convertido a H2CO3 pela enzima anidrase carbônica.

3. O H2CO3 se dissocia no íon

bicarbonato HCO3- e um

próton H+. Parte do HCO3-

(~60%) difunde para o plasma, onde constitue o principal sistema tampão.

4. Uma parte pequena (~8%) do CO2 liga-se diretamente ao resíduo N-terminal de cada globina, formando a carbamino-Hb.

CO2 DIFUSÃO CO2 (1)

H2CO3

+H2OAnidrase carbônica

(2)

+

Cl

O HCO3-

transportado no plasma

representa 60% do CO2 formado

nos tecidos

HCO3- HCO3

- H+

Cl

(3)

HbNH3

+

HbNHCOO-

(4)

pO2 – 25 a 40 torr

HEMÁCIAS PLASMATECIDOS


5. O próton H+ gerado da dissociação do H2CO3 é tamponado por histidinas que ligam o heme.

6. Ao receber o próton, a HbO2 sofre o efeito Bohr, que resulta em uma diminuição da afinidade pelo o O2, facilitando a desoxigenação.

7. Concordando com o efeito Bohr, a Hb oxigenada é mais ácida (pK ~7.4) do que a Hb desoxigenada (pK ~7.6 ).

H2CO3

+H2OAnidrase carbônica

CO2 DIFUSÃO CO2

+

Cl

O HCO3-



nos tecidos

HCO3- HCO3

-

Cl

H+

HbNH3

+

Fe O2 HHCC

NN NHNH

HCHC CC

(5)

Fe2+ HHCC

NN NH2N

HCHC CC

HbNHCOO-

(5)

(6)O2 DIFUSÃO

(6)

pO2 – 25 a 40 torr

HEMÁCIAS PLASMAALVÉOLOS


8. No pulmão, a pO2 é de 100 torr e o pH é mais alcalino (pH ~7.6).

9. A Hb desoxigenada recebe O2 e libera os prótons H+ recebidos no tecido. O efeito Bohr agora resulta em um aumento da afinidade pelo o O2, facilitando a oxigenação.

10. Esses fatores fazem a anidrase carbônica catalizar a reação reversa, formando CO2 e H2O a partir de H2CO3, resultante da associação bicarbonato e H+.

HbNHCOO-

Fe2+ HHCC

NN NHNH2

HCHC CC

FeO2 HHCC

NN NNH

HCHC CC

HbNH3

+

O2 DIFUSÃO(9)

pO2 – 100 torr(11)

11. O CO2 ligado à Hb é liberado.

12. O CO2 difunde para o plasma e daí para os alvéolos.

H+

+ H2O

Anidrase carbônica

CO2

(10)

O HCO3-



nos tecidos

+

Cl

HCO3- HCO3

-

H2CO3

Cl

(10)

DIFUSÃOCO2

(12)

O 2,3-bifosfoglicerato (2,3 BPG) é um produto exclusivo do metabolismo das hemácias, formado a partir de um dos intermediário da via glicolítica, por uma enzima mutase específica.

Glicose

1,3 bifosfoglicerato

piruvato

2,3-BPG

Mutase(só em hemácias)

Via glicolítica nas hemácias

Vários mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio. O 2,3-difosfoglicerato é um regulador alostérico negativo da hemoglobina.

A ligação de uma molécula de 2,3 BPG à hemoglobina reduz a sua afinidade por O2,

facilitando a desoxigenação. O 2,3 BPG liga-se na cavidade central do tetrâmero da hemoglobina, estabilizado por interações

eletrostáticas com resíduos de carga positiva.

Na oxihemoglobina, a cavidade central é menor, expulsando o 2,3-DPG e aumentando a afinidade da molécula por O2.

A mudança conformacional que ocorre na primeira desoxigenação torna essa cavidade maior na desoxi-hemoglobina, possibilitando a ligação do 2,3-DPG.

A concentração plasmática de 2,3-DPG é constante, ~5 mM.

Populações que habitam regiões de elevada altitude, onde a atmosfera é

rarefeita, apresentam como mecanismo compensatório um aumento nos níveis da

enzima mutase que forma o 2,3 BPG.

Com concentrações plasmáticas mais elevadas de 2,3-BPG, e uma consequente diminuição da afinidade da Hb por O2, não

há prejuizo da oxigenação dos tecidos, apesar da pO2 atmosférica mais baixa eventualmente não ser suficiente para

saturar 100% a Hb.

A regulação da afinidade da hemoglobina pelo O2 é um somatório do efeito Bohr e do 2,3 –bifosfoglicerato, além da cooperatividade positiva.

Stripped Hb – Hb sem nenhum modulador

Whole blood – Hb em sangue total, com todos seus moduladores

A figura ilustra a somatória de efeitos moduladores negativos do 2,3 BPG e do CO2 (efeito Bohr) sobre a afinidade da hemoglobina para o oxigênio.

Observe como a P50 (pressão parcial de O2 que satura 50% das moléculas) aumenta progressivamente a medida que os moduladores são adicionados ao meio.

O efeito Bohr (presença de CO2) e o 2,3-BPG, juntos, diminuem em cerca de 2,6 vezes a afinidade da Hb pelo O2.

50%

Evolução das globinas

heme mioglobina

hemoglobina

Na evolução das globinas, houve um evento de duplicação gênica, e depois, divergência de cada um dos genes através de mutações pontuais, que acabaram

originando as duas cadeias globínicas da atual hemoglobina.

Ontogenia das hemoglobinas humanas

A hemoglobina A (HbA), composta das cadeias e , corresponde a 96-98 % da hemoglobina total de um adulto.

Um variante normal da hemoglobina A, correspondente a 2-3% da hemoglobina total em adultos, é a HbA2, formada por cadeias e (delta), ou seja, .

No adulto, a Hemoglobina A resulta da expressão co-dominante de 2 genes que codificam a cadeia e de 4 genes que codificam a cadeia .

Durante a vida embrionária e fetal, diferentes genes para as globinas são expressos sucessivamente.

Existem 17 genes para globinas no genoma humano.

Hb embrionárias

Hb Gower 1

Hb Gower 2

Hb Portland

Hb Fetal

Hb adulto

Ontogenia das hemoglobinas humanas: 17 genes codificando cadeias globínicas

idade gestacional idade pós-natal (semanas) (semanas)

nasci

men

to

O gráfico e a tabela mostram a sucessão de diferentes hemoglobinas e a sua composição em cadeias globínicas presentes no embrião, feto (após a 12a. semana) e no adulto. Após o nascimento, com a repressão da síntese da cadeia e aumento da síntese da cadeia , ocorre a troca da HbF pela HbA, que se completa entre o 3o e 4o mês de vida. Nessa fase são muito importantes os “banhos de luz” dados na criança, pois estes auxiliam na degradação de derivados tóxicos do heme, formados na destruição das hemácias fetais.

A Hemoglobina Fetal (HbF)A Hemoglobina Fetal (HbF)

• A HbF possue cadeias (gama) equivalentes à cadeia dabA, com10 aminoácidos diferentes nas sequências primárias dessas globinas.

• Uma das substituições importantes na HbF é a posição 82 da cadeia , que possui um resíduo de serina (polar sem carga), diferentemente da cadeia que tem lisina (Lys82; com carga positiva) nessa posição.

• Essa substituíção resulta numa ligação mais fraca do 2,3-DPG, que interage com as globinas por interações eletrostáticas, à HbF. • Como resultado, a HbF apresenta maior afinidade por O2 do que a HbA materna, possibilitando a captação de O2 a nível da barreira placentária.

Ligação do 2,3-BPG com a hemoglobina A

Hemoglobinopatias

• Como existem 4 alelos de cadeia e 2 de cadeia expressos co-dominantemente, são conhecidos mais mutantes de cadeia (produzem 50 % de Hb anômala) do que de cadeia (produção de 25 %de Hb anômala).

• Hemoglobinopatias podem resultar de mutações nos genes estruturais das globinas, ou ainda nos genes reguladores da síntese das diferentes globinas, que é o caso das talassemias.

• Mutações pontuais nos genes das globinas e são relativamente frequentes. Em outubro de 2003 já eram conhecidos mais de 900 tipos de hemoglobinas anômalas contendo a troca de 1 aminoácido na cadeia a ou na cadeia b.• Mutações duplas, inserções e deleções são casos mais raros.

A figura acima ilustra posições na sequência primária de cadeias ou para as quais são conhecidos mutantes pontuais de Hb com alterações na estabilidade e/ou solubilidade da proteína ou na afinidade por oxigênio, que resultam em patologias.

Observe que a grande maioria dessas posições estão em “cotovelos” da molécula, onde as -hélices não existem. Mutantes das histidinas proximal e distal (posições 92 e 63 na cadeia , respectivamente), podem resultar em incapacidade de ligar O2.

6

23

42

63

92 93

121

7976

73

145

143

A tabela mostra exemplos de hemoglobinas anormais que são mutantes pontuais.

Hemoglobina* Anormal

Resíduo Normale Posição

Substituição

Cadeia Alfa(4 alelos)

Torino Fenilanina43 ValinaMBoston Histidina 58 TirosinaChesapeake Arginina92 LeucinaGGeorgia Prolina9 LeucinaTarrant Aspartato126 AsparaginaSuresnes Arginina141 Histidina

Cadeia Beta (2 alelos)

S Glutamato6 ValinaRiverdale-Bronx Glicina 24 ArgininaGenova Leucina ProlinaZurich Histidina 63 ArgininaMMilwaukee Valina 67 GlutamatoMHydePark Histidina 92 TirosinaYoshizuka Asparagina108 Aspartato

Hiroshima Histidina 146 Aspartato

* Variantes da hemoglobina normalmente recebem o nome do local geográfico de origem

Hemoglobinas M apresentam substituições nas histidinas proximal ou distal, ou resíduos hidrofóbicos do bolsão do heme. Como resultado, nas HbM ocorre a oxidação do Fe2+a Fe3+, tornando-as incapaz de ligar O2.

Metahemoglobina é uma HbA normal oxidada a Fe3+, situação que pode ser causada por fumaça de cigarro, cianetos, etc.Não confundir metahemoglobina com HbM.

Hemoglobina S ou falciforme apresenta uma troca de uma resíduo ácido por um apolar, causando alterações na solubilidade da proteína, que passa a ter tendência de polimerizar. Não há alterações na afinidade pelo O2.

Algumas variantes de hemoglobina com importância clínica

Hemoglobina Origem geográfica

Substituição de Aminoácido

% presente em

heterozigotos

* Existem outros variantes de HbG de cadeia . A HbG Philadelphia é um variante de cadeia que frequentemente traz deleção dos alelos não afetados. Quando não ocorre deleção, existe ~20% de HbG, com deleção de 1 alelo, ~30% de HbG, e com deleção de 2 alelos, ~40% HbG.

*** HbD Punjab apresenta o mesmo tipo de mutação.

# Não é uma mutação pontual e sim um porduto de crossover durante a meiose.

Anemia falciforme e hemoglobina S (HbS)

A HbS apresenta um resíduo de valina na posição 6 da cadeia b, no lugar do ácido glutâmico presente na HbA.

Essa troca resulta em alteração da solubilidade da HbS, que apresenta tendência de polimerizar quando desoxigenada, formando fibras que se depositam dentro da hemácia, deformando-a.

Deformadas, essas hemácias são retiradas de circulação, causando o quadro anêmico.

A figura ao lado é uma micrografia de uma fibras de HbS, que se organizam por polimerização de muitas moléculas, conforme o esquema abaixo.

Fibra de HbS

Hemácia falcêmica

Hemoglobina S: a valina na posição 6 da cadeia da HbS faz interação hidrofóbica com resíduos Phe 85 e Leu 88 da cadeia de outra molécula de HbS, determinando

polimerização da HbS desoxigenada. A polimerização reverte quando a HbS fica 100% saturada. Não há alteração

da afinidade por O2, ou seja, o efeito Bohr, a ligação do 2,3-BPG e a cooperatividade não são afetados.

6

• Origem geográfica: região de São Leopoldo, RS, Brasil

• mutação pontual com substituição de Ser por Cys na posicão 9 da cadeia na região helicoidal A6

• por conter uma cisteína a mais, a HbPorto Alegre apresenta tendência de polimerizar, fazendo tetrâmeros via pontes –S-S-

• a polimerização é baixa in vivo, mas intensa em hemácias armazenadas (diminuição do poder redutor)

• veja artigo e texto complementar para mais informações.

A Hemoglobina Porto Alegre

Tetrâmero de HbPA

Microscopia eletrônica de tetrâmeros de HbPa

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