HEMOGRAMA AUTOMATIZADO

Interno CAMILO BECERRA MARTINEZServicio de Hematología General

INEN

HISTORIA

En los últimos 30 años se usaron distintos En los últimos 30 años se usaron distintos equipos que ovolucionaron desde los equipos que ovolucionaron desde los sistemas semiautomatizados de un solo sistemas semiautomatizados de un solo canal hasta los de multiples canales. canal hasta los de multiples canales. Capaces de evluar hasta 20 parámetros Capaces de evluar hasta 20 parámetros hematológicoshematológicos

AUTOMATIZADOS

Los contadores electronicos son más Los contadores electronicos son más precisosque las técnicas manuales.precisosque las técnicas manuales.

Se dispone de varios modelos de equipos.Se dispone de varios modelos de equipos. Miden diversos parámetros hematológicos.Miden diversos parámetros hematológicos. Analizan en forma comparativas las Analizan en forma comparativas las

muestras, rápido y con poco error.muestras, rápido y con poco error.

TIPOS PRINCIPALES

IMPEDANCIA DEL FLUJO ELECTRICOIMPEDANCIA DEL FLUJO ELECTRICO DISPERCIÓN DE LUZ PARA CONTAR DISPERCIÓN DE LUZ PARA CONTAR

LAS CELULASLAS CELULAS

Todo conteo celular comparte tres pasos básicos :

1. Dilución de la sangre2. Toma de muestra de una cantidad medida3. Enumeración de partículas

Ventajas de los métodos electrónicos :

1. Velocidad 2. Precisión3. Cálculo automatizado del Hematocrito y

constantes4. Impresión de resultados

El conteo diferencial manual está sujeto a varios errores Errores en la preparación del frotis Errores en la preparación del frotis Errores en la tinción del frotisErrores en la tinción del frotis Distribución celularDistribución celular Interpretación celularInterpretación celular Número de células contadasNúmero de células contadas

Un buen diferencial automatizado debe ser capaz de :

1. Identificar células normales y anormales2. Resultados reproducibles en conteos repetitivos3. El conteo debe exceder largamente ( 8,000 –

32,000 cel. ) al tradicional conteo manual ( 100 – 200 células )

1. El conteo debe llevarse a cabo en un mínimo lapso de tiempo

1. Se debe tener capacidad de almacenamiento de datos

TECNOLOGIA UTILIZADA Impedancia Eléctrica :

Contaje total de hematíes (RBC) Contaje total de leucocitos (WIC) Contaje total de plaquetas (PLT) VCM y VPM.

El sistema de impedancia eléctrica cuenta y detecta el tamaño de los eritrocitos, plaquetas y leucocitos. Este se basa en la detección de los cambios en la resistencia eléctrica producidos por una partícula suspendida en un diluyente conductor a su paso por una abertura.

TECNOLOGIA UTILIZADA

Colorimetría La medición directa de hemoglobina (HGB), se realiza por el método modificado de la cianmetahemoglobina, utilizando como fuente lumínica un diodo emisor de baja energía, a 540 nm.

TECNOLOGIA UTILIZADA

MPASS (Multi Angle Polarized Scatter Separation) : Contaje total de leucocitos (WOC) Diferencial de 5 poblaciones (fórmula) Reticulocitos El MPASS es un sistema de citometría de flujo y láser He/Ne.

PRINCIPIO DE MEDICIÓN POR EL MÉTODO

DE LA IMPEDANCIA ELÉCTRICA

Apertura

Estos equipos cuentan las células en una abertura pequeña, por registro de la modificación de la resistencia eléctrica provocada por su pasaje. La corriente continua regulada se desplaza entre dos electrodos de platino sumergidos en un diluyente conductor de electricidad, se coloca un puente aislado con una abertura entre los electrodos. Se suspenden as células en el diluyente y se movilizan a través del orificio a velosidad constante

VOLUMETRIA

No se puede obtener el recuento celular absoluto a menos que se conozca el volumen preciso de sangre total diluida que atraviesa la abertura durante el ciclo de recuento

Método de Conteo Celular por Dispersión de la Luz La snagre diluida pasa a través de un La snagre diluida pasa a través de un

detector de flujo celular colocado en el detector de flujo celular colocado en el trayecto de un rayo luminoso de foco trayecto de un rayo luminoso de foco cercano (láser). cercano (láser).

Cada célula provoca un cambio en el rayo y Cada célula provoca un cambio en el rayo y que genera un impulso eléctrico que se que genera un impulso eléctrico que se registra.registra.

Método de Conteo Celular por Dispersión de la Luz En algunos equipos el rayo crea patrones de En algunos equipos el rayo crea patrones de

dispersión que se emplean para definir el dispersión que se emplean para definir el tamaño de la célula, volumen, la tamaño de la célula, volumen, la configuración e indice de refracción.configuración e indice de refracción.

Technicon H-6000 y H-1Technicon H-6000 y H-1

Medida a 0ºMedida a 0º sirve para medir el sirve para medir el tamaño celulartamaño celular

Medida a 10ºMedida a 10ºmide la complejidad mide la complejidad celularcelular

Medida a 90ºMedida a 90º mide la superficie mide la superficie celular y la estructura internacelular y la estructura interna

( granularidad )( granularidad ) Medida a 90ºDMedida a 90ºD midemide

determinados tipos dedeterminados tipos de

granularidad celular granularidad celular

FOCALIZACIÓN DE CORRIENTE HIDRODINÁMICA

A medida que las células A medida que las células penetran en el área de penetran en el área de visualización específica, se visualización específica, se produce la interacción con produce la interacción con el rayo láser con ángulos el rayo láser con ángulos diferentes, que suministran diferentes, que suministran información sobre el tamaño información sobre el tamaño de la célula, la estructura de la célula, la estructura interna, la granularidad y la interna, la granularidad y la morfología de la superficie.morfología de la superficie.

Equipos OrthoEquipos Ortho Indice de RefracciónIndice de Refracción

RADIOFRECUENCIA (Conductividad )

La conductividad de las ondas de radio a través de las células, nos revelan su composición interna

TECNOLOGIA VCS

La tecnología VCS es el mecanismo por la cual los analizadores de hematología COULTER realizan la diferenciación de los diferentes tipos de leucocitos en 5 tipos: Neutrófilos, Linfocitos, Monocitos, Eosinófilos y Basófilos

La muestra (sangre) es mezclada con el rectivo, lo cual produce una rápida lisis de los eritrocitos y reduce los restos celulares sin alterar los leucocitos. Posterior a esta reacción se agrega el preservante de los leucocitos a fin de que resistan en su estado casi nativo las mediciones subsecuentes (Volumen, Conductividad y Scatter)

TECNOLOGIA VCS

PRINCIPIOS VCS

FLOWCELL: FLOWCELL:

La muestra una vez tratada es La muestra una vez tratada es dirigida a una celda de flujo dirigida a una celda de flujo (Flow cell) en la cual por el (Flow cell) en la cual por el diseño hidrodinámico, los diseño hidrodinámico, los leucocitos se alinean y pasan leucocitos se alinean y pasan formados uno a uno y en donde se formados uno a uno y en donde se realizan las siguientes mediciones realizan las siguientes mediciones

PRINCIPIO VCS

VOLUMEN:VOLUMEN:

Mediante impedancia Mediante impedancia de baja frecuencia se de baja frecuencia se determina el volumen determina el volumen de la célula de la célula

PRINCIPIO VCS

CONDUCTIVIDAD: CONDUCTIVIDAD: La conductividad de alta La conductividad de alta frecuencia de frecuencia de Radiofrecuencia (RF) Radiofrecuencia (RF) determina la determina la conductividad interna de conductividad interna de la célula la célula

PRINCIPIOS VCS

SCATTER: SCATTER:

La dispersión La dispersión (scatter) de luz láser (scatter) de luz láser indica la estructura y indica la estructura y forma de la célula forma de la célula

DF1: Volumen vs. Scatter DF1: Volumen vs. Scatter DF2: Volumen vs. DF2: Volumen vs.

Conductividad Conductividad DF3: Volumen vs. DF3: Volumen vs.

Conductividad extrayendo Conductividad extrayendo las señales de Neutrófilos las señales de Neutrófilos y Eosinófilos y Eosinófilos

Las lecturas de estas 3 señales análogas es enviadas al analizador para su amplificación y proceso, luego el sistema genera 3 gráficos

Eosinófilos

NeutrófilosPolinucleados

Linfocítos

MonocítosBasófilos

DF1

DF2

DF3

RF

DC

Centroide inicialDe los granulocitos

Centroide inicial deMonocitos

Centroide inicialDel estroma

CentroideInicial deLinfocitos

PARAMETROPARAMETRO PRINCIPIOPRINCIPIO

WBCWBC ImpedanciaImpedancia

RBC/PLTRBC/PLT Corriente Directa/ enfoque Corriente Directa/ enfoque hidrodinámicohidrodinámico

HGBHGB Lauril Sulfato de sodio (SLS ) Lauril Sulfato de sodio (SLS ) Cianmetahemoglobia. Fotométrico Cianmetahemoglobia. Fotométrico

HCTHCT Acumulación de la altura de los pulsosAcumulación de la altura de los pulsos

LY, MO, GRANLY, MO, GRAN Citometria ( MAPSS ), CD,Citometria ( MAPSS ), CD,

Radiofrecuencia ( RF )- VCSRadiofrecuencia ( RF )- VCS

EOEO CDCD

BASOBASO CDCD

IMIIMI RF, DC, RFRF, DC, RF

Retic %Retic % Citometria de flujo & fluorescenciaCitometria de flujo & fluorescencia

• El MCV es calculado sobre las bases de la sumatoria de la altura de los pulsos de las células rojas y dividido por el conteo de G.R.

• El volumen del paquete celular es calculado del MCV multiplicado por el conteo de células rojas

• El MCH es calculado del valor de la Hemoglobina y el conteo de G.R.

• El MCHC es calculado del valor de Hemoglobina y el Hematocrito

1. La turbidez producida por conteos elevados de células blancas, pueden alterar el valor de la Hemoglobina, MVC, y Hto.

2. En LLC y otras leucemias las células son fácilmente dañadas por laapertura, pudiendo aparecer falsos conteos bajos de leucocitos( WIC / WOC )

3. Títulos altos de aglutininas frías, que agregan los GR a temperaturaambiente, son responsables de macrocitosis y valores altos de MCHM

1. Hematocrito : se mide en % y representa la proporción total de GR en la sangre. no se mide directamente con los citómetros de flujo y se calcula a partir del VCM y en número de GR. Tiene menor presición

2. El hematocrito es medido electrónicamente :“ el pulso que es generado cuando los GR pasan a través de laabertura es proporcional a su volumen “. Se determina comparando elvolumen total o acumulado de GR al volumen total de sangre en los 11.7ul de la dilución 1:500

+ 3%

0%

-3%

HCM

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 +3%

0%

- 3%

+ 3%

0%

-3%

VCM

CCMH

Gráfica de Control de los Indices Eritrocitarios

+ 3%

0%

-3%

+3%

0%

- 3%

+ 3%

0%

-3%

Desplazamiento del VCM yHCM en la misma dirección, signo deobturación parcial del orificio de recuento

VCM

HCM

CCMH

+ 3%

0%

-3%

+3%

0%

- 3%

+ 3%

0%

-3%

VCM

HCM

CCMH

Desviación de la HCM y CCMH en el mismo sentido decreciente,causada por desajustes en la calibración de la Hb o recuento de hematíes

+ 3%

0%

-3%

+3%

0%

- 3%

+ 3%

0%

-3%

VCM

HCM

CCMH

Patrón con un pico de desviación positiva del VCM y HCM, causada por la incorporación de muestras de enfermos con marcada macrocitosis.

10 -

8 -

6 -

4 -

2 -

0 -

-2 -

-4 -

-6 -

-8 -

-10 -

- 12 -

0 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 12.0 24.0 48.0

Effect of specimen storage at room temperature ( 18º - 20ºC ) 0n the completeblood count parameters of the Abbott CD 3500 blood analyzer.

WBC

RBC

HB

MCV

PLT

HCT

Ch

ange

( %

)

Time ( h )

Efecto del almacenamiento a temperatura ambiente ( 18 -20 ºC ) sobre el conteodiferencial de leucocítos, resultados del autoanalizador hematológico Abbott CD 3500

Ch

ange

( %

)

Time ( h )

10

0

-10

-20

-30

-40

-50

-60

20

0 0.5 1 2 4 8 12 24 48

v

Eosinófilos

Monocitos

Basófilos

Neutrófilos

Linfocitos

Sismex SF - 3000

SX - 21

COULTER

CELL DYN 3500 El equipo autoanalizador realiza la medición de 22 El equipo autoanalizador realiza la medición de 22

parámetros hematológicos de la sangreparámetros hematológicos de la sangre.. Utiliza la medición por impedancia y dispersión de Utiliza la medición por impedancia y dispersión de

luz láser.luz láser. Algunos parámetros son medidos directamente y Algunos parámetros son medidos directamente y

algunos son calculados.algunos son calculados. Los leucocitos, hematíes y plaquetas se miden por Los leucocitos, hematíes y plaquetas se miden por

impedancia eléctrica, la fórmula diferencial por flujo impedancia eléctrica, la fórmula diferencial por flujo óptico. La hemoglobina por espectrofotometría.óptico. La hemoglobina por espectrofotometría.

En cada ciclo la muestra es aspirada, diluida y En cada ciclo la muestra es aspirada, diluida y mezclada y se realizan las mediciones de cada mezclada y se realizan las mediciones de cada parámetro.parámetro.

SISTEMA MODULAR TOTALMENTE AUTOMATIZADOCELL DYN 4000, CON EL LAMINADOR SMS – 5H2901

                                 

CELL DYN 4000

El Cell-Dyn 4000 es el primer analizados El Cell-Dyn 4000 es el primer analizados hematológico automatizado para ofrecer el análisis hematológico automatizado para ofrecer el análisis de anticuerpos monoclonales. A través del uso de un de anticuerpos monoclonales. A través del uso de un láser de un Ion de Argón.láser de un Ion de Argón.

el CD4000 es único manteniendo el descubrimiento el CD4000 es único manteniendo el descubrimiento fluorescente NRBCs, reticulocítos y viabilidad de fluorescente NRBCs, reticulocítos y viabilidad de WBC. WBC.

Además, el análisis de plaqueta óptico y el linealidad Además, el análisis de plaqueta óptico y el linealidad de WBC extendidode WBC extendido

CELL DYN 4000

La citometría de flujo fluorescenteLa citometría de flujo fluorescente.. el ADN-ARN marcadoel ADN-ARN marcado.. la medida de la impedancia del flujo.la medida de la impedancia del flujo. Los datos automáticamente generados Los datos automáticamente generados

incluyen la nuclealidad en la cuenta de incluyen la nuclealidad en la cuenta de la célula de serie roja, reticulocítos con la célula de serie roja, reticulocítos con la razón de inmadurez y el factor de la razón de inmadurez y el factor de viabilidad celular blanco. viabilidad celular blanco.