HERRAMIENTAS MOLECULARESAl estudiar el comportamiento biolgico de las molculas que componen las clulas vivas, la Biologa molecular roza otras ciencias que abordan temas similares: as, por ejemplo, juntamente con laGenticase interesa por la estructura y funcionamiento de los genes y por la regulacin (induccin y represin) de la sntesis intracelular de enzimas y de otras protenas. Con laCitologa, se ocupa de la estructura de los corpsculos subcelulares (ncleo, nuclolo, mitocondrias, ribosomas, lisosomas, etc.) y sus funciones dentro de la clula. Con la Bioqumica estudia la composicin y cintica de las enzimas, interesndose por los tipos de catlisis enzimtica, activaciones, inhibiciones competitivas o alostricas, etc. Tambin colabora con la Filogentica al estudiar la composicin detallada de determinadas molculas en las distintas especies de seres vivos, aportando valiosos datos para el conocimiento de la evolucin.7.1.1 Sntesis del DNALa replicacin del DNA es el proceso por el cual la informacin contenida en el DNA es perpetuada. La replicacin del DNA es semiconservadora. Cada Cadena de DNA acta como molde para la sntesis de una nueva cadena. El resultado son dos molculas de DNA nuevas, cada una con una cadena nueva y otra vieja.Este proceso se denomina replicacin semiconservadora. La sntesis del DNA progresa invariablemente en direccin 5' 3.Y por lo tanto es semidiscontinua. La replicacin empieza en un punto de origen y normalmente avanza de forma bidireccional formando una doble horquilla. La replicacin es muy precisa. La replicacin tiene lugar con un grado extraordinario de fidelidad. En E. coli se comete un error cada 1010 nucletidos incorporados.El DNA es sintetizado por DNA polimerasas. Se conocen numerosos tipos de Polimerasas tanto en procariotas como en eucariotas, pero su mecanismo de accin es similar en todos los casos: todas ellas actan sintetizando una doble cadena complementaria a la doble cadena deDNA preexistente y todas ellas requieren un cebador inicial, cadena corta de RNA, para poder proceder a la sntesis de DNA.Los orgenes de replicacin son los puntos fijos, situados en la doble hlice de DNA, a partir de los cuales se lleva cabo la replicacin, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla. La cantidad de DNA que se puede sintetizar a partir de un nico origen de replicacin se denomina replicn o unidad funcional de replicacin.El genoma bacteriano es un replicn nico circular. En organismos eucariotas, la replicacin del ADN se inicia en mltiples orgenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay multitud de replicones.

REPARACIN Y MUTAGENESIS DE DNAUna de las fuentes de variabilidad gentica que han hecho posible la evolucin es la mutacin o cualquier cambio heredable en la secuencia de nucletidos del material gentico (ADN) de un organismo. Las mutaciones suponen la alteracin del genotipo, o constitucin gentica del individuo, y en ocasiones tambin del fenotipo que son las caractersticas externas del individuo.Las mutaciones ocurren al azar, esto se descubri en un experimento en el que se hicieron 10 cultivos de 10 (8) clulas cada uno. A cada cultivo se le aadi el fago T1, las clulas eran deE. coli. Si las mutaciones no ocurren al azar cabra esperar que el nmero de colonias resistentes fuera ms o menos igual en cada cultivo, si la mutacin es al azar se espera gran variabilidad en el nmero de colonias resistentes en cada tubo. As, se comprob, que la mutacin era al azar.Las mutaciones pueden afectar a uno (puntuales), unos pocos (pseudopuntuales) o a un gran nmero de nucletidos de una secuencia de ADN (cromosmicas).Tipos de mutacionesPuntuales y pseudopuntualesCambios de base transiciones: Purina por purina y pirimidina por pirimidina transversiones: Purina por pirimidina y pirimidina por purinaDesfases (cambio en el nmero) delecin insercinCromosmicas deleciones duplicaciones inversiones translocacionesLas mutaciones pueden ser espontneas mediante varios mecanismos diferentes, incluyendo errores de replicacin del DNA y lesiones fortuitas de ste; o mediante mutgenos. Los mutgenos son agentes que aumentan la frecuencia de mutagnesis, generalmente alterando el DNA y en este caso son inducidas.Mutaciones espontneasErrores en la replicacin del DNADurante la sntesis del DNA puede producirse un error en la replicacin porque se forme un emparejamiento ilegtimo de nucletidos como A-C que da lugar a la sustitucin de una base por otra.Cada una de las bases aparece en el DNA en una de varias formas llamadastautmerosque son ismeros que se diferencian en las posiciones de sus tomos y en los puentes que se forman entre ellos. Esas formas estn en equilibrio. La forma ceto es la que se encuentra normalmente en el DNA mientras que las formas imino o enol son menos frecuentes. La capacidad del tautmero menos frecuente de una base de emparejarse errneamente y producir mutaciones durante la replicacin del DNA fue puesta de manifiesto por primera vez por Watson y Crick. A estos emparejamientos errneos se les llama cambios tautomricos.Tambin pueden ocurrir emparejamientos errneos cuando una de las bases se ioniza, esto sucede con ms frecuencia que los cambios tautomricos.TransicionesTodos los emparejamientos errneos anteriores producen mutaciones por transicin, en las que una purina es sustituida por otra purina y una pirimidina es sustituida por otra pirimidina.TransversionesNo pueden realizarse por emparejamientos errneos como los debidos a cambios tautomricos.Pero s pueden realizarse si una base sufre un cambio tautomrico mientras que la otra base rota sobre su enlace glucosdico y quedan enfrentadas sus cargas.DesaminacinEs una de las ms frecuentes debido a la inestabilidad qumica, afectando gravemente a la replicacin del ADN provocando transiciones. En este caso la base se modifica antes de la replicacin debido a los radicales que provoca el metabolismo.La Desaminacin de citosina produce uracilo, as los resduos de uracilo que no sean reparados se emparejarn con adenina durante la replicacin produciendo la conversin de un par GC en uno AT, se produce una transicin.Cambios de faseEstas mutaciones pueden ser inserciones o deleciones.Las inserciones se producen por un deslizamiento o resbaln de la cadena sintetizada con lo que se forma un lazo de varios pares de bases. En la siguiente ronda de replicacin se aadirn tantas bases como comprenda el lazo ya que cuando se produce el resbaln sigue replicndose por donde se qued antes del resbaln.Las deleciones se producen por un deslizamiento o resbaln de la cadena molde, como las que hay que copiar no se pueden no se aaden a la cadena hija.DespurinizacinEl ADN pierde de alguna manera alguna de sus bases y si hay un hueco la reparacin introduce una base.La frecuencia de las mutaciones espontneas es generalmente baja.MECANISMOS DE REPARACIONEl nivel de fidelidad de las copias de DNA es muy alto, debido a:1. La especificidad enzimtica de la maquinaria replicativa2. La correccin de errores de las DNA polimerasas mediante prueba de lecturaDetectan nucletidos incorrectos y los eliminan hacia atrs (actividad exonucleasa 3 - 5)3. Los mecanismos de reparacin post-replicativosa) Reparacin directa. La regin daada se corrige in situLa DNA fotoliasa utiliza energa de la luz para eliminar los dmeros de pirimidina formados por radiacin UVb) Reparacin por escisin de basesLas bases daadas se retiran y se reemplazanc) Reparacin por escisin de nucletidosSe elimina y se reemplaza un fragmento en torno a la zona daadaLa escinucleasa urvABC escinde 12 nucletidos en la zona daadaRegeneracin a cargo de la DNA Pol I y la DNA ligasa.

RECOMBINACION DE DNALarecombinacin genticaes el proceso por el cual una hebra de material gentico (usualmenteADN, pero tambin puede serARN) se corta y luego se une a unamolculade material gentico diferente.Eneucariotasla recombinacin comnmente se produce durante lameiosis, como entrecruzamiento cromosmicoentre loscromosomasapareados. Este proceso conduce a que la progenie tenga combinaciones de genes diferentes a las de sus padres y puede produciralelosquimricos.En biologa evolutiva se cree que esta mezcla de genes tiene varias ventajas, incluyendo que permite a los organismos que se reproducen sexualmente y evitar eltrinquete de Muller.Enbiologa molecular, "recombinacin" tambin se refiere a la recombinacin artificial y deliberada de piezas de ADN distintas, a menudo de diferentes organismos, creando lo que se llamaADN recombinante.Ciertasenzimasllamadasrecombinasascatalizan las reacciones de recombinacin natural.RecA, la recombinasa encontrada enEscherichia coli, es responsable de la reparacin de las roturas en el ADN bicatenario.En levaduras y otros organismos eucariotas se necesitan dos recombinasas para reparar esas roturas. La protenaRAD51es necesaria para las recombinacionesmitticaymeitica, mientras que la protenaDMC1es especfica de la recombinacin meitica.

Existen varios tipos de recombinacin gentica en lasclulaseucariotas:Recombinacin homloga

Larecombinacin homloga(tambin llamada recombinacin general) sucede durante laprofase Ide lameiosisy tiene lugar entre las largas regiones de ADN cuyas secuencias son homlogas, es decir altamente similares aunque no idnticas.

Entrecruzamiento cromosmicoSe denomina as a la recombinacin entre loscromosomasapareados, generalmente durante lameiosis. Durante la profase I, en la sub-fase de paquitene, las cuatro cromtidas disponibles estn estrechamente posicionadas una con respecto a la otra. En esta disposicin los sitioshomlogosen las dos cromtidas pueden coincidir entre s, y pueden intercambiar informacin gentica.

Como la recombinacin puede producirse en cualquier lugar del cromosoma, lafrecuencia de recombinacinentre dos puntos depende de la distancia entre ambos. Por lo tanto, para genes suficientemente distantes en el mismo cromosoma la frecuencia de recombinacin es lo suficientemente alta para destruir la correlacin entrealelosrecombinantes.

En clulas BLasclulas Bdelsistema inmunitariorealizan una recombinacin gentica llamadacambio de clase de inmunoglobulinas. Es un mecanismo biolgico que cambia un anticuerpo de una clase a otra, por ejemplo, de un isotipo llamado IgM a otro llamado IgG.

Conversin gnicaEn la conversin gnica, una seccin de material gentico se copia de un cromosoma a otro, pero deja el cromosoma donante sin cambios.

7.2.1 La recombinacin genticaLarecombinacin genticaes el proceso por el cual una hebra de material gentico (usualmenteADN, pero tambin puede serARN) se corta y luego se une a unamolculade material gentico diferente. Eneucariotasla recombinacin comnmente se produce durante lameiosis, comoentrecruzamiento cromosmico entre loscromosomasapareados. Este proceso conduce a que la progenie tenga combinaciones de genes diferentes a las de sus padres y puede produciralelos quimricos. En biologa evolutiva se cree que esta mezcla de genes tiene varias ventajas, incluyendo que permite a los organismos que se reproducen sexualmente y evitar eltrinquete de Muller.Enbiologa molecular, "recombinacin" tambin se refiere a la recombinacin artificial y deliberada de piezas de ADN distintas, a menudo de diferentes organismos, creando lo que se llamaADN recombinante.Ciertasenzimasllamadasrecombinasascatalizan las reacciones de recombinacin natural.RecA, la recombinasa encontrada enEscherichia coli, es responsable de la reparacin de las roturas en el ADN bicatenario. En levaduras y otros organismos eucariotas se necesitan dos recombinasas para reparar esas roturas. La protenaRAD51es necesaria para las recombinacionesmitticaymeitica, mientras que la protenaDMC1es especfica de la recombinacin meitica.7.2.2 La expresin gnicaLaexpresin gnicaes el proceso por medio del cual todos los organismosprocariotasyclulas eucariotastransforman la informacin codificada por loscidos nucleicosen lasprotenasnecesarias para su desarrollo y funcionamiento.En todos los organismos el contenido delADNde todas sus clulas es idntico. Esto quiere decir que contienen toda la informacin necesaria para la sntesis de todas las protenas. Pero no todos losgenesse expresan al mismo tiempo ni en todas lasclulas.Exceptuando a losgenes constitutivos(genes que se expresan en todas las clulas del organismo y codifican protenas que son esenciales para su funcionamiento general) todos los dems genes se expresan o no dependiendo de la funcin de la clula en un tejido particular. Por ejemplo, genes que codifican protenas responsables del transporteaxonalse expresan enneuronaspero no enlinfocitosen donde se expresan genes responsables de larespuesta inmune. Tambin existe especificidad temporal, esto quiere decir que los diferentes genes en una clula se encienden o se apagan en diferentes momentos de la vida de un organismo. Adems, la regulacin de los genes vara segn las funciones de stos.

7.2.3 El procesamiento del ARNLa transcripcin de genes que codifican protenas crea un transcrito primario de ARN en el lugar donde se encuentra el gen. Este discurso puede ser alterado antes de ser traducido, esto es particularmente comn en las clulas eucariotas. El procesamiento del ARN ms comn es el empalme para eliminar losintrones. Los intrones son segmentos de ARN que no se encuentran en el ARN maduro, a pesar de que pueden funcionar como precursores, por ejemplo, para snoARNs, que son ARN que realizan la modificacin directa de los nucletidos en otro ARNs. Los intrones son comunes en los genes eucariotas, pero rara en los procariotas. El procesamiento del ARN, tambin conocido como modificacin post-transcripcional, puede comenzar durante la transcripcin, como es el caso para el empalme, en donde el espliceosoma elimina los intrones del ARN recin formado. El procesamiento del ARN extenso puede ser una ventaja evolutiva posible por el ncleo de los eucariotas. En los procariotas la transcripcin y la traduccin (ver abajo) suceden al mismo tiempo, mientras que en los eucariotas la membrana nuclear separa los dos procesos que dan tiempo para que el procesamiento del ARN se produzca.Maduracin del ARN no codificanteEn la mayora de los organismos los genes no codificantes (ncARN) se transcriben como precursores que someterse a una transformacin posterior. En el caso de ARN ribosmico (rARN), a menudo se transcribe como un pre-rARN que contiene uno o ms rARN, la pre-rARN se rompe, con modificaciones (2'-O-metilacin y la formacin de pseudouridina) a sitios especficos de nucleolo, aproximadamente 150 diferentes especies restringidas pequeas de ARN, llamadas ARN pequeo nucleolar (snoARNs), que, como ARNsn's, snoARNs estn asociados con protenas, formando snoPRNs. En los eucariotas, en particular, un snoPRN, llamado RNasa MRP rompe el pre-45S rRNA en el 28S, 5,8 S, y 18S rARN. El rARN y los factores de procesamiento del ARN son agregados de forma grande llamado elnucleolo. En el caso de ARN de transferencia (tARN), por ejemplo, la secuencia 5 'se elimina por la RNasa P, mientras que el extremo 3' se elimina por la enzima Z tRNase. En el caso de micro ARN (miARN), los miARNs se transcriben primero como transcripciones de primaria o pri-miARN con una gorra y cola poli-A y procesados cortamente como, 70-madre de nucletidos, estructuras de bucle conocidas como pre-miARN en el ncleo celular por las enzimas Drosha y Pasha, luego de ser exportados, es luego procesada para madurar los miRNAs en el citoplasma por la interaccin con laendonucleasaDicer, que tambin se inicia la formacin del RNA-inducido silenciando el complejo (RISC), integrada por la protena Argonauta.La exportacin de ARNEn los eucariotas ms maduros el ARN debe ser exportado al citoplasma del ncleo. Si bien algunas funciones de ARN en el ncleo, muchas molculas de ARN son transportados a travs de los poros nucleares y en elcitosol. En particular, esto incluye todos los tipos de ARN que participan en la sntesis de protenas. En algunos casos el ARN es adems transportado a una parte especfica del citoplasma, como la sinapsis, que son luego arrastrados por las protenas motoras a travs de protenas que se unen a secuencias especficas de vinculador ( llamados "cdigos postales") en el ARN.Traduccion del ARNLa traduccin es el paso de la informacin transportada por el ARN-m a protena. La especificidad funcional de los polipptidos reside en su secuencia lineal de aminocidos que determina su estructura primaria, secundaria y terciaria. De manera, que los aminocidos libres que hay en el citoplasma tienen que unirse para formar los polipptidos y la secuencia lineal de aminocidos de un polipptido depende de la secuencia lineal de ribonucletidos en el ARN que a su vez est determinada por la secuencia lineal de bases nitrogenadas en el ADN.Los elementos que intervienen en el proceso de traduccin son fundamentalmente: los aminocidos, los ARN-t (ARN transferentes), los ribosomas, ARN-r (ARN ribosmico y protenas ribosomales), el ARN-m (ARN mensajero), enzimas, factores proteicos y nucletidos trifosfato (ATP, GTP).El primer paso que tiene que producirse es la activacin de los aminocidos y formacin de los complejos de transferencia. Los aminocidos por s solos no son capaces de reconocer los tripletes del ARN-m de manera que necesitan unirse a un ARN de pequeo tamao (constante de sedimentacin 4S) llamadoARN adaptador,ARN solubleoARN transferente. Crick (1958) postul la necesidad de la existencia de un adaptador que acoplar cada aminocido a su correspondiente codn.