Herramientas  diagnós.cas  para  la  determinación  de  alérgenos  en  

alimentos  

 Mgr.,  Bqca.  Patricia  Silvina  Knass  Romer  Labs  La:n  America  Adviser  

Resumen  de  la  presentación  

•  ¿Porqué  vamos  a  analizar?  •  ¿Qué  vamos  a  analizar?  •  ¿Cuales  son  las  técnicas  disponibles?  •  ¿Cuales  son  las  fortalezas  y  debilidades  de  algunos  métodos?  

•  Errores  y  problemas  comunes  en  el  análisis  de  alérgenos  

•  Cuando  analizar  •  Validación  

¿Porqué  vamos  a  analizar?  

•  Las  verdaderas  alergias  alimentarias  presentan  una  respuesta  inmunológica  a  proteínas  específicas  de  algunos  alimentos.    

•  Los  métodos  analí:cos  pueden  determinar  las  proteínas  de  interés  o  el  material  gené:co  que  produce  esas  proteínas  (DNA)  

•  El  método  analí:co  debe  ser  lo  más  específico  posible  para  el  producto  de  interés.    

•  El  método  analí:co  debe  ser  capaz  de  detectar  el/los  analito/s  de  interés  bajo  una  gran  variedad  de  circunstancias  (procesos  a  los  que  se  somete  al  alimento,  incluyendo  el  tratamiento  térmico)  

Retiro de Productos

mercado ‘Allergen-free’

Interés de los medios

Protección de la marca

Alérgenos alimentarios = riesgo para la inocuidad alimentaria

Legislación y estándares

Determinación  de  Alérgenos:  Tendencias  

Cual  es  el  escenario  para  el  analista?  

Validaciones  &  Aprobaciones  

Unidades  y  definiciones  

Toma  de  muestra  

Niveles  umbral  

Calibración  

Test  kits      

El  análisis  es  solo  una  pequeña  parte  

¿Qué  vamos  a  analizar?  (donde  buscar  alérgenos)  

•  Ingredientes  o  materias  primas.    •  Productos  terminados.  •  Muestras  ambientales.    •  Limpieza  

o  Superficies  en  contacto  con  alimentos  o  Agua  de  enjuague  o  Primera  porción  de  la  producción  

¿Qué  vamos  a  analizar?  Analitos:  alérgenos/marcadores  

Proteínas  involucradas  

en  las  reacciones  adversas  

Marcadores  DNA  

Proteína  no  involucrada  en  la  reacción  adversa,  

pero  caracterís:ca  del  

alimento  considerado  

como  alergénico  

 Qué marcador estamos utilizando?

¿Cuáles  son  las  técnicas  disponibles?  •  Métodos  inmunoquímicos:  

o  ELISA  o  Disposi.vos  de  Flujo  lateral  (FLD)  o  Mul.plex  

•  Métodos  de  biología  molecular:  o  PCR  o  Mul.plex  

•  Espectrometría  de  masas  •  Genéricos/No  específicos  (limpieza)  

o  Proteínas  o  ATP  o  Inspección  visual  

•  Otros  métodos  

Selección  de  un  método  para  detectar  alérgenos  

•  Propósito  •  Tipo  de  muestra  •  Matriz  o  producto  •  Efecto  del  Procesamiento  •  Tiempo  de  Respuesta  •  Disponibilidad  de  recursos  

ELISA  •  Detección  de  la  proteína  específica  (u  otra  asociada)  por  medio  de  an:cuerpos  

•  ELISA  Sándwich  es  más  común  en  métodos  para  alérgenos  

•  1    a  2  horas  para  el  análisis  •  Cualita:vo  o  Cuan:ta:vo  •  Empleado  para  ingredientes,  productos  finales,  muestras  ambientales,  hisopos,  agua  de  enjuague.  

Ventajas  y  Limitaciones  del  ELISA  

Ventajas •  Sensible (ppm) •  Cuantitativo o

semicuantitativo •  Anticuerpos que detectan

proteínas alergénicas o marcadoras

•  Relativamente rápido •  Poco equipamiento •  Nivel de habilidad: medio

Limitaciones •  Entrenamiento /Seguir el

protocolo •  Muestreo •  Extracción •  Matriz (polifenoles, pH,

procesamiento, aceites) •  Tipo de proteína •  Falta de matrices de

referencia •  Necesidad de validación

“in house”

Y  además….  (cuando  monitoreamos  después  de  la  limpieza)  

•  Cuando  la  proteína  alergénica  se  desnaturaliza  (detergentes,  procesos)  se  presentan  falsos  nega:vos.  

•  En  presencia  de  leche  de  soja,  no  se  detecta  gluten  con  el  an:cuerpo  R5  cuando  se  extrae  con  EtOH  60%  

•  La  prueba  inmunoquímica  puede  verse  afectada  por  la  presencia  de  residuos  de  detergentes  o  desinfectantes.  

Métodos  alterna.vos!!!!!!  

FLD  (.ras)  •  Dispositivos basados en la tecnología ELISA. (Cualitativos / Semi-

cuantitativos) •  Se visualiza con la aparición de una línea de color •  Muestras ambientales, verificación de limpieza, screening de

alimentos. •  Rápidos (10´) / In Situ

PCR  

Método  cualita.vo      DNA,  primers,  dNTPs,  

polimerasa,  termociclador    Desnaturalización  (95°C)   Unión  del  primer      Síntesis  de  DNA    (DNA-­‐

polimerasa    72°C)    Siguiente  ciclo  

 →  Electroforesis  en  gel  de  

agarosa  

PCR  •  Método para la detección del DNA específico de la especie

(no la proteína alergénica) •  Es un método cualitativo donde se amplifica el DNA

específico y luego se detecta. •  Es útil cuando los resultados de ELISA son cuestionables

(proteínas liofilizadas, para aceites – problemas con la extracción acuosa-, lecitina de soja en leche en polvo)

•  Se requiere de habilidad y equipamiento más costoso.

Real.me  PCR  

Método  cuan.ta.vo  

   Sonda  adicional  de  ADN          (TaqMan  probe)    

    Ciclo  umbral    

Realtime PCR

•  PCR  en  Tiempo  Real  es  un  método  cuan:ta:vo  

•  Se  adiciona  una  sonda  específica  de  ADN    •  Cuando  la  sonda  encuentra  el  target,  se  

elimina  el  quencher  y  se  emite  una  señal  fluorescente.  

•  Durante  la  reacción  se  mide  la  fluorescencia  en  el  termociclador.  

•  La  cuan:ficación  se  lleva  a  cabo  a  par:r  del  ciclo  umbral  (Ct  value).    

•  La  can:dad  original  de  DNA  se  calcula  con  estándares  internos.  

Mar:n  Röder,  Stefan  Vieths,  Thomas  Holzhauser,  Sensi:ve  and  specific  detec:on  of  poten:ally  allergenic  almond  (Prunus  dulcis)  in  complex  food  matrices  by  Taqman®  real-­‐:me  polymerase  chain  reac:on  in  comparison  to  commercially  available  protein-­‐based  enzyme-­‐linked    immunosorbent  assay,  Analy:ca  Chimica  Acta,  Volume  685,  Issue  1,  24  January  2011,  Pages  74-­‐83,)    

Espectrometría  de  Masas    •  Detecta  proteínas  y  pép:dos  •  Extracción,  cleanup,  ionización,  separación  de  las  proteínas/pép:dos  

ionizados,  detección  •  Alto  grado  de  sensibilidad  y  resolución  •  Provee  información  de  la  composición  proteica,  estructura  y  

secuencia.    •  Detección  y  confirmación  de  la  proteína  en  un  solo  paso  •  Detección  y  cuan:ficación  de  pép:dos  sencilla.  

Ventajas  y  Limitaciones  de  MS  Ventajas •  Identificación y

cuantificación certera de las proteínas alergénicas

•  Método muy sensible •  Método de elección para

la confirmación

Limitaciones •  Mucha experiencia •  Equipamiento costoso •  Laborioso y gran inversión

de tiempo •  Se requiere de extracción

y cleanup •  No es útil para los

procedimiento de rutina

hpp://www.intechopen.com/books/a-­‐comprehensive-­‐survey-­‐of-­‐interna:onal-­‐soybean-­‐research-­‐gene:cs-­‐physiology-­‐agronomy-­‐and-­‐nitrogen-­‐rela:onships/proteomics-­‐and-­‐its-­‐use-­‐in-­‐obtaining-­‐superior-­‐soybean-­‐genotypes  

Antes  de  los  métodos  no  específicos….  

Validación  y  Verificación  

•  Los  procedimientos  de  limpieza  requieren  de  ambos:  de  validación  y  verificación  

•  Validación  –  que  la  limpieza  será  efec:va  •  Verificación  –  que  la  limpieza  fue  efec:va    

Validación  y  Verificación  Métodos  de  Validación   Métodos  de  Verificación  

 ELISA   Pruebas  rápidas  para  alérgenos  

Microbiología  tradicional   Bioluminiscencia  de  ATP  Métodos  PCR  (DNA)   Proteínas  (colorimetría)  

Toma  de  muestra  para  validar  la  limpieza  •  Debe  asegurar  la  recuperación  de  los  residuos  de  alérgenos  de  la  superficie  o  del  producto  final,  y  el  nivel  de  recuperación  y  repe:bilidad  debe  ser  suficiente  para  cumplir  con  los  criterios  definidos  para  considerar  efec:va  la  limpieza.  

•  Donde,  cuando  y  como  deben  tomarse  las  muestras  puede  inferir  en  el  resultado  de  la  validación.  

Toma  de  muestras:  Aguas  de  lavado  y  enjuague  •  Agua  de  enjuague:  solo  cuando  no  pueda  accederse  al  equipo  (CIP)  •  Agua  de  lavado:  si  se  recicla  o  si  es  común  (lavado  de  bandejas  o  

utensilios.  •  Agua  de  pre-­‐enjuague  y  de  enjuague  (para  verificar  la  reducción  del  

alérgeno)  •  Material  de  purga:  limpieza  a  seco  (industria  farmacéu:ca)  Análisis  de  agua  de  enjuague  y  primer  producto  para  determinar  maní  (4  limpiezas/3  muestras)  

Etapa  de  la  limpieza   ELISA  para  maní  (ug/ml)   Test  de  Bradford  (ug/ml)   Resultado  

Agua  de  enjuague  

       Pre-­‐lavado   98,5  –  1.379   85,9  –  917,6   posi:vo  

       Luego  de  limp.  alc.   ND   ND   nega:vo  

       Luego  de  limp.  Ac.   ND   ND   nega:vo  

Producto  

       Luego  de  limpieza   ND  –  1,1   ND   nega:vo  Stephan  et  al  (2004)  

Toma  de  muestras:  Superficies  •  Hisopos  pre-­‐humedecidos  (compa:bles  con  el  método  analí:co  

seleccionado)  •  Enjuague  de  partes  con  una  can:dad  conocida  de  solución  de  

extracción.  •  En  caso  de  polvos  alérgenos  (harinas)  permi:r  que  se  asiente  antes  

de  tomar  la  muestra.  

Toma  de  muestras:  Producto  final  

•  Primer  producto  del  lote  (luego  de  la  limpieza)  •  Verificar  que  las  materias  primas  no  contengan  alérgeno  

Método  no  específico:  Bioluminiscencia  de  ATP  

•  Efec.vidad  de  la  sani.zación    •  Detecta  ATP  proveniente  de  fuentes  biológicas  •  Hisopos  convencionales  de  ATP  (higiene)  •  Hisopos  de  alta  sensibilidad  (residuos  de  alimentos)  •  Ventajas:    

–  rápido  (<  30  segundos)  –  Más  económico  que  ELISA  –  La  prueba  se  lleva  a  cabo  in  situ  (“:empo  real”)  

•  Limitaciones:  Aplicación  (limpieza  húmeda  de  superficies)  •  Puede  tomar  ATP  de  la  fuente  de  suministro  de  agua  •  Mide  la  presencia  de  ATP,  no  de  alérgenos  •  Indicador  de  alérgeno:  solamente  validando  y  correlacionando  con  

prueba  alérgeno-­‐específica    

Método  no  específico:  Proteínas  totales    •  Efec.vidad  de  la  sani.zación    •  Ventajas:    

–  rápido  (<  30  segundos)  – Más  económico  que  ELISA  – Mide  proteínas  

•  Limitaciones:  Aplicación  (limpieza  húmeda  de  superficies)  –  Determina  todas  las  proteínas  (no  solo  alérgenos)  

 Desacos  en  la  detección  de  alérgenos  

•  Falta  de  materiales  de  referencia  

•  Sin  estandares  cer.ficados  disponibles    Qué  an.cuerpo  detecta  la  „proteína  correcta“??  

•  For:ficación  diwcil  –  Extracto  de  la  proteína  (que  se  detecta?)  –  Alérgeno  (alimento)  –  For:ficar  extracto  –  For:ficar  muestra  

¿Cuando  analizar  alérgenos?  

•  Inves:gación  de  reclamos  •  Validación  de  métodos  de  limpieza  •  Validación  de  materias  primas  •  (Análisis  del  producto  terminado?)  

Herramientas  diagnós.cas  para  la  determinación  de  alérgenos  en  

alimentos  

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