Herstellung von rekombinantem Erythropoietin in immobilisierten Insektenzellen

Der Technischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Zur Erlangung des Grades

Dr.-Ing.

vorgelegt von

Tobias Weidner

aus Hirschau

Als Dissertation genehmigt

von der Technischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 25.02.15

Vorsitzende des Promotionsorgans: Prof. Dr.-Ing. habil. M. Merklein

1. Gutachter: Prof. Dr. R. Buchholz

2. Gutachter: Prof. Dr. T. Brück

Meiner Familie

“Experience is what you get when you didn't get what you wanted.”

Randy Pausch

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung ........................................................................................................................................ V

Abstract......................................................................................................................................................... VI

1 Einleitung ................................................................................................................................................ 1

2 Stand des Wissens .................................................................................................................................. 2

2.1 Insektenzellen ................................................................................................................................ 2

2.2 Das Baculovirus ............................................................................................................................. 2

2.2.1 Lebenszyklus des Baculovirus ................................................................................................. 3

2.2.2 Einfluss der Baculovirusinfektion auf die Zelle ...................................................................... 5

2.2.3 Einfluss auf das Zytoskelett ..................................................................................................... 5

2.2.4 Einfluss auf den Zellzyklus ...................................................................................................... 6

2.2.5 Unterdrückung der zellulären Abwehr ................................................................................... 6

2.2.6 Kontroverse Ansichten zum lytischen Zyklus des Baculovirus............................................. 7

2.3 Einsatz des Baculovirus ................................................................................................................ 7

2.3.1 Biopestizid ................................................................................................................................. 8

2.3.2 Proteinherstellung ..................................................................................................................... 8

2.4 Proteinherstellung in Insektenzellen............................................................................................ 9

2.4.1 Proteinaufreinigung .................................................................................................................. 9

2.4.2 Glykoproteine .......................................................................................................................... 11

2.4.3 Glykosylierungspotential von Insektenzellen ....................................................................... 13

2.5 Gesichtspunkte bei der Kultivierung von Insektenzellen ........................................................ 14

2.5.1 Schädigung durch Gaseintrag ................................................................................................ 15

2.5.2 Zugabe von protektiven Substanzen ..................................................................................... 16

2.5.3 Speziell für Insektenzellen geeignete Reaktorsysteme ......................................................... 17

2.5.4 Scherarme Kultivierungssysteme .......................................................................................... 17

2.5.5 Immobilisierte Hochzelldichtesysteme.................................................................................. 18

2.5.6 Zellrückhalt durch Membranen ............................................................................................. 19

2.5.7 Immobilisierung durch Zelleinschlussverfahren .................................................................. 20

3 Problemstellung.................................................................................................................................... 22

4 Methoden .............................................................................................................................................. 23

4.1 Allgemeine Zellkultur ................................................................................................................. 23

4.1.1 Silikonisierung von Erlenmeyerkolben ................................................................................. 23

4.1.2 Kryokultivierung..................................................................................................................... 23

4.1.3 Bestimmung der Zellkonzentration und der Vitalität von Suspensionskulturen............... 23

4.1.4 Batch-Kultivierung mit Suspensionszellen ............................................................................ 23

4.2 BVES in Suspension .................................................................................................................... 24

I

Inhaltsverzeichnis

4.2.1 Virusherstellung ...................................................................................................................... 24

4.2.2 TCID50 zur Bestimmung des Virustiters ................................................................................ 24

4.2.3 Amplifikation rekombinanter Viren ...................................................................................... 24

4.2.4 Proteinherstellung ................................................................................................................... 25

4.2.5 Kultivierung mit Proteaseinhibitor ........................................................................................ 25

4.3 Immobilisierung durch Verkapseln ........................................................................................... 25

4.3.1 Verkapselung nicht infizierter Zellen .................................................................................... 25

4.3.2 Verkapselung infizierter Zellen ............................................................................................. 26

4.4 Immobilisierung im Hohlfaserreaktor (HFR) ............................................................................ 26

4.4.1 Bestimmung der Verweilzeit (VWZ) ..................................................................................... 27

4.4.2 Vorbereitung des HFR ............................................................................................................ 27

4.4.3 Aufbau und Vorbereitung der Reaktorperipherie ................................................................ 28

4.4.4 Kultivierung im HFR .............................................................................................................. 30

4.5 Zellanalytik .................................................................................................................................. 31

4.5.1 Messung der Sauerstoffverbrauchsrate der Suspensionszellen ........................................... 31

4.5.2 Messung des Sauerstoffprofils über die Kapselgeometrie ................................................... 32

4.5.3 Identifizierung der infizierten Zellen .................................................................................... 33

4.5.4 Bestimmung des Zellzyklus mit Propidiumjodid (PJ) .......................................................... 33

4.5.5 Zellsynchronisation................................................................................................................. 33

4.5.6 Tracking der Zellteilung mit CFDA-SE ................................................................................. 33

4.5.7 Bestimmung der Glukosekonzentration im Kulturmedium ................................................ 33

4.5.8 Bestimmung der Laktatkonzentration im Kulturmedium ................................................... 33

4.6 Proteinanalytik ............................................................................................................................ 35

4.6.1 Probenvorbereitung und Zellaufschluss ............................................................................... 35

4.6.2 Gesamtproteinfällung ............................................................................................................. 35

4.6.3 SDS-Gelelektrophorese ........................................................................................................... 35

4.6.4 2D-Gelelektrophorese ............................................................................................................. 36

4.6.5 Western-Blot ............................................................................................................................ 37

4.6.6 ELISA ....................................................................................................................................... 38

4.6.7 Bradford-Assay ....................................................................................................................... 39

4.6.8 IMAC-Affinitätschromatographie gegen den His-Tag ......................................................... 41

4.6.9 Lektin-Affinitätschromatographie von Glykoproteinen ...................................................... 43

5 Ergebnisse ............................................................................................................................................. 44

5.1 Kultivierung einer Sf 21 Suspensionskultur .............................................................................. 44

5.1.1 Nicht infizierte Kultur ............................................................................................................ 44

5.1.2 Virusherstellung und Amplifikation ..................................................................................... 47

II

Inhaltsverzeichnis

5.1.3 Infizierte Kultur ....................................................................................................................... 48

5.2 In Hohlkapseln immobilisierte Zellen ....................................................................................... 54

5.2.1 Kultivierung nicht infizierter Sf 21 ......................................................................................... 54

5.2.2 Proteinproduktion................................................................................................................... 56

5.3 Im Hohlfaserreaktor immobilisierte Zellen ............................................................................... 61

5.3.1 Verweilzeitverhalten ............................................................................................................... 61

5.3.2 Vorversuche zur Kultivierung von Sf 21 ............................................................................... 64

5.3.3 Optimierte Kultivierung von Sf 21 ......................................................................................... 65

5.3.4 Proteinproduktion................................................................................................................... 69

5.4 Proteinanalytik ............................................................................................................................ 71

5.4.1 Etablierung des anti-EPO Westernblots ................................................................................ 71

5.4.2 Etablierung der IMAC Affinitätschromatographie............................................................... 73

6 Fehlerbetrachtung ................................................................................................................................ 82

6.1 Trypanblau-Färbung in Suspensionszellen ............................................................................... 82

6.2 Trypanblau-Färbung in Kapselkulturen .................................................................................... 82

6.3 Bestimmung der Zellkonzentration im Hohlfaserreaktor ........................................................ 83

7 Diskussion............................................................................................................................................. 85

7.1 Proteinanalytik ............................................................................................................................ 85

7.1.1 Loses Nickelsepharosegel ....................................................................................................... 85

7.1.2 Evaluierung der IMAC-Affinitätschromatographie ............................................................. 85

7.1.3 Kopplung der IMAC mit weiteren chromatographischen Methoden ................................. 87

7.1.4 Bewertung der Ergebnisse ...................................................................................................... 88

7.2 Sauerstoffaufnahmerate der Insektenzellen .............................................................................. 89

7.3 Kultivierungssysteme mit nicht infizierten Zellen .................................................................... 92

7.4 Kultivierungssysteme mit infizierten Zellen ............................................................................. 96

7.4.1 Infizierte Suspensionskulturen .............................................................................................. 97

7.4.2 Infizierte immobilisierte Kulturen ......................................................................................... 99

7.4.3 Infektionsrate in immobilisierten Kulturen ......................................................................... 100

7.5 Bewertung der einzelnen Systeme ........................................................................................... 100

7.5.1 Proteinexpression in den Kulturüberstand ......................................................................... 101

7.5.2 Handhabung bei Vorbereitung und Kultivierung im Labormaßstab................................ 102

7.5.3 Proteinproduktion................................................................................................................. 103

7.5.4 Sauerstoffeintrag in die Kultursysteme ............................................................................... 104

7.6 Fazit ............................................................................................................................................ 110

8 Ausblick .............................................................................................................................................. 112

8.1 Optimierung in der Prozessführung und –analytik................................................................ 112

III

Inhaltsverzeichnis

8.2 Optimierung in der Proteinreinigung und –analytik.............................................................. 112

Literaturverzeichnis ................................................................................................................................... 114

Abbildungsverzeichnis .............................................................................................................................. 124

Tabellenverzeichnis ................................................................................................................................... 126

Formelverzeichnis ...................................................................................................................................... 128

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................................. 129

9 Anhang ................................................................................................................................................ 133

9.1 Weitere Daten ............................................................................................................................ 133

9.1.1 Suspensionskultivierung ...................................................................................................... 133

9.1.2 ELISA ..................................................................................................................................... 133

9.1.3 Immobilisierung in Kapseln ................................................................................................. 134

9.1.4 Immobilisierung im HFR ...................................................................................................... 135

9.1.5 Kalibrierkurven ..................................................................................................................... 137

9.1.6 Proteinanalytik ...................................................................................................................... 140

9.2 Puffer und Lösungen ................................................................................................................ 142

9.2.1 Zellkultur ............................................................................................................................... 142

9.2.2 Analytik ................................................................................................................................. 143

9.3 Medium ...................................................................................................................................... 148

9.4 Antikörper ................................................................................................................................. 149

9.5 Kitsysteme ................................................................................................................................. 149

9.6 Chromatographie-Säulen .......................................................................................................... 149

9.7 Chemikalien und Reagenzien ................................................................................................... 150

9.8 Laborequipment ........................................................................................................................ 152

9.9 Verbrauchsmaterialien .............................................................................................................. 153

9.10 Software ..................................................................................................................................... 154

9.11 Sequenz des rekombinanten Erythropoietins ............................................................................ 154

IV

Zusammenfassung

Zusammenfassung Im Herstellungsprozess rekombinanter Proteine vieler Forschungslabore und weltweiter Pharmaun-ternehmen nimmt das Baculovirusexpressionssystem (BVES) einen festen Platz ein. Die Attraktivität basiert auf kurzen Entwicklungszeiten, einer variablen Plattform und der Stärke des viralen Expres-sionssystems. Bestrebungen, die Insektenzellen genetisch mit den Enzymen zur Synthese humanglei-cher Glykolysierungen auszustatten, erweitern das Einsatzgebiet auf dem Markt der therapeutischen Proteine. Ein großes Manko des BVES ergibt sich jedoch aus den Auswirkungen der viralen Infektion auf den Metabolismus, die Integrität und letztendlich auch auf die Scherempfindlichkeit der Insekten-zellen: Unter anderem abhängig von der Scherbeanspruchung der Zellen im Kultivierungssystem führt eine Baculovirusinfektion nach wenigen Tagen der Produktionsphase zu einer Lyse der Zellen. Dabei frei werdende Proteasen können das Zielprotein zersetzen und daher die Ausbeute vermin-dern.

Diese Arbeit greift nun in einem pragmatischen Ansatz die Problematik der Zelllyse und der kurzen Produktionsphase auf. Die mögliche Verzögerung des Absterbens der Zellen und damit eine Verlän-gerung der Produktionsphase durch einen physikalischen Schutz der infizierten Zellen (Immobilisie-rung) bilden dabei den wesentlichen Bestandteil der zugrundeliegenden Arbeitshypothese. Danach ergibt sich die Motivation, in einem Vergleich einer standardmäßigen Suspensionskultivierung mit zwei immobilisierten Kultivierungskonzepten (Verkapselung und Hohlfaserreaktor) den „proof of concept“ der Arbeitshypothese zu erbringen.

Die Expression des Modellproteins Erythropoietin (EPO) und die Sezernierung in den Kulturüberstand konnte dabei in allen Kultursystemen nachgewiesen werden. Dabei wurde die Produktionsphase von 4 Tagen in Suspensionskultivierung mit einer Produktionsrate von 6,4∙10-2 mIU∙Z-1d-1 EPO auf 10 Tage im Hohlfaserreaktor (1,0∙10-2 mIU∙Z-1d-1) bzw. auf etwa 60 Tage (5,6∙10-2 mIU∙Z-1d-1) in den verkapselten Ansätzen verlängert. Die gleichzeitige Realisierung von Hochzelldichtebedingungen mit über 1,0∙107 Z∙ml-1 durch die Immobilisierung führte, approximiert auf den Gesamtprozess, zu einer etwa 2,5-fachen Steigerung der Gesamtausbeute an EPO im Hohlfaserreaktor (18,4∙106 mIU) sowie einer etwa 100-fachen Steigerung in den Kapseln (804∙106 mIU).

Dennoch offenbarten tiefer gehende Untersuchungen einen weiteren Optimierungsbedarf, um in den immobilisierten Kulturen die Proteinproduktionsrate der Suspensionszellen zu erreichen. Mit Defizi-ten in der Sauerstoffversorgung und der Infektionsrate in den derzeit bestehenden Systemen konnten erfolgreich Ansatzpunkte identifiziert werden. Die Kernpunkte zur Verbesserung der Kultivierungs-bedingungen beruhen deshalb auf der Verkleinerung des Kapseldurchmessers bzw. der Verbesserung der Sauerstofflöslichkeit der Membranen im Hohlfaserreaktor.

V

Abstract

Abstract The baculovirus expression vector system (BEVS) is a well-established technology and one of the ma-jor methods of protein expression not only in basic research but also applicable for the generation of therapeutic proteins. Due to the high productivity of a virus-based expression system it provides sci-entists with a simple, versatile and – after 30 years of research - still evolving instrument: Lately, the art of genetic engineering delivered insect cells with enzymes needed to mimic human glycosylation patterns, further enhancing its attraction for pharmaceutical applications. Nevertheless, the foremost drawback of the BEVS lays within the consecutive effects of the virus infection on metabolism and integrity of the host cell, proclaimed in literature as the lytic cycle of the baculovirus. Shortly, altera-tions in the protein expression forced by the virus and a swelling of the infected cells lead to an in-creased shear sensitivity and furthermore to cell death after few days of protein production. The fol-lowing rupture and consequential release of proteases can degrade the protein of interest and dimin-ish the total yield of the product.

This thesis addresses the bottleneck of the production phase, limited due to the cell lysis, in a prag-matic approach with the hypothesis, that a physical barrier around the cells (immobilization) may protect them against shear forces in the reactor and thus lengthen the expression of the protein of in-terest. To circumstantiate the hypothesis, a comparison between a typical suspension cultivation of infected cells and two forms of immobilization, the encapsulation of cells and the cultivation in a hol-low fiber reactor (HFR), was conducted.

Expression and secretion of the model-protein erythropoietin (EPO) was demonstrated in each of the mentioned cultivation system. Thereby the protein expression phase could be expanded from 4 days in suspension culture with a production rate of 6.4∙10-2 mIU EPO per cell and day to 10 days in HFR (1.0∙10-2 mIU∙c-1∙d-1) and 60 days in encapsulated cells (5.6∙10-2 mIU∙c-1∙d-1). The prolonged time of pro-duction merged with the implementation of a high-density cultivation (more than 1.0∙107 c∙ml-1) pro-vides a proof of concept with an approximated 2.5-fold increased yield of epo in the hfr and 100-fold increase in the encapsulated process resulting in a total production yield of 18.4∙106 and 804∙106 mIU respectively.

Further investigations indicated a deficient supply of oxygen and unsatisfying rates of infection. Con-sequently the optimization process for the immobilized cultivation is not yet concluded. As crucial aspects to enhance the performance of the immobilized cultivation methods, the reduction of the cap-sule diameter and the improvement of the oxygen solubility within the membranes in the hollow fiber reactor were identified.

VI

Einleitung

1 Einleitung Gut 150 Jahre vor Entschlüsselung des strukturellen Aufbaus der DNA durch Watson und Crick be-gann Jenner mit der Impfung von James Phipps gegen Kuhpocken die Ära der biotechnologisch her-gestellten Therapeutika (Watson und Crick 1953; Huygelen 1996). Weitere Meilensteine folgten da-nach erst 1921 mit der Isolierung von Insulin (Banting 1926) und der Entdeckung des Penicillins (Fle-ming 1929). Die weltweiten Bestrebungen, immer spezifischere und wirksamere Medikamente zu generieren, mündete mit der Entdeckung der Hybridom-Technik und der Herstellung monoklonaler Antikörper in die Entwicklung der proteintherapeutischen Arzneimittel (Köhler und Milstein 1975). Heutzutage stehen für die Produktion der Proteine wie Antikörper, verschiedene Interferone oder das Wachstumshormon Erythropoietin mit Bakterien, Hefen, Pflanzen-, Insekten- oder Säugerzellkulturen eine Palette an Expressionssystemen zur Verfügung (Jayaraj und Smooker 2009; Wurm 2004). Der immer weiter expandierende Absatzmarkt therapeutischer Proteine zeigt sich auch in einer weltwei-ten Umsatzsteigerung von 63,8 Milliarden $ in 2006 auf ein Volumen von 140 Milliarden $ in 2013 (La Merie Publishing 2014).

Nicht zuletzt aufgrund der Komplexizität dieser neuen Therapeutika ergeben sich in der Entwick-lungsphase enorme Anforderungen bei der Wahl und Optimierung der Produktionssysteme sowie strikte Reglementierungen und somit ökonomische Belastungen in den Zulassungsverfahren (Pronker et al. 2011). Die Wahl des Produktionsorganismus ist dabei meist sehr eingeschränkt, da die Aktivität von mittlerweile mehr als 70 % dieser Proteine, neben postranslationalen Modifikationen wie der Ausbildung von Disulfidbrücken, von der korrekten Ausbildung der meist komplexen (humanen) Glykolysierungsstruktur abhängig ist (Durocher und Butler 2009). Ohne vorherige genetische Mani-pulation sind daher oft einzig Säugerzelllinien wie Chinese Hamster Ovary-Zellen in der Lage, das Zielprotein in seiner aktiven Form zu synthetisieren. Trotz der aufwendigen Proteinreinigung zum Ausschluss einer Kontamination des Präparats mit Humanpathogenen sowie der vergleichsweise geringen Expressionsrate der Säugerzellen ist deren Einsatz oft alternativlos.

Bestrebungen einiger Forschergruppen, weitere Produktionsorganismen wie Insektenzellen genetisch mit den Fähigkeiten der humanen Glykosylierung auszustatten, rücken unter anderem das Baculovi-rusexpressionssystem in den Vordergrund (Contreras-Gómez et al. 2014). Seit der Entdeckung des viralen Systems zur Herstellung rekombinanten Proteins vor gut 30 Jahren (Smith et al. 1983) ist diese Technologie zu einer potenten und weit genutzten Plattform gereift, um Proteine zu Forschungszwe-cken sowie zur Herstellung von bespielsweise Impfstoffen gegen Hepatitis B mit einer den Säugerzel-len überlegenen Expressionsrate herzustellen (Oers et al. 2014; Cox 2012).

1

Stand des Wissens

2 Stand des Wissens

2.1 Insektenzellen

Seit der Entwicklung der ersten stabilen Insektenzelllinie in den 1960er Jahren konnten mindestens 260 weitere, überwiegend aus Eiern oder Embryonen von Invertebraten der Ordnung Lepidoptera, etabliert werden. Etwa 100 dieser Linien erlauben die Kultivierung von Baculoviren in vitro (Lynn 2007) und damit die Anwendung im Baculovirusexpressionssystem (BEVS). Die meist verwendeten Zellen auf diesem Gebiet resultieren aus Insekten der Gattung Spodoptera frugiperda mit der Zelllinie Sf 21 bzw. dem Subklon Sf 9 (Vaughn et al. 1977), Trichoplusia ni (Tn-5) und Bombyx mori (Bm5) (O'Reil-ly et al. 1994; Lynn 2007). Weitere Insektenzelllinien wie S2 Schneider Zellen, geeignet zur Proteinpro-duktion nach einer stabilen Transformation, wurden aus Drosophila gewonnen (Murhammer 2007).

Die Insektenzellen verfügen über einen vollständigen Citratzyklus und können neben der präferierten Kohlenstoffquelle Glukose auch andere Zucker wie Maltose und Fruktose verstoffwechseln. Zusam-men mit einer im Vergleich erhöhten Glukoseaufnahmerate weisen sie daher deutliche Unterschiede zum Metabolismus von Säugerzellen auf (Neermann und Wagner 1996; Ikonomou et al. 2003). Zusätz-liche Wege der Energiegewinnung sind den Insektenzellen durch den Pentose-Phosphatweg und der Oxidation von Glutamin - als Hauptenergiequelle unter den Aminosäuren - im Citratzyklus gegeben (Benslimane et al. 2005). Die Bildung von metabolischen Nebenprodukten ist dabei relativ gering, Laktat wird aufgrund des aktiven Citratzyklus in signifikanten Mengen ausschließlich unter Sauer-stoffmangel gebildet (Bernal et al. 2009).

2.2 Das Baculovirus

Die Familie der Baculoviren umfasst mindestens 64 bekannte Spezies (National Center for Biotechno-logy Information (US) 2014). Außer in Insekten sind die Viren nicht vermehrungsfähig. Diese Wirtsspezifität resultiert aus einer Co-Evolution der Viren über Millionen Jahre mit ihren arthropoden Wirten. Verschiedenste Baculoviren werden aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften als Biopesti-zide oder, rekombinant, zur Proteinherstellung eingesetzt.

Die filamentösen Baculoviren verfügen über ein stabförmiges Nucleocapsid mit einer Größe von 30-60 auf 250-300 nm, das die doppelsträngige, zirkulär angeordnete DNA mit 90 bis 180 kpb beinhaltet (Herniou et al. 2003). Von diesen Virionen sind zwei verschiedene Phenotypen vorherrschend: In der Überdauerungsform, den occlusion-derived virions (ODV), sind ein oder mehrere der Capside in einer kristallinen Proteinmatrix, dem occlusion body (OB), eingehüllt (Abbildung 2-1). Die OBs schützen die DNA vor Umwelteinflüssen und sind für die Primärinfektion des Insekts verantwortlich. Die budded virions (BV) entstehen nach Reproduktion eines einzelnen Virus durch Knospung aus infizierten Zel-len; dementsprechend ist das Virion hier von der Cytoplasmamembran der Wirtszelle umgeben (Monsma et al. 1996).

2

Stand des Wissens

Abbildung 2-1: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Nucleocapsiden: einzelne Virionen im Zellkern (links) sowie Capside mit mehreren Virionen vor der Einhüllung in den OB. Die Balken stellen ein Längenmaß von 0,1 µm dar (Fraser 1986).

Die taxonomische Einteilung der Familie der Baculoviren erfolgte bis in die 2000er Jahre aufgrund von morphologischen Charakteristika und unterschiedlichen Mechanismen bei der Bildung der ODV-Phenotypen in die zwei Gattungen der Nucleopolyhedraviren (NPV) und der Granuloviren (GV). Neben der Anzahl der eingebetteten Virionen unterscheiden sich die Viren zudem in der Infektiösität, der Zellspezifizität sowie in ihrer Zytopathologie (Herniou et al. 2004). Als Reaktion auf diverse phyloge-netische Studien zum Ursprung und der Evolution des Baculovirus (Herniou et al. 2003; Jehle et al. 2006) wurde 2008 vom International Committe on Taxonomy of Viruses (ICTV) die Einteilung revidiert und die Baculoviren in die Gattungen Alpha-, Beta-, Gamma- sowie Deltabaculovirus eingeordnet.

2.2.1 Lebenszyklus des Baculovirus

Das Autographa californica Multicapsid Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) gehört der Gattung der Alphaba-culoviren an und befällt die Larve des Nachtfalters Spodoptera frugiperda. Das Genom des Virus ist voll-ständig sequenziert und kodiert für 150 offene Leserahmen (Rohrmann 2001). In seiner Wildtyp-Form umgibt das Capsid eine schützende Proteinmatrix aus Polyhedrin (ODV), welches im Verlauf einer In-fektion durch einen starken Promotor exprimiert wird. Dieser Promotor eignet sich nach Austausch des Polyhydrin-Genes durch ein gene of interest (g.i.) auch zur Herstellung eines rekombinanten Pro-teins in einer in vitro Kultur von Insektenzellen (Luckow und Summers 1988). Sowohl der Infektions-zyklus des Wildtyps (WT) in vivo als auch der Verlauf einer Infektion einer Zelle mit rekombinantem Virus in vitro sind in Abbildung 2-2 schematisch dargestellt.

3

Stand des Wissens

Abbildung 2-2: Replikationszyklus des Baculovirus mit Darstellung der Primär- sowie Sekundärinfektion. Die

Primärinfektion des WT-Virus erfolgt nach Auflösung der Polyhedrinmatrix im Darm des Insek-tenwirtes. Die freigesetzten Virionen fusionieren mit der Membran der Epithelzellen und wer-den mit Hilfe des Aktinskeletts zum Kern transportiert. Dort findet die Virusreplikation statt. Die fertigen Virionen werden wiederum in eine Polyhedrinmatrix eingebettet oder knospen durch die Zytoplasmamembran, um in einer Sekundärinfektion weitere Zellen des Insekts zu befallen. Der Replikationszyklus eines rekombinanten Virus in vitro läuft ebenfalls nach dem Schema einer Sekundärinfektion ab; anstatt Polyhedrin wird das g.i. exprimiert, der rekombinan-te Virus liegt ausschließlich als budded virus vor (Monteiro et al. 2012).

Der Wildtyp des Baculovirus durchläuft einen bi-phasischen Replikationszyklus, der beide Formen der Capsid-Einhüllung (ODV und BV) beinhaltet. Ein rekombinantes Virus hingegen liegt aufgrund des fehlenden Polyhedrins ausschließlich als budded virus und damit im zweiten Teil des Replikations-zyklus vor. In Anbetracht der Genexpression lässt sich der Lebenszyklus temporär in drei aufeinan-derfolgende Phasen einteilen: die sehr frühe bzw. frühe Phase (0-6 h post infection, p.i.), die späte (6-18 h p.i.) und die sehr späte Phase (ab 18 h p.i.) (Passarelli und Guarino 2007; Passarelli und Miller 1993).

Die Infektion des Insekts mit AcMNPV beginnt mit der oralen Aufnahme der ODV (Keddie et al. 1989). Im alkalischen Milieu des Mitteldarms löst sich die Polyhedrinmatrix um die Virionen in Gegenwart von Proteasen auf (Wang und Granados 1997). Danach kommt es, vermittelt durch eine Reihe von Proteinen in der Hülle des Virions (per os infectivity factors, pif), zur Bindung an Rezeptoren der Epithelzellen des Darms (Horton und Burand 1993, 1993, Kikhno et al. 2002) und anschließend zur Primärinfektion über eine Fusion der Virushülle mit den Mikrovilli (Volkman 2007). Im Cytoplasma angekommen, initiieren Proteine auf der Oberfläche des Capsids eine Polymerisation von Aktin-Filamenten, welche dem Capsid hilft, den Zellkern zu erreichen (Ohkawa et al. 2010). Dort wird mit der Transkription von Virusgenen durch die RNA-Polymerase des Wirts die sehr frühe Phase der Infekti-

4

Stand des Wissens

on eingeleitet und die Virusreplikation sowie die Umprogrammierung des Metabolismus der Zelle vorbereitet (Passarelli und Miller 1993). Der Übergang in die späte Phase geht mit der Aktivierung der viruseigenen Replikationsenzyme einher (DNA-Polymerase, RNA-Polymerase). Die Vervielfältigung der Virus-DNA erfolgt zeitgleich mit der Expression von Komponenten, welche die Bildung von neu-en Nucleocapsiden unterstützen (Herniou et al. 2003). Die neu synthetisierten Capside verlassen den Zellkern und knospen nach dem Transport durch das Zytosol als budded viruses aus der Zellmembran. Dies geschieht bevorzugt in glycoprotein 64-reichen (GP64) Regionen der Membran. Hier lagert sich das Protein in der Phase der frühen Genexpression in der Membran an (Passarelli 2011; Monsma et al. 1996). Die budded viruses sorgen in der zweiten Phase des Replikationszyklus innerhalb des Insekts für eine systemische Infektion, indem weitere Zellen durch eine GP64-mediierte Endozytose befallen werden (Ohkawa et al. 2010). In diesen Zellen wiederholt sich der beschriebene Ablauf der Replikati-on. Die späte Phase der Infektion beginnt mit der Expression des Proteins Polyhedrin, das als Matrix die im Kern lokalisierten Virionen in ODV einschließt. Die vollständige Infektion des Insekts führt letztendlich zum Tod und zur Freisetzung der ODV in die Umwelt. Durch die Schutzhülle aus Po-lyhedrin bleiben die ODV auch über einen längeren Zeitraum infektiös und können nach oraler Auf-nahme weitere Tiere infizieren (Szewczyk et al. 2006).

Abbildung 2-3: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Capsiden: Darstellung beim Knospen durch die Zellmembran (links) sowie extrazellulärer budded virus (rechts). Die Balken stellen ein Längen-maß von 0,1 µm dar (Fraser 1986).

2.2.2 Einfluss der Baculovirusinfektion auf die Zelle

Neben den beschriebenen Vorgängen greift das Virus innerhalb seiner Replikationsphasen auf man-nigfaltige Weise in den Metabolismus der Wirtszelle ein. Bernal et al. konnten zeigen, dass aus einer Baculovirusinfektion eine erhöhte Aktivität im katabolen Stoffwechsel resultiert (Bernal et al. 2010; Monteiro et al. 2014). Weitere Untersuchungen zeigen, dass eine Kaskade von viruseigenen Proteinen mit Mechanismen der Zelle interagiert, um Zellstrukturen sowie die Genexpression zu manipulieren oder über einen Zellzyklusarrest bzw. die Unterbindung einer Apoptosekaskade die Zellvorgänge an die Bedürfnisse des Virus anzupassen.

2.2.3 Einfluss auf das Zytoskelett

Ein primäres Ziel des Virus nach dem Passieren der Zellmembran ist die Manipulation des Zytoske-letts der Zelle. Dies beginnt direkt nach dem Eindringen mit der Reorganisation der Aktin-Filamente (Cudmore et al. 1997). Verschiedene Oberflächenproteine des Nucleocapsids (VP39, P78 sowie VP80) binden direkt an Aktin und fördern den Aufbau von filamentösen Strukturen. Dieser Mechanismus

5

Stand des Wissens

geschieht vor jeglicher viraler Genexpression und gewährleistet den Transport des Virions zum Zell-kern (Ohkawa et al. 2010; Xu et al. 2007; Marek et al. 2011; Marek et al. 2012).

Ein Protein der frühen Genexpression des Baculovirus, der actin-rearrangement-inducing factor 1 (arif-1), ist verantwortlich für eine weitere Alternierung der zelleigenen Aktin-Struktur. Arif-1 induziert die die Ausprägung von Aktin-Filamenten, die von der Zellmembran ausgehend nach innen ins Zyto-plasma gerichtet, aufgebaut werden (Dreschers et al. 2001; Roncarati und Knebel-Mörsdorf 1998).

Ein weiterer Eingriff in das Zytoskelett zielt auf die Bildung von Aktin-Filamenten im Zellkern und der damit verbundenen Unterstützung und Stabilisierung der Nucleocapsid-Aggregation ab (Volk-man 1988; Kasman und Volkman 2000). Dieser Prozess startet mit der Akkumulation von Aktin-Monomeren bereits während der frühen Phase der Genexpression und zieht sich bis in die späte Pha-se (Blissard und Rohrmann 1991; Milks et al. 2003). Nachgewiesen sind bisher eine Kaskade von Prote-inen wie Transkriptionsfaktoren (Ie-1 und Pe38), ein Protein zur Prozessierung von RNA (he65), sowie weitere Faktoren, wie ac004, ac102 und ac152, deren Funktion noch nicht näher charakterisiert werden konnte (Cibulka et al. 2012; Nguyen et al. 2013). Die eigentliche Polymerisation der Aktin-Monomere zu filamentösem Aktin geschieht im Zuge der späten Genexpression (Charlton und Volkman 1991). Zeitgleich dazu startet die Expression des späten viralen Proteins P10, welches in und um den Kern zu einer Art Netzwerk polymerisiert. So wird der aufgrund der Anhäufung von viralen Proteinen und Virionen geschwollene Zellkern stabilisiert und während der ODV-Bildung vor einem Zerplatzen bewahrt (Carpentier et al. 2008). Nach der Reifung der Virionen werden diese, wiederum unter Nut-zung des zelleigenen Zytoskeletts und, initiiert von Faktoren des Virus (EXON0, ac93 und Bm61), zu den Knospungsstellen an der Zellmembran transportiert (Fang et al. 2009; Shen und Chen 2012).

2.2.4 Einfluss auf den Zellzyklus

Der Zellzyklus einer Zelle regelt den Ablauf der DNA-Replikation und der Zellteilung. Der zeitliche Ablauf der einzelnen Phasen (G1, S und G2/M) und so das Fortschreiten im Zellzyklus wird durch äußere Einflüsse sowie durch Botenstoffe der Zelle in Form von Cyclinen bzw. cyclin-abhängigen Kinasen geregelt (Morgan 1995). Verschiedenste Viren besitzen die Fähigkeit, in den Zellzyklus der Wirtszelle einzugreifen und sich so eine Umgebung zu schaffen, die für eine maximale Vervielfälti-gung der Viren-DNA geeignet ist (Monteiro et al. 2012). Auch für den Baculovirus konnte diese Stra-tegie mit einem Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase nachgewiesen werden. Die Proliferation der Wirtszelle wird eingestellt und deren Proteinexpression vollständig von der vireneigenen abgelöst. Der Arrest bietet zudem dem Virus eine optimale Umgebung für eine Reifung der Virionen. Weiterhin hat dieser Zustand Auswirkungen auf die Integrität der Zelle wie ein beständig vergrößerter Zellkern, eine erniedrigte Steifigkeit der Zellmembran und das Vorhandensein von Mikrovesikeln im Nukleus (Braunagel et al. 1998).

2.2.5 Unterdrückung der zellulären Abwehr

In Antwort auf eine Infektion und die Übernahme der Steuerung der Zellvorgänge durch das Virus besitzen Zellen verschiedene Abwehrmöglichkeiten wie die Einleitung einer Hitzeschock-Reaktion oder die des programmierten Zelltods, der Apoptose. Die Aktivierung der Hitzeschock-Antwort leitet zum Schutz zelleigener DNA und Proteine eine instentane Expression etlicher Chaperone ein. Wie ge-zeigt werden konnte, können die angestrebten Abwehrmechanismen jedoch durch das Virus ausge-hebelt werden. So sind verschiedene Chaperone essentiell für die virale Genexpression sowie für den korrekten Aufbau der Virionen (Monteiro et al. 2012). Zudem kodiert das Genom des Baculovirus für das Protein P35, das die Aktivator-Kaskade der Apoptose unterdrückt (Clem 2001).

6

Stand des Wissens

2.2.6 Kontroverse Ansichten zum lytischen Zyklus des Baculovirus

Trotz der beschriebenen Unterbrechung der Apoptosekaskade und der Einleitung eines sogenannten pro-survival-pathways durch das Virus (Monteiro et al. 2012) ist für den Baculovirus ein „lytischer Zyk-lus“, einsetzend in der sehr späten Phase der Infektion nach 72 Stunden, schon seit Beginn der inten-siven Forschungsaktivität auf diesem Gebiet publiziert (Clem et al. 1991). Ein genetischer Hintergrund für das Absterben der Zellen konnte bisher nicht ermittelt werden, jedoch gelang es Ho et al. durch eine nicht näher beschriebene, zufällige Punktmutation in einem rekombinanten Baculovirus eine etwa zehnfach verbesserte Vitalität in der späten Phase der Infektion zu erreichen (Ho et al. 2004).

Identifiziert wurden hingegen zwei Enzyme, die zwar nicht mit dem Zelltod direkt in Verbindung stehen, jedoch in vivo die Auflösung des Wirts und somit die Freisetzung der ODV katalysieren: eine Chitinase (chiA) sowie eine Cathepsin Protease (V-CATH). Dass die Enzyme nur in Abhängigkeit von-einander die Fähigkeit besitzen, die Larve aufzulösen, konnte durch den Einsatz zweier defizienter Baculoviren gezeigt werden (Hawtin et al. 1997). Beim Cathepsin handelt es sich um ein Homolog zu Cathepsin L, einer lysosomalen Cystein Protease.

Für beide Enzyme konnte in vitro gezeigt werden, dass sie bereits in der frühen Phase der Infektion in ihren Vorstufen vorliegen und in infizierten Zellen akkumulieren, jedoch erst mit Eintreten des Zell-tods aktiviert werden (Hom et al. 2002). ChiA dient dabei als Aktivator und prozessiert die Vorstufe von V-CATH zum reifen Enzym. Zusätzliche Studien mit chiA-defizienten Viren offenbarten jedoch weitere multiple Aktivatoren (Hodgson et al. 2013). Neben der Zugabe des spezifischen Proteaseinhi-bitors E-64c zur Unterdrückung der Reifung von V-CATH zeigt auch die Zugabe von Fötalem Kälber Serum (fetal calf serum, FCS) ins Kulturmedium eine proteaseinhibierende Wirkung. Zusätzlich zu den beiden angesprochenen wurden noch eine Reihe weiterer Proteasen im Zelllysat sowie im Kultur-überstand von infizierten wie nicht infizierten Insektenzellen identifiziert (Lindskog et al. 2006).

Der propagierte lytische Zyklus einer Baculovirusinfektion lässt sich somit vermutlich durch multifak-torielle Vorgänge beschreiben, welche die strukturellen Veränderungen in der Zelle sowie Eingriffe in den Metabolismus, das Fehlen von Reparaturmechanismen durch Manipulation der Proteinsynthese, Zellzyklusarrest und den Einfluss verschiedenster Proteasen beinhalten. Jeder einzelne dieser Fakto-ren ist dafür bekannt einen Zelltod auszulösen. Der beobachtete zytopathogene Effekt ist beim Einsatz des Baculovirus als Insektizid durchaus gewünscht, bei der Herstellung von Proteinen jedoch kontra-produktiv. Hier werden durch die Lyse der Zellen Proteasen freigesetzt, die unter anderem auch das Zielprotein angreifen können (Lindskog et al. 2006).

2.3 Einsatz des Baculovirus

Das Baculovirus ist in der Lage, in Säugerzellen einzudringen und die zelleigene Proteinproduktion zu beeinflussen. Die Replikation ist jedoch nur in Arthropoden oder den daraus abgeleiteten Zelllinien möglich. Mit diesen einzigartigen und zugleich ambivalenten Eigenschaften eröffnet das Baculovirus ein großes Repertoire an denkbaren Einsatzmöglichkeiten. Neben der Verwendung als Biopestizid und zur Proteinproduktion in Insektenzellen wird daher auch die Proteinexpression in Säugerzellen sowie die Anwendung zur Gentherapie intensiv beforscht (Paul et al.; Hu et al. 2003; Moscardi 1999; Contreras-Gómez et al. 2014). Im Folgenden wird sich ausschließlich auf die Anwendung des Baculo-virus als Biopestizid und zur Proteinherstellung bezogen.

7

Stand des Wissens

2.3.1 Biopestizid

Aufgrund der Pathogenität und der Wirtsspezifität der Baculoviren bieten diese eine umweltfreundli-che Alternative zur chemischen Schädlingsbekämpfung. Das Potential des Baculovirus dazu wurde bereits in den Anfängen der 1890er Jahre bei ersten Versuchen zur Schädlingsbekämpfung bekannt. Die erfolgreiche Eindämmung eines endemischen Schädlingsbefalls mit einem speziellen Virus gelang erstmals in den 1930er Jahren in Kanada (Moscardi 1999; Fuxa 2004). Die Ausbreitung eines aus Skan-dinavien eingeschleppten Schädlings, die parasitäre Blattwespe Diprion hercyniae, konnte durch Ein-satz eines spezifischen Baculovirus unter Kontrolle gebracht werden. Das Virus ist seither ebenso wie der Wirt ein fester Bestandteil des Ökosystems, eine weitere Bekämpfung des Schädlings ist nicht mehr nötig (Bird und Burk J. M. 1961; Fuxa 2004). Einzige Nachteile des Systems sind die Schwierig-keiten der großtechnischen Produktion sowie die im Vergleich zu chemischen Mitteln langsame Wir-kung. Zudem muss aufgrund der strikten Wirtsabhängigkeit jeder Schädling mit einem abgestimmten Präparat behandelt werden. Optimierungsversuche beschränken sich unter Verbot des Einsatzes gene-tisch veränderter Organismen in der Entwicklung einer Schädlingsfrüherkennung sowie in der techni-schen Umsetzung der Virenproduktion. In Ländern mit weniger strikten Regularien werden zur Er-höhung der tödlichen Wirkung rekombinante Viren beforscht, die nach Infektion eine Überexpression von insektenspezifischen Hormonen oder Toxinen initiieren (Szewczyk et al. 2006). Weitere Ansätze zielen beispielsweise auf eine genetische Optimierung der Infektiösität ab (Jakubowska et al. 2010).

2.3.2 Proteinherstellung

Je nach der Komplexität des Zielproteins und der geplanten Verwendung, z.B. zur Forschung oder in medizinischer Anwendung, bieten sich verschiedene Expressionssysteme an. Die Ausbeuten einiger dieser Systeme sind anhand der Produktionseffizienz von Hirudin, einem blutgerinnungshemmenden Polypeptid, in Tabelle 2-1 dargestellt. Grundsätzlich wird versucht, für jede Problemstellung die je-weils passende Methode der Herstellung zu wählen. Als einfachstes System ist hier die chemische Peptidsynthese zu nennen, welche angesichts der wenig komplexen Matrix eine leichte Aufreinigung bietet, aber auf Peptide mit einer Maximallänge von 70 Aminosäuren beschränkt ist und keinerlei posttranslationale Modifikationen bietet (Reinwarth et al. 2012). Längere Proteine, die ebenfalls keiner Modifikationen bedürfen, können einfach und im großen Maßstab mit einer hohen Raum-Zeit-Ausbeute im bakteriellen System hergestellt werden. Beide Herstellungsmethoden offenbaren zudem Schwächen bei der Ausbildung von Disulfidbrücken, die meist wesentlich für die richtige Faltung des Proteins sind. Dies kann unter Verwendung von Hefe als einfachstem eukaryontischen Produktions-organismus - mit äquivalenten Kultivierungsbedingungen und Ausbeuten - umgangen werden. Der Organismus bietet zudem die Möglichkeit der Glykosylierung, jedoch oft mit immanenten Unter-schieden zu humanen Strukturen, was zu einer Herabsetzung der Aktivität des Proteins führen bzw. im medizinischen Einsatz Immunreaktionen auslösen kann (Jayaraj und Smooker 2009). Anspruchs-volle Proteine, deren Aktivität von authentischen Glykanstrukturen abhängt und die zum human-therapeutischen Einsatz gedacht sind, werden vornehmlich in Säugerzellkulturen, z.B. Chinese Hamster Ovary Zellen hergestellt. Die Herstellung der Proteine kann durch transiente oder, effizienter, durch stabile Transfektion bzw. mit maximaler Ausbeute über Viren als DNA-Shuttle erfolgen. Den Vortei-len der vollständigen Proteinprozessierung stehen immense Kosten für hochwertige Kulturmedien und –systeme sowie das Risiko der Kontamination mit Humanpathogenen gegenüber. Dies erfordert ein kostenintensives Downstreaming (Kollewe und Vilcinskas 2013).

Mit dem vollständigen Repertoire an eukaryontischen posttranslationalen Modifikationen ausgestat-tet, bietet sich das Baculovirusexpressionssystem als kostengünstigere Alternative der Expression in Säugerzellen an. Die starken Promotoren des Virus gewährleisten eine der Säugerzelle überlegene Ausbeute auch an großen Proteinen; eine Kontamination ist aufgrund der Spezifität des Virus auf

8

Stand des Wissens

Invertebraten ausgeschlossen (Demain und Vaishnav 2011). Obwohl die Insektenzellen zum überwie-genden Teil in der Lage sind, die Proteinmodifikationen der Säugerzellen zu leisten, können, begrün-det auf einem verschiedenartigen Enzymapparat, manche komplexe Glykostrukturen nicht vollstän-dig prozessiert werden. Dies kann zur Verminderung der Proteinstabilität, zum Verlust der Aktivität oder zu Immunreaktionen beim therapeutischen Einsatz führen (Demain und Vaishnav 2011).

Tabelle 2-1: Vergleich der Produktivität verschiedener Organismen bei der Herstellung von rekombinantem Hirudin (Demain und Vaishnav 2011).

Rekombinanter Organismus mg∙l-1

Baby Hamster Kidney 0,05

Insektenzellen 0,40

Streptomyces lividans 0,25-0,5

Escherichia coli 200-300

Saccharomyces cerevisiae 40-500

Hansenula polymorpha 1.500

Pichia pastoris 1.500

2.4 Proteinherstellung in Insektenzellen

2.4.1 Proteinaufreinigung

Die Erforschung der Struktur von rekombinanten Proteinen im Allgemeinen und des Glykosylie-rungsmusters der Produktionssysteme im Besonderen, setzt eine hohe Reinheit des Zielproteins vo-raus und stellt damit enorme Anforderungen an den Prozess der Proteinreinigung. Daher wird ver-sucht, auch zur Senkung der Gesamtproduktionskosten, das rekombinante Protein möglichst rein und mit wenig Verlust durch einfache Methoden zeitsparend zu gewinnen. Bei der Auswahl der Aufreini-gungsschritte sind dementsprechend die chemischen Eigenschaften des Zielproteins wie die pH-Stabilität in Betracht zu ziehen (Rosenberg 2005).

Die zu entwickelnde Aufreinigungsstrategie ist zudem davon abhängig, ob das Protein intra- oder extrazellulär vorliegt. Basierend auf den technischen Entwicklungen im Bereich der Proteinauf-reinigung konnten sich einige Standardvorgehensweisen etablieren (z.B. Abbildung 2-4). Liegt das Protein intrazellulär vor, erfolgt nach dem Ernten der Kultur zunächst ein Schritt, der einen Zellaufschluss bzw. eine Extraktion des Proteins aus der Zelle beinhaltet. Danach, oder im Falle eines ausgeschleusten Proteins, bietet sich der Einsatz einer Affinitätschromatographie an, um das Zielprotein bereits mit einer Reinheit von etwa 90 % zu fraktionieren und das eingesetzte Volumen zu reduzieren. Über weitere chromatographische Methoden, wie Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration, lässt sich die Reinheit des Produktes weiter steigern (Rosenberg 2005).

9

Stand des Wissens

Abbildung 2-4: Schematische Darstellung einer generellen Aufreinigungsstrategie mit einem elektiven Schritt

zur Extraktion eines intrazellulären Proteins und anschließender Steigerung der Produktrein-heit über Affinitäts- (Auffangschritt) sowie Ionenaustausch- (Zwischenreinigung) und Gelfiltra-tion (Feinaufreinigung) zur Gewinnung des reinen rekombinanten Proteins.

Die Aufreinigung eines nicht modifizierten, rekombinanten Zielproteins aus einer Masse von tausen-den Fremdproteinen des Proteoms eines Produktionsorganismus erweist sich meist als unmöglich, da sich die Proteine sowohl in der Größe als auch in ihren chemischen Eigenschaften stark überlappen (Issaq und Veenstra 2008). Rekombinante Proteine werden daher in den meisten Fällen mit Tags ver-sehen, die den spezifischen Einsatz einer Affintätschromatographie ermöglichen. Mögliche Tags kön-nen N-, oder C-terminal an das Protein fusioniert werden, sind in verschiedenen Größen verfügbar und basieren auf der Verwendung von spezifischen Säulenmatrizes mit entsprechenden Elutionsbe-dingungen (Tabelle 2-2). Abhängig von der chemischen Stabilität des Zielproteins wird für das jewei-lige Produktionssystem der kleinste Tag gewählt, um die Ausbeute zu maximieren und die sterische Hinderung bei der Faltung des Proteins zu minimieren. Um im weiteren Aufreinigungsprozess das Protein rein und in nativer Form darzustellen, können zur spezifischen Abspaltung des Tags vom Protein zusätzlich Proteaseschnittstellen eingefügt werden (Terpe 2003).

Tabelle 2-2: Verschiedene Tags zur Aufreinigung rekombinanter Proteine mit Angabe der Proteingröße, der Länge der Aminosäuresequenz (AS) sowie der Säulenmatrix in der Affinitätschromatographie.

Tag

Größe in kDa

AS

Säulenmatrix

-Arg 0,80 5 Kationenaustauscher

-His 0,84 6 Ni2+, Co2+

FLAG 1,01 8 Anti-FLAG Antikörper

Strep-tag II 1,06 8 Modifiziertes Streptavidin

c-myc 1,20 11 Monoklonaler Antikörper

S- 1,75 15 S-Fragment der RNAse A

Streptavidin-binding Protein 4,03 38 Streptavidin

-transferase 26,0 211 Glutathione

10

Stand des Wissens

2.4.2 Glykoproteine

Viele eukaryontische Proteine bedürfen für die Ausbildung der korrekten Faltung und der Aktivität in vivo bestimmter Glykosylierungsmuster (Shental-Bechor und Levy 2008). Diese sind zudem für die Verweildauer im Organismus und für Zell-Zell-Interaktionen essentiell (Rudd 1999; Chitlaru et

2002). Grundsätzlich unterscheidet man dabei zwischen N- und O-Glykanen, wobei N-Glykane über die Amidgruppe von Asparagin (Asn) in einer Konsenssequenz von Asn-X-Ser/Thr (Serin, Ser; Threonin, Thr) an das Proteinrückgrat gebunden sind. X kann außer Prolin jede andere beliebige Aminosäure sein. Ausgehend von einer an Asn übertragenen, hoch konservierten Kernstruktur (Abbildung 2-5), die aus zwei N-Acetyl-D-Glukosaminen (GlcNAc) und zwei 1,3- sowie 1,6-verknüpften Mannosen (Man) besteht, werden die N-Glykane zu komplexeren Strukturen aufgebaut.

Abbildung 2-5: Darstellung der konservierten Kernstruktur von N-Glykanen mit N-Acetylglucosamin sowie

Mannose .

Die N-Glykoside werden in drei Grundtypen an N-Glykosylierungen unterschieden: komplexer Typ, hybrider Typ sowie high-Mannose-Typ. Der high-Mannose-Typ besteht, abgesehen von den GlcNAcs der Kernstruktur, ausschließlich aus Mannoseresten. Diese können in Form von zwei bis vier Anten-nen an die Kernstruktur angelagert werden (bi-, tri-, tetraantennär). Bei der Ausbildung des komple-xen Typus werden an jede der beiden Mannosen der Kernstruktur ein oder zwei GlcNAcs gebunden, resultierend in zwei bis vier Antennen. Danach folgt eine Galaktoseeinheit (Gal), bevor die Kette endet oder eine Wiederholung der Antennenstruktur bzw. eine Sialinsäure (N-Acetylneuraminsäure, Neu6Ac) angehängt wird. Beim hybriden Typ können die Antennen sowohl aus Mannosen als auch aus komplexen Strukturen bestehen. Mögliche weitere Modifikationen lassen, mit dem Einfügen von Fucosen oder beliebigen Wiederholungen, eine Vielzahl von Glykosylierungsmustern zu (Nettleship 2012).

Abbildung 2-6: Beispielhafte Darstellung der verschiedenen Arten der N-Glykanstrukturen mit komlexem Typ

(links), hybridem Typ (Mitte) sowie high-Mannose-Typ (rechts); aufgebaut aus N-Acetylglukosamin , Mannose , Galactose , Fucose und Sialinsäure .

Die O-Glykosylierung eines Proteins hingegen folgt keiner Konsensussequenz. In serin- und threonin-reichen (Ser, Thr) Regionen können O-Glykane über N-Acetylgalaktosamin (GalNAc) an die Reste der

11

Stand des Wissens

Aminosäuren gebunden werden. Weiterhin folgen O-Glykosylierungen keinem distinkten Schema, die ausgebildeten Strukturen lassen sich in acht verschiedene sogenannte mucine Kernstrukturen un-terscheiden. Hierbei sind N-Acetylglucosamine (GlcNAc) und/oder Galaktosen (Gal) an GalNAc ge-bunden, auch Repeats an GalNAcs können auftreten (Nettleship 2012).

Abbildung 2-7: Darstellung der Kernstrukturen von O-Glykanen mit den mucinen Kernstrukturen I bis VIII und

den vorkommenden Zuckern N-Acetylglucosamin , Galactose sowie N-Acetylgalacto-samin .

2.4.2.1 Erythropoietin (EPO) Das Hormon Erythropoietin (Abbildung 2-8) wird im humanen Organismus hauptsächlich in der Ne-benniere, aber auch in anderen Organen wie der Leber ausgeschüttet (Jacobson 1959). Das Gly-koprotein aktiviert die Differenzierung von pluripotenten Erythropoietin- (ERC) zu Pro-erythroblasten und über Zwischenstufen zu Erythrozyten (Graber und Krantz 1978). Der Pegel an EPO im Kreislauf wird über den Grad der Sauerstoffversorgung reguliert: Unter Hypoxie wird EPO ausgeschüttet und resultierend die Anzahl der roten Blutkörperchen erhöht (Krantz 1991).

12

Stand des Wissens

Abbildung 2-8: Räumliche Darstellung von Erythropoietin mit Proteinrückgrat als Sekundärstruktur mit α-

Helices (rot) und β-Faltblättern (grün) sowie den drei N-Glykosylierungsstellen (blau) und der O-Glykosylierung (pink) (Woods 2014).

Das unreife EPO besteht aus 193 Aminosäuren (AS). Während der posttranslationalen Modifikation zum aktiven Hormon (165) werden davon eine 27 AS lange leading sequence sowie später ein C-terminales Arginin abgespalten. Unglykosyliert ergibt sich für die 166 AS-Kette ein Molekulargewicht von 18.398 Da (Lai et al. 1986). Das Molekulargewicht der vollständig human glykosylierten Form wird mit 30.400 (Bittner et al. 1998) bis 34.000 Da angegeben (Ferretto et al. 2009; Gunturi et al. 2007). Bedeutend für die biologische Aktivität des Proteins sind die im nativen Zustand ausgebildeten Disul-fidbrücken zwischen den Cysteinresten an Position 7 und 161 sowie 29 und 33 (Zhou et al. 1998), so-wie die vollständige Ausbildung der vier Glykosylierungsstellen: drei N-Glykane, verknüpft an ASN 24, 38 und 83 sowie eine O-Glykosylierung an Ser 126 (Krantz 1991; Ferretto et al. 2009; Gokana et al. 1997; Zhou et al. 1998). Die in vivo Halbwertszeit des EPO sowie die Aktivität werden maßgeblich durch die Sialinsäuren am Ende der Antennen der N-Glykane beeinflusst. Liegen die Galaktosen frei, wird das Protein in der Leber abgebaut (Morell et al. 1971).

2.4.3 Glykosylierungspotential von Insektenzellen

Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni oder Drosophila melanogaster sind in der Lage, Glykoproteine per se zu exprimieren. Im Gegensatz zur N-Glykanstruktur der Säugerzellen (Abbildung 2-9) bilden die Insekten physiologisch jedoch kürzere Zuckerketten in Oligomannose- bzw. Paucimannoseform aus. Die Glykane sind fucosyliert, verfügen jedoch nicht über endständige Sialinsäuren (Nettleship 2012). In dieser Inkompetenz liegt der entscheidende Nachteil des BVES, da vor allem im human-therapeutischen Bereich die vollständige Ausprägung der Glykostrukturen im-manent ist. Mit etwa 70 % der hier eingesetzten Proteine ist der überwiegende Anteil glykosyliert, die biologische Aktivität und die immunologische Verträglichkeit hängen stark von den Glykanen ab (Durocher und Butler 2009). Bestrebungen, diese Einschränkung des BVES zu eliminieren, resultierten in gentechnisch modifizierten, stabilen Insektenzelllinien (Abbildung 2-9, rechts). Diese exprimieren neben einer rekombinanten Glukosaminyltransferase sowohl eine Galaktosyltransferase als auch eine Sia-lyltransferase. Diese Enzyme erlauben den Zellen bei gleichzeitiger Supplementierung einer Vorstufe der Sialinsäure (Acetyl-D-Mannosamin) human-gleiche Glykostrukturen aufzubauen (Contreras-Gómez et al. 2014; Wittmann und Danishefsky 2007).

13

Stand des Wissens

Die Fähigkeit der Insektenzellen, O-Glykane auszubilden, ist hingegen nicht dediziert aufgeklärt. Un-tersuchungen von Lopez zeigten, dass Insekten über ein weit weniger diverses Glykosylie-rungsmuster als Säugerzellen verfügen. Die resultierenden Strukturen sind dabei abhängig von der verwendeten Zelllinie sowie vom eingesetzten Kulturmedium (Lopez 1999).

Abbildung 2-9: N-Glykosylierungspattern von Expressionssystemen. Aufbau der Glykostrukturen: Ausgehend

von einer gemeinsamen Vorstufe der Insekten- und Säugerzellen wird im linken Zweig über die (I) N- und weitere Schritte die für Säugerzellen typische komplexe Glykosylierung gebildet. Im mittleren Zweig ist die native Glykostruktur der Insektenzellen (Pauccimannose), katalysiert über die (II) N- , dargestellt. Gentechnisch ver-änderte Insektenzellen besitzen die Fähigkeit mittels (III) - - - - -N-

, (IV) - - 1 sowie (V) - - - 1 die komplexe Struktur der Säugerzellen aufzubauen. Die Strukturen bestehen

aus den Zuckern N-Acetylglucosamin , Galactose , Fucose und Sialinsäure .

2.5 Gesichtspunkte bei der Kultivierung von Insektenzellen

Seit der Identifizierung des Potentials des Baculovirusexpressionssystems werden Reaktorkonzepte gesucht, um eine möglichst hohe Ausbeute an Proteinen zu erlangen (Agathos 1996). Mit der Erfah-rung der Kultivierung von Säugerzellen bediente man sich dazu zunächst bei den bekannten Reaktor-typen wie Rührkessel- oder Airliftreaktor. Die speziellen Anforderungen der Insektenzellen an das Kultivierungssystem legen jedoch die Entwicklung eines geeigneten Reaktorkonzepts nahe. An Be-sonderheiten wären hier die Notwendigkeit eines zweistufigen Prozesses zur Anzucht von Zellen und

Säugerzellen Insektenzellen

Gentechnisch veränderteInsektenzellen

I III

II

IV

V

14

Stand des Wissens

einer nachfolgenden Infektion mit einer Produktionsstufe, der etwa 50 % höhere Sauerstoffbedarf im Vergleich zu Säugerzellen sowie die stark wachstums- und produktionshemmenden Effekte einer Akkumulation von Kohlendioxid zu nennen (Drugmand et al. 2012).

2.5.1 Schädigung durch Gaseintrag

Konträr zum hohen Sauerstoffbedarf zeigen sich Insektenzellen im Vergleich zu anderen Zelllinien wie Maushybridomzellen sensitiver gegenüber direktem Gaseintrag in den Kulturreaktor (Kioukia et al. 1996). Die Schädigung der Zellen resultiert vor allem aus dem Zerplatzen der Blasen an der Ober-fläche sowie aus Turbulenzen und Scherfeldern, die sich während des Aufstieges der Gasblasen in der Blasengrenzschicht ausbilden. Große Gasblasen sind dabei weniger zellschädigend, da sie schneller aufsteigen, weniger Zellen in der Grenzschicht mit sich ziehen und kürzere Zeit im Schaum verblei-ben. Im unbegasten System zeigen sich Insektenzellen hingegen wenig anfällig für mechanische Schä-digungen durch Rührer, in Gegenwart von Gasblasen werden die Schädigungen durch Rührereinwir-kung verstärkt (Chisti 1993).

2.5.1.1 Schädigungsmechanismus Im begasten Reaktor folgen die Zellschädigungen einer Kinetik erster Ordnung, die durch folgende Gleichung beschrieben werden kann:

dxdt =-kd∙X

Formel 2-1

dxdt Änderung der Zellkonzentration

X Zellkonzentration

kd Spezifischer Sterbeterm

Der Verlust an Zellen ist dabei abhängig von der Zellkonzentration im System X, der Zeit t und von der spezifischen Absterberate kd:

kd=24∙Q∙VK

π2∙dB3 ∙dT

2 ∙hL

Formel 2-2

Q Volumetrische Begasungsrate

hL Höhe des Fluids

dT Breite des Reaktors

dB Blasendurchmesser

VK Hypothetische Turbulenzzone

Gemäß Formel 2-2 ist die Absterberate kd direkt proportional zur Frequenz der Blasenbildung n, die sich aus der volumetrischen Begasungsrate und dem Blasenvolumen ableiten lässt:

n=6∙Qπ∙dB

3

15

Stand des Wissens

Dementsprechend kann der Absterbeterm im steady state auch proportional zur Häufigkeit des Zer-platzens von Blasen an der Oberfläche gesehen werden. Weiterhin konnte experimentell gezeigt wer-den, dass die Sterberate der Insektenzellen mit steigender Fluidhöhe abnimmt. Dies unterstützt die Theorie, dass die Zellschädigung vor allem im Bereich der Oberfläche beim Zerplatzen der Blasen eintritt. Die für die Zellen schädliche Turbulenzzone um die Gasblasen geht indirekt proportional in den Sterbeterm ein; steigt der Blasendurchmesser, sinkt der Einfluss der Turbulenzzone (Chisti 2000).

Erklären lässt sich dieses Phänomen beim Betrachten der Vorgänge beim Blasenaufstieg: Beim Errei-chen der Fluidoberfläche treten Gasblasen bis zu einem gewissen Punkt aus der Flüssigkeit aus, bevor die Luftblase zerplatzt. Die Höhe des Austritts ist direkt von der Blasengröße abhängig; kleinere Bla-sen ruptieren aufgrund der höheren Oberflächenspannung tiefer im Fluid und sind dabei zellschädi-gender. Beim Zerplatzen der aus dem Fluid ragenden Blase (Abbildung 2-10) strömt die Flüssigkeit des Blasenfilms zurück in den bulk der Flüssigkeit. Dabei entsteht an der höchsten Stelle der Blase ein Loch, welches sich nach unten ausbreitet und den Ursprung einer ringförmigen Wellenfront bildet. Die beim Zurückziehen der Welle auftretenden Kräfte sind abhängig von der Stärke des Blasenfilmes und können im Film befindliche Zellen zerscheren. Im weiteren Verlauf treffen sich die Wellenfronten unter der Blase und erzeugen dabei eine turbulente Zone unter Ausbildung eines lokalen Druckan-stieges. Die dabei freigesetzte Energie ist wiederum aufgrund der Oberflächenspannung bei kleineren Blasen höher und führt zu zwei entgegengesetzten Fluidströmungen von einer Geschwindigkeit von 6,4 m∙s-1 bei Blasen mit einem Durchmesser von 1 mm bzw. 0,94 m∙s-1 (6 mm) (Boulton-Stone und Blake 1993; Chisti 2000).

Abbildung 2-10: Zerplatzen einer Gasblase an der Fluidoberfläche: Die Gasblase steigt auf, der Film in der

Fluidgrenzschicht wird dünner (links). Es bildet sich ein Loch in der Grenzschicht aus; ausge-hend davon entsteht eine ringförmige Wellenfront, die sich in den Bulk des Fluids ausbreitet. Die Welle bricht unter der Gasblase zusammen, wobei lokale Turbulenzen und Druckerhöhun-gen auftreten (Mitte). Dies führt zur Ausbildung zweier entgegengesetzter Jet Strömungen in den bulk bzw. aus dem Fluid heraus (Chisti 2000).

2.5.2 Zugabe von protektiven Substanzen

Um die Schädigung von Zellen durch Gasblasen und Turbulenzen im Reaktor zu minimieren, können dem Kultivierungsmedium verschiedene Substanzen zugegeben werden, welche sowohl physische als auch physiologische Wirkung zeigen. Die Supplementierung mit Fötalem Kälber Serum bewirkt ei-nerseits eine Dämpfung von auftretenden Turbulenzen, andererseits dient es der Zelle als Quelle von Lipiden. Diese werden in die Plasmamembran der Zellen eingebaut und unterstützen die Zellintegri-tät. Serum eignet sich jedoch nicht als Additiv bei der Herstellung von therapeutisch eingesetzten Produkten, da durch den tierischen Ursprung eine hohe Gefährdung durch Kontaminationen besteht (Ramirez und Mutharasan 1992; Chisti 2000). Bei Verwendung von serumfreien Medien werden daher überwiegend künstliche Lipidmischungen sowie das nichtionische Polymer Pluronic ® F68 eingesetzt. Ähnlich dem beobachteten Effekt bei Verwendung von Serum ist auch hier eine die Plasmamembran

Blase

Film Oberfläche Zelle

Medium

Ringförmige Welle

Zone des größten Druckes

Jet Strömung

Jet Strömung

16

Stand des Wissens

unterstützende Wirkung nachgewiesen. Zudem verhindert die grenzflächenaktive Substanz über elektrostatische Wechselwirkungen die Anlagerung von Zellen in die Oberfläche von Luftblasen, die schädigende Wirkung beim Zerplatzen wird vermieden. Weiterhin wird die Grenzschicht zwischen Gas und Medium stabilisiert und es werden weniger Zellen in der turbulenten Wolke hinter den Bla-sen mitgezogen (Handa-Corrigan et al. 1989; Palomares et al. 2000).

2.5.3 Speziell für Insektenzellen geeignete Reaktorsysteme

Aufgrund der beschriebenen Zellschädigung in den klassischen, direkt begasten Reaktoren richteten sich die Bestrebungen der Forschung hin auf die Verwendung alternativer Reaktorkonzepte. Diese sind im Wesentlichen ausgerichtet auf eine minimale Scherbelastung durch Begasung mit möglichst großen Gasblasen oder durch indirekte Begasung über Membranen. In Betracht gezogen werden da-bei Kultivierungen im batch, fed- oder repeated batch sowie im kontinuierlichen oder perfundierten Sys-tem (Agathos 1996).

2.5.4 Scherarme Kultivierungssysteme

Eine Möglichkeit der scherarmen Kultivierung bietet der rotating-wall reactor (rwr, Abbildung 2-11), der in verschiedenen Modifikationen im batch, fed-batch sowie perfundiert betrieben werden kann. Die Zellen können dabei in Suspension oder auf Mikroträgern kultiviert werden. Das Kernstück des Reak-tors bildet ein abgeschlossener Zylinder, der, angetrieben von einem Motor rotierend um eine hori-zontale Achse, für die Durchmischung des Systems sorgt. Die Begasung erfolgt dabei blasenfrei über einen in dieser Achse eingelassenen Membranoxygenator (Hammond und Hammond 2001). Die Scherbeanspruchung auf die kultivierten Insektenzellen konnte im Vergleich zu einer Suspensionskul-tur im Schüttelkolben bei einer vergleichbaren Sauerstoffversorgung sowie verbesserten Kohlendioxi-dabfuhr von 1,0∙10-5 auf 0,2∙10-5 N∙cm-2 gesenkt werden (Cowger et al. 1997). Vergleichskultivierungen zeigten zudem eine deutlich längere Phase des stationären Wachstums im rwr (4-5 Tage im Schüttel-kolben bzw. 9-15 Tage im rwr) bei gleicher maximaler Zelldichte und einer etwa 20-fach niedrigeren Absterberate. Die Raum-Zeit-Ausbeute bei der Produktion von Proteinen steigerte sich unter scher-armen Bedingungen etwa um 50 % (Ikonomou et al. 2003).

Abbildung 2-11: rotating wall reactor in schematischer Darstellung: Ein Motor (4) treibt über einen Riemen den

um die Horizontalachse rotierenden zylindrischen Reaktor (1) an. Über einen Kompressor (5) kann Begasungsluft durch einen Sterilfilter (3) in den Zellraum gepumpt werden. Durch ein Umkehren der Flussrichtung wird das Abgas aus dem Reaktor entlassen. Der Membranoxyge-nator (2) ist um die Achse des rotierenden Reaktors angebracht (Hammond und Hammond 2001).

17

Stand des Wissens

Die Verwendung von Einwegreaktoren konnte sich vor allem zur Herstellung von therapeutischen Proteinen im klein- und mittelgroßen Maßstab mit dem Vorteil etablieren, eine Kreuzkontamination zwischen verschiedenen batches von vorneherein auszuschließen. Eine scherarme Alternative der Einwegreaktoren ist durch den wave bioreactor gegeben (Contreras-Gómez et al. 2014). Begasbare, steri-le Polyethylen-Beutel werden mit Medium gefüllt, Zellen in Suspension oder auf Mikroträgern inoku-liert und auf einer Wippe kultiviert. Durch die entstehenden Wellen wird für eine homogene Durch-mischung und Sauerstoffeintrag ins Medium gesorgt (Singh 1999). In Untersuchungen konnten Rausch et al. zeigen, dass sowohl Sf 9 als auch High Five Insektenzellen im wave reactor vergleichbare Wachstumsgeschwindigkeiten einer optimierten Suspensionskultur in Schüttelkolben aufweisen. In den Verdopplungszeiten konnte bei den High Five kein, bei Sf 9 mit 21,7 Stunden (wave reaktor) bzw. 22,6 Stunden (Schüttelkolben) nur ein marginaler Unterschied nachgewiesen werden. In den durchge-führten batch-Versuchen wurde in beiden Kultivierungssystemen eine maximale Zelldichte von etwa 5∙106 Z∙ml-1 erreicht. Die Produktion von eGFP in High Five war ebenso in beiden Systemen analog (Rausch et al. 2010).

Abbildung 2-12: Schematische Darstellung des wave reactors zum Betrieb im batch mit medium-gefülltem Ein-

wegbeutel auf einer Wippe, Be- und Entlüftung über Sterilfilter (Mikola et al. 2007).

2.5.5 Immobilisierte Hochzelldichtesysteme

Nährstoff- oder Sauerstofflimitierungen können das Zellwachstum sowie die Proteinproduktion bei höheren Zelldichten im batch einschränken. Die maximal empfohlene Startzelldichte bei Infektion einer Batchkultur im BVES beträgt daher etwa 5∙106 Z∙ml-1 (Contreras-Gómez et al. 2014). Hochzell-dichtekultivierungen ab einer Zellkonzentration von 1∙107 infizierten Zellen pro Milliliter versprechen hier bei der Möglichkeit einer optimierten Kultivierung höhere Raum-Zeit-Ausbeuten (Jäger 1996). Dem Gegenüber steht der bei Insektenzellen propagierte sogenannte „cell density effect“, eine metaboli-sche Umstellung bei Zelldichten ab 3∙106 Z∙ml-1, welcher – unabhängig vom Status der Oxygenierung oder Nährstoffversorgung – die Wachstumsgeschwindigkeit von nicht infizierten bzw. die Produkti-vität von infizierten Zellen senkt (Bernal et al. 2009). Durch gezielte Supplementierung von Pyruvat oder α-Ketoglutarat während der Kultivierung kann dieser Effekt eliminiert werden, so dass in einer infizierten Kultur der Zelldichte 4∙106 Z∙ml-1 etwa 7-fach höhere Ausbeuten erreicht werden konnte (Carinhas et al. 2010).

Hochzelldichtekultivierungen sind vor allem durch Immobilisierung der Zellen auf der Oberfläche von Mikroträgern, durch Zelleinschluss in Polymergele oder durch membran-vermittelten Zellrück-halt gegeben. Diese Verfahren erlauben zudem einen einfachen Wechsel des Zellmediums sowie – je nach Art der Immobilisierung – eine lokale Aufkonzentrierung von Wachstumsfaktoren. Des Weite-ren ergibt sich bei sekretierten Proteinen eine Erleichterung des Downstream-Prozesses, da der Schritt

18

Stand des Wissens

der Trennung von Produkt und Biomasse von vorneherein vermieden werden kann (Yamaji 2006; Yamaji 2000; Mahmoud und Helmy 2009). Im Folgenden wird sich, den Wachstumseigen-schaften der Insektenzellen geschuldet, auf Einschlussverfahren der Immobilisierung beschränkt.

2.5.6 Zellrückhalt durch Membranen

Der Einsatz von technischen Membranen bildet mit der Möglichkeit der blasenfreien Begasung (Schneider 1995), der kontinuierlichen Abtrennung von Produkt bzw. Metaboliten (Genzel 2014) sowie der direkten Kultivierung in einem Membranreaktor (Knazek 1972) die Grundlage für das Erreichen hoher Zelldichten und Ausbeuten in der Zellkulturtechnik eukaryotischer Zellen.

Mit dem Vorteil der Tangentialanströmung und damit verbunden die geringere Konzentrationspola-risation bzw. werden für die genannten Prozessoperationen meist Hohlfasermodule (oder Hohlfaserreaktoren, HFR) eingesetzt (Abbildung 2-13). Die in ein Polymergehäuse eingeklebten faser-förmigen Membranen können aus einer Vielzahl von Polymeren und Ausschlussgrößen hergestellt werden (Ohlrogge 2006). Durch diesen Aufbau ergeben sich im Modul zwei durch die Membranen abgetrennte Bereiche, welche durch jeweilige Anschlüsse für Ein- bzw. Auslass zugänglich sind: den Extrakapillarraum (EKR) sowie den Kapillarraum (KR). Bei einer Kultivierung im HFR befinden sich die Zellen im EKR, während der KR mit begastem Medium perfundiert wird. Abwandlungen von HFR können zusätzliche Fasern zur Begasung im Modul enthalten (Nagel 1999; Wolfe 2002).

Abbildung 2-13: Aufbau eines Hohlfasermoduls mit EKR, KR und Anschlüssen für Mediumein- und -auslass.

Studien in Säugerzellen konnten zeigen, dass in HFR ein in vivo ähnliches Wachstum mit gewebeähn-lichen Zelldichten bis zu 108 -1 mit einer über Monate anhaltenden hohen Vitalität möglich ist (Jackson 1996). Zudem können im Vergleich zu herkömmlichen Kultivierungsmethoden im HFR Proteine wie monoklonale Antikörper bis zu hundertfach aufkonzentriert werden (Nagel 1999).

Zur perfundierten Kultivierung von Lepidopteran Insektenzellen wurden ebenfalls bereits vielverspre-chende Studien durchgeführt. In einem membranbegasten und über Membran mit Medium perfun-dierten Rührkesselreaktor konnte Deutschmann bei einer nicht infizierten Sf 21 Kultur eine maximale

7 -1 bis zu einem einsetzenden b der Membran nach 400 h bei hoher Vitalität kultivieren (Deutschmann und Jäger 1994). In späteren Arbeiten in demselben Reaktorsystem wurde in High Five Zellen zudem die Ausbeute an glykosyliertem -trace protein um den Faktor 20 gesteigert (Chico und Jäger 2000). Baxter konnte eine ähnliche Produktionssteigerung an humanem

-5 bei der Kultivierung von S2 Zellen im HFR erreichen (Baxter 2006).

19

Stand des Wissens

2.5.7 Immobilisierung durch Zelleinschlussverfahren

Mit dem direkten Einschluss von Zellen in spontan ausbildende Membranen ist durch Mikroverkap-selung in solide, beschichtete solide Kugeln sowie Hohlkugeln ein spezielles Immobilisierungssystem gegeben. Die resultierenden Sphären eignen sich aufgrund ihrer hydrodynamischen Eigenschaften gut zum Einsatz in verschiedenen Bioreaktorsystemen wie Rührkessel, Blasensäule oder in rwr und wave reactor und fanden bereits Anwendung in den Bereichen der Lebensmittelindustrie, Abwasser-behandlung oder auch im medizinischen Bereich und in der Proteinherstellung (Huebner und Buch-holz 2002).

Die Herstellung von soliden Kugeln erfolgt durch Unterkühlung von gelierenden Substanzen wie Agarose oder Gelatine zu kolloidalen Aggregaten oder durch die Ausbildung ionischer Quervernet-zungen zwischen einem geladenen Polymer wie Alginat und einem zweiwertigen Ion, beispielsweise Calcium. Der vielfache Einsatz dieser Kugeln in der Kultivierung von Mikroorganismen und Zellen resultiert aus der mechanischen Stabilität und der guten Permeabilität. Nachteilig zeigt sich eine feh-lende solide Membranschicht, so dass Zellen aus der Kugel in das umgebende Medium auswandern können (Huebner und Buchholz 2002). Zudem ist eine Langzeitstabilität der Sphären in Gegenwart von Citrat, Phosphat, Laktat oder einwertigen Ionen wie Natrium aufgrund von Ausfällungs- oder Austauschreaktionen des Calciums aus der Quervernetzung mit Alginat nicht gegeben (Serp et al. 2000; Hübner 2007).

Besteht die solide Kugel aus einem geladenen Polymer (Alginat oder Agarose), kann durch die Be-schichtung mit gegensätzlich geladenen Polyelektrolyten wie Poly-L-Lysin oder Chitosan eine Simp-lexmembran an der Oberfläche der Kugel geschaffen werden. Das wechselnde Aufbringen weiterer gegensätzlich geladener Polymere führt zu einer mehrlagigen Membran, welche nach Belieben in Ei-genschaften wie der Molekülausschlussgröße oder in den Diffusionseigenschaften eingestellt werden kann. Solche Beschichtungen sorgen für eine Herabsetzung der Immunogenität, so dass bereits Stu-dien von verkapselten Therapeutika oder Zellen nach Transplantation in vivo zur Behandlung von Viruserkrankungen, Diabetis, Krebs oder Nierenversagen im Tierversuch durchgeführt wurden (Ori-ve et al. 2003; Wu et al. 2014).

Zur Herstellung von Hohlkugeln werden gegensätzlich geladene Polyelektrolyte verwendet, um in einem Schritt eine Simplexmembran um einen flüssigen Kern zu erzeugen. Hierbei ist eine Vielzahl der Kombinationsmöglichkeiten solcher Polymere wie Cellulosesulfat (CS) zusammen mit Poly(diallyl dimethylammoniumchlorid) (p(DADMAC)) oder CS mit Poly(Ehylen-imin) denkbar. Grundsätzlich werden die zu verkapselnden Zellen im negativen Elektrolyt aufgenommen und in ein Fällbad mit dem Gegenion vertropft. Geeignete Polymere können nicht ineinander diffundieren und es entsteht an der Oberfläche des Tropfens eine solide Simplexmembran (Huebner und Buchholz 2002). Auf-grund der hervorragenden Langzeitstabilität, der Biokompatibilität sowie des Ausschlusses der Im-munogenität eignen sich die Kapseln neben einer Hochzelldichtekultivierung von eukaryontischen Zellen auch zur Transplantation in vivo (Schaffellner et al. 2005; Hübner 2007; Rabanel et al. 2009).

Verfahren zur Herstellung der Kapseltypen im Labormaßstab sowie Möglichkeiten des upscalings wurden von Hübner und Buchholz (2002) ausführlich beschrieben. Die einfachste Form der Generie-rung von Kapseln mit einem Durchmesser von 1,5-3 mm ist durch die Vertropfung über eine Kanüle in ein Fällbad mit dem Gegenion gegeben. Zur Reduzierung des Durchmessers kann mit luft- oder flüssigkeitsüberlagerten Strömen durch eine Kanüle gearbeitet werden. Weitere Möglichkeiten zur Reduzierung der Kapselgröße bieten Verfahren mit mechanischer Zerkleinerung der Fluidtröpfchen und Prozesse, die über Vibrationen eine Tropfenbildung induzieren und so reproduzierbare Kapsel-größen bis 250 µm gewährleisten können (Huebner und Buchholz 2002).

20

Stand des Wissens

Als Applikation der Verkapselung in der Hochzelldichtekultivierung konnte bei verschiedenen euka-ryontischen Zelllinien Zelldichten im Bereich von 1∙108 Z∙ml-1 erreicht werden (Hübner 2007). Ebenso konnte die Kultivierung von Insektenzellen mit dem Wildtyp des Baculovirus und die Expression von rekombinantem GFP im Baculovirusexpressionssystem bei einer Zelldichte von ebenfalls etwa 1∙108 Z∙ml-1 erfolgreich durchgeführt werden. Dabei wurde die Ausbeute des Proteins im Vergleich zur Suspensionskultur etwa um den Faktor 30 gesteigert. Das Protein wurde allerdings nicht aus den Zellen sekretiert, so dass zur Quantifizierung die Kapseln aufgebrochen werden mussten (Son et al. 2006).

21

Problemstellung

3 Problemstellung Das Insektenzellen-Baculovirusexpressionssystem bietet sich aufgrund der starken Proteinexpression als kompetente Alternative zur Herstellung posttranslational modifizierter Proteine in Säugerzellen an. Die genetische Veränderung von Insektenzelllinien schafft zudem die Möglichkeit, auch human-glykosylierte Proteine für den therapeutischen Einsatz ohne die Bedenken einer Kontamination mit Humanpathogenen zu exprimieren. Im Hinblick auf eine weitere, prozessabhängige Erhöhung der Proteinausbeute stößt man jedoch in den üblichen Suspensionskultivierungen aufgrund der Physiolo-gie der Baculovirusinfektion an eine natürliche Grenze: Wie im Stand des Wissens dargestellt, erfolgt durch das Baculovirus ein so immanenter Eingriff in den Metabolismus der Insektenzelle, dass für die infizierten Zellen vor allem bei direktem Sauerstoffeintrag eine extreme Schersensitivität folgt. Dies resultiert selbst bei blasenarmer Begasung unter Kultivierungsbedingungen in einer etwa nur vier Tage andauernden Proteinproduktionsphase. Hierbei wird üblicherweise mit einer vergleichsweise niedrigen Zelldichte kultiviert, um eine Limitierung von Nährstoffen und Sauerstoff auszuschließen.

Eine effektive Strategie zur Steigerung der Proteinausbeute besteht in der prozesstechnischen Realisie-rung einer Hochzelldichtekultivierung im Baculovirusexpressionssystem. In diesbezüglichen Ansät-zen sind die Zellen physikalisch z.B. durch Membranen vor Scherkräften geschützt. Unter Nutzung membranbasierter Immobilisierungsmethoden soll nun der Beweis erbracht werden, dass die Kulti-vierung infizierter Insektenzellen in Hochzelldichte und die Herstellung rekombinanten Proteins möglich ist. Im Vergleich mit einer standardmäßigen Suspensionskultivierung soll zudem das Poten-tial der immobilisierten Kultivierung evaluiert werden.

22

Methoden

4 Methoden

4.1 Allgemeine Zellkultur

4.1.1 Silikonisierung von Erlenmeyerkolben

Um ein Anwachsen der Zellen an die Oberfläche der Erlenmeyerkolben zu vermeiden, werden die Kultivierungskolben mit Silikonöl beschichtet und passiviert. Dazu werden die sauberen Kolben mit etwa 50 ml Silikonöl ausgeschwenkt und bei 100°C 20 min lang getrocknet. Nach zweimaliger Wieder-holung werden die Kolben bei 180°C über 4 h eingebrannt und hitzesterilisiert.

4.1.2 Kryokultivierung

4.1.2.1 Einfrieren Aus einer vitalen (>95 % Vitalität) Vorkultur der Sf 21 (DMSZ Nummer AC 119) werden je einzufrie-rendem Kryoröhrchen 5·106 Zellen entnommen und über 8 min bei 180 g zentrifugiert. Das Pellet wird in 1,26 ml je Kryoröhrchen resuspendiert, 0,36 ml FCS sowie 0,18 ml DMSO je Röhrchen ergänzt. Es folgt eine definierte Abkühlung (1°C·min-1) mit einer einstündigen Lagerung bei -20°C, bevor die Röhrchen in die -80°C Kühltruhe überführt werden.

4.1.2.2 Auftauen Die Kryoröhrchen werden in der Hand aufgetaut, danach sofort in ein Zentrifugenröhrchen überführt und tropfenweise 10 ml Medium mit 10 % FCS zugegeben. Die Zellen werden bei 180 g 8 min lang pelletiert und in 18 ml Medium resuspendiert. Nach einer zweistündigen Inkubation in einer Zellkul-turflasche wird der Überstand verworfen und frisches Medium zugegeben.

4.1.3 Bestimmung der Zellkonzentration und der Vitalität von Suspensionskulturen

Zur Bestimmung der Zellkonzentration werden 100 µl Zellsuspension in einem Eppendorfgefäß mit 100 µl Trypanblau-Lösung (Tabelle 9-6) vermischt. Je nach Dichte der Kultur wird die Zellsuspension weiter mit 0,9 % NaCl-Lösung (Tabelle 9-5) verdünnt. Nach Auszählung von vier Großquadraten einer Neubauerzählkammer erfolgt die Berechnung der Zellkonzentration und der Vitalität unter Beachtung des Verdünnungsfaktors und der Trypanblau-positiven Zellen.

4.1.4 Batch-Kultivierung mit Suspensionszellen

Nach dem Auszählen der Vorkultur wird aus einer exponentiell wachsenden Vorkultur Zellsuspensi-on mit der gewünschten Gesamtzellzahl in ein PP-Zentrifugenröhrchen überführt. Nach einem Zentri-fugationsschritt von 8 min bei 180 g wird der Überstand verworfen und das Zellpellet in 10 ml vorge-wärmten Medium (Ex-Cell 420®, Insektenmedium) aufgenommen. Die Zellsuspension wird in einen silikonisierten Erlenmeyerkolben (300 ml) überführt und bis zum Gesamtvolumen von 30 ml mit Me-dium aufgefüllt. Die Kultivierung wird bei 27°C im Schüttelinkubator (50 rpm) durchgeführt.

23

Methoden

4.2 BVES in Suspension

4.2.1 Virusherstellung

Die Herstellung des rekombinanten Baculovirus erfolgt nach dem Protokoll des Baculogold™ Bright Kitsystems. Danach werden in vier wells einer 6-well-Platte je 106 Zellen ausgesät und über eine Stunde im Inkubator bei 27°C adhäriert. Im Anschluss wird das Medium abgezogen und mit 500 µl Transfek-tionspuffer A ersetzt. In einem 15 ml Zentrifugenröhrchen werden zu 10 µl linearisierter Baculogold™ Bright DNA, 4 µl des EPO Transfervektors und 2 ml Transfektionspuffers B pipettiert und gevortext. Jedem der wells wird 500 µl der Lösung unter Schütteln tropfenweise zugegeben. Nach einer vierstün-digen Inkubation wird der Überstand abgenommen, die wells mit 2 ml Medium gewaschen und erneut mit 2 ml Medium supplementiert. Nach einer fünftägigen Inkubation wird der Überstand abgezogen und bis zur Amplifikation des Titers bei 4°C gelagert.

4.2.2 TCID50 zur Bestimmung des Virustiters

Aus einer exponentiell wachsenden Vorkultur werden 4,5∙106 Zellen entnommen und über 8 min bei 180 g abzentrifugiert. Das Pellet wird mit 15 ml Medium auf eine Zellkonzentration von 3∙105 Z·ml-1 eingestellt. Parallel dazu wird eine dekadische Verdünnungsreihe aus Virusstock (10-3 bis 10-7) und Medium erstellt. Im Anschluss werden je 900 µl Zellsuspension einem Eppendorfgefäß mit 100 µl der Virusverdünnung zupipettiert. Somit beträgt die höchste Viruskonzentration 10-4. Die homogen ver-mischten Verdünnungsstufen werden zu je 8 wells pro Verdünnung mit zusätzlich 2 Kontrollreihen in eine 96-well-Platte pipettiert. Nach 10 d Inkubationszeit wird die Viruskonzentration nach Reed und Muench in pfu∙ml-1 bestimmt (Reed und Muench 1938). Die Berechnung des in der Arbeit verwendeten Virusstocks ergibt einen Titer von 2,15∙108 pfu∙ml-1 (Tabelle 4-1).

Tabelle 4-1: Auswertung des TCID50 nach der Methode von Reed und Muench.

Virusverdünnung

Positive wells

Negative wells

Infizierte wells in %

10-4 8 0 100

10-5 8 0 100

10-6 8 0 100

10-7 6 2 75

10-8 0 8 0

10-9 0 8 0

4.2.3 Amplifikation rekombinanter Viren

Nach Bestimmung der Zelldichte der Vorkultur werden Zellen für eine angestrebte Zelldichte von 5,0∙105 Z·ml-1 in den entsprechenden Ansätzen entnommen und zentrifugiert (8 min, 180 g). Die Zellen werden in 10 % des Endvolumens resuspendiert und entsprechend der Ansätze auf PP-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt. Die Viruskulturen werden mit einem MOI von 0,01 aus dem Virus-stock versetzt. Nach einer anschließenden Inkubation über 2 h bei 27°C und 50 rpm werden die Kultu-ren in silikonisierte Erlenmeyerkolben überführt und bis zum Gesamtvolumen aufgefüllt. Die Kulti-vierung wird bei einem Vitalitätsabfall auf 80 % in der infizierten Kultur abgebrochen, die Zellen und größere Zellbestandteile bei 3.220 g, 8°C über 30 min abzentrifugiert, der Kulturüberstand bei 4°C ge-lagert und der Virustiter nach Kapitel 4.2.2 bestimmt.

24

Methoden

4.2.4 Proteinherstellung

Das Vorgehen der Infektion und Kultivierung entspricht 4.2.3, jedoch wird ein höherer MOI von min-destens 3 eingesetzt. Der TOI wird zwischen 1,0 und 2,0∙106 Z·ml-1 gewählt.

4.2.5 Kultivierung mit Proteaseinhibitor

Zum Test des Einflusses von potentiellen Proteasen während der Kultivierung auf die Ausbeute des Zielproteins kann das Kulturmedium mit Proteaseinhibitor versetzt werden. Dazu wird eine neunfach konzentrierte Stammlösung aus 30 ml Kulturmedium mit Proteaseinhibitor angesetzt. 10 ml dieses Stocks entsprechen der Menge, die nach Ernte dem Kulturüberstand zugegeben wird, um proteolyti-schen Abbau des Proteins zu verhindern. Für die Kultivierungen mit Proteaseinhibitor werden 100 % (10 ml) bzw. 50 % (5 ml) dieser Menge dem Medium beigemischt.

4.3 Immobilisierung durch Verkapseln

4.3.1 Verkapselung nicht infizierter Zellen

4.3.1.1 Vorbereitung des Natriumcellulosesulfats (NaCS) Das NaCS quillt mit 1,9%w/v in PBS (pH 6,3, Tabelle 9-2) über Nacht in einem mit Parafilm bedeckten Becherglas. Die Lösung wird im Anschluss auf einem Magnetrührer homogenisiert; aufgrund der Viskosität muss beachtet werden, dass der Rührmagnet das Becherglas im Durchmesser möglichst ausfüllt. Das Autoklavieren der NaCS-Lösung in dem mit Alufolie bedeckten Becherglas findet im vorgeheizten Autoklav über 5 min bei 121°C statt, um eine zu starke Autolyse der CS-Ketten zu ver-hindern. Unter Rühren wird die Lösung auf RT abgekühlt.

4.3.1.2 Vorbereitung von p(DADMAC) Je 5 ml einzusetzender NaCS-Lösung werden 125 ml p(DADMAC) (1,2 %w/w) in PBS (Tabelle 9-2) mit einem Tropfen Tween versetzt als Fällbad vorbereitet. Dem Becherglas wird ein Magnetrührfisch zu-gegeben und die mit Alufolie abgedeckte Lösung zusammen mit dem NaCS autoklaviert.

4.3.1.3 Verkapselung Zum Verkapseln werden pro ml NaCS 1,0∙106 Zellen aus einer exponentiell wachsenden Vorkultur entnommen und abzentrifugiert. Das Pellet wird in FCS resuspendiert, so dass im finalen Ansatz 5 % FCS enthalten sind. Bei anschließender Zugabe von NaCS muss auf eine homogene Vermischung mit der Zellsuspension geachtet werden. Die Suspension aus Zellen, FCS und NaCS wird in eine sterile Einmalspritze überführt und mit Hilfe einer Schlauchpumpe über eine Kanüle in das gerührte Polymerisationsbad mit p(DADMAC) vertropft. Nach einer Polymerisationsdauer von 5 min wird der Überstand abgekippt und die Kapseln werden 3 mal über 15 min mit 250 ml mit PBS (Tabelle 9-2) gewaschen. Danach werden die Kapseln in Schikanekolben überführt; je 5 ml NaCS-Lösung werden 40 ml Kulturmedium eingesetzt. 2 h nach der Verkapselung wird ein Mediumwechsel durchgeführt. Die Kultivierung geschieht im Inkubator bei 27°C und 70 rpm.

4.3.1.4 Bestimmung der Zellkonzentration und der Vitalität in verkapselten Zellen Um die verkapselten Zellen einer Bestimmung der Zellkonzentration durch Auszählung in einer Neubauerzählkammer zugänglich zu machen, werden die soliden Kapseln zunächst aufgelöst und die Zellen in Suspension gebracht. Eine Probe von mindestens drei Kapseln wird dazu durch Abtupfen von Medium befreit und in ein Zentrifugenröhrchen gegeben. Zur Bestimmung der benötigten Menge an Cellulase-Lösung (Tabelle 9-7) werden die Kapseln abgewogen. In den ersten beiden Wochen der Kultivierung wird zum Auflösen der Kapseln unter der Annahme, dass 1 ml Cellulase 1 g Kapsel ent-spricht, die 6-fache Menge des Kapselgewichts an Cellulase, ab der dritten Woche die 11-fache Menge

25

Methoden

eingesetzt. Die in Cellulase suspendierten Kapseln werden über 2 h im Schüttelinkubator (50 rpm) bei 27°C inkubiert. Im Anschluss werden die größtenteils aufgelösten Kapseln durch Pipettieren homoge-nisiert, mit Trypanblau angefärbt und gezählt.

4.3.1.5 Fed-batch-Kultivierung von verkapselten Zellen Die verkapselten Zellen werden im Inkubator bei 27°C und 100 rpm kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgt alle 2 Tage, Kapseln für Zellzählung oder andere Messungen werden mit abgeschnittenen Pi-petten steril entnommen.

4.3.2 Verkapselung infizierter Zellen

Die Versuchsvorbereitung sowie die Verkapselung werden wie unter 4.3.1 beschrieben durchgeführt. Jedoch werden parallel zur Vorkulturführung einen Tag vor der Verkapselung Zellen mit einem MOI von 5 infiziert (Kapitel 4.2.4) und über Nacht inkubiert. Am Tag der Verkapselung wird durch eine Messung am Durchflusszytometer der Anteil der GFP-positiven (Kapitel 4.5.3), also infizierten Zellen, bestimmt. Durch die Einstellung einer gewünschten Mischung zwischen der infizierten Kultur und der nicht infizierten Vorkultur kann ein beliebiger Anteil an infizierten Zellen pro Kapsel erreicht werden (MOIK).

4.4 Immobilisierung im Hohlfaserreaktor (HFR)

Die Kenndaten der verwendeten Hohlfaserreaktoren sind in Tabelle 4-2 zusammengefasst.

Tabelle 4-2: Charakteristika und Benennung der verwendeten Hohlfaserreaktoren.

Reaktortypen 1 bzw. 2 3 4

Hersteller SpectrumLabs.com SpectrumLabs.com FiberCellSystems

Länge cm 10,2 23 15

Membranoberfläche cm² 8 20 3.000

Material PS mPES PS

EKR ml 0,5 0,9 20

Anzahl Fasern 6 6 4.608

dI Kapillaren mm 0,5 0,5 0,2

MWCO kDa 10 bzw. 500 100 20

Rückhalt % 95 95 50

26

Methoden

4.4.1 Bestimmung der Verweilzeit (VWZ)

Abbildung 4-1: Fließschema zur Verdrängungsmessung im HFR mit Vorlagegefäßen für Puffer sowie Markie-

rungssubstanz, Schlauchpumpe, HFR, Fluoreszenz-Durchflussküvette sowie Abfallgefäß.

Zur Ermittlung des Verweilzeitverhaltens der HFR wird eine Verdrängungsmessung mit dem Fluo-reszenzfarbstoff Resorufin durchgeführt (Abbildung 4-1). Durch Umschalten eines drei-Wege-Hahnes wird die 1:100 in Carbonatpuffer (Tabelle 9-12) verdünnte Stocklösung von Resorufin (Tabelle 9-13) zum Startzeitpunkt in den zu untersuchenden HFR gepumpt. Die ansteigende Konzentration an Reso-rufin wird am Ausgang des Reaktors über ein Spektrometer nach Laseranregung in einer Fluores-zenzdurchflussküvette gemessen. Um eine F(t)-Kurve zu erhalten, werden die Daten über die Zeit aufgetragen. Die VWZ ergibt sich unter Berücksichtigung der Durchflussrate, dem Volumen in der Peripherie und dem HFR-Volumen. Die Einflüsse der Peripherie auf die VWZ werden durch Refe-renzmessungen ohne HFR erfasst.

4.4.2 Vorbereitung des HFR

Wie in Abbildung 4-2 dargestellt, verfügen sowohl der Kapillarraum (KR) als auch der Extrakapillar-raum (EKR) des HFR über jeweils zwei Luer-Lock-Zugänge. An diese können Spritzen oder Schläuche angeschlossen werden. Die Verwendung von unsterilen Medien kann durch Zwischenschalten eines Sterilfilters ermöglicht werden.

Zur Bestimmung des Reaktorvolumens wird vor dem Einbau der HFR in den Medienkreislauf (Abbildung 4-3 und Abbildung 4-4) das Leergewicht bestimmt. Danach wird der Reaktor wie folgt mit mehreren Spülschritten vorbereitet: Bei Polysulfonfasern (PS) wird mit 2 ml an 100 % Ethanol, danach 2 ml Reinstwasser pro cm² Membranoberfläche gewaschen; modifizierte Polyethersulfon (mPES) Membranen werden lediglich mit 1 ml Reinstwasser pro cm² gespült. Zur Bestimmung des Reaktorvo-lumens wird der wassergefüllte HRF abgewogen. Anschließend wird der gesamte Reaktor mit Zell-kulturmedium gefüllt und an die autoklavierte Peripherie im Inkubator bei 27°C angeschlossen und der Kreislauf gestartet.

27

Methoden

Abbildung 4-2: Schematischer Aufbau eines Hohlfaserreaktors mit Luer-Adaptern an den Zugängen des KR

sowie des EKR.

4.4.3 Aufbau und Vorbereitung der Reaktorperipherie

Die Reaktorperipherie für die HFR-Typen 1 bis 3 (Tabelle 4-2) setzt sich aus einem Medienkreislauf mit einem Medienreservoir, einer kalibrierten Schlauchpumpe (Kapitel 4.4.3.3) und jeweils um den Reaktor positionierten Durchflusssonden zur Messung des Sauerstoffpartialdrucks zusammen (Abbildung 4-3). Für die möglichst kurzen Schlauchstücke zwischen dem Reaktor und den Sonden wird gasundurchlässiges Material verwendet, für den Rest des Kreislaufs Silikonschläuche. Der ge-samte dargestellte Aufbau befindet sich während der Kultivierung im Inkubator bei 27°C.

Abbildung 4-3: Reaktorperipherie für HFR 1 bis 3 mit Medienreservoir, Schlauchpumpe sowie Durchflussson-

den zur Sauerstoffmessung vor und nach dem HFR.

Zur Kultivierung im HFR Typ 4 wird der Aufbau der Peripherie erweitert (Abbildung 4-4): Das Me-diumreservoir besteht aus einem temperaturgeregelten und begasten Rührkessel (STR, stirred tank reaktor) mit einem Gesamtvolumen von 1,3 l und einem Mediumvolumen von 800 ml. Der STR ist zu-dem mit einer amperometrischen Sauerstoffelektrode sowie einer pH-Elektrode ausgestattet. Die Be-gasung erfolgt über eine Ringbrause. Im Abgasstrom ist ein Kondensatabscheider angebracht, der Kulturraum ist mit Luftfiltern eingeschlossen. Zur Kalibrierung der Sauerstoffsonden kann die Zuluft mit Stickstoff oder Druckluft gespeist werden. Die Parameter im STR werden über einen Control Tower am PC aufgenommen und gesteuert. Für den Kulturkreislauf mit dem HFR zieht eine kalibrierte Schlauchpumpe (Kapitel 4.4.3.3) das Medium aus dem STR. Blasenfallen mit Pulsationsdämpfer und integrierten Spots zur Sauerstoffmessung sind vor und nach dem HFR in den Medienkreislauf imple-mentiert. Während der Kultivierung befindet sich der HFR im Inkubator bei 27°C und ist über gas-

28

Methoden

dichte Schläuche mit der Pumpe an den STR gekoppelt. Die Schlauchlänge wird so gewählt, dass der HFR aus dem Inkubator genommen und für Probenahmen usw. unter die Sicherheitswerkbank ge-bracht werden kann, ohne den Kreislauf zu trennen.

Abbildung 4-4: Reaktorperipherie für HFR 4 mit Messonden für Temperatur, pH-Wert sowie Sauerstoffsätti-

gung im Medienreservoir (STR) mit Gaszufuhr (Luft, Stickstoff), Abgaskühler, Sterilfilter und mit dem Perfusionskreislauf mit Pumpe, Blasenfallen und Sauerstoffsonden vor und nach dem HFR.

4.4.3.1 Aufbau des Kreislaufs Vor der Benutzung wird die Peripherie exklusive des HFR autoklaviert; anstatt des HFRs ist der Kreislauf mit einem Schlauchstück geschlossen. Durch Anlegen von Druckluft wird das System auf Dichtigkeit geprüft, anschließend mit Insektenmedium befüllt. Nach der Kalibrierung der Sauer-stoffsonden (Kapitel 4.4.3.4 und 4.4.3.5) wird der Kreislauf zum Zwecke eines Steriltests mindestens 2 Tage lang betrieben.

Parallel dazu werden die vorbereiteten HFR (4.4.2) in einen separaten Kreislauf mit einem Medienre-servoir und einer Schlauchpumpe eingespannt und ebenfalls mindestens 2 Tage mit wiederholtem Mediumwechsel gespült, um eventuelle Rückstände von zelltoxischen Stoffen auszuspülen.

4.4.3.2 Bestimmung des Stoffübergangskoeffizienten im Rührkesselreaktor Während des Steriltests kann im STR unter Anwendung der Ausgasungsmethode mit Stickstoff der Stoffübergangskoeffizient für Sauerstoff des Reaktors (kl,a) in Insektenmedium ermittelt werden. Dazu wird zunächst der Sauerstoff durch Anlegen von Stickstoff ausgestrippt, anschließend nach Umschal-ten auf Luftzufuhr die Steigung der Sauerstoffsättigung aufgenommen. Aus der Steigung kann der kl,a für die gewählte Rührerdrehzahl und den Begasungsstrom berechnet werden.

4.4.3.3 Kalibrieren der Pumpen Vor dem Anschluss des HFR an den Medienkreislauf ist eine Kalibrierung der Pumpen nötig. Dazu wird für verschiedene Pumpengeschwindigkeiten in bestimmten Zeitintervallen Wasser in ein Gebin-de gepumpt, abgewogen und der Durchfluss berechnet. Die Kalibriergeraden für die entsprechenden Pumpen finden sich unter (Abbildung 9-13 und Abbildung 9-14).

29

Methoden

4.4.3.4 Kalibrierung der Durchfluss-Sauerstoffsonden Sobald das Zellmedium auf 27°C temperiert ist, können die Sauerstoffsonden mit einem angenomme-nen Normaldruck von 1.013 hPa kalibriert werden. Die Kalibrierung der Sonden läuft in jedem Fall gleich ab, unabhängig vom verwendeten Messaufbau mit Sauerstoff-Durchflussküvetten oder Sauer-stoffspots in den Blasenfallen.

Für den 0 %-Wert wird das Mediumreservoir über gasdichte Schläuche mit Stickstoff begast. Sobald die Auswertesoftware einen konstanten Phasenwinkel konstatiert, wird die 0 %-Marke festgelegt. Anschließend wird mit Druckluft begast und bei konstantem Phasenwinkel die Kalibrierung mit dem 100 %-Wert abgeschlossen.

4.4.3.5 Kalibrierung der amperometrischen Sauerstoff-Sonde Der STR wird mit Medium gefüllt, auf 27°C temperiert und mit Stickstoff begast. Sobald eine konstan-te Stromstärke verzeichnet wird, wird der 0 %-Wert gesetzt. Druckluftbegasung und die Einstellung des 100 %-Wertes beenden die Kalibrierung.

4.4.3.6 Kalibrierung der pH-Sonde Die pH-Sonde des STR wird vor dem Autoklavieren bei einer konstanten Temperatur mit Puffer-Lösungen (pH 7,02 und 4,01) bei Erreichen einer konstanten Spannung kalibriert.

4.4.4 Kultivierung im HFR

4.4.4.1 Reaktortyp 1 bis 3 Zur Animpfung des HFR werden Zellen aus einer exponentiell wachsenden Vorkultur mit einer steri-len Spritze in den Reaktor injiziert und mit Hilfe einer zweiten Spritze im Reaktor verteilt. Gegebenen-falls wird die Vorkultur vor dem Injizieren mit infizierten Zellen gemischt. Nach dem Anschluss der Sonden im Inkubator werden der Medien-Kreislauf und die Sauerstoffmessung gestartet. Während der Kultivierung können unter der Sicherheitswerkbank mit Spritzen Proben genommen werden. Das entnommene Volumen wird durch frisches Kulturmedium ersetzt.

4.4.4.2 Reaktortyp 4 Mit abgeschlossener Vorbereitung des HFR und der Peripherie wird zum Animpfen des Reaktors die gewünschte Zellzahl aus einer exponentiell wachsenden Vorkultur entnommen. Bei Bedarf wird die Vorkultur mit einer gewünschten Zellzahl an infizierten Zellen gemischt, um im Reaktor einen belie-bigen MOIH (Anteil der infizierten Zellen beim Animpfen des HFR) einzustellen. Die Zellsuspension wird mit sterilen Spritzen in den HFR gespült und durch mehrmaliges Durchspülen möglichst homo-gen verteilt. Nach dem Animpfen werden sowohl der Mediumkreislauf als auch sämtliche Messungen gestartet.

Während der Kultivierung können aus dem Medienreservoir sowie aus dem EKR des Hohlfasermo-duls Proben zur Bestimmung von Metaboliten- sowie EPO-Konzentration entnommen werden. Wei-terhin wird nach Bedarf ein Teil des Mediums aus dem Reservoir gewechselt.

30

Methoden

4.5 Zellanalytik

4.5.1 Messung der Sauerstoffverbrauchsrate der Suspensionszellen

Abbildung 4-5: Messaufbau zur Bestimmung der Sauerstoffaufnahmerate mit den Komponenten: OXY-

Transmitter (1), Glasfaserkabel (2), Stick-on Adapter (3), Magnetrührfisch (4), Sensorspot (5), Messkammer (6), Wärmemantel (7), POM-Verdrängungskörper (8), Verschlusskappe (9), Mag-netrührer (10), Temperatursonde (11), Wärmetauscher (12), Schlauchpumpe (13) und Silikon-schlauch (14).

Die Messkammer (6) des Versuchsaufbaus (Abbildung 4-5) wird mit etwa 6 ml vortemperiertem (27°C) Insektenmedium gefüllt. Der Wärmekreislauf, bestehend aus einer Schlauchpumpe (13), dem Wärmetaucher (12) und dem Wärmemantel (7), gewährleistet eine konstante Temperatur in der Inku-bationskammer. Der Magnetrührer (10) sorgt für möglichst homogene Mischverhältnisse. Vor Beginn der eigentlichen Messung muss eine Kalibrierung der Sensorspots (5) (siehe unten) durchgeführt wer-den. Für die Messung wird die gewünschte Zellzahl aus einer Vorkultur entnommen und zentrifu-giert. Das Pellet wird in genau so viel Medium resuspendiert, dass die Messkammer damit komplett befüllt werden kann. Der POM-Zylinder (8) verdrängt beim Schließen die restliche Luft aus der Inku-bationskammer. Die Messung wird über die Auswertesoftware gestartet und bei einem konstanten 0 %-Wert abgebrochen.

4.5.1.1 Kalibrierung auf 0 % Sauerstoffpartialdruck In die Messkammer wird, über ein Rotameter geregelt, Stickstoff eingeleitet, ohne dass es zu einer übermäßigen Schaumbildung kommt; die Öffnung wird mit einem Zellstofftuch abgedeckt. Nach Start der Auswertesoftware wird gewartet, bis sich ein minimaler Wert an pO2 einstellt. Die Kalibrie-rung erfolgt bei konstanter Temperatur in der Messkammer und bei konstantem Sauerstoffwert in Bezug auf den vorherrschenden Luftdruck und der Temperatur im Medium. Die Folgemessungen können bei unterschiedlichen, aber konstanten Temperaturen durchgeführt werden.

4.5.1.2 Kalibrierung auf 100 % Sauerstoffpartialdruck Die Kalibrierung des Messaufbaus auf 100 % pO2 wird analog zu Kap. 4.5.1.1 durchgeführt, jedoch wird zur Einstellung des Gleichgewichts mit Druckluft begast.

31

Methoden

4.5.2 Messung des Sauerstoffprofils über die Kapselgeometrie

Abbildung 4-6: Schema des Messaufbaus zur Bestimmung des pO2-Profils über die Kapsel mit Saugbecken (1),

OXY-Transmitter (2), Glasfaserkabel (3), Klemmschraube (4), Pulsationsdämpfer (5), Überlauf-becken (6), Silikonschlauch (7), Kanüle mit implementiertem ausfahrbarem O2-Mikrosensor (8), Temperatursonde (9), Wärmetauscher (10), Schlauchpumpe (11), NaCS Hohlkapsel (12), An-saugstutzen (13), Kulturkammer (14) und Silikonschlauch (15).

Im Wärmekreislauf, bestehend aus Kulturkammer (14), Schlauchpumpe (11), Wärmetauscher (10) und Pulsationsdämpfer (5) exklusive des Ansaugstutzens und der Hohlkapsel (12 und 13), wird Kultur-medium auf 27°C vortemperiert.

Für die Kalibrierung auf 0 % pO2 (prinzipiell analog zu Kap. 4.5.1.1) wird der Medienkreislauf ge-stoppt und der Mikrosensor im mit Stickstoff begasten Ansaugbecken eingetaucht. Die Kalibrierung auf 100 % pO2 wird unter Begasung mit Druckluft durchgeführt.

Für die Messung des Sauerstoffprofils wird eine Hohlkapsel aus Kultur in einer Petrischale mit etwas Zellmedium entnommen und am Mikroskop fotodokumentiert. Durch Öffnen der Klemmschraube (4) entströmt dem Saugbecken (1) Wasser und der in den Silikonschläuchen (15) entstehende Unterdruck kann am Ansaugstutzen (13) genutzt werden, um eine Hohlkapsel zu fixieren. Das Überlaufbecken (6) verhindert, dass eventuell angesaugtes Medium aus der Petrischale aufgrund von Kapillarkräften im Silikonschlauch dem Unterdruck entgegenwirkt. Nach dem Einbringen in die Kulturkammer wird diese mit Medium überströmt. Der Mikrosensor (8) wird über der Kapsel zentriert und die Sonden-spitze mittels einer Präzisionsschraube bis etwa zu einer Eindringtiefe von 75 % des Kapseldurchmes-sers in die Kapsel versenkt. Nun wird der Wärmekreislauf gestartet; der Hüllstrom aus sauerstoffge-sättigtem Medium strömt mit einer Flussrate von 20 -1 an der Messsonde entlang und über die Kapsel. Somit wird erreicht, dass die Kapsel beständig von Medium bedeckt ist und mit Sauerstoff versorgt wird. Nach Start der Messung wird die Sondenspitze über die Mikrometerschraube schritt-weise, beim Einstellen eines konstanten Wertes für den Sauerstoffpartialdruck, aus der Kapsel gezo-gen. Die Profilmessung ist abgeschlossen, sobald der Sensor die Kapsel verlässt und den Sättigungs-wert des Mediums anzeigt.

32

Methoden

4.5.3 Identifizierung der infizierten Zellen

Infizierte Zellen produzieren das Reporterprotein GFP, welches im Fluoreszenzmikroskop optisch etwa zwei Tage p.i. sowie im Durchflusszytometer etwa 18 h nach der Infektion nachgewiesen werden kann. Für die Quantifizierung des Infektionserfolges werden etwa 1,0∙106 Zellen an Probe entnommen und im Durchflusszytometer vermessen. Dazu wird die Probe mit 0,9 % NaCl so verdünnt, dass nicht mehr als 500 Events pro Sekunde detektiert werden. Die Auswertung erfolgt anhand eines Histo-gramms nach Auftragung des grünen Fluoreszenzkanals.

4.5.4 Bestimmung des Zellzyklus mit Propidiumjodid (PJ)

Eine Probe von etwa 5,0∙105 bis 1,0∙106 Zellen wird aus der Kultur entnommen, abzentrifugiert und das Pellet in 1 ml DNA-Puffer (Tabelle 9-4) resuspendiert. Nach Zugabe von 300 µl RNAse-Lösung (Tabelle 9-8) erfolgt eine Inkubation über 20 min bei Raumtemperatur (RT). Nach Anfärbung mit 50 µl PJ (Tabelle 9-14) und einer weiteren Inkubation bei RT (30 min) erfolgt die Erfassung der Ergebnisse am Durchflusszytometer. Die Auswertung erfolgt in einem Histogramm basierend auf dem Fluores-zenzkanal Fl-3.

4.5.5 Zellsynchronisation

Zur Herstellung einer synchron wachsenden Kultur werden 5,0∙105 vitale Zellen aus der Vorkultur entnommen, bei 180 g über 8 min zentrifugiert und in frischem Medium resuspendiert. Das Medium wird mit einer 1:50 Verdünnung an Hydroxyharnstoff-Stocklösung (Tabelle 9-15) versetzt. Eine Inku-bation über Nacht bei 27°C und 50 rpm führt zu einer Synchronisation der Kultur in der S-Phase. Nach einmaligem Waschen mit PBS pH 6,3 (Tabelle 9-2) erfolgt die weitere Kultivierung in frischem Medi-um.

4.5.6 Tracking der Zellteilung mit CFDA-SE

Zu färbende Zellen werden zentrifugiert (180 g, 8 min) und in 1 ml des Überstandes resuspendiert. Der Zellsuspension wird 1 ml der CFDA-SE-Gebrauchslösung (Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester, Tabelle 9-11) zugegeben, die Zellen über 30 min bei 27°C und 50 rpm im Dunkeln inkubiert. Nach erneutem Zentrifugieren folgt ein Waschschritt in PBS pH 6,3. Die Zellen können direkt im Durchflusszytometer vermessen (grüner Kanal, Fl-1) oder in frischem Medium weiter kultiviert wer-den. Das CFDA-SE verteilt sich bei Zellteilung auf die Tochterzellen; daher kann die Intensität der Fluoreszenz im Histogramm zum Tracking der Zellteilung verwendet werden.

4.5.7 Bestimmung der Glukosekonzentration im Kulturmedium

Für die Kalibrierung der enzymatischen Bestimmung der Glukosekonzentration wird eine Verdün-nungsreihe mit Medium erstellt (bis 1:10). Davon, und von den zu messenden Proben werden je 10 µl in eine 96-well-Platte gegeben und mit je 200 µl Glucose liquiUV mono versetzt. Zusätzlich wird eine blank-Probe mitgeführt. Die 96-well-Platte wird bei 37°C und 100 rpm geschüttelt und über 20 min im Plate-reader inkubiert. Im Anschluss wird in den Proben die Absorption des in der Reaktion gebildeten NADH/H+ von 340 nm vermessen und über die Kalibrierung die Glukosekonzentration berechnet.

4.5.8 Bestimmung der Laktatkonzentration im Kulturmedium

Der Bestimmung von Laktat im verwendeten Kitsystem liegt ebenfalls der Absorptionsanstieg von NADH/H+ zugrunde, das über die enzymkatalysierte Reaktion (Laktat-Dehydrogenase, D-LDH) von Laktat zu Pyruvat aus NAD+ gebildet wird. Pyruvat wird aus diesem Gleichgewicht über eine Transaminierung (D-Glutamat-Pyruvat-Transaminase, D-GPT) als D-Alanin bzw. 2-Oxoglutarat entzo-

33

Methoden

gen. Für den Einsatz in der 96-well-Platte ergibt sich für die Messung ein Volumen von Vw=234 µl im well. Der Test kann in einem Messbereich von 0,03-3,3 mM angewandt werden.

Tabelle 4-3: Pipettierschema der Bestimmung der Laktatkonzentration im Kulturmedium.

Lösung Blank in µl

Probe in µl

H2Oreinst 170 160

Probe - 10

Probenpuffer 50 50

NAD+ 10 10

D-GTP 20 20

Die 96-well-Platte wird für 3 min auf dem Schüttler bei 350 rpm gemischt, im Anschluss die Anfangs-absorption A1 bei 340 nm bestimmt. Die Reaktion wird durch Zugabe von je 20 µl D-LDH-Lösung gestartet. Nach 5 min Inkubation auf dem Schüttler kann die Endabsorption A2 gemessen werden. Die Differenz der beiden Absorptionswerte des Blanks ΔAB wird von der Differenz der Probenwerte ab-gezogen. Zur Erstellung einer Kalibrierung wird mit den entsprechenden Standards analog verfahren. Die Berechnung der Laktatkonzentration erfolgt nach:

c=Vw∙MWϵ∙l∙v

∙ΔALaktat

Formel 4-1

mit

l =VW

π ∙ �d2�

2

Formel 4-2

c Konzentration an Laktat g∙l-1

VW Testvolumen µl

MW Molekulargewicht Laktat g∙mol-1

ε Molarer Extinktionskoeffizient; 6300 l∙mol-1∙cm-1

l Weglänge cm

v Probenvolumen µl

d Durchmesser eines wells cm

34

Methoden

4.6 Proteinanalytik

4.6.1 Probenvorbereitung und Zellaufschluss

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Proben aus Kulturüberständen von Suspensionskulturen, immobili-sierten Kulturen (Kapseln, Hohlfaser) sowie aus Zellaufschlüssen der Analytik zugeführt. Proben aus Kulturüberständen werden nach der Entnahme zunächst bei 3.220 g und 7°C für 15 min zentrifugiert, um Zellen sowie größere Zellbruchstücke und Partikel abzutrennen. Im anschließenden Zentrifugati-onsschritt bei 15.000 g, 7°C werden über 20 min kleinere Bruchstücke entfernt. Die Überstände werden direkt verwendet oder zur Lagerung bei -20°C eingefroren und für die Verwendung aufgetaut und mit Proteaseinhibitor versetzt.

Für den Zellaufschluss wird ein Pellet aus Suspensionszellen mit dem dreifachen Volumen an Lyse-puffer (Tabelle 9-24) versetzt und bei 300 rpm auf einem Schüttler über 30 min verdaut. Das Lysat wird bei 16.000 g und 4°C über 10 min abzentrifugiert, der Überstand in ein neues Röhrchen überführt und restliche Partikel und Zellbestandteile über 30 min bei 16.000 g und 4°C abzentrifugiert. Die Lysate können entweder bei -20°C eingefroren oder direkt verwendet werden.

4.6.2 Gesamtproteinfällung

Zur Fällung des gesamten Proteoms wird ein Teil Probe mit 8 Teilen Aceton (20 mM DTT) sowie ei-nem Teil Trichloressigsäure versetzt. Die Mischung wird nach Zugabe der Komponenten invertiert. Nach der Präzipitation bei -20°C wird das ausgefällte Protein bei 4°C über 15 min bei 18.000 g abzentri-fugiert. Der Überstand wird dekantiert und das Pellet mit 1 ml eiskaltem Aceton (20 mM DTT) gewa-schen. Nach Wiederholung des Zentrifugationsschrittes wird der Überstand verworfen und das restli-che Aceton verdampft, ohne das Pellet komplett zu trocknen. Das Pellet wird in der gewünschten Menge aufgenommen und über eine Stunde bei gelegentlichem Vortexen oder Mischen gelöst.

4.6.3 SDS-Gelelektrophorese

4.6.3.1 Vorbereitung und Durchführung Zum Gießen der Gele werden die Platten von Staub, Fett und Proteinen gereinigt und im Gießstand fixiert. Zunächst wird das Trenngel (Tabelle 9-25) gegossen und für die Polymerisationsdauer von 45 min mit Isopropanol überschichtet, um ein Austrocknen und die Bildung von Luftblasen im Gel zu verhindern. Nach dem vollständigen Entfernen des Isopropanols wird über das polymerisierte Trenn-gel die Sammelgel-Lösung (Tabelle 9-26) gegossen und die Glasplatten vollständig aufgefüllt. Der Probenkamm wird eingesetzt. Das Sammelgel polymerisiert ebenfalls 45 min.

Für die Gelelektrophorese werden 3 Teile Probe in einem Eppendorfgefäß mit einem Teil 4-fachen Probenpuffer (Tabelle 9-27) versetzt, über 10 min bei 95°C und 350 rpm im Thermomixer erhitzt und anschließend mit Eis auf RT abgekühlt.

Nach dem Zusammenbau wird die Elektrophorese-Apparatur mit 1-fach konzentriertem Laufpuffer (Tabelle 9-28) aufgefüllt sowie die Taschen des Gels mit 40 µl vorbereiteter Probe befüllt. Um eine Überhitzung zu vermeiden, steht die Apparatur während der Laufzeit von 20 min (70 V) für das Sammelgel, respektive 50-60 min (180 V) für das Trenngel, im Eisbad.

4.6.3.2 Färbung mit Coomassie Blau Nach dem Lauf wird das Gel entnommen und über Nacht bei RT in Fixierlösung (Tabelle 9-29) ge-schwenkt. Im Anschluss wird das Gel drei Stunden in Coomassie Blau Färbelösung (Tabelle 9-30) inkubiert, danach durch mehrmaliges Waschen mit Reinstwasser entfärbt und dokumentiert.

35

Methoden

4.6.3.3 Färbung mit Silbernitrat Nach der Entnahme aus der Gelelektrophorese wird das Gel über Nacht in 50 ml Fixierlösung (Tabelle 9-31) geschwenkt. Es folgt eine 30-minütige Inkubation in 50 ml Sensitivierlösung (Tabelle 9-32). Nach einem dreifach wiederholten Waschschritt wird das Gel über 20 min in 50 ml Silbernitratlösung inku-biert. Zur eigentlichen Färbung wird das Gel in 50 ml Entwicklerlösung (Tabelle 9-34) gegeben. Bei gewünschtem Färbegrad wird die Lösung abgekippt und die Färbung mit 50 ml Stopplösung (Tabelle 9-35) beendet. Das Gel kann im Folgenden in Reinstwasser gelagert und dokumentiert werden.

4.6.4 2D-Gelelektrophorese

4.6.4.1 Isoelektrische Fokussierung (IEF) Für die isoelektrische Fokussierung wird ein 7 cm IPG-Streifen mit einem nichtlinearen pH-Gradienten von pH 3-10 mit 3 bis 6 µg Protein beladen. Die Proteinmenge wird entsprechend nach einer Fällung (Kap. 4.6.2) und einer Quantifizierung (Kap. 4.6.7) rehydratisiert (Tabelle 9-41) und ein-gestellt. Das Volumen wird mit Rehydratisierungspuffer auf 125 µl eingestellt und der Lösung etwa 20 ppm Bromphenolblau zur optischen Kontrolle der Auftrennung zugegeben. Nach dem gleichmäßi-gen Beladen der Probenkammer mit der Proteinlösung wird der IPG-Streifen mit Ausrichtung nach unten in die Kammer gegeben und mit 300 µl Silikonöl überschichtet. Über Nacht wird der Strip so rehydratisiert. Vor Beginn der Fokussierung werden zugeschnittene Filterpapierstücke in Reinstwas-ser getränkt und auf die Elektroden in der Probenkammer platziert. Die IPG-Streifen werden noch-mals mit dem Silikonöl überschichtet und die Fokussierung wird begonnen (Tabelle 4-4). Im Verlauf müssen die Filterpapierstücke nach jedem Teilschritt bzw. beim Erreichen hoher Stromstärken über 50 µA gewechselt werden.

Tabelle 4-4: Spannungsprotokoll für die isoelektrische Fokussierung.

Stufe Bezeichnung Spannung in V

Dauer in Vh

Dauer in min

S1 Step & Hold 300 200 ~30

S2 Gradient 1000 300 ~30

S3 Gradient 5000 4500 ~90

S4 Step & Hold 5000 3000 ~36

4.6.4.2 SDS-PAGE nach IEF Der Gelstreifen aus der IEF wird nach Beendigung des Protokolls zunächst 15 min in 7 ml Equilibrie-rungspuffer A, anschließend analog in Equilibrierungspuffer B (Tabelle 9-42) inkubiert und dabei reduziert und alkyliert. Damit der Strip bündig in das Sammelgel eingesetzt werden kann, wird der Streifen noch entsprechend gekürzt.

Das Gießen der Trenngele wird analog zu Kap. 4.6.3.1 durchgeführt. Das Sammelgel wird zunächst nur so weit gegossen, dass der Kamm für die Probentaschen nur leicht eintauchen würde. Für die spätere Markertasche wird ein Zahn des Kammes eingesetzt. Nun wird der vorbereitete Streifen mög-lichst ohne in die Markertasche zu ragen in das Gel eingesetzt und bis zum Rand der Glasplatten mit Agarose übergossen. Nach dem Aushärten wird das Kammstück aus der Markertasche entfernt. Die Einstellungen des Gel-Laufes finden sich unter Kap. 4.6.3.1. Im Anschluss besteht die Möglichkeit einer Silber- oder Coomassie-Färbung bzw. die Durchführung eines Westernblots.

36

Methoden

4.6.5 Western-Blot

Für die Durchführung der Western-Blots wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Übertra-gungsverfahren angewandt.

4.6.5.1 Dot-Blot Eine Probe aus hergestelltem Protein oder Proteinstandard wird nach Kapitel 4.6.3 mit einer Konzent-ration von 1,0 ng∙ml-1 vorbereitet und denaturiert. Im Anschluss werden 1,3 µl in möglichst kleinen Tropfen auf eine Nitrocellulose-Membran getropft, so dass ein Verlaufen vermieden wird. Die einzel-nen Tropfen werden an Luft oder mit einem Fön getrocknet.

4.6.5.2 Semidry-Blot Vor dem Blot wird ein SDS-Elektrophorese-Lauf (Kap. 4.6.3) durchgeführt, das Sammelgel und die Bromphenol-Lauffront werden vom Gel getrennt. Bei einem Waschschritt in Reinstwasser werden Reste von SDS vom Gel entfernt.

Bei der verwendeten Semidry-Blot-Apparatur befindet sich die Anode im unteren Teil des Gehäuses, dementsprechend ist das Sandwich folgendermaßen aufgebaut: Zwei Lagen Filterpapier, die Nitrocel-lulosemembran, das SDS-Gel und wiederum zwei Lagen Filterpapier, bevor die Kathode aufgesetzt wird. Die Filterpapierstreifen sowie die Nitrocellulosemembran werden zuvor auf genau die Maße des Gels zugeschnitten und, ebenso wie das Gel über 10 min, in Transferpuffer nach Towbin (Tabelle 9-36) equilibriert. Für den Transfer wird an der Blot-Apparatur eine Stromstärke von 2 mA pro cm² Membranfläche über 90 min angelegt. Zur Überprüfung der Effizienz des Blottings wird das benutzte Gel mit Silbernitrat (Kap. 4.6.3.3) sowie die Membran mit Ponceau S (4.6.5.3) oder MemCode™ (4.6.5.4) reversibel gefärbt.

4.6.5.3 Ponceau-S-Färbung Zum Nachweis des Übertrags auf die Membran wird diese nach dem Blot entnommen, kurz in Reinstwasser gewaschen und im Anschluss 5 min in Ponceau-Lösung (Tabelle 9-37) gefärbt. Die Membran färbt sich rot, beim anschließenden Waschen in Reinstwasser entfärbt sich der Hintergrund schneller und die übertragenen Proteinbanden werden sichtbar. Die Membran wird dokumentiert und durch weiteres Waschen mit Reinstwasser oder im folgenden Blockierschritt der Immunodetekti-on (Kap. 4.6.5.5) komplett entfärbt.

4.6.5.4 MemCode™-Färbung Die kurz in Reinstwasser gewaschene Membran wird mit 25 ml der Färbelösung etwa 30 s auf dem Rocker inkubiert, die Membran färbt sich blau. Der Hintergrund wird durch dreimaliges kurzes Wa-schen und einem fünfminütigen Waschschritt mit dem Destain Reagent entfärbt. Anschließend wird die Membran viermal kurz und einmal über 5 min mit Reinstwasser auf dem Rocker gewaschen. Die Membran wird dokumentiert und die Proteinbanden mit dem Stain Eraser durch zweiminütiges Wa-schen entfärbt. Eine Wiederholung des Waschschrittes mit Reinstwasser komplettiert den Entfärbe-schritt. Alle der benutzten Lösungen sind Bestandteil des MemCode™-Kitsystems.

4.6.5.5 Immunodetektion Nach Durchführung des Blots bzw. der reversiblen Färbung der Proteinbanden (siehe oben) wird die Membran kurz mit Reinstwasser gewaschen und in Blockpuffer (Tabelle 9-39) über eine Stunde bei RT auf dem Rocker (18 rpm) inkubiert. Je nach Größe der Membran und des Färbeschälchens muss das Volumen für den Blockierschritt und den weiteren Verlauf der Färbung angepasst werden. Nach dem Blockieren wird die Membran in der gewünschten Verdünnung des Primärantikörpers in Blockpuffer über Nacht im Kühlschrank inkubiert. Die Primärantikörper-Lösung kann dazu bis zu dreimal wie-derverwendet werden. Nach einem dreimaligen Waschschritt in TBST (Tabelle 9-38) folgt mit der

37

Methoden

Zugabe des Sekundärantikörpers in Blockpuffer eine einstündige Inkubation bei RT auf dem Rocker (18 rpm). Dem dreimaligen Waschen mit TBST folgt die Detektion und Dokumentation nach Aufgabe eines Chemilumineszenz-Substrats auf die Membran.

4.6.6 ELISA

4.6.6.1 Anti-EPO und Anti-Cathepsin Das verwendete kommerzielle Sandwich-ELISA-Kit beinhaltet 12 Streifen à 8 wells, in denen der Pri-märantikörper bereits immobilisiert vorliegt. Auch das Blockieren der wells ist bereits durchgeführt. Das Kit-System enthält weiterhin 20-fach konzentrierten Wasch- und Assay-Puffer sowie einfach kon-zentrierten Sample Diluent Puffer, das TMB-Substrat (Tetramethyl-Benzidin) und die Stopplösung. Die Lösungen werden vor dem Einsatz entsprechend verdünnt. Für jeden angesetzten Test wird eine in-terne Kalibrierung in Triplikaten durchgeführt (Tabelle 4-5 und Tabelle 4-6).

Tabelle 4-5: Standardverdünnungsreihe für die interne Kalibrierung des EPO-ELISA.

Standard, Verdünnungsstufe

Konzentration in mIU·ml-1

1 100

2 50

3 25

4 12,5

5 6,3

6 3,1

7 1,6

Tabelle 4-6: Standardverdünnungsreihe für die interne Kalibrierung des Cathepsin-ELISA.

Standard, Verdünnungsstufe

Konzentration in mIU·ml-1

1 25

2 12,5

3 6,25

4 3,125

Vor dem Test werden die benötigten wells zweimal mit einfach konzentriertem Waschpuffer (300 µl) gewaschen. Für die Kalibrierung werden die Standards zu je 100 µl in die wells gegeben, die Proben werden wie gewünscht vorverdünnt und dann 1:1 mit Sample Diluent in den wells gemischt. Der bio-tinkonjugierte Sekundärantikörper wird 1:100 in Assay-Puffer verdünnt mit 50 µl allen wells zugege-ben. Der dreistündigen Inkubation auf dem Schüttler bei RT und 400 rpm folgt ein sechsfacher Wasch-schritt mit 300 µl Waschpuffer. Die Proben werden im Anschluss mit 100 µl einer 1:100 in Assay-Puffer Streptavidin-HRP-Reagenz versetzt und eine Stunde auf dem Schüttler (400 rpm) inkubiert. Die Reak-tion erfolgt nach Zugabe von 100 µl des TMB-Substrats unter Lichtabschluss auf dem Schüttler. Die

38

Methoden

Färbung wird nach 10 min oder vor zu starker Färbung durch Zugabe von 100 µl Stopplösung abge-brochen, da ansonsten keine Quantifizierung mehr erfolgen kann. Die Platte wird innerhalb von 30 min im Platereader bei 450 nm vermessen, die Quantifizierung erfolgt anhand der internen Kalib-rierung (EPO: Abbildung 9-9, Cathepsin: Abbildung 9-10) in mIU∙ml-1. Ein mIU∙ml-1 an EPO entspricht dabei 7,82 pg∙ml-1 an Protein.

y= y0+b1∙x+b2∙x2

Formel 4-3

EPO Cathepsin

y Absorption 450 nm

y0 Absorption Blindwert 450 nm 0,0818 -0,4473

b1 Variable 1 0,00884 0,2206

b2 Variable 2 1,362∙10-4 2,351∙10-3

4.6.6.2 Anti-His-Tag ELISA Der Anti-His-Tag ELISA dient nicht der Quantifizierung von EPO, sondern dem qualitativen Ver-gleich zwischen verschieden behandelten Proben. Für den direkten ELISA werden 30 µl Probe mit 280 µl mit Coating-Puffer (Tabelle 9-44) gemischt und in einer Dreifachbestimmung je 100 µl pro well in einer ELISA-Platte über Nacht im bei 4°C gecoated. Im Anschluss werden die wells fünfmal mit 300 µl PBS-T (Tabelle 9-45) gewaschen und über eine Stunde mit 300 µl Blockierlösung (Tabelle 9-45) bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 5 weiteren Waschschritten folgt die Zugabe von Anti-His6-Peroxidase Antikörper in Blockierlösung (1:4.000) und eine einstündige Inkubation (RT). Nach 5 Waschschritten wird je well 100 µl TMB-Substrat zugegeben. Die Farbreaktion läuft über 10 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler ab (300 rpm). Nach dem Stoppen der Reaktion mit 100 µl einer 2 mol Schwefelsäure kann die Absorption bei 450 nm im Platereader vermessen werden.

4.6.7 Bradford-Assay

Bei jeder Messung mittels Bradford-Assay wird eine interne Kalibrierung durch Mitführen einer Ver-dünnungsreihe aus bovinem Serum Albumin (BSA) (Tabelle 4-7 undTabelle 4-8) durchgeführt. Für den Test werden sowohl von den Standards und den Proben als auch blanks der Puffersysteme jeweils 5 µl Triplikate in eine 96-well-Platte pipettiert. Von den Proben und Blanks werden zusätzlich Ver-dünnungen von 1:5 und 1:10 in 0,9 % NaCl-Lösung angesetzt. Zu den vorgelegten Lösungen wird 250 µl an Bradford-Reagenz gegeben und die Platte etwa 30 s auf dem Schüttler bei 300 rpm durch-mischt. Nach einer anschließenden Inkubation über 10 min bei RT werden die Platten bei 595 nm im Plate-Reader vermessen. Für die Auswertung wird von den Mittelwerten der Triplikate der entspre-chende Blank-Wert abgezogen. Die Bestimmung der Proteinkonzentration geschieht auf Basis der BSA-Kalibrierung (Abbildung 9-11 und Abbildung 9-12).

39

Methoden

Tabelle 4-7: Standardverdünnungsreihe für den Bradford-Assay im Bereich von 100-1500 µg∙ml-1

Standard, Verdünnungsstufe

Konzentration an BSA in µg∙ml-1

1 2.000

2 1.500

3 1.000

4 750

5 500

6 250

7 125

8 25

9 0

Tabelle 4-8: Standardverdünnungsreihe für den Bradford-Assay im Bereich von 2-25 µg∙ml-1

Standard, Verdünnungsstufe

Konzentration an BSA in µg∙ml-1

1 0

2 2,8

3 5,6

4 10

5 15

6 20

9 25

Wiederum durch Anwendung der Formel 4-3 und der entsprechenden Werte der Kalibrierung lassen sich die Absorptionswerte zurückrechnen.

y= y0+b1∙x+b2∙x2

Formel 4-3

0-25 µg 0-2.000 µg

y Absorption 595 nm

y0 Absorption Blindwert 595 nm 0,0129 0,33731

b1 Variable 1 0,033 7,869∙10-4

b2 Variable 2 5,355∙10-4 1,866∙10-7

40

Methoden

4.6.8 IMAC-Affinitätschromatographie gegen den His-Tag

Für die Aufreinigung des Zielproteins per IMAC-Affinitätschromatographie befanden sich Säulen mit unterschiedlichen Eigenschaften (HiTrap FF crude, HiTrap Talon, HiTrap excel, Kapitel 9.6) in diversen Puffersystemen in der Anwendung.

4.6.8.1 IMAC mit losem Säulenmedium Zur Vorbereitung eines Ansatzes werden 0,5 ml des Säulenmaterials (beads, Ni-Sepharose) abzentrifu-giert (500 g, 5 min), der Überstand verworfen und die beads für 3 min mit 1,25 ml Reinstwasser gewa-schen. Nach erneutem Entfernen des Überstandes werden die beads mit 1,25 ml des gewählten Wasch-puffers gewaschen. Anschließend wird das abzentrifugierte Pellet mit gleichem Volumen an Wasch-puffer verdünnt und so eine 50 %v/v Suspension erzeugt. Im weiteren Verlauf wird nach jedem Schritt eine Probe für die Analyse des Versuches entnommen: 2 ml der gewählten Probe aus dem Kulturüber-stand einer infizierten Kultur werden mit 20 mmol Imidazol versetzt, auf pH 7,4 eingestellt und über 1 h auf dem Schüttler bei 300 rpm und RT an das Säulenmaterial gebunden. Anschließend folgen zwei Waschschritte (W1 und W2, Tabelle 9-46) mit je 2 ml für 10 min auf dem Schüttler sowie zwei Elutions-schritte (Tabelle 9-46) mit 1,5 ml und denselben Bedingungen. Das Säulenmaterial wird mehrmals mit Reinstwasser gewaschen und in 20 % Ethanol gelagert.

4.6.8.2 Säulenregenerierung Die gegen Auswaschung des Komplexions anfälligen Säulen (HiTrap FF crude, HiTrap Talon) müssen regelmäßig, nach Auftragung von etwa 50 ml Probe, regeneriert werden. Dazu werden die Säulen zunächst mit 5 ml Reinstwasser gespült. Die HiTrap Talon wird zusätzlich mit 5 bis 10 Säulenvolumen (column volume, cv) MES-Puffer (Tabelle 9-18) gespült, bevor das Komplexion aus der jeweiligen Säule mit 10 cv Strippuffer (Tabelle 9-16 bzw. Tabelle 9-19; FF crude bzw. Talon) entfernt wird. Nach einem Waschschritt mit 5 bis 10 cv Reinstwasser werden die Säulen mit 0,5 ml Nickelsulfat-Lösung (FF crude, Tabelle 9-17) respektive 10 cv Cobaltchloridlösung (Talon, Tabelle 9-20) beladen. Die Regenerierung der FF crude wird mit Durchspülen von 10 cv Reinstwasser abgeschlossen, die Säule kann anschlie-ßend mit 10 cv des gewählten Waschpuffers equilibriert werden. Die Talon-Säule wird nach dem Bela-den zunächst mit 7 cv Reinstwasser, dann mit 3 cv einer 300 mM NaCl-Lösung und nochmals mit 3 cv Reinstwasser gespült, bevor mit Bindepuffer (Tabelle 9-46) equilibriert werden kann. Die Schritte werden jeweils manuell mit einer Spritze mit einem Fluss von etwa 1 ml∙min-1 durchgeführt.

4.6.8.3 Durchführung der Affinitätschromatographie Vor dem Injizieren auf die IMAC werden die Proben aus Suspensions-, Hohlfaser- oder Kapselkultu-ren bei 3.220 g (7°C) 15 min zentrifugiert, um Zellen, im Anschluss bei 15.000 g (7°C, 20 min) zentrifu-giert, um Zellbestandteile abzutrennen. Alternativ werden Zellen lysiert (Kapitel 4.6.1), um der Auf-reinigung das gesamte Proteom zugänglich zu machen. Für spätere Verwendung werden die Proben bei -20°C gelagert und nach dem Auftauen mit Proteaseinhibitor versetzt.

Die Chromatographieläufe sind bei allen verwendeten Säulen gleich aufgebaut (Tabelle 4-9): Dem Equilibrieren (Equ) der Säule in Waschpuffer folgt die Probenaufgabe (B) mit mindestens einem Waschschritt (W1, 2) und die anschließende fraktionierte (1,5 ml) Elution (E), wobei Proteine bei 254 nm detektiert werden.

41

Methoden

Tabelle 4-9: Schritte in der IMAC- Affinitätschromatographie.

Equilibrieren (Equ)

Injektion (B)

Waschen (W)

Elution (E)

cv in ml 5 - ≥25 ≥10

Fluss in ml·min-1 1 0,5 0,5 1

Für den Optimierungsprozess werden in der Affinitätschromatographie verschiedene Säulen sowie Pufferzusammensetzungen getestet (Tabelle 4-10). Verglichen werden ein phosphat-gepuffertes (Tabelle 9-46), ein Tris-gepuffertes (Tabelle 9-47) sowie ein denaturierendes Puffersystem (Tabelle 9-48). Jeweils auf die Säule bzw. auf den entsprechenden Schritt (Binden, Waschen, Eluieren) ange-passt wird die Konzentration des Eluenten, Imidazol sowie Harnstoff beim denaturierten Puffersys-tem.

Tabelle 4-10: Zusammenfassung der IMAC-Säulen und Puffersysteme.

HisTrap FF crude HisTrap excel HiTrap Talon

Puffer Schritt Imidazol in mM

Harnstoff in M

Imidazol in mM

Harnstoff in M

Imidazol in mM

Harnstoff in M

Phosphat

Equ 10 - 10 - 5 -

B 10 - - - 5 -

W1 10 - 10 - 5 -

W2 entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt

E 150 - 150 - 150 -

TRIS

Equ 10 - 10 - 10 -

B 10 - - - 10 -

W1 10 - 10 - 10 -

W2 entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt

E 150 - 150 - 150 -

Denaturiert

Equ 10 8 10 8 - -

B 13 8 - 8 - -

W1 10 8 10 8 - -

W2 20 - 20 - - -

E 500 - 500 - - -

42

Methoden

4.6.9 Lektin-Affinitätschromatographie von Glykoproteinen

Die Concanabalin A (Con A) Säule verfügt über ein Volumen von 1 ml und einer Bindekapazität von 25 bis 40 mg Protein und eignet sich zur Aufreinigung von Glykoproteinen. Die Proteinprobe wird vor der Injektion auf die Säule mit zweifach konzentriertem Bindepuffer (Tabelle 9-22) 1:1 verdünnt. Die Schritte der Chromatographie sind in Tabelle 4-11 zusammengefasst. Nach dem Lauf wird die Säule im Lagerungspuffer (Tabelle 9-23) aufbewahrt.

Tabelle 4-11: Schritte in der Con A Affinitätschromatographie.

Equilibrieren (Equ)

Injektion (B)

Waschen (W)

Elution (E)

cv in ml 5 - 15 ≥10

Fluss in ml·min-1 1 0,5 0,5 1

43

Ergebnisse

5 Ergebnisse

5.1 Kultivierung einer Sf 21 Suspensionskultur

5.1.1 Nicht infizierte Kultur

Die grundlegende Charakterisierung der verwendeten Insektenzelllinie (Sf 21) hinsichtlich ihrer Wachstumseigenschaften sowie des Metabolismus erfolgt, ebenso wie die Stammhaltung, in Suspen-sionskultivierung im silikonisierten Erlenmeyerkolben (Kapitel 4.1.1) bei 50 rpm und 27°C im Inkuba-tor. Die Ergebnisse dienen vor allem dem späteren Vergleich mit den gewählten Immobilisierungsme-thoden. Die Evaluierung der Zellkonzentration sowie der Vitalität der Kultur erfolgt nach Protokoll 4.1.3.

5.1.1.1 Wachstumscharakteristika In Abhängigkeit des Kultivierungssystems und des Zellmediums lassen sich für die kultivierte Zellli-nie charakteristische Kenndaten wie die maximale Wachstumsgeschwindigkeit µmax, die maximal erreichbare Zelldichte pcd oder die zellspezifische Glukoseaufnahmerate erheben. Die maximale Wachstumsgeschwindigkeit kann in der Phase des exponentiellen Wachstums unter Ausschluss einer Sauerstoff- und Nährstofflimitierung bestimmt werden. Dazu werden Zellen mit einer niedrig ge-wählten Startzellzahl von 5,0∙105 Z∙ml-1 im batch kultiviert und die Wachstumskurve aufgezeichnet (Abbildung 5-1). Diese Startzellzahl erlaubt eine exponentielle Wachstumsphase von 3 Tagen bei an-haltend hoher Vitalität mit einer Generationszeit von 20,9 h, was einer Wachstumsrate von 0,79 d-1 entspricht. Nach Erreichen einer pcd von 4,3∙106 Z∙ml-1 geht die Kultur zunächst in eine kurze stationä-re Wachstumsphase und anschließend, bis zum Abbruch des Experiments bei einer Vitalität von etwa 80 %, in die Absterbephase über.

Da sich nicht ableiten lässt, ob sich das Ende der exponentiellen Wachstumsphase in Sauerstoff- oder Nährstoffmangel begründet, folgt eine fed-batch Kultivierung mit einer im Vergleich höher angesetzten Startzellzahl von 2,0∙106 Z∙ml-1. Mit einem vollständigen Mediumwechsel im Zweitagesrhythmus ergibt sich zu Beginn eine zum vorangegangenen Versuch analoge Wachstumsgeschwindigkeit von 0,79 d-1. Ab dem Erreichen einer Zellkonzentration von etwa 6,0∙106 Z∙ml-1 geht die Wachstumsrate zurück. Die pcd des Systems wird bei 1,1∙107 Z∙ml-1 erreicht, die Vitalität bleibt bis zum Abbruch des Versuches nach 7 Tagen auf einem Niveau von über 90 %.

44

Ergebnisse

0 1 2 3 4 5 6 7

106

107

Zellz

ahl i

n-1

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

0 1 2 3 4 5 6 70

1

2

3

4

5

6

7

Glu

kose

konz

entr

atio

n in

g-1

Prozesszeit in d

Abbildung 5-1: Wachstumscharakterisierung von Sf 21 Suspensionszellen. Aufgetragen sind die Zellzahlen und die zugehörigen Vitalitätswerte zur Bestimmung von μmax und pcd im batch ( ) und fed-batch ( ) sowie der Glukoseverbrauch im batch und fed-batch über die Prozesszeit.

Zur Validierung der Ergebnisse sind Wachstumsraten aus weiteren Versuchen in Tabelle 5-1 zusam-mengefasst. Die berechneten Verdopplungszeiten variieren zwischen etwa 19 und 21 h. Die zugehöri-ge Auftragung der Daten findet sich in Abbildung 9-1.

Tabelle 5-1: Vergleich der Wachstumsraten bzw. Verdopplungszeiten in Suspensionskultur für verschiede-ne Startzellzahlen.

Startzellzahl in -1

Wachstumsrate μmax in d-1

Verdopplungszeit in h

Auftragung

5 0,82 20,4 Abbildung 9-1 5 0,82 20,4 Abbildung 9-1 5 0,87 19,1 Abbildung 9-1 5 0,79 20,9 Abbildung 5-16 0,79 21,1 Abbildung 5-1

45

Ergebnisse

Im batch-Ansatz wird die Glukose im Medium, beginnend ab dem Initialwert von 6 -1, mit einer nahezu konstanten Steigung und einer resultierenden zellspezifischen Glukoseaufnahmerate von

-13 -1 d-1 bis Prozesstag 7 auf einen Wert von 0,85 -1 verbraucht (Abbildung 5-1). Das Ende der exponentiellen Wachstumsphase wird bei einer Glukosekonzentration von 3,55 -1 erreicht. In der fed-batch-Kultivierung fällt der Glukosegehalt aufgrund der höheren Zelldichte vor den Medien-wechseln auf 2,0 -1, 2,7 bzw. 2,6 -1

5.1.1.2 Sauerstoffaufnahmerate Eine weitere wichtige Kenngröße, die zellspezifische Sauerstoffaufnahmerate q , kann sowohl für eine Charakterisierung des Zellmetabolismus im eingesetzten System als auch zur Bestimmung der Lebendzellzahl von späteren Kultivierungen im immobilisierten Reaktorsystem dienen. Dazu wird nach Protokoll 4.5.1 die Abnahme des Sauerstoffpartialdrucks in der Messkammer unter Einsatz ver-schiedener Startzellzahlen bestimmt und repräsentativ dargestellt (Abbildung 5-2). Der Sauerstoffver-brauch zeigt sich direkt proportional zur eingesetzten Zellzahl; die zellspezifische Sauerstoffaufnah-merate lässt sich direkt aus der Steigung der resultierenden Funktion bestimmen. Die Steigung der Sauerstoffabnahme verläuft in allen Fällen linear, bis sich ab einem Wert von etwa 5 % ein Abknicken erahnen lässt. Die Abnahmeraten sowie die zugehörig berechneten Verbrauchsraten sind in Tabelle 5-2 zusammengefasst. Mit einer Standardabweichung von 8,6 % ergibt sich aus den Messungen ein

-11 -1 -1.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

25

50

75

100

Saue

rsto

ffsät

tigun

g in

%

Prozesszeit in min

Abbildung 5-2: Messung der Sauerstoffaufnahmerate von Sf 21 Suspensionszellen mit Startzellzahlen von 5,0 5 , 1,0 6 6 -1, aufgetragen über der Prozesszeit.

46

Ergebnisse

Tabelle 5-2: Sauerstoffabnahme sowie resultierendes q̇ für verschiedene Startzellzahlen.

Zellzahl in Z∙ml-1

Steigung der Sauerstoffabnahme in % pO2·min-1

zellspez. Sauerstoffaufnahmerate q̇ in mmol∙min-1∙Z-1

5,0∙105

-1,5538 8,2525∙10-12

-1,9308 1,0255∙10-11

-2,2152 1,1765∙10-11

1,0∙106

-4,0922 1,0867∙10-11

-4,0937 1,0871∙10-11

-4,1505 1,1022∙10-11

1,5∙106

-5,8076 1,0282∙10-11

-5,9335 1,0505∙10-11

-5,9843 1,0595∙10-11

5.1.2 Virusherstellung und Amplifikation

Das in dieser Arbeit verwendete Virus wurde unter Verwendung des BaculoGold Bright™ Kitsystems hergestellt (Kapitel 4.2.1). Der die Sequenz des rekombinanten EPOs (Kapitel 9.11) enthaltende Trans-fervektor PAcGP67A codiert zusätzlich für die Expression der gP67-Leadersequenz, ein Glykoprotein, das für die Segregation des unter dem Polyhedrin-Promotor stehenden rekombinanten Proteins sorgt. Der, N-terminal über eine Spacersequenz sowie eine Proteaseschnittstelle (TEV-Protease, Tobacco Etch Virus) an das g.i. angehängte His-Tag (6x Histidin) soll eine Aufreinigung des Proteins aus dem Kul-turüberstand durch eine Affintätschromatographie gewährleisten. Weiterhin beinhaltet das Virus zur leichteren Detektion des Infektionserfolges bzw. der Expression des Zielproteins eine Gensequenz zur Koexpression des Green Fluorescent Proteins (GFP). Dies findet ebenfalls unter Kontrolle des Polyhedrin-Promotors statt. Durch die Modifikationen erreicht das Zielprotein in unglykosylierter Form nach Berechnung mit ExPASy eine Masse von 21 kDa, vollständig human glykosyliert würde eine Masse von 37 kDa erreicht (Walker 2005).

Nach erfolgreicher Klonierung und homologer Rekombination des Virus werden die Viren der ersten Generation dreimal amplifiziert (Kapitel 4.2.3), um eine ausreichend große Menge an vitalem Virusstock (>108 pfu∙ml-1) zu generieren. Um das Auftreten von defekten Partikeln und somit den Passage-Effekt zu vermeiden, wird sowohl MOI als auch TOI niedrig gewählt (Abbildung 5-3): Eine mit einem MOI von 0,01 infizierte Kultur mit einer Startzellzahl von 5,0∙105 Z∙ml-1 wächst in etwa zwei Tage parallel zur Kontrollkultur, bevor durch die Sekundärinfektion eine Stagnation im Wachstum zu verzeichnen ist und die Vitalität abfällt. Auch der Erntezeitpunkt (TOI) ist bei 80 % Vitalität so gewählt, dass eine Freisetzung von defekten Viren durch ein Auflösen der Zellen möglichst vermieden wird.

47

Ergebnisse

0 1 2 3 3 4 5 6

106

107

Zellz

ahl i

n -1

Prozesszeit in d

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

Abbildung 5-3: Herstellung eines Virusstocks mit Suspensionszellen. Darstellung der Zellzahlen und Vitalitä-

ten der Kontrollkultur ( ) sowie der mit MOI 0,01 infizierten Kultur ( ) über der Prozesszeit.

5.1.3 Infizierte Kultur

Die Untersuchungen von Kultivierungen infizierter Suspensionszellen dienen neben der Charakteri-sierung des Zellwachstums bei Infektion auch der Evaluierung des Infektionserfolges sowie dem Nachweis der Produktion des Zielproteins (EPO). Weiterhin eignet sich die Kultivierung von Suspen-sionszellen dazu, den Einfluss von zelleigenen Proteasen auf das Produktionssystem zu ermitteln.

5.1.3.1 Wachstumsverhalten bei Infektion Zur näheren Charakterisierung des Kultivierungsprozesses beim Einsatz infizierter Suspensionszellen werden vier Parallelkultivierungen mit einer jeweiligen Startzellzahlen 05 -1 angesetzt und neben der Kontrollkultur der MOI von 0,1 über 1 bis 10 variiert (Protokoll 4.2.4).

0 1 2 3 4

106

107

Zellz

ahl i

n -1

Prozesszeit in d

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

Abbildung 5-4: Suspensionskultivierung unter Variation des MOI. Auftragung der Zellzahlen sowie der zuge-

hörigen Vitalitäten der Kontrollkultur ( ) und der infizierten Kulturen mit MOI 0,1 ( ), 1 ( ) und 10 ( ) über die Prozesszeit.

48

Ergebnisse

Bei Darstellung der Zellkonzentrationen sowie der Vitalität der einzelnen Ansätze zeigt die Kontroll-kultur in Abbildung 5-4 über 3 Tage ein exponentielles Wachstum ohne Verlust an Vitalität. Die mit einem MOI 0,1 infizierte Kultur hingegen zeigt ähnlich Abbildung 5-3 schon nach einem Tag Prozess-zeit ein geringeres Wachstum, bevor die Kultur nach 2 Tagen ihre pcd erreicht und anschließend die Absterbephase einsetzt. Die mit einem MOI von 1 infizierte Kultur benötigt am ersten Tag etwa die doppelte Duplikationszeit, die Absterbephase setzt nach dem Einknicken der Vitalität am ersten Pro-zesstag einen Tag später ein. Kaum Wachstum bzw. ein sofortiges Absterben der Zellen wird bei einer Infektion mit MOI 10 bereits einen Tag p.i. detektiert. Hier sinkt die Vitalität bis zum Ende der Kulti-vierung auf unter 50 %. Ergänzend sind in Tabelle 5-3 für die entsprechenden Kulturen die maxima-len Wachstumsraten, die Verdopplungszeit, die pcd sowie die Vitalität zusammengefasst.

Tabelle 5-3: Vergleich der Wachstumsraten und Vitalität bei Variation des MOI.

Wachstumsraten bei Start µmax in d-1

Verdopplungszeit td in h

pcd in ml-1

Vitalität nach 97 h in %

Kontrolle 0,852 19,5 5,3∙106 100 MOI 0,1 0,674 24,7 2,6∙106 94 MOI 1 0,540 30,8 1,4∙106 71 MOI 10 0,324 51,3 1,0∙106 57

Parallel zur Bestimmung der wachstumsspezifischen Parameter werden täglich Zellproben durch-flusszytometrisch auf die Bildung von GFP und somit auf eine positive Infektion untersucht (Kapitel 4.5.3). Die Ergebnisse der Fluoreszenzintensitäten an den einzelnen Prozesstagen (1-4 p.i.) sind für die Ansätze mit MOI 0,1, 1 sowie 10 im Vergleich zur jeweiligen Kontrollkultur halblogarithmisch in His-togrammform aufgetragen (Abbildung 5-5). Die Auswertung ist in Tabelle 5-4 zusammengefasst. Am Tag eins p.i. zeigt sich mit etwa 1 % positiver events noch kein signifikanter Unterschied zwischen der Kontrollkultur und den mit MOI 0,1 infizierten Zellen, der über ein leicht erhöhtes Ausmaß an Auto-fluoreszenz hinaus an eine Infektion hindeuten könnte. Die Ansätze mit MOI 1 und 10 weisen jedoch bereits deutliche Anzeichen einer GFP-Produktion (8,5 sowie 66 %) auf. Im Verlauf der Kultivierung nimmt der Anteil der produzierenden Zellen in der Kultur mit MOI 0,1 auf final etwa 72 % zu, wo-hingegen bei MOI 1 eine Steigerung auf über 80 % an Tag 3 p.i. mit einer folgenden Abnahme der Fluoreszenz zu verzeichnen ist. Bei einer Infektion mit MOI 10 wird das Maximum an infizierten Zel-len mit über 90 % bereits an Tag 2 p.i. durchschritten. In allen Messungen zeigt sich jedoch eine Ver-breiterung des Fluoreszenz-peaks mit Zunahme der Anzahl der positiven Zellen.

49

Ergebnisse

0

50

100

150

200

250

300

coun

ts1 2

1 10 100 1000 100000

50

100

150

200

250

3003

coun

ts

GFP-Fluoreszenz1 10 100 1000 10000

4

GFP-Fluoreszenz

Abbildung 5-5: GFP-Fluoreszenz einer Sf 21 Suspensionskultivierung bei Variation des MOI. Auftragung der durchflusszytometrischen Auswertung an den Tagen 1 bis 4 p.i. der Kulturen mit MOI 0,1 , 1 sowie 10 im Vergleich zur Kontrollkultur .

Tabelle 5-4: Zusammenfassung der statistischen Auswertung der GFP-positiven events der unter Variation des MOI infizierten Sf 21 an den entsprechenden Prozesstagen.

Prozesstag p.i. in d

MOI 0,1 GFP positiv in %

MOI 1 GFP positiv in %

MOI 10 GFP positiv in %

1 1,1 8,5 66,6

2 15,2 67,7 92,3

3 48,3 84,1 85,0

4 72,1 73,5 63,9

5.1.3.2 EPO-Produktion in Suspensionskultur Um für spätere Vergleiche bezüglich der Ausbeute an produziertem EPO mit den immobilisierten Systemen den Grundstock zu legen, soll nun die Produktion in Suspensionskulturen untersucht wer-den. Neben der Evaluierung der Produktivität werden gleichzeitig noch weitere Gesichtspunkte ver-folgt: Zum einen wird die unspezifische Bindung der Antikörper und damit die Generierung eines falsch-positiven Signals des ELISA-Kits durch Untersuchung von Proben einer Wildtypinfektion eva-luiert, zum anderen wird mittels eines Cathepsin-ELISA die Konzentration der in der Literatur als hauptsächlich nach einer Infektion gebildeten Protease untersucht (siehe Kapitel 2.2.6).

50

Ergebnisse

Die Bestimmung der EPO-Konzentration im Überstand einer WT-infizierten Kultur (Abbildung 9-2) liegt über die gesamte Prozesszeit der Kultivierung unter einem Signal von 20 -1. Eine Interfe-renz des ELISAs mit zell- oder virusspezifischen Proteinen kann somit ausgeschlossen werden. Der Verlauf der Cathepsin-Konzentration über die Prozesszeit einer mit MOI von 10 infizierten Kultur ergibt einen Höchstwert von etwa 1,2 -1 (Abbildung 9-3). Somit kann davon ausgegangen wer-den, dass Cathepsin nicht in größeren Mengen als Antwort auf eine Infektion im vorliegenden System produziert wird.

Es ist jedoch nicht vollständig auszuschließen, dass weitere Proteasen in der Zellkultur vorliegen, die das produzierte Zielprotein abbauen. Nach Beendigung der Kultivierungen wird deshalb standard-mäßig den Proben Proteaseinhibitor zugegeben, um diese für eine weiterführende Analytik zu kon-servieren. In diesem Zusammenhang soll auch getestet werden, ob die Zugabe von Proteaseinhibitor bereits während einer Kultivierung Vorteile bringen kann. Dazu wird in einem ersten Schritt das Wachstum einer Kontrolle ohne Proteaseinhibitor mit einer infizierten Kultur (MOI 3) aufgenommen. Im Vergleich dazu wird eine nicht infizierte Kultur mit 100 % Proteaseinihibitor (PI, Definition nach Kapitel 4.2.5) angesetzt (Abbildung 5-6). In der Auftragung der Wachstumskurve zeigt sich eine bis zu Tag 3 exponentiell wachsende Kontrollkultur; die infizierte Kultur teilt sich innerhalb des ersten Tages parallel dazu und geht dann in eine Absterbephase über, bis am Tag des Kulturabbruches eine Vitali-tät von etwa 60 % erreicht wird. Die Kultur mit PI zeigt zu Beginn eine kurze ag-Phase, von Tag 2 bis 3 kann man von einer exponentiellen Wachstumsphase sprechen, bevor die Phase des stationären Wachstums beginnt. Die maximale Wachstumsrate fällt dabei mit μmax=0,502 d-1 ebenso wie die pcd mit 6 -1 deutlich geringer als in der Kontrollkultur (μmax=0,912 d-1, pcd 6 -1) aus.

0 1 2 3 4

106

107

Zellz

ahl i

n -1

Prozesszeit in d

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

Abbildung 5-6: Kultivierung von Sf 21 in Suspension mit Proteaseinhibitor. Aufgetragen sind die Zellzahlen

und Vitalitäten der Kontrollkultur ohne PI ( ), der Kontrollkultur mit 100 % PI ( ) sowie eine, mit MOI 3 infizierte Kultur ohne PI ( ).

In der Auftragung der infizierten Kulturen mit einem PI-Anteil von 0 über 50 bis 100 % ist der Unter-schied in der Wachstumskurve zunächst nicht so ersichtlich wie in den Kontrollkulturen (Abbildung 5-7). Alle Kulturen wachsen bis einen Tag , bevor sie in eine stationäre Phase und ab Prozesstag 3 in eine Absterbephase übergehen. Zwar sinken die Zellkonzentration sowie die Vitalität in der Kultur ohne Proteaseinhibitor am stärksten ab, jedoch lassen sich in dieser Betrachtung keine weiteren gesi-cherten Schlüsse ziehen, ob die Zugabe von PI die Vitalität der Kultur konserviert, da sich bei 100 %

51

Ergebnisse

PI gegen Ende der Kultivierung ebenfalls ein negativer Trend bezüglich Zellkonzentration und Vitali-tät zeigt.

0 1 2 3 4

106

Zellz

ahl i

n -1

Prozesszeit in d

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

Abbildung 5-7: Untersuchung der EPO-Produktion bei Zugabe von Proteaseinhibitor . Darstellung der Zellzah-len sowie Vitalitäten der infizierten Kulturen (MOI 3) ohne PI ( ), mit PI ( ), sowie mit 50 % PI ( ).

Weitere Informationen über den Einfluss des Proteaseinhibitors ergeben sich aus durchflusszytomet-rischen Messungen bezüglich der GFP-Fluoreszenz (Abbildung 5-8, Tabelle 4-3). Am ersten Prozesstag zeigt die Kultur ohne Zugabe von PI ein Signal von über 30 % GFP-positiven Zellen, wohingegen die Kultur mit 50 % PI zu etwa 10 % positiv ist und die 100 %-Kultur kaum Unterschied zur Kontrollkul-tur erkennen lässt. Ab Tag zwei verzeichnet die Kultur ohne PI über 80 % GFP-produzierende Zellen und verbleibt bis zum Prozessende auf einem Niveau zwischen 80 und 90 %. Die 50 % PI-Kultur pen-delt sich ebenfalls nach einem Wert von etwa 70 % am zweiten Tag ab Prozesstag 3 auf diesem Niveau ein. Die Probe mit 100 % PI hinkt gegenüber der nicht supplementierten Kultur in der GFP-Produktion einen Tag hinterher und durchläuft ihr Maximum mit etwa 80 % positiven Zellen an Tag 3.

52

Ergebnisse

0

50

100

150

200

250

3001

coun

ts

3

2

1 10 100 1000 100000

50

100

150

200

250

300

coun

ts

GFP-Fluoreszenz1 10 100 1000 10000

GFP-Fluoreszenz

4

Abbildung 5-8: GFP-Fluoreszenz einer infizierten Sf 21 Suspensionskultivierung nach Zugabe von Proteasein-

hibitor. Auftragung der durchflusszytometrischen Auswertung an den Tagen 1 bis 4 p.i. der in-fizierten Kulturen (MOI 3) ohne PI , 50 % PI sowie 100 % PI im Vergleich zur Kontrollkultur .

Tabelle 5-5: Auswertung der GFP-positiven (infizierten) events an den Prozesstagen.

Prozesstag p.i. in d

MOI 3 infiziert in %

MOI 3, 50 % PI infiziert in %

MOI 3, 100 % PI infiziert in %

1 33,5 8,5 1,2

2 85,4 73,0 38,5

3 89,9 88,5 80,4

4 84,5 86,7 77,4

Eine Auswertung des Kulturüberstands mit einem anti-EPO ELISA (Protokoll 4.6.6) in Abbildung 5-9 zeigt jeweils in der Kultur mit 100 % PI sowie in der infizierten Kultur ohne PI eine Zunahme an Ziel-protein von Tag 1 bis 3 p.i. Zum letzten Prozesstag hin nimmt die Konzentration an EPO in den Pro-ben wieder ab. Abgesehen vom ersten Tag liegen die Werte für die Kultur mit Proteaseinhibitor etwa 20 % unter dem Wert der infizierten Kultur ohne PI.

53

Ergebnisse

0 1 2 3 40

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

EPO

Kon

zent

ratio

n in

mU

-1

Prozesszeit in d

Abbildung 5-9: EPO Konzentration im Überstand einer infizierten Kultur bei Zugabe von PI. Auswertung eines anti-EPO ELISA von Suspensionskulturen (MOI 3) ohne Zugabe von PI sowie bei Supple-mentierung mit 100 % PI .

5.2 In Hohlkapseln immobilisierte Zellen

Je nach eingesetzter Viruslast (MOI) nimmt die Vitalität von infizierten Insektenzellen bereits nach einem Tag Kultivierung in Suspension merklich ab. Zugrunde liegt hier unter anderem die Scherein-wirkung auf die durch die Infektion angeschwollenen Zellen (Kapitel 2.2). Im Folgenden soll deshalb untersucht werden, ob eine Immobilisierung in Hohlkapseln Vorteile in Bezug auf die mögliche Pro-zess- bzw. Proteinproduktionsdauer bringen kann.

5.2.1 Kultivierung nicht infizierter Sf 21

Zum Vergleich mit der Suspensionskultivierung erfolgt zunächst im immobilisierten System eine Charakterisierung des Wachstumsverhaltens. Dazu werden mehrere Kulturen, wie in 4.3.1 beschrie-ben, mit einer Startzelldichte von 1,0 106 -1 verkapselt.

5.2.1.1 Wachstumsverhalten Die resultierenden Kulturen mit einem Kapseldurchmesser von 2,5 bis 3 mm (Abbildung 5-11) werden pro 5 NaCS-Ansatz in einem Schikanekolben mit 40 Zellmedium kultiviert. Um den Medienver-brauch in den Kapselkulturen zu evaluieren, wird in Parallelansätzen die Auswirkung des Intervalls des Mediumwechsels überprüft. Die durch Zellzählung ausgewerteten Wachstumskurven (Kapitel 4.3.1.4) sind in Abbildung 5-10 mit einem fed-batch-Zyklus von 2 (A) sowie 3 Tagen (B) über 100 res-pektive 40 Tage Prozesszeit dargestellt: Die initial nach der Verkapselung wiedergefundene Zellzahl entspricht in keinem Ansatz der eingesetzten Zellkonzentration. Allerdings wachsen die Kulturen von

7 bis 5 7 Zellen pro Milliliter Kapselmaterial. Ein-zig die Kultur K3 scheint eine etwa viertägige ag-Phase einzugehen. In der exponentiellen Wachs-tumsphase variieren die maximalen Wachstumsraten der Ansätze zwischen 0,22 und 0,39 d-1 (Tabelle 5-6).

54

Ergebnisse

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

105

106

107

108Ze

llzah

l in

-1

Prozesszeit in d

A

0 10 20 30 40

Prozesszeit in d

B

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

Abbildung 5-10: Wachstumsverlauf verkapselter Zellen mit Variation der fed-batch Strategie Darstellung der

Zellzahlen sowie Vitalitäten im fed-batch bei Mediumwechsel alle 2 Tage (A) bei K1 ( ) und K2 ( ) sowie im 3-Tageszyklus mit K3 ( ), K4 ( ) und K5 ( ).

Das Einsetzen der stationären Phase nach etwa 2 Wochen Kultivierung geht mit einem Rückgang und einer starken Schwankung in der Vitalität einher. Markant ist hierbei eine Marke von 60 % vitalen Zellen, die bei einem fed-batch-Zyklus von 2 Tagen die Untergrenze der Vitalität der Kultur darstellt. Bei einem Zyklus von 3 Tagen sinkt die Vitalität hingegen bis auf 40 % ab.

Tabelle 5-6: Zusammenfassung der Wachstumsdaten der verkapselten Sf 21 mit Angabe der maximalen Wachstumsrate μmax, der Verdopplungszeit td sowie der maximalen Zelldichte pcd

max. Wachstumsrate μmax in d-1

Verdopplungszeit td in h

pcd in -1

K1 0,22 77,0 3,4 107

K2 0,39 42,6 2,9 107

K3 0,23 73,7 4,9 107

K4 0,39 42,5 3,9 107

K5 0,36 46,8 3,6 107

Eine mikroskopische Betrachtung von Kapselproben (Abbildung 5-11) bestätigt den Verlauf der Wachstumskurve. So erkennt man zunächst vereinzelte Zellen (Tag 2), bis die Zellen über den Pro-zessverlauf aus diesen initialen Kolonien heraus die ganze Kapsel bewachsen (Tag 13, 23, 37).

55

Ergebnisse

Tag 2

Tag 6

Tag 13

Tag 17

Tag 23

Tag 37

Abbildung 5-11: Bewachsen der Kapseln von nicht infizierten Sf 21. Mikroskopische Betrachtung mit 4-facher Vergrößerung.

5.2.2 Proteinproduktion

Nach Etablierung des Immobilisierungs- bzw. Kultivierungsprozesses liegt der Fokus nun auf der Kultivierung von infizierten Zellen zur Herstellung rekombinanten Proteins. Hierfür sind verschiede-ne Infektions- und Verkapselungsstrategien denkbar: So können bereits bewachsene Kapseln durch Zugabe von Virusstock ins Kulturmedium unter Ausnutzung von Membranleerstellen infiziert wer-den. Diese Lücken entstehen, wenn nach dem Verkapseln in der Membran befindliche Zellen im Lauf der Kultivierung absterben. Eine weitere Strategie ist, bereits infizierte Zellen zu verkapseln. Hier können Zellen mit einem eingestellten MOI infiziert und anschließend immobilisiert werden. Denkbar ist auch die vollständige Infektion einer Vorkultur einen Tag vor der Verkapselungsprozedur und der Herstellung einer definierten Mischung aus infizierten und nicht infizierten Zellen Ein Vorteil der zuletzt genannten Methode liegt in der möglichen Überprüfung des Infektionserfolges vor dem Ver-kapseln über die GFP-Produktion der Zellen. Somit ist die Einstellung eines reproduzierbaren, statisti-schen Verhältnisses von infizierten und nicht infizierten Zellen in den Kapseln gegeben. Für dieses Vorgehen wird ein abgewandelter MOIK eingeführt, der besagtes Verhältnis beschreibt. Die Strategien werden nun bezüglich des Zellwachstums in den Kapseln, des Infektionserfolges sowie der Homoge-nität, Infektion und der Stabilität des Prozesses untersucht.

5.2.2.1 Infektion durch die Kapselmembran Ein maximaler Infektionserfolg setzt eine exponentielle Wachstumsphase in den verkapselten Zellen voraus. Der Infektionszeitpunkt ist daher nach einer Prozesszeit von 14 Tagen gewählt; dies entspricht mit einer Zelldichte von 1,0∙107 Z∙ml-1 einer Kapselbewachsung von etwa 25 bis 30 %. Die Zellen sind dementsprechend nicht platzlimitiert, dennoch sollten bereits Trefferereignisse zwischen Virus und Zelle möglich sein. Die Infektion erfolgt durch eine vierstündige Inkubation der Kapseln in 20 ml Vi-russtock eines Titers von etwa 1∙108 pfu.

56

Ergebnisse

0 10 20

106

107

108

Zellz

ahl i

n -1

Prozesszeit in d

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

Abbildung 5-12: Infektion einer verkapselten Sf 21 Kultur über die Kapselmembran; Auftragung der Zellzahlen sowie Vitalität der Kontrollkultur ( ) sowie der infizierten Kultur (TOI 7 -1) ( ).

In Abbildung 5-12 ist der Verlauf der Kontrollkultur sowie der ab Tag 14 infizierten Kultur aufgetra-gen. Beide Kulturen durchlaufen eine etwa 20-tägige exponentielle Wachstumsphase. Mit dem Errei-chen der stationären Phase setzt, wie bereits dokumentiert (Abbildung 5-10), ein Absinken der Vitali-tät ein. Die Zellkonzentration in der Kontrollkultur während der stationären Phase ist mit etwa 5,0 107 -1 auf einem leicht höheren Niveau als in der infizierten Kultur (um 2,0 107 -1). Vom Zeitpunkt der Infektion bis zum Abbruch der Kultivierung nach 26 Tagen konnte keine Infektion der Kapseln anhand einer GFP-Produktion nachgewiesen werden.

5.2.2.2 Infektion vor der Verkapselung Die Infektion durch die Membran unterliegt multifaktoriellen Einflüssen, wie der Konzentration der Polymere, deren Kettenlängen und auch z.B. TOI oder der Inkubationszeit. Nachfolgend wird daher versucht, den Prozess zu vereinfachen und bereits infizierte Zellen zu verkapseln.

Hier muss der MOI so gewählt werden, dass in der Kapsel genügend Zellen infiziert sind, um für eine Ausbreitung zu sorgen, allerdings ohne das Zellwachstum in der Kapsel komplett zu unterbinden. Das von vorneherein in den Kapseln verlangsamte Wachstum muss zudem in Betracht gezogen wer-den. Zur Evaluierung des Infektions- und des Produktionserfolges werden zunächst Ansätze mit MOIs von 0,004 und 0,01 betrachtet (Abbildung 5-13 und Abbildung 9-4). Die infizierten Ansätze un-terscheiden sich hier weder in ihrer maximalen Wachstumsgeschwindigkeit (0,35 d-1) während der 15-tägigen exponentiellen Wachstumsphase, noch in der erreichten pcd merklich von der Kontrollkultur (um 7 -1). Die Vitalität unterliegt den bereits beobachteten Schwankungen und geht während der stationären Phase merklich zurück. Hierbei wird gegen Ende der Kultivierung bei den Kapseln mit der höchsten Viruslast die höchste Vitalität gemessen.

57

Ergebnisse

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

105

106

107

108

Zellz

ahl i

n -1

Prozesszeit in d

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

Abbildung 5-13: Kultivierung von vor dem Verkapseln infizierten Sf 21 . Darstellung der Wachstumsverläufe sowie der Vitalitäten einer Kontrollkultur ( ) sowie von infizierten Zellen mit MOI 0,01 ( ) und 0,004 ( ) über die Prozesszeit.

Die optisch beobachtete GFP-Produktion gestaltet sich mit den gewählten MOIs in den Ansätzen als inhomogen: Eine Infektion mit MOI 0,004 resultiert in sehr vereinzelten grünen Spots, wobei viele Kapseln kein GFP-Signal aufweisen und somit nicht infiziert werden. Der Einsatz eines MOI von 0,01 ergibt Kapseln mit größeren GFP-produzierenden Segmenten (Abbildung 5-16). Die Rate an infizier-ten Kapseln mit MOI 0,01 kann auf etwa 70 % geschätzt werden.

A

B

Abbildung 5-14: Mikroskopische Betrachtung von infizierten Kapseln aus der Kultivierung in Abbildung 5-13 mit MOI 0,004 (A) und 0,01 (B).

Die Infektion der Kapseln kann optisch bis zu einem Maximum nach etwa 3 Wochen Prozesszeit ver-folgt werden, bevor die GFP-Produktion sichtbar zurückgeht. Dennoch können in allen Ansätzen auch nach 5 Wochen Kultivierung noch positive Kapseln gefunden werden.

5.2.2.3 Verkapselung mit infizierter Vorkultur Ein Nachteil der Methode der direkten Verkapselung infizierter Zellen ist, dass der Infektionserfolg vor dem Immobilisieren nicht detektiert und nachvollzogen werden kann. Um den Prozess insgesamt

58

Ergebnisse

besser reproduzierbar zu gestalten und den Anteil der infizierten Kapseln möglichst zu steigern, wer-den Untersuchungen mit einer infizierten Vorkultur durchgeführt. Dazu wird 24 Stunden vor der Verkapselung eine Kultur mit MOI 5 infiziert (Kapitel 4.2.4) und durch Mischen mit einer nicht infi-zierten Vorkultur ein gewünschter Anteil an infizierten Zellen eingestellt (MOIK). Die Verkapselung einen Tag p.i. erlaubt, den Infektionserfolg über die GFP-Produktion durchflusszytometrisch zu ermit-teln. Somit kann der MOIK genau ermittelt und eingestellt werden. Unmittelbar nach dem Verkapseln kann die Verteilung der infizierten Zellen in den Kapseln mikroskopisch überprüft werden. Die Aus-wertung der infizierten Vorkultur in Abbildung 5-15 zeigt einen Anteil von etwa 75 % infizierten Zel-len an. Die Zellen werden verwendet, um Kulturen mit MOIK von 0,01 bis 0,1 anzusetzen (Abbildung 5-16).

1 10 100 1000 100000

50

100

150

200

250

300

coun

ts

GFP- Fluoreszenz

Abbildung 5-15: Durchflusszytometrische Identifizierung von GFP-positiven Sf 21 Zellen. Auftragung des Auto-fluoreszenzsignals der Kontrollkultur sowie des Fluoreszenzsignals der mit MOI 5 infizier-ten Suspensionskultur .

In beiden Ansätzen zeigt die Kontrolle ein exponentielles Wachstumsverhalten, die pcd in Abbildung 5-16 A wird nach etwa 20 Kulturtagen, in Abbildung 5-16 B nach 12 Tagen erreicht. In beiden Ansät-zen zeigt sich schon ab einem MOIK von 0,01 eine lag-Phase, die bisher konstatierte maximale Zell-dichte wird jedoch in beiden Kultivierungen erreicht (25 bzw. 15 Tage). Bei Einsatz eines MOIK von 0,03 zeigt sich ein ähnlicher Verlauf, eine Steigerung auf 0,06 und darüber hinaus (0,1) führt in beiden Fällen zu einer sofortigen Abnahme der Zellkonzentration in den Kapseln. Zur besseren Übersicht ist mit 45 Tagen nur etwa die halbe Kultivierungsdauer (85 Tage) aufgetragen.

59

Ergebnisse

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

105

106

107

108

Zellz

ahl i

n -1

Prozesszeit in d

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

B

Prozesszeit in d

A

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

Abbildung 5-16: Kultivierung von infizierten und verkapselten Zellen. Darstellung (A) der Zellzahlen und Vita-litätswerte der Kontrollkultur ( ) und der infizierten Kulturen mit MOIK 0,01 ( ), 0,03 ( ) sowie 0,06 ( ). Weitere Kultivierungen (B) sind mit Kontrollkultur ( ), MOIK 0,1 ( ) und 0,01 ( ), ebenfalls über der Prozesszeit aufgetragen.

Der Anteil der GFP-positiven Kapseln im Ansatz bei einem MOIK von 0,01 beträgt etwa 70 %, wobei die GFP-Produktion über die Versuchsdauer hinweg variiert. Während zu Beginn und gegen Ende der Kultivierung nach 85 Tagen nur einzelne proteinproduzierende Herde zu erkennen sind, können in einem Zeitraum zwischen 14 und 60 Tagen Prozessdauer etwa 50 % der Kapseln mit größeren zu-sammenhängenden positiven Arealen ausgemacht werden. In Abbildung 5-17 ist der Prozessverlauf anhand fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen dokumentiert.

Tag 9 Tag 15 Tag 18

Tag 30 Tag 53 Tag 83

Abbildung 5-17: Mikroskopische Beobachtung von infizierten Kapseln mit einem MOIK von 0,01 über eine Pro-zessdauer von 83 Tagen.

Der Ansatz mit einem MOIK von 0,03 zeichnet sich durch einen höheren Anteil initial infizierter Zel-len aus. Es können in allen Kapseln GFP-positive Herde ausgemacht werden, jedoch ist – analog zu

60

Ergebnisse

den vorangegangenen Experimenten – keine vollständig durchinfizierte Kapsel zu detektieren. Die Infektion der Kapseln kann wiederum bis zum Abbruch des Versuches nach etwa 3 Monaten bestätigt werden (Abbildung 5-18).

Tag 26

Tag 31

Tag 47

Tag 55

Tag 79

Tag 85

Abbildung 5-18: Mikroskopische Beobachtung von infizierten Kapseln mit einem MOIK von 0,03 über eine Pro-zessdauer von 85 Tagen.

5.3 Im Hohlfaserreaktor immobilisierte Zellen

Neben der Einkapselung von Zellen soll mit der Kultivierung im HFR eine weitere Methode der Im-mobilisierung zum Schutz vor Scherkräften untersucht werden. Die Perfusion der Hohlfaser mit Nährmedium ermöglicht eine diffusive Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff. Gleichzeitig werden Metabolite und Kohlendioxid mit dem Medium abtransportiert und in unmittel-barer Nähe der Zellen verdünnt. Für ein besseres Verständnis der Kultivierung im HFR erfolgt zu-nächst eine hydrodynamische Charakterisierung des Prozesses.

5.3.1 Verweilzeitverhalten

Die Untersuchung der Verweilzeitverteilung (VWZ) erlaubt Aussagen über die Mischungsverhältnis-se bzw. die Nährstoffversorgung der Zellen im entsprechenden Kultivierungssystem. Die VWZ wur-de nach Protokoll 4.4.1 als Verdrängungsmessung akquiriert, die Summenverteilung normiert und in Abhängigkeit der dimensionslosen Zeit für Reaktor Typ 4 in Abbildung 5-19 aufgetragen. Ein weiteres Diagramm der VWZ-Summenverteilung für Typ 2 findet sich im Anhang in Abbildung 9-5, die Daten für beide Messungen sind in Tabelle 5-7 zusammengefasst.

Die Diagramme zeigen jeweils die Verdrängungsmessung für die alleinige Peripherie sowie die Peri-pherie mit angeschlossenem Reaktor für eine Durchflussrate von 30 ml∙min-1 (Typ 4) respektive 7 ml∙min-1 (Typ 2). Die Auswertung der Summenkurve der Reaktorperipherie (Typ 4) ergibt einen plug-flow geprägten Verlauf: Bis zu einer dimensionslosen Zeit (Θ) von 0,6 wird zunächst kein Farb-stoff detektiert, im Anschluss kommt es zu einem sprunghaften Anstieg auf den 100 %-Wert.

61

Ergebnisse

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

0,0

0,5

1,0

F()

Dimensionslose Zeit

Abbildung 5-19: Verweilzeitverteilung für Hohlfaserreaktor Typ 4. Auftragung der Verweilzeitsummenformel über die dimensionslose Zeit von Verdrängungsmessungen der Reaktorperipherie sowie der Peripherie mit HFR .

Das bereinigte Signal des HFRs ohne Peripherie zeigt ein deutliches Abweichen vom idealen Verlauf (Tabelle 5-7). Unter Anwendung des Kompartmentmodells wird die Auftragung in 1-und der Verlauf als Reihenschaltung eines idealen Strömungsrohrs (p ug reactor, PFTR) sowie eines idealen Rührkessels (STR) angenommen.

Unter diesen Voraussetzungen gilt Formel 5-1:

1 F( ) = y = expV

Vt +

VV

y = 1 für y 1

y 1

Formel 5-1

V Volumenstrom -1

V Volumenanteil STR

V Volumenanteil PFTR

Die aus einer Variation der Parameter (Tabelle 5-7) resultierende Modellkurve spiegelt in Abbildung 5-20 für Reaktortyp 4 (Typ 2 in Abbildung 9-6etwa 0,6 bis zum Anstieg des Signals mit einer anschließenden langsamen Annäherung an den 100 %-Wert wider.

62

Ergebnisse

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

0,0

0,3

0,5

0,8

1,0

1-F(

)

Dimensionslose Zeit

Abbildung 5-20: Anwendung des Kompartmentmodells für Reaktor Typ 4; Darstellung der Verweilzeitvertei-lung (1- und der berechneten Modellkurve .

Die berechneten Werte für die Peripherie des Reaktor-Typs 4 bestätigen den optischen Eindruck des - Charakters, der mit über 90 % ins Gewicht fällt. Nach Abzug der Volumina der Peripherie

ergeben sich die Daten für den HFR selbst. Hier fällt auf, dass das berechnete Volumen nur etwa zu einem Viertel dem tatsächlichen Volumen entspricht und etwa zu gleichen Teilen durchmischtes und pfropfenförmiges Verhalten auftreten (Tabelle 5-7).

Das Modellvolumen der Peripherie des Reaktors Typs 2 entspricht nicht exakt dem tatsächlichen Vo-lumen; zudem wird nur ein - Anteil von 60 % erreicht. Die Strömungsbereiche diesen Typus werden mit etwa einem Drittel des realen Volumens und in jeweils gleichen Teilen auf Rührreaktor und Strömungsrohr abgebildet.

Tabelle 5-7: Auswertung des Kompartmentmodells für HFR Typ 2 und 4, sowie die jeweilige Reaktor-periperie mit Angabe des Volumenstroms V, der gemessenen und hydrodynamischen VWZ

hydr, das Gesamtvolumen der jeweiligen Einheit Vr sowie die aus dem Kompartmentmodell be-rechneten Volumenanteile eines STR Vmixed und PFTR Vplug.

V hydr. Vr Modell Vmixed Modell Vplug

in -1 in s in s in in in

Typ

4

Peripherie 30 24 20 10,1 1 10

Gesamt 30 42 100 50,1 6 14

HFR 18 80 40,0 5 4

Typ

2

Peripherie 7 9 5 0,6 0,25 0,65

Gesamt 7 12 11 1,6 0,45 0,80

HFR 3 6 1,0 0,20 0,15

63

Ergebnisse

5.3.2 Vorversuche zur Kultivierung von Sf 21

Da die Immobilisierung von Zellen in Hohlfaserreaktoren keine reproduzierbare Probennahme er-laubt, muss zur Aufzeichnung der Kultivierung die Zelldichte über indirekte Verfahren bestimmt werden. Als simples nicht invasives Verfahren bietet sich die Bestimmung der Zelldichte über den Sauerstoffverbrauch im HFR an. Die Grundlage für die Berechnung bieten die Ergebnisse zum Sauer-stoffbedarf von Suspensionszellen (Kapitel 5.1.1.2). Die Vorversuche in den Reaktortypen 1 bis 3 (8 bis 20 cm² Oberfläche) dienen daher überwiegend der Untersuchung der Reproduzierbarkeit des Messaufbaus. Abbildung 5-21 stellt eine entsprechende Messung der Sauerstoffsättigung im Eingangs- und Ausgangsstrom des Moduls sowie die Differenz in einem Versuchsaufbau nach Kapitel 4.4.3 (Re-aktortyp 1) dar. Die graphische Auswertung der Kultivierung mit einer Startzellkonzentration von 5,0 105 -1 und einer Durchflussrate von 2,9 -1 zeigt nach einem initialen Wert von etwa 101 % für beide Sondensignale einen parallelen Verlauf mit einer leichten Abnahme des Signals auf etwa 96 % (Reaktorausgang) respektive 97 % (-eingang) bis Prozesstag eins. Im Anschluss folgt ein leichter Anstieg zum Prozesstag zwei, gefolgt von einer erneuten Abnahme des Signals. Die im Prozess auftre-tenden Schwankungen werden von beiden Sondensignalen parallel durchlaufen. Im Differenzsignal findet sich daher ein über die Prozesszeit relativ konstanter Wert mit Schwankungen im Bereich von 0,2 bis 1,2 % Sauerstoffpartialdruck.

0 1 2 390

92

94

96

98

100

102

104

Saue

rsto

ffsät

tigun

g in

% p

O2

Prozesszeit in d

0

2

4

Diff

eren

z in

% p

O2

Abbildung 5-21: Messung des Sauerstoffbedarfs einer Sf 21-Kultur im HFR Typ 1 mit einer Startzellzahl von

5,0 5 -1. Die Sondensignale sind für den Reaktoreingang , -ausgang sowie der Sauer-stoffverbrauch als Differenzsignal der Messungen über der Prozesszeit aufgetragen.

Nachdem die Kultivierung im HFR zu den oben beschriebenen Bedingungen in keiner sichtbaren Veränderung der Sauerstoffaufnahme und somit keiner Änderung in der Zellkonzentration resultiert, werden weitere Kultivierungen mit Variation des Reaktor-Typus sowie von Parametern durchgeführt, um die Eignung der Sauerstoffmessung zur Bestimmung der Zellzahl genauer zu untersuchen (Tabelle 5-8). Dabei werden im Folgenden aus Gründen der Übersichtlichkeit ausschließlich die Differenzdaten der Sauerstoffmessungen aufgetragen. Grundsätzlich wird erwartet, dass sich Veränderungen in der Flussrate bzw. der Startzellkonzentration in Änderungen der Differenzwerte niederschlagen. Weiterhin sollte eine Vergrößerung der Oberfläche des HFR zu einem verstärkten Sauerstoffübergang führen und sich ebenfalls im Resultat der Messung niederschlagen.

64

Ergebnisse

0 1 2 3 4 5 6

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Diff

eren

z in

% p

O2

Prozesszeit in d

Abbildung 5-22: Kultivierung in HFRen mit Variation der Flussrate bzw. der Startzellzahl. Ansätze mit 3,0 106 -1 (Typ 1, 1,5 -1 ), 5,0 106 -1 (Typ 2, 5,7 -1 ) sowie 1,0 107 -1 (Typ 3, 7,2 -1 ).

Eine Erhöhung der Startzelldichte auf 3,0 106 -1 mit einer gleichzeitigen Reduzierung der Durch-flussrate auf 1,5 -1 führt in den ersten 24 Stunden zunächst zu einem Anstieg des Sauerstoffver-brauchs im HFR von initial 2 auf 4 % (Abbildung 5-22). Daraus kann auf ein Zellwachstum im Reaktor geschlossen werden. Im weiteren Verlauf der sechstägigen Kultivierung nimmt jedoch das Differenz-signal stetig bis auf etwa 1 % ab. Eine weitere Erhöhung der Startzellzahl auf 5,0 106 -1 mit Einsatz eines höher gewählten cutoffs und einer höheren Durchflussrate von 5,7 -1 im Reaktortyp 2 re-sultiert über die Kultivierungsdauer in einem relativ konstanten Signal zwischen 2 und 3 %. Ein ähnli-ches Bild ergibt die Auftragung der Ergebnisse des Reaktortyps 3 bei einer Startzellzahl von 1,0 107 -1, einer Flussrate von 7,2 -1 und einer Oberfläche von 20 cm². Hier liegt der Sauer-stoffverbrauch stark schwankend zwischen 5 und 7 %.

Tabelle 5-8: Parameter bzw. Spezifikationen für die Kultivierung in HFR-Typ 1 bis 3.

Reaktortypen 1 2 3

Startzellkonzentration -1 3,0 106 5,0 106 1,0 107

Innenvolumen, gewogen 0,95 0,95 1,8

KR, berechnet 0,12 0,12 0,27

Durchflussrate -1 1,5 5,7 7,2

Hydrodynamische VWZ min 0,08 0,02 0,04

5.3.3 Optimierte Kultivierung von Sf 21

Die bisher gewonnen Daten lassen nur ansatzweise auf ein Zellwachstum schließen. Festzustellen ist allerdings ein im Vergleich erhöhter Sauerstoffverbrauch beim Einsatz eines HFR mit größerer Ober-fläche. Im weiteren Verlauf wird daher auf einen Reaktor mit einer Oberfläche von 3000 cm² und ei-nem EKR von 20 zurückgegriffen (Typ 4). Um eine Zellteilung während der Kultivierung alternativ zur Sauerstoffmessung nachzuweisen, werden die Zellen vor dem Inokulum mit CFDA-SE (car-

) angefärbt. Der Farbstoff kann per Diffusion die Zellmembran

65

Ergebnisse

passieren. Im Cytosol wird eine Estergruppe unter Entstehung einer amin-reaktiven Gruppe durch intrazelluläre Esterasen abgespalten. Diese fluoreszenzaktive Gruppe bindet kovalent an Lysinreste von Proteinen. Die Zellteilungen können am Durchflusszytometer verfolgt werden, da die zellinter-nen Proteine und somit die Farbstoffe gleichmäßig auf die Tochterzellen aufgeteilt werden (Quah et al. 2007).

5.3.3.1 Zellsynchronisierung und CFDA-SE Färbung Da mit jeder Teilung das messbare Fluoreszenzsignal des Farbstoffes abnimmt, wird zunächst in Sus-pensionskultur überprüft, wie viele Teilungen nachvollzogen werden können. Zur besseren Visuali-sierung der Teilungen werden die Zellen zuvor mit Hydroxyharnstoff synchronisiert (Protokoll 4.5.5). Dies verhindert durch reversible Hemmung der Ribonukleotid Reduktase eine de novo Synthese von Ribonukleotiden und bewirkt einen Zellarrest in der späten G1- bzw. frühen S-Phase des Zellzyklus (Linke et al. 1996). In Abbildung 5-23 ist die Zellzyklusmessung (Protokoll 4.5.4) einer Kontrollkultur sowie einer mit Hydroxyharnstoff behandelten Kultur dargestellt. Die Messung zeigt eine übliche Verteilung der Zellzyklusphasen in der Kontrollkultur mit peaks in der G1 sowie G2/M-Phase und einer intermediären S-Phase. Die Zugabe mit Hydroxyharnstoff wirkt sich in eine Rechtsverschiebung und Verbreiterung des G1-peaks aus. Ein für die G2/M-Phase charakteristischer peak ist nicht auszu-machen. Die Ergebnisse der Zellzyklusanalyse sind nach Auswertung mit dem Algorithmus nach Watson in Tabelle 5-9 zusammengefasst.

0 500 10000

50

100

150

200

250

coun

ts

DNA-Gehalt

Abbildung 5-23: Zellzyklusmessung nach Synchronisierung einer Sf 21 Suspensionskultur. Auftragung des DNA-Gehalts einer Kontrollkultur sowie einer mit Hydroxyharnstoff arretierten Kul-tur .

Tabelle 5-9: Zellzyklusanalyse der Sf 21 vor und nach Synchronisierung mit Hydroxyharnstoff; Angabe der Breite des G1-peaks als Variationskoeffizient (CV) und der Verteilung der Population über G1-, S- sowie G2/M-Phase; berechnet nach dem Algorithmus nach Watson (Watson et al. 1987).

Kontrolle in % synchronisierte Kultur in %

G1 40,1 58,6

S 42,7 36,0

G2/M 17,0 1,6

G1; Cv 3,48 7,06

66

Ergebnisse

Die entsprechende Messung der CFDA-SE angefärbten Zellen ist (Protokoll 4.5.6) in Abbildung 5-24 dargestellt. Aufgetragen sind eine ungefärbte Kontrollkultur sowie die gefärbte Kultur an den Pro-zesstagen 1 bis 3. Die einzelnen Tage sind als distinkte peaks auszumachen und unterscheiden sich deutlich von der Autofluoreszenz der Kontrollkultur. Somit ist festzuhalten, dass zumindest 3 Teilun-gen nach einer CFDA-SE Anfärbung nachzuvollziehen sind.

1 10 100 1000 100000

25

50

75

100

125

150

co

unts

CFDA-SE-Fluoreszenz

Abbildung 5-24: CFDA-SE Färbung von Sf 21 Suspensionszellen. Auswertung der Autofluoreszenz der Kon-trollkultur sowie der Fluoreszenz der mit CFDA-SE gefärbten Zellen an Prozesstag 1 , 2 und 3 .

5.3.3.2 Wachstumsverlauf Zur Kultivierung wurde der HFR sowie die Reaktorperipherie entsprechend vorbereitet (Kapitel 4.4), aufgebaut und mit CFDA-SE gefärbten Zellen (Protokoll 4.5.6) einer Startzellzahl von 5,0∙107 Zellen inokuliert. Vor dem Animpfen wurden die Zellen nicht synchronisiert, um einen unnötigen Stress zu vermeiden. Während der Kultivierung beträgt die Sauerstoffsättigung im Mediumreservoir beständig zwischen 97 und 100 %. Die online-Messung des Sauerstoffverbrauchs (Differenz über den Reaktor) ist, ebenso wie die Durchflussrate, in Abbildung 5-25 dargestellt. Der Sauerstoffverbrauch steigt nach einem initialen Wert von 5 %, mit starken Schwankungen unterlegt, bis Prozesstag 10 auf einen Wert von 17,5 % an und bewegt sich bis zum Abbruch des Versuches nach 21 Tagen auf einem Niveau um 10 %. Teilweise gehen die sprunghaften Änderungen im Sauerstoffbedarf mit dem Erhöhen der Durchflussrate von 30 ml∙min-1 auf 50 (Tag 3), bzw. auf 90 ml∙min-1 an Tag 7 einher. Die zudem aufge-tragene Zelldichte im Reaktor wurde unter Berücksichtigung der Änderung der Verweilzeit bei Erhö-hung der Durchflussrate und der zuvor gemessenen Sauerstoffaufnahmerate der Insektenzellen (Ka-pitel 5.1.1.2) nach Formel 5-2 berechnet:

67

Ergebnisse

Zellzahl = cO2

∆pO2 100 ∙ VWZKR ∙ q̇

Formel 5-2

cO2 Konzentration Luftsauerstoff 2,66∙10-4 mmol∙ml-1

∆pO2 Differenz Sauerstoffpartialdruck siehe unten %

VWZKR Verweilzeit im Kapillarraum 18 min

q̇ zellspezifische Sauerstoffaufnahmerate 1,05∙10-11 mmol∙Z-1∙min-1

Aus der Auftragung lässt sich eine etwa 8-tägige exponentielle Wachstumsphase mit einem µmax von 0,252 (Verdopplungszeit von 66 h) im Reaktor ableiten, welcher eine stationäre Wachstumsphase im Bereich der pcd von etwa 1∙107 Z∙ml-1 folgt.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 220

5

10

15

20

25

D

iffer

enz

in %

pO

2

Prozessdauer in d

20

40

60

80

100

Dur

chflu

ssra

te in

ml⋅m

in-1

106

107

bere

chne

te Z

ellz

ahl i

n Z⋅

ml-1

Abbildung 5-25: Kultivierung von Sf 21 im HFR Typ 4. Auftragung des Differenzverlaufs einer Sauerstoffmes-

sung mit berechneter Zellzahl über der Prozesszeit mit Angabe der Flussrate .

Während der Kultivierung wurden aus dem EKR des HFR regelmäßig Zellproben entnommen und im Durchflusszytometer die aus der initialen CFDA-SE Anfärbung resultierende Fluoreszenz untersucht (Abbildung 5-26). In der Auswertung zeigt sich ein definierter peak zu Beginn der Kultivierung, klar abgetrennt von der Kontrollkultur. Nach einer Kultivierung von 7 Tagen ergibt die Messung eine brei-tere Fluoreszenzverteilung mit einer Überlagerung von mindestens 5 verschiedenen Einzel-peaks. Da-nach ist im Fluoreszenzniveau keine Veränderung mehr zu verzeichnen. Die Kultur liegt somit wei-terhin oberhalb der Autofluoreszenz der Zellen. Ein Zellwachstum über den betrachteten Zeitraum kann also bestätigt werden.

68

Ergebnisse

1 10 100 1000 100000

25

50

75

100

125

150

coun

ts

CFDA-SE Fluoreszenz

Abbildung 5-26: CFDA-SE Färbung bei Kultivierung der Sf 21 im HFR Typ 4. Auftragung der Autofluoreszenz der Kontrollkultur sowie der Fluoreszenz der gefärbten Zellen zu Prozessbeginn und nach einer Prozesszeit von 7 Tagen .

5.3.4 Proteinproduktion

Zur Untersuchung der Proteinproduktion im HFR und für den angestrebten Vergleich der immobili-sierten Kultivierungssysteme mit der Suspensionskultur werden im Folgenden infizierte Sf 21 Zellen im HFR Typ 4 kultiviert.

5.3.4.1 Wachstumsverlauf Die Vorbereitung der Reaktorperipherie sowie des HFR wird wiederum nach Kapitel 4.4 durchge-führt. Zum Inokulieren werden Zellen aus einer exponentiell wachsenden Vorkultur einen Tag vor Beginn der Kultivierung mit einem MOI von 5 infiziert und über Nacht inkubiert (Kapitel 4.2.4). Diese Zellen werden mit nicht infizierten Zellen aus der Vorkultur so gemischt, dass der Reaktor mit einer Gesamtzellzahl von 5∙107 Zellen und einem Anteil von 1 % infizierter Zellen beimpft werden kann. Die Begasung sowie die Rührerdrehzahl werden so geregelt, dass zu jeder Zeit der Kultivierung die Sauerstoffsättigung im Mediumreservoir über 97 % liegt. Der daraus resultierende Verlauf der Sauer-stoffdifferenzmessung zeigt, analog zu Kapitel 5.3.3, ein sprunghaftes Verhalten mit starken Aus-schlägen bei Änderungen der Durchflussrate (Abbildung 5-27). Die Werte durchlaufen nach initial 5 % ein Maximum an Tag 4 bei etwa 15 %; bis zum Kultivierungsende folgt die Kurve einem abneh-menden Trend auf etwa den Ausgangswert. Die Berechnung der Gesamtzellzahl (Formel 5-2) bzw. der Zellkonzentration über die Kultivierungsdauer ergibt eine etwa viertägige exponentielle Wachs-tumsphase mit einer maximalen Wachstumsgeschwindigkeit µmax von 0,29 d-1 und einer pcd von 9,4∙106 Z∙ml-1. Die anschließende stätionäre Phase zieht sich etwa über 10 Tage, gefolgt von einer Ab-sterbephase mit einer Abnahme der berechneten Zellzahl auf etwa 4,2∙106 Z∙ml-1. Die Durchflussrate wird während der Kultivierung von 30 ml∙min-1 über 50 und 70 auf 90 ml∙min-1 erhöht.

69

Ergebnisse

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240

5

10

15

20

25

Diff

eren

z in

% p

O2

Prozessdauer in d

20

40

60

80

100

Dur

chflu

ssra

te in

ml⋅m

in-1

106

107

Zellz

ahl i

n Z⋅

ml-1

Abbildung 5-27: Kultivierung von infizierten Sf 21 im HFR Typ 4. Auftragung des Differenzverlaufs einer Sauer-

stoffmessung mit berechneter Zellzahl über der Prozesszeit mit Angabe der Flussra-te .

5.3.4.2 Bestimmung der infizierten Zellen Durch den Nachweis der Produktion des Tracer-Moleküls GFP in der Kultur kann eine erfolgreiche Infektion der Zellen bestätigt werden. Das fluoreszierende Protein kann – je nach produzierter Menge – im Mikroskop qualitativ, bzw. im Durchflusszytometer quantitativ, nachgewiesen werden. Die Bildüberlagerung einer Hellfeldaufnahme sowie einer Fluoreszenzaufnahme nach einer Kultivie-rungsdauer von 17 Tagen zeigt in Abbildung 5-28 (links) GFP-produzierende, grün leuchtende Zellen. Eine quantitative durchflusszytometrische Messung (rechts) resultiert nach einem Kultivierungstag in einen Anteil von 4 % positiven Zellen, nach 14 Tagen ergibt sich ein Anteil von 72 %.

1 10 100 1000 10000

0

25

50

75

100

125

coun

ts

GFP-Fluoreszenz

Abbildung 5-28: Identifizierung von GFP-positiven Zellen; qualitativ im Fluoreszenzmikroskop (links) bzw. quantitativ durch Vermessung im Durchflusszytometer an Tag 1 bzw. 14 der Kulti-vierung im Vergleich zur Autofluoreszenz einer Kontrollkultur .

70

Ergebnisse

5.4 Proteinanalytik

Insektenzellen besitzen das Potential, gewisse Glykosylierungsmuster als posttranslationale Modifika-tion und nach genetischer Modifizierung auch die humane Form auszubilden (siehe Kapitel 2.4.3). Humanes Erythropoietin ist ein komplex glykosyliertes Protein und somit ein interessantes Untersu-chungsmodell, um die Fähigkeiten der Glykosylierung der Insektenzellen näher zu beleuchten. Daher soll in dieser Arbeit nicht nur der reine Nachweis einer EPO-Produktion erbracht werden, sondern möglichst eine Aufreinigungsstrategie etabliert werden, um das produzierte Protein möglichst rein darstellen zu können. Als Konsequenz soll das EPO aus den Insektenzellen späteren Arbeiten für eine eingehende Untersuchung der Proteinstruktur nach tryptischen Verdau mit z.B. MALDI-TOF bzw. einer Analyse der Glykostrukturen zugänglich gemacht werden.

Die Aufreinigungsstrategie ist hierbei auf die Eigenschaften des rekombinanten EPOs abgestimmt. Der N-terminal am Protein angefügte His-Tag wird genutzt, um in einer immobilisierten Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) das Protein aus dem Kulturüberstand zu binden. Die Etablierung der einzelnen Aufreinigungsschritte wird mit SDS-Gelelektrophorese sowie teils mit Westernblot und/oder ELISA qualifiziert.

5.4.1 Etablierung des anti-EPO Westernblots

Im Zuge der Herstellung des rekombinanten Proteins im Labormaßstab ist es evident wichtig, das Zielprotein möglichst sensitiv zu identifizieren. Der Westernblot als Nachweismethode stellt hierbei neben der Identifizierung des EPOs Aussagen über die Proteingröße bereit und liefert somit bereits erste Hinweise auf eine mögliche posttranslationale Modifikation. Mit seinen vielfältigen Operations-schritten ist der Westernblot ein Prozess, der Optimierungsansätze an den entsprechenden Parame-tern erlaubt.

5.4.1.1 Dot-Blot Um die maximale Sensitivität im Westernblot zu erreichen, werden in Ausführung eines Dot-Blots (Protokoll 4.6.5.1) der Einfluss der Blockiersubstanz sowie die Konzentrationen der Primär- (1. AB) und Sekundärantikörper (2. AB) auf die Güte des Ergebnisses untersucht (Tabelle 5-10). Die Spezifika-tionen der verwendeten Antikörper (Pierce EPO und anti-Chicken) finden sich in Tabelle 9-53.

Tabelle 5-10: Pipettierschema der Dot-Blot Optimierung mit Verdünnungen für Primär- und Sekundäranti-körper sowie Angabe der Blockiersubstanz.

Blockiersubstanz

BSA 1 % Milchpulver 5 %

1. AB 1:1.000 1:2.000 1:1.000 1:2.000

2. AB 1:5.000 1:5.000 1:5.000 1:5.000

1. AB 1:1.000 1:2.000 1:1.000 1:2.000

2. AB 1:25.000 1:25.000 1:25.000 1:25.000

1. AB 1:1.000 1:2.000 1:1.000 1:2.000

2. AB 1:50.000 1:50.000 1:50.000 1:50.000

Nach den Inkubationsschritten wird der Dot-Blot (Kapitel 4.6.5.1) mit Chemilumineszenz-Substrat entwickelt (Abbildung 5-29). Bei Einsatz von Milchpulver als Blockiersubstanz ist lediglich in der höchsten Antikörperkonzentration ein Spot zu erkennen. Nach Blockieren mit BSA hingegen kann in der detektierten Intensität deutlich die Verdünnung der Antikörper mit der Signalabnahme nachvoll-

71

Ergebnisse

zogen werden. Das intensivste Signal resultiert in der höchsten Konzentration an Primär- und Sekun-därantikörpern.

Abbildung 5-29: Darstellung des EPO Dot-Blots mit den Weißlichtbildern der prozessierten Nitrocellulose-Membran (jeweils links) sowie die Lumineszenz-Aufnahmen nach der Entwicklung (jeweils rechts) der Antikörperverdünnung mit BSA (links) respektive Milchpulver als Blockiersubstanz (rechts).

5.4.1.2 Western-Blot Nach Optimierung der Parameter im Dot-Blot folgt mit dem Übertrag auf den Western-Blot eine Eva-luierung der Sensitivität des Systems. Die Verdünnungen an EPO-Standard werden dazu nach dem Transfer (Kapitel 4.6.5.2) vom SDS-Gel auf die Nitrocellulosemembran und den entsprechenden Pro-zessierungen durch die Zugabe von Chemilumineszenz-Substrat visualisiert (Abbildung 5-30). Die EPO-Verdünnungen von etwa 95 ng bis 5,5 ng zeigen bei der Auswertung breitgefächerte Banden bei etwa 39 und 77 kDa und mit steigender Verdünnung eine abnehmende Intensität. Die prägnantere 39 kDa Bande ist bis zu einer EPO-Konzentration von etwa 11 ng klar auszumachen und selbst bei Einsatz von 5,5 ng noch schemenhaft zu erkennen.

Abbildung 5-30: Invertierte Chemilumineszenz-Aufnahme eines Western-Blots einer Verdünnungsreihe an EPO-

Standards von 93,75 (5), 46,88 (4), 23,43 (3), 11,72 (2) und 5,86 (1) ng sowie der SA (6).

72

Ergebnisse

5.4.2 Etablierung der IMAC Affinitätschromatographie

Das Prinzip der IMAC beruht auf der Ausbildung eines Chelatkomplexes zwischen einem auf der Säule immobilisierten zweiwertigen Metallion (Nickel oder Cobalt) und den aromatischen Histidin-resten des Zielproteins. Daraus resultiert die Bindung des Proteins an die Säule. Nach dem Auswa-schen unspezifisch gebundener Proteine kann durch Zugabe eines Eluenten (Imidazol) das Ziel-protein in einem kompetitiven Prozess aus der Säule eluiert werden. Das Säulenmedium liegt zum einen in Form einer Säule zum Einsatz in einer MPLC-Anlage (z.B. Äkta Purifier), zum anderen auch als loses Medium zur Untersuchung der Binde-, Wasch- und Eluierschritte in Zentrifugenröhrchen vor. Der Einsatz des losen Mediums eignet sich deshalb auch, um in einer Variation der Parameter den Aufreinigungsprozess zu untersuchen.

5.4.2.1 Loses Säulenmaterial Mit dem wird das Standardmaterial der His-Tag-Affinitätschromatographie eingesetzt, um die Eignung zur Aufreinigung des Proteins zu evaluieren. Dazu wird der Überstand einer infizierten Suspensionskultivierung nach Protokoll 4.6.8.1 mit den für das Material empfohlenen phosphatgepufferten Wasch- und Elutionspuffern (Tabelle 9-46), einer Imidazol-Konzentration von 20 respektive 200 , im SDS-Gel (Protokoll 4.6.3.1), Abbildung 5-31, ergibt in den Proben vor und nach dem Binden an das Material multiple überlagerte Banden (Spuren 8 und 7) über den gesamten Größenbereich. Im Überstand des ersten Waschschrittes (Spur 6) zeigt sich weiterhin eine Vielzahl von überlagerten Banden mit schwächerer Intensität, der zweite Waschschritt (Spur 5) ergibt keine klar erkennbaren Proteinbanden. Beide Elutionsschritte (4 und 3) ergeben jeweils eine diffuse Bande, die in etwa auf der Höhe des zusätzlich aufgetragenen EPO-Standards (2) in einem Bereich bei 37 kDa läuft.

Abbildung 5-31: SDS-Gel der IMAC-Fraktionen mit losem Säulenmedium mit Auftragung vor dem Beladen (8),

nach dem Beladen (7), nach den beiden Waschschritten (6 und 5), nach den beiden Elutions-schritten (4 und 3) sowie des EPO-Standards (2) und des Größenstandards (1).

Ein Westernblot (Kapitel 4.6.5) des Gels mit anschließender Immunodetektion (Abbildung 5-32) resul-tiert zusätzlich zum EPO-Standard in jeweils eine positive Bande in den Spuren der ursprünglichen Probe (8), nach dem Bindeschritt (7) sowie den Elutionsschritten (2 und 3). Die Banden des detektier-ten rekombinanten EPOs liegen jedoch nicht entsprechend dem Standard auf einer Höhe von etwa

73

Ergebnisse

37 kDa, sondern im Bereich von 25 kDa. Im zuvor gefärbten Gel sind in den Elutionsfraktionen auf dieser Höhe keine klaren Banden auszumachen.

Abbildung 5-32: Westernblot der IMAC-Fraktionen mit losem Medium nach Entwicklung mit Chemilumines-

zenzsubstrat. Auftragung vor dem Beladen (8), nach dem Beladen (7), nach beiden Waschschrit-ten (6 und 5), nach beiden Elutionsschritten (4 und 3) sowie eines EPO-Standards (2) und des aus der Weißlichtaufnahme des Blots eingefügten Größenstandards (1).

In weiteren Ansätzen wird der Einfluss einer vorhergehenden Entsalzung des Kulturüberstandes, einer Variation des pH in der Probe oder den Puffern sowie der Imidazolkonzentration in den Puffern untersucht und mittels ELISA quantifiziert (Tabelle 9-1, Abbildung 9-15). Die Auswertung der Eluti-onsfraktionen zeigt, dass die nach Protokoll 4.6.8.1 durchgeführte Prozessierung der Proben die höchste Wiederfindungsrate sowie den besten Elutionserfolg im ersten Elutionsschritt gewährleistet.

5.4.2.2 Affinitätschromatographie Im Anschluss an die Versuche mit losem Sepharosemedium sollen die Auswahl einer geeigneten Säu-le und des Puffersystems erfolgen (Tabelle 4-10). Die Spezifikationen zu den ausgewählten Säulen finden sich in Tabelle 9-56. Die Säulen nutzen Nickel (HisTrap FF crude und HiTrap excel) oder das sensitivere Metall Cobalt (HiTrap Talon) zur Ausbildung des Chelatkomplexes mit dem His-Tag des rekombinanten Proteins. Weitere grundlegende Unterschiede ergeben sich nach Herstellerangaben in der chemischen Stabilität der Matrix; so ist die HiTrap excel resistent gegen ein Auswaschen des Me-tallions durch EDTA und zudem auf den Gebrauch mit Insektenmedium optimiert. Die zu testenden Puffersysteme werden jeweils an die angegebenen Anforderungen der Säule angepasst.

In Abbildung 5-33 findet sich die exemplarische Auftragung aller während des Chromatographielau-fes essentieller Daten beim Einsatz einer HisTrap FF crude im phosphat-gepufferten System. Gezeigt ist der Verlauf der Messung der Leitfähigkeit, der Absorption, der eingestellte Gradient des Eluenten, der Druck, die Flussrate sowie die Fraktionierung über dem Durchfluss durch die Säule, beginnend mit der Probenaufgabe (Kapitel 4.6.8.3). Die Leitfähigkeit fällt mit Beginn der Probenaufgabe nach dem Equilibieren vom Niveau der Leitfähigkeit des Waschpuffers ab und steigt nach Beladung der Säule nach etwa 6 ml Durchfluss wieder auf den Ursprungswert an. Ein einstufiger Gradient auf 100 % des Eluierungspuffers nach 19,5 ml Durchlauf ändert die Leitfähigkeit nicht. Der Druck steigt mit der Pro-benaufgabe auf einen Wert von 0,5 MPa an und verbleibt im Anschluss, abgesehen von einem kleinen peak beim Wechsel auf den Elutionspuffer, auf einem Wert um 0,4 MPa. Die Durchflussrate von

74

Ergebnisse

0,5 ml∙min-1 wird mit beginnender Fraktionierung (in 1,5 ml Fraktionen) auf 1 ml∙min-1 angepasst. Das Signal der Protein-Detektion bei einer Absorption von 254 nm steigt mit Auftrag der Probe auf über 2.000 mAU an. Während des Waschschrittes ab 6 ml Durchfluss werden unspezifisch gebundene Pro-teine von der Säule gelöst und das Signal sinkt bis auf 0 mAU ab. Beim Eluieren ist im Bereich der Fraktionen 2 bis 5 ein in dieser Skala sehr niedriger Anstieg zu erkennen.

1 2 3 4 5 6 7 Waste

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 320

500

1000

1500

2000

2500

Abs

orpt

ion

254

nm in

mA

U

Durchfluss in ml

0

20

40

60

80

100

120

140

Gra

dien

t B in

%

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Dru

ck in

MPa

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Flu

ssra

te in

ml⋅m

in-1

0

10

20

30

40

50

Leitf

ähig

keit

in m

S⋅cm

-1

Abbildung 5-33: IMAC-Chromatogramm mit Darstellung der relevanten Parameter beim Einsatz einer HisTrap

FF crude Säule und Phosphat als Puffersystem; Auftragung der Leitfähigkeitsmessung , der Absorptionsmessung bei 254 nm , des Gradienten des Elutionspuffers , des Systemdru-ckes , der Flussrate sowie der Fraktionen beim Eluieren (nummerierte Balken) über dem Durchfluss.

5.4.2.3 IMAC mit Phosphat-gepuffertem System Zunächst sollen die Ergebnisse beim Einsatz phosphat-gepufferter Lösungen (Tabelle 9-46) in den ausgewählten Säulen untersucht werden. Dazu wird eine Probe aus Kulturüberstand der Sf 21 aliquo-tiert und zu jeweils 5 ml auf die Säulen aufgegeben (Kapitel 4.6.8.3). Das resultierende UV-Signal im Chromatogramm ist, fokussiert auf den Bereich der Fraktionierung, nach der einstufigen Erhöhung des Elutionspuffers auf 100 % in Abbildung 5-34 dargestellt. Oben rechts im Diagramm ist der Ge-samtverlauf der UV-Detektion mit Probenaufgabe, Waschschritt und Elution skizziert. Im fraktionier-ten Bereich ergibt sich zu Beginn bei allen Säulen ein kleiner peak, der aus der Umstellung des Puffers resultiert. Ab Fraktion 2 ergibt sich in jedem Fall ein Signal-Anstieg mit einem über bis zu 5 Fraktionen tailenden bzw. schmierenden peak. Die Intensität erreicht bei Verwendung der HiTrap Talon sowie HisTrap FF jeweils über 20 mAU, die HisTrap excel ergibt eine peak-Höhe von etwa 15 mAU. Das geringste tailing zeigt die HiTrap Talon, die beiden anderen Säulen lassen sich diesbezüglich nicht unterscheiden. Alle peaks beinhalten vielfache Schultern, die sich durch Druckschwankungen im Sys-tem erklären lassen. Weiterhin zu erwähnen ist der alleinig in der HisTrap excel vorkommender Peak von etwa 50 mAU im Waschschritt.

75

Ergebnisse

1 2 3 4 5 6 7 Waste

1 2 3 4 5 6 7Waste

20 25 30

0

5

10

15

20

25

Abs

orpt

ion

254

nm in

mA

U

Durchfluss in ml

0 5 10 15 20 25 300

1000

2000

254

nm

Durchfluss in ml

Abbildung 5-34: IMAC-Chromatogramm zum Säulenvergleich bei phosphat-gepuffertem System. Auftragung

der UV-Absorption auf den vergrößerten Bereich der Fraktionierung bei Einsatz der HisTrap FF crude , der HisTrap excel sowie der HiTrap Talon sowie Darstellung des Gesamt-verlaufs der UV-Detektion (oben rechts).

Zur Evaluierung des Ergebnisses der Affinitätschromatographie werden die jeweiligen Fraktionen im Zentrum des Elutionspeaks auf ein SDS-Gel (Abbildung 5-35) aufgetragen. Die resultierenden Spuren zeigen ein ähnliches Bandenmuster mit distinkten Banden bei etwa 28 und 37 kDa sowie vielfältigen überlagerten Banden im Bereich höheren Molekulargewichts. Die eindringlichsten Banden liegen hier bei etwa 100 bzw. 120 kDa. Bei Auftragung des gleichen Volumens auf die Spuren zeigt sich jedoch ein deutlicher Intensitätsunterschied zwischen den eingesetzten Säulen. So nimmt die Bandenintensität ausgehen von der HisTrap FF crude über die HiTrap Talon zur HisTrap excel hin ab.

Abbildung 5-35: SDS-Gel der IMAC-Elutionsfraktionen. Silberfärbung der Auftragung eines SA (3) sowie der

Fraktionen (Fr) 2 und 3 der HisTrap FF (1 und 2), Fr 1 bis 3 der HisTrap excel (4 bis 6) sowie Fr 2 und 3 der HiTrap Talon (7 und 8).

76

Ergebnisse

5.4.2.4 IMAC mit Tris-gepuffertem System Die Verwendung desselben Kulturüberstandes aus Kapitel 5.4.2.3 im Tris-gepufferten (Tabelle 9-47) System resultiert in ein deutlich unterschiedliches Chromatogramm. Ab Fraktion 2 ergibt sich beim Einsatz der HisTrap FF crude ein, ähnlich zum vorhergehenden Versuch, tailender Peak mit einer Höhe von etwa 15 mAU, wohingegen die anderen Säulen bei Elution ein Signal von 5 mAU nicht überschrei-ten.

1 2 3 4 5 6 7 Waste

35 40 45 50

0

5

10

15

20

25A

bsor

ptio

n 25

4 nm

in m

AU

Durchfluss in ml

0 10 20 30 400

1000

2000

254

nm

Durchfluss in ml

Abbildung 5-36: IMAC-Chromatogramm zum Säulenvergleich bei Tris-gepuffertem System. Auftragung der

UV-Absorption auf den vergrößerten Bereich der Fraktionierung bei Einsatz der HisTrap FF cru-de , der HisTrap excel sowie der HiTrap Talon sowie Darstellung des Gesamtver-laufs der UV-Detektion (oben rechts).

Auch bei Betrachtung der Silberfärbung der vielversprechendsten Fraktionen aus dem vorhergehen-den Chromatogramm zeichnet sich ein unterschiedliches Bild zum phosphat-gepufferten System ab (Abbildung 5-37). Die Spuren der Fraktionen der HisTrap FF zeigen wiederum das im Vergleich inten-sivste Bandensignal, jedoch mit Überlagerungen im Bereich der 37 kDa-Bande. Neben weiteren, nicht differenzierbaren Banden ab einer Größe von 48 kDa, treten zudem im Bereich von etwa 45 kDa sowie 75 kDa prägnante Banden auf. Der Einsatz der HiTrap Talon führt in allen getesteten Fraktionen zu zwei deutlichen Proteinbanden bei 37 und 75 kDa, wohingegen die erste Fraktion der HisTrap excel eine schwache Bande bei etwa 45 kDa, sowie in den weiteren Fraktionen zusätzlich die bekannten Banden bei 37 und 75 kDa offenbart.

77

Ergebnisse

Abbildung 5-37: SDS-Gel der IMAC-Elutionsfraktionen. Silberfärbung der Auftragung eines SA (2) sowie der

Fraktionen (Fr) 2 bis 4 der HisTrap FF (1, 3 und 4), Fr 2 bis 4 der (5 bis 8) sowie Fr 2 bis 3 der (8 bis 10).

Neben der Gelelektrophorese wird hier zudem ein anti-EPO ELISA eingesetzt, um die einzelnen Schritte der Chromatographieläufe der HisTrap FF crude sowie der quantitativ abzubil-den. Dazu werden Proben während des Bindens an die Säule, während des Waschvorganges und von Fraktionen der Elution untersucht. Die Auswertung einzelner Fraktionen (Abbildung 5-38) ergibt, dass beim Einsatz der HisTrap FF im Vergleich zu den anderen getesteten Materialien die Bindung an die Säule weit weniger effektiv verläuft. Beim Waschen wird hier zwar wenig, in der Vergleichssäule jedoch kein Zielprotein ausgetragen. Bei Betrachtung der Elutionsfraktionen über den peak fällt allerdings auf, dass die HisTrap FF Vorteile in der Wiederfindung mit sich bringt.

Bind

en 1

Bind

en 2

Was

chen

Elut

ion

1El

utio

n 2

Elut

ion

3El

utio

n 4

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

EPO

-Kon

zent

ratio

n in

mIU

-1

Proben

Abbildung 5-38: EPO-Konzentration in Schritten der IMAC mit dem Einsatz des Tris-Puffersystems. Bestim-

mung der Konzentration über anti-EPO ELISA von Proben aus dem Durchfluss, während des Waschens und aus Elutionsfraktionen der Säulen HisTrap FF crude sowie der .

78

Ergebnisse

5.4.2.5 IMAC mit denaturierendem Puffer-System Beim Einsatz des Tris-Puffersystems wurde gezeigt, dass relativ viel an Zielprotein beim Beladen der Säule im Durchlauf ausgetragen wird. Dies könnte an sterischen Hinderungen bei der Chelatbindung zwischen dem His-Tag des Proteins und den auf der Säule immobilisierten Metallionen liegen, so dass trotz des niedrig gewählten Aufgabevolumenstroms die Verweilzeit für eine Ausbildung der Bindung nicht ausreicht. Eine mögliche Verbesserung des Capture-Schrittes könnte die Bindung des Proteins im, durch das Chaotrop Harnstoff entfalteten, bzw. reversibel denaturierten Zustand an die Säule bringen. Beim Einsatz des Puffers wird der Chromatographielauf durch einen weiteren Waschschritt nach Aufgabe des Proteins ebenfalls mit denaturierendem Puffer ergänzt (Kapitel 4.6.8.3). Die Renatu-rierung des Proteins erfolgt im zweiten Waschschritt in Abwesenheit des Chaotrops. Gleichzeitig wird, zur Erhöhung der Proteinkonzentration in der Säule, ein größeres Volumen injiziert. Aufgrund der höchsten Wiederfindungsrate sowie den ausgeprägtesten Banden im SDS-Gel in den vorangegan-gen Versuchen wird für diese Untersuchung das Ergebnis der HisTrap FF crude dargestellt. Weitere Ergebnisse unter Einsatz der HisTrap excel finden sich unter Kapitel 9.1.6. Die Aufgabe von 510 ml Kulturüberstand resultiert beim Eluieren in einen über 3 Fraktionen tailenden peak mit einer Höhe von etwa 15 mAU (Abbildung 5-39).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Waste

550 560 570 580 590 600

0

5

10

15

20

25

Abs

orpt

ion

254

nm in

mA

U

Durchfluss in ml

0 200 400 6000

200400600800

254

nm

Durchfluss in ml

Abbildung 5-39: IMAC-Chromatogramm zum Säulenvergleich der HisTrap FF crude beim Einsatz des denaturie-

renden Puffersystems als UV-Signal über dem Durchfluss mit Darstellung der Fraktionie-rung.

Zur Qualifizierung des Chromatographielaufes werden Proben jeweils zu Beginn und Ende der Injek-tion sowie während der Waschschritte und aus dem Elutionspeak im anti-EPO ELISA verglichen.

79

Ergebnisse

Tabelle 5-11: EPO-Konzentration während der IMAC beim Einsatz der HisTrap FF crude und denaturieren-dem Puffersystem.

Konzentration in mIU∙ml-1

Beginn Injektion 627

Ende Injektion 3.174

Waschen 1 65

Waschen 2 2.023

Elution 9.911

Der Anstieg der EPO-Konzentration auf die etwa fünffache Menge an initial ausgetragenem Protein gegen Ende der Injektionsphase weist auf einen Durchbruch der Säule hin. Auch während des zwei-ten Waschschrittes ist der Verlust mit 2.023 mIU∙ml-1, verglichen mit der Ausbeute von 9.911 mIU∙ml-1 beim Eluieren, relativ hoch.

Die Elutionsfraktion wird zudem zur genaueren Charakterisierung im Western-blot untersucht (Kapi-tel 4.6.5). Im Vergleich zu den deutlichen Banden auf einer Höhe im Bereich von 35 und etwa 100 kDa, die im EPO-Standard bis zu einer Aufgabemenge von 5,9 ng zu erkennen sind, lässt die Auftragung der HisTrap FF Fraktion keine klare Bandenabgrenzung zu. Ein diffuses positives Signal kann hier im Bereich um etwa 28 kDa vermutet werden. Ein ein wenig schärferes Bild zeigt sich beim Chromato-graphielauf derselben Probe über die HisTrap excel (Abbildung 9-16). Hier lässt sich aus dem ebenfalls diffusen positiven Bereich eine Bande bei etwa 28 kDa abgrenzen.

Abbildung 5-40: Western-Blot nach IMAC mit Proben der denaturierten Läufe der Fr 15 HisTrap FF (1), Fr 9

(Abbildung 9-16) HisTrap excel (2), EPO-Standards mit 5,9 ng (3), 12 (4), 23 (5), 47 (6) und 94 ng (7) sowie SA (8).

5.4.2.6 Con A Aufreinigung Eine alternative oder ergänzende Aufreinigungsmethode zur IMAC bietet sich in Form der HiTrap Con A Säule an. Diese ermöglicht aufgrund der Beschaffenheit des Säulenmaterials (tetrameres Me-talloprotein) eine Diskriminierung zwischen per se glykolysiertem Protein und unglykolysiertem Pro-

80

Ergebnisse

tein. Diese Selektivität basiert auf der Bindung von α-D-Mannopyranose und α-D-Glucopyranose an die Säule und erlaubt es dadurch auch, die Säule als zweiten Aufreinigungsschritt des Zielproteins nach der IMAC einzusetzen. Abbildung 5-41 zeigt das Chromatogramm einer der HisTrap FF crude nachgeschalteten Con A Aufreinigung. Nach dem Binden der Proteine sinkt beim Waschen die UV-Absorption auf 0 ab, bevor sich beim Eluieren ein Anstieg auf ein Plateau ergibt.

1 2 3 4 5 6 7Waste

0 5 10 15 20 25 30-505

101520253035404550

Abs

orpt

ion

254

nm in

mA

U

Durchfluss in ml

Abbildung 5-41: Con A-Chromatogramm als UV-Signal über dem Durchfluss mit Darstellung der Fraktionierung

nach vorhergehender Aufreinigung über die HisTrap FF crude mit phosphat-gepuffertem System.

Das Resultat einer Auftragung der Elutionsfraktionen auf SDS-Page sind klare Banden des Moleku-largewichts von etwa 31, 42 und 47 kDa. Im Bereich höherer Massen zeichnen sich weitere, allerdings sehr schwache Banden ab. Die Durchführung eines Con A Laufes mit nachgeschalteter HisTrap FF Säule ergibt hingegen keinerlei Banden.

Abbildung 5-42: SDS-Gel der Con A Elutionsfraktionen: Silberfärbung der Auftragung von Fr 3 (1), eines SA (2)

sowie der Fraktionen 4 bis 6 (3 bis 5) der Con A Elution nach vorhergehender HisTrap FF sowie die Elutionsfraktionen der HisTrap FF (6 bis 9) mit vorangehender Con A Aufreinigung.

81

Fehlerbetrachtung

6 Fehlerbetrachtung Im Folgenden sollen Fehlerquellen identifiziert werden, welche direkten Einfluss auf die objektive Bewertung der Kultivierungssysteme nehmen können. Systematische Abweichungen wie Pipettierfeh-ler oder Messungenauigkeiten bei verwendeten kommerziellen Test-Kits werden an dieser Stelle nicht beziffert und können den Herstellerangaben entnommen werden. Prozessrelevante Fehler in der Etab-lierung der Proteinanalytik werden direkt in der Diskussion (Kapitel 7.1) abgehandelt, so dass sich die wichtigsten Fehlerursachen auf die Bestimmung der Zellkonzentration und –vitalität in den Kultivie-rungssystemen beschränken.

6.1 Trypanblau-Färbung in Suspensionszellen

Die Zellzählung Trypanblau-gefärbter Zellen im Hämocytometer erlaubt die gleichzeitige statistische Bestimmung der Zellkonzentration und –vitalität in einer Zellkultur. Um eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erreichen, wurde die Probenverdünnung so gewählt, dass in einem Großquadrat der Neubauer Zählkammer 50 bis 100, bei vier Großquadraten also mindestens 200 Zellen, gezählt wur-den. Die durchschnittliche Abweichung in den Suspensionskultivierungen betrug nach diesem Vor-gehen 15,7±1,7 %. Diese Varianz setzt sich aus subjektiven Fehlern des Operanden sowie aus Verdün-nungsfehlern zusammen. Letztere resultieren vor allem aus einer Aggregatbildung der Insektenzellen in serumfreien Medium. Untersuchungen zeigten, dass die Zellen bei Kultivierung in einer scherar-men Umgebung ohne Serum zur Bildung von Aggregaten einer Größe von bis zu 200 bis 300 Zellen neigen (Hensler et al. 1994). Diese Heterogenität innerhalb der Probe kann vor der Zellzählung nur unter hohem Vitalitätsverlust durch massives Resuspendieren und daher durch Verursachung eines weit höheren Fehlers ausgeglichen werden.

6.2 Trypanblau-Färbung in Kapselkulturen

Der Zellzählung der in den Kapseln immobilisierten Zellen geht ein Verdau der Kapselmembran durch Cellulase und eine anschließende Homogenisierung der Bruchstücke und Zellen voraus. Die aus den Bestimmungen resultierende Varianz liegt mit 21,9±3,6 % etwa 30 % höher als in Suspensi-onskultur. Der größere Fehlerbereich lässt sich zum einen durch Schwierigkeiten bei der Diskriminie-rung von Zellen und Membranbruchstücken (Abbildung 6-1) erklären, zum anderen bei der Auszäh-lung von geringen Zellkonzentrationen zu Beginn der Kultivierung mit etwa 5 bis 10 Zellen pro Groß-quadrat in der Zählkammer auf statistische Fehler zurückführen.

Abbildung 6-1: Trypanblau-Zählung von verkapselten Zellen nach Auflösen der Kapselmembran mit Cellulase

und anschließender Homogenisierung.

Ähnliche Einflüsse kommen bei Bestimmung der Zellvitalität durch den Trypanblau-Ausschluss zum Tragen. So kann davon ausgegangen werden, dass durch das Prozessieren der Kapseln vor der Zell-

82

Fehlerbetrachtung

zählung Zellen ruptiert werden und daraus eine falsch zu niedrige Vitalität resultiert. Erschwerend kommt hinzu, dass die Trypanblau-Färbung bei niedrigen Vitalitäten große Abweichungen in den falsch-positiven Bereich, also hin zu einer weiteren Verschlechterung zeigt (Mascotti et al. 2000).

6.3 Bestimmung der Zellkonzentration im Hohlfaserreaktor

Eine Zellentnahme aus dem HFR kann aufgrund der inhomogenen Verteilung im Reaktor nicht als repräsentativ betrachtet werden. Die Bestimmung der Zellkonzentration erfolgt daher indirekt über den Sauerstoffverbrauch innerhalb des Reaktors. Grundlegend für dieses Vorgehen ist die Annahme einer über den Kultivierungsverlauf konstanten zellbezogenen Sauerstoffaufnahmerate. Dies ist nur gewährleistet, wenn sich alle Zellen im gleichen metabolischen Zustand befinden und gleichzeitig keine Sauerstofflimitierungen auftreten. Aufgrund fehlender Alternativen muss der aus der Annahme resultierende Fehler akzeptiert werden; eine genaue Bezifferung ist jedoch nicht möglich.

Die Ermittlung der Sauerstoffkonzentration beruht auf einem optischen Messprinzip unter Verwen-dung von in Durchflussküvetten immobilisierten Spots mit sauerstoffsensitiven Fluoreszenzfarbstof-fen. Dabei wird die durch das Messsystem angeregte Fluoreszenz des Chromophors mit steigender Sauerstoffkonzentration gequencht. Ein der Anregungshäufigkeit geschuldetes Ausbleichen des Farb-stoffes führt zu einer Abnahme der Amplitude des Messsignals und damit der Sensitivität: Während einer Kultivierung von 30 Tagen und einer Samplingrate von 1 min-1 ist nach Herstellerangaben ein Drift von 0,03 % O2 zu erwarten. Zur Vermeidung einer übermäßigen Ungenauigkeit wurde vor je-dem Experiment eine Kalibrierung der Sonden durchgeführt und mit einer Samplingrate von 1 min-1 gearbeitet. Die allgemeine Fehlerabweichung der Messung ist aufgrund des Messprinzips abhängig von der Sauerstoffkonzentration und beträgt bei einem Wert von 21 % Luftanteil ±0,2 %, bei 0,2 % eine Abweichung von ±0,05 %.

Die Sauerstoffkonzentration ist grundsätzlich eine Funktion des Systemdrucks (und so auch der Pumprate) sowie der –temperatur. Zusätzlich dazu zeigt sich auch ein Einfluss der Temperatur auf die Messung selbst. Bereits geringe Störungen im System, wie das Öffnen des Inkubators, führten zu Ausreißern in den Sauerstoffmessungen und einem erneuten Einpendeln der Werte auf dem entspre-chenden Konzentrationsniveau (z.B. Abbildung 5-25). Im Medienreservoir sowie im Inkubator wurde die Temperatur auf 27°C eingestellt, je nach Außentemperatur kam es jedoch zu Schwankungen von ±0,3°C. Die beschriebenen Einflussfaktoren wirken sich auf die Sondensignale vor und nach dem Re-aktor gleichermaßen aus, so dass durch die Verwendung des Differenzsignales zur Bestimmung der Zellkonzentration der Großteil der Schwankungen eliminiert werden kann (Abbildung 6-2). Die Ein-stellung eines konstanten Niveaus nach einem Eingriff ins System, wie die Variation der Pumprate, ist somit überwiegend eine Funktion der Trägheit des Systems.

83

Fehlerbetrachtung

0 10 20 30 40 50 60 70 8097

98

99

100

101

102

103

Saue

rsto

ffsät

tigun

g in

% p

O2

Prozesszeit in min

20

30

40

50

60

70

80

Dur

chflu

ssra

te in

ml⋅m

in-1

Abbildung 6-2: Einfluss des Systemdrucks auf die Sauerstoffmessungen vor und nach dem Reaktor.

Die Messung wurde im zellfreien System bei Variation der Pumprate durchgeführt; die Kalibrierung erfolgte bei einer Durchflussrate von 50 ml∙min-1.

84

Diskussion

7 Diskussion

7.1 Proteinanalytik

Durch den Einsatz eines kommerziellen ELISA-Kits konnte die Produktion von EPO in Suspensions-zellen nachgewiesen werden (Kapitel 5.1.3.2). Ziel der weiterführenden Proteinreinigung und -analytik war es zudem, das Protein für weitere strukturelle Analysen wie MALDI-TOF nach einem tryptischen Verdau konzentriert und in möglichst reiner Form darzustellen. Eine zentrale Rolle in der gewählten Aufreinigungsstrategie kommt dabei dem an das rekombinante EPO angehängten His-Tag zu, der einen Capture-Schritt aus dem Kulturüberstand durch eine IMAC Affinitätschromato-graphie erlaubt (Wong et al. 1991). Diese Proteinreinigung und –konzentrierung sollte eine Zwischen- bzw. Feinaufreinigung über weitere chromatographische Schritte wie Ionentauscher und Größenaus-schluss (siehe Kapitel 2.4.1) vorbereiten. Ergänzend zur Qualifizierung der Reinigungsschritte mittels ELISA wurde dazu ein Westernblot-Protokoll (Kapitel 5.4.1) entwickelt.

7.1.1 Loses Nickelsepharosegel

Mit dem Ziel, ein robustes Aufreinigungsprotokoll für die spätere Anwendung in der MPLC zu Etab-lieren, wurden mit Einsatz des losen Nickelsepharosemediums die Schritte des Bindens des Proteins an das Medium sowie die Wasch- und Elutionsschritte untersucht (Kapitel 5.4.2.1). Eine Auswertung der Elutionsfraktionen im Westernblot (Abbildung 5-32) resultiert in positive Banden im Bereich von 25 kDa. Diese liegt nach den Berechnungen (Kapitel 0) im erwarteten Größenbereich zwischen dem unglykosylierten Protein mit 21 kDa und der vollständig human glykosylierten Form mit 37 kDa. Dementsprechend kann von einer teilweisen Glykolysierung des Proteins mit einer Masse der Zu-ckerstrukturen von etwa 4 kDa ausgegangen werden. Im zugehörigen SDS-Gel (Abbildung 5-31) konnten ausschließlich Proteinbanden bei etwa 37 kDa detektiert werden. Die Diskrepanz beruht ver-mutlich auf der niedrigen Konzentration des Zielproteins im Gel und der höheren Sensitivität des Westernblots. Weiterhin können Glykanstrukturen die Bindung der Silberionen an die Seitenketten des Proteins sterisch beeinflussen und so einen Sensitivitätsverlust der Silberfärbung bedingen (Møl-ler und Poulsen 2009). Grundsätzlich lässt die Eliminierung der vielfältig überlappenden Proteinban-den aus der Spur der ursprünglichen Probe im SDS-Gel jedoch auf eine Reinigung des Zielproteins schließen. Weitere Varationen des Aufreinigungsprotokolls mit Veränderungen des pH-Wertes, der Pufferzusammensetzung oder einem vorherigen Entsalzungsschritt blieben ohne positiven Effekt. So deutet im ELISA (Abbildung 9-15) ein geringeres Signal der entsalzte Probe auf den Verlust von Ziel-protein während der Prozessierung hin. Die Zugabe von Imidazol in die Probe vor dem Binden und damit der Aufbau eines Selektionsdruckes zur Vermeidung unspezifischer Bindungen (Johnson et al. 1996) resultiert ebenso in einer höheren Wiederfindung an Zielprotein beim Eluieren.

7.1.2 Evaluierung der IMAC-Affinitätschromatographie

Als automatisierter Capture-Schritt, aufbauend auf den Ergebnissen der Proteinreinigung mit Nickel-sepharose, wurde die Effizienz der IMAC-Affinitätschromatographie unter Einsatz verschiedener Säulen und Puffersysteme getestet. Die Bewertung der Ergebnisse wurde zunächst hinsichtlich der Bandenmuster im SDS-Gel durchgeführt (Abbildung 5-35 und Abbildung 5-37). Beim Vergleich der Säulen weisen die Banden der HisTrap FF crude die intensivste Färbung im Bereich der im Westernblot als positiv identifizierten 25 kDa Bande auf. Alle Säulen ergeben zudem multiple Banden, welche auf eine Verunreinigung des Zielproteins bei den entsprechenden Elutionsfraktionen hindeuten. Bezogen auf die Wahl des Puffersystems zeigt die Gegenüberstellung bei Einsatz des Phosphatpuffers deutlich prägnantere Banden im Zielbereich.

85

Diskussion

Die Untersuchung der chromatographisch prozessierten Proben (Abbildung 5-38) zeigt zudem, dass der Capture-Schritt des Proteins an die Säule sehr ineffizient ist. Je nach eingesetzter Säule ergibt sich ein Wert für die Aktivität von EPO im Durchfluss, welcher nahezu die der Elutionsfraktionen erreicht. Im Folgenden sollen daher die möglichen Gründe für den Verlust an Zielprotein während der IMAC näher erörtert werden.

Ein gewisser Verlust an Zielprotein während der Bindung ist verständlich, da sämtliche Proteine im Kulturüberstand einer gewissen Affinität zur positiven Ladung des Nickels um die Bindestellen am Säulenmaterial konkurrieren. Im Experiment mit losem Medium konnte durch eine längere Kontakt-zeit auch die Treffer- und somit die Bindewahrscheinlichkeit erhöht werden. Diese statische Bindung ist somit nur begrenzt mit der dynamischen Bindung beim Injizieren auf die Säule vergleichbar (Ar-vidsson et al. 2003).

Ein immanenter Faktor beim Binden des Zielproteins ist die Zugänglichkeit des angefügten Protein-Tags bezüglich der Faltung des Proteins. Ein sterisch beeinträchtigter und nicht direkt nach außen präsentierter His-Tag könnte so die schlechteren Bindeeigenschaften der Säule im Vergleich zum losen Medium erklären. Um die Einflüsse der Proteinfaltung näher zu untersuchen, wurde mit 8 M Harn-stoff denaturiertes Protein auf die Säule injiziert und der chromatographische Verlauf unter Verwen-dung eines anti-EPO ELISA aufgezeichnet (Kapitel 5.4.2.5). Die Daten aus Tabelle 5-11 zeigen, dass zu Beginn der denaturierten Injektion Protein mit einer Aktivität von 627 mIU∙ml-1 durch die Säule bricht, gegen Ende 3.174 mIU∙ml-1. Dies deutet im ersten Hinblick auf eine Überladung der Säule hin. Um überhaupt Zielprotein an die Säule binden zu können, müssen unbesetzte Nickelionen zur Verfügung stehen. Grundsätzlich stehen alle im Überstand vorliegenden Proteine mit dem getaggten Zielprotein um die Bindestellen in Konkurrenz. Allerdings sollte im Vorfeld durch Zugabe des Elutionsmittels Imidazol der Probe in geringen Mengen (20 mmol) eine unspezifische Bindung von Proteinen an die Nickelreste unterdrückt werden (Cheung et al. 2012). Angesichts der Bindekapazität der HisTrap crude FF von 50 mg Protein und einer Proteinausbeute von 9.911 mIU∙ml-1, umgerechnet 7,5∙10-5 mg EPO, erscheint eine Überladung sehr unwahrscheinlich. Dies gilt unter der Voraussetzung, dass das rekom-binante EPO aus den Proteinen im Kulturüberstand die höchste Affinität zur Säule aufweist und nicht durch andere Proteine verdrängt wird.

Nickel, der Bindepartner des Histidin-Tags, ist ebenfalls über eine Chelatbindung (Abbildung 7-1) an die Säulenmatrix gekoppelt (Wong et al. 1991). Demnach können die Nickelionen durch Substanzen wie EDTA – auch eingesetzt beim Regenieren der Säule (vgl Kapitel 4.6.8.2) – ausgetragen werden und die Fähigkeit der Proteinbindung geht verloren. Allerdings können auch manche serumfreie In-sektenmedien Substanzen wie Histidine, Triglyceride, Sterine oder Phospholipide enthalten, welche ebenfalls in der Lage sind, Nickel aus der Säule zu lösen (Kollewe und Vilcinskas 2013). Das in den Experimenten eingesetzte Kulturmedium Excell 420® unterliegt einer geheimen Komposition und wird vom Hersteller nicht preisgegeben. Angesichts des beobachteten Chromatographielaufes mit dem Durchbruch des Zielproteins und der geringen Ausbeute beim Eluieren kann davon ausgegan-gen werden, dass Bestandteile die Chelatbindung zum Nickel aufbrechen und die Säule ausbluten.

86

Diskussion

N

Matrix

CO

CO

ONi2+

H2O

OH2O

H2O

N

Matrix

CO

CO

ONi2+

H2O

O

NH

R

NH

NN

O

N

N

OR

His-Tag

Abbildung 7-1: Darstellung der Immobilisierung von Nickelionen an die Säulenmatrix sowie Bindung des His-Tags an das Nickelion.

7.1.3 Kopplung der IMAC mit weiteren chromatographischen Methoden

Nach der teilweisen Eliminierung von Fremdprotein durch die Affinitätschromatographie sollte das Zielprotein in einem weiteren chromatographischen Schritt einer Feinreinigung unterzogen werden (siehe Kapitel 2.4.1). Die zu diesem Zweck angedachte Anwendung einer Ionenaustauschchromato-graphie konnte nicht verwirklicht werden, da die Anforderungen bezüglich der Salzkonzentration bzw. Leitfähigkeit in den Elutionsfraktionen der IMAC nicht eingehalten werden konnten. Die obere Grenze liegt hier bei 5 mS∙cm-1 (Rosenberg 2005), je nach Einsatz des Puffersystems konnten in den Fraktionen der IMAC 8 (Tris gepuffert) bis 48 mS∙cm-1 im denaturierten Puffersystem mit der höchsten Proteinausbeute erreicht werden (Tabelle 7-1). Ein zusätzlicher Entsalzungsschritt vor der Ionenaus-tauschchromatographie kommt bei diesem Stand der Entwicklung nicht in Frage, da jede weitere Operation erneuten Verlust an Zielprotein bedeutet.

Tabelle 7-1: Leitfähigkeit verschiedener Puffersysteme bei Einsatz in der IMAC Affinitätschromatographie.

Puffersystem Leitfähigkeit in mS∙cm-1

Phosphat 30-44

Tris 8

denaturiert 48

Als Alternative zur Ionenaustauschchromatographie wurde eine chromatographische Reinigung über Concanavalin A (Con A) gewählt. Die Lektinsäule ist in der Lage, Kohlenhydrate zu binden und kann so zwischen glykosylierten und unglykosylierten Proteinen diskriminieren. Ein Vergleich der SDS-Gele der Aufreinigungsschritte (Abbildung 7-2) zeigt ein durchgängiges Bandenmuster oberhalb einer Molekülgröße von etwa 25 kDa nach der IMAC, mit den intensivsten Banden im Bereich zwischen 35 und 75 kDa. Die zusätzliche Fraktionierung über Con A resultiert in der weitestgehenden Eliminierung der höhermolekularen Banden über etwa 50 kDa, die intensiven Banden bei etwa 37 und 42 kDa blei-ben bestehen. Weiterhin tritt eine vor dem Schritt nur leicht sichtbare Bande bei 27 kDa deutlicher hervor. Die detektierten Banden liegen, insbesondere die 27 kDa Bande, im erwarteten Größenbereich. Ein ebenfalls nach der Con A- Aufreinigung durchgeführter Westernblot konnte keine positiven Ban-

87

Diskussion

den detektieren. Es könnte daher sein, dass auf Höhe der 27 kDa eine Überlappung mehrer Proteine, unter anderem möglicherweise EPO in geringer Konzentration, vorliegt.

Abbildung 7-2: SDS-Page einer chromatographischen Proteinreinigung über IMAC (links) mit 3 Elutionsfrakti-

onen und einem Größenstandard (2) sowie nachfolgende Elutionsfraktionen der Lektinaufrei-nigung (rechts) mit Größenstandard (2).

7.1.4 Bewertung der Ergebnisse

Die Aufreinigungserfolge mit losem Nickel-Sepharosemedium konnten in der Affinitätschromatogra-phie nicht bestätigt werden. Während der Injektion bricht das Zielprotein durch die Säule, eine Kon-zentrierung des Proteins kann unter Verwendung physiologischer Puffersysteme nicht, unter denatu-rierten Bedingungen nur rudimentär, erreicht werden. Die höhere Wiederfindungsrate beim Einsatz eines denaturierenden Puffersystems spricht dafür, dass der His-Tag des Zielproteins sterisch nicht gut genug für die Bindung an das Nickelion zugänglich ist. Alternativ dazu könnte es sein, dass EPO durch ein Protein höherer Affinität von der Säule verdrängt wird. Dafür spricht, dass bereits zu Be-ginn der Injektion EPO im Durchfluss detektiert werden kann. Auch die multiplen Banden in den SDS-Gelen im höheren Größenbereich stützen diese These. Ein Hauptgrund für die unbefriedigende Proteinaufreinigung liegt wahrscheinlich in einem leeching der Nickelionen durch Bestandteile des Kulturmediums aus der Affinitätssäule. Somit steht dem His-Tag des EPO kein Bindepartner mehr zur Verfügung, das Protein passiert die Säule. Auch eine alternative Chromatographiesäule, die speziell zur Verwendung bei Insektenmedien empfohlen wird (HisTrap excel, Kapitel 5.4.2.2), konnte hier keine größeren Erfolge vorweisen. Weiterhin konnte im SDS-Gel gezeigt werden, dass unter den Versuchs-bedingungen die Fraktionen der Affinitätschromatographie nicht nur das Zielprotein, sondern auch diverse Proteine höherer Molekülmasse enthalten (z.B. Abbildung 7-2). Die Notwendigkeit weiterer Proteinreinigungsschritte wird zudem durch einen Vergleich von 2-dimensional prozessierten SDS-Gelen (Protokoll 4.6.4) von nicht infizierten sowie infizierten Kulturen deutlich (Abbildung 7-3). Nach Fraktionierung durch die IMAC zeigen sich im erwarteten Größenbereich zwischen etwa 20 und 40 kDa in beiden Gelen mehrere Proteinspots. Teilweise können diverse Spots gleichen Molekularge-wichtes mit unterschiedlichem isoelektrischen Punkt detektiert werden. Ein Nachweis des EPO durch einen Westernblot konnte auch hier nicht erfolgreich durchgeführt werden. Die Berücksichtigung dieser Erkenntnisse zeigt, dass ein SDS-Gel allein nicht als Nachweis für die Produktion des Zielpro-teins dienen kann, da die im 2d-Gel getrennten Proteine gleichen Molekulargewichts sich im eindi-mensionalen Gel als eine überlagerte Bande manifestieren.

88

Diskussion

Abbildung 7-3: Vergleich der Protein-Spots im 2d-Gel von Kulturüberstand aus einer nicht infizierten (oben)

sowie einer infizierten Kultur (unten) unter Markierung des Größenbereichs des Zielproteins.

7.2 Sauerstoffaufnahmerate der Insektenzellen

Tierische- und insbesondere Insektenzellen stellen mit ihrem hohen Sauerstoffbedarf und gleichzeiti-ger Sensitivität gegenüber Scherkräften hohe Anforderungen an das Kultivierungssystem (vgl. Kapitel 2.5). Die Kenntnis der Sauerstoffaufnahmerate einer Zelllinie ist daher ein wichtiges tool zur Simulie-rung und korrekten Auslegung eines Kulturreaktors. Weiterhin ergibt sich die Möglichkeit, über eine kontinuierliche Sauerstoffmessung nicht invasiv über den Sauerstoffverbrauch auf die Zellkonzentra-tion zurückzurechnen. Hierbei gelten die Auswirkungen der Wachstumsphase, der Kultivierungsbe-dingungen sowie der Zusammensetzung des Kulturmediums auf die Sauerstoffaufnahmerate zu be-achten (Drugmand et al. 2012; Wagner et al. 2011). Die Auftragung des Sauerstoffverlaufes (Abbildung 5-2) aus den Experimenten mit Sf 21 (Kapitel 5.1.1.2) zeigt, abgesehen von Ausreißern zu Beginn der Messung, bei allen eingesetzten Zelldichten eine lineare Abnahme des Sauerstoffpartialdruckes über die Prozesszeit. Lediglich bei der höchsten eingesetzten Zelldichte von 1,5∙106 Z∙ml-1 ist ab etwa einer Sauerstoffsättigung von 5 bis 10 % mit einem Abflachen der Steigung ein Hinweis auf eine Unterver-sorgung der Zellen und eine Umstellung des Stoffwechsels zu erkennen. Die Auswertung stützt sich ausschließlich auf den linearen Teil der Messung, Literaturdaten von Messungen mit Sf 21 sowie dem Subklon Sf 9 zum Vergleich zu eigenen Werten sind in Tabelle 7-2 zusammengefasst.

89

Diskussion

Tabelle 7-2: Vergleich der Sauerstoffaufnahmeraten von Insektenzelllinien. Literaturangaben mit eigenen Messwerten unter Angabe der Zelllinie, der Wachstumsphase (exponentiell, exp; stationär, stat.), des Kultivierungssystems, des Mediums, des FCS-Anteils sowie des Infektionsstatus der Zellen. Der Index a kennzeichnet Werte, welche über die dynamische Ausgasungsmethode während der Kultivierung bestimmt wurden.

Zellline q̇ ∙10-12 mmol∙Z-1∙min-1

Phase System Infiziert Medium FCS %

Sf 21 2,33(1)a exp. Perfusion nein IPL-41 5

Sf 9 2,58(2) exp. Messkammer nein IPL-41 10

Sf 9 3,66(3)a - STR ja IPL-41 10

Sf 9 6,50(3)a - STR Ja ICSF-WB 0

Sf 9 1,20-3,00(4)a exp. STR nein Sf-900 II 0

Sf 9 1,50-2,70(4)a - STR ja Sf-900 II 0

Sf 9 5,50(5)a exp. STR nein Excell 401 0

Sf 9 10,0(5)a - STR ja Excell 401 0

Sf 9 3,13-3,35(1)a exp. Airlift nein IPL-41 10

Sf 9 1,33(1)a stat. Airlift nein IPL-41 10

Sf 21 10,5(6) exp. Messkammer nein Excell 420 0

Quellenangaben: (1) (Deutschmann und Jäger 1994) (2) (Maiorella et al. 1988) (3) (Reuveny et al. 1992) (4) (Rhiel et al. 1997) (5) (Hensler und Agathos 1994) (6) Eigene Messwerte

Beim Vergleich der Angaben für die Sauerstoffaufnahmerate von Sf 21 respektive Sf 9 Zellen zeigt sich, dass sich die Werte innerhalb eines Bereiches von etwa 1∙10-12 bis 10∙10-12 mmol∙Z-1∙min-1 bewegen. Die Schwankungen ergeben sich durch unterschiedliche Medienzusammensetzungen, welche den metabolischen Zustand der Zellen und somit die Atmungsaktivität determinieren; einen deutlichen Einfluss übt zudem auch der Anteil von FCS im Medium aus.

Dass der eigene Messwert an der oberen Grenze der Datensammlung angesiedelt ist, kann durch die verwendeten Messsysteme erklärt werden. Der überwiegende Teil der gezeigten Literaturdaten be-zieht sich auf eine dynamische Sauerstoffmessung innerhalb eines Kulturreaktors (STR oder Airlift). Das Prinzip der dynamischen Messung nutzt ein Gleichgewicht zwischen der Sauerstofftransferrate (Oxygen Transfer Rate, OTR) und der –aufnahmerate (Oxygen Uptake Rate, OUR) im stationären Fall während einer Messung:

90

Diskussion

OTR=OUR=kl,a∙∆cO2=kl,a∙�cO2* -cO2

0 �=q̇O2 ∙X Formel 7-1

OTR Oxygen Transfer Rate mol∙l-1∙min-1

OUR Oxygen Uptake Rate mol∙l-1∙min-1

kl,a Stoffübergangskoeffizient min-1

cO2* Konzentration O2 in Zuluft mol∙l-1

cO20 Konzentration O2 im Medium zu Beginn der Messung mol∙l-1

q̇O2 zellspezifische Sauerstoffaufnahmerate mmol∙Z-1∙min-1

X Zellzahl Z∙ml-1

Im statischen Betrieb der Kultivierung stellt sich ein Gleichgewicht zwischen der Sauerstoffkonzentra-tion in der Zuluft cO2

* und im Kulturmedium cO20 ein. Dieses Verhältnis wird für den Zeitraum der

Messung als konstant angenommen. Die Messung startet mit dem Stoppen des Gaseintrages, die Zel-len verbrauchen den im System gelösten Sauerstoff. Mit abnehmendem Signal kann so die OUR be-stimmt und nach Formel 7-1 bei bekanntem kl,a des Reaktors die zellspezifische Sauerstoffaufnahme-rate berechnet werden. Die Verwendung eines Kulturreaktors zur Ermittlung von q̇O2

ist deshalb

nachteilig, da sich trotz Begasungsstops noch Sauerstoff im Kopfraum des Reaktors befinden kann. Dieser kann sich über die Oberfläche in das Fluid lösen, die OTR ist in diesem Fall nicht entkoppelt. Die Berechnung der Sauerstoffaufnahmerate würde hier einen falsch zu niedrigen Wert ergeben. Im Vergleich dazu ist die eigene Messkammer mit Beginn der Messung luftdicht verschlossen und alles Gas aus der Kammer verdrängt (Abbildung 4-5, (8) Verdrängungskörper).

Der Einfluss einer Baculovirusinfektion auf die Sauerstoffaufnahme der Zellen wird in der Literatur kontrovers beschrieben. Rhiel et al. (1997) infizierten Sf 9 Zellen in einem Rührkesselreaktor und konn-ten 24 h p.i. keine Änderung im Sauerstoffbedarf sowie in der Zellkonzentration feststellen. Am nächs-ten Messpunkt, 48 h p.i., setzte die Absterbephase mit einhergehender Abnahme des Sauerstoffbedarfs ein. Dies lässt darauf schließen, dass nicht der gewünschte MOI von 0,2, sondern das Virus in deutlich höherer Konzentration eingesetzt wurde (Rhiel et al. 1997). Im Gegensatz dazu konnten Hensler und Agathos (1994) in einer Spinnerflask mit einer genaueren zeitlichen Messauflösung nachweisen, dass in den ersten 24 h p.i. (MOI 10) die Sauerstoffaufnahmerate etwa um den Faktor 2 ansteigt. Dieser peak endet bereits 24 h vor dem Absterben der Zellen, so dass mit eintretender Absterbephase in etwa wie-der der Ausgangswert erreicht ist (Hensler und Agathos 1994). Dieses Ergebnis steht auch im Ein-klang mit der Kontrolle des Virus über die Zelle und die so erzwungene Überexpression an Polyhedrin respektive rekombinantem Protein (vgl. Kapitel 2.2). In der vorliegenden Arbeit wurde ausschließlich die Sauerstoffaufnahmerate von nicht infizierten Zellen eingesetzt, um die Zellkonzentration im Hohlfasermodul abzuschätzen. Da zu Beginn der Kul-tivierung lediglich 1 % infizierte Zellen in den HFR inokuliert wurden, verläuft die Infektion hier im Vergleich zum Einsatz eines MOI von 10 eher schleichend. Zudem kann aufgrund der inhomogenen Probenahme nicht zweifelsfrei der Anteil an infizierten Zellen bestimmt werden, so dass der Anteil an verbrauchtem Sauerstoff nicht anteilig auf unterschiedliche Aufnahmeraten gesplittet werden kann.

91

Diskussion

7.3 Kultivierungssysteme mit nicht infizierten Zellen

Die Effektivität des Baculovirusexpressionssystems hängt in vielerlei Hinsicht vom Kultivierungssys-tem und den –bedingungen ab. Um das volle Potential ausschöpfen zu können, gilt es, unter anderem die Schersensitivität und den Sauerstoffbedarf der Zellen zu berücksichtigen. Die Produktausbeute kann maximiert werden, wenn es gelingt, mit möglichst hoher Zelldichte unter Vermeidung des „cell density effects“ zu kultivieren (Kapitel 2.5).

Um die eigenen Ergebnisse korrekt in einen Bezug mit Literaturdaten bestehender Kultivierungssys-teme stellen zu können, werden zunächst die Wachstumseigenschaften nicht infizierter Insektenzellen in den unterschiedlichen Kultivierungsansätzen betrachtet.

7.3.1.1 Wachstumscharakteristik von Suspensionszellen In seinem umfangreichen Review zur Wachstumskinetik von Insektenzellen konstatierte Schmid eine Abhängigkeit der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit µmax sowie der maximal erreichbaren Zell-dichte pcd der Insektenzellen von der Medienkomposition, von dem Anteil an FCS oder vergleichba-ren Supplementen sowie von der Sauerstoffsättigung. Wie gezeigt, wirken sich Sauerstoffwerte unter 20 % sowie über 100 % Luftsauerstoff negativ auf die Wachstumsrate und die Zelldichte im System aus (Schmid 1996). In Tabelle 7-3 ist ein Vergleich der Wachstumscharakteristika von Sf 9 respektive Sf 21 zwischen eigenen und Literaturdaten dargestellt. In der Übersicht variieren die Wachstumsraten von 0,39 bis 0,99 d-1, die pcd liegt in einem Bereich von 2,8 bis 14∙106 Z∙ml-1.

Tabelle 7-3: Vergleich der Wachstumscharakteristik von Insektenzellen in verschiedenen Kultursystemen und –modi unter Angabe der Medienkomposition, des FCS-Anteils und der Sauerstoffsättigung bezogen auf den Luftsauerstoffanteil.

Zellline System Modus Medium FCS %

µmax in d-1

pcd ∙106 Z∙ml-1

O2-Wert

%

Sf 9 Shaker fed-batch Excell 401 0 0,52(1) 13 k.a.

Sf 9 rwr fed-batch Excell 401 0 0,39(1) 14 >100

Sf 9 wave reactor fed-batch SF900 II 0 0,67(2) 9,2 k.a.

Sf 21 Spinner batch TC100 5 0,99(3) 2,8 k.a.

Sf 21 Spinner batch TNM-FH 0 0,87(3) 3,8 k.a.

Sf 21 STR batch IPL-41 5 0,86(3) 6,6 k.a.

Sf 21 Shaker batch Excell 420 0 0,82(4) 4,3 k.a.

Sf 21 Shaker r. batch Excell 420 0 0,82(4) 11 k.a.

Sf 21 STR batch Excell 400 0 0,65-0,79(5) 5,0 40

Sf 21 Airlift batch SF-900 SFM 0 0,69(5) 8,0 10-20

Sf 21 Airlift batch Excell 400 0 0,83(5) 2,9 10-20

Quellenangaben: (1) (Cowger et al. 1997) (2) (Weber et al. 2002) (3) (Deutschmann und Jäger 1994) (4) Eigene Daten (repeated batch, r. batch) (5) (Schmid 1996)

92

Diskussion

Die Wachstumsraten der batch-Experimente (0,69-0,99 d-1, eigene 0,82 d-1) scheinen im Vergleich vor allem vom Kultivierungssystem und dem Kulturmedium abzuhängen. Der Einfluss des Mediums und der Medienergiebigkeit wird zudem in den maximalen Zellkonzentrationen deutlich. Hier fällt bei Betrachtung auf, dass die Zelldichten im batch (2,9 bis 8,0∙106 Z∙ml-1) deutlich hinter denen der fed- oder repeated-batch (9,2-14∙106 Z∙ml-1) Kultivierungen zurückbleiben. Damit ist eine Sauerstofflimitierung für diese Kultivierungssysteme ausgeschlossen und es kann von einer Substratlimitierung ausgegangen werden. In den eigenen Experimenten zur Wachstumscharakterisierung der Sf 21 (Abbildung 5-1) ist der Verlauf der Glukosekonzentration als wichtigste Energiequelle der Insektenzellen (Contreras-Gómez et al. 2014) dargestellt. Mit Erreichen der stationären Wachstumsphase liegt die Konzentration des Zuckers noch bei etwa 3 g∙l-1 und kommt daher ebenfalls nicht als limitierender Faktor in Frage. Allerdings kann unter der Annahme einer Nährstofflimitierung als Grund für das Ende der exponen-tiellen Wachstumsphase die Zeit bis zur Erschöpfung des Mediums als Funktion von Zellkonzentrati-on und Kultivierungsdauer mathematisch beschrieben werden:

Da die Wachstumskinetik einer exponentiellen Funktion folgt, gilt die allgemeine Gleichung:

X(t)=X0∙eµ∙t

Formel 7-2

X(t) Zellkonzentration zum Zeitpunkt t Z∙ml-1

X0 Zellkonzentration zum Startzeitpunkt Z∙ml-1

µ Wachstumsrate h-1 bzw. d-1

t Zeit h bzw. d

Durch Integration über die Zeit zwischen Kultivierungsbeginn und Ende der exponentiellen Phase berechnet sich die Fläche unter der Wachstumskurve (A), die dem Nährstoffvolumen entspricht:

� X0∙eµ∙t dt

texp

t=0

=X0 (eµ∙texp-1)

µ=A

Formel 7-3

A Flächenintegral unter der Wachstumskurve Z∙h∙ml-1

texp Dauer der exponentiellen Wachstumsphase h

Mit den bekannten Parametern aus Abbildung 5-1 (texp=69,2 h, X0=4,12∙105 Z∙ml-1 und µ=0,034 h-1) folgt eine Erschöpfung des Excell 420® Mediums bei einer durchschnittlichen (theoretischen) Zelldichte von 1,15∙108 Z∙h∙ml-1 nach einer Stunde.

Durch Umstellung von Formel 7-3 erhält man die mögliche Kultivierungsperiode t für beliebige Start-zellzahlen bis zum Erreichen der stationären Phase im batch für die spezifische Medienkomposition:

t=ln �A∙µX0

+1�

µ

Formel 7-4

Neben Glukose können noch weitere limitierende Medienbestandteile wie Glutamin als zweitwich-tigste Energiequelle oder weitere essentielle Aminosäuren wie Methionin oder Tyrosin in Betracht

93

Diskussion

gezogen werden (Hu und Bentley 2000; Mendonça 1999). Glutamin wird in Lepidopteran Zellen -Ketoglutarat in den

Zitronensäurezyklus eingebracht. Die Aminosäure ist instabil und zerfällt im Medium mit einer Halbwertszeit von 3 Wochen bei 4°C respektive 2 Wochen bei 25°C (Freshney 2005). Durch Nutzung der von Drugmand (2012) bestimmten -14 -1 h-1) lässt sich unter Berücksichtigung der Zerfallsreaktion (Formel 7-5), des Zellwachstums und des resultierenden Ver-brauchs durch die Zellen die Glutaminkonzentration während einer Kultivierung von Sf 21 im Excell 420® Medium (enthält 6,8 -1 Glutamin) näherungsweise iterativ berechnen (Drugmand 2012).

N(t) = N 2

Formel 7-5

N(t) Stoffmenge zum Zeitpunkt t

N0 Stoffmenge zum Startzeitpunkt

Zerfallsrate (Halbwertszeit-1) h-1 bzw. d-1

t Zeit h bzw. d

Nach Abzug des zerfallenen Glutamins während einer durchschnittlichen zweiwöchigen Lagerung im Kühlschrank und einem viertätigen Steriltest nach der Filtration ergibt sich eine Restkonzentration 3,51 -1 im Kulturmedium. Der nach den Vorgaben für die exponentielle Phase der batch-Kultivierung (Abbildung 5-1) berechnete Verbrauch an Glutamin findet sich in Abbildung 7-4 darge-stellt. Es zeigt sich, dass gegen Ende der exponentiellen Phase nach etwa 70 Stunden die Aminosäure nahezu aufgebraucht ist.

0 1 2 3

106

Zellz

ahl i

n -1

Zeit in d

0,0

5,0x10-2

1,0x10-1

1,5x10-1

Glu

tam

inko

nzen

trat

ion

in

Abbildung 7-4: Darstellung der berechneten Glutaminkonzentration in einer batch-Kultivierung von Sf 21 mit

der gemessenen Zellzahl , den zur Berechnung intrapolierten Zellkonzentrationen sowie der berechneten Glutaminkonzentration im Kulturmedium .

Die Berechnung zeigt, dass ein Mangel an Glutamin der Auslöser für das Einleiten der stationären Wachstumsphase bzw. der Absterbephase in Abbildung 5-1 sein könnte. Im Umkehrschluss kann bei

94

Diskussion

bekanntem Verlauf des limitierenden Stoffes die feed-Strategie angepasst werden (fed- oder repeated batch), um eine Nährstofflimitierung zu vermeiden und höhere Zelldichten zu erreichen.

Wird beim fed- oder repeated batch die Medienausnutzung beachtet, so ist die maximale Zelldichte durch die Sauerstofflimitierung gegeben. Cowger et al. erreichten durch Erhöhung des Sauerstoffpar-tialdruckes die, im Literaturvergleich (Tabelle 7-3), höchste Zelldichte von 14∙106 Z∙ml-1 im rotating wall reactor (Cowger et al. 1997). Die auffällig niedrige Wachstumsrate entspricht hierbei den Ergebnissen aus dem Review von Schmid (siehe oben) und kann als Folge der hohen Sauerstoffkonzentration inter-pretiert werden. Im eigenen Experiment zur Bestimmung der pcd (repeated batch) konnte die Wachs-tumsrate über eine Kultivierungsdauer von etwa 2,5 d auf dem Niveau der batch-Kultur gehalten wer-den (Abbildung 5-1). Im Anschluss nimmt die Wachstumsgeschwindigkeit jedoch bis zum Erreichen der maximalen Zelldichte nach 4 d deutlich ab. Dieses Phänomen der abnehmenden Teilungsrate bei höherer Zelldichte zeigt sich auch bei den aufgeführten Literaturdaten und kann durch die metaboli-sche Umstellung der Zellen bei hoher Zelldichte (Kapitel 2.5.5) oder durch eine einsetzende Sauerstof-flimitierung erklärt werden.

7.3.1.2 Wachstumscharakteristik von Insektenzellen im immobilisierten System Die Immobilisierung von Zellen eröffnet die Möglichkeit der scherarmen Kultivierung mit intensive-rem Sauerstoffeintrag ins Reaktorsystem. Zudem wird durch den Rückhalt der Zellen ein Wechsel des Kulturmediums erleichtert (Kapitel 2.5.5). Wie sich im Hinblick auf die pcd (Tabelle 7-4) zeigt, können daraus resultierend Zellen in höheren Zelldichten kultiviert werden. Im Vergleich zur Suspensions-kultur (Tabelle 7-3) kann die Zellkonzentration bis um den Faktor 10 gesteigert werden. Dem Gegen-über steht mit 0,17-0,55 d-1 eine deutlich geringere Wachstumsrate im immobilisierten System (Sus-pension bis 0,99 d-1), was sich in zwei- bis dreifach erhöhten Verdopplungzeiten widerspiegelt.

Tabelle 7-4: Vergleich der Wachstumscharakteristik immobilisierter Insektenzellen in verschiedenen Kul-tursystemen und –modi unter Angabe der Medienkomposition und des FCS-Anteils.

Zellline System Modus Medium FCS in %

µmax in d-1

pcd ∙106 Z∙ml-1

Sf 21 Shaker, verkapselt r. batch TC100 0 0,55(1) 80,0

Sf 21 Shaker, verkapselt r. batch SF900 II 0 0,2(2) 100,0

Sf 21 STR, perfusion konti IPL-41 0 0,25-0,52(3) 55,0

Sf 21 Shaker, verkapselt r. batch SF900 II 5 0,17-0,31(4) 96-143

Sf 21 Shaker, verkapselt r. batch Excell 420 0 0,22-0,39(5) 30-50

Sf 21 HFR, perfusion konti Excell 420 0 0,25(5) 10,0

Quellenangaben: (1) (Wu und Goosen 1996) (2) (Son et al. 2006) (3) (Deutschmann und Jäger 1994) (4) (Lindenberger 2010) (5) Eigene Daten

Die aufgeführten Hochzelldichtekultivierungen können allgemein in die Modi repeated batch (verkap-selt) und kontinuierliche Perfusion unterschieden werden. Im kontinuierlichen Betrieb wird das Me-dium beständig erneuert, so dass keine Nährstofflimitierungen auftreten können.

In den Kapselkulturen wird das Medium regelmäßig etwa alle zwei Tage getauscht (Lindenberger 2010; Wu und Goosen 1996; Son et al. 2006). Unter Nutzung von Formel 7-4 ergibt sich, dass das eigens genutzte Kulturmedium in der exponentiellen Wachstumsphase der Kultivierung (Abbildung 5-10,

95

Diskussion

links) etwa für 8 Tage ausreichend ist. Bei maximaler Bewachsung der Kapseln während der stationä-ren Phase lässt sich eine Medienergiebigkeit von gut 24 Stunden ermitteln. Dies steht im Einklang mit den aus Abbildung 5-10 gefolgerten Zyklen des Mediumwechsels. Hier wird bei einer Verlängerung des Zyklus von 2 auf 3 Tage ein signifikanter Abfall in der Vitalität beobachtet.

Die Zelldichte respektive die Wachstumsrate im perfundierten System wurden von Deutschmann und Jäger (1994) durch Zellzählung ermittelt. Das Reaktorkonzept besteht hier aus einem Rührkesselreak-tor, der perfundiert über Membranschläuche sowohl mit Medium versorgt als auch blasenfrei begast wird (Deutschmann und Jäger 1994). Im eigenen Aufbau erfolgt die Medien- und Sauerstoffversor-gung des HFR diffusiv aus dem mit Sauerstoff gesättigten Vorlagebehälter. Die Zellkonzentration im HFR kann aufgrund einer fehlenden repräsentativen Probennahme nicht durch Zellzählung ermittelt werden, sondern wird indirekt aus dem Sauerstoffverbrauch im Reaktor berechnet. Als Vorausset-zung dafür wird eine homogene Sauerstoffverteilung über den Reaktor und eine konstante Sauer-stoffaufnahmerate der gesamten Zellpopulation, entsprechend der Suspensionszellen in der exponen-tiellen Wachstumsphase (Abbildung 5-2), angenommen. Hierbei handelt es sich dementsprechend um eine „worst case“ Abschätzung, da davon ausgegangen werden kann, dass mit Nährstoffen bzw. mit Sauerstoff unterversorgte Zellen eine geringere Aufnahmerate aufweisen. Die im Vergleich zu Deutschmann niedrigere pcd kann dementsprechend durch die Unterschiede im Kultivierungssystem oder durch eine fehlerhafte Bestimmung der Zellkonzentration im HFR begründet sein. Alternative Messmethoden wie eine online bestimmte metabolisch katalysierte Farbreaktion (XTT, WST oder Resazurin bzw. Alamar blue) wurden im Verlauf der Arbeit in Betracht gezogen, jedoch aufgrund von systemischen Problemen, wie der Absorption des Farbstoffes an die Hohlfaser, verworfen.

7.4 Kultivierungssysteme mit infizierten Zellen

Nach erfolgreicher Infektion durch das Baculovirus sind die Insektenzellen im Zellzyklus arretiert, die zelleigene Proteinexpression und somit Reparaturmechanismen unterdrückt. Zugleich wird die Zell-membran von budding viruses perforiert und die Zelle schwillt um etwa 20 % im Durchmesser an, die Schersensitivität der Zellen wird demnach erhöht. Resultierend daraus wird in Insektenzellkulturen, je nach eingesetzter Viruslast, ein Absterben ab etwa 72 Stunden p.i. beobachtet. Dieser Effekt limitiert die Kultivierungsdauer und damit verbunden die Raum-Zeit-Ausbeute erheblich, da beim Absterben der Zellen frei werdende Proteasen das Zielprotein schädigen und die Kultivierung abgebrochen werden muss (Drugmand et al. 2012).

Der Schutz der infizierten Zellen durch Immobilisierung und damit die Kultivierung bei Hochzell-dichte über einen längeren Zeitraum könnte die Raum-Zeit-Ausbeute erheblich verbessern. Zur besse-ren Abschätzung der eigenen Daten werden zunächst verschiedene Kultivierungssysteme anhand der eingesetzten Startzellzahlen (TOI), des MOI, des Infektionsgrads der Kultur sowie der Kultivierungs-dauer und pcd verglichen (Tabelle 7-5).

96

Diskussion

Tabelle 7-5: Vergleich der Wachstumscharakteristika infizierter Zellen in verschiedenen Kultivierungssys-temen und –modi unter Angabe des MOI, TOI, Kulturmediums, der maximalen Infektionsrate, der Kultivierungsdauer tK sowie der pcd.

Zellline System Medium MOI TOI

∙106 Z∙ml-1

Infektionsrate tK

in d

pcd

∙106 Z∙ml-1 in %

Suspension, batch

Sf 21 shaker SF900 II 1 1,0 k.a. 4(1) 1,0

Sf 9 wave SF900 II 0,5 1,5 75 5(2) 1,8

Sf 21 shaker Excell 420 0,1 0,75 72 4(3) 2,6

Sf 21 shaker Excell 420 1 0,75 84 4(3) 1,4

Sf 21 shaker Excell 420 10 0,75 92 3(3) 1,0

Tn5 spinner Excell 401 0,1 0,4 86 4(4) 1,5

Tn5 spinner Excell 401 1 0,4 100 3(4) 0,9

Immobilisiert, Perfusion

Tn5 Reaktor Excell 401 5 2,0 k.a. 3(4) 2,5

Tn5 Reaktor Excell 401 5 3,0 k.a. 5(4) 4,0

Sf 21 HFR Excell 420 0,01‡H 0,5 72 10(3) 9,0

Immobilisiert, repeated batch

Sf 21 shaker Excell 420 0,01‡K 0,5 <30 85(3) 20,0

Sf 21 shaker Excell 420 0,03‡K 0,5 <30 70(3) 20,0

Sf 21 shaker SF900 II 1† 90 k.a 38(1) 80,0

Sf 21 Reaktor╬ SF900II k.a. † 20 ca. 50 30(5) 100,0

Quellenangaben: ‡ vor Verkapselung/Inokulierung infiziert (1) (Son et al. 2006) † nach Verkapselung infiziert (2) (Weber et al. 2002) ╬ kontinuierlicher Betrieb im Reaktor (3) Eigene Daten (4) (Chico und Jäger 2000) (5) (Lindenberger 2010)

7.4.1 Infizierte Suspensionskulturen

Bei Betrachtung der Versuchs- und Literaturdaten der Suspensionskulturen fällt der Einfluss des MOI auf die Kultivierungsdauer sowie die pcd deutlich ins Gewicht. Je nach Kultivierungssystem zeigt sich bei Wahl eines MOI größer als 1 eine kürzere Zeit bis zum Abbruch der Kultur, die pcd nimmt ab. Die höchste maximale Infektionsrate wird beim Einsatz hoher MOIs initial, oder, wie in den Experimenten von Chico und Jäger mit Tn 5-Zellen bei Einsatz eines niedrigen MOI über die Sekundärinfektion er-reicht. Eine Erstinfektion von Zellen folgt statistisch einer Poissonverteilung (O'Reilly et al. 1994):

97

Diskussion

P(NV)=MOINV∙e-MOI

NV!

Formel 7-6

P Wahrscheinlichkeit, dass keine Infektion stattfindet %

NV Anzahl der infektiösen Viren, die eine Zelle treffen -

MOI Multiplicity of Infektion -

In der Gleichung der Poissonverteilung repräsentiert NV die Anzahl der Viren, die eine Zelle treffen und infizieren. Bei einem MOI von 1 ergibt sich eine Wahrscheinlichkeit P(0) von 36,79 %, dass eine Zelle nicht infiziert wird, bzw. 1-P(0)= 63,21 % für eine Infektion. Die Infektionswahrscheinlichkeit einer Zelle durch mindestens ein Viruspartikel findet sich in Abhängigkeit vom MOI in Abbildung 7-5 aufgetragen.

0 2 4 6 8 100

102030405060708090

100

Ant

eil i

nfiz

iert

er Z

elle

n in

%

MOI Abbildung 7-5: Poissonverteilung; Wahrscheinlichkeit der Erstinfektion einer Insektenzelle durch mindestens

ein Baculovirus bei Variation des MOI.

Bei den eigenen Experimenten konnte die erfolgreiche Infektion durch die Expression des Reporter-proteins GFP ab etwa 20 h p.i. nachgewiesen werden. Tabelle 7-6 zeigt einen Vergleich des nach der Poissonverteilung berechneten Anteils und der durchflusszytometrischen Bestimmung (Kapitel 5.1.3) infizierter Zellen. Etwa 24 h nach Infektion ist das Fluoreszenzsignal im Zytometer noch zu schwach, um einen signifikanten Unterschied zwischen der Kontrollkultur und den infizierten Kulturen zu detektieren; der Anteil der infizierten Zellen liegt deutlich unter den berechneten Werten. Bis etwa 36 h p.i. (Tag 2) nehmen die Werte für die infizierten Zellen zu und liegen bei MOI 0,1 und 1 über den berechneten Werten. Dies kann durch eine beginnende Sekundärinfektion oder durch subjektives gating bei Auswertung der Messdaten begründet werden. Lediglich beim Einsatz von MOI 10 liegt der Prozentsatz mit 92,3 % hinter den berechneten Daten mit 100 % Infektionswahrscheinlichkeit zurück. Hierbei gilt zu beachten, dass sowohl eine schlechte Durchmischung bei der Infektion selbst sowie ungünstige intrazelluläre Bedingungen für eine schlechtere Infektion verantwortlich sein können. So zeigen Lynn und Hink (1978) anschaulich die Abhängigkeit des Infektionserfolgs von der Zellzyklus-phase: Mit Zellen, die sich in der Mitte oder am Ende der S-Phase befinden, kann der höchste Infekti-onsgrad erzielt werden (Lynn und Hink 1978).

98

Diskussion

Tabelle 7-6: Vergleich der Infektionsrate nach der Poissonverteilung unter Angabe der berechneten Infekti-onswahrscheinlichkeit und einer durchflusszytometrischen Messung an Tag1 bzw. 2 p.i..

MOI 1-P(0) %

Infizierte Zellen d 1 %

Infizierte Zellen d 2 %

0,1 9,5 1,1 15,2

1 63,2 8,5 67,7

10 100 66,6 92,3

7.4.2 Infizierte immobilisierte Kulturen

In Bezug auf die immobilisierten Kulturen ergeben sich deutliche Unterschiede in den Wachstums-charakteristika. Auffällig ist hierbei die kürzere Kultivierungsdauer in den perfundierten Experimen-ten, welche wiederum von den Bedingungen abhängig ist. Chico und Jäger (2000) konnten bei Infekti-on mit MOI 5 in einem perfundierten Reaktorsystem die pcd im Vergleich zur Suspensionskultur um 30 % und gleichzeitig die Kultivierungsdauer von 3 auf 5 Tage steigern. Eine Infektionsrate ist im perfundierten Fall nicht angegeben; da die Zellen in beiden Fällen homogen verteilt sind, kann davon ausgegangen werden, dass eine mit der Suspensionskultivierung vergleichbare Rate vorliegt (Chico und Jäger 2000). Die eigene perfundierte Kultivierung im HFR resultierte bei einer Kultivierungsdauer von 10 Tagen bis zur Absterbephase in eine Infektionsrate von etwa 72 %. Die Zelldichte konnte dabei, ausgehend vom Inokulum, 20-fach gesteigert werden. Dabei wurde der Reaktor nur mit etwa 1 % infizierter Zellen angeimpft, die Infektion breitete sich erst im Verlauf der Kultivierung aus. Die deut-lich längere Kultivierungsdauer im HFR läßt sich dennoch nur durch den besseren Schutz vor Scher-kräften als im perfundierten Reaktor erklären.Die Tn5-Zellen sind nicht zuletzt aufgrund des im Ver-gleich zu den Sf 9 bzw. Sf 21 um etwa 20 % größeren Zelldurchmessers schersensitiver (Sander und Harrysson 2007).

Unterschiedliche Prozessierungsmöglichkeiten im Kultivierungsverlauf finden sich auch beim Ver-gleich der verkapselten Zellen. Son und Lindenberger gelang es, bereits bewachsene Kapseln durch die Membran aus CS und p(DADMAC) zu infizieren (Son et al. 2006; Lindenberger 2010). Zellzahlen bei Infektion von 90 respektive 20∙106 Z∙ml-1 erlaubten eine Kultivierung über 38 bzw. 30 Tage zu pcds bis 80 und 100∙106 Z∙ml-1. Bei Lindenberger wurde dabei eine Infektion von etwa 30 % der Zellen er-reicht. Die im Vergleich zu den eigenen Ergebnissen (20∙106 Z∙ml-1) deutlich höhere pcd bei Lindenber-ger kann dadurch erklärt werden, dass hier in einem STR mit aktiver Begasung und Durchmischung kultiviert wurde. Auch die Kapselgröße wurde mit etwa 300 µm deutlich kleiner gewählt und eine mögliche wachstumslimitierende Gradientenbildung über der Kapsel verringert. Im Gegensatz dazu wurde die von Son angegebene und 4-fach höhere pcd unter vergleichbaren Bedingungen zum eige-nen Kultursystem und gleicher Kapselgröße erreicht. Aus der in der Veröffentlichung beschriebenen Prozessführung kann kein Unterschied ausgemacht werden, der eine solche Differenz in der pcd recht-fertigt. Allerdings erfolgte die Bestimmung der Zellkonzentration in beiden Literaturvergleichen mit-tels Zellaktivitätstest: Die enzymatische Reduktion des gelben wasserlöslichen Farbstoffs 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) wird unter Verbrauch der Reduktions-äquivalente NADH und NADPH der Zellen zum wasserunlöslichen Formazan umgesetzt. In einer Endpunktbestimmung wird das Formazan nach Inkubation mit den Zellen vermessen (Mosmann 1983). Die Methode mit MTT macht eine vorherige Aufnahme einer Kalibrierung notwendig. Auf-grund der Unzugänglichkeit der Zellen nach der Verkapselung muss diese Kalibrierung mit Suspen-sionszellen durchgeführt werden. Unterschiede im Metabolismus der Zellen in den Kultivierungssys-temen müssen also vernachlässigt werden. Weiterhin kann der unspezifische Umsatz des MTT durch

99

Diskussion

Reduktionsäquivalente, freigesetzt von in der Kapsel abgestorbenen oder lysierten Zellen, nicht einge-schätzt werden. Die tatsächliche Differenz der Zellkonzentration in den Kapseln der Vergleichswerte kann zudem vom eingesetzten Medium abhängig sein und kann aufgrund der angegebenen Daten nicht genau beziffert werden. Angesichts der Unwägbarkeit beider Methoden ist die tatsächliche Dif-ferenz der pcds als geringer anzunehmen.

7.4.3 Infektionsrate in immobilisierten Kulturen

Für eine gewünschte Optimierung der Raum-Zeit-Ausbeute der Proteinproduktion muss neben der pcd auch die Infektionsrate der Zellen im Kultivierungssystem beachtet werden. Chico und Jäger (2000) machten diesbezüglich in ihrer Veröffentlichung keine Angabe, es kann aber davon ausgegan-gen werden, dass im perfundierten STR, ähnlich zur spinner flask, eine hohe Infektionsrate von nahezu 100 % erreicht werden kann (Chico und Jäger 2000). Dem gegenüber steht mit etwa 72 % infizierten Zellen die eigene Perfusionskultur im HFR. Angesichts der doppelten Werte der Kultivierungsdauer und maximalen Zelldichte zeigt sich die Kultivierung im HFR hier überlegen.

Vor allem in der Kapselkultivierung offenbart sich die Infektionsrate als eine kritische Größe. Linden-berger (2010) gibt hier einen Erfolg von etwa 50 % infizierten Zellen in den Kapseln an. In den eigenen Experimenten zeigt sich eine stärkere Inhomogenität mit etwa 30 % infizierten Zellen. Die beobachtete Infektion tritt in jedem Fall als eine Anhäufung von positiven Zellen, ausgehend von einzelnen Her-den, auf. Initial befallene Zellen infizieren die umliegenden, so dass es zu einer segmentiellen Ausbrei-tung des Virus kommt (siehe Abbildung 5-14). Im Gegensatz zu Lindenberger oder Son wurden die eigens verkapselten Zellen nicht durch die Kapselmembran von außen, sondern vor dem Verkapse-lungsprozess infiziert. Eine Variation des MOIK, dem Prozentsatz an infizierten Zellen bei der Ver-kapselung, zeigt, dass bereits ab einem Anteil von 6 % die Zellen in der Kapsel absterben (Kapitel 5.2.2.3). Die besten Ergebnisse bezüglich der erreichten pcd und Infektionsrate konnten hier bei einem MOIK von 0,03 erzielt werden. Bei einem durchschnittlichen Kapseldurchmesser von 3 mm und einem resultierenden Volumen von etwa 14 µl mit einer Startzellkonzentration von 5∙105 Z∙ml-1 bedeutet dies statistisch gesehen ein Verhältnis von 7.000 nicht infizierten Zellen bzw. 210 infizierten Zellen pro Kapsel. Die von einer infizierten Zelle maximal generierte und abgegebene Anzahl an Viruskopien liegt, approximiert nach Hu und Bentley, etwa bei 10.000 (Hu und Bentley 2000). Damit müssten theo-retisch 2 Millionen Viruskopien in einer Kapsel zu Beginn des Prozesses vorliegen. Geht man davon aus, dass das Virus von Resten an CS in der Kapsel nicht beeinträchtigt wird und sich diffusiv ausbrei-ten kann, müsste auch bei einer Generierung von weit weniger Viruskopien die Anzahl ausreichen, um die Zellen in den Kapseln vollständig zu infizieren. Entsprechende analytische Ansätze konnten im bearbeiteten Projekt aufgrund der Komplexität nicht verfolgt werden. Dennoch müssen zusätzliche Einflussfaktoren, wie die bereits beschriebene Abhängigkeit des Zellzyklus von der Infektionswahr-scheinlichkeit (Kapitel 7.4.1) sowie weitere Inhomogenitäten während des Verkapselungsprozesses in Betracht gezogen werden. Diese können sich durch eine inhomogene Durchmischung der Suspension aus Zellen und CS vor dem Verkapseln ergeben oder resultieren aufgrund der Kapselgröße in einer Gradientenbildung von Nährstoffen wie Glukose oder beispielsweise Sauerstoff (Hübner 2007).

7.5 Bewertung der einzelnen Systeme

Nach der Betrachtung verschiedener Charakteristika zum Wachstum und zur Infektion in den zu vergleichenden Kultivierungssystemen sollen diese nun auf ihren tatsächlichen Nutzen im Hinblick auf die Proteinproduktion evaluiert werden. Interessante Parameter sind hier die allgemeine Mach-barkeit, die Steuerung der Kultivierungsbedingungen mit dem Ziel einer Produktionsoptimierung, die erreichte Raum-Zeit-Ausbeute sowie die Handhabung.

100

Diskussion

7.5.1 Proteinexpression in den Kulturüberstand

Ein wichtiges Kriterium bei der Herstellung von Proteinen ist die Ausschleusung des fertigen Proteins aus der Zelle in den Kulturüberstand. Kann dies erreicht werden, lässt sich beim Downstreaming mit dem Zellaufbruch bzw. der Zelllyse ein komplexer und kostenintensiver Prozessschritt einsparen. Vor allem für die potentielle Proteinherstellung in den betrachteten immobilisierten Systemen ist dieser Schritt immanent, da die Zellen hier zusätzlich durch Membranen eingeschlossen sind. Im BVES kann eine entsprechende Sekretierung des Proteins durch Einfügen einer geeigneten Leadersequenz in das Genom des Virus, z.B. das in dieser Arbeit verwendete gP67, forciert werden. Die Funktion der Se-quenz und die Ausschleusung in den Kulturüberstand konnten durch einen ELISA aus Proben eines Kulturüberstandes einer Suspensionskultur nachgewiesen werden (Abbildung 5-9).

In den immobilisierten Proben ist eine Anreicherung im Kulturüberstand nur erfolgreich, wenn das Zielprotein die Membran diffusiv passieren kann. Für das verwendete Hohlfasermodul mit einem cutoff bei 20 kDa (50 %) kann daher vermutet werden, dass EPO mit einer erwarteten Größe zwischen etwa 20 und 40 kDa teilweise im Modul zurückgehalten wird. Eine Analyse von Proben aus dem Ka-pillarraum sowie Extrakapillarraum des HFR (Abbildung 9-8) zeigt, dass das Zielprotein überwiegend von der Membran zurückgehalten wird und konzentriert im EKR vorliegt. Eine Anpassung des cutoffs ist jedoch im Zuge des Herstellungsverfahrens der Hohlfasermembranen ohne Probleme möglich, so dass HFRen, optimiert für das Zielprotein oder beliebige andere Proteine, angefertigt werden können (Ohlrogge 2006).

Im Prozess der Verkapselung von Zellen mit CS und p(DADMAC) kann durch Variation von Parame-tern wie der Salzkonzentration oder der Verweilzeit im Fällbad der cutoff der Kapselmembran indivi-duell eingestellt werden (Dautzenberg et al. 1999). Zur Herstellung von Proteinen wird die Membran-bildung sinnvollerweise so angepasst, dass weder Nährstoffe oder Metabolite noch das Zielprotein zurückgehalten werden. Die nach dem entwickelten Protokoll selbst hergestellten Kapseln weisen nach Analyse des Kulturüberstandes im SDS-Gel einen cutoff (100 %) von etwa 100 kDa auf (Abbildung 7-6) und sind somit für eine Produktion des EPO mit anschließender Reinigung aus dem Kulturüberstand geeignet.

Abbildung 7-6: Bestimmung des cutoffs der Kapselmembran im silbergefärbten SDS-Gel aus dem Auftrag eines

Größenstandards (1) sowie zweier Proben aus dem Überstand einer infizierten verkapselten Kultur (2 und 3).

101

Diskussion

7.5.2 Handhabung bei Vorbereitung und Kultivierung im Labormaßstab

Für eine ganzheitliche Bewertung der Kultursysteme zur Proteinherstellung werden zusätzlich die Herausforderungen in Bezug auf die Prozesskontrolle, die Steriltechnik sowie den Zeit- und Gesamt-aufwand betrachtet.

7.5.2.1 Vorbereitung Die Grundvoraussetzungen für die immobilisierte Kultivierung im BVES mit dem Expandieren einer Vorkultur an Insektenzellen, der Virusamplifizierung und Infektion stellen zugleich den überwiegen-den Teil des Gesamtaufwandes für die Kultivierung von infizierten Suspensionszellen im Schüttelkol-ben dar. Zusätzliche vorbereitende Schritte werden nötig, wenn die Zellen unter besser definierten Bedingungen in Suspension im Rührkesselreaktor kultiviert werden sollen.

Zur Kultivierung verkapselter Zellen erweitert sich der Aufwand um die Vorbereitung und Autokla-vierung der Polymerlösungen (siehe Kapitel 4.3.1 und 4.3.2) von NaCS und p(DADMAC). Der gesam-te Prozess von der Infektion der Zellen über die eigentliche Verkapselung nimmt auch aufgrund der Wartezeiten etwa 2 Tage bis zur eigentlichen Kultivierung im Schikanekolben in Anspruch.

Beim Einsatz eines Hohlfasermoduls zur perfundierten Kultivierung der Insektenzellen wird im ein-fachsten Fall zusätzlich der Aufbau einer Reaktorperipherie mit einem Mediumreservoir und einem –kreislauf über eine Schlauchpumpe benötigt (z.B. in Abbildung 4-3). Mit dem Ziel, definierte Kultivie-rungsbedingungen zu schaffen, wurde in der vorliegenden Arbeit das Medienreservoir durch einen Rührkesselreaktor ersetzt. So konnte das Perfusionsmedium aktiv begast und Parameter wie der pH des Mediums oder die Sauerstoffsättigung erfasst werden (Abbildung 4-4). Die Reaktorperipherie, zusammen mit den um den HFR angebrachten Sauerstoffsonden, muss vor dem Einsatz autoklaviert und die Messsonden kalibriert werden. Der zeitliche Aufwand mit Steriltests der Reaktorperipherie und dem Durchspülen des HFR bis zur Inokulierung und zum Start einer Kultivierung kann mit 4 bis 5 Tagen eingeschätzt werden.

7.5.2.2 Prozess und Steriltechnik Nach dem Animpfen der Schüttelkolben wird aus der infizierten Suspensionskultur täglich unter der Sterilbank eine Zellprobe zur Bestimmung der Zellkonzentration durch Trypanblauzählung oder nach Abzentrifugieren der Zellen zur Bestimmung der EPO-Konzentration genommen. Ein Mediumwech-sel ist über die Kultivierungsdauer von 4 bis 5 Tagen nicht nötig. Nach dem Ernten werden ebenfalls die Zellen abzentrifugiert, der Überstand kann der Proteinanalytik zugeführt werden.

Während einer über mehrere Wochen andauernden Kultivierung von verkapselten Zellen muss spä-testens alle 2 Tage ein Wechsel des Kulturmediums erfolgen (siehe Kapitel 7.3). Dies kann ebenfalls problemlos unter der Sterilwerkbank durchgeführt werden. Die Zellkonzentration in den Kapseln wird nach dem Auflösen in Cellulase ebenfalls durch Trypanblauzählung bestimmt. Zum Downstreaming des Zielproteins entfällt der Zentrifugationsschritt, das Protein kann direkt aus dem Kulturüberstand aufgereinigt werden.

Die Immobilisierung der Insektenzellen in den HFR erlaubt keine repräsentative Probennahme mit anschließender Trypanblauzählung, die Zellkonzentration wird daher online über den Sauerstoffbe-darf der Zellen bestimmt. Weiterhin ist über den Kultivierungszeitraum von 2 bis 3 Wochen aufgrund des im Vergleich zur Zellzahl großen Medienreservoirs kein vollständiger Mediumswechsel nötig. Allerdings resultiert jeglicher Eingriff in das laufende Kultivierungssystem in situ, wie eine Probe-nahme aus dem HFR oder dem Medienreservoir zur Bestimmung der EPO-Konzentration, in einem hohen Kontaminationsrisiko. Aus diesem Grund wurden die Verbindungsschläuche des Medienkreis-laufs so gewählt, dass sowohl die Probenahme aus dem EKR als auch dem Medienreservoir bzw. ein Tausch des Kulturmediums unter der Sterilwerkbank durchgeführt werden konnte. Die Proteinreini-

102

Diskussion

gung aus dem Kulturmedium im KR kann ohne weiteren Zwischenschritt durchgeführt werden; für Proben aus dem EKR ist eine vorherige Zentrifugation nötig.

7.5.3 Proteinproduktion

Die Raum-Zeit-Ausbeute an EPO dient als Kennwert für das Potential zur Proteinproduktion in den Kultivierungssystemen und kann anhand der maximalen EPO-Produktionsrate PEPO (Tabelle 7-7) unter den jeweiligen Kulturbedingungen berechnet respektive abgeschätzt werden. In Suspensions-kultur lässt sich PEPO aus Abbildung 5-9 ableiten. Der maximale Anstieg der Konzentration an Eryth-ropoietin lässt sich zwischen Tag 1 und 2 p.i. feststellen. Für den HFR ergibt sich die stärkste Zunahme an EPO nach 5, für die verkapselte Kultur nach etwa 21 Tagen.

Tabelle 7-7: Vergleich der EPO-Produktion pro Zelle in den unterschiedlichen Kultivierungssystemen unter Angabe der Zellkonzentration, der absoluten Zellzahl sowie des Kulturvolumens und der theo-retischen EPO-Produktion PEPO pro Tag.

System PEPO in mIU∙Z-1∙d-1

Zellkonz. in Z∙ml-1

Kulturvolumen in ml

Zellzahl absolut in Z

EPO gesamt pro Tag in mIU

Suspension 6,44∙10-2 1∙106 30 3,0∙107 1,93∙106

HFR 1,02∙10-2 9∙106 20 (+400) 1,8∙108 1,84∙106

Kapsel 5,58∙10-2 3∙107 Kapsel 8 (+80) 24∙107 13,4∙106

Die berechneten zellbezogenen Produktionsraten lassen sich in einen Größenbereich zwischen etwa 1,0 bis 6,5∙10-2 mIU∙Z-1∙d-1 einordnen, wobei der höchste Wert in Suspensionskultur erreicht wird. Da sich auf die Gesamtzahl im System bezogen wurde, ohne die Infektionsrate zu berücksichtigen, resul-tiert dieses Ergebnis sicherlich aus dem höheren Infektionsgrad der Suspensionszellen (vgl. Kapitel 5.1.3.1). Im HFR wurden maximal 72 %, in den verkapselten Kulturen geschätzt nur etwa 30 % infi-zierte Zellen detektiert. Weiterhin muss in Betracht gezogen werden, dass die immobilisierten Kulti-vierungsmethoden nicht prozessoptimiert durchgeführt wurden (vgl. Kapitel 7.5.4).

Für eine Abschätzung des Potentials der EPO-Produktionssysteme im Gesamtprozess ist es essentiell, die Proteinproduktionsrate über die Prozesszeit als konstant anzunehmen. Konträr dazu konnte in Suspensionskultur gezeigt werden, dass die Produktion im Verlauf des Experiments abnimmt und gegen Ende Protein abgebaut wird (Abbildung 5-9). Dieser Trend lässt darauf schließen, dass von den Zellen freigesetzte Proteasen das Zielprotein schädigen. Eine Kultivierung mit supplementiertem Pro-teaseinhibitorcocktail (ebenfalls Abbildung 5-9) konnte hier keine Verbesserung der Ausbeute brin-gen. Eine Analyse des Zellwachstums sowie des Infektionsverlaufes anhand des Reporterproteins GFP deutet jedoch darauf hin, dass durch Zugabe einer Mischung aus mehreren Proteaseinhibitoren auch für die Infektion und die resultierende Proteinproduktion wichtige zelleigene Enzyme blockiert wer-den (Abbildung 5-6 und Abbildung 5-7). Dies bestätigt im Wesentlichen die Ergebnisse von Gotoh et al., der zeigen konnte, dass mit Supplementierung eines Cocktails aus Proteaseinhibitoren zwar die Proteinausbeute sinkt, aber gleichzeitig Proteasen und der Abbau von Zielprotein gehemmt werden (Gotoh et al. 2001). Weitere Untersuchungen zeigten jedoch auch die Möglichkeit eines Einsatzes spe-zifischer Proteaseinhibitoren, um die Ausbeute an Zielprodukt etwa 2-fach zu steigern (Hu und Bent-ley 1999; Gotoh et al. 2001). Hier bietet es sich an, zunächst und speziell auf das gewünschte Protein angepasst, zymographisch das Spektrum der im System aktiven Proteasen zu detektieren und dann gezielt einzelne spezifische Hemmstoffe einzusetzen (Ikonomou et al. 2003). Die zuvor getroffene An-nahme der konstanten Produktionsrate kann daher in einem Kultursystem mit optimierter Prozess-führung als realistisch eingesetzt werden.

103

Diskussion

Unter Verwendung der konstanten EPO-Produktionsrate ist die theoretischen Ausbeute an Protein der Gesamtprozesse (Tabelle 7-8) unter Angabe der gesamten Dauer der Kulturführung sowie – ab-züglich der Zeit bis zu einer ausreichenden Infektion der Zellen - als Produktionsdauer dargestellt. In Suspensionskultur werden die Zellen mit einem hohen MOI über 3 beaufschlagt, um initial möglichst viele Zellen zu infizieren. Die Phase der Produktion des Zielproteins beginnt dementsprechend mit dem Erreichen der späten Phase im Infektionszyklus und der Aktivierung des Polyhedrin-Promotors in etwa zeitgleich in der gesamten Zellpopulation. Die Ausbeute an Gesamtprotein berechnet sich somit aus der Produktionsdauer und der maximalen Produktionsrate. Nach den verwendeten Immobilisie-rungsprotokollen werden im HFR bzw. in den Kapseln initial 1 bis 5 % infizierte Zellen inokuliert. Im weiteren Kultivierungsverlauf wächst die Zellpopulation weiter bis zum Erreichen der pcd, während sich die Infektion im System ausbreitet. Die Phase der maximalen Proteinproduktion beginnt daher einige Zeit nach dem Inokulieren.

Tabelle 7-8: EPO-Herstellung im Gesamtprozess mit Angabe der Kultivierungs- und Produktionsdauer sowie der Gesamtausbeute an Protein.

Kultivierungsdauer in d

Produktionsdauer in d

Gesamtprotein in mIU

Suspension 4 4 7,72∙106

HFR 14 10 18,4∙106

Kapsel 80 60 804∙106

7.5.4 Sauerstoffeintrag in die Kultursysteme

Der Eintrag von Sauerstoff stellt für alle aeroben biotechnologischen Prozesse eine sensitive Größe dar. Insbesondere bei der Kultivierung bzw. Proteinherstellung mit eukaryontischen Zellen wie Insek-tenzellen ist das Einhalten eines stabilen Levels der Sauerstoffsättigung im Reaktor für die Produkt-ausbeute essentiell (Ikonomou et al. 2003). Bei der Proteinproduktion im BVES variieren die limitie-renden Werte der Sauerstoffsättigung mit dem Zielprotein. Untersuchungen zeigen, dass in den meis-ten Fällen die Untergrenze des optimalen Sättigungsbereiches bei 30 % liegt, in jedem Fall aber min-destens 10 % Sauerstoff zur Verfügung stehen sollte (Drugmand et al. 2012).

7.5.4.1 Suspensionskultur Das Maß für den Sauerstoffeintrag in ein Reaktorsystem wird durch die reaktorspezifische Größe kl,a beschrieben und kann durch verschiedene Methoden vor Beginn oder während einer Kultivierung experimentell bestimmt werden. Der, insbesondere von der Geometrie des Reaktors, von etwaigen Einbauten und der Rührerdrehzahl bzw. Schüttelgeschwindigkeit abhängige oberflächenbezogene Stoffübergangskoeffizient von Sauerstoff (kl,a) kann für Schüttelkolben ohne aufwendige Messtechnik und unter Verwendung der Stoffdaten von Wasser nach Formel 7-7 approximiert werden (Chisti 2002).

104

Diskussion

kl,a∙ �ϑg2�

13�

=0,5∙ �d3

VF�

89�

∙ �DO2,l

ϑ�

12�

∙ �ϑ2

d3∙g�

827�

∙ �n2∙√e∙d

g�

12�

Formel 7-7

kl,a Stoffübergangskonstante von Sauerstoff in Wasser h-1

ϑ kinematische Viskosität Wasser 1,01∙10-3 kg∙s-1∙m-1

g Erdbeschleunigung 9,81 m∙s²

d Durchmesser Schüttelkolben 0,087 m

VF Füllvolumen 3,0∙10-5 m³

DO2,l Diffusionskoeffizient von Sauerstoff in Wasser 2,41∙10-9 m²∙s-1

n Rotationsgeschwindigkeit 50 min-1

e Exzentrizität 0,051 m

Mit einem kl,a von 1,4 h-1 liegt der Schüttelkolben unter den gewählten Kulturbedingungen in dem von Singh angegebenen Bereich des wave bioreactors von 1 bis 4 h-1 (0,1 vvm, 5 bis 30 rmp) und eignet sich daher per se zur Herstellung von Protein im Labormaßstab (Singh 1999).

7.5.4.2 Hohlfaserreaktor Mit dem Aufbau des Medienkreislaufs zur Kultivierung im Hohlfaserreaktor befinden sich 2 – in Be-zug auf den Massentransfer von Sauerstoff relevante – Module im System: das begaste Medienreser-voir (Rührkessel) sowie der HFR. Der kl,a des Rührkesselreaktors konnte experimentell (Kapitel 4.4.3.2) bei einer Drehzahl von 300 rpm und einer Begasungsrate von 5 slpm auf 56,88 h-1 bestimmt werden (Abbildung 9-7). Der Stofftransport im HFR kann aus den in Kapitel 5.3.3 ermittelten Daten allgemein nach Formel 7-1 berechnet werden.

Q̇O2=OTR=OUR=ZZ∙q̇O2=kl,a∙∆cO2

Formel 7-1

Q̇O2 Stofftransport Sauerstoff mol∙l-1∙h-1

kl,a Stoffübergangskonstante von Sauerstoff in Medium h-1

ZZ Zellzahl im Reaktor 2,0∙108 Z

q̇O2 Zellspezifische Sauerstoffaufnahmerate 1,05∙10-11 mmol∙min-1∙Z-1

∆cO2 Differenz der Sauerstoffkonzentration im HFR mmol∙l-1

Da sich aufgrund des Sauerstoffverbrauchs durch die Zellen während der Kultivierung über die Län-ge des HFR ein Sauerstoffgradient aufbaut, muss der Term für ∆cO2 in Formel 7-1 dementsprechend angepasst werden. Dazu wird der resultierende Gradient näher betrachtet: Liegt im HFR keine Sauer-stofflimitierung vor, d.h. Sauerstoff ist im Überschuss, kann der Sauerstoffverbrauch als Reaktion pseudo-erster Ordnung betrachtet und der Gradient als linear angenommen werden. Die Sauerstoff-differenz aus obiger Formel wird dann aus der Eingangskonzentration und dem Mittelwert aus Ein-gangs- und Ausgangskonzentration berechnet:

105

Diskussion

Q̇O2 = kl,a∙ �cO2,R,E − �cO2,R,E + cO2,R,A

2��

Formel 7-8

Q̇O2 Stofftransport Sauerstoff mol∙l-1∙h-1

kl,a Stoffübergangskonstante von Sauerstoff in Medium h-1

cO2,R,E Sauerstoffkonzentration Reaktoreingang 0,266 mmol∙l-1

cO2,R,A Sauerstoffkonzentration Reaktorausgang 0,242 mmol∙l-1

Für eine Differenz zwischen den Messsonden von 17,5 % bei einer Zellkonzentration von 1,0∙107 Z∙ml-1 und einer Durchflussrate von 90 ml∙min-1 folgt dann ein kl,a von 5,42, der damit etwa dreifach größer als im Schüttelkolben ist. Mit bekanntem Stofftransport kann nun die theoretische maximale Zellzahl im HFR (best case-Abschätzung) berechnet werden. Dazu werden die Transporteffekte im Medien-bulk vernachlässigt. Als Bezugsgröße wird die limitierende Sauerstoffkonzentration der Insektenzellen (aus Kapitel 5.1.1.2) mit etwa 5 % (clim., F,A) für den Reaktorausgang herangezogen und nach Umstel-lung der Formel 7-9 unter Berücksichtigung des Transportwiderstandes der Membran als Pendant dazu die limitierende Sauerstoffkonzentration in der Hohlfaser berechnet. In diesem Modell wird ausschließlich der diffusive Transport von Sauerstoff durch die Poren der Membran betrachtet, die Diffusion durch die Polysulfonmembran wird aufgrund des etwa tausendfach niedrigeren Diffusi-onskoeffizienten (Baker 2012) vernachlässigt.

Q̇O2=DW,O2 ∙π∙L∙z∙�clim., F,I-clim., F,A�

ln rArI

Formel 7-9

DO2,l Diffusionskoeffizient Sauerstoff in Wasser 2,41∙10-5 cm²∙s-1

π Kreiszahl -

L Länge der Hohlfasern 15 cm

z Anzahl der Hohlfasern 3000 -

clim., F,I Konzentration Sauerstoff Faser, innen mmol∙l-1

clim., F,A Konzentration Sauerstoff Faser, außen 1,33∙10-2 mmol∙l-1

rA Radius Faser, außen 0,108 mm

rI Radius Faser, innen 0,1 mm

Nach Umformung von Formel 7-1 und Einsetzen der resultierenden Sauerstoffkonzentration von 1,41∙10-2 mmol∙l-1 für clim., F,I ergibt sich eine theoretische maximale Zellzahl von 9,1∙107 Z∙ml-1 im HFR. Trotz dieses Ergebnisses kann eine zumindest in Teilbereichen des HFR vorherrschende Sauerstoffli-mitierung während der Kultivierung nicht ausgeschlossen werden. Eine Messung der Laktatkonzent-ration (Abbildung 7-7) ergibt ab Tag 7 einen über nahezu die gesamte Prozesszeit kontinuierlichen Anstieg der Konzentration, zeitgleich zum Erreichen der maximalen Zellkonzentration. Diese Be-obachtung kann als einsetzende Sauerstofflimitierung gewertet werden, da Sf 21 Zellen ausschließlich unter anaeroben Bedingungen Laktat produzieren (Bernal et al. 2009).

106

Diskussion

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

106

107

Zellz

ahl i

n -1

Prozessdauer in d

0

2

4

6

8

10

12

Lak

tat i

n

Abbildung 7-7: Laktatproduktion im HFR; Darstellung der Laktatkonzentration sowie der Zellkonzentration im Reaktor über der Prozesszeit.

7.5.4.3 Verkapselte Kultivierung Die Immobilisierung der Insektenzellen in Polymerkapseln bietet einen wirksamen physischen Schutz vor Scherkräften. Die Kultivierung kann daher im Schikanekolben und bei einer höheren Rotationsge-schwindigkeit als mit Suspensionszellen durchgeführt werden. Der Einfluss der Geometrie der Schi-kanen lässt keine genaue Abschätzung zu, jedoch resultieren beide der genannten Faktoren in eine Verbesserung des Sauerstofftransfers in das Kulturmedium und damit in einen höheren kl,a (Henzler und Schedel 1991). Eine genaue Abschätzung ist hierbei jedoch nicht möglich. Der Stoffübergangsko-effizient der Hohlkapseln selbst konnte von Raup experimentell zu 44,4 h-1 bestimmt werden (Raup 2011).

Trotz des hohen Sauerstofftransfers über die Kapselmembran kann vermutet werden, dass sich im Inneren mit zunehmender Bewachsung durch die Zellen ein Sauerstoffgradient aufbaut. Eine diesbe-zügliche Untersuchug (4.5.1, Abbildung 7-8) zeigt die Entwicklung des Gradienten mit dem Zell-wac 7 -1 konnte eine anaerobe Zone mit einem Radius von etwa 0,3 mm im Inneren der Kapsel bewiesen werden. Um eine homogene Versorgung aller in der Kapsel befindlicher Zellen zu erreichen, müsste also ein geringerer Kapseldurchmesser eingestellt werden.

Eine mathematische Modellierung der Stoffdiffusion soll genauere Aufschlüsse über die Ausbildung des Sauerstoffgradienten unter Variation des Kapseldurchmessers bringen. Zur Erstellung des Mo-dells wird die Kapsel im stationären Zustand betrachtet, folglich sind Konzentrationsunterschiede ausschließlich von der Ortskoordinate innerhalb der Kapsel abhängig. Die für die Berechnung benö-tigte Stoffstromdichte an Sauerstoff entspricht der Sauerstoffaufnahme- und –transferrate und kann unter Anwendung des ersten Fick’schen Gesetzes durch den Diffusionskoeffizienten von Sauerstoff, die spezifische Kapseloberfläche (Formel 7-11) sowie die Ortskoordinate ausgedrückt werden.

107

Diskussion

OTR = OUR = JO2=D O2,l∙a∙dcO2

dx

Formel 7-10

a=AK

VK=

3r

Formel 7-11

JO2 Stoffstromdichte Sauerstoff mol∙s-1

DO2,l Diffusionskoeffizient Sauerstoff in Wasser 2,41∙10-5 cm²∙s-1

a Spezifische Kapseloberfläche 2 mm-1

cO2 Sauerstoffkonzentration 2,66∙10-4 mmolm∙l-1

AK Kapseloberfläche mm²

VK Kapselvolumen mm³

r Kapselradius 1,5 mm

Durch Einsetzen der Sauerstoffaufnahmerate und anschließender Integration (Formel 7-12) kann die Sauerstoffkonzentration c1,i,O2 an der Position r1,i berechnet werden. Der Index i beschreibt, dass durch die beliebige Wahl der Schrittweite Δri jede Position innerhalb der Kapsel betrachtet werden kann. Die simulierten Sauerstoffprofile sind zusammen mit den gemessenen Daten in Abbildung 7-8 dargestellt.

c1,O2=c2,O2-q̇O2 ∙ZZDW,O2 ∙6

∙�r2,i2 -r1,i

2 �

Formel 7-12

c1,O2 Sauerstoffkonzentration an Position 1 mmol∙l-1

c2,O2 Sauerstoffkonzentration an Position 2 mmol∙l-1

r2,i Position 2 auf dem Kapselradius cm

r1,i Position 1 auf dem Kapselradius cm

q̇O2 Zellspezifische Sauerstoffaufnahmerate 1,05∙10-11 mmol∙min-1∙Z-1

ZZ Zellkonzentration in der Kapsel - Z

DO2,l Diffusionskoeffizient Sauerstoff in Wasser 2,41∙10-5 cm²∙s-1

108

Diskussion

-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Saue

rsto

ffsät

tigun

g in

%

Position in Kapsel in mm

Abbildung 7-8: Sauerstoffprofil in einer Kapsel; gemessene Werte und Simulation für die Zelldichten 5,0 5 -1 ( ), 2,2 6 ( ) sowie 9,9 6 -1 ( ).

Durch eine Zielwertanpassung kann nun mit einer gewählten Untergrenze der Sauerstoffkonzentrati-on in der Kapsel bei vorgegebener Zelldichte der Durchmesser der Kapsel so berechnet werden, dass die Zellen in der Kapsel keiner Limitierung ausgesetzt sind (Abbildung 7-9). Die gewählten Grenzen liegen bei 5 %, um eine Limitierung der Zellen auszuschließen, bzw. bei 30 %, der empfohlenen Min-destkonzentration bei der Herstellung von Proteinen (Drugmand 2012). Der resultierende Durchmesser für 5,0 107 -1, der maximal in den eigenen Kapseln detektierten Zellkonzentration liegt bei 1,0 bzw. 1,2 mm. Sollte bei kleineren Kapseln durch die verbesserte Sauerstoffversorgung eine höhere Zelldichte erreicht werden können, muss der Wert entsprechend angepasst werden.

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Saue

rsto

ffsät

tigun

g in

%

Position in Kapsel in mm

Abbildung 7-9: Simulation des Sauerstoffgradienten in der Kapsel bei einer Zelldichte von 5,0 7 -1 für Kapseln mit einem Durchmesser von 1,0 und 1,2 mm

109

Diskussion

7.6 Fazit

Die vorgestellten Immobilisierungssysteme eignen sich im Gegensatz zur Suspensionskultivierung für Hochzelldichtekultivierungen von nicht infizierten und infizierten Insektenzellen. Dabei konnte die Produktion von Erythropoietin in allen Kultursystemen nachgewiesen werden. In Suspension wurde gezeigt, dass die Ausschleusung des Proteins durch die im Virus enthaltene Leader-Sequenz gP67 aus der Zelle eine Aufreinigung aus dem Kulturüberstand ermöglicht. Im Hohlfasermodul dagegen lag das ausgeschleuste Protein aufgrund des Membran-cutoffs bei 20 kDa (50 %) überwiegend im Extraka-pillarraum vor. Eine Erhöhung des cutoffs wäre hier eine einfache Abhilfe, um das Protein durch Pro-benahme aus dem Medienreservoir gewinnen zu können. Die Größenausschlussgrenze der Kapseln von etwa 100 kDa ermöglicht problemlos die Proteinreinigung aus dem Kulturüberstand. Problema-tisch zeigte sich in beiden immobilisierten Systemen die Infektionsrate der Zellen, welche durch die Fluoreszenz des Reporterproteins auf etwa 70 % (HFR) bestimmt bzw. auf etwa 25 bis 30 % in der verkapselten Kultivierung abgeschätzt werden konnte. Der Infektionsgrad kann durch eine unzu-reichende Durchmischung und somit eine verringerte Infektionsrate erklärt werden. Weiterhin kön-nen Zellzykluseffekte oder ein ungünstiger energetischer Zustand aufgrund einer Unterversorgung mit Nährstoffen oder Sauerstoff für ein Scheitern der Infektion mancher Zellen verantwortlich sein. Unabhängig davon müssen zudem die Eigenschaften des Reporterproteins GFP in Betracht gezogen werden, welches als Nachweis für eine erfolgreiche Detektion dient: Das eigentliche Fluorophor des GFP besteht aus einer Sequenz dreier Aminosäuren (Ser-Tyr-Gly). Die posttranslationale Modifikation des GFP hin zur Ausbildung der Fluoreszenz beinhaltet dabei eine Oxidationsreaktion der Hydroxy-phenyl-Gruppe des Tyrosins. Unter anaeroben Bedingungen produziertes GFP zeigt daher keine Fluo-reszenz (Cubitt et al. 1995; Heim et al. 1994). Es ist somit möglich, dass der Infektionsgrad innerhalb der sauerstofflimitierten Kapseln als falsch zu niedrig angenommen wird. Eine Analyse der Ausbeute an EPO in den Kultursystemen zeigt, dass die Suspensionskultur bezüglich der zellbezogenen Pro-teinproduktion den immobilisierten Kultivierungen überlegen ist. Zieht man jedoch die Produktion des Zielproteins über die gesamte Kultivierungsdauer und in den vorliegenden Zellkonzentrationen in Betracht, zeigt sich vor allem das Potential der Kapselkultivierung mit einer etwa 100-fachen Steige-rung der Ausbeute (HFR etwa 1,5-fach). Die zusätzliche Berücksichtigung des Aufwandes zur Vorbe-reitung und Durchführung der Kultivierung sowie den begleitenden steriltechnischen Anforderungen heben die Vorteile der Kultivierung von verkapselten Zellen gegenüber denen des HFR hervor. Insge-samt betrachtet bleibt die Proteinproduktion jedoch deutlich hinter den Erwartungen des Baculoex-pressionssystems zurück, wie ein Vergleich von Produktionsraten zeigt (Tabelle 7-9).

Tabelle 7-9: Vergleich volumetrischer Proteinproduktionraten PV,max im Baculovirusexpressionssystem mit eigenen Daten unter Angabe der Produktionsraten von Proteinen bei unterschiedlichen Opti-mierungsansätzen (Medium, feed-Strategie).

Zelllinie Rekombinantes Protein PV,max in mg∙l-1

Sf 9 Glukozerebrosidase 3,2(1)

Sf 9 Rezeptordomäne des EGF 6,4(1)

Sf 9 Bovies Rotavirus Nukleokapsid 0,8(1)

Sf 9 Humaner Nervenwachstumsfaktor 20(1)

Sf 21 Erythropoietin 0,6(2)

Quellenangaben: (1) (Ikonomou et al. 2003) (2) Eigene Daten, Suspensionskultur

110

Diskussion

Ein Teil der Einbußen kann auf die bisher fehlende Optimierung der Prozessbedingungen (z.B. MOI, TOI, Sauerstoffsättigung) sowie der Koexpression der beiden Proteine GFP und EPO zurückgeführt werden. Weiterhin muss in Betracht gezogen werden, dass nicht das gesamte produzierte Protein aus der Zelle ausgeschleust wird. So zeigt der Westernblot einer Probe lysierter Suspensionszellen, dass ein beträchtlicher Teil des EPO in der Zelle verbleibt (Abbildung 9-16). Es kann also davon ausgegan-gen werden, dass die tatsächliche Gesamtausbeute an Protein deutlich über den in einer Suspensions-kultur im Kulturüberstand detektierten 0,6 mg∙l-1 liegt. Letztendlich bleibt zudem die Frage offen, ob die codon-usage der Insektenzellen sich – trotz vorheriger Optimierung der Sequenz – zur Herstellung des Erythropoietins eignet (Jiang et al. 2008).

111

Ausblick

8 Ausblick Die Produktion von Erythropoietin sowie dessen Ausschleusung aus den Zellen zur Reinigung aus dem Kulturüberstand konnte erfolgreich in allen untersuchten Kultursystemen nachgewiesen werden. Das Potential der immobilisierten Kultivierungen liegt hier vor allem in den deutlich längeren Kulti-vierungsdauern bei höherer Zelldichte. Um diesen Vorteil nutzen zu können, besteht jedoch weiterer Optimierungsbedarf der Prozesse hin zu einer Steigerung der Produktionsrate des rekombinanten Proteins.

8.1 Optimierung in der Prozessführung und –analytik

Aus den eigenen Ergebnissen sowie Literaturvergleichen zeigt sich die Sensitivität der Hochzelldich-tesysteme bezüglich der Versorgung mit allen im Kulturmedium enthaltenen essentiellen Nährstoffen (z.B. cell density effect, Kapitel 2.5.5). Die Ausarbeitung einer angepassten feed-Strategie erfordert des-halb eine lückenlose und möglichst online betriebene Analytik der wichtigsten Nährstoffe und Amino-säuren, um eine Unterversorgung der Zellen auszuschließen. Essentiell ist zudem die Gewährleistung einer verbesserten Sauerstoffversorgung der Zellen, welche in den Kapseln durch die Verringerung des Durchmessers verwirklicht werden kann. Im Hohlfasermodul wäre dies beispielsweise durch eine verbesserte Anpassung der Pumprate oder den Einsatz von Membranen mit verbesserter Sauerstoff-löslichkeit denkbar. Auch die Verwendung eines HFR mit einem zusätzlichen Membranstrang, der z.B. mit sauerstoffgesättigtem Perfluorcarbon perfundiert wird, sollte in Betracht gezogen werden.

Nach derzeitigem Erkenntnisstand sollte eine Optimierung der angesprochenen Kultivierungspara-meter auch in einen höheren Infektionsgrad in der Kultur resultieren. Zusätzlich sollte nach prozess-technischen Möglichkeiten gesucht werden, um eine homogenere Verteilung der, vor dem Prozess infizierten Zellen, in den Kapseln respektive dem HFR zu erreichen.

Hinsichtlich der Produktqualität sollten zymographische Untersuchungen durchgeführt werden, um Proteasen zu identifizieren und diese dann gezielt mit einzelnen, während bestimmter Kultivierungs-phasen supplementierten, Inhibitorstoffen zu eliminieren. Das Augenmerk muss dabei darauf gelegt werden, dass diese Substanzen potent die Proteasen hemmen können, ohne zelleigene Enzyme zu beeinträchtigen.

Sind die Mechanismen zur Kultivierung im immoblilisierten System komplett verstanden und defi-niert, bietet es sich an, die EPO-Konzentration durch den Einsatz eines Viruskonstruktes ohne GFP zu steigern. Mit diesem Virus kann ein Vergleich des Glykosylierungsmusters zwischen Wildtyp und genetisch modifizierten Insektenzellen angestrebt werden. Zur weiteren Steigerung der Proteinpro-duktion kann für den angestrebten Vergleich ein Upscaling der Kultursysteme in Betracht gezogen werden. Für die Suspensionszellen bedeutet dies die Kultivierung in einem scherarmen System wie dem wave reactor oder einem Rührkessel mit indirekter Begasung über Membranen. Für die immobili-sierten Ansätze bietet sich die Wahl einer größeren Hohlfaserkartusche bzw. die Automatisierung der Verkapselungseinheit mit anschließender kontinuierlicher Kultivierung in einem Rührkesselreaktor an.

8.2 Optimierung in der Proteinreinigung und –analytik

Vor der Etablierung einer Proteinfeinreinigung (Ionenaustauscher) oder einem Polishing-Schritt (Grö-ßenausschlusschromatographie) ist es essentiell, eine Verbesserung der Proteinausbeute im Capture-Schritt der Affinitätschromatographie zu erreichen. Hierbei bietet es sich an, an verschiedenen Prob-lempunkten anzusetzen: Im Aufreinigungsverfahren über den His-Tag des Proteins kann das Leeching des Nickels aus der Säule durch Bestandteile des Kulturmediums vermieden werden, indem die Probe

112

Ausblick

zuvor einer Filtration oder Dialyse unterzogen wird. Diesbezügliche Untersuchungen sollten auch die Zugabe von Nickelionen in die Probe des Kulturüberstandes vor Injektion auf die Säule mit einbezie-hen (Kollewe und Vilcinskas 2013). Um die Leeching-Effekte zu umgehen, könnte alternativ dazu der His-Tag auf dem EPO-Konstrukt ersetzt, oder C-terminal ein weiterer geeigneter Tag angebracht wer-den. Dieser wird für einen ersten Affinitätsschritt so gewählt, dass die Capture-Säule möglichst wenig mit dem Kulturmedium interagiert. Zur Überprüfung der räumlichen Zugänglichkeit des Protein-Tags sollten in jedem Fall Untersuchungen einer Variation der Spacer-Länge durchgeführt werden.

Um die Aussagekraft der gelelektrischen Analytik zu steigern, sollte zusätzlich zur Silberfärbung eine Anfärbung mit Alcianblau oder über eine PAS-Reaktion (periodic acid-Schiff) in Betracht gezogen wer-den. Beide Färbemethoden eignen sich besonders zur Detektion von Glykoproteinen und können die Sensitivität bis zu 10-fach erhöhen (Miller et al. 2006).

Das Ziel der Proteinanalytik muss es zum einen sein, mit geringem Aufwand unter Überwachung der Proteinqualität während der langen Kultivierungsphasen, beispielsweise in den Kapseln, eine Qualifi-zierung des Prozesses zu leisten. Zum anderen muss die Reinheit des Proteins so gesteigert werden, dass eine Glykoanalytik z.B. zum Vergleich des Produktes von Insektenzellen des Wildtyps und gene-tisch modifizierten Zelllinien durchgeführt werden kann.

113

Literaturverzeichnis

Literaturverzeichnis Agathos S. (1996): Insect cell bioreactors. Cytotechnology (20):173-189

Arvidsson P., Plieva, F. M., et al. (2003): Direct chromatographic capture of enzyme from crude ho-mogenate using immobilized metal affinity chromatography on a continuous supermacroporous adsorbent. Journal of Chromatography A (986):275–290

Baker R. W. (2012): Membrane Technology and Applications. Wiley

Banting F. G. (1926): An Adress on Diabetes and Insulin. Canadian Medical Association Journal (16):221–230

Baxter S. C., Panarello, D., et al. (2006): Recombinant-protein production in insect cells utilizing a hol-low-fibre bioreactor. Biotechnology and Applied Biochemistry (45):167–172

Benslimane C., Elias, C. B., et al. (2005): Insights into the Central Metabolism of Spodoptera frugiperda (Sf-9) and Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4(Tn-5) Insect Cells by Radiolabeling Studies. Biotechnol Pro-gress (21):78–86

Bernal V., Carinhas, N., et al. (2009): Cell density effect in the baculovirus-insect cells system: A quan-titative analysis of energetic metabolism. Biotechnol. Bioeng. (104):162–180

Bernal V., Monteiro, F., et al. (2010): An integrated analysis of enzyme activities, cofactor pools and metabolic fluxes in baculovirus-infected Spodoptera frugiperda Sf9 cells. Journal of biotechnology (150):332–342

Bird F. T., Burk J. M. (1961): Artificially Disseminated Virus as a Factor Controlling the European Spruce Sawfly, Diprion hercyniae. The Canadian Entomologist (93):228–238

Bittner B., Morlock, M., et al. (1998): Recombinant human erythropoietin (rhEPO) loaded poly(lactide-co-glycolide) microspheres: influence of the encapsulation technique and polymer purity on micro-sphere characteristics. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics (45):295–305

Blissard G. W., Rohrmann, G. F. (1991): Baculovirus gp64 Gene Expression: Analysis of Sequences Modulating Early Transcription and Transactivation by IE1. Journal of Virology (65):5820–5827

Boulton-Stone J. M., Blake, J. R. (1993): Gas bubbles bursting at a free surface. J. Fluid Mech. (254):437

Braunagel S. C., Parr, R., et al. (1998): Autographa californica nucleopolyhedrovirus infection results in Sf9 cell cycle arrest at G2/M phase. Virology (244):195–211

Carinhas N., Bernal, V., et al. (2010): Improving baculovirus production at high cell density through manipulation of energy metabolism. Metab. Eng. (12):39–52

Carpentier D. C., Griffiths, C. M., et al. (2008): The baculovirus P10 protein of Autographa californica nucleopolyhedrovirus forms two distinct cytoskeletal-like structures and associates with polyhe-dral occlusion bodies during infection. Virology (371):278–291

Charlton C. A., Volkman, L. E. (1991): Sequential rearrangement and nuclear polymerization of actin in baculovirus-infected Spodoptera frugiperda cells. J Virol (65):1219–1227

Cheung R., Wong, J., et al. (2012): Immobilized metal ion affinity chromatography: a review on its applications. Appl Microbiol Biotechnol (96):1411-1420

Chico E., Jäger, V. (2000): Perfusion culture of baculovirus-infected BTI-Tn-5B1-4 insect cells: A meth-od to restore cell-specific β-trace glycoprotein productivity at high cell density. Biotechnol. Bioeng. (70):574–586

114

Literaturverzeichnis

Chisti Y. (1993): Animal cell culture in stirred bioreactors: Observations on scale-up. Bioprocess Engi-neering (9):191-196

Chisti Y. (2000): Animal-cell damage in sparged bioreactors. Trends in Biotechnology (18):420–432

Chisti Y. (2002). Mass Transfer. In: Encyclopedia of Bioprocess Technology. John Wiley & Sons, Inc

Chitlaru T., Kronman, C., et al. (2002): Overloading and removal of N-glycosylation targets on human acetylcholinesterase: effects on glycan composition and circulatory residence time. Biochem. J. (363):619–631

Cibulka J., Fraiberk, M., et al. (2012): Nuclear Actin and Lamins in Viral Infections. Viruses (4):325–347

Clem R. J. (2001): Baculoviruses and apoptosis: the good, the bad, and the ugly. Cell death and Differen-tiation (8):137–143

Clem R. J., Fechheimer, M., et al. (1991): Prevention of Apoptosis by a Baculovirus Gene During Infec-tion of Insect cells. Science (1991):1388–1390

Contreras-Gómez A., Sánchez-Mirón, A., et al. (2014): Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Prog. (30):1–18

Cowger N. L., O'Connor, K. C., et al. (1997): Influence of simulated microgravity on the longevity of insect-cell culture. Enzyme and microbial technology (20):326–332

Cox M. M. (2012): Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine (30):1759–1766

Cubitt A. B., Heim, R., et al. (1995): Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends in Biochemical Sciences (20):448–455

Cudmore S., Reckmann, I., et al. (1997): Viral manipulations of the actin cytoskeleton. Trends in Micro-biology (5):142–148

Dautzenberg H., Schuldt, U., et al. (1999): Size exclusion properties of polyelectrolyte complex micro-capsules prepared from sodium cellulose sulphate and poly[diallyldimethylammonium chloride]. Journal of Membrane Science (162):165–171

Demain A. L., Vaishnav, P. (2011): 3.29 - Production of Recombinant Proteins by Microbes and Higher Organisms. In: Moo-Young M (ed) Comprehensive Biotechnology (Second Edition). Academic Press, Burlington, pp 333–345

Deutschmann S. M., Jäger, V. (1994): Optimization of the growth conditions of Sf21 insect cells for high-density perfusion culture in stirred-tank bioreactors. Enzyme and microbial technology (16):506–512

Dreschers S., Roncarati, R., et al. (2001): Actin rearrangement-inducing factor of baculoviruses is tyro-sine phosphorylated and colocalizes to F-actin at the plasma membrane. J. Virol. (75):3771–3778

Drugmand J.-C., Schneider, Y.-J., et al. (2012): Insect cells as factories for biomanufacturing. Biotechnol-ogy Advances (30):1140–1157

Durocher Y., Butler, M. (2009): Expression systems for therapeutic glycoprotein production. Chemical biotechnology ● Pharmaceutical biotechnology (20):700–707

Fang M., Nie, Y., et al. (2009): Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus core gene ac96 encodes a per Os infectivity factor (PIF-4). J. Virol. (83):12569–12578

115

Literaturverzeichnis

Ferretto R. M., Leal, D. P., et al. (2009): Validation of a Size-Exclusion LC Method and Assessment of rhEPO in Pharmaceutical Formulations by Liquid Chromatography and Biological Assay. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies (32):1392–1406

Fleming A. (1929): On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae. British Journal of Experimental Pathology (10):226–236

Fraser M. J. (1986): Ultrastructural observations of virion maturation in Autographa californica nucle-ar polyhedrosis virus infected Spodoptera frugiperda cell cultures. Journal of Ultrastructure and Mo-lecular Structure Research (95):189–195

Freshney R. I. (2005): Culture of animal cells. A manual of basic technique, 5th edn. Wiley-Liss, Hobo-ken, N.J

Fuxa J. R. (2004): Ecology of insect nucleopolyhedroviruses. Agriculture, Ecosystems & Environment (103):27–43

Genzel Y., Vogel, T., et al. (2014): High cell density cultivations by alternating tangential flow (ATF) perfusion for influenza A virus production using suspension cells. Vaccine Technology IV (32):2770–2781

Gokana A., Winchenne, J. J., et al. (1997): Chromatographic separation of recombinant human eryth-ropoietin isoforms. Journal of Chromatography A (791):109–118

Gotoh T., Miyazaki, Y., et al. (2001): Proteolytic activity and recombinant protein production in virus-infected Sf-9 insect cell cultures supplemented with carboxyl and cysteine protease inhibitors. Jour-nal of bioscience and bioengineering (92):248–255

Graber S. E., Krantz, S. B. (1978): Erythropoietin and the Control of Red Cell Production. Annual Re-view of Medicine (29):51–66

Gunturi S. R., Ghobrial, I., et al. (2007): Development of a sensitive size exclusion HPLC method with fluorescence detection for the quantitation of recombinant human erythropoietin (r-HuEPO) ag-gregates. J Pharm Biomed Anal (43):213–221

Hammond T., Hammond, J. M. (2001): Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Ameri-can Journal of Physiology - Renal Physiology (281):F12-F25

Handa-Corrigan A., Emery, A. N., et al. (1989): Effect of gas—liquid interfaces on the growth of sus-pended mammalian cells: mechanisms of cell damage by bubbles. Enzyme and microbial technology (11):230–235

Hawtin R. E., Zarkowska, T., et al. (1997): Liquefaction of Autographa californica nucleopolyhe-drovirus-infected insects is dependent on the integrity of virus-encoded chitinase and cathepsin genes. Virology (238):243–253

Heim R., Prasher, D. C., et al. (1994): Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences (91):12501–12504

Hensler W., Agathos, S. (1994): Evaluation of monitoring approaches and effects of culture conditions on recombinant protein production in baculovirus-infected insect cells. Cytotechnology (15):177-186

Hensler W. T., Singh, V., et al. (1994): Sf9 Insect Cell Growth and β-Galactosidase Production in Serum and Serum-free Mediaa. Annals of the New York Academy of Sciences (745):149–166

Henzler H.-J., Schedel, M. (1991): Suitability of the shaking flask for oxygen supply to microbiological cultures. Bioprocess Engineering (7):123-131

116

Literaturverzeichnis

Herniou E. A., Olszewski, J. A., et al. (2003): The genome sequence and evolution of baculoviruses. Annu. Rev. Entomol. (48):211–234

Herniou E. A., Olszewski, J. A., et al. (2004): Ancient Coevolution of Baculoviruses and Their Insect Hosts. Journal of Virology (78):3244–3251

Ho Y., Lo, H.-R., et al. (2004): Enhancement of correct protein folding in vivo by a non-lytic baculovi-rus. Biochem. J. (382):695–702

Hodgson J. J., Arif, B. M., et al. (2013): Role of Interactions between Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus Procathepsin and Chitinase Chitin-Binding or Active-Site Domains in Viral Cathepsin Processing. Journal of Virology (87):3471–3483

Hom L. G., Ohkawa, T., et al. (2002): Autographa californica M Nucleopolyhedrovirus ProV-CATH is Activated during Infected Cell Death. Virology (296):212–218

Horton H. M., Burand, J. P. (1993): Saturable Attachment Sites for Polyhedron-Derived Baculovirus on Insect Cells and Evidence for Entry via Direct Membrane Fusion. Journal of Virology (67):1860–1868

Hu Y. C., Bentley, W. E. (1999): Enhancing yield of infectious Bursal disease virus structural proteins in baculovirus expression systems: focus on media, protease inhibitors, and dissolved oxygen. Bio-technol. Prog. (15):1065–1071

Hu Y.-C., Bentley, W. E. (2000): A kinetic and statistical-thermodynamic model for baculovirus infec-tion and virus-like particle assembly in suspended insect cells. Chemical Engineering Science (55):3991–4008

Hu Y.-C., Tsai, C.-T., et al. (2003): Enhancement and prolongation of baculovirus-mediated expression in mammalian cells: focuses on strategic infection and feeding. Biotechnol Prog (19):373–379

Hübner H. (2007): Cell Encapsulation. In: Pörtner R (ed) Animal Cell Biotechnology. Humana Press, pp 179-191

Huebner H., Buchholz, R. (2002): Microencapsulation. In: Encyclopedia of Bioprocess Technology. John Wiley & Sons, Inc

Huygelen C. (1996): Jenner's cowpox vaccine in light of current vaccinology. Verh K Acad Geneeskd Belg (58):479-536; discussion 537-8

Ikonomou L., Schneider, Y.-J., et al. (2003): Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology (62):1–20

Issaq H., Veenstra, T. (2008): Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE): ad-vances and perspectives. Biotech. (44 Supplement):697–700

Jackson L. R., Trudel, L. J., et al. (1996): Evaluation of hollow fiber bioreactors as an alternative to mu-rine ascites production for small scale monoclonal antibody production. Journal of Immunological Methods (189):217–231

Jacobson L. O., Marks, E. K., et al. (1959): Studies on Erythropoiesis. XI. Reticulocyte Response of Transfusion-Induced Polycythemic Mice to Anemic Plasma from Nephrectomized Mice and to Plasma from Nephrectomized Rats Exposed to Low Oxygen. Blood (14):635–643

Jäger V. (1996): Perfusion bioreactors for the production of recombinant proteins in insect cells. Cy-totechnology (20):191-198

117

Literaturverzeichnis

Jakubowska A. K., Caccia, S., et al. (2010): Downregulation of a Chitin Deacetylase-Like Protein in Response to Baculovirus Infection and Its Application for Improving Baculovirus Infectivity. Jour-nal of Virology (84):2547–2555

Jayaraj R., Smooker, P. M. (2009): So you need a Protein - A Guide to the Production of Recombinant Proteins. The Open Vererinary Science Journal :28

Jehle J. A., Blissard, G. W., et al. (2006): On the classification and nomenclature of baculoviruses: A proposal for revision. Arch Virol (151):1257–1266

Jiang Y., Deng, F., et al. (2008): An extensive analysis on the global codon usage pattern of baculovi-ruses. Arch Virol (153):2273-2282

Johnson R. D., Todd, R. J., et al. (1996): Multipoint binding in metal-affinity chromatography II. Effect of pH and imidazole on chromatographic retention of engineered histidine-containing cyto-chromes c. Journal of Chromatography A (725):225–235

Kasman L. M., Volkman, L. E. (2000): Filamentous actin is required for lepidopteran nucleopolyhe-drovirus progeny production. J Gen Virol (81):1881–1888

Keddie B., Aponte, G., et al. (1989): The pathway of infection of Autographa californica nuclear poly-hedrosis virus in an insect host. Science (243):1728–1730

Kikhno I., Gutiérrez, Serafín, Crozier, Lilian, et al. (2002): Characrterization of pif, a gene required for the per os infectivity of Spodoptera littoralis nucleopolyhedrovirus. Journal of general virology (83):3013–3022

Kioukia N., Nienow, A. W., et al. (1996): Influence of Agitation and Sparging on the Growth Rate and Infection of Insect Cells in Bioreactors and a Comparison with Hybridoma Culture. Biotechnol. Prog. (12):779–785

Knazek R. A., Gullino, P. M., et al. (1972): Cell culture on artificial capillaries: an approach to tissue growth in vitro. Science (178):65–67

Köhler G., Milstein, C. (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. . Nature (256):495–497

Kollewe C., Vilcinskas, A. (2013): Production of recombinant proteins in insect cells. American Journal of Biochemistry and Biotechnology (9):255–271

Krantz S. B. (1991): Erythropoietin. Blood (77):419–434

La Merie Publishing (2014): 2013 Sales of Recombinant Therapeutic Proteins & Antibodies, Stuttgart

Lai P.-H., Everett, R., et al. (1986): Structural Characterization of Human Erythropoietin. Journal of Bio-logical Chemistry (261):3116–3121

Lindenberger C. (2010): Prozessabhängigkeit des Baculovirus-Expressionssystems. Dissertation, Er-langen

Lindskog E., Svensson, I., et al. (2006): A homologue of cathepsin L identified in conditioned medium from Sf9 insect cells. Appl Microbiol Biotechnol (71):444-449

Linke S. P., Clarkin, K. C., et al. (1996): A reversible, p53-dependent G0/G1 cell cycle arrest induced by ribonucleotide depletion in the absence of detectable DNA damage. Genes & Development (10):934–947

Lopez M., Tetaert, D., et al. (1999): O-Glycosylation potential of lepidopteran insect cell lines. Bio-chimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects (1427):49–61

118

Literaturverzeichnis

Luckow V. A., Summers, M. D. (1988): Trends in the Development of Baculovirus Expression Vectors. Nature biotechnology (6):47–55

Lynn D. E. (2007): Available lepidopteran insect cell lines. Methods Mol Biol (388):117–138

Lynn D. E., Hink, W. F. (1978): Infection of synchronized TN-368 cell cultures with alfalfa looper nu-clear polyhedrosis virus. Journal of Invertebrate Pathology (32):1–5

Mahmoud D. A., Helmy, W. A. (2009): Potential Application of Immobilization Technology in En-zyme and Biomass Production (Review Article). Journal of Applied Sciences Research (5):2466–2476

Maiorella B., Inlow, D., et al. (1988): Large-Scale Insect Cell-Culture for Recombinant Protein Produc-tion. Nat Biotech (6):1406–1410

Marek M., Merten, O.-W., et al. (2011): Baculovirus VP80 protein and the F-actin cytoskeleton interact and connect the viral replication factory with the nuclear periphery. J. Virol. (85):5350–5362

Marek M., Merten, O.-W., et al. (2012): Essential C-terminal region of the baculovirus minor capsid protein VP80 binds DNA. J. Virol. (86):1728–1738

Mascotti K., McCullough, J., et al. (2000): HPC viability measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. Transfusion (40):693–696

Mendonça R. Z., Palomares, L. A., et al. (1999): An insight into insect cell metabolism through selective nutrient manipulation. Journal of biotechnology (72):61–75

Mikola M., Seto, J., et al. (2007): Evaluation of a novel Wave Bioreactor cellbag for aerobic yeast culti-vation. Bioprocess Biosyst Eng (30):231–241

Milks M. L., Washburn, J. O., et al. (2003): Deletion of pe38 attenuates AcMNPV genome replication, budded virus production, and virulence in heliothis virescens. Virology (310):224–234

Miller I., Crawford, J., et al. (2006): Protein stains for proteomic applications: which, when, why? Pro-teomics (6):5385–5408

Møller H., Poulsen, J. (2009): Staining of Glycoproteins/Proteoglycans on SDS-Gels. In: Walker J (ed) The Protein Protocols Handbook. Humana Press, pp 569-574

Monsma S. A., Oomens, A. P., et al. (1996): The GP64 Envelope Fusion Protein Is an Essential Bacu-lovirus Protein Required for Cell-to-Cell Transmission of Infection. Journal of Virology (70):4607–4616

Monteiro F., Bernal, V., et al. (2014): Metabolic profiling of insect cell lines: Unveiling cell line deter-minants behind system's productivity. Biotechnol. Bioeng. (111):816–828

Monteiro F., Carinhas, N., et al. (2012): Toward system-level understanding of baculovirus-host cell interactions: from molecular fundamental studies to large-scale proteomics approaches. Front Mi-crobiol (3):391

Morell A. G., Gregoriadis, G., et al. (1971): The role of sialic acid in determining the survival of glyco-proteins in the circulation. J Biol Chem (246):1461–1467

Morgan D. O. (1995): Principles of CDK regulation. Nature (374):131–134

Moscardi F. (1999): ASSESSMENT OF THE APPLICATION OF BACULOVIRUSES FOR CONTROL OF LEPIDOPTERA. Annual review of Entomology :257–289

Mosmann T. (1983): Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to prolif-eration and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods (65):55–63

119

Literaturverzeichnis

Murhammer D. W. (ed) (2007): Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. Humana Press

Nagel A., Koch, S., et al. (1999): Membrane-based cell culture systems-an alternative to in vivo produc-tion of monoclonal antibodies. Development in biological standardization (101):57–64

National Center for Biotechnology Information (US) (2014): Baculoviridae. 64 complete genomes. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi?taxid=10442. Accessed 15 March 2014

Neermann J., Wagner, R. (1996): Comparative analysis of glucose and glutamine metabolism in trans-formed mammalian cell lines, insect and primary liver cells. Journal of Cellular Physiology (166):152–169

Nettleship J. E. (2012): Structural Biology of Glycoproteins. In: Petrescu S (ed) Glycosylation. InTech

Nguyen Q., Nielsen, L., et al. (2013): Genome Scale Transcriptomics of Baculovirus-Insect Interactions. Viruses (5):2721–2747

Oers M. M., Pijlman, G. P., et al. (2014): Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: From dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol.

Ohkawa T., Volkman, L. E., et al. (2010): Actin-based motility drives baculovirus transit to the nucleus and cell surface. J. Cell Biol. (190):187–195

Ohlrogge K. (ed) (2006): Membranen. Grundlagen, Verfahren und industrielle Anwendungen. Wiley-VCH, Weinheim [u.a.]

O'Reilly D. R., Miller, L. K., et al. (1994): The baculovirus expression vectors: a laboratory manual. Oxford University Press

Orive G., Hernández, R. M., et al. (2003): Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. (9):104–107

Palomares L. A., González, M., et al. (2000): Evidence of Pluronic F-68 direct interaction with insect cells: impact on shear protection, recombinant protein, and baculovirus production☆. Enzyme and microbial technology (26):324–331

Passarelli A., Guarino, L. (2007): Baculovirus Late and Very Late Gene Regulation. CDT (8):1103–1115

Passarelli A., Miller, L. K. (1993): Three Baculovirus Genes Involved in Late and Very Late Gene Ex-pression: ie-1, ie-n, and lef-2. Journal of Virology (67):2149–2158

Passarelli A. L. (2011): Barriers to success: how baculoviruses establish efficient systemic infections. Virology (411):383–392

Paul A., Hasan, A., et al.: Bioengineered baculoviruses as new class of therapeutics using micro and nanotechnologies: Principles, prospects and challenges. Advanced Drug Delivery Reviews

Pronker E. S., Weenen, T. C., et al. (2011): The gold industry standard for risk and cost of drug and vaccine development revisited. Vaccine (29):5846–5849

Quah B. J., Warren, H. S., et al. (2007): Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc (2):2049–2056

Rabanel J.-M., Banquy, X., et al. (2009): Progress technology in microencapsulation methods for cell therapy. Biotechnol. Prog. (25):946–963

120

Literaturverzeichnis

Ramirez O. T., Mutharasan, R. (1992): Effect of Serum on the Plasma Membrane Fluidity of Hybrido-mas: An Insight into Its Shear Protective Mechanism. Biotechnol. Prog. :40–50

Raup A. C. (2011): Charakterisierung von NaCS/pDADMAC Hohlkapseln. Diplomarbeit, Erlangen

Rausch M., Knäblein, J., et al. (2010): Influence of Culture Conditions on Insect Cell Growth and Pro-tein Production – Comparison of Wave Bioreactor and Shake Flasks. In: Noll T (ed) Cells and Cul-ture. Springer Netherlands, pp 319-324

Reed L., Muench, H. (1938): A Simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology (27):493–497

Reinwarth M., Nasu, D., et al. (2012): Chemical Synthesis, Backbone Cyclization and Oxidative Fold-ing of Cystine-knot Peptides — Promising Scaffolds for Applications in Drug Design. Molecules (17):12533–12552

Reuveny S., Kemp, C. W., et al. (1992): Carbohydrate Metabolism in Insect Cell Cultures during Cell Growth and Recombinant Protein Production. Annals of the New York Academy of Sciences (665):230–237

Rhiel M., Mitchell-Logean, C. M., et al. (1997): Comparison of Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4 (high five[trade]) and Spodoptera frugiperda Sf-9 insect cell line metabolism in suspension cultures. Bio-technol. Bioeng. (55):909

Rohrmann G. F. (2001): Baculovirus Molecular Biology: Second Edition [Internet]. The AcMNPV ge-nome: Gene content, conservation and function, 2nd edn. National Center for Biotechnology In-formation (US), Bethesda

Roncarati R., Knebel-Mörsdorf, D. (1998): Identification of the Early Actin-Rearrangement-Inducing Factor Gene, arif-1, from Autographa californica Multicapsid Nuclear Polyhedrosis Virus. J Virol (72):888-889

Rosenberg I. M. (2005): Protein analysis and purification. Benchtop techniques, 2nd edn. Birkhäuser, Boston

Rudd P. M., Wormald, M. R., et al. (1999): Roles for glycosylation of cell surface receptors involved in cellular immune recognition. Journal of Molecular Biology (293):351–366

Sander L., Harrysson, A. (2007): Using cell size kinetics to determine optimal harvest time for Spodop-tera frugiperda and Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 cells infected with a baculovirus expression vec-tor system expressing enhanced green fluorescent protein. Cytotechnology (54):35-48

Schaffellner S., Stadlbauer, V., et al. (2005): Porcine islet cells microencapsulated in sodium cellulose sulfate. Transplantation Proceedings (37):248–252

Schmid G. (1996): Insect cell cultivation: growth and kinetics. Cytotechnology (20):43–56

Schneider M., Reymond, F., et al. (1995): Bubble-free oxygenation by means of hydrophobic porous membranes. Enzyme and microbial technology (17):839–847

Serp D., Cantana, E., et al. (2000): Characterization of an encapsulation device for the production of monodisperse alginate beads for cell immobilization. Biotechnol. Bioeng. (70):41–53

Shen H., Chen, K. (2012): BM61 of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus: its involvement in the egress of nucleocapsids from the nucleus. FEBS Lett. (586):990–995

Shental-Bechor D., Levy, Y. (2008): Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermo-dynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (105):8256–8261

121

Literaturverzeichnis

Singh V. (1999): Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology (30):149-158

Smith G. E., Fraser, M. J., et al. (1983): Molecular Engineering of the Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus Genome: Deletion Mutations Within the Polyhedrin Gene. Journal of Virology (46):584–593

Son J. H., Buchholz, R., et al. (2006): Production of baculoviruses and expression of green fluorescent protein in immobilised Sf21 insect cell cultivation. Recent Advances of Biochemical Engineering in Bi-oproduction and Biomedical Engineering (29):55–61

Szewczyk B., Hoyos-Carvajal, L., et al. (2006): Baculoviruses — re-emerging biopesticides. Biotechnolo-gy Advances (24):143–160

Terpe K. (2003): Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol (60):523-533

Vaughn J. L., Goodwin, R. H., et al. (1977): The establishment of two cell lines from the insectspodop-tera frugiperda (lepidoptera; noctuidae). In Vitro (13):213-217

Volkman L. (2007): Baculovirus Infectivity and the Actin Cytoskeleton. CDT (8):1075–1083

Volkman L. E. (1988): Autographa californica MNPV nucleocapsid assembly: Inhibition by cyto-chalasin D. Virology (163):547–553

Wagner B. A., Venkataraman, S., et al. (2011): The rate of oxygen utilization by cells. Free Radical Biolo-gy and Medicine (51):700–712

Walker J. M. (2005): The proteomics protocols handbook. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. Humana Press, Totowa, N.J.

Wang P., Granados, R. R. (1997): An intestinal mucin is the target substrate for a baculovirus enhancin. Proceedings of the National Academy of Sciences (94):6977–6982

Watson J. D., Crick, F. H. (1953): Molecular Structure of Nucleic Acids. Nature :737–738

Watson J. V., Chambers, S. H., et al. (1987): A pragmatic approach to the analysis of DNA histograms with a definable G1 peak. Cytometry (8):1–8

Weber W., Weber, E., et al. (2002): Optimisation of protein expression and establishment of the Wave Bioreactor for Baculovirus/insect cell culture. Cytotechnology (38):77-85

Wittmann V., Danishefsky, S. J. (2007): Glycopeptides and glycoproteins. Synthesis, structure, and application. Springer, Berlin, New York

Wolfe S. P., Hsu, E., et al. (2002): A novel multi-coaxial hollow fiber bioreactor for adherent cell types. Part 1: Hydrodynamic studies. Biotechnology and bioengineering (77):83–90

Wong J. W., Albright, R. L., et al. (1991): Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography (IMAC) Chemistry and Bioseparation Applications. Separation & Purification Reviews (20):49–106

Woods R. J. (2014): Predicted structure of glycosylated human Erythropoietin. http://glycam.ccrc.uga.edu/ccrc/. Accessed 8 April 2014

Wu J.-Y., Goosen, M. A. (1996): Immobilization of insect cells. Cytotechnology (20):199-208

Wu X., Zhao, S., et al. (2014): Encapsulation of EV71-specific IgY antibodies by multilayer polypeptide microcapsules and its sustained release for inhibiting enterovirus 71 replication. RSC Adv. (4):14603

122

Literaturverzeichnis

Wurm F. M. (2004): Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. (22):1393–1398

Xu H., Yao, L., et al. (2007): Host Filamentous Actin Is Associated with Heliothis armigera Single Nu-cleopolyhedrosis Virus (HaSNPV) Nucleocapsid Transport to the Host Nucleus. Curr Microbiol (54):199-206

Yamaji H., Manabe, T., et al. (2006): Efficient production of recombinant protein in immobilized insect cell culture using serum-free basal media after baculovirus infection. Biochemical engineering journal (28):67–72

Yamaji H., Tagai, S.-I., et al. (2000): Production of recombinant protein by baculovirus-infected insect cells in immobilized culture using porous biomass support particles. Journal of bioscience and bioen-gineering (89):12–17

Zhou G. H., Luo, G. A., et al. (1998): Application of capillary electrophoresis, liquid chromatography, electrospray-mass spectrometry and matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight - mass spectrometry to the characterization of recombinant human erythropoietin. Electrophoresis (19):2348–2355

123

Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis Abbildung 2-1: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Nucleocapsiden 3 Abbildung 2-2: Replikationszyklus des Baculovirus 4 Abbildung 2-3: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Capsiden 5 Abbildung 2-4: Schematische Darstellung einer generellen Aufreinigungsstrategie 10 Abbildung 2-5: Darstellung der konservierten Kernstruktur von N-Glykanen 11 Abbildung 2-6: Beispielhafte Darstellung der verschiedenen Arten der N-Glykanstrukturen 11 Abbildung 2-7: Darstellung der Kernstrukturen von O-Glykanen 12 Abbildung 2-8: Räumliche Darstellung von Erythropoietin 13 Abbildung 2-9: N-Glykosylierungspattern von Expressionssystemen 14 Abbildung 2-10: Zerplatzen einer Gasblase an der Fluidoberfläche 16 Abbildung 2-11: rotating wall reactor 17 Abbildung 2-12: Schematische Darstellung des wave reactors 18 Abbildung 2-13: Aufbau eines Hohlfasermoduls 19 Abbildung 4-1: Fließschema zur Verdrängungsmessung im HFR 27 Abbildung 4-2: Schematischer Aufbau eines Hohlfaserreaktors 28 Abbildung 4-3: Reaktorperipherie für HFR 1 bis 3 28 Abbildung 4-4: Reaktorperipherie für HFR 4 29 Abbildung 4-5: Messaufbau zur Bestimmung der Sauerstoffaufnahmerate 31 Abbildung 4-6: Schema des Messaufbaus zur Bestimmung des pO2-Profils über die Kapsel 32 Abbildung 5-1: Wachstumscharakterisierung von Sf 21 Suspensionszellen 45 Abbildung 5-2: Messung der Sauerstoffaufnahmerate von Sf 21 Suspensionszellen 46 Abbildung 5-3: Herstellung eines Virusstocks mit Suspensionszellen 48 Abbildung 5-4: Suspensionskultivierung unter Variation des MOI 48 Abbildung 5-5: GFP-Fluoreszenz einer Sf 21 Suspensionskultivierung bei Variation des MOI 50 Abbildung 5-6: Kultivierung von Sf 21 in Suspension mit Proteaseinhibitor 51 Abbildung 5-7: Untersuchung der EPO-Produktion bei Zugabe von Proteaseinhibitor 52 Abbildung 5-8: GFP-Fluoreszenz einer infizierten Sf 21 Suspensionskultivierung 53 Abbildung 5-9: EPO Konzentration im Überstand einer infizierten Kultur bei Zugabe von PI 54 Abbildung 5-10: Wachstumsverlauf verkapselter Zellen mit Variation der fed-batch Strategie 55 Abbildung 5-11: Bewachsen der Kapseln von nicht infizierten Sf 21 56 Abbildung 5-12: Infektion einer verkapselten Sf 21 Kultur über die Kapselmembran 57 Abbildung 5-13: Kultivierung von vor dem Verkapseln infizierten Sf 21 58 Abbildung 5-14: Mikroskopische Betrachtung von infizierten Kapseln 58 Abbildung 5-15: Durchflusszytometrische Identifizierung von GFP-positiven Sf 21 Zellen 59 Abbildung 5-16: Kultivierung von infizierten und verkapselten Zellen 60 Abbildung 5-17: Mikroskopische Beobachtung von infizierten Kapseln 60 Abbildung 5-18: Mikroskopische Beobachtung von infizierten Kapseln 61 Abbildung 5-19: Verweilzeitverteilung für Hohlfaserreaktor Typ 4 62 Abbildung 5-20: Anwendung des Kompartmentmodells für Reaktor Typ 4 63 Abbildung 5-21: Messung des Sauerstoffbedarfs einer Sf 21-Kultur im HFR Typ 1 64 Abbildung 5-22: Kultivierung in HFRen mit Variation der Flussrate bzw. der Startzellzahl 65 Abbildung 5-23: Zellzyklusmessung nach Synchronisierung einer Sf 21 Suspensionskultur 66 Abbildung 5-24: CFDA-SE Färbung von Sf 21 Suspensionszellen 67 Abbildung 5-25: Kultivierung von Sf 21 im HFR Typ 4 68 Abbildung 5-26: CFDA-SE Färbung bei Kultivierung der Sf 21 im HFR Typ 4 69 Abbildung 5-27: Kultivierung von infizierten Sf 21 im HFR Typ 4 70

124

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 5-28: Identifizierung von GFP-positiven Zellen 70 Abbildung 5-29: Darstellung des EPO Dot-Blots 72 Abbildung 5-30: Invertierte Chemilumineszenz-Aufnahme eines Western-Blots 72 Abbildung 5-31: SDS-Gel der IMAC-Fraktionen mit losem Säulenmedium 73 Abbildung 5-32: Westernblot der IMAC-Fraktionen mit losem Medium 74 Abbildung 5-33: IMAC-Chromatogramm mit Darstellung der relevanten Parameter 75 Abbildung 5-34: IMAC-Chromatogramm zum Säulenvergleich 76 Abbildung 5-35: SDS-Gel der IMAC-Elutionsfraktionen 76 Abbildung 5-36: IMAC-Chromatogramm zum Säulenvergleich 77 Abbildung 5-37: SDS-Gel der IMAC-Elutionsfraktionen 78 Abbildung 5-38: EPO-Konzentration in Schritten der IMAC 78 Abbildung 5-39: IMAC-Chromatogramm zum Säulenvergleich 79 Abbildung 5-40: Western-Blot nach IMAC 80 Abbildung 5-41: Con A-Chromatogramm 81 Abbildung 5-42: SDS-Gel der Con A Elutionsfraktionen 81 Abbildung 6-1: Trypanblau-Zählung von verkapselten Zellen 82 Abbildung 6-2: Einfluss des Systemdrucks auf die Sauerstoffmessungen 84 Abbildung 7-1: Darstellung der Immobilisierung von Nickelionen an die Säulenmatrix 87 Abbildung 7-2: SDS-Page einer chromatographischen Proteinreinigung 88 Abbildung 7-3: Vergleich der Protein-Spots im 2d-Gel 89 Abbildung 7-4: Darstellung der berechneten Glutaminkonzentration 94 Abbildung 7-5: Poissonverteilung 98 Abbildung 7-6: Bestimmung des cutoffs der Kapselmembran 101 Abbildung 7-7: Laktatproduktion im HFR 107 Abbildung 7-8: Sauerstoffprofil in einer Kapsel 109 Abbildung 7-9: Simulation des Sauerstoffgradienten in der Kapsel 109 Abbildung 9-1: Suspensionskultivierung zur Bestimmung der Wachstumsrate 133 Abbildung 9-2: Evaluierung der Kreuzreaktivität des anti-EPO ELISA 133 Abbildung 9-3: Konzentration an Cathepsin L 134 Abbildung 9-4: Kultivierung von vor dem Verkapseln infizierten Sf 21 134 Abbildung 9-5: Verweilzeitverteilung für Hohlfaserreaktor Typ 2 135 Abbildung 9-6: Anwendung des Kompartmentmodells für Reaktor Typ 2 135 Abbildung 9-7: Bestimmung des kl,a im Rührkesselreaktor 136 Abbildung 9-8: EPO-Produktion im Hohlfaserreaktor 136 Abbildung 9-9: Kalibrierkurve des anti EPO ELISA 137 Abbildung 9-10: Kalibrierkurve des anti Cathepsin L ELISA 137 Abbildung 9-11: Bradford-Kalibrierung 138 Abbildung 9-12: Bradford-Kalibrierung 138 Abbildung 9-13: Pumpenkalibrierung 139 Abbildung 9-14: Pumpenkalibrierung 139 Abbildung 9-15: Anti-His ELISA 140 Abbildung 9-16: Western-Blot nach IMAC mit HisTrap excel 141

125

Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis Tabelle 2-1: Vergleich der Produktivität verschiedener Organismen 9 Tabelle 2-2: Verschiedene Tags zur Aufreinigung rekombinanter Proteine 10 Tabelle 4-1: Auswertung des TCID50 nach der Methode von Reed und Muench 24 Tabelle 4-2: Charakteristika und Benennung der verwendeten Hohlfaserreaktoren 26 Tabelle 4-3: Pipettierschema der Bestimmung der Laktatkonzentration im Kulturmedium 34 Tabelle 4-4: Spannungsprotokoll für die isoelektrische Fokussierung 36 Tabelle 4-5: Standardverdünnungsreihe für die interne Kalibrierung des EPO-ELISA 38 Tabelle 4-6: Standardverdünnungsreihe für die interne Kalibrierung des Cathepsin-ELISA 38 Tabelle 4-7: Standardverdünnungsreihe für den Bradford-Assay 40 Tabelle 4-8: Standardverdünnungsreihe für den Bradford-Assay 40 Tabelle 4-9: Schritte in der IMAC- Affinitätschromatographie 42 Tabelle 4-10: Zusammenfassung der IMAC-Säulen und Puffersysteme 42 Tabelle 4-11: Schritte in der Con A Affinitätschromatographie 43 Tabelle 5-1: Vergleich der Wachstumsraten bzw. Verdopplungszeiten in Suspensionskultur 45 Tabelle 5-2: Sauerstoffabnahme sowie resultierendes q20T 47 Tabelle 5-3: Vergleich der Wachstumsraten und Vitalität bei Variation des MOI 49 Tabelle 5-4: Zusammenfassung der statistischen Auswertung der GFP-positiven events 50 Tabelle 5-5: Auswertung der GFP-positiven (infizierten) events an den Prozesstagen 53 Tabelle 5-6: Zusammenfassung der Wachstumsdaten der verkapselten Sf 21 55 Tabelle 5-7: Auswertung des Kompartmentmodells für HFR 63 Tabelle 5-8: Parameter bzw. Spezifikationen für die Kultivierung in HFR-Typ 1 bis 3 65 Tabelle 5-9: Zellzyklusanalyse der Sf 21 66 Tabelle 5-10: Pipettierschema der Dot-Blot Optimierung 71 Tabelle 5-11: EPO-Konzentration während der IMAC 80 Tabelle 7-1: Leitfähigkeit verschiedener Puffersysteme 87 Tabelle 7-2: Vergleich der Sauerstoffaufnahmeraten von Insektenzelllinien 90 Tabelle 7-3: Vergleich der Wachstumscharakteristik von Insektenzellen 92 Tabelle 7-4: Vergleich der Wachstumscharakteristik immobilisierter Insektenzellen 95 Tabelle 7-5: Vergleich der Wachstumscharakteristika infizierter Zellen 97 Tabelle 7-6: Vergleich der Infektionsrate nach der Poissonverteilung 99 Tabelle 7-7: Vergleich der EPO-Produktion pro Zelle 103 Tabelle 7-8: EPO-Herstellung im Gesamtprozess 104 Tabelle 7-9: Vergleich volumetrischer Proteinproduktionraten PV,max 110 Tabelle 9-1: Alternative Probenvorbereitung zur Durchführung der IMAC 140 Tabelle 9-2: Phosphat-Buffered Saline Puffer (PBS) 142 Tabelle 9-3: Phosphat-Buffered Saline Puffer (PBS) 142 Tabelle 9-4: DNA-Puffer 142 Tabelle 9-5: Isotonische Kochsalzlösung 142 Tabelle 9-6: Trypanblau-Lösung 142 Tabelle 9-8: RNAse-Lösung 142 Tabelle 9-9: p(DADMAC)-Lösung 143 Tabelle 9-10: NaCS-Lösung 143 Tabelle 9-11: CFDA-SE-Lösung 143 Tabelle 9-12: Carbonat-Puffer 143 Tabelle 9-13: Resorufin-Stocklösung 143 Tabelle 9-14: Propidiumiodid-Lösung 143

126

Tabellenverzeichnis

Tabelle 9-15: Hydroxyharnstoff-Stocklösung 143 Tabelle 9-16: Strippuffer zur Regenerierung der HisTrap FF crude 143 Tabelle 9-17: Nickelsulfatlösung zur Regenerierung der HisTrap FF crude Säule 143 Tabelle 9-18: MES-Puffer zur Regenerierung der HiTrap Talon crude Säule 144 Tabelle 9-19: Strippuffer zur Regenerierung der HiTrap Talon crude Säule 144 Tabelle 9-20: Cobaltchloridlösung zum Regenerieren der HiTrap Talon crude Säule 144 Tabelle 9-21: Regenerierungspuffer für die HiTrap Con A 4B Säule 144 Tabelle 9-22: Bindepuffer für die HiTrap Con A 4B Säule 144 Tabelle 9-23: Lagerungspuffer für die HiTrap Con A 4B Säule 144 Tabelle 9-24: Lysepuffer zum Zellaufschluss von Zellpellets 144 Tabelle 9-25: Formulierung für 1 SDS-Trenngel 145 Tabelle 9-26: Formulierung für 1 SDS-Sammelgel 145 Tabelle 9-27: SDS-Gel-Probenpuffer 145 Tabelle 9-28: Laufpuffer für SDS-Gelelektrophorese 145 Tabelle 9-29: Fixierlösung für Coomassie Blau Färbung 145 Tabelle 9-30: Coomassie Blau Färbelösung 146 Tabelle 9-31: Fixier-Lösung für Silberfärbung 146 Tabelle 9-32: Sensitivierungs-Lösung für Silberfärbung 146 Tabelle 9-33: Silbernitrat-Lösung für Silberfärbung 146 Tabelle 9-34: Entwickler-Lösung für Silberfärbung 146 Tabelle 9-35: Stopp-Lösung für Silberfärbung 146 Tabelle 9-36: Towbin-Puffer für Westernblot 146 Tabelle 9-37: Ponceau S Färbelösung 146 Tabelle 9-38: Tris buffered saline (TBS) für Westernblot 147 Tabelle 9-39: Blocking-Puffer für Westernblot mit BSA 147 Tabelle 9-40: Blocking-Puffer für Westernblot mit Milchpulver 147 Tabelle 9-41: Rehydratisierungspuffer 147 Tabelle 9-42: Equilibrierpuffer zur Reduzierung und Alkylierung 147 Tabelle 9-43: Imidazol-Stocklösung 147 Tabelle 9-44: Coating Puffer für Anti-His ELISA 147 Tabelle 9-45: Waschpuffer für Anti-His ELISA 147 Tabelle 9-46: Phosphatpuffer für die Affinitätschromatographie 148 Tabelle 9-47: Tris-Puffer für die Affinitätschromatographie 148 Tabelle 9-48: Denaturierender Puffer für die Affinitätschromatographie 148 Tabelle 9-49: Waschpuffer für Con A Aufreinigung 148 Tabelle 9-50: Elutionspuffer für Con A Aufreinigung 148 Tabelle 9-52: Eingesetzte Antikörper 149 Tabelle 9-53: Spezifikation der eingesetzten Antikörper 149 Tabelle 9-54: Eingesetzte Kitsysteme 149 Tabelle 9-55: In der Affinitätschromatographie verwendete Säulen 149 Tabelle 9-56: Spezifikationen der verwendeten Säulen 150

127

Formelverzeichnis

Formelverzeichnis Formel 2-1 15 Formel 2-2 15 Formel 4-1 34 Formel 4-2 34 Formel 4-3 39 Formel 5-1 62 Formel 5-2 68 Formel 7-1 91 Formel 7-2 93 Formel 7-3 93 Formel 7-4 93 Formel 7-5 94 Formel 7-6 98 Formel 7-7 105 Formel 7-8 106 Formel 7-9 106 Formel 7-10 108 Formel 7-11 108 Formel 7-12 108

128

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis AcMNPV Autographa californica Multicapsid Nucleopolyhedrovirus

APS Ammoniumperoxodisulfat

BSA bovines Serum Albumin

BV budded virion

BVES Baculovirusexpressionssystem

CBB Coomassie Brilliant Blue

CFDA-SE carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester

CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-propan-sulfonat

Con A Concanavalin A

CS Cellulosesulfat

D-GPT D-Glutamat-Pyruvat-Transaminase

D-LDH Laktat-Dehydrogenase

DNA Desoxyribunukleinsäure

DNAse Desoxyribonuklease

DTT Dithiothreitol

EGF Epidermaler Wachstumsfaktor

EKR Extrakapillarraum

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

FCS Fötales Kälberserum

g.i. gene of interest

Gal Galaktose

GalNAc N-Acetylgalaktosamin

GFP green fluorescent Protein

GlcNAc N-Acetyl-D-Glukosamin

GP64 glycoprotein 64

GV Granulovirus

HFR Hohlfaserreaktor

HRP Horse Raddish Peroxidase

HRP horse raddish peroxidase

ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses

IEF isoelektrische Fokussierung

IMAC immobilisierte Metallchelat Affinitätschromatographie

KR Kapillarraum

MALDI matrix-assisted laser desorption/ionisation

Man Mannose

MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure

129

Abkürzungsverzeichnis

MOI multiplicity of infection

MOIH Anteil der infizierten Zellen beim Animpfen des HFR

MOIK Anteil der infizierten Zellen pro Kapsel bei Verkapselung

mPES modifiziertes Polyethersulfon

MWCO molecular weight cutoff

NaCS Natriumcellulosesulfat

NADH/H+ Nicotinamdadenindinukleotid

NPV Nuclear Polyhedrosis virus

OB Occlusion body

ODV Occlusion derived virion

p(DADMAC) Polydiallyldimethylammoniumchlorid

p.i. post infection

PAS periodic acid-Schiff

PBS Phosphate Buffered Saline

pcd peak cell density

PEPO EPO Produktionsrate

PFTR plug flow tubular reactor

pfu plug forming units

PI Proteaseinhibitor

pif per os infectivity factors

PJ Propidiumjodid

pO2 Sauerstoffpartialdruck

POM Polyoxymethylen

PS Polysulfon

RNA Ribonukleinsäure

RNAse Ribonuklease

RT Raumtemperatur

rwr rotating wall reactor

SA Protein-Größenstandard

Sf Spodoptera frugiperda

STR stirred tank reactor

TCID50 tissue culture infected dose 50

TEMED Tetramethylethylendiamin

TEV Tobacco Etch Virus

TMB Tetramethyl-Benzidin

TOF time of flight

TOI time of infection

130

Abkürzungsverzeichnis

VE Voll entsalzt

VWZ Verweilzeitverteilung

WT Wildtyp

Formelzeichen mit Einheiten Q̇O2 Stofftransport Sauerstoff mol∙l-1∙h-1

∆pO2 Differenz Sauerstoffpartialdruck %

cO2* Konzentration O2 in Zuluft mol∙l-1

cO2,R,A Sauerstoffkonzentration Reaktorausgang mmol∙l-1

cO2,R,E Sauerstoffkonzentration Reaktoreingang mmol∙l-1

cO2 Konzentration Luftsauerstoff mmol∙ml-1

cO2 Sauerstoffkonzentration mol∙l-1

cO20 Konzentration O2 im Medium zu Beginn der Messung mol∙l-1

c1,O2 Sauerstoffkonzentration an Position 1 mmol∙l-1

c2,O2 Sauerstoffkonzentration an Position 2 mmol∙l-1

clim., F,A Konzentration Sauerstoff Faser, außen mmol∙l-1

clim., F,I Konzentration Sauerstoff Faser, innen mmol∙l-1

DO2,l Diffusionskoeffizient Sauerstoff in Wasser cm²∙s-1

JO2 Stoffstromdichte Sauerstoff mol∙s-1

kl,a Stoffübergangskoeffizient min-1

q̇ zellspezifische Sauerstoffaufnahmerate mmol∙min-1∙Z-1

r1,i Position 1 auf dem Kapselradius cm

r2,i Position 2 auf dem Kapselradius cm

V̇ Volumenstrom ml∙min-1

∆cO2 Differenz der Sauerstoffkonzentration mmol∙l-1

µmax maximale Wachstumsrate d-1

A Flächenintegral unter der Wachstumskurve Z∙h∙ml-1

a Spezifische Kapseloberfläche m-1

AK Kapseloberfläche mm²

d Durchmesser m

dB Blasendurchmesser m

dT Reaktorbreite m

e Exzentrizität m

F(Θ) Summenfunktion der Verweilzeitverteilung -

g Erdbeschleunigung m∙s²

hL Fluidhöhe m

131

Abkürzungsverzeichnis

kd spezifischer Sterbeterm -

L Länge der Hohlfasern cm

MOI Multiplicity of Infektion -

n Frequenz der Blasenbildung s-1

N Stoffmenge mol

n Rotationsgeschwindigkeit min-1

NV Anzahl der infektiösen Viren, die eine Zelle treffen -

OTR Oxygen Transfer Rate mol∙l-1∙min-1

OUR Oxygen Uptake Rate mol∙l-1∙min-1

P Wahrscheinlichkeit, dass keine Infektion stattfindet %

pcd peak cell density Z∙ml-1

PV,max volumetrische Produktionsrate mg∙l-1

Q Volumetrische Begasungsrate vvm

r Kapselradius mm

rA Radius Faser, außen mm

rI Radius Faser, innen mm

t Zeit h

td Verdopplungszeit d

VF Füllvolumen m³

VK Hypothetische Turbulenzzone m³

VK Kapselvolumen mm³

VKR Volumen des Kapillarraums ml

Vm Volumenanteil STR ml

Vp Volumenanteil PFTR ml

VWZKR Verweilzeit im Kapillarraum min

X Zellkonzentration Z∙ml-1

z Anzahl der Hohlfasern -

ZZ Zellzahl Z

ε molarer Extinktionskoeffizient l∙mol-1∙cm-1

Θ dimensionslose Zeit -

ϑ kinematische Viskosität kg∙s-1∙m-1

λ Zerfallsrate (Halbwertszeit-1) h-1

π Kreiszahl -

132

Anhang

9 Anhang

9.1 Weitere Daten

9.1.1 Suspensionskultivierung

0 2 4 6 8

106

107

Ze

llzah

l in

-1

Prozesszeit in d

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

Abbildung 9-1: Suspensionskultivierung zur Bestimmung der Wachstumsrate mit Auftragung der Zellkonzent-

rationen und Vitalitäten der Sf 21 von batch-Ansätzen der Startzellkonzentrationen 4,6 5 ( ), 5,6 ( ) sowie 6,0 105 -1

9.1.2 ELISA

1 2 30

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

EPO

-Kon

zent

ratio

n in

mIU

-1

Prozesszeit in d

Abbildung 9-2: Evaluierung der Kreuzreaktivität des anti-EPO ELISA durch Auftragung der falsch-positiven EPO-Konzentration nach Infektion der Sf 21 mit Wildtyp Virus über die Prozesszeit.

133

Anhang

1 2 3 40,0

0,3

0,5

0,8

1,0

1,3

Cath

epsin

Kon

zent

ratio

n in

mIU

-1

Prozesszeit in d

Abbildung 9-3: Konzentration an Cathepsin L nach Infektion der Sf 21 mit EPO-Virus über die Prozesszeit.

9.1.3 Immobilisierung in Kapseln

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

105

106

107

108

Zellz

ahl i

n -1

Prozesszeit in d

0

20

40

60

80

100

Vita

lität

in %

Abbildung 9-4: Kultivierung von vor dem Verkapseln infizierten Sf 21 . Darstellung der Wachstumsverläufe

sowie der Vitalitäten einer Kontrollkultur ( ) sowie von infizierten Zellen mit MOI 0,004 ( ) über die Prozesszeit.

134

Anhang

9.1.4 Immobilisierung im HFR

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

0,0

0,5

1,0

F()

Dimensionslose Zeit

Abbildung 9-5: Verweilzeitverteilung für Hohlfaserreaktor Typ 2. Auftragung der Verweilzeitsummenformel über die dimensionslose Zeit von Verdrängungsmessungen der Reaktorperipherie sowie der Peripherie mit HFR .

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

0,0

0,3

0,5

0,8

1,0

1-F(

)

Dimensionslose Zeit

Abbildung 9-6: Anwendung des Kompartmentmodells für Reaktor Typ 2; Darstellung der Verweilzeitvertei-lung (1- und der berechneten Modellkurve .

135

Anhang

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

0102030405060708090

100

Saue

rsto

ffsät

tigun

g in

%

Zeit in min

Abbildung 9-7: Bestimmung des kl,a im Rührkesselreaktor durch die Ausgasungsmethode mit Stickstoff in Auftragung der Sauerstoffsättigung über der Prozesszeit.

0 5 10 15 20 250

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

EPO

Kon

zent

ratio

n in

mIU

-1

Prozesszeit in d

Abbildung 9-8: EPO-Produktion im Hohlfaserreaktor; Angabe der EPO-Konzentration im Extrakapillarraum

und im Kapillarraum .

136

Anhang

9.1.5 Kalibrierkurven

0,1 1 10 100

0

1

2

3

Abs

orpt

ion

450

nm

Konzentration EPO-Standard in mIU⋅ml-1

Abbildung 9-9: Kalibrierkurve des anti EPO ELISA bei einer Absorption von 450 nm mit einer Verdünnung an

EPO-Standards.

1 100

1

2

3

4

Abs

orpt

ion

450

nm

Cathepsin L Standard in mIU⋅ml-1

Abbildung 9-10: Kalibrierkurve des anti Cathepsin L ELISA bei einer Absorption von 450 nm mit einer Verdün-

nung an Cathepsin L-Standards.

137

Anhang

0 500 1000 1500 20000,0

0,3

0,5

0,8

1,0

1,3

1,5

1,8

2,0

Abs

orpt

ion

595

nm

BSA-Standard in µg

Abbildung 9-11: Bradford-Kalibrierung für den Bereich von 0-2000 µg BSA-Standard.

0 10 20 300,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Abs

orpt

ion

595

nm

BSA-Standard in µg

Abbildung 9-12: Bradford-Kalibrierung für den Bereich von 2-25 µg BSA-Standard.

138

Anhang

0 25 50 75 100 125 150 175

0

25

50

75

100

125

150

175

Vol

umen

stro

m in

ml

Pumpeneinstellung in ml

Abbildung 9-13: Pumpenkalibrierung der Masterflex-Pumpe; Auftragung des Volumenstroms der Pumpenein-stellung.

0 25 50 75 100

02468

101214161820

Vol

umen

stro

m in

ml

Pumpeneinstellung in SKT

Abbildung 9-14: Pumpenkalibrierung der Ismatec REGLO; Auftragung des Volumenstroms über Skalenteilen.

139

Anhang

9.1.6 Proteinanalytik

Tabelle 9-1: Alternative Probenvorbereitung zur Durchführung der IMAC

K1 K2 K3 K4

Vor

bere

i-tu

ng

pH 7,4 7,4 7,4 6,5

Imidazol 20 mM - 20 mM -

Entsalzt - - in Waschpuffer -

Puffe

r pH WP 7,4 7,4 7,4 6,5

pH EP 8,0 8,0 8,0 6,5

B W1 W2 E1 E20,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Abs

orpt

ion

450

nm

Proben

Abbildung 9-15: Anti-His ELISA der Fraktionen nach dem Binden (B) des Proteins an das lose Säulenmaterial

sowie nach den Waschschritten W1 und W2 bzw. den Elutionsschritten E1 und E2 zur Qualifi-zierung der Parameter zur Proteinaufreinigung. Auftragung der Proben K1 , K2 , K3

K4 .

140

Anhang

Abbildung 9-16: Western-Blot nach IMAC mit mit Proben des denaturierten Laufes mit aufge-

schlossenem Pellet vor (1) bzw. nach der Denaturierung (2), Durchlauf der Chromatographie (3 und 4), Waschen der Säule (Ende 5 und Anfang 6), Elution (Fr 9 und 10; 7 und 8) sowie SA (9).

141

Anhang

9.2 Puffer und Lösungen

9.2.1 Zellkultur

Tabelle 9-2: Phosphat-Buffered Saline Puffer (PBS) pH 6,3

NaCl 136,9 mM

KCl 2,7 mM

Na2HPO4 3,2 mM

in VE-Wasser lösen, mit KH2PO4 auf pH 6,3 einstellen

Tabelle 9-3: Phosphat-Buffered Saline Puffer (PBS) pH 7,4

NaCl 136,9 mM

KCl 2,7 mM

Na2HPO4 8,1 mM

KH2PO4 1,5 mM

In VE-Wasser lösen, mit HCl oder NaOH auf pH 7,4 einstellen

Tabelle 9-4: DNA-Puffer

TRIS-base 100 mM

NaCl 160 mM

CaCl2 1,05 mM

MgCl2 5 mM

BSA 2 g·l-1

Igepal 1 %v/v

in Reinstwasser lösen, mit 2 M HCl auf pH 7,4 einstellen

Tabelle 9-5: Isotonische Kochsalzlösung

NaCl 0,9 %w/v

in VE-Wasser lösen

Tabelle 9-6: Trypanblau-Lösung

Trypanblau 0,4 %v/v

in Kochsalzlösung

Tabelle 9-7: Zellulase-Lösung

Zellulase 2 %w/v

in Medium lösen

Tabelle 9-8: RNAse-Lösung

RNAse 0,2 %w/v

in PBS, pH 7,4 lösen und zum Inaktivieren von DNAsen 15 min kochen

142

Anhang

Tabelle 9-9: p(DADMAC)-Lösung

p(DADMAC) 20 % 6 %w/v

Tween 20 1 Tropfen

in PBS 6,3

Tabelle 9-10: NaCS-Lösung

NaCS 1,9 %w/v

in PBS 6,3

Tabelle 9-11: CFDA-SE-Lösung

CFDA-SE 1 mM

in DMSO lösen; zum Einsatz auf 30 µM in PBS pH 6,3 verdünnen und steril filtrieren

Tabelle 9-12: Carbonat-Puffer pH 10

NaHCO3 0,05 M

mit 0,01 M NaOH auf pH 10 einstellen

Tabelle 9-13: Resorufin-Stocklösung

Resorufin 0,05 %w/v

in Carbonat-Puffer pH 10 lösen

Tabelle 9-14: Propidiumiodid-Lösung

Propidiumiodid 0,2 %w/v

in 0,9 % NaCl-Lösung lösen

Tabelle 9-15: Hydroxyharnstoff-Stocklösung

Hydroxyharnstoff 100 mM

in 0,9 % NaCl-Lösung lösen

9.2.2 Analytik

Tabelle 9-16: Strippuffer zur Regenerierung der HisTrap FF crude pH 7,4

NaH2PO4 20 mM

NaCl 500 mM

Na-EDTA 50 mM

in Reinstwasser lösen

Tabelle 9-17: Nickelsulfatlösung zur Regenerierung der HisTrap FF crude Säule

NiSO4 ∙6 H2O 100 mM

in Reinstwasser lösen

143

Anhang

Tabelle 9-18: MES-Puffer zur Regenerierung der HiTrap Talon crude Säule pH 5,0

MES 20 mM

in Reinstwasser lösen

Tabelle 9-19: Strippuffer zur Regenerierung der HiTrap Talon crude Säule pH 7,0

Na-EDTA 200 mM

in Reinstwasser lösen

Tabelle 9-20: Cobaltchloridlösung zum Regenerieren der HiTrap Talon crude Säule

CoCl2∙6H2O 50 mM

in Reinstwasser lösen

Tabelle 9-21: Regenerierungspuffer für die HiTrap Con A 4B Säule pH 8,5

NaCl 500 mM

Tris 20 mM

in Reinstwasser lösen

Tabelle 9-22: Bindepuffer für die HiTrap Con A 4B Säule 2-fach konzentriert, pH 7,4

Tris-HCl 40 mM

NaCl 500 mM

MnCl2 2 mM

CaCl2 2 mM

in Reinstwasser lösen

Tabelle 9-23: Lagerungspuffer für die HiTrap Con A 4B Säule pH 6,0

NaCl 1 M

NaCh3COO 100 mM

MnCl2 1 mM

CaCl2 1 mM

MgCl2 1 mM

EtOH 20 %v/v

in Reinstwasser lösen

Tabelle 9-24: Lysepuffer zum Zellaufschluss von Zellpellets

NaH2PO4 50 mM

NaCl 150 mM

Benzonase 10 U

Igepal 2 %v/v

Proteaseinhibitor 1/8 Tablette

in Reinstwasser lösen

144

Anhang

Tabelle 9-25: Formulierung für 1 SDS-Trenngel (5 ml, 11 %)

H2OR 1,8 ml

Rotiphorese gel 30 1,85 ml

1,5 M Tris (pH 8,8) 1,25 ml

10 % SDS 0,05 ml

10 % APS 0,05 ml

TEMED 0,002 ml

Tabelle 9-26: Formulierung für 1 SDS-Sammelgel (2 ml, 5 %)

H2OR 1,4 ml

Rotiphorese gel 30 0,33 ml

1 M Tris (pH 8,8) 0,25 ml

10 % SDS 0,02 ml

10 % APS 0,02 ml

TEMED 0,002 ml

Tabelle 9-27: SDS-Gel-Probenpuffer, 4-fach konzentriert

Sucrose 10 %w/v

DTT 50 mM

SDS 1 %w/v

Tris-HCl pH 8,8 62,5 mM

Bromphenolblau 0,001 %w/v

in Reinstwasser

Tabelle 9-28: Laufpuffer für SDS-Gelelektrophorese, 10-fach konzentriert

Tris 250 mM

Glycin 2500 mM

SDS 1 %w/v

Tabelle 9-29: Fixierlösung für Coomassie Blau Färbung

Methanol 50 %v/v

Phosphorsäure 3 %v/v

in Reinstwasser, frisch angesetzt

145

Anhang

Tabelle 9-30: Coomassie Blau Färbelösung

CBB G-250 0,12 %w/v

(NH4)2SO4 10 %w/v

H3PO4 10 %w/v

Methanol 20 %w/v

H2OR 60 %w/v

Tabelle 9-31: Fixier-Lösung für Silberfärbung

Ethanol 16,7 %v/v

Eisessig 0,5 %v/v

in Reinstwasser

Tabelle 9-32: Sensitivierungs-Lösung für Silberfärbung

Ethanol 16,7 %v/v

Na2S2O3 x 4 H2O 8 mM

NaAc 82,9 mM

in Reinstwasser, direkt vor Einsatz 250 µl Glutaraldehyd je 50 ml Sensitivierungslösung zugeben

Tabelle 9-33: Silbernitrat-Lösung für Silberfärbung

AgNO3 5,9 mM

in Reinstwasser, direkt vor Einsatz 20 µl Formaledhyd je 50 ml Silbernitratlösung zugeben

Tabelle 9-34: Entwickler-Lösung für Silberfärbung

Na2CO3 235,9 mM

frisch in Reinstwasser ansetzen; direkt vor Einsatz 10 µl Formaldehyd je 50 ml Entwicklerlösung zuge-ben

Tabelle 9-35: Stopp-Lösung für Silberfärbung

Na-EDTA 39,2 mM

in Reinstwasser

Tabelle 9-36: Towbin-Puffer für Westernblot

Tris 39,2 mM

Glycin 192 mM

Methanol 20 %v/v

H2OR 70 %v/v

Tabelle 9-37: Ponceau S Färbelösung

Ponceau S 0,1 %w/v

Eisessig 5 %v/v

in Reinstwasser

146

Anhang

Tabelle 9-38: Tris buffered saline (TBS) für Westernblot , pH 7,5

Tris 50 mM

NaCl 150 mM

in Reinstwasser; pH mit 2 M HCl einstellen, zur Herstellung von TBST mit 0,05 %v/v Tween versetzen.

Tabelle 9-39: Blocking-Puffer für Westernblot mit BSA

BSA 1 %w/v

in TBST einwiegen

Tabelle 9-40: Blocking-Puffer für Westernblot mit Milchpulver

Milchpulver 5 %w/v

in TBST einwiegen

Tabelle 9-41: Rehydratisierungspuffer

Harnstoff 8 M

Thioharnstoff 2 M

CHAPS 1 %w/v

Pharmalyte 0,5 %v/v

in Reinstwasser

Tabelle 9-42: Equilibrierpuffer zur Reduzierung und Alkylierung zur des IPG-Streifens der Isoelektrischen Fokussierung

Tris-HCl 75 mM

Harnstoff 6 M

Glycerol 30 %v/v

SDS 138 mM

in Reinstwasser; für Equilibrierpuffer A wird 1 %w/v DDT, zur Herstellung von Equilibrierpuffer B 2,5 %w/v sowie 20 ppm Bromphenolblau zugesetzt

Tabelle 9-43: Imidazol-Stocklösung

Imidazol 400 mM

in Reinstwasser

Tabelle 9-44: Coating Puffer für Anti-His ELISA, pH 9,6

Na2CO3 50 mM

in Reinstwasser, frisch ansetzen

Tabelle 9-45: Waschpuffer für Anti-His ELISA, pH 7,2

Tris 10 mM

NaCl 150 mM

Tween 20 0,1 %v/v

in Reinstwasser, frisch ansetzen; zur Herstellung des Blockpuffers 1 %w/v BSA einwiegen

147

Anhang

Tabelle 9-46: Phosphatpuffer für die Affinitätschromatographie, pH 7,4

NaCl 300 mM

NaH2PO4 50 mM

in Reinstwasser, nach Bedarf Imidazol aus Imidzol-Stocklösung zugeben zur Herstellung von Wasch-bzw. Elutionspuffer zugeben.

Tabelle 9-47: Tris-Puffer für die Affinitätschromatographie, pH 7,4

Tris 50 mM

in Reinstwasser, nach Bedarf Imidazol aus Imidzol-Stocklösung zugeben zur Herstellung von Wasch-bzw. Elutionspuffer zugeben.

Tabelle 9-48: Denaturierender Puffer für die Affinitätschromatographie, pH 8,0

Harnstoff 8 M

NaH2PO4 50 mM

NaCl 200 mM

in Reinstwasser, nach Bedarf Imidazol aus Imidzol-Stocklösung zugeben zur Herstellung von Wasch-puffer zugeben.

Tabelle 9-49: Waschpuffer für Con A Aufreinigung, pH 7,4

NaCl 500 mM

Tris 20 mM

MnCl2 1 mM

CaCl2 1 mM

in Reinstwasser

Tabelle 9-50: Elutionspuffer für Con A Aufreinigung, pH 7,4

NaCl 500 mM

Tris 20 mM

Methyl-α-D-Glucopyranosid 500 mM

in Reinstwasser

9.3 Medium Tabelle 9-51: Excell 420® Medium zur Kultivierung der Insektenzellen

Hefe-Extrakt enthalten

L-Methionin enthalten

Pluronic F-68 0,1 %w/v

Glucose 33,3 mmol

L-Glutamin 6,8 mmol

NaHCO3 4,3 mmol

148

Anhang

9.4 Antikörper

Tabelle 9-52: Eingesetzte Antikörper

Antikörper Artikelnummer Hersteller Konjugat

Anti-His6-Peroxidase 11 965 085 001 Roche HRP

Pierce Erythropoietin Antibody PA1-20852 Thermo Scientific -

Rabbit anti-Chicken IgY (H+L) 31401 Thermo Scientific HRP

Tabelle 9-53: Spezifikation der eingesetzten Antikörper

Antikörper Verdünnung Target Organismus

Anti His6 1:500 His-Tag, monoklonal Mouse

Pierce EPO Antibody 1:1.800 bis 1:2.200 Erythropoietin, polyklonal Chicken

Anti-Chicken 1:5.000- 1:200.000 Chicken, polyklonal Rabbit

9.5 Kitsysteme

Tabelle 9-54: Eingesetzte Kitsysteme

Assay Artikelnummer Hersteller

Laktat Assay K-LATE Megazyme

Glutamin Assay K-ASNAM Megazyme

Anti EPO ELISA BMS2035CE eBioscience

Anti Cathepsin ELISA BMS257 eBioscience

Bradford Protein Assay K015.2 Roth

MemCode Protein Stain 24580 Thermo Scientific

Dura Super Signal Westernblot 35075 Thermo Scientific

BaculoGold bright® linearisierte DNA 552846 BD Bioscience

BaculoGold® Transfection Kit 554740 BD Bioscience

GLUCOSE liquiUV mono 10786 HUMAN Diagnostics

9.6 Chromatographie-Säulen

Tabelle 9-55: In der Affinitätschromatographie verwendete Säulen

Säule Art Artikelnummer Hersteller

HisTrap FF crude IMAC 11-0004-58 GE Healthcare

HiTrap Talon crude IMAC 28-9537-66 GE Healthcare

HisTrap excel IMAC 17-3712-05 GE Healthcare

HiTrap Con A 4B Lektin 28-9520-85 GE Healthcare

149

Anhang

Tabelle 9-56: Spezifikationen der verwendeten Säulen

Säule Medium Volumen Bindekapazität

HisTrap FF crude cross-linked Agarose 1 ml 40 mg

HiTrap Talon cross-linked Agarose 1 ml 20 mg

HisTrap excel highly cross-linked Agarose 1 ml 10 mg

HiTrap Con A 4B Agarose 1 ml 13 mg

9.7 Chemikalien und Reagenzien

2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) ≥ 99 % 4265.2 Roth

Aceton ≥ 99,9% T906.1 Roth

Agarose 3810.2 Roth

Ammonium Persulfat (APS) ≥ 98 % 9592.1 Roth

Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) 1.01216.5000 Merck

Benzonase ≥ 90 % 1.01654.0001 Merck

Bovines Serum Albumin (BSA) A7906 Sigma-Aldrich

Bromphenolblau 32768 Riedel-de Haen

Calciumchlorid (CaCl2∙2 H2O) ≥ 90 % T885.2 Roth

Cellulase 22178 Sigma-Aldrich

CFDA-SE 21888 Sigma-Aldich

CHAPS 17-1314-01 GE Healthcare

Cobaltchlorid-hexahydrat (CoCl2∙6 H2O) 7095.1 Roth

Coomassie-Brilliant-Blau (CBB G-250) 9598.1 Roth

Dimethylsulfoxid (DMSO) A994.1 Roth

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) P030.2 Roth

Dithiothreitol (DTT) 6908.3 Roth

Eisessig 1.00063.2511 Merck

EPO Standard, EPO-alpha, human C-60033 Promokine, Heidelberg

Ethanol (EtOH) ≥ 99,9 % P076.2 Roth

Excell 420® Insektenmedium 24420C Sigma-Aldrich

Formaldehyd 37 % 4979.1 Roth

Fötales Kälber Serum (FCS) S0615 Biochrom

Glutaraldehyd 25 % 1.04239.0250 Merck

Glycerol ≥ 99,5 % 3783.1 Roth

Glycin ≥ 99 % 3790.3 Roth

Harnstoff ≥ 99,6 % 7638.1 Roth

Hydroxyurea H8627 Sigma-Aldrich

150

Anhang

Igepal, Nonidet P40 74385 Sigma-Aldrich

Imidazol ≥ 99 % 1.04716.1000 Merck

Iodacetamid (IAA) I1149 Sigma-Aldrich

IPG-Streifen (2d) 17-6001-11 GE Healthcare

Isopropanol ≥ 99,95 % AR73.2 Roth

Kaliumchlorid (KCl) ≥ 99 % P017.1 Roth

Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) ≥ 99 % 3904.1 Roth

Kaliumhydroxid Plätzchen ≥ 85 % P.747.1 Roth

Magnesiumchlorid (MgCl2) KK36.1 Roth

Manganchlorid (MnCl2) 1.05297.0100 Merck

Methanol (MeOH) ≥ 99,9 % P717.1 Roth

Methyl-α-D-Glucopyranosid ≥ 99 % 66940 Fluka

Milchpulver T145.1 Roth

N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin (TEMED) 2367.1 Roth

Natriumacetat (NaAc) ≥ 98,5 % X891.2 Roth

Natriumcarbonat (Na2CO3) ≥ 99,9 % 1.06392.0500 Merck

Natriumcellulosesulfat (NaCS) Charge ME39 Euroferm, Erlangen

Natriumchlorid (NaCl) ≥ 99,8 % 9265.1 Roth

Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) ≥ 99 % 04270 Riedel-de Haen

Natriumdodecylsulfat (SDS) ≥ 99 % 2326.2 Roth

Natrium-EDTA (Na-EDTA) X986.2 Roth

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) HN01.2 Roth

Natriumhydroxid Plätzchen ≥ 99 % 6771 Roth

Natriumthiosulfat (Na2S2O3∙4 H2O) 1.06516.0500 Merck

Ni Sepharose 6 Fast Flow 17-5318-06 GE Healthcare

Nickelsulfat (NiSO4∙6 H2O) 31483 Sigma-Aldrich

p(DADMAC) 409022 Sigma-Aldrich

Pharmalyste 17-0456-01 GE Healthcare

Phosphorsäure (H3PO4) 85 % 6366.1 Roth

PlusOne Dry Strip Cover Fluid 17-1335-01 GE Healthcare

Propidiumiodid ≥ 94 % P4170 Sigma-Aldrich

Proteaseinhibitor S8830 Sigma-Aldrich

Resorufin R3257 Sigma-Aldrich

RNAse 7156.1 Roth

Rotiphorese Gel 30 3029.1 Roth

Salzsäure (HCl) 37 % 4625.1 Roth

Schwefelsäure (H2SO4) 95-97 % 1.00732.2500 Merck

151

Anhang

Silbernitrat (AgNO3) 1.01512.0025 Merck

Silikonöl 35130.02 Serva Electrophoresis

Sucrose ≥ 99 % 84100 Fluka

Super Signal West Dura 37071 Thermo Scientific

Tetramethylbenzidin (TMB) 860336 Sigma-Aldrich

Thioharnstoff ≥ 98 % 9513.1 Roth

Trichloressigsäure (TCA) ≥ 99 % T9159 Sigma-Aldrich

Tris-base ≥ 99,3 % AE15.2 Roth

Tris-HCl ≥ 99 % 9090.3 Roth

Trypanblau T6146 Sigma-Aldrich

Tween 20, Polysorbat 20 P5927 Sigma-Aldrich

Wasserstoffperoxid, 25 % 95321 Sigma-Aldrich

9.8 Laborequipment

ÄKTA purifier GE Healthcare, Solingen

Analysewaage ABS Kern, Schifferstadt

Autoklav V-95 Systec GmbH,, Wettenberg

Blasenfalle mit Olivenanschlüssen Eigene Konstruktion

Durchflusszytometer LSR I BD Biosciences, Heidelberg

Gefrierschrank -20°C Liebherr, Bulle (Schweiz)

Gefrierschrank -80°C New Brunswick, Eppendorf AG, Hamburg

Gel-Dokumentationskammer Biorad, München

Gelelektrophoresekammer Biorad, München

Handspektrophotometer Avantes, Niederlande

Heißluftsterilisator Function line Heraeus, Hanau

Inkubator Heraeus, Hanau

Isoelektrische Fokussierung Ettan IPGphor3 GE-Healthcare, Solingen

Kontrolleinheit, Peripherie STR New Brunswick, Eppendorf AG, Hamburg

Lab Thermometer IP165 TFA, Wertheim

Laborwaage Extend Sartorius AG, Göttingen

Laser grüm 532 nm Laser Fuchs, Koblenz

Laser Intensilight C-FGFI Nikon GmbH, Düsseldorf

Magnetrührer Heidolph Instruments, Schwabach

Mikroskop, Phasenkontrast TE2000-U Nikon GmbH, Düsseldorf

O2-4-Kanal-Transmitter Oxy-4 mini Presens GmbH Regensburg

Optische Polymerfaserkabel Presens GmbH, Regensburg

pH-Meter 766 calimatic Knick, Berlin

152

Anhang

Pipette 0,5-10 µl Brand GmbH, Wertheim

Pipette 100-1.000 µl Brand GmbH, Wertheim

Pipette 10-100 µl Brand GmbH, Wertheim

Pipette, Mehrfach 30-300 µl Brand GmbH, Wertheim

Platereader EnSpire 2300 PerkinElmer, Rodgau

Rocker Witec Labortechnik GmbH, Wertheim

Sauerstoffmessgeräte

Sauerstoffsonde, amperometrisch Mettler Toledo GmbH, Gießen

Schlauchpumpe (verkapseln) Watson Marlow GmbH, Rommerskirchen

Schlauchpumpe, groß (Masterflex 7525-45) Thermo Fisher Scientific, USA

Schlauchpumpe, klein (REGLO Analog) Ismatec, Wertheim

Schüttel-Inkubator Innova 44 New Brunswick, Eppendorf AG, Hamburg

SDS-Gelelktrophorese Biorad, München

Sicherheitswerkband Klasse 2 Heraeus, Hanau

Spektrophotometer Analytik Jena, Jena

Thermomixer comfort Eppendorf AG, Hamburg

Trockenschrank Thermo Scientific, USA

Vortex-Genie 2 Scientific Industries, New York (USA)

Wärmebad SWB 20 Haake Technik GmbH, Verden

Zentrifuge 5810 R Eppendorf AG, Hamburg

Zentrifuge Biofuge pico Kendro Laboratory GmbH, Langenselbold

9.9 Verbrauchsmaterialien

96-well-Platte, MaxiSorp Nunc, eBiosciences, Frankfurt a. M.

96-well-Platte, nicht hydrophilisiert Sarstedt AG, Nürnberg

Bechergläser, 50-500 ml Schott AG, Mainz

BioTrace NT Pure Nitrocellulose 0,2 µm Pall, USA

C-FLEX® Schlauch (ID 3,2 mm), Bio-Chem Biochem Fluidics, Berlin

Eppendorfgefäß (1,5 ml) Sarstedt AG, Nürnbrecht

Erlenmeyerkolben, 300 ml Schott AG, Mainz

FACS-Röhrchen Sartedt AG, Nürnbrecht

Filterpapier, Gel-Blotting Whatman Roth, Karlsruhe

Gelfärbeschalen Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Glaspipetten 2-50 ml Brand GmbH, Wertheim

Hohlfasermodul C2011, 3.000 cm² FiberCell® Systems Inc., USA

Hohlfasermodul MicroKros 8 cm², 20 cm² Spectrum® Labs Inc., Niederlande

Kanüle 8 mm B. Braun AG, Melsungen

153

Anhang

Kryoröhrchen Sarstedt AG, Nürnberg

Luer-Lock Verbindungen Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Neubauer-Zählkammer Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Pipettenspitzen 1-1.000 µl Sarstedt AG, Nürnbrecht

Pumpenschlauch Pharmed (ID 1,52 mm) Saint-Gobain, Gerolzhofen

Sauerstoffsonde (durchfluss), autoklavierbar Presens GmbH, Regensburg

Sauerstoffsonde (Spot), autoklavierbar Presens GmbH, Regensburg

Schikanekolben 500 ml Glasgerätebau Ochs, Lenglern

Schüttelkolben 300 ml Schott AG, Mainz

Serologische Kuntststoffpipetten Sarstedt AG, Nürnberg

Silikonschlauch, transparent (ID 1,5 mm) Deutsch & Neumann GmbH, Berlin

Spritzen 1-50 ml B. Braun AG, Melsungen

Spritzen, Luer-Lock 15, 50 ml Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Sterilfilter PTFE Sartotius AG, Göttingen

Zentrifugenröhrchen (Glas) Sarstedt AG, Nürnberg

Zentrifugenröhrchen (PP) Sarstedt AG, Nürnberg

9.10 Software

OXY-4 mini version 2.30FB Presens GmbH, Regensburg

AvaSoft 7.5 Avantes, Niederlande

Biocommand Plus New Brunswick, Eppendorf AG, Hamburg

DB Viewer 32 New Brunswick, Eppendorf AG, Hamburg

Unicorn GE-Healthcare, Solingen

9.11 Sequenz des rekombinanten Erythropoietins

Aminosäuresequenz des Zielproteins

MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAPPRLICDSRVLQRYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPD TKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTT LLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR

154