1UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICOINSTITUTO DE BIOTECNOLOGA

PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIASBIOQUMICAS

EVALUACIN FINAL CURSO DE MTODOS

COORDINADOR DEL CURSO: DR. ROBERTO STOCK

ALUMNA: BLANCA RAMOS CERRILLO

TEMA:HIBRIDACIN in situ

2NDICE

I. Introduccin 1

II. Breve historia 1

III. Pasos y consideraciones de la hibridacin in situ 2

IV. Preparacin de la sonda 4

a) Diseo de sondas 5b) Tipo de sonda y mtodo de sntesis 5c) Eleccin de la sonda 6

d) Tamao de la sonda 6e) Estabilidad de la sonda 7f) Sondas de doble cadena contra las de cadena sencilla 7

V. Marcaje 7a) (3H) Tritio 7b) 35S 8c) 32P 8d) 33P 8e) Marcaje con digoxigenina 8f) Marcaje con biotina 9g) Marcaje fluorescente de cidos nuclicos 11h) Mtodos de marcaje para: i) DNA 12

ii) RNA 13iii) Oligonucletidos 13

VI. Preparacin de tejidos 14a) Fijacin 14b) Tejido embebido y su seccionamiento 15

VII. Tratamiento de la laminilla 15

VIII. Pretratamiento del tejido 16a) Tratamiento con solventes orgnicos 16b) Tratamiento con proteasas para facilitar 16

la accesibilidad al RNA de intersc) Inactivacin endgena enzimtica 17d) Tratamiento con RNasas 17e) Tratamiento con HCL 17f) Tratamiento con detergentes 17

3g) Impedimento de enlaces 17h) Pre-hibridacin 17i) Blancos del DNA 17

IX. Pre-hibridacin y desnaturalizacin de la sonda y su blanco 18

X. Hibridacin 18a) Largo de la sonda 20b) Composicin de la sonda 20c) Identidad 20d) Composicin de la solucin de lavados de la hibridacin 20e) Desnaturalizacin del DNA 21f) pH 21g) Temperatura 21

XI. Lavados post-hibridacin 23

XII. Deteccin 23a) Sondas radioactivas 23

i) Grados de la emulsin 24ii) Espesor de la emulsin 24iii) Almacenamiento y vida media de la emulsin 24iv) Condiciones de exposicin 24v) Tiempo de exposicin 24vi) Condiciones para revelarla 24

b) Sondas marcadas con haptenos 24

XIII. Tcnicas de doble tincin 25

XIV. Controles 26a) Hibridacin cruzada con secuencias de 26 cidos nuclicos inespecficosb) Enlaces inespecficos 26c) Generacin inespecfica de la seal 27d) Ruido de fondo sobre tejidos especficos 27e) Ruido de fondo de sondas marcadas con haptenos 27

XV. Fotografa 28

XVI. Microscopa 28a) De campo claro 28b) De campo oscuro 29c) De contraste de fases 29d) Microscopa de contraste de reflexin 29e) De fluorescencia 29

4f) Imgenes digitales 29g) Microscopa electrnica 29h) Flujo citomtrico 29

XVII. Algunas otra tcnicas: PRINS 30a) Principios y mtodos de in situ PCR 30b) Amplificacin in situ 30c) Deteccin de productos de PCR en la clula 30d) Eficiencia de PCR in situ 31e) PCR in situ tiene una gran nmero

de aplicaciones en diagnstico 31f) Controles para PCR in situ 32

XIX. Comparacin de las tcnicas de hibridacin in situ 34

5Abreviaturas A AdeninaAP Fosfatasa alcalinaBCIP 5-bromo-4cloro-3-indolil fosfatoBio biotinaBrdU 5-bromo-4-cloro-3-indolid fosfatoC citosinacDNA DNA complementarioDAB diaminobenzidinaDAPI 4,6-diamino-2-fenilindoleDEPC dietilpirocarbonatoDIG digoxigeninaDMSO dimetilsufxidoDNasa deoxiribonucleasadsDNA doble cadena de DNADTT ditiotreitolEDTA cido etilenoadiaminotretacticoFISH fluorescence in situ hybridizationFITC Fluorescencia in situFLU FluorescenaG GuaninamRNA mRNANTB 4-nitroblue-tretrazolium chloridePBS buffer fosfato salinoPCR reaccin en cadena de la polimerasaPFA paraformaldhedoRNasa ribonucleasasnRNA small nuclear RNAsnoRNA small nucleolar RNAssDNA cadena sencilla de DNASTS sitio de pegado de la secuenciaT timinaTBE tris-borato-EDTATBS tris buffer salinoTE tris-EDTATEMED tetrametilenediaminaTESPA 3-aminopropiltrietoxisilinaTm Temperatura de fusinTr Temperatura de reasociaintRNA RNA de transferenciaU uraciloUV luz ultravioleta

6ndice de tablas y figuras

Pg.

Figura 1. Principios de la hibridacin in situ 1

Figura 2. Diagrama de flujo de la hibridacin in situ 3

Figura 3. Estructura qumica de la digoxigenina 8

Figura 4. Estructura qumica de la biotina 9

Tabla 1. Ventajas y desventajas de sistemas de marcaje 11

Figura 5. Estructura qumica de la fluorescena 12

Tabla 2. Ventajas y desventajas entre la sondas de hibridacin 20

Tabla 3. Aplicaciones de la hibridacin in situ 32

Tabla 4. Controles requeridos para experimentos de hibridacin 33

I. Introduccin.

Hibridacin in situ es una tcnica que detecta secuencias de cidos nucleicosen clulas, cromosomas o tejidos preservados.La deteccin in situ provee una visualizacin directa de la localizacinespacial de secuencias especficas que es crucial para dilucidar laorganizacin y funcin gnica, por lo que el mtodo de hibridacin in situ seha convertido en una tcnica importante en diversos campos, incluyendodiagnstico de rearreglos cromosomales, deteccin de infecciones virales yanlisis de la funcin gnica durante el desarrollo embrionario.La hibridacin in situ toma como fundamento la complementaridad de loscidos nuclicos, la cual puede ser DNA y/o RNA, a travs de puentes dehidrgeno formados entre las bases: adeninatimina (DNA) o uracilo (RNA) ycitosina-guanina (DNA y RNA). Este apareamiento da lugar a una doblecadena en la cual una cadena, tiene la orientacin opuesta a la otra conrespecto al esqueleto azcar-fosfato. La secuencia es leda de 5' a 3'.

Secuencia DNA RNA

5' TGATCCGTTA3' 5'UGAUCCGUUA3'3' ACTAGGCAAT5'

Transcripcin

2Figura 1. Principios de la hibridacin in situ. La relacin entre la doble cadena de DNA y sutranscrito a RNA. El DNA genmico consiste de dos cadenas complementarias, A aparea conT y G con C en orientacin opuesta (5' a 3' y 3' a 5'). La transcripcin usa la cadena ldercomo templado y genera una secuencia idntica de RNA.

II. Breve historia

La tcnica fue desarrollada en 1969 por Gall y Pardue e independientementepor Jonh et al., en el mismo ao. Gall y colaboradores describieron unatcnica que formaba hbridos moleculares entre RNA y DNA. La tcnica sellev a cabo en ovocitos de Xenopus laevis, hibridando rRNA con rDNAextracromosomal. Detectaron la localizacin diferencial en las clulas, de loshbridos de cidos nuclicos ha distintos estados. En ese momento la nicaforma de marcaje eran los radioistopos, por lo que se us tritio para elexperimento y la forma de deteccin fue por autoradiografa. Demostraronque en ciertas partes como tejido conectivo, la tcnica no era suficientementesensible para mostrar las cantidades pequeas de rDNA en un genoma. Estolo llevaron a cabo exponiendo las preparaciones por periodos ms all de dosmeses. Evaluaron variables de la tcnica que afectan el rendimiento de lahibridacin, hacindo hincapi en un paso fundamental que se debe llevar acabo para realizar la tcnica: la desnaturalizacin.Plantearon que el hbrido puede reabsorberse en el soporte que utilizaron(agar) y esto puede fungir como impedimento para que se lleve a cabo lareaccin. Finalmente propusieron mejorar la tcnica, pese a las limitaciones

de ese momento, incrementando el rendimiento con el uso de RNAsintetizado in vitro, es decir preparndolo enzimticamente, usando comotemplado el rDNA satlite de Xenopus.Adems el clonaje molecular no era posible en ese tiempo y la hibridacin insitu se restringi a aquellas secuencias que pudieran ser purificadas yaisladas por mtodos bioqumicos y resolver problemas como localizacincitolgica del DNA.Vale la pena resaltar que estos experimentos arrojaron informacin valiosaque contribuy a perfeccionar la tcnica y poderla aplicar en varios campos.El clonaje molecular de cidos nucleicos y el mejoramiento de las tcnicas demarcaje radioactivo han cambiado el panorama dramticamente. Por ejemploHarper et al., en 1981 detect en cromosomas metafsicos el gen de lainsulina. El mtodo de deteccin fue la autorradiografa. En 1985 Coghlansintetiz oligonucletidos marcados radioactivamente para deteccin. Estemismo investigador en 1986 detect citolgicamente un bajo nmero decopias de mRNAs.La alta sensibilidad que provee la prueba (de 20 a 50 copias de secuenciasblanco/clula), as como el rango tan grande de aplicaciones di pie a quemuchos laboratorios adoptaran la tcnica; aunque uno de los principales

3problemas que enfrentaba la hibridacin in situ era el tipo de marcaje(radioactivo) y el tiempo requerido para la deteccin (autorradiografa). Con eltiempo sto fue cambiando, desarrollando otro tipo de marcaje de los cidosnucleicos dejando de lado al mayor impedimento para la aplicacin generalde la hibridacin in situ, lo cual abri nuevas oportunidades para empleardistintos marcajes en un experimento. La estrategia actual es utilizar unsistema de deteccin con anticuerpos aumentando la accesibilidad de laprueba.

III. Pasos y consideraciones para la hibridacin in situ.

La tcnica involucra:a) Generacin de cidos nucleicos marcados para una deteccin

subsecuente.b) Fijacin de tejidos (seccionados), preparacin de cromosomas.c) Preparacin del tejido para incrementar el acceso del cido nucleico

marcado.d) Hibridacin de la sonda marcada en cromosomas o tejidos.e) Lavados selectivos que remuevan las sondas que no hibridan.

4f) Deteccin de la sonda marcada, revelando la localizacin celular de loscidos nucleicos.

Figura 2. Diagrama de flujo de la hibridacin in situ.Este mtodo puede ser combinado con PCR para amplificar las secuenciasde pegado y aumentar la deteccin de la seal. Un aspecto crtico en stemtodo es que los cidos nucleicos que estn retenidos in situ no deben deser degradados por nucleasas, para que sea posible la hibridacin de lasonda.Actualmente existen varias alternativas para elegir el tipo de sonda y losmtodos de marcaje y deteccin.

Determinacin de la especificidad en lahibridacin(controles)Tratamiento con nucleasasUso de sondas mltiplesUso de vectores o cidos nulceicosheterlogos

Preparacin de laminillas- tratamiento con gelatina o poli-L-lisina-siliconizacin

Fijacin del material en la laminilla- por precipitacin (etanol)Por entrecruzamiento (formaldhedo)

Pretratamiento del tejido (opcional)a) tratamientos que previenen el ruidoInactivacin endgena de la enzimaTratamiento con RNasasb) Permeabilizacincidos diludosDetergente/alcoholProteasas

Prehibridacin (opcional)Incubacin de la muestra con una solucinpre-hibridacin, a la misma temperaturaque la hibridacin

Desnaturalizacin de la sonda y suBlanco pH o calorDesnaturalizqacin simultnea o separadade la sonda y su blanco (si es doblecadena)

HibridacinComponentes de la solucincidos nuclicos heterlogosFosfato de sodio, EDTA, SDS, salesFormamidaDextrn sulfato

Pasos post-hibridacinTratamiento con nucleasas (opcional)Lavados astringentes

Deteccin inmunolgicaBloqueoIncubacin con anticuerposMicrsocopa de fluorescencia o sustratoscolorimtricosMontaje

Micrsocopa, anlisis de resultados

Evaluacin

Microscopa defluorescencia por sondasdirectamente marcadas conun fluorocromo

Sondaa) Eleccin de la sondads: DNA, cDNAss: RNA, oligonucletidos ss-DNAb) Preparacin de la sondaAislamiento de fragmentos de DNA(opcional)cDNA: clonajeRNA: clonaje y transcripcin en vectoresOligonucletidos: sntesis qumicac) Marcaje de la sondaDs DNA: random primed, nick translation,PCRRNA: transcripcin in vitro, RT-PCROligonucletidos marcados

Determinacin de las condiciones dehibridacinDeterminacin de la temperatura dehibridacin, pH, uso de formamida,concentracin de salesComposicin de la solucin dehibridacinConcentracin de la sonda

5Las alternativas mayormente usadas son:a) Sondas de RNA, sondas de DNA (cadena doble o sencillo) uoligonucletidosb) Marcas radioactivas o haptenosc) Marcajes directos e indirectos

La deteccin del mtodo depende de lo que se requiera:

a) Sensibilidad. Depende del fcil acceso que tenga la sonda marcada, lacantidad y tipo de marca includa en la sonda y el mtodo de deteccin.

b) Resolucin. La resolucin de la seal puede variar de sitios especficos enuna clula, lo cual depende de la sonda marcada y del mtodo de deteccin.

c) Especificidad. La especificidad de la seal depende de la selectividad dellavado y de secuencias similares que interfieran en el pegado de la sonda.

d) Anlisis de secciones celulares o de tejidos montados en laminillas osecciones de tejidos que se encuentren en solucin, tejidos enteros oembriones.

e) Deteccin mltiple de genes o productos gnicos. La relacin fsica entregenes o regiones cromosomales pueden ser visualizadas por el uso dedistintas marcas fluorescentes para la deteccin simultnea de distintosproductos gnicos en una clula o tejido.

f) Programas computacionales. Estos pueden ayudar a la visualizacin demodelos espaciales de transcritos en un tejido o embrin. Se pueden llevar acabo modelos tridimensionales.

g) Conveniencia y seguridad. Las marcas no radioactivas son ms estables,seguras y rpidas.

IV. Preparacin de la sonda.

Para sondas de cadena sencilla, se debe usar la secuencia reversacomplementaria. Cuando las sondas son sintetizadas por transcripcin,involucra generar mRNA del gen endgeno. Cuando se disean los oligosmarcados, es importante recordar que la secuencia antisentido es la hebracomplementaria reversa de la cadena lder y debe ser leda de 5 a 3.

En general es preferible usar sondas especficas, ya que esto garantiza unabuena hibridacin. Existen situaciones en las cuales esto no puede llevarse acabo, por ejemplo, si los genes todava no estn clonados de las especies

6usadas para la hibridacin o si la secuenica gnica es muy similar entreespecies. Esto puede favorecer una hibridacin entrecruzada. Para evitarsto, se requiere una alta selectividad que reduzca la presencia de bases malapareadas, aumentando de esta manera la especificidad. Si los modelos deexpresin son los mismos, como se pueden ver con una sonda homloga, esun experimento alentador, aunque no prueba la especificidad. sto puede serprobado por un Northern o un Southern-blot. La hibridacin entrecruzadaprovee informacin preliminar muy valiosa.

a) El diseo de sondas se resume en los siguientes puntos:i) La hibridacin entrecruzada utiliza sondas largas (>100 pb) usadas bajocondiciones selectivas especialmente despus de la digestin con nucleasas,ya que una sonda adems de homloga, debe ser lo suficientemente ampliapara llevar a cabo la hibridacin.ii) Para sondas pequeas (oligonucletidos de 20-30 pb) es muy probableque algn gen distinto al de inters tenga una secuencia idntica.Alternativamente se puede hacer un screening y ste puede ser realizado porbsqueda de secuencias en bases de datos.iii) Los mRNA poseen las secuencias poli(T) y poli(U), al transcribirse a cDNAse evita que la sonda no incluya esta cola, porque secuencias largas, ricas enGC dan una gran estabilidad a la sonda por los triples enlaces que se formanentre estas bases.Se necesitan dos elecciones ms para la preparacin de la sonda: el tipo decidos nucleicos y la marca que se incorpora en la sonda. Algunos mtodosalternativos estn disponibles para la sntesis de la sonda.

b) Tipo de sonda y mtodo de sntesis. Distintos tipos de sondas de cidosnucleicos pueden ser utilizadas para la hibridacin in situ:i) Sondas de DNA doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando tcnicascomo nick translation, random priming o PCR, en las cuales el nucletidomarcado es incorporado. PCR y random priming proporcionan una buenaactividad especfica. Estas sondas pueden ser desnaturalizadas antes deusar. Cuando se usan para detectar una cadena simple como mRNA, estasson menos sensibles debido a que la concentracin de la sonda marcada esreducida.ii) Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadasutilizando primer extension en templados de cadena simple o por PCR conun nucletido marcado. ste ltimo es el ms usado porque es ms fcil dellevar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad de material.El PCR permite una gran flexibilidad en la eleccin de las secuenciasmarcadas por el uso de primers. Estas marcas han sido ampliamente usadas.iii) Oligonucletidos (entre 20 y 40 bases). Son marcados incorporandooligonucletidos modificados durante la sntesis qumica o adicionando unacola marcada. Una de las desventajas es que algunos oligonucletidosmarcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye.

7iv) Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso deuna RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de lasonda es clonada en un vector que flanquear dos sitios distintos deiniciacin.La cadena de RNA antisentido (sonda) es sintetizada en direccin opuesta algen endgeno. Se recomienda linearizar la sonda de RNA con enzimas quedejen el extremo 5 cohesivo, por que se ha reportado, que el extremo 3romo promueve la sntesis de transcritos anormales.

c) Eleccin de la sonda. Las sondas largas de cadena simple (RNA o DNA)proporcionan una alta sensibilidad en la deteccin de cadena sencilla. Losoligonucletidos son muy sensibles y la seal puede ser incrementada por eluso de un cocktail de sondas que flanquearn en regiones distintas.Para estudios de mRNAs estrechamente relacionados, las sondasespecficas, pueden ser obtenidas por sntesis de oligonucletidos. Sedisean primers que sern usados para la amplificacin del fragmentodeseado de DNA en el PCR. Estos fragmentos pueden ser clonados yusados para sintetizar cadenas dobles o sencillas de DNA o RNA.Alternativamente, para el caso de sondas de RNA, pueden ser marcadasdirectamente sin clonacin incluyendo el primer marcado en el sitio deiniciacin de la RNA polimerasa.Finalmente las sondas de DNA de doble cadena son recomendadas parablancos de doble cadena y esto puede ser suficientemente sensible paradetectar abundancia de cadena sencilla.

d) Tamao de la sonda. Las sondas largas pueden emitir una seal msfuerte debido a que incorporan mayor nmero de nucletidos marcadosdentro de ella. Sin embargo, las sondas que son tan largas dan sealesdbiles, debido a que la sonda penetra menos eficientemente en el tejido. Lamejor estrategia es usar una secuencia larga como templado para la sntesisde la sonda pero asegurar que la sonda generada es lo suficientementepequea para poder penetrar . Muchos procedimientos estn basados en quela sonda de 50-150 bases porque emiten seales ptimas para la hibridacinen secciones de ciertos tejidos (Cox, 1984.). Se ha encontrado que lassondas de RNA que miden por arriba de 1 kb proveen seales ptimas parala hibridacin in situ, en embriones fijados en paraformaldhedo. Lapenetracin est influenciada por el tamao de la sonda aunque tambindepende de la naturaleza del tejido, de la forma de fijacin y si elpretratamiento ha sido realizado para remover las protenas celulares.

El tamao de la sonda puede ser controlado durante la reaccin de sntesis:

i) Sondas de DNA, sintetizadas por nick translation, el largo estdeterminado por la cantidad de DNasa en la reaccin.ii) Sondas marcadas por random priming el tamao est determinado por laconcentracin del primer.

8iii) Primers que puedan ser elegidos para deteminar el tamao de la sondasintetizada por PCR.iv) Sondas largas de DNA pueden ser cortadas parcialmente por incubacina altas temperaturas.v) Sondas largas de RNA son parcialmente cortadas por hidrlisis alcalinalimitada. Si el tamao de la sonda es cortada por hidrlisis hay que revisar eltamao de la sonda, porque si sta es muy pequea, sta no hibridar bajocondiciones selectivas standard, dando una baja seal.

e) Estabilidad de la sonda y la interaccin con su blanco. Enexperimentos de hibridacin los puentes entra la sonda y la secuencia blancojuega un rol importante. El largo decrementa la estabilidad en el siguienteorden RNA-RNA, DNA-RNA, DNA-DNA (Wetmur et al., 1986). La estabilidadde los hbridos est influenciada por las condiciones de hibridacin, por laconcentracin de formamida, sales y la temperatura.

f) Sondas de doble cadena contra cadena sencilla. Un nmero dereacciones competentes ocurren durante la hibridacin in situ con sondas dedoble cadena. Las sondas de cadena sencilla proveen las siguientesventajas:i) La sonda no se agota porque no se autoliga.ii) No son cadenas largas porque deben penetrar en la seccin de tejido o enlos cromosomas.Con DNA-DNA la renaturalizacin in situ de secuencias blanco se lleva acabo eficientemente porque los hbridos tienen una estabilidad trmicasimilar. La renaturalizacin in situ de DNA puede ser impedida por el uso desondas de RNA de cadena sencilla.Los hbridos DNA-RNA son ms estables trmicamente que los hbridosDNA-DNA. Las condiciones de hibridacin pueden ser diseadas de talmanera que la formacin del hbrido DNA-DNA no sea favorecido, pero elhbrido DNA-RNA s.

V. MARCAJE

Existen dos alternativas para que el marcaje sea incorporado dentro de lasonda: el marcaje radioactivo que es detectado por autorradiografa, o porhaptenos (no radioactivo) el cual es detectado directa o indirectamente porinmunocitoqumica.

Isotpicos radioactividad Sistemas directos

No isotpicos no radioactivosIndirectos

Los sistemas isotpicos ofrecen una alta sensibilidad, particularmente contritio, as como alta resolucin. Por otro lado el empleo de radiositopos

9requieren licencia especial. El mtodo de deteccin (autorradiografa)requiere un tiempo de exposicin de semanas.Algunos istopos han sido usado para marcajes radiocativos en la hibridacinin situ, que difieren en cuanto a la resolucin de la seal, la velocidad enobtencin de resultados y la estabilidad de la sonda.a) 3H - proporciona una seal a nivel subcelular pero requiere largasexposiciones autorradiogrficas.b) 35S proporciona resolucin de un dimetro celular, con tiempos deexposicin de una semana. Agentes reductores como el ditiotreitol (DTT)pueden ser includos en la solucin que contenga 35S para proteger al azufrede la oxidacin. La vida media de este istopo es de 87 das y la marca debeser usada en un mes aproximadamente.c) 32P da una resolucin menor que el 35S y adems proporciona una bajaeficiencia en la autorradiografa, ofrece una pequea ventaja en cuanto a lavelocidad de obtencin de resultados. Posee una vida media de 14 das.d) 33P da una resolucin similar a 35S, pero ste tiene una vida media mscorta (25 das) y el costo es mayor.

Con el uso de sondas radioactivas es posible hacer un mtodo cuantitativo.

Existen dos tipos de sistemas no isotpicos para la prueba de hibridacin:directo e indirecto.En el primero, la molcula detectable (reportera) es enlazada directamente alcido nuclico y este hbrido puede ser visualizado en el microscpioinmediatamente despus de la reaccin de hibridacin. El paso limitante enste mtodo es que el hbrido subsista a las condiciones de lavado.Lo ms importante, adems, es que la molcula reportera no interfiera con lahibridacin. El marcaje con un fluorocromo en pruebas de RNA desarrolladapor Bauman et al., 1980, 1984, y el marcaje directo de cidos nucleicos conenzimas, descrito por Renz y Kurz, 1984, siguen este criterio.Los mtodos indirectos requieren una marca que contenga la molculareportera, introducida qumica o enzimticamente, que pueda ser detectadapor afinidad citoqumica. En este mtodo al igual que el anterior, el marcajeno debe interferir con la hibridacin, ya que la molcula reportera debe estaraccesible a los anticuerpos que la detecten. Se han descrito un sin nmerode modificaciones a haptenos (Langer et al., 1981) y uno de los sistemas mspopulares es el sistema DIG (digoxigenina) el cual ser descritoposteriormente.Tiempo atrs se decribi la sntesis qumica de oligonucletidos conteniendogrupos funcionales (grupos sulfhidrilos, aminas primarias alifticas). Con estose pudo hacer reaccionar haptenos, fluorocromos o enzimas que producenun marcaje estable, el cual se utiliz para la hibridacin in situ (Agrawal et al.,1986).

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e) Marcaje con digoxigenina (DIG) El mtodo de marcaje con DIG est basado en un esteroide aislado de lasplantas Digitalis purpurea y Digitalis lanata. Las hojas y flores de estasplantas son la nica fuente natural de digoxigenina.

Figura 3. Digoxigenina-UTP/dUTP/DDUTP, alcali-estable. Digoxigenina-UTP (R1=OH, R2=OH). Digoxigenina-dUTP(R1=OH, R2=H) y Digoxigenina-ddUTP (R1=H, R2=H).

La digoxigenina se enlaza en la posicin C5 de la uridina mediante un brazoque contiene 11 tomos de carbono. Los nucletidos marcados con DIGpueden ser incorporados a las sondas de cidos nucleicos por DNApolimerasas (E. coli DNA polimerasa I, T4 DNA polimerasa, T7 DNApolimerasa, reverso transcritptasa y Taq DNA polimerasa), al igual que RNApolimerasas (SP6, T3 O T7 RNA polimerasa) y transferencia terminal.Los cidos nucleicos pueden ser marcados qumicamente con DIG-NHSester o con DIG Chem-Link.Las sondas DIG-marcadas pueden ser detectadas con una alta especificidadpor anticuerpos anti-digoxigenina (Anti-DIG) que son conjugados a fosfatasaalcalina, peroxidasa, fluorescena, rodamina u oro coloidal. Alternativamente,anticuerpos anti-digoxigenina primarios y secundarios pueden ser usados.La sensibilidad de la deteccin depende del mtodo usado para visualizar losanticuerpos anti-DIG conjugados. Cuando un anti-DIG conjugado a fosfatasaalcalina es visualizado por colorimetra (NTB y BCIP o 5 bromo, 4 cloro, 3-indolidfosfato nitro azul) o sustraros fluorescentes (HNPP), la sensibilidad dela deteccin es aproximadamente de 0.1 pg.Las mezclas marcada contenidas en los kits de marcaje con DIG relacionan ala uridina marcada con DIG a dTTP la cual produce una marca de hibridacinaltamente sensible. Esta relacin produce una incorporacin de 20 a 25nucletidos marcados con DIG al DNA.

f) Marcaje con biotinaEl marcaje de cidos nucleicos con biotina-dUTP (Figura 4) fue desarrolladopor David Ward y colaboradores en la Universidad de Yale (Langer et al.,1981). Recientemente se han sintetizado otros nucletidos biotinilados comoadenosina biotinilado y citosn-trifosfatos (Gebeyehu et al., 1987). Tambinse han implementado procedimientos fotoqumicos al igual que un nmero de

O

OCH3

CH3

OH

OH

H

H

O

O

NHO

NH

O

N

NH

OO

R1R2

OPOO PPO

O O O

O O O

11

mtodos de biotinilacin qumica han sido descritos (Gillam and Tener, 1986;Reisfeld et al., 1987; Viscidi et al., 1986).

Figura 4. Estructura qumica de la biotina-dUTP.

En principio la biotina puede ser detectada en la misma longitud de onda quela digoxigenina, dependiendo del fluorforo acoplado a estreptavidina.La estreptavidina o avidina es ms frecuentemente usada porque stasmolculas tienen una alta capacidad de enlace con la biotina. La avidina(proveniente de la clara de huevo) es una glicoprotena de 68 kDa con unaconstante de asociacin de 10-15 M a 25 C.

Las sondas marcadas con haptenos tienen varias ventajas, incluyendoseguridad, alta estabilidad, obtencin rpida de resultados y resolucin.Adems la hibridacin in situ puede ser realizada en un soporte. Los mtodosms sensibles involucran incorporacin de nucletidos modificados quetienen un grupo hapteno que es detectado por un anticuerpo especfico.Siguiendo la hibridacin, el tejido es incubado con haptenos enlazandoanticuerpos acoplados a una enzima y entonces la seal es producida porcolorimetra.El rango de haptenos tiene un uso limitado por la disponibilidad comercial.El marcaje fluorescente de la sonda o de anticuerpos anti-haptenos, ofrece laventaja de usar etiquetas fluorescentes distintas simultneamente,detectando diferentes secuencias. Esta estrategia es usada generalmentepara la hibridacin en cromosomas y es menos recurrente para la deteccinde mRNA por la baja sensibilidad. Una nueva alternativa que se ofrece es eluso de anticuepos acoplados a oro coloidal usados para la deteccin pormicroscopia electrnica.La eleccin de la marca depende de los requerimientos para la sensibilidad yresolucin de la seal. Las sondas marcadas con 35S son ms sensibles quelas sondas marcadas con haptenos, y pueden ser elegidas para la deteccinde transcritos no abundantes. Si la resolucin a nivel celular y/o visualizacintridimensional de la expresin gnica es requerida, entonces el mtodo ideal

O

NHO

NHO

O

NHNH

O

N O

O

HO

OPOO PO P

O O O

O O O

S

NHHN

HH

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es el marcaje con haptenos. La seguridad es una consideracin importantepara la eleccin del mtodo.

En la tabla 1 se muestran las ventajas y desventajas que tiene cada uno delos sistemas:

Tabla 1. Ventajas y desventajas de sistemas istipicos y no isotpicos

Isotpicos(Marcaje con 35S, 3H, 33Py 32P)

No isotpicas(Biotina, digoxigenina,

FITC, dinitrofenil,marcaje con fosfatasaalcalina o peroxidasa)

VENTAJAS

Alta sensibilidad, fcildeteccin, eficiencia enel marcaje de la sondaque puede ser estimadorpidamente. Puede serusada para cuantificacinpor conteo de granos deplata (35S).

Buena sensib i l idad,e x p o s i c i n n oradiocativa, larga vidamedia de la sonda,reproducibilidad, buenaresolucn celular ymorfologa. Protocolosaccesibles. Permanenteretencin del color.

DESVENTAJAS

Equipo para uso deradioactividad, tiempo deexposicin variable y lar e s o l u c i n e sdependiente de marcaje.Los radioisotopos tienenu n a v i d a m e d i arelativamente corta. Sedeben de tener estrictoscontroles dentro de laprueba. Con frecuenciavar iab i l idad en laeficiencia de la prueba.

Dificultad en deteccinde secuencias norepetitivas. Problemascon ruido de fondo entejidos ricos de lamolcula marcada (ej.b i o t i n a ) . P a s o sadicionales para ladeteccin. Dificultades enla cuantificacin exactade la molcula marcada.

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g) Marcaje Fluorescente de cidos nucleicosLos nucletidos marcados con fluorescena (Figura 5) son una alternativa delos marcajes radioactivos. Los anlogos de nucletidos marcados confluorescena pueden ser usados como sistemas directos e indirectos de lahibridacin (Dirk et al., 1991; Wiegant et al., 1991).

La fluorescena dUTP/UTP/ddUTP pueden ser incorporados enzimticamentea los cidos nucleicos de acuerdo a tcnicas standard.El marcaje con fluorescena es un marcaje directo que no requiere deteccininmunocitoqumica por lo que es necesario que haya un mnimo ruido defondo. En general las desventajas de los mtodos directos es que son menossensibles que los mtodos indirectos descritos anteriormente.Alternativamente, los nucletidos marcados con fluorescena pueden serdetectados con un anticuerpo conjugado anti-fluorescena o con unanticuerpo no conjugado o con un anticuerpo secundario contra fluorescena.Otros nucletidos marcados con fluorocromos, como tetrametil-rodamina-5-dUTP que emite en rojo estn disponibles actualmente.

Figura 5. Estructura qumica de la fluorescena dUTP

h) Mtodos de marcaje para:

i) DNA. Las sondas preparadas por marcaje random primed sonpreferenciales para aplicaciones de blot por la alta tasa de incorporacin denucletidos y la alta tasa de produccin de sondas marcadas. En la reaccinde marcaje por random primed, el templado de DNA es linearizado,desnaturalizado y un primer es incorporado. Inicia en el extremo 3-OH delprimer, por sntesis de Klenow. Se sintetiza una molcula de DNA a lo largodel sustrato de cadena sencilla.El tamao de la sonda es cerca de 200-1000 pb con la ayuda de reactivospremezclados y marcados (como DIG, biotina o fluorescena) la reaccin derandom primed puede producir de 30-70 ng (por 10 ng de templado y unahora de incubacin) de 2.10-2.65 g (por 3 g de templado y 20 horas deincubacin) de una sonda de DNA no radioactiva.En la reaccin de nick translation, el templado de DNA puede sersuperenrrollado o linearizado. Despus el DNA es cortado con DNasa I,

X 4 Li+

OOO

OOO

O P PO O P O

R2 R1

OO

HN

N

O

HN

O HN O

CO

OH

OHO O

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comienza la actividad de la exonucleasa de DNA-polimerasa I que va de 5 a3 y se extiende desde la muesca hasta la siguiente muesca (nick-gap);entonces la polimerasa reemplaza los nucletidos escindidos con nucletidosmarcados. La reaccin produce ptimos marcajes despus de 60 a 90minutos. El tamao de la sonda despus de la reaccin debe ser cerca de200 a 500 pb.Las sondas pueden ser preparadas por PCR. En ste, dos primers hibridanen los extremos del DNA y flanquean secuencias especficas, entonces unapolimerasa termoestable (como la Taq polimerasa) elonga a los dos primers.

Una serie repetitiva de ciclos (desnaturalizacin, anclaje y extensin delprimer) resulta en una acumulacin exponencial de copias de la secuencia(cerca de millones de copias en 20 ciclos). La incorporacin de nucletidosmarcados durante el PCR puede producir grandes cantidades de sondamarcada.Eel largo de la sonda amplificada est definida por el extremo 5 delos primers para el PCR. El PCR permite una fcil produccin de sondas contamao ptimo.Los tres mtodos de marcaje de DNA permiten una gran flexibilidadconsiderando el largo de los fragmentos marcados. En las reacciones denick translation el cambio en la concentracin de DNasa altera la longituddel fragmento, en cambio la reaccin de random primed es afectada por laconcentracin del primer y para el caso de PCR la secuencia de los primerscontrolan el tamao del fragmento.En los tres casos se produce una buena cantidad de sondas marcadas,muchas de las cuales tienen regiones complementarias sobrelapadas.

ii) RNA. Las sondas de RNA son generadas por transcripcin in vitro de untemplado linearizado. En este caso un promotor para la RNA polimerasapuede estar en el vector de DNA, SP6, T3 o T7 RNA polimerasa y soncomnmente usadas para la sntesis de la complementaria de RNA al DNAsustrato. El transcrito sintetizado es una copia exacta de la secuencia delpromotor al sitio de restriccin. El tamao de la sonda puede ser ajustadomediante los sitios de restriccin y de esta manera tener un control en eltamao de todas las sonda de RNA. La cantidad de RNA marcado es cercade 10 g por 1g de DNA.

iii) Oligonucletidos. Oligonucletidos sintticos tienen algunas ventajas.Son sintetizados automticamente, son pequeos y de cadena sencilla. Porsu pequeo tamao poseen una gran capacidad de penetracin, la cual esconsiderada como uno de los factores ms importantes de la hibridacin insitu.Por otro lado el tamao del oligo puede ser una desventaja, porqueusualmente flanquean menos blancos que las sondas de cDNA convencional.Recientes estudios han sugerido que la propiedad de penetracin de la sondacompensa el nmero de blancos que quedan sin flanquear. Una de las

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mayores ventajas que tiene este tipo de marcaje es que la cadena sencillaexcluye la posibilidad de renaturalizacin.Los oligonucletidos pueden ser marcados directamente con un fluorocromo,con enzimas o con haptenos como biotina, o DIG, las cuales son visualizadaspor afinidad citoqumica despus de la hibridacin. Algunas marcas puedenser seguidas qumica o enzimticamente.El primer enfoque fue qumico utilizando oligos sintticos los cuales tenanaminas reactivas o grupos tioles, adicionados en el paso final de la sntesisautomtica. Despus de la purificacin, el oligonucletido reactivo esmodificado con un hapteno. Ejemplo: DIG-NHS o con molculas reporteras.La segunda aproximacin qumica fue probar DIG o biotina y ver que noformaba una unin de tipo covalente coordinado.

Los protocolos enzimticos utilizan deoxinucleotidil transferasa terminal,marcando enzimticamente oligos sintticos en el extremo 3. Algunosmtodos son ventajosos en cuanto a la produccin de sondas a pequeaescala porque no requiere la sntesis y derivatizacin de oligos.

VI. PREPARACIN DEL TEJIDO

El procedimiento para preparar tejidos est determinado por la naturaleza delmismo y los requerimientos especficos del experimento. Las clulas encultivo de tejidos pueden ser crecidas directamente en soportes, en loscuales sern fijadas para posteriormente seccionarlos. Los puntosimportantes para llevar a cabo la fijacin del tejido son: el mtodo deincrustacin y evaluar el material de la superficie de pegado.

a) Fijacin. Para preservar morfolgicamente el material biolgico debe serfijado. La fijacin es un paso crtico para obtener buenos resultados. Desde elpunto de vista qumico existen limitaciones en el tipo de fijacin:

i) Los grupos funcionales involucrados en el aparemiento de las bases estnprotegidos por la estructura de DNA.ii) El RNA es poco reactivo con agentes entrecruzantesiii) La reaccin es reversible con formaldhedo

Para fijar cromosomas metafsicos, sta se hace con metanol/cido actico.Para tejidos embebidos en parafina se usa la fijacin con formalina.Para secciones de tejido congelado (criostato) son fijadas con formaldhedo4% por 30 minutos o con solucin Bovin Fix que ha dado resultadossatisfactorios, al igual que la fijacin por vapor de paraformaldhedo.Las fijaciones entrecruzadas, como por aldhedos, proporcionan facilidad enel acceso y retencin de RNA que precipita en el fijado. Las condiciones parala fijacin son un fuerte compromiso. Fijaciones fuertes permiten una buenapreservacin de la morfologa celular, pero el incremento en elentrecruzamiento baja la accesibilidad al blanco. Lo comnmente usado es

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4% paraformaldhedo, 4% formaldhedo o 1% glutaraldhedo, obteniendo unamayor tasa de entrecruzamiento. La solucin de para formaldhedo puedepreparase fresca o puede ser refrigerada a 4C por dos semanas. Elalmacenaje prolongado favorece la formacin de cido frmico, resultando enuna fijacin inadecuada. La fijacin es llevada a cabo usualmente entre0-4 C inhibiendo de esta manera las endonucleasas endgenas. El tiempode fijacin depende del tamao de la muestra; para clulas aisladas, 20minutos es suficiente, para tejidos de de hasta 1 mm de grosor, 2-3 horas sonsuficientes; para tejidos de hasta 0.5 cms, toda la noche es suficiente; paratejidos de mayor tamao es necesaria la perfusin.La fijacin prolongada (3 4 das) disminuye la intensidad de la seal.Debe ser notado que las secuencias blanco de DNA y RNA estn rodeadasde protenas y que existe una interaccin entre stos que enmascaran losblancos buscados. Por otro lado el procedimiento de permeabilizacin esrequerido.Desafortunadamente un protocoo general de fijacin que pueda ser usadopara todos los sustratos no ha sido descrito. La fijacin y el pretratamiento detejidos debe ser optimizado para distintas aplicaciones.

b) Tejidos embebidos y su seccionamiento. El seccionamiento de lostejidos puede ser realizado en un criostato o embeber la muestra en unamatriz para despus cortarla con un microtomo. Excelentes resultados se hanobtenido seccionando la muestra con el criostato y la ventaja de ste mtodoes que permite la posibilidad de fijar despus de seccionar. Elseccionamiento de tejidos embebidos, tiene algunas ventajas, incluyendo unabuena preservacin en la morfologa del tejido, al igual que los cortes finos delas secciones favorecen la orientacin correcta y se pueden obtener rodajasseriadas al cortarlo. La parafina es el medio ms popular para embebertejidos, pudiendo obtener cortes menores a 1 m. Posteriormente la parafinapuede ser disuelta totalmente del tejido antes de la hibridacin, empleandoxileno e hidratando gradualmente con alcohol. Las secciones muy delgadastienen la desventaja de que emiten poca seal. El grosor de las seccionesusada commnete es de 6-10 m. sto hace posible que las seccionespuedan ser montadas en laminillas e hibridarlas en solucin.Los tejidos embebidos en plstico permiten cortar secciones delgadas comolo requiera la microscopa electrnica.Los tejidos se congelan en nitrgeno lquido y se mantienen a -80C, puedenser seccionados desde 5 m y fijados en acetona fra o 95% etanol por 30minutos antes de la hibridacin. Este mtodo no es el ms recomendablepara la hibridacin in situ porque la morfologa de los tejidos no se conserva.Todos las secciones deben ser puestas en laminillas de vidrio cubiertas conpoli-L-lisina, con el fin de que la muestra tenga una adherencia adecuada yno se desprenda durante el procesamiento. De sto de hablar msampliamente en la sigueinte seccin.Para hibridacin in situ de RNA se deben utilizar guantes estriles almomento de cortar los bloques y cada vez que se haga un nuevo corte se

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debe de cambiar la navaja por una nueva con el fin de reducir lacontaminacin por RNAsas.

VII. TRATAMIENTO DE LA LAMINILLA.

Las laminillas se tratan para que tengan la capacidad de adherir las clulas otejidos y puedan ser retenidos durante los pasos subsecuentes de lahibridacin in situ. Existen mtodos distintos incluyendo el uso de cromo-alumgelatina, poli-L-lisina o aminopropiltrietoxisilina (TESPA). Se ha encontradoque este compuesto proporciona una fuerte adherencia. Alternativamente laslaminillas se venden cargadas positivamente dando una buena adherencia.

VIII. PRE-TRATAMIENTO DEL TEJIDO.

Antes dela hibridacin, el tejido debe tener un pretratamiento para queincremente la eficiencia de la hibridacin y minimice los pegadosinespecficos:

a) Los tejidos o secciones son usualmente tratadas con solventesorgnicos (etanol o metanol) para permeabilizar las clulas removiendo lasmembranas lipdicas. Los tejidos que estn embebidos en cuelquier polmero,es necesario removerlo antes de la hibridacin.

b) Tratamiento con proteasas para facilitar la accesabilidad al RNA deinters. La digestin con proteasas es un paso crtico; una digestininsuficiente o la sobredigestin puede afectar sustancialmente la intensidadde la seal as como la morfologa. La digestin es seguida de una refijacin,de lo contrario la desintegracin del tejido ocurrir. El tratamiento conproteasas mejora la seal obtenida de una sonda mayor a 100 pb (Wilkinson,1999). El tiempo ptimo de tratamiento con proteasas debe ser determinado,ya que difiere entre distintos tejidos. Un problema de procesamiento de unebrin entero es que las proteasas no penetran hasta los tejidos internos ypor tanto la digestin es menos eficiente que en la superficie. Una alternativaa este problema es tratar al tejido con una mezcla de detergentes. Esto esms fcil de controlar pero es menos efectivo que el tratamiento conproteasas.Las proteasas ms utilizadas hoy en da para desenmascarar al mRNAblanco son la proteinasa K, pepsina, tripsina, pronasa E y colagenasas.Generalmente un procedimiento bueno es digerir las seccionesdespaarafinadas por 15 a 30 minutos a 37 C en 10 g/ml de proteinasa K en50 mM Tris/HCl, pH 7.5. El tiempo de digestin depende del tipo de tejido. Laconcentracin de la enzima y la duracin de la digestin debe ser ajustadoempricamente, dependiendo del tipo de tejido y duracin de la fijacin.El control de la temperatura es una consideracin importante. El reducir latemperatura de digestin inadvertidamente e incrementa el ruido de fondo ypresenta variacin dentro y entre especmenes. La digestin se puede llevar

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a cabo en un bao a 37C adicionandole la cantidad requerida de enzima,para posteriormente sumergir la laminilla donde esta fijada la muestra. Elintroducir la laminilla en la solucin de digestin baja la temperatura del bao,entonces se tiene que esperar hasta que ste alcance 37 C y a partir de esemomento se empieza a contar el tiempo de digestin. El proceso de digestinse para lavando la laminilla en una solucin salina, la cual puede ser Tris-buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl).Se ha demsotrado que el uso de la pepsina ha dado excelentes resultadoscon secciones de tejidos embebidos en parafna y fijados con formalina. Ladigestin con pepsina involucra la incubacin de las preparaciones 30minutos a 37C en 200 mM HCl conteniendo 500 g/ml de pepsina. Ladigestin puede pararse lavando las laminillas con Tris buffer salino (TBS) obuffer fosfato salino (PBS) a pH 7.5. El desenmascaramiento enzimtico noes adecuado si se requiere una alta sensibilidad, como por ejemplo unadeteccin de una copia simple del virus del papiloma 16 (HPV).Algunas otras hidrolasas como la colagenasa y la dispasa pueden serutilizadas si por ejemplo las preparaciones son de tejido conectivo o hgadopero stas dan un alto ruido de fondo. Tambin se han utilizado ciclos decongelamiento y descongelamiento para mejorar la penetracin de la sondaen el tejido.

Algunos otros pre-tratamientos son:

c) Inactivacin endgena enzimtica. Cuando hay una enzima es usadacomo marca, la actividad enzimtica endgena puede ser inactivada.Ejemplo, para el caso de peroxidasa la muestra es tratada con 1% perxidode hidrgeno en metanol por 30 minutos. Para la fosfatasa alcalina, ellevamisol puede adicionarse a la solucin sustrato anque esto no esnecesario ya que la actividad residual de la fosfatasa alcalina se pierdedurante la hibridacin.

d) Tratamiento con RNAsas. Sirve para remover RNA endgeno y puedemejorar la seal en hbridos DNA-DNA. Este tratamiento puede ser usadocomo control en hibridaciones de mRNA. Se lleva a cabo incubando lapreparacin con RNAsa (100 g/ml) en 2X SSC a 37C por 1 hora. (SSC=150mM NaCl, 15 mM citrato de sodio pH 7.4).

e) Tratamiento con HCl. En algunos protocolos se trata la muestra de 20 a30 minutos con 200 mM HCl. La accin precisa que provoca el cido esdesconocida pero la extraccin de protenas y la hidrlisis parcial de lassecuencias blanco puede contribuir a un mejoramiento en la seal.

f) Tratamiento con detergentes. Las preparaciones pueden ser pretratadascon tritn X-100, SDS u otro detergente si los componentes de la membranalipdica no han sido extrados por otros procedimientos como fijacin,deshidratacin, incrustacin e inactivacin endgena de la enzima.

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g) Se pueden evitar enlaces de sondas no especficas con grupos aminocargados positivamente por acetilacin de estos residuos con cido acticoanhidro o trietanolamina.

h) Para llevar a cabo la hibridacin de tejidos enteros se tiene que hacer unaprehibridacin. sta contiene todos los componentes de la hibridacinexcepto la sonda y el dextrn sulfato. Esto se hace con el fin de bloquearsitios de enlace no especficos. Para secciones tisulares, la deshidratacin esrealizada gradualemnte (70, 80, 95 y 100%) y la sonda es absorbida. Se hanencontrado que los pasos de prehibridacin no son necesarios parasecciones tisulares. El problema que genera la prehibridacin es que diluye lasonda, decrementando la seal.

i) Para los blancos de DNA de doble cadena, se desnaturaliza con calor.

Lo anterior es esencial para evitar la degradacin de los cidos nuclicosblancos por nucleasas durante los pasos de pre-hibridacin. Esto esespecialmente importante si el RNA es el blanco ya que estas molculastienen una alta susceptibilidad a la degradacin por ribonucleasas. Lasribonucleasas deben ser inactivadas por tratamientos con DEPC, trabajandocon soluciones autoclaveadas y tomando precauciones que el tejido no secontamine con RNasas.

IX.PRE-HIBRIDACIN. Desnaturalizacin de la sonda y su blanco.

Para la hibridacin in situ el DNA cromosomal y el DNA blanco deben serdesnaturalizados. En general algunos tratamientos pueden causar la prdidade morfologa por lo que se debe de llegar al compromiso entre la sonda dehibridacin y la morfologa. Las desnaturalizaciones alcalinas han sidousadas tradicionalmente. La desnaturalizacin por calor ha llegado a serpopular, por su simplicidad experimental y por eficacia. La variacin, tiempo ytemperatura debe ser evaluada encontrando las mejores condiciones paradesnaturalizacin.Para la desnaturalizacin por calor, la sonda y el DNA cromosomal blancopuede ser desnaturalizado simultneamente. Para llevar a cabo esto, se ponela sonda en la laminillas y recubre. Sube la temperatura a 80 C por dosminutos y despus se enfra a 37C. Para tejidos seccionados, si esnecesario, se extiende el tiempo de desnaturalizacin a 10 minutos.Para la hibridacin competitiva, la sonda marcada compite con el DNA nomarcado. Para desnaturalizar se sube la temperatura (hasta 80C), una vezque el DNA cromosmico se ha desnaturalizado, se baja la temperatura, paraque se lleve a cabo la competencia.

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X. HIBRIDACIN.

La hibridacin se realiza bajo condiciones ptimas que permiten larenaturalizacin de la sonda al cido nucleico (blanco) en el tejido.El tejido es lavado para remover las sondas que no se hibridaron.La hibridacin depende de la capacidad que el DNA desnaturalizado tengapara renaturalizarse con la cadena complementaria justo por debajo de suTm (temperatura de fusin).La Tm es la temperatura a la cual la mitad del DNA est presente en cadenasencilla (forma denaturalizada). La Tm puede ser calculada midiendo laabsorcin a 260 nm. La estabilidad del DNA es dependiente del contenido deGC. Mientras el DNA tenga mayor contenido de GC, la Tm ser ms alta.La Tm est influenciada por varios factores:a) Naturaleza de la sonda y sus blancos. Los hbridos RNA-RNA son msestables que RNA:DNA que a su vez son ms estables que los hbridosDNA:DNA. Cada tipo de sonda posee distintas ventajas y desventajas, lascuales requieren consideraciones para hacer una buena prueba dehibridacin in situ.Por ejemplo, las sondas de oligonucletidos tienen baja especificidad,aunque pueden ser los nicas que detectan el cambio en una base. Este tipode sondas son poco sensibles ya que poseen pequeo tamao, y al serincorporadas al blanco la estabilidad del hbrido disminuye.La sonda de doble cadena de DNA se sintetiza de manera ms sencilla y esms resistente a la degradacin, pero puede ser de las menos sensibles porlas renaturalizaciones que ocurren con las sondas marcadas .En general las sondas de DNA o RNA deben ser menores a 400 pb, parafacilitar la penetracin al tejido. Oligonucletidos pequeos (15 a 40nucletidos) pueden ser usados como sondas pero es difcil amplificar laseal. Los oligonucletidos poseen problemas adicionales desde un punto devista cintico, porque algunas bases estn comprometidas a puentes dehidrgeno para estabilizar al hbrido por lo que los oligos pueden serfcilmente disociados durante el proceso.Ambas reacciones de acomplamiento enzimtico y directo pueden ser usadaspara marcar oligos. En general los oligos pequeos son marcados por tailing3 con unas series de bases: biotina, DIG o 2,4 dinitrofenil. ste ltimoprovee de muy buena seal. Las sondas deben unir regiones nicas en elDNA o RNA blanco. Algunos programas computacionels como Oligo 5.0(Molecular Biology Insights, Inc. Cascade Co.) son muy tiles para identificarregiones probables de pegado en una secuencia dada.El largo de la sonda puede influenciar la calidad de los resultados. Sondaslargas ofrecen la ventaja de incrementar la amplificacin de la seal porquede un gran nmero de nucletidos marcados y bajas tasas de disociacindebido a un extenso nmero de residuos comprometidos a formar puentes dehidrgeno.

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Tabla 2. Ventajas y desventajas entre las sondas que se pueden utilizar parala hibridacin in situ

Sondas Ventajas Desventajas

ds cDNA (DNA doble cadenacomplementaria)

Estables, marcadasfcilmente por random

priming, nick translation oPCR; alta actividad

especfica, buena deteccinpor una gran nmero de

marcas incorporadas

Necesitan secuenciassubclonadas en un vector

requiriendo biologamolecular; puede

renaturalizarse ella mismabajando la eficacia de pegado

despus de ladesnaturalizacin. Solamenteuna cadena (antisentido) estadisponible para la hibridacin

a mRNA. Problemas en lapenetracin de sondas muy

largas al tejido; el vector de lasecuencia puede producirhibridacin no especfica

ss RNA (cadena sencilla deRNA)

Cadena sencilla, altaactividad especfica,

sintetizada fcilmente ymarcada por transcripcin in

vitro. Gran estabilidad dehbridos RNA:RNA, alta

especificidad en lahibridacin, los lavados

pueden ser muy astringentes.El antisentido entero es

aprovechado para formarhbridos

Susceptibilidad a ladegradacin por

contaminates (RNasas), portanto se requieren medidaspara minimizar este tipo deproblemas. Pegados muyfuertes con respecto a las

sondas de doble cadena deDNA, incrementa el ruido defondo; las sondas muy largas

presentan problemas depenetracin al tejido

Sondas de oligonucletidos

Largas, definidas, cadenasencilla, sintetizada fcil y

rpidamente; excelenterendimiento en cuanto a

penetracin; capacidad paradiferenciar secuencias muy

parecidas

Baja sensibilidad en ladeteccin debido a su altaespecificidad. Los hbridos

son menos estables debido altamao pequeo, por tanto

los lavados muy astringentesdecrementan la intensidad de

la seal

a) Largo de la sonda. Las sondas largas forman hbridos ms estables comoya se habl anteriormente.

b) La composicin de la sonda. Dos puentes de hidrgeno en cada par debases A:T/U, y tres puentes de hidrgeno en cada par de base G:C. por lotanto, el alto contenido de GC propicia una Tm alta.

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c) Identidad. La identidad de la secuencia entre la sonda y el blanco. Si lasonda es divergente es la secuencia de pegado, esto formar hbridos menosestables que las sondas homlogas. El efecto en la Tm es mayor parasondas pequeas.

d) Composicin de la solucin de lavados de la hibridacin. Altasconcentraciones de cationes monovalentes, como iones de sodio, incrementala estabilidad de los hbridos. Los cationes monovalentes interactanelectrostticamente con los grupos fosfaos de los cidos nucleicos. Larepulsin electrosttica entre las dos cadenas del duplex disminuye con unaalta concentracin de sal. Bajas concentraciones de sales afectan la Tm aligual que la tasa de renaturalizacin.La concentracin de iones de sodio por arriba de 0.4 M afectan ligeramente latasa de renaturalizacin y la Tm.

e) Desnaturalizacin del DNA. El DNA se desnaturaliza entre 90-100C en0.1-0.2M NaCl. Para la hibridacin in situ implica que la preparacinmicroscpica puede ser hibridada a 65-75C por periodos prolongados. Estopuede deteriorar la morfologa. Afortunadamente los solventes orgnicosreducen la estabilidad trmica de la doble cadena, por lo que la hibridacinpuede ser realizada a bajas temperaturas en presencia de formamida.La formamida ha sido por aos el solvente orgnico por excelencia. stareduce la Tm de los duplex DNA-DNA y DNA-RNA 0.6-0.72C por porcentajede formamida; tambin reduce el ruido de fondo en la hibridacin.La hibridacin puede realizarse entre 30-40C con 50% formamida presenteen la mezcla de hibridacin.La tasa de renaturalizacin decrementa en presencia de formamida. La Tmdel hbrido en presencia de formamida puede ser calculada de acuerdo a lasiguiente ecuacin:

Para 0.01-0.2M NaCl

Tm=16.6 log M + 0.41 (GC) + 81.5-0.72 (% de formamida)

Para concentraciones de NaCl por encima de 0.4M

Tm= 81.5 + 0.41 (GC) 0.72 (% de formamida)

Para obtener un mayor incremento en la hibridacin in situ para rDNA seutiliza 70% de formamida a 37C. Durante el proceso de hibridacin, grandescantidades de DNA pueden perderse (Raap et al., 1986).

f) pH. Desde un rango de 5-9 la tasa de renaturalizacin es independiente depH.

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g) Temperatura. La tasa mxima de renaturalizacin de DNA es a 25C. Sepuede llevar a cabo en el rango que va desde 16C hasta 32C por debajo dela Tm.

Para los experimentos de hibridacin, se han desarrollado frmulas parapredecir la Tm. Todo esto es aplicable a hbridos en solucin, donde loshbridos formados por el entrecruzamiento de los cidos nuclicos presentesen el tejido son menos estables, presumiblemente porque los impedimentosestricos no permiten la renaturalizacin de la sonda en toda su extensin.Los hbridos RNA:RNA formados durante la hibridacin in situ tienen una Tmcerca de 5C menos que los hbridos formados en solucin.

(a) Hbridos DNA:DNA (sondas de DNA con ms de 22 bases):

Tm=81.5+16.6 log(molaridad de cationes monovalentes)+41(fracciones G+C)-500 largo de la sonda en bases-0.62 (% de formamida)

(b) Para deoxioligonucletidos entre 14 y 20 pares de bases, bajocondiciones standard (0.9 M NaCl), es usada para estimar la temperatura dehibridacin. sta se lleva acabo entre 10 y 15C por debajo de la Tmcalculada:

Tm=4(suma de G+C) + 2 (suma de A+T)

(c) RNA:RNA. Para las osndas de RNA:RNA la siguiente frmula ha sidousada para calcular la Tm

Tm= 79.8+18.5log(molaridad de cationes monovalentes)+58.4(fracciones G+C)+41.8(fracciones G+C)2-820

(largo de las sondas en bses)-0.35(% de formamida)

Para RNA:DNA, el ltimo trmino es reemplazado por 0.5% ede formamida.La cintica de la hibridacin in situ no es an bien conocida, especialmenteporque esta influenciada por la accesibilidad de la sonda, tambin dependedel entrecruzamiento en el tejido, el tamao de la sonda y para el mRNA, lasposibles estructuras secundarias.

Los siguentes factores son importantes:

(a) Concentracin de la sonda. La alta concentracin de la sonda asegurauna tasa alta de renaturalizacin, que por otro lado incrementa el ruido defondo. La concentracin ideal de la sonda y la tasa de hibridacin se puedenincremenatr utilizando un agente como el dextrn sulfato.

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(b) Dextrn sulfato (5 al 10%). En soluciones acuosas el dextrn sulfato estfuertemente hidratado. Esto resulta en un incremento en la concentracinrelativa de la sonda porque el agua interacta con el dextrn sulfato,aumentando la tasa de hibridacin. El dextrn sulfato incrementa tambin laviscosidad de la solucin de hibridacin, por eso decrementan la tasa a lacual la sonda pueda difundirse hacia su secuencia blanco.

(c) Selectividad de la hibridacin. Durante la hibridacin se formandplexes entre bases correctamente apareadas y con menos frecuencia conotras bases que no corresponden a su complementaria. Esto puede sermanipulado por la selectividad de la hibridacin in situ.Para remover el ruido de fondo asociado de hbridos no especficos sesomete a lavados con una solucin con baja concentracin de sal. La bajaconcentracin de sal y la alta temperatura inducen una alta selectividad en ellavado, ya que esto desestabiliza el dplex. Las fuerzas repulsivas de losenlaces fosfodister cargados negativamente estn expuestos, por lo que sino hay suficiente concentracin de sales, no tendr la capacidad deneutralizar las cargas y por tanto habr una alta selectividad. nicamente lasbases correctamente aparaeadas podrn contender con las fuerzasrepulsivas.

(d) Bases mal apareadas. Resultan en la reduccin tanto de la tasa dehibridacin como en la estabailidad trmica del dplex resultante. Para teneruna fuerte discriminacin entre secuencias de DNA cercanamenterelacionadas, se hibrida bajo condiciones astringentes. En promedio la Tmdecrementa cerca de 1C por base mal apareada en sondas largas. El malapareamiento de las bases en oligonucletidos influencian fuertemente laestabilidad del hbrido.

(e) El tamao de la sonda. La tasa de renaturalizacin del DNA en solucines proporcional a la raza cuadrada del tamao del fragmento (cadenasencilla). La tasa de mxima hibridacin es obtenida con sondas largas. Lasiguiente frmula relaciona a fragmentos cortos y largos con el cambio en laTm (cadena doble):

El cambio en la Tm * n = 500

Donde n=nucletidos.

XI. LAVADOS POST-HIBRIDACIN.

Los lavados de las muestras hbridadas se llevan a cabo para removersondas no especficas. Los requerimientos crticos son: usar las condicionesapropiadas de selectividad para remover nicamente las sondasinespecficas. La astringencia (moderada a alta se lleva a cabo en los lavadospost-hibridacin (subiendo la temperatura por debajo de la Tm). sto es

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importante saberlo porque sondas pequeas o sondas ricas en AT tendrnpoca seal si se lavan con una alta astringencia.Para los sondas de RNA, los lavados pueden llevarse a cabo conribonucleasas, degradando todas las cadenas sencillas, dejando nicamentelos hbridos de doble cadena, aumentando la especificidad y bajando el ruidode fondo. Para remover las sondas que hayan hibridando con secuencias

heterlogas, es necesario aplicar un lavado altamente selectivo que asegureque la seal que estamos percibiendo es de secuencias homlogas.

XII. DETECCIN.

El paso final de la hibridacin in situ es la deteccin de la sonda marcada enel tejido. El mtodo para sto depende del tipo de marcaje que ha sidoincorporada en la sonda.

a) Sondas radioactivas. Para las sonda radioactivas marcadas con 35S sepuede obtener una baja resolucin en la seal, poniendo la laminilla dehibridacin encima de un film de rayos-X durante toda la noche. Esto puedeser til para obtener rpidos resultados, cuando se conocen las ptimascondiciones, pero la resolucin es tan baja que no puede ser til para otrospropsitos. Una mejor resolucin es obtenida sumergiendo la laminilla de unaemulsin, la cual es secada y expuesta a 4C. Algunos factores afectan lacalidad de los resultados obtenidos por este mtodo:

i) El grado de emulsin. Los grados altos son ms sensibles pero dan unaresolucin muy pobre en la seal.

ii) El espesor de la emulsin. Para 35S, una capa fina de emulsinproporciona una buena seal pero baja rresolucin.

iii) Almacenamiento y vida media de la emulsin. La emulsin puede seraislada de radiacin para evitar un alto rudio de fondo por granos de plata.Adems los granos de plata son generados por un mal manejo (estrsmecnico) por lo que la emulsin debe ser tratada sin moviemientos bruscos.El secado de las laminillas no debe ser muy rpido.

iv) Condiciones de exposicin. La temperatura y las condiciones dehumedad afectan la eficiencia de la autorradiografa.

v) Tiempo de exposicin. Se debe evitar la sobreexposicin ya que stocausa una reduccin en la seal radioactiva.

vi) Condiciones para revelarla. El uso de altas temperaturas, agitacin delas laminillas o un tiempo largo para desarrollar grandes campos de granosde plata, ocasiona una baja resolucin.

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Despus el tejido es teido, usualmente con una tincin nuclear como azul detoluidinda.Altas densidades de granos de plata pueden ser observados bajomicroscopa de campo claro o en un microsopio de luz, pero la visualizacinms sensible pere detectar los granos de plata es usar la iluminacin decampo oscuro. Un problema con sto es que el tejido est teido y puede serdifcil correlacionar la seal con clulas especficas. Por eso es que sesobrepone la seal del tejido, tomando una doble exposicin fotogrfica, en elcanal rojo, de los granos de plata bajo campo oscuro, encima de una imagende campo claro.

b) Sonda marcadas con haptenos. La localizacin de sondas marcadas conhaptenos pueden ser visualizadas por microscopa de fluorescencia, si lasonda es marcada con un fluorforo o indirectamente con un anticuerpoconjugado. Estas tcnicas funcionan muy bien para hibridacin in situcromosomal y ofrecen un gran flexibilidad para detecciones simultneas desecuencias mltiples, pero slo son suficientemetene sensibles para ladeteccin de mRNAs abundantes. Un mtodo ms sensibles es amplificar laseal usando una enzima acoplada a un anticuerpo o una protena por la cualel sustrato cromognico est disponible para generar un producto insolublecolorido. Los anticuerpos mayormente usados son anti-DIG o antifluorescena conjugados a fosfatasa alcalina (AP), usando NTB-BCIP comosustrato. La alta estabilidad de esta enzima permite amplificar la seal. Unavariedad de otros sustratos estn disponibles, deteniendo productoscoloridos: rojo, magenta, verde fluorescente, pero estos son menos sensiblesque NTB/BCIP.La -galactosidasa es una enzima estable y con X-gal como sustrato escomnmente usada adems del conjugado a estreptavidina.La peroxidasa de rbano es menos estable y puede ser usada parapequeas reacciones cromognicas.Antes de la incubacin con diluciones de anticuerpos conjugados anti-haptenos, los tejidos a hibridar son princubados con una solucin quecontiene detergentes y otros agentes que bloquean el pegado indespecficodel anicuerpo.El tejido es entonces incubado con el anticuerpo a una ptima concentracin;si el anticuerpo est muy diludo la seal se perder, pero si est en excesocausar un alto ruido de fondo. Lavados extensivos con buffer que contienedetergentes, como 0.1% de Tritn X-100, es entonces llevado a cabo pararemover anticuerpos no unidos. Las altas concentraciones de detergentespueden causar una baja en las interacciones especficas de anticuerpos, ypor tanto decrementa fuertemente la seal. Finalmente la reaccincromognica es llevada a cabo equilibrando el tejido con el sustratocromognico que es convertido por la enzima en un producto coloridoinsoluble. Es importante saber que no hay algunas enzimas endgenas quepueden generar el producto. Para el caso de la fosfatasa alcalina, lalevamisola puede ser includa en la reaccin ya que esta inhibe otras

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fosfatasas distinta a la fosfatasa alcalina conjugada al anticuerpo. En muchostejidos sto no es necesario, pero en otros casos, pueden existir fosafatasasendgenas que no son afectadas por este inhibidor; entonces estas puedenser inactivadas por calor o por tratamiento con cido antes de la incubacincon un anti-hapteno. Si la peroxidasa es usada para la reaccin cromognica,la peroxidasa endgena debe ser inactivada, preincubando con perxido dehidrgeno. Por otro lado altas temperaturas son usadas durante la hibridaciny los lavados inactivan las peroxidasas endgenas y muchas fosfatasas.Algunos protocolos incluyen una incubacin con H2O2.

XIII. TCNICAS DE DOBLE TINCIN

La deteccin mltiple de secuencias gnicas en cromosomas es invaluablepara el anlisis de su organizacin fsica y esto puede ser llevada a cabo poruso de anticuerpos anti-haptenos anclados a diferentes fluorocromos. Ladeteccin de algunos productos gnicos es til para relacionar la expresinde un gene particular en un tipo celular o dominios espaciales marcados porla expresin de un gen.La hibridacin in situ puede ser combinada usando sondas radioactivas conotro mtodo de deteccin, pero una detccin mltiple puede ser realizada porsondas marcadas con diferentes haptenos que son detectados conanticuepos conjugados a enzimas.Dos enzimas distintas pueden ser usadas para las reacciones cromognicas,pero debido a la alta estabilidad de la fosfatasa alcalina, el mtodocomunmente usado es la deteccin de la sonda con un anticuerpo-peroxidasas usando sustratos que permitan diferenciar los productoscoloridos.Alternativamente la hibridacin in situ puede ser combinada coninmunohistoqumica para detectar protenas especficas u otros antgenos. Ladeteccin de un producto gnico no puede comprometer la deteccinsubsecuente del otro. Una limitacin de stos mtodos es que solamente esposible detectar seal bajo condiciones ptimas. Los principales problemasson que un color puede fcilmente enmascarar a otro y/o el producto formadono permite el acceso de otro reactivo. Adems, muchos de los sustratosdisponibles son menos sensibles o dan mayores tinciones inespecficas queel NTB/BCIP. Una posibilidad es usar fluorocromos conjugados a anticuerpossi son lo suficientemente sensibles. Estas limitaciones se resolvern con eldesarrollo de sustratos y nuevas enzimas y/o desarrollando fluorocromos msintensos y sensibles. En el futuro, sto ser posible, generando cidosnuclicos modificados que permitan la deteccin espectroscpica de hbridosen tejidos vivos.La hibridacin in situ puede ser sombinada con tcnicas que revelanaspectos de fisiologa celular as como la organizacin y la deteccin de unlinaje celular. Tambin se puede detectar la proliferacin celular por laincorporacin in vivo de 5-bromodeoxiuridina dentro del DNA. El diseo dealgunos protocolos estn en funcin de la deteccin, por ejemplo si la

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deteccin de un linaje celular con molculas fluorescentes que se intercalanen la membrana lipdica, la fotoconversin de esta seal en una tincinpermanente tiene que realizarse antes de la hibridacin in situ.

XIV. CONTROLES

La seal puede surgir no slo de los sitios de hibridacin de la sonda sinotambin de otros lugares. Es importante que los controles apropiados estnpresentes para evaluar la especificidad de la seal. Los siguientes puntos sonposibles causas de seales inespecficas:

a) Hibridacin cruzada con secuencias de cidos nuclicosinespecficasi) Se deben de tomar precauciones en el diseo de la sonda para minimizarla posibilidad de una hibridacin con secuencias relacionadas. Evaluar si elmismo patrn es observado usando sondas con regiones distintas deltrnscrito.ii) Si se est usando una selectividad moderada, la posibilidad de que lahibridacin cruzaada ocurra en estas condiciones puede ser evaluadaobservando si el mismo patrn de expresin es detectado con una mayorastringencia o si se usa una sonda de RNA despus de un tratamiento conRNasa post-hibridacin.iii) Averiguar si la sonda no hibrida inespecficamente bajo las condicionesselectivas adoptadas en el protocolo. Esto puede ser probado con unSouthern-blot o Northern-blot.

b. Enlaces inespecficos de la sonda.i) Un control usulamente usado para la hibridacin especfica del mRNA esusar una cadena sencilla sentido inespecfica al RNA blanco. Una alternativavlida es usar una sonda de expresin gnica distinta y en el caso deoligonucletidos usar una secuencia tipo scrambled como sonda.ii) Un tratamiento pre-hibridacin del tejido con RNasa el cual remover elRNA blanco. Si la seal es an generada, entonces es probable que lasonda se est pegando a otros componentess celulares. Este control esconveniente para las sondas de DNA, pero si la sonda es de RNA debe detomarse en cuenta que las RNasas no degraden la sondaiii) La inclusin de un exceso de sonda no marcada que decrementardrsticamente la seal especfica, pero si el efecto es mnimo, seguramenteexiste un enlace no especfico entre la sonda y otros componentes celulares.iv) Si la seal es generada despus de omitir la sonda puede ser debido a losenlaces inespecficos de los agentes de deteccin.

c. Generacin inespecfica de la seal.i) Para sondas radioactivas la seal puede ser generada debido al estrsmecnico o quimiografa de la emulsin fotogrfica. La seal an estarpresente despus de omitir la sonda.

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ii) Para sondas marcadas con haptenos detectados con anticuerposconjugados a enzimas, la seal puede ser generada por enzimas endgenas.Esto puede evaluarse por controles en los cuales la sonda y el anticuerpo noestn presentes.

Aqu son listados algunos artefactos ms comnes y sus posibles soluciones.

a) Ruido de fondo sobre la laminilla (sondas radiactivas). ste es el msfrecuente debido a la emulsin. Evaluar la emulsin sumergiendo unalaminilla blanca. Un ruido de fondo muy alto, puede aparecer en las orillas dela laminilla debido al secado muy rpido de la sonda durante la hibridacin,evitando tener secciones de tejido cerca de las orillas de la lmina.

b) Ruido de fondo en los lmittes del tejido (sondas radioactivas). Granos deplata pueden ser detectados alrededor del tejido por estrs menico duranteel secado. El secado de la emulsin debe ser muy lento reemplazandol porun plato fresco.

c) Ruido de fondo uniforme sobre el tejido. ste es el mayormente causadopor enlaces no especficos de la sonda, el cual puede ser debido a:i) Para sondas de RNA, la secuencia del plsmido ha sido transcrita.ii) La sonda es muy larga o muy pequea.iii) La concentracin de la sonda es muy alta (o tan pequea que el ruido defondo llega a ser un factor imitante despus de una larga exposicin(reaccin colorimtrica).iv) La baja selectividad de los lavados en la hibridacinv) Si la digestin post-hibridacin con ribonucleasas est actuando sobre lasonda de RNA.vi) La sonda es enlazada a un componente celular. Esto amerita evaluar unaregin distnta en el mismo gene. Se evita usar sondas que sean ricas en GC.

d) Ruido de fondo sobre tejidos especficos. Ciertos tejidos parecenfavorecere ms el pegado de la sonda que otros. Tratando diferente a lasonda o ajustando la concentracin, la hibridacin y/o las condiciones delavado puede ayudar.

e) Ruido de fondo con sondas marcadas con haptenos. Puede ser debidoa:i) Alta concentracin del anticuerpo anti-haptenos.ii) Bloqueo insuficiente de sitios de pegado inespecfico antes de lahibridacin. Condiciones muy astringentes en los lavados al igual que en lasde bloqueo.iii) Presencia de enzimas endgenas que pueden catalizar la seal dedetccin. El uso de inhibidores a una alta temperatura o con cidos puedenser usados para inactivar ciertas enzimas endgenas.

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iv) Sondas marcadas con biotina, la presencia de haptenos endgenos en eltejido, pueden causar un alto ruido de fondo.v) Durante la hibridacin, la sonda y el anticuerpo pueden quedarseatrapados en cavidades del tejido lo cual ocasiona un ruido de fondo, parasolucionar este problema, se tratan de evitar la formacin de estas cavidadesusando frceps o agujas para acomodar el tejido antes de la hibridacin.

f) La baja seal puede ser debida a:i) Degradacin del blanco. La contaminacin con nucleasas puede serevitada en las soluciones y recipientes usados para la pre-hibridacin y lostejidos pueden ser fijados fcilmente.ii) La fijacin del tejido y/o el tratamiento con proteasas no es ptimo.iii) Baja eficiencia en el marcaje de la sonda. Checar si sto no es unproblema de los nucletidos marcados y que la concentracin sea correcta enla reaccin de marcaje.iv) El tamao de la sonda (muy larga o muy corta)v) La baja concentracin de la sondavi) La alta selectividad de los lavados en la hibridacinvii) Una abundancia baja del blanco. Los factores limitantes sern sensiblesal mtodo y al ruido inespecfico. Si es posible es recomendable una sondalarga.

XV. FOTOGRAFA

La fotografa de los datos de hibridacin in situ es un paso crucial paraobtener un buen registro de los datos. Las fotografas de baja calidad puedenser tomadas usando un microscopipo de diseccin, pero un microscopiocompuesto es requerido para las fotos de buena calidad. Es fundamentaltener un microscopio equipado con los filtros y lentes apropiados: porejemplo, contraste diferencial (DIC, Nomarski) de se desea visualizar clulassin tincin, iluminacin epifluorescente para visualizar los granos de plata.Las secciones de tejidos son montadas en glicerol al 70% y algunas vecessto puede ser til para disectar parcialmente al tejido y la seal esvisualizada fcilmente. La pelcula correcta debe ser usada. Para microscopade campo claro y oscuro, pelculas de alta resolucin ASA de 64 o 100 sonusadas. Para imagenes de baja intensidad fluorescente es preferible usarpelculas ms sensibles. Las fotografas blanco y negro son tomadas usandopelculas negativas. Para fotografas de color es mejor usar slide film ya queestas pueden ser usadas directamente para presentaciones y es fcil obtenerel balance de color correcto.Es muy importante conocer como se usa el microscopio correctamente ycomo tomar fotografas con la exposicin correcta en la cual la muestra escorrectamente orientada, enmarcada y enfocada. Las imgenes pueden serregistradas directamente del microscopio o por scaning de la fotografa, yesto aumenta y realza la generacin de figuras.

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XVI. MICROSCOPA

a) De campo claro. Las imgenes son obtenidas por transmisin directa deluz a travs de la muestra.La evaluacin de los resultados de hibridacin in situ por microscopa decampo claro es preferida para muchas aplicaciones rutinarias porque laspreparaciones son permanentes. Por otro lado la sensibilidad demandadapara muchas aplicaciones requiere de microscopa ms sosfiticada (ejemplo:localizacin de una copia de un gen, requiere el deteccin de atogramos deDNA).b) De campo oscuro. La luz dispersa entra a los lentes del microscopio, portanto el material aparece como un objeto iluminado en un fondo negro.Esta microscopa es extensivamente usada para experimentos radioactivosporque el campo puede ser examinado a una magnificacin baja. Ladistribucin de los granos de plata pueden ser vistos con un gran contraste.Este tipo de microscopa es usada rara vez para localizar productos conmarcaje radioactivo.c) De contraste de fases. Explota los efectos de la interfase producidacuando dos sets de onda se combinan. ste es el caso cuando la luz pasa atravs de una parte delgada o densa de la clula (como el ncleo) y esretrasda. En consecuenia su fase es cambiada relativamente a la luz quepasa por una regin adyacente (delgada) del citoplasma.La microscopa de contraste de fases es usada para deteccin enzimtica.d) Microscopa de contraste de reflexin. Es similar a la de contraste defases. Esta tcnica mide el cambio de la longitud de onda de la luz reflejadade la muestra que de la luz emitida directamente.Bonnet hizo la observacin que con microscopa de contraste de reflexin, elproducto DAB/peroxidasa produca reflexiones brillantes cuando lascantidades eran extremadamente baja. Esta propiedad hizo que estamicroscopa se conviertiera en el medio para detectar una copia simple delgen sin radiactividad.Estudios de la formacin de imgenes DAB en esta microscopa handemostrado que producen mejores resultados en objetos delgados.e) De fluorescencia. Contiene una lmpara para excitar fluorforo y un filtroespecial, el cual transmite un alto porcentaje de luz emitida por el fluorforo.La microscopia de fluorescencia es de gran utilidad para la hibridacin in situno radioactiva; sta es altamente sensible. Adems sta puede ser usadapara excitar tres inmunofluorforos diferentes con espectros de emisinseparados (lo cual permite una deteccin mltiple). Tambin el uso desistemas altamente sensibles facilita la cuantificacin de la seal.f) Imgenes digitales. Puede detectar seales que no pueden ser vistas conmicroscopa covencional. La tecnologa de procesamiento de imgenesprovee de un mejoramieto dn la deteccin de la seal como medida de datoscuantificados. El sistema ms sensible hoy en da es la cmara CCD (ChargeCoupled Device), que detecta fotones con una alta eficacia sobre un rango deamplio espectro de longitud de onda. Si se quieren ver imgenes en dos

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dimensiones, ste es el instrumento ideal. Para anlisis en tres dimensionesla microspia confocal es una alternativa.g) Microscopa electrnica. La resolucin de este tipo de microscoparesalta cuando los electrones en lugar de luz son usados, teniendo cortaslongitudes de onda (0.004 nm). El poder de resolucin de los microscopioselectrnicos ms modernos es de 0.01 nm. La resolucin de la microscopiaelectrnica es de 0.1 nm resuelve las estructuras finas de la clula.h) Flujo citomtrico. La velocidad donde la cual la fluorescencia de clulasindividuales puede ser medido con un flujo citomtrico lo cual tiene muchasventajas para la cuantificacin de la seal en la hibridacin in situ.

XVII. ALGUNAS OTRAS TCNICAS: PRINS

Es la tcnica de marcaje de DNA con un primed in situ. Consiste en usaroligonucletidos pequeos (18-22) e hibridarlos con las secuencias deinters. El oligo es renaturalizado al DNA celular. La reaccin se lleva a cabopor la incorporacin de precursores dUTP marcados con biotina odigoxigenina, usando una DNA polimerasa termoestable. Una base malaperadad emite el blanco y la sonda produce un hbrido menos estable anivel trmico. Adems si el nucletido esta localizado en extremo 3, nopermitir ninguna enlongacin por la DNA polimerasa.

a) Principios y mtodos de in situ PCRLos protocolos experimentales de esta tcnica comparten varios pasos de lahibridacin in situ, como fijacin de la muestra, permeabilizacin durante lapreparacin de la muestra.i) Preparacin de la muestra. Para preservar la morfologa y permitir elacceso de los componentes del PCR en la clula, las muestras necesitan serfijadas y permeabilizadas. Para fijar la muestra se sumerge enparaformaldhedo y formaldhedo con etanol y cido actico.

Los pasos de fijacin son una varible crtica que determinan a PRINS. Lasmuestra que estn embebidas en parafina poseen ciertos incovenientescomo impedimentos para accesar los componentes del PCR al DNA nuclear(o cDNA citoplsmico) y tambin en la preservacin de DNA o RNA. Ladigestin con proteasas en los tejidos, despus de la fijacin contribuye a unbuen PRINS, removiendo el DNA unido a protenas, hacindo huecos en lasmembranas del ncleo y citoplasma. La sobre sobredigestin y la digestinineficiente pueden dar falsos positivos o negativos. Basagra et al., hansugerido una estrategia para determinar la duracin ptima de la proteolisisde distintas muestras que involucran la evaluacin por contraste de fases.

b) Amplificacin in situ. Puede llevarse acabo con clulas o tejidos fijadosen solucin. En el caso de muestras en suspensin las clulas sonrecuperadas por centrifugacin, despus del PCR. Para el caso de lasmuestras en laminillas el material celular y los compnentes del PCR son

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mezclados y algunas medidas son tomadas para evitar la evaporacin. Unaventaja de las clulas en suspensin es que pueden ser lisadasy analizadaspor electroforesis o Southern-blot y de esta manera comprobar si se llev acabo el PCR. Las clulas fijadas parecen funcionar como sacos deamplificacin con membranas semipermeables que permitan al primer, a losdNTPs y a la DNA polimerasa pasar a travs del ncleo y citoplasma. Enalgunos casos la difusin es insuficiente y esto afecta la deteccin. Unproblema recurrente con PRINS ha sido la inconsistencia de los resultados, locual podra deberse a las variables mecnicas (aparatos) o biolgicas.

c) Deteccin de productos de PCR en la clula. La visualizacin deproductos de PCR intracelulares son detectados por sondas marcadas (PCRin situ indirecto) o a travs de deteccin inmunohistoqumica de nucletidosmarcados (ej. Digoxigenina-1-dUTP, fluorescena-dUTP) que han sidoincorporados en los prductos de PCR durante los ciclos trmicos.PCR in situ directo suele resultar en falsos positivos, especialmente cuandose trabaja con secciones de tejido. Los falsos positivos resultan deincorporacin de oligonucletidos marcados no especficos en fragmentos deDNA. Estos artefactos exhiben seales nucleares y son evidentes en clulasapoptticas, donde la fragmentacin del DNA es una caracterstica clave. Lafijacin puede incrementar el nmero de muescas (nicks) en la cadena dobleo sencilla. Los artefactos en la tcnica, pueden ser reducidos por unaexonucleasa o reparando nicks de DNA con una T4 DNA ligasa o usandociclos con sondas no marcadas. sto no elimina a los falsos positivos pero essuficiente para llevar a cabo una deteccin especfica.Los mtodos indirectos usando sondas que reconocen secuenciasamplificadas proveen unas mxima especificidad en la deteccin deproductos de PCR intacelulares. Las sondas largas completas o sondasgenmicas son usadas para incrementar el nmero de molculas reporteras ytener una buena seal.La naturaleza de los sistemas reporteros pueden influenciar la calidad en losexperimentos de hibridacin in situ. Las sondas radioactivas ofrecen una altaestabilidad, aunque tambin tienen sus desventajas como el costo, etc. lossistemas colorimtricos basados en fosfatasa alcalina o peroxidasa resultanen una seal pobre lo cual aparenta una baja eficiencia de la tcnica. Lossistemas de deteccin basados en la fluorescenca han sido utilizados, perostos no son muy recomendables para esta tcnica porque no se preservadel todo la morfologa del tejido.

d) Eficiencia de PCR in situ. Muchos factores contribuyen a que la eficienciasea baja en la amplificacin, incluyendo ciertos efectos deletreos de lafijacin con aldhedo. Para maximizar la eficiencia de los pasos de PCR,varios grupos han determinado empiricamente la temperatura derenaturalizacin, tiempos de extensin que son requeridos generalmentepara relacionar las temperaturas imprecisas, etc. El incremento en laconcentracin de DNA polimerasa y iones de magnesio son requeridas por

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los efectos absortivos de las laminillas o por las enzimas contaminantes queeluyen de los tejidos o superficies de las laminillas.

e) PCR in situ tiene un gran nmero de aplicaciones en diagnstico.Algunos grupos han reportado que esta tcnica es excelente para detectarcopias de secuencias de cidos nuclicos en clulas y para detectar pocascopias de DNA o RNA en secciones de tejido. Muchos de los estudios se hanenfocado en la deteccin viral o proviral de secuencias de cidos nuclicos.Adems PCR in situ ha sido aplicado en estudios de secuencias de DNAendgeno, incluyendo copias de genes, rearreglos de genes ytranslocaciones cromosomales y para mapear un bajo nmero de copias enlos cromosomas metafsicos. Recientemente se ha reportado la deteccin deun bajo nmero de copias de mRNA y RNA virales. En la tabla 3 se muestranlas aplicaciones de la tcnica PCR in situ.

Tabla 3. Aplicaciones de la hibridacin in situ

DNA/RNA extrao

DNA endgeno

mRNA endgeno

BlancoDNA lentivirusDNACitomegalovirusDNA Papilloma virus humanoDNA Virus de inmunodeficiencia humana(HIV)DNA Virus de tumores mamarios de ratn(MMTV)RNA virus de hepatitis C (HCV)DNA virus de hepatitis B (HBV)DNA virus de herpes simplex (HSV)DNA virus JCDNA Virus humano T-linfotrpico (HTVL)DNA virus de inmunodeficiencia en simios(SIV)DNA Pneumocystis carinniDNA Mycobacterium tuberculosis

Mutaciones fibrosis qusticaRearreglos de genesTranslocaciones cromosomalesMapeo de cromosomas

mRNA lipoxigenasa-12mRNA metaloproteinasamRNA Factor neural de crecimiento (NGF)Receptor de cator de crecimientoepidrmico mRNA (EGFR)mRNA granzima, mRNA perforinamRNA Factor de crecimiento tipo insulina(IGF).

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f) Controles para PCR in situ. Para la interpretacin correcta de losresultados, es necesario incluir controles. Estos deben ser cuntitativos yculaitativos, as como el uso de controles internos de la muestra. Controlesespcficos para PCR in situ deben ser includos en cada experimento:i) Omisin de la DNA polimerasa de la reaccin de PCR para detectarpegados no especficos de la sonda y/o anticuerpos.ii) Omisin de primers para detectar artefactos relacionados con la reparacindel DNA en experimentos directos RT-PCR in situiii) Pretratamiento de muestras con RNasas y la omisin de la reversotranscriptasa en experimentos que detecten secuencias de mRNA.En la tabla 4, se mencionan los controles para los experimentos de PCR insitu.

Tabla 4. Controles requeridos para experimentos de PCR in situ.Mtodo Controles Propuesta

General Uso de muestras controlpositivas y negativas.

Control para especificidad ysensibilidad del mtodousado.

Muestras a evaluar quitandoDNA/RNA.

Deteccin de falsos positivos,control para la sensibilidad.

Amplificacin de secuenciasde DNA endgeno.

Deteccin de falsosnegativos, controles paraDNA/RNA.

Omisin del anticuepoprimario en deteccininmunohistoqumica.

Deteccin de actividadenzimtica endgena.

Clulas en suspensin

Lisis celular despus de PCRin situ y anlisis de productosde PCR por electroforesis engel, Southern-blot ysecuenciacin.

Control en la especificidad deproductos de PCR

PCR in situ indirectoOmisin de DNA polimerasa

Uso se sondas irrelevantespara la hibridacin in situ.

Control para la especificidadde la hibridacin in situ.

Uso se sondas irrelevantespara la hibridacin in situ

Deteccin de sondas noespecficas y pegado deanticuerpos.

PCR in situ directo Omisin de primers.

Deteccin de artefactosrelacionados con el malapareamiento del DNA yamplificacin del DNAendgeno.

Omisin de DNA polimerasa.Deteccin de sondas noespecficas y pegado deanticuerpos.

PCR in situ cuantitativo

PCR in situ en mezclascelulares como controlespositivos y negativos endistintas proporciones.

Identificacin de distintos tiposcelulares porinmunohistoqumica.

Control de especificidad ysensibilidad del mtodousado.

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XIX. COMPARACIN DE LAS TCNICAS DE HIBRIDACIN in situ

En seguida se comparan las tcnicas de la deteccin in situ de DNAintracelulares y mRNA.

Hibridacin in situDescripcin: Hibridacin de una sonda intracelular marcada de DNA o RNAAplicaciones: Localizacin de DNA y mRNA endgenos o DNA/RNAforneos en clulas (embebidas en parafina, criosecciones, preparacionescelulares y cromosomales)Ventajas: buena preservacin morfolgica, alta especificidad, aplicaciones aDNA o RNA, bajos costos en instrumentos e isotrmico.Desventajas: baja sensibilidad.

PCR in situDescripcin: Amplificacin intracelular de PCR y deteccin de secuenciaspor hibridacin de una sonda marcada o deteccin inmunohistoqumica denucletidos marcados.Aplicaciones: localizacin de genes alterados y DNA extrao a la clula(embebidas en parafina, criosecciones, preparaciones celulares ycromosomales).Ventajas: alta sensibilidad, disponibilidad para deteccin de un bajo nmerode copias.Desventajas: requieren ciclos trmicos que requieren aparatos costosos,reproducibilidad variable en los resultados, destruccin y prdida de tejidos,cuantificacin pobre, generalmente requiere de HIS.

RT-PCR in situDescripcin: cDNA o RT de mRNA seguido por deteccin y amplificacin porPCR intracelular.Aplicaciones: localizacin de mRNA especfico o RNA virales en clulas(parafina o criseccin o preparaciones celulares).Ventajas: alta sensibilidad, deteccin de nmero bajo de copias demensajeros. Capacidad para obtener resultados exactos por deteccin denucletidos marcados.Desventajas: requiere de ciclos trmicos