Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1993,12 (2), 385-404

Hibridización de ácidos nucleicos y amplificación en cadena por polimerasa en el

diagnóstico de enfermedades infecciosas de los animales

M. R O D R Í G U E Z y A . A . S C H U D E L *

Resumen: Los autores describen el uso de métodos de detección de ácidos nucleicos genómicos - hibridización de ácidos nucleicos y amplificación en cadena por polimerasa (polymerase chain reaction) - en el diagnóstico de enfermedades infecciosas de animales domésticos.

La amplificación en cadena por polimerasa es una poderosa herramienta que permite la amplificación exponencial in vitro de un fragmento genómico específico del ácido desoxirribonucleico. En la actualidad se la utiliza para estudiar la patogenia a nivel molecular de numerosas enfermedades infecciosas y también como un eficaz método diagnóstico.

Dado que posee gran especificidad y una sensibilidad superior a la de los métodos convencionales, y que no requiere infraestructura compleja, será en un futuro cercano la tecnología de uso diario de veterinarios de campo, funcionarios del área de salud y laboratorios de diagnóstico veterinario.

PALABRAS CLAVE: Amplificación en cadena por polimerasa -Diagnóstico - Sanidad animal - Sondas.

INTRODUCCIÓN

El diagnóstico de enfermedades infecciosas ha sufrido limitaciones resul tantes de la complejidad de las técnicas, la infraestructura necesaria y la lent i tud de los procedimientos disponibles para la detección y caracterización de patógenos. Con el advenimiento de la tecnología de sondas moleculares , los veterinarios de campo, funcionarios de sanidad animal y laborator ios de diagnóstico podrán disponer de nuevos métodos que ofrecen una sensibilidad y especificidad similar o superior a la de los procedimientos convencionales y que, además, al ser métodos rápidos (resultados en el mismo día), dan la oportunidad de tomar medidas de control más racionales.

La presencia de agentes infecciosos en muestras de tejido o muestras fluidas puede ponerse de manifiesto a través de su visualización microscópica, actividad biológica o la detección de sus componentes estructurales - proteínas antigénicas y ácidos nucleicos.

* Instituto de Virología, Instituto nacional de tecnología agropecuaria, Centro de investigaciones en ciencias veterinarias, C.C. 77, Morón 1708, Argentina.

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La secuencia nucleotídica del genoma de cada patógeno es única, esto es, diferente a la de otros microorganismos y de los ácidos nucleicos del animal huésped. Este hecho representa la base del desarrollo de recientes técnicas diagnósticas: la hibridización de ácidos nucleicos y la amplificación en cadena por pol imerasa (polymerase chain reaction: PCR). Sus características y aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades infecciosas de animales domésticos son decritas en esta revisión. A fin de obtener una visión más amplia, el lector podrá consultar excelentes publicaciones previas sobre estas tecnologías (15,20,24,27,52,56,57,61,67).

CONSIDERACIONES TÉCNICAS

La detección de ácidos nucleicos se basa en la propiedad de cadenas simples y complementarias de reasociase. Si una de estas cadenas (sonda) es marcada, es posible detectar la presencia de la otra en una muestra mediante una prueba de hibridización. Por otra parte, si se utilizan dos pequeñas sondas (cebadores o primers) en condiciones de reacción adecuadas, es posible detectar hasta mínimas cantidades de ácido nucleico en un patógeno a través de una prueba PCR (Fig. 1).

H i b r i d i z a c i ó n

A m p l i f i c a c i ó n

Dot blot

In situ

Reacción en cadena por polimerasa

Marcación radioactiva

Marcación no radioactiva

Biotina Digoxigenina Sulfonilación

Los resultados pueden leerse en geles de agarosa o por hibridización

F I G . l

Las técnicas de detección de ácidos nucleicos dominantes para la detección de agentes infecciosos

Extracción de ácidos nucleicos

El paso inicial de la detección de ácidos nucleicos (AN) es su extracción de la muestra. Genera lmente , muestras fluidas u homogeneizadas son incubadas con detergentes y digeridas con proteasa a fin de l iberar a los A N que se separan de proteínas, lípidos y restos celulares mediante una extracción fenólica. El AN se precipita con etanol y se siembra en una membrana de nylon o nitrocelulosa para hibridizar, o bien es usado directamente en PCR.

Cuando el AN de interés es ácido ribonucleico (ARN), deben tomarse precauciones para evitar su degradación por ribonucleasas (ARNsas). Todo material, vidrio o agua que tomara contacto con la muestra debe tratarse. Debe utilizarse material plástico descartable autoclavado y guantes en todo momento. Las muestras deben procesarse en frío y rápidamente. Inhibidores de ARNsas como vanadil-ribocomplejos y extractos de placenta (ARNsin) son útiles para evitar esta degradación (64).

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Los métodos tradicionales de extracción han sido en algunos casos reemplazados con éxito por protocolos más sencillos. Ejemplos de éstos son la purificación del ácido desoxirribonucleico (ADN) de citomegalovirus a partir de muestras de orina con polvo de vidrio (11) y la liberación de genomas del virus de la hepatitis B presentes en suero, mediante incubación de la muest ra a 100°C por unos minutos (F.E. Baral le , comunicación personal).

Hibridización

Clásicamente las sondas se producen por inserción de secuencias del gene de interés en el ADN de plásmidos o vectores bacteriófagos, que pueden ser propagados para obtener cantidades adecuadas de sonda (2). De la biblioteca de secuencias genómicas obtenidas se seleccionan clones con determinadas características: especificidad, sensibilidad y reactividad con un amplio espectro de cepas de campo. La pureza del AN que se utiliza como sonda es fundamental para evitar señales de fondo que harían difícil la interpretación de los resultados. La excisión del fragmento de A D N clonado reduce el ruido de fondo debido a hibridización inespecífica con secuencias del huésped o contaminantes.

Una estrategia alternativa para la producción de sondas es el uso de oligonucleótidos sintéticos, sondas ARN y productos de PCR. El diseño de sondas de oligonucleótidos se basa en la información existente de la secuencia del patógeno. Pueden ocurrir diferencias de bases cuando estas sondas son utilizadas para detectar aislados de campo con la consiguiente reducción del grado de interacción entre sonda y AN blanco. Varios autores han señalado que si se eligen regiones genómicas conservadas y si las condiciones de hibridización son optimizadas, este tipo de sonda puede ser útil para la detección de virus (9,10, 30). Las sondas de ARN, que deben ser manejadas teniendo en cuenta la presencia de ARNsas en el medio, pueden ser sintetizadas in vitro en grandes cantidades usando plásmidos recombinantes especiales, como los que contienen el promotor SP6. Dado que las sondas de A R N son de cadena simple (ss) no existe reasociación que compita con el A N blanco durante la hibridización, lo que garantiza una mayor sensibilidad (1). Si la PCR ha sido optimizada para un microorganismo particular, se pueden producir sondas para su detección utilizando cebadores (primers) marcados o desoxirribonucleótidos unidos a residuos de biotina o digoxigenina.

Las sondas pueden ser marcadas con isótopos o marcadores no radioactivos tales como la biotina o la digoxigenina. Esto se lleva a cabo a través del reemplazo de una proporción de nucleótidos de la sonda por nucleótidos marcados (nick translation y random priming) o agregando nucleótidos marcados a un extremo de la sonda (end labelling). El A N puede ser también químicamente modificado (sulfonado) de tal manera que su presencia es detectable por medio de un ant icuerpo monoclonal específico. Aunque el 3 2 P ha sido el marcador de elección cuando una alta sensibilidad es esencial, existen muchos informes y la propia experiencia de los autores, que indican que puede ser reemplazado por marcadores no radioactivos. Estos últimos ofrecen importantes ventajas operativas tales como larga vida útil y ausencia de riesgos para la salud del operador.

La biotina presenta una gran afinidad con la avidina. Si esta última es marcada con una enzima como peroxidasa o fosfatasa alcalina, es posible leer los resultados de una reacción de hibridización por métodos colorimétricos. E n forma similar, el hapteno digoxigenina es usado para marcar sondas que son detectables por anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con enzimas. Fluorocromos conjugados a biotina o anticuerpos han sido utilizados con éxito en pruebas de hibridización in situ permi t iendo la localización de secuencias particulares en cortes de tejido y monocapas celulares.

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Una prueba de hibridización se lleva a cabo incubando en condiciones apropiadas una sonda marcada por algún medio con la membrana en la que se han sembrado los AN extraídos de muestras. Luego de varios lavados, la membrana es expuesta a una película sensible a radiaciones si la sonda fue marcada con isótopos, o procesada para la visualización colorimétrica de los resultados si se utilizó marcación no radioactiva (27).

Amplificación en cadena por polimerasa

Esta técnica, descrita por pr imera vez por Saiki y col. (63), hace posible la amplificación de una secuencia de A D N específica un millón de veces o más. Si la secuencia de interés es ARN debe sintetizarse una copia A D N por transcripción reversa antes de realizar la prueba PCR. Esta reacción requiere un proceso de ciclado que comprende tres etapas:

a) desnaturalización del ADN, b) anillado de cebadores, y c) extensión de cebadores.

Duran te la desnaturalización a 93°C-95°C, las dos cadenas de A D N se separan. Durante el anillado los cebadores se unen a regiones complementarias que bordean la secuencia blanco a la derecha (5') o a la izquierda (3'). Durante la primera extensión, se producen nuevas cadenas de A D N al agregar nucleótidos, en el extremo 3 ' de cada cebador anillado, a la cadena de A D N suelta. Este proceso ocurre mediante el efecto catalítico del ADN polimerasa termoestable. El número de copias de A D N se duplica al final de cada ciclo, y luego de 30 a 45 ciclos, se acumulan millones de copias (denominadas amplicones) de la secuencia de interés (Fig. 2).

FIG.2

El proceso de la amplificación en cadena por polimerasa

Las cadenas de ácido desoxirribonucleico ( A D N ) del patógeno (a) son separadas (desnaturalizadas) a 94°C y los cebadores (primers) hibridizan (anillan) a sus secuencias complementarias a 37-60°C (b). En un tercer paso (extensión) una A D N polimerasa termoestable produce cadenas complementarias

a 72°C (c). Si este proceso de «3 pasos» es repetido 30 a 40 veces se produce una acumulación exponencial de copias de A D N (d) y la secuencia blanco de origen es amplificada millones de veces

(a) 2 cadenas (original)

(b)

(c) 4 cadenas

(pr imer ciclo)

8 cadenas (segundo ciclo)

(d)

Mi l lones de copias (30-40 ciclos)

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Selección de cebadores (primers)

Los cebadores son oligonucleotidos sintéticos ss cuya secuencia es complementaria al extremo izquierdo de una de las cadenas o al ex t remo derecho de la otra del fragmento genómico que se ha de amplificar. A fin de diseñar cebadores para la detección de un patógeno en particular es necesario contar con datos de la secuencia de su genoma. Generalmente las zonas genómicas más adecuadas para pruebas de PCR sobre material de campo son aquellas que están conservadas entre los aislados, aunque diferencias de 2 o 3 bases no inhiben necesariamente la amplificación enzimática.

Luego de la selección de un fragmento genómico para PCR se trata de identificar cebadores (pares de oligonucleótidos 18-24 mer) con ciertas características:

- contenido de 40% a 60% de G+C,

- ausencia de polipurinas o polipirimidinas,

- ausencia de estructura secundaria, y

- ausencia de complementariedad, en particular en el extremo 3 ' entre cebadores, para evitar la formación de un artefacto denominado «dímero de cebadores».

Existen programas de computación, accesibles por pedido, que son útiles para llevar a cabo la selección (62). Dado que la eficiencia de la prueba PCR disminuye cuando la longitud del fragmento que se ha de amplificar aumenta, los cebadores seleccionados no deben estar separados entre sí por más de 600 bases.

Optimización de la amplificación en cadena por polimerasa

Los componentes básicos de una reacción de P C R son los cebadores , deoxinucleótidos (dNTPs) , un buffer que contiene cloruro de magnesio, una A D N polimerasa termoestable y A D N blanco. La concentración de los componentes y los parámetros de duración y temperaturas de ciclado deben ajustarse para la amplificación eficiente de cada ADN. Un punto inicial sería 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada primer, una concentración de Cl 2Mg de 1,5 mM, 2,5 unidades de enzima y 10.000 copias de A D N blanco semipurificado. La temperatura de anillado es definida inicialmente por las características de los cebadores, mientras que la desnaturalización y extensión generalmente se llevan a cabo a 94°C y a 7°C, respectivamente. Treinta y cinco ciclos de 90 seg para cada paso en general permiten visualizar la banda amplificada en geles de agarosa. El paso siguiente consiste en determinar la concentración óptima de Cl 2Mg, entre 1 y 6 mM. Si se detectan en el gel productos inespecíficos además del amplicón del tamaño esperado, puede ser necesario elevar la temperatura de anillado, optimizar la concentración de cebadores o ensayar otros cebadores. Luego deben realizarse pruebas disminuyendo el número de moléculas de AN blanco y preparando muestras artificiales que incluyen controles positivos y negativos. F ina lmente , a fin de de te rminar la sensibilidad y especificidad del protocolo desarrollado, se debe examinar un número significativo de muestras de campo y controles negativos, y comparar los resultados con aquellos obtenidos con técnicas de referencia convencionales.

Detección de amplicones

El producto de la prueba PCR (amplicón) generalmente se detecta como una banda en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio. Su tamaño, comparado con los pesos moleculares de referencia, corresponde a la longitud de la secuencia blanco definida por los cebadores. La identidad del producto amplificado es confirmada por hibridización

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con un oligonucleótido sonda cuya secuencia es complementaria a una zona interna de una de las cadenas del amplicón, y por la presencia de sitios de restricción que cortan el amplicón en fragmentos de tamaño predecible visibles en gel de agarosa. La hibridización se lleva a cabo con producto de PCR sembrado en membranas (técnica del dot blot) o luego de la transferencia de ácidos nucleicos presentes en gel de agarosa a una membrana (técnica del Southern blot).

Estos procedimientos son relativamente complejos y excesivamente largos para el laboratorio de diagnóstico microbiológico. Una alternativa interesante que podría permitir el procesamiento de un gran número de muestras simultáneamente y aún su automatización, es la captura específica del amplicón por una fase sólida, seguida de una detección colorimétrica. Esta estrategia utiliza placas de 96 pozos a los cuales se ha unido covalentemente una sonda de captura (55). Las moléculas de PCR generadas usando cebadores marcados con biotina son atrapadas y la presencia de los híbridos detectada con un conjugado estreptavidina-peroxidasa en presencia de un sustrato cromogénico (35).

Organización del laboratorio para las pruebas de amplificación en cadena por polimerasa y prevención de contaminación

Resultados falsos positivos de la prueba PCR resultan de la contaminación de una muestra por amplicones de reacciones previas. Dado que en cada reacción positiva se producen millones de copias y que sólo son necesarias unas pocas moléculas contaminantes para producir un resul tado falso positivo, deben tomarse ciertas precauciones. La incorporación de controles positivos, negativos y sin A D N en cada prueba resulta esencial para detectar este fenómeno denominado «carryover». Varias normas, además de una buena práctica de laboratorio, deben ser adoptadas (37):

- usar diferentes laboratorios y equipos para manipulaciones pre y post-PCR,

- autoclavar el agua, buffers, puntas de pipeta y material plástico y exponer las mesas de trabajo a luz ultravioleta,

- preparar alíquotas de reactivos de uso diario en un ambiente libre de producto amplificado,

- agregar el A D N al final a cada tubo.

Los experimentos críticos deben repetirse y siempre que sea posible debe utilizarse en ellos dos pares de cebadores que amplifiquen fragmentos genómicos distintos.

APLICACIONES DIAGNÓSTICAS

Aunque las pruebas de hibridización sirven muy bien algunos propósitos específicos, su sensibilidad relativamente baja y la complejidad de su realización han limitado su aplicación en laboratorios de diagnóstico. Esta tecnología ha sido extensamente revisada recientemente por Knowles y Gorham (36). Por otra parte, la alta sensibilidad de la prueba PCR, que es usualmente superior a la de las técnicas convencionales, hace de esta técnica una verdadera candidata para reemplazar muchos de los procedimientos utilizados actualmente para la detección rápida de patógenos. Gracias al hecho que muy pocas moléculas de ácido nucleico genómico son suficientes para detectar un patógeno, los laboratorios que implementan la prueba PCR con propósitos diagnósticos son cada vez más numerosos.

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A diferencia de las técnicas convencionales que requieren una infraestructura distinta para cada grupo de microorganismos, la implementación de la prueba PCR necesita reactivos y procedimientos similares para todos los patógenos.

Detección del virus de la fiebre aftosa por amplificación en cadena por polimerasa

Con propósitos ilustrativos se describirá a continuación el desarrollo y evaluación de un protocolo para la detección del virus de la fiebre aftosa (VFA) por PCR. Se eligió para amplificación enzimática el gen que codifica para la polimerasa viral, localizado cerca del extremo 3 ' del genoma viral, porque su secuencia, además de ser disponible, está altamente conservada en los distintos serotipos (45). Se identificaron oligonucleótidos con varias características, incluyendo la ausencia de estructura segundaria y un contenido G+C de 50% a 60%, mediante la utilización de un programa de computación (62). La concentración de los diferentes reactivos y los parámetros de duración y temperatura de ciclado fueron optimizados utilizando un plásmido en el cual se había insertado la secuencia de interés. Las condiciones de transcripción reversa fueron definidas utilizando ARN viral purificado. La extracción de A R N de muestras se realizó según el protocolo desarrollado ad hoc por Meyer y col. (47). Los resultados se leyeron en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio y fueron confirmados por hibridización de los productos amplificados sembrados en membrana de nylon con una sonda de 30 bases marcada con digoxigenina (Rodríguez y col., manuscrito en preparación).

A fin de de te rminar la sensibilidad y especificidad de la prueba , se real izaron experimentos utilizando diluciones de suspensiones virales de los serotipos A, O y C, muestras artificiales y tejidos tomados en la necropsia de bovinos infectados experimentalmente (Cuadros I y II) . Además , se obtuvieron datos adicionales que indicaron una especificidad de 100% al examinarse 50 muestras de distintos tejidos (epitelio lingual, faringe, ganglio linfático, esófago, pulmón y riñon) de bovinos sanos e infectados experimentalmente (P. Murphy y col., comunicación personal).

Los resultados experimentales indican que la prueba de PCR desarrollada para la detección del VFA es específica y que su sensibilidad es por lo menos del mismo orden de magnitud que la de los métodos convencionales cuando los resultados se leen en geles de agarosa. U n a sensibilidad mayor se observa luego de la hibridización del producto de PCR. Se requieren menos de 24 horas para procesar muchas muestras simultáneamente y luego de su optimización la detección del VFA por este método no necesita una infraestructura compleja.

Evaluación de la sensibilidad de la amplificación en cadena por polimerasa para la detección del virus aftoso utilizando diluciones virales

de los serotipos A, O y C

CUADRO I

D L 5 0 : dosis media para ratones recién nacidos Los resultados fueron leídos en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio,

y confirmados por hibridización

Stock viral Serotipo Título (log 1 0DL 5 0/ml)

Sensibilidad

(DL50) No. 644 ° i 6,90 1,90 No. 547 ° i 7,04 0,27 No. 622 A87 7,04 0,27 No. 578 C85 6,80 0,19

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CUADRO II

Evaluación de la sensibilidad y especificidad de la amplificación en cadena por polimerasa para la detección del virus de la fiebre aftosa utilizando muestras

artificiales (a) y carne y epitelio tomados en la necropsia de animales experimentalmente infectados (b)

Resultados de la PCR

El ensayo se realizó con alícuotas de 0,25 ml de homogenatos 1/10 y los resultados fueron leídos en geles de agarosa y confirmados por hibridización

PCR: amplificación en cadena por polimerasa PBS: phosphate-buffered saline (1) muestras tomadas a los 3 días p.i. (2) muestras tomadas a los 16 días p.i.

OTRAS APLICACIONES DE LA AMPLIFICACIÓN EN CADENA POR POLIMERASA PARA LA DETECCIÓN Y

CARACTERIZACIÓN DE AGENTES INFECCIOSOS

Virus

Virus de la peste porcina africana

Se diseñaron y sintetizaron cuatro primers y una sonda oligonucleotídica con el propósito de amplificar un fragmento de 740 pares de bases (pb) correspondientes a una zona conservada del genoma viral del virus de la peste porcina africana. Se amplificó específicamente un fragmento de 640 pb y se real izaron ensayos con templados extraídos de órganos y plasma de animales infectados. Se determinó que la prueba PCR es más rápida y sensible que los métodos convencionales (73).

Virus de la leucemia endógena aviar

A través del uso de métodos de amplificación del A D N se secuenciaron genes de la envoltura viral encontrándose que secuencias de sub-grupo específicas poseen una alta homología con las de RAV-O (Rous-associated virus type O) (60).

Muestra Serotipo Título (DL 5 0/0,25 ml)

Resultados di la PCR

a) Homogenato normal + stock No. 567 Homogenato normal + stock No. 567 Homogenato normal + stock No. 567 Homogenato normal + PBS

Oí Ol Oí

54,00 5,40

. 0,54

Positivo Positivo Positivo Negativo

b) Carne infectada 0 1

Carne infectada 0 1

Carne infectada 0 1

Carne normal

A O c

1,98 15,70

1,98

Positivo Positivo Positivo Negativo

Epitelio infectado'21

Epitelio infectado'21

Epitelio infectado'21

Epitelio normal

A O c

1,00 1,24 1,00

Positivo Positivo Positivo Negativo

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Poliomavirus aviar

Se desarrolló un ensayo PCR para la detección del poliomavirus l lamado B F D V (budgerigar fledgling disease virus). El ensayo utiliza un solo grupo de primers complementarios a una zona del gen de la pro te ína VP1 de B F D V . La p rueba es áltamente específica y sensible, y permite detectar 20 copias del genoma viral. Este estudio sugiere la posibil idad de infección pers is tente de aves adultas y de la transmisión in ovo (58).

Virus de la lengua azul

Se adoptó una prueba PCR para la detección de secuencias globalmente conservadas, serogrupo específicas del ARN del virus de la lengua azul (BTV) (210 pb) de serotipos de tec tados en Es tados Unidos de América . Resul tados prel iminares indican que es posible detectar menos de 2 fg de secuencias blanco del A R N de BTV, equivalentes a 7.500 partículas virales (16). Util izando primers complementarios al segmento 7 de BTV-ISA, fue posible detectar 6 moléculas por muestra del segmento 7 cadena doble (ds) A R N como también A R N purificado de otros serot ipos. Se obtuvieron resultados positivos en glóbulos rojos de bovinos infectados conteniendo 16 T C I D 5 0 pero no 1,6 T C I D 5 0 (81). Primers construidos en base a la secuencia del segmento 3 que codifica para la pro te ína reactiva VP3 se usaron para detectar diferentes serogrupos en plaquetas, buffy coat y glóbulos rojos de ovinos infectados (43).

Coronavirus bovino

Se sintet izaron por PCR sondas A D N ss y ds para la detección del Coronavirus bovino (BCV) utilizando plásmidos recombinantes como templado. Mediante PCR de fragmentos específicos se detectaron aproximadamente 10 genomas virales luego de la lectura en geles de agarosa (78). El diagnóstico de BCV en 134 muestras clínicas fue más eficiente por hibridización con sondas ss que con sondas ds sintetizadas por PCR o con una combinación de 6 sondas plasmídicas de secuencias no yuxtapuestas (79).

Herpesvirus bovino tipo 4

Se comparó la prueba PCR con las técnicas de hibridización y aislamiento en cultivo de tejidos para la detección del herpesvirus bovino tipo 4 (BHV-4) en tejidos de conejos exper imentalmente infectados. Se detectó el virus por PCR en varios órganos, incluyendo tejido nervioso, que dieron resul tados negativos por las otras técnicas utilizadas (50).

Virus de la inmuno deficiencia bovina

La infección de células de pulmón embr ionar io bovino con virus de la inmunodeficiencia bovina fue monitoreada por la formación de sincicios y transcripción reversa seguida por PCR; se determinaron las ventajas de esta última técnica (33).

Virus de la leucemia bovina

Se detectó A D N proviral en A D N linfocítico y tumoral en todos los estadios de la infección de bovinos por amplificación enzimática e hibridización del producto amplificado (51). La prueba PCR para gag-p24, env-gp51, previa transcripción reversa, fue utilizada para examinar la presencia de A D N específico en células mononucleares periféricas de animales seropositivos y seronegativos. El protocolo permitió detectar 1 genoma viral entre 100.000 células (49). Utilizando cebadores para los genes pol y px del virus de la leucemia bovina se amplificaron consistentemente hasta 10 copias del

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A D N del virus. Esta técnica se utilizó con éxito en un estudio a ciegas de células mononucleares sanguíneas de 18 bovinos (72).

Papillomavirus bovino

Por PCR se detectó A D N del papillomavirus bovino (BPV) en el 70% de partidas comerciales de suero fetal bovino observándose una correlación de 100% con los datos obtenidos por aislamiento (69). Se detectaron genomas de BPV por PCR en cortes de tejido fijado con formol de 20 sarcoides equinos utilizando primers correspondientes al marco de lectura abierta de la zona E5 del genoma viral de los tipos 1 y 2 de BPV. Estos resultados apoyan la visión generalizada que sugiere que el BPV desempeña un papel importante en los sarcoides equinos (74).

Rotavirus bovino

Por PCR se amplificó A D N copia (cADN) del gen completo que codifica el antígeno neutralizante mayor. La prueba PCR posee 100.000 y 5.000 veces más sensibilidad que el electroferotipo y la hibridización respectivamente, para la detección de rotavirus bovino en materia fecal (89).

Virus de la diarrea viral bovina

A través de la amplificación y secuenciado de la región que codifica para la proteína pl25 de un par homólogo del biotipo del virus de la diarrea viral bovina (BVDV), cepas Pe 515 citopatogénicas y no citopatogénicas fueron detectadas (18). Por medio de primers de 20 pb localizados en la región conservada cercana al extremo 3 ' genómico fue posible obtener un producto de 205 pb a partir del A D N del B V D V . La prueba permitió detectar una molécula de cADN clonado lo que demuestra que la sensibilidad de PCR es superior a 1 T C I D 5 0 (42). La prueba PCR fue 10 veces más sensible que los métodos convencionales para la detección de B V D V (77). Primers que amplifican la zona 6322-7475 de la cepa N A D L se usaron para detectar BVDV en suero y glóbulos blancos de bovinos persis tentemente infectados (8). Seis secuencias de 20 bases de distintas áreas genómicas fueron seleccionadas por análisis de homología de las cepas N A D L y Osloss de BVDV. La sonda correspondiente al extremo 5 ' del A R N viral (ND001), detectó el 86% de los aislamientos citopáticos y no citopáticos analizados (38). Util izando primers de la región gp 48 de la cepa citopática N A D L se detectó B V D V en muestras de suero de animales pers i s ten temente infectados (6). Oligonucleótidos cebadores degenerados diseñados en base a la secuencia de dos cepas de BVDV y una de peste porcina clásica permitieron detectar al A R N viral en células infectadas in vitro y en linfocitos circulantes (83).

Virus de la artritis/encefalitis caprina

Los virus de la artritis/encefalitis caprina y del Maedi-Visna fueron detectados por PCR (90).

Virus del moquillo

Morbillivirus de Phoca vitulina y cADN obtenido del morbillivirus de la peste bovina fueron detectados por PCR (25).

Virus de la arteritis infecciosa equina

Mediante transcripción reversa y PCR con tres diferentes pares de primers se detectó A R N genómico en muestras clínicas con una sensibilidad de hasta 600 PFU/ml en plasma seminal (14).

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Herpesvirus equino tipo 1

Se examinaron por PCR cultivos celulares normales e infectados y 63 muestras de 29 fetos equinos abortados. Resultados generados en menos de 24 horas y evaluados en geles de agarosa y por hibridización con un oligonucleótido sonda marcado con biotina mostraron una fuerte correlación con aquellos obtenidos por aislamiento (3). A D N no purificado der ivado de cultivos infectados con herpesvirus equinos tipos 1 y 4 fue amplificado por PCR utilizando un par de oligonucleótidos cebadores. Restricción enzimática con PVuII seguida por electroforesis revelaron un polimorfismo de los fragmentos de restricción enzimática lo que permitió la diferenciación de los dos tipos virales (53).

Virus de la anemia infecciosa equina

Se detectaron por PCR genomas del virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), cepa CL22, en células mononucleares periféricas de equinos infectados (87). Se monitoreó la presencia de secuencias provirales en células mononucleares de sangre periférica en tres equinos por PCR. Luego de cada episodio virémico los niveles de provirus en monocitos periféricos disminuyeron a menos de 1 copia en 5 x 10 6 células (54).

Virus de la leucemia felina

La prueba PCR fue utilizada para examinar la patogénesis de la coinfección de gatos con virus de la inmunodeficiencia felina y virus de la leucemia felina (FeLV) (76). Ha sido también utilizada para la detección de FeLV en neuroblastomas olfatorios felinos (68).

Virus de la fiebre aftosa

Se logró una rápida y sensible detección del virus de la fiebre aftosa en tejidos porcinos y bovinos por amplificación enzimática del gen de la pol imerasa viral. La sensibilidad del método fue de menos de 1 T C I D 5 0 mediante hibridización del producto amplificado a una sonda marcada. No se observó reactividad cruzada con otros doce virus, incluyendo enterovirus (47).

Virus de la peste porcina clásica

Luego de la transcripción reversa del A R N total aislado de tejidos infectados, el cADN fue amplificado por PCR con una sensibilidad de 10.000 T C I D 5 0 . La sensibilidad aumentó 1.000 veces luego de la reamplificación con cebadores internos (nested primers) (40).

Virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar

El gen del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar (IALV) homólogo del de la glicoproteína B (g B) del virus herpes simplex tipo 1 fue identificado por amplificación del A D N genómico de IALV (59).

Virus de la bronquitis infecciosa

Se desarrolló una técnica de PCR que permite la tipificación de aislamientos del virus de la bronquitis infecciosa causantes de nefritis (39).

Influenzavirus

A fin de determinar la persistencia del influenzavirus en gansos luego de la infección por vía oral, se realizó una prueba PCR del gen de la hemoaglutinina; no se encontró ARN viral en muestras de bazo (82).

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Virus del Maedi-Visna

Utilizando múltiples cebadores que generan segmentos de A D N con extremos complementarios es posible detectar el virus del Maedi-Visna en cultivos celulares infectados con una sensibilidad superior de dos órdenes de magnitud a la de los métodos existentes (26). Un aislamiento de un virus (EV-1) similar al virus del Maedi-Visna obtenido de una oveja con signos de artritis y neumonía fue analizado por PCR con el propósito de demostrar el grado de homología con cepas conocidas del virus del Maedi-Visna (65).

Virus de la fiebre catarral maligna (alcelaphine herpesvirus type 1)

Dos pares de cebadores de 30 bases, correspondientes a la secuencia nucleotídica del herpesvirus tipo 1 fueron utilizados con éxito para la prueba PCR de lisados celulares crudos (31). Un fragmento del virus de la fiebre catarral maligna (AHV-1) fue subclonado en PVC18 y secuenciado. Se desarrolló PCR de dos pasos basándose en un fragmento del A D N de A H V - 1 clonado. Cinco aislamientos de A H V - 1 y AHV-2 fueron específica e idénticamente positivos. Los herpesvirus bovinos BHV-1, BHV-2 y BHV-4 no pudieron ser detectados por esta prueba . Por esta técnica se detectó 0,01 T C I D 5 0 de AHV-1 (34).

Virus de la enfermedad de Aujeszky

Secuencias genómicas del virus de la enfermedad de Aujeszky (PRV) fueron amplificadas por PCR a partir de cultivos infectados, células nasales y órganos de cerdos con infección aguda y latente (5). Una prueba PCR de 25 ciclos permitió la detección de PRV presente en homogenatos celulares en 1 hora con una sensibilidad igual a la de los métodos convencionales (32). A fin de investigar varios aspectos de la latencia de PRV en cerdos, se utilizó amplificación enzimática in vitro basada en PCR con primers del gen gpll en A D N extraído de ganglios trigéminos de porcinos latentemente infectados con PRV. Cien fg de PRV-ADN se detectaron en geles y 1 fg (equivalente a 6 genomas virales) por PCR combinada con hibridización (41). Se detectó A D N de PRV latente en 7 de 8 muestras utilizando cebadores correspondientes a los genes gX y gII por PCR combinada con hibridización (44). Un protocolo de P C R (bases 433-651 de gp50) permit ió detectar consis tentemente en 24 horas P R V en muestras de amígdala examinadas con el propósito de detectar latencia viral (85). A D N latente de PRV fue detectado por PCR en ganglios trigéminos de 10 cerdos infectados por vía intranasal con vacunas preparadas con cepas TK negativas de PRV a los 81 días o más luego de la infección (80).

Virus de la rabia

Se investigó mediante PCR el sitio de multiplicación de un virus de la vaccinia recombinante (VVTGgRAB) que expresa la glicoproteína G del virus de la rabia en comparación con la cepa parental Copenhagen, luego de la administración oral a zorros. La prueba PCR permitió detectar V V T G g R A B en las amígdalas y mucosa bucal de zorros a las 24 y 48 h, en el paladar blando del 50% de los animales a las 24 h y luego de 48 h en un 30% más. Se inocularon zorros con virus aislado de amígdalas 24 h luego de la administración oral (con o sin amplificación en cultivo de tejido) para realizar ambos pasajes. No se detectó virus en ningún caso luego de este pasaje. La inocuidad de VVTGgRAB para zorros fue demostrada (75). Se usó PCR para examinar la patogenia del virus rábico en ratones luego de la inoculación en el músculo masetero. Se detectó ARN de cadena positiva en estadios tempranos en ganglios trigéminos; en estadios más tardíos (96 h p.i.), A R N de cadena positiva fue detectado en grandes cantidades en el músculo masetero (71).

397

Bacterias

Brucella abortus

Se desarrolló una prueba específica y sensible de PCR para el gen que codifica una proteína de superficie capaz de detectar 0,1 pg de A D N de la cepa 19 (menos de 100 bacterias) utilizando cebadores que permiten la amplificación de un fragmento de 635 pb de un gen proteico 43KD de membrana exterior de la cepa 19 de Brucella abortus (21).

Escherichia coli

Se desarrol laron protocolos de PCR que poseen la misma sensibilidad y especificidad que los métodos convencionales para detectar contaminación por Escherichia coli en agua (4), queso (46), excremento de cerdo (29) y carne (84). Ha sido posible la amplificación enzimática, mediante cebadores con inosina, de diferentes alelos del gen que codifica para la toxina termoestable tipo I de E. coli enterotoxigénica (13). La amplificación del operón mal B de cepas E. coli A I I E produjo fragmentos específicos de ADN. El límite de detección fue de 10 bacterias. La prueba fue validada con 27 cepas enterotoxigénicas (13).

Leptospira spp.

Se desarrol ló una p rueba PCR para detectar un fragmento de 631 pb del A D N ribosomal 16S bacteriano de la región 5 ' (28). Cuando se aplicó PCR en muestras de orina bovina, se detectaron hasta 5-10 leptospirae por ml (23).

Listeria monocytogenes

Se detectó Listeria monocytogenes en productos alimenticios a través de la amplificación enzimática de secuencias específicas bacter ianas uti l izando cinco oligonucleótidos como cebadores (7). Se amplificaron por PCR fragmentos genómicos correspondientes a las hemolisinas alfa y beta en salchichas cocidas y leche en 48 h. La sensibilidad fue de 10 L. monocytogenes/10 ml de leche (22). Resultados variables se obtuvieron al utilizar PCR para L. monocytogenes en muestras de queso (84). A través de PCR se determinó que la ausencia del gen que codifica para el fosfatidil inositol está asociada a la patogenia de L. monocytogenes (12).

Mycobacterium paratuberculosis

Una sonda (PCR 278) so obtuvo por amplificación por PCR de un fragmento de 278 pb de la región 5'de IS 900, un elemento de inserción contenido en el genoma de Mycobacterium paratuberculosis. Cuando esta sonda fue usada en conjunto con PCR, se obtuvo una sensibilidad de 10 fg de material inicial de M. paratuberculosis, equivalente a dos genomas bacterianos (48).

Mycobacterium tuberculosis

Un producto específico de 396 pb se obtuvo por P C R en ausencia de reacción cruzada con 10 diferentes cepas de Mycobacterium incluyendo aquellas del complejo M. tuberculosis. El producto de PCR fue detectado por hibridización aun cuando sólo 10 fg de A D N de M. tuberculosis fueron utilizados como blanco. Se obtuvo una buena correlación con métodos convencionales y una sensibilidad de 10 fg de A D N purificado (17). Se desarrolló una prueba PCR, realizable en 48 h, para el segmento repetit ivo IS 6110 (123 pb) del cromosoma de M. tuberculosis a partir de muestras de esputo (19). El protocolo P C R fue el método más sensible para el diagnóstico de la meningitis tuberculosa (70).

398

Salmonella spp.

Cebadores específicos y un mé todo inmunomagnét ico (partículas magnéticas cubiertas con ant icuerpos monoclonales) fueron utilizados para amplificar un fragmento de 163 pb del genoma de Salmonella typhimurium. Por este método se logró amplificar por PCR 25 cepas de Salmonella pero no otras 19 Enterobactereaceae. La sensibilidad del método fue de 100 PFU (88).

Otros patógenos

Mycoplasma spp.

Usando cebadores diseñados para las secuencias de los genes del A D N 16S de Mycoplasma pneumoniae y M. genitalis, se desarrolló una prueba de amplificación in vitro específica y sensible que permitió detectar hasta 100 células de M. pneumoniae y 1.000 células de M. genitalis (66).

Toxoplasma spp.

Muestras de tejido de fetos abortados fueron examinadas en vistas de detectar la presencia de Toxoplasma por amplificación por P C R del gen p30. Se demost ró la presencia del agente en todos los casos (86).

T E C H N I Q U E S D ' H Y B R I D A T I O N D E S A C I D E S N U C L É I Q U E S ET D'AMPLIFICATION EN CHAÎNE PAR POLYMÉRASE APPLIQUÉES AU DIAGNOSTIC DES MALADIES INFECTIEUSES ANIMALES. - M. Rodríguez et A.A. Schudel.

Résumé : Les auteurs décrivent l'application des techniques de détection des acides nucléiques génomiques - hybridation des acides nucléiques et amplification en chaîne par polymérase (polymerase chain reaction : PCR) -au diagnostic des maladies animales.

La technique PCR est un outil biologique puissant qui permet l'amplification enzymatique exponentielle in vitro d'une séquence d'acide désoxyribonucléique donnée. Cette technique est actuellement appliquée à l'étude de la pathogénie moléculaire de nombreuses maladies infectieuses ainsi qu'au diagnostic.

La technique PCR qui est, en général, plus sensible et plus spécifique que les méthodes traditionnelles et ne nécessite pas d'installations complexes, devrait prochainement devenir la méthode de prédilection des laboratoires de diagnostic, des vétérinaires praticiens et des autorités sanitaires.

MOTS-CLÉS : Amplification en chaîne par polymérase - Diagnostic - Santé animale - Sondes.

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