Hibridizasyon Son

8/12/2019 Hibridizasyon Son

1/33

Nkleik Asit MelezlemesineDayal Yntemler


2/33

Nkleik asit melezleme (hibridizasyon) yntemleritek ipliklinkleik asit molekllerinin tamamlayc

dizileriile uygun koullar altnda kendiilindenelenerek ift iplikli melezmolekller (hibridler)oluturma zelliine dayanr.

Bu tip melezleme yntemleri DNA/DNA, RNA/RNAve RNA/DNA arasnda gerekleebilir.

Genel olarak,- Tek iplikli nkleik asit dizilerine,- Bu dizileri tanyacak,radyoaktif veya radyoaktif

olmayan bir belirleyici ile iaretlenmi tamamlaycnkleik asit paralarna (prob) gerek vardr.

----Ama, DNA yada RNA zerindeki belirli nkleotiddizilerini tayin etmektir.


3/33

In situMelezleme (ISH)

In situmelezleme (hibridizasyon) (ISH), nkleik asitdizilerinin (DNA ve RNA) morfolojik olarak korunmukromozomlar, hcreler veya doku kesitlerinde saptanarakgsterilmesini salayan temel bir tekniktir.

In situmelezlemenin dier Southern ve Northern blottingyntemlerinden fark nkleik asitlerin kendi hcreselortamlarnda tannarak gsterilmesidir. Bylece hedef nkleikasit dizisinin hcredeki yeri belirlenmi olur.

Son 15 yl iinde yardmc floresan tekniklerin gelimesiylebirlikte, bu tekniin uygulanmasnda bir art gzlenmitir.

ISH tekniinin nemli modifikasyonlarndan biri de genomik insitu hibridizasyondur (GISH).

GISH, trler aras hibritlerde, parental genomlarn

ayrlmasna olanak tanyan genomik boyama tekniidir.


4/33

Ama,

Kromozomlarn fiziksel haritalarnnyaplmasnda,

Kromozom yap ve hatalarnn analizinde,

Kromozomlarn ve genomun yap, ilev veevriminin aratrlmasnda,

Gen anlatmnn belirlenmesinde,

Eey tayininde,

Dokudaki virs ve bakterilerin tansnda Genlerin ,Transformasyon dizilerinin ve

onkogenlerin yerlerinin belirlenmesindenemlidir.


5/33


6/33


7/33

Denatrasyon, Melezleme ve Ykamalar

Melezleme ncesi ilemler zeminboyamasn nlemek iin, prob vedekstran slfat hari melezlemekarmndaki tm elemanlar ieren

prehibridizasyon solusyonu ile inkbeedilir.


8/33

Denatrasyon

DNA/DNA in situ melezleme iinprob ve hedef dizilerin tek ipliklihale getirilmesi gerekir.

Denaturasyon asit, s veya alkaliuygulamasyla yaplr. En ok tercihedilen s ile olan denatrasyondur.

Ar denatrasyon DNA kaybnaneden olduu iin bu aamadadikkatli olunmaldr.


9/33

Melezleme

Prob ve hedef nkleik asitler tek ipliklihale getirildikten sonra DNA/DNAmelezleri 37C da, RNA/RNA melezleri50-55 C da bir gece inkbasyonabraklr.

Bu scaklklar Tmdeerinin 20-25 C ninaltndadr.

Radyoaktif ISHda nkleik asit probununher kilobaz iin 0.1-0.3 ngl-1prob

konsantrasyonu nerilmektedir. aretlenmi nkleik asit problar,

formamid, dekstran slfat, bloke ediciDNA veya tRNA, SDS, sr serumalbumini ve eitli tuzlar ieren bir

melezleme iine konur.


10/33

Melezleme sonras ykamalar

aretli prob hedef dizi dnda homolojigsteren baka dizilerle zgn olmayanmelezlemeler yapabilir.

Byle melezler doru elenmi olanlaranazaran daha dayankszdr ve eitliykama ilemleri ile zlebilir.

RNA/RNA melezlemesi iin ek olarak,

RNaz uygulamas gerekir. Yalnzcamelezlenmemi tek iplikli RNA y temizler.


11/33


12/33

In situMelezleme Blgelerinin Saptanmas

Radyoaktif iaretli problarn saptanmas iinotoradyografik , radyoaktif olmayanlar iin iseimmnohistokimyasal yntemler kullanlr.

Radyoaktif olmayan problarn saptanmas

dorudan ve dolayl olmak zere iki eittir.-Dorudan yntemde iaret, dorudan doruyankleik asit probuna balanr ve hemenmikroskobun altnda grntlenirken,

Dolayl yntemde proba balanan iaretleyici

molekl dorudan doruya grlemez.Melezlemeden sonra ikinci bir molekl (habercimolekl) probdaki iaretleyiciye balanr vebylece probun melezleme blgeleri grnr halegelir.


13/33

Radyoaktif olmayan problarn saptanmasndaen ok kullanlan iaretler biotin ve

digoksigenindir. Digoksigenin (anti- digoksigenin) antikoruyla

saptanabilir.

Biotin ise (anti-biotin antikorlar ve biotin-

(strept)avidin) sistemleri ile saptanabilir. Antikora veya (strept)avidine balanarak

sinyal oluturan sistemler (habercimolekller);

-Fluorokromlar

-Enzimler

-Metaller


14/33


15/33

ISHda Melezleme Problarnn Seim

Prob tipleri,- ift iplikli DNA, tek iplikli DNA, tek iplikli

RNA ve oligonkleotidler olaraksaptanabilir.

Prob uzunluu,-Maksimum melezleme oran uzun problar

ile elde edilir. Ancak ISHda ksa problargereklidir.nk probun hcre veya

kromozomlar evresindeki younmatriksten geerek hedefe ulamasgerekir.Problarn 50-150 bazlk olanlar birok doku iin en iyi sinyali verir.


16/33

Probun aretlenmesi

2 ana yol vardr;-zotropik aretleme***Radyoaktif madde ile iaretleme

yaplr ve belirlemek iin otoradyografikullanlr.

***H3iaretli problar yksekznrl nedeniyle subsellleruygulamalar iin, S35ISHda en yaygnkullanma sahip olmakla beraberhcresel uygulamalar iin uygundur.


17/33

zotropik Olmayan aretleme,

***aretleme radyoaktif olmayanmaddelerle yaplr.

***Tayini mmnohistokimyasal

yntemlerle yaplr.***Son yllarda avantajlarndan dolay

daha sk kullanlr. Hzl sonu, dahauzun sre muhafaza, znrlk

yksek, daha fazla iretlemeDezavantaj ise duyarllnn daha dk

olmas


18/33

Preparation of Traditional Nucleic Acid Probe

Amino acid sequenceGLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU-----

GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC---

Nucleic acid sequence * Codon degeneracy* * * * * * *

Synthesizing

oligonucleotide

PROBE:GGGGACGAGTCCTCCGTTCT

The nucleic acid sequence is

Deduced from amino acid sequence

Chemical synthesis

Juang RH (2004) BCbasics


19/33

GG

ATC

CATCC

CCTGCTCAGGAGGCAAGAGG

CAT

GGGGACGAGTC

CT

CCGTTCT

P32

Target geneDNA

denaturation

Single colony

Lysed

Hybridization

Probe is labeled with radioactive 32P

Juang RH (2004) BCbasics


20/33


21/33

FISH

Molekler sito-genetikteki hzl ilerlemeler,bantlama ve boyama tekniklerinin hzlgeliimiylesalanmtr.

Standart bantlama teknikleri yalnzca birdenemede bir hcre iin tm genomusorgulamada yetersiz kalmaktayken,

Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH),genleri ve kromozomlar boyamada fluoresanmolekllerin kullanld bir yntem olarakbantlama teknikleriyle birlikte iyi birdeerlendirmearacdr.


22/33
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/57/FISH_%28Fluorescent_In_Situ_Hybridization%29.jpg


23/33
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/57/FISH_%28Fluorescent_In_Situ_Hybridization%29.jpg


24/33
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/77/Bcrablinter.jpg


25/33

Blotlama Teknikleri

Bu teknikler, nkleik asitlerin (DNA veRNA) ve proteinlerin hcre iilokalizasyonlarnn tespiti, miktarlarnntayini, ekspresyonlar, reglasyonlar ile

deiik bulac hastalklar ile kaltsalhastalklarn belirlenmesinde ve adlivakalarda ska kullanlmaktadr.

Blotlama, DNA, RNA ve protein gibi

makromolekllerin naylon veyanitroselloz membranlar zerineaktarlmas ilemine verilen isimdir.


26/33

Blotting (Blotlama) Teknikleri

Southern Blot

Northern Blot

Western Blot

DNA Southern Blot

RNA Northern Blot

Protein Western Blot


27/33

Southern Blot

Bu tekniin basamaklar 1. Uygun restriksiyon enzimi ile DNA nn

kesilmesi 2. Kesilen DNA nn agaroz jelde

yrtlmesi 3. DNA nn denatre edilmesi 4. Denatre edilen DNA nn naylon veya

nitroselloz membrana transfer edilmesi

5. Tek iplikikli DNA probu ile membrannmuamelesi 6. Grntleme


28/33

06_12.jpg


29/33

06_12_2.jpg


30/33


31/33

Northern Blot

Bu tekniin basamaklar

1. Uygun restriksiyon enzimi ile RNA

nn kesilmesi 2.RNA nn naylon veya nitroselloz

membrana transfer edilmesi

3.Tek iplikikli RNA probu ile

membrann muamelesi

4. Grntleme


32/33


33/33

Documents

Hibridizasyon Son