HIDROLASES SINTÉTICAS

Hidrolases Sintéticas: Hidrolases Sintéticas: Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA

Hidrolases Sintéticas:Hidrolases Sintéticas:

Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNAPerspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA

Professor Dr. Ademir NevesLABINC – Laboratório de Bioinorgânica e CristalografiaDepartamento de Química – UFSCE-mail: [email protected]: 0xx/48/3319219; FAX: 0xx/48/3319711

Florianópolis2003


23 cromossomas 3 bilhões de pares de bases do DNA

~40 000 Genes codificados os quais são transcritos no mRNA

antes da síntese daProteína (em estudo)

Simples mutação de qualquer gene ou degradação de uma proteína pode

ter sérias consequências

Dada a importância de se manter o código genético e a função específica decada proteína específica, a natureza arquitetou de forma sábia as ligações fósforo-diéster para juntar os nucleosídeos no DNA e RNA e as ligações

peptídicas que acoplam os aminoácidos nas proteínas.

A meia vida do DNA para a hidrólise das ligações fosfo-diéster - 130 000 a 106 anos a 25 oC e pH-neutro (RNA – 4 a 103 anos).

Ligações peptídicas – meia vida = 7 anos sob as mesmas condições

Genoma humano


OBase

H

XO

CH2OP

O

O

O-

P O

O-

O CH2OBase

H

XOX = H, DNA = OH, RNA

N

H

CR H

C

O

NC

H R

C

O

Cadeia polipeptídica


Ironicamente, as mesmas propriedades que fazem com que essas ligações sejam tão úteis nos biopolímeros, também podem ser problemáticas. Ex.: 1) mutações no DNA precisam ser identificadas e reparadas; 2) mRNA precisa ser hidrolisado para que a proteína codificada não seja sintetizada de forma desnecessária;

3) proteínas precisam ser degradadas nos seus aminoácidos correspondentes uma vez exercidass as suas funções.

Natureza utiliza enzimas denominadas de HIDROLASES E/OU NUCLEASES

=> HIDROLASES SINTÉTICAS


Por que desenvolver hidrolases sintéticas – metalonucleases ?

1) Gerar moléculas capazes de clivar o DNA em sítios específicos não reconhecidos por enzimas de restrição; Possíveis novas drogas.

2) Utilização no sequenciamento do genoma; endonucleases que reconhecem 4, 6 ou 8 seqüências de bases resulta num grande no. de fragmentos – mais difícil de serem separados. Nas proteínas muitas vezes ocorre o oposto: peptidases naturais fornecem fragmentos os quais são muito grandes para o sequenciamento.

3) Utilização na análise conformacional de ácidos nucléicos e proteínas.

4) Elucidação do papel dos íons metálicos nas hidrolases naturais

5) Vantagem em relação a agentes que clivam o DNA através de processos oxidativos ( geração de radicais e não produzem fragmentos consistentes com aqueles produzidos pelas hidrolases naturais – 5’-fosfato e 3’-hidroxil).


ML

L

L

L

OH2

OH2

Complexos Mononucleares

ML

OH2

L

L

L

OH2

Estratégia Utilizada - Hidrolase Sintética (íon metálico no sítio cataliticamente ativo)

Sítios lábeis cis-orientados

Reduzir pKa da H2O coordenada

(fornecer nucleófilo em pH neutro)

Ativar o substrato e/ou estabilizar o

estado de transição

Liberar produtos a umavelocidade razoável

M M

L2L2

L

OH

ponte

OH2

L

L1

L

ponte

Complexos binucleares

1

21


Complexos MononuclearesComplexos Mononucleares

R-NH2 + R'-CO

HCH3OH/3hs

0 0C

R-N=CH-R' CH3OH

[H2/Pd/C]R-NH-CH-R'

** SCARPELLINI, M., NEVES, A., BORTOLUZZI, A. J., et al. Acta Crystallographica Section C, v. C57, 356-358, 2001.

* SCARPELLINI, M., NEVES, A., BORTOLUZZI, A. J., et al. J. Chem. Soc.,Dalton Trans., v. 18, 2616-2623, 2001.

HN N

N

N

N

CH3

HISMIMI*

N

N

CH3

HN N

NH

HISMIMA**


H3C CuCl

NN

NN

N

ClH

Complexo 1

Complexo 2

H3C CuCl

NN

NN

NH

Cl

H

Cl1'

C15'C7'

C9'

N14'

N8'

C10'

C13'

N11'

C12'

Cu1'

C6'

C5'

N1'

C4'

C2'N3'

Cl2'

Cl2

N3

C4

C2

C5

N1

Cl1

C6

Cu1

C7

N8

N11

C9

C10

C12

N14

C13

C15

Cu(1)-N(1)1,9596(19)Cu(1)-N(11)1,9872(19)Cu(1)-N(8) 2,096(2)Cu(1)-Cl(2)2,2882(11)Cu(1)-Cl(1)2,5789(10)N(8)-C(9) 1,268(3)

Cl(2)-Cu(1)-Cl(1) 103,22(4)

(= 0,14)

Cu(1)-N(11)1,9540(19)Cu(1)-N(1)1,9662(18)Cu(1)-N(8)2,0784(17)Cu(1)-Cl(1)2,2875(8)Cu(1)-Cl(2)2,9242(11)

Cl(1)-Cu(1)-Cl(2) 100,23(4)( = 0,03)


Titulação potenciométricaTitulação potenciométrica

LCu – (OH2)2 LCu –(OH2)(OH ) + H +

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

-Log[H+]

Cu

N

N OH2

N

OH2

Cu

N

N OH

N

OH2

Complexo 1

pKa 8,94

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

-Log[H+]

Cu

N

N OH2

N

OH2

Cu

N

N OH

N

OH2

Complexo 2

pKa 9,30


Voltametria Cíclica: Complexo 1Voltametria Cíclica: Complexo 1

CH3OH (pHap = 9): -1,207 V vs Fc+/Fc

800 600 400 200 0 -200 -400 -600 -800 -1000 -1200

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5 CuII/Cu

IFc+/Fc

I (A)

E (mV)

CH2Cl2

1000 500 0 -500 -1000 -1500-100

-50

0

50

100

150

200

250

CuIICu

II/Cu

IICu

I

CuII/Cu

I

Fc+/Fc

I (A)

E (mV)

CH3OH

1000 500 0 -500 -1000 -1500

-50

0

50

100

150Cu

IICu

II/Cu

IICu

I

Fc+/Fc

I (A)

E (mV)

CH3OH (pHap = 9)

CH2Cl2: -0,676 V vs Fc+/Fc

CH3OH: -0,553/-1,263 V vs Fc+/Fc

H3C CuCl

NN

NN

N

ClH


RPE: complexos de CuRPE: complexos de CuIIII sete linhas:

g 4,3 e A// = 82 x 10-4 cm-

1 Complexo 1: etanol/H2O

2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600

-8000

-6000

-4000

-2000

0

2000

4000

6000

Inte

nsid

ade

Campo (G)

1000 1200 1400 1600 1800 2000-1200

-1000

-800

-600

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

inte

nsid

ade

campo (G)

g// = 2,240g = 2,062

A// = 164,5

estado tripleteinteração entre dois

centros de CuII

transição proibida Ms = 2

transições permitidas Ms= 1

g1 = 1,950

Equilíbrio dímero-monômero

H3C CuCl

NN

NN

N

ClH


Síntese do complexo binuclearSíntese do complexo binuclear

M = 304 -1.cm2. mol-1 em CH3CN (2:1)

Cu2C20H32N10O10Cl2. 1/2 CH3CN (M = 791,04 g.mol-1)

C, 31,88(32,12) H, 4,27(4,12)

N, 18,89 (18,04)

IV (KBr): (OH) 3616/3539; (NHar) 3242; (NHsec) 3125; (CHar/CHalif)

2949-2864; (C=N/C=C) 1619-1428; (ClO4) 1091; (CHar) 749 em cm-1.

0

10

20

30

40

50

60

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

cm-1

% T

[Cu(CH3CN)4]ClO4 + HISMIMA 1) CH3CN / CH3OH / argônio

2) O2 / sopropanolH

H .(ClO4-)2 H3C Cu

Cl

NN

NN

N

Cl

HH2O / pH 9,3 / NaClO4.H2O

2+

H3C Cu

NN

N N

NH

Cu

NN

NN

CH3

NH

O

O

H3C CuCl

NN

NN

N

ClH


Magnetoquímica do complexo binuclear sólidoMagnetoquímica do complexo binuclear sólido

Dependente:* Ângulo CuO\Cu

* distânciaentre centros de CuII

0 50 100 150 200 250 300

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000c:/Origin50/simi.opj - Marciela dimero Cu-imina

eff

(2K) = 1.06 BM

eff (300K) = 3.04 BM

J = -13 cm-1 g = 2.0

par = 20 % TIP = 1020 x 10-6 cm

3/mol

C = -140 K I = -0.3 KR = 1.260

1

6

B C

[ 1

0-6 c

m3 /m

ol ]

Temperature (K)

0 50 100 150 200 250 300

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

eff (

BM

)

D E

J = -13 cm-1 Acoplamento antiferro

H3C CuCl

NN

NN

N

ClH


Reatividade frente a um substrato modeloReatividade frente a um substrato modelo

Complexos1 e 2

O

NO2

NO2

P

O

OO

NO2

O2N -

+ catalisador

O

NO2

NO2

-

++ catalisador 2,4-dinitrofenilosfato

• Hidrólise 2,4-BDNPP


Complexo 1

7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,01

2

3

4

5

6

7

k obs (

x105 .s

-1)

pH

8,78 0,05(8,94)

Efeito do pHEfeito do pH

Complexo 2

7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

k obs(x1

05 .s-1)

pH

9,38 0,02(9,30)

[Cu(L)(H[Cu(L)(H22O)O)22] ] [Cu(L)(H [Cu(L)(H22O)(OH)]O)(OH)]++ + H + H++


Efeito da concentração do complexoEfeito da concentração do complexo

k1/2 (mol-1/2.L1/2.s-1)

(6,67 0,17) x 10-4

k1/2 (mol-1/2.L1/2.s-1)(3,07 0,35) x 10-4

Complexo 1

0 10 20 30 40 50 60 70 800

1

2

3

4

5

[complexo] (x 10 3.mol.L-1)

k obs

(x 1

05 .s-1)

k obs

(x 1

05 .s-1)

[complexo]1/2

(x 103.mol

1/2.L

-1/2)

0 1 2 3 4 5 6

0

1

2

3

4

5

Complexo 2

20 30 40 50 60 70 80 90 100 1101,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

k obs

(x 1

05 .s-1)

[complexo] (x 10 3.mol.L-1)

k obs

(x 1

05 .s-1)

[complexo]1/2

(x 103.mol

1/2.L

-1/2)

0 2 4 6 8 100

1

2

3

4


Efeito da concentração do complexoEfeito da concentração do complexo

Complexo Kf (mol-1.L) k (s-1)

1 11,9 x 103 5,7 x 10-6

2 12,8 x 103 4,3 x 10-6

LCu + -OPO(OR)(OR´) K2

LCu-OPO(OR)(OR´)

LCu-OPO(OR)(OR´)k3 -OR + 2-OPO2(OR´)

5,0])[2(5,0(][ Tf CuKLCu

]2

])[2(5,0(.[

][5,0

f

Tf

K

CuKk

dt

ORdv

´)])((.[. 32 OROROPOkKk


Efeito da concentração do substratoEfeito da concentração do substrato

Complexo 2

0 1 2 3 4 5 6 7 80

1

2

3

4

5

6

1/v 0(

mol

-1.L

.s)

1/[2,4-BDNPP] (mol-1.L)

v 0(x1

09 .mol

.L-1.s

-1)

[2,4-BDNPP] (x103.mol.L

-1)

100 200 300 400 500 600 700 800 9001,50E+008

2,00E+008

2,50E+008

3,00E+008

3,50E+008

4,00E+008

4,50E+008

5,00E+008

Complexo 1

0 1 2 3 4 5 6 7 80

1

2

3

4

5

1/v

0(m

ol-1.L

.s)

1/[2,4-BDNPP] (mol-1.L)

v 0(x1

09 .mo

l.L-1.s

-1)

[2,4-BDNPP] (x103.mol.L

-1)

100 200 300 400 500 600 700 800

2,00E+008

3,00E+008

4,00E+008

5,00E+008

6,00E+008

7,00E+008

8,00E+008

9,00E+008

Complexo Vmax(mol.L-1.s-1) KM (mol.L-1) kcat(s-1) Kass(mol-1.L)a

taxab

1 16,4x10-9 17,3x10-3 3,28 x10-4 57,8 121 2 7,2x10-9 3,03x10-3 1,40x10-4 330,0 51,9

a Kass = 1/KM; btaxa = kcat/ke, onde ke = 2,7x10-6 s-1 a 50 0C (hidrólise da reação espontânea)


Mecanismo Proposto para (1)Mecanismo Proposto para (1)

Kf

H3C Cu

NN

NN

N

OH2

OH

+

H3C CuCl

NN

NN

N

Cl

H

H2O K1

H3CCu

NN

N N

N

OH

O

P O

NO2

NO2OO

O2N

O2N

K2

O

O P- NO2

O2N

O

O

O2N

NO2

K3

NO2

NO2

O-

H3C CuOH2

NN

NN

N

OH2

H

2+

HH H

H

H

H

H

2+H

H3C Cu

NN

N N

NH

O

OH

H

Cu

NN

H

NN

CH3

N

(a) (b)

(c)

(d)

(e)

H H

H3CCu

NN

N N

N

OP

O

O

NO2

NO2

O

(f)

Neves, Scarpellini, HörnerTerenzi, Inorg. chem.2003, Submetido

H3C CuCl

NN

NN

N

ClH


Micrografia Eletrônica das formas do DNA plasmidial


Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNApelo complexo mononuclear (1)pelo complexo mononuclear (1)

H3C CuOH2

NN

NN

N

OH2

H

1 2 3 4

Degradação do DNA Genômico – pH = 8,0

2) 91,56 % da banda de maior peso molecular com: 8,50 % de degradação;- 3) 11,99 % da banda de maior peso molecular com: 88,01 % de degradação;- 4) 4,13 % da banda de maior peso molecular com: 95,87 % de degradação.

Complexo 1

0,00 0,375 1,250 3,750 mM de 1

Neves, Scarpellini, HörnerTerenzi, Inorg. Chem.2003, in press


Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAH3C Cu

OH2

NN

NN

N

OH2

H

Degradação do DNA Plasmidial pBSKII – pH = 8,0

Complexo (1)

1) 0,375 mM do complexo: 87,00 % da forma I e 13,00 % de degradação F II;2) 0,750 mM do complexo: 86,74 % da forma I e 13,26 % 3) 1,250 mM do complexo: 85,31 % da forma I e 14,65 % “4) 1,880 mM do complexo: 84,69 % da forma I e 15,31 % “5) 0,000 mM do complexo:

II circular

I superenovelada

1 2 3 4 5



OH2

NN

NN

N

OH2

H

Complexo 1

Determinação do mecanismo: Complexo em [1] = 1,88 mM

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1) 0 mM do complexo

2) 1,88 mM do complexo

3) 1,22 M de Ce4+ (é só Ce4+ no DNA)

4) 1,22 M de Ce4+ + 1,88 mM do complexo.

Seguindo a seqüência, 5,6,7,8 temos DMSO 0,04 M e 9,10, 11, tiouréia 0,04mM.

I

II

Não houve nenhuma inibição na degradação Não houve nenhuma inibição na degradação mecanismo hidrolítico mecanismo hidrolítico



OH2

NN

NN

N

OH2

H

Complexo 1Reação na ausência de O2: Complexo em [1] = 1,88 mM- Não houve inibição na degradação

Banda 1 – Padrão DNABanda 2 – DNA cortado com a EcoRI (enzima de restrição da Escherichia coli)Banda 3 – Adição da T4DNA ligase ( religação)Banda 4 – T4DNA ligase + Complexo + DNA + EcoRIBanda 5 – Complexo + DNA Banda 6 - Complexo + DNA + T4DNA ligase

Religação através da T4DNA ligase - 5’-fosfato e 3’-hidroxil

Não houve religação (ver banda 6). Porém, vemos na banda 4 que o complexo atua na ligase

1 2 3 4 5 6 7FI

FIIIFII



OH2

NN

NN

N

OH2

H

Complexo 1

Degradação do DNA plasmidial em diferentes pHs a 50 oC, [1] = 1,88 mM, durante 24 h

pH 7.0 7,5 8,0 8,5 9,3

1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

1 = complexo2 = padrão

pHs e tampões

Tris pH 7,0

Tris pH 7,5

Tris pH 8,0

Tris pH 8,5

CHES pH 9,3

% da forma I

85,53 36,40 26,81 6,96 1,44

% de degrada-ção da forma I

14,67

63,60

73,19

93,04

98,56

pKa = 8,94


Anaerobic x aerobic plasmid DNA cleavage. Lanes 1-3, anaerobic conditions; Lanes 4-6. aerobic conditions; Lanes 1 and 4, control plasmid DNA; Lanes 2 and 5, plasmid DNA, 0.1mM Fe(EDTA)2-, 10mM DTT;

Lanes 3 and 6, plasmid DNA, 3.75mM complex 1. All samples were incubated in 100mM CHES buffer pH 9.30 for 4h at 50 °C. Above the image of the gel is shown a histogram of the quantified plasmid DNA

forms observed in the gel.

1 2 3 4 5 60

20

40

60

80

100

Pla

sm

id D

NA

%

F I F II

F II

F I


. Kinetic analysis of complex 1 DNA cleavage activity. Plasmid DNA (pBSKII. 4 mM phosphodiester links) and 2 mM Complex 1 were incubated at pH 9.3 (200 mM CHES).

50 C for 0, 2, 4, 6, 8 or 24 h (lanes 1 to 6. respectively).

F II

F I

1 2 3 4 5 6



OH2

NN

NN

N

OH2

H

Complexo 1Determinação do mecanismo: Cinética em gel-agaroseComplexo em [1] = 2,11 mM, Tampão CHES pH 9,3;[DNA: pBSKII] em excesso com 2, 6, 10 ligações fosfato: uma de complexo

y = (y0 – const) exp(-kobsx) + const

y = (100 – y0)(1- exp(-kobsx))

kobs’= Vmax’[cat]/(KM + [cat])

kobs = Vmax[subst]/(KM + [subst])

kobs = 0,0016 min-1

T1/2 = 384 min

Fator catalítico de ~10Fator catalítico de ~1077

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

kobs

Tempo (minutos)


Fosfatases (hidrolases) e nucleases catalisam a hidrólise de ésteres de fosfato de aminoácidos fosforilados e sacarídeos, nucleotídeos, DNA e RNA, envolvendo a quebra da ligação P-O sob condições fisiológicas em vitro.

Estrutura cristalina da fosfatase ácida púrpura de Fe(III)Zn(II).(STRÄTER, N. et al. Science 1995, 268, 1489)

His 325His 323

OH

His 286

FeZn

OH

H2O

Asn 201

Asp 164

Asp 135

Tir 167

Degradação de eritrócitos

Fonte de radicais hidroxila – degradação óssea

Liberação de fosfato de compostos organofosforados

Em vivo se propõe:


Estrutura tridimensional da FeIIIZnII - PAP


Espectros mostrando a interconversão da forma púrpura (Fe2III, 550

nm) na forma rosa (FeIIIFeII, 505 nm) da UFPAP.


Espectros de EPR em vários valores de pH e gráfico do % da espécie em baixo pH versus pH para a forma de valência mista da bsPAP.


Espectros Mössbauer da forma ativa a 185 K (A) e inativa a 10 K(B) da UFPAP.

• Parâmetros Mössbauer

(mm/s) Eq(mm/s)

FeIIFeIII 1.22 2.86

0.52 1.83

FeIIIFeIII 0.46 2.12

0.55 1.65


Mecanismo proposto para as PAPs na hidrólise de ésteres de fosfato:

(GANI, D., WILKIE, J. Structure and Bonding 1997, 89, 133)

Enz

M Fe2+ 3+

H2O OH

ROPO3H-

-H2O

-ROH

OHO

O OP

--

+H2O

- OH

3+2+ FeM

Enz

OHP

O

O OH

- H2PO4-

+ H2O

OH

3+2+ FeM

Enz

O

PRO

O

OH

3+2+ FeM

Enz

Existem dois mecanismos alternativos propostos por Que e Averill


Mecanismo proposto por Lindqvist e colaboradores para a hidrólise de ésteres de fosfato promovida pelas PAPs.


Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAComplexo binuclear de Fe(III)Complexo binuclear de Fe(III)

N

N

O

O

C l

N

N

O

Fe

O

FeOH2

C l

H2O

Cl

O3W

O1

O2

N1'

Fe

N21'

N21

Fe'N1

O2'

O1'

O3W'

Cl'

[Fe2(BPClNOL)2(H2O)2]2+ [Fe2(BPClNOL)2(H2O)(OH)]+

[Fe2(BPClNOL)2(H2O)(OH)]+ [Fe2(BPClNOL)2(OH)2]

[Fe2(BPClNOL)2(OH)2] [Fe2(BPClNOL)2(OH)3]-

pKa = 5.00

pKa = 7.03

pKa = 9.65

Complexo 6

NOH

Cl

N

OH


Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNAPerspectivas na Clivagem hidrolítica do DNA

Degradação do DNA Plasmidial pBSKII

N

N

O

O

C l

N

N

O

Fe

O

FeOH2

C l

H2O

0 3 7 5 M p H 6 .1

p H 8 .0

I

I I

I I I

I I

I I I

I

Buffer pH 6.1

020

4060

80100

0 75 150 250 375

Com plex concentration

plas

mid

form

(%)

I

II

III

total cleavage (%)

Buffer pH 8.0

020

4060

80100

0 75 150 250 375

Com plex concentration

plas

mid

form

(%)

I

II

III

total cleavage (%)

Complexo 6

Neves e TerenziInor. Chem.Commun.4 (2001)388-391.


Mecanismo PropostoMecanismo Proposto

- O complexo 6 não reage com diésteres de fosfato devido à configuração-anti das moléculas de H2O

N

N

O

O

C l

N

N

O

Fe

O

FeOH2

C l

H2O

Complexo 6

- O acesso de 1 ao DNA é proposto com base nas interações eletrostática e hidrofóbica (sais de FeIII não degradam o DNA)

-A largura (11,7 Å) e profundidade (8,8 Å do sulco maior no B-DNA dupla-fita pode facilmente acomodar o complexo 1 no qual as duas moléculas de água/OH-

estão separadas por 7,7 Å. Isto também explica a maior atividade hidrolítica em pH 8 (2 grupos OH-).


N

N

O

O

C l

N

N

O

Fe

O

FeOH2

C l

H2O

Complexo 6

Mecanismo PropostoMecanismo Proposto


MetodologiaMetodologia

Síntese do ligante H2BPBPMP

CH3

OH OCl

CH3

OH

Reimer-Tiemann

NaOH/CHCl3/H2O

CH3

OH O

HCHO

HCl

CH3

OH

N

N

N

OH

SOCl2

CH3

OH

N

N

N

Cl

NH

N

HO

CH3

OHO

N

N

N

N

NH

2

NaBH4

CH3

OH

N

N

N

OH

N

N


C44

C45

C43

C74

C46

N42

C73

C26

C20

O72

C41

C25

C2

O71

C21

C53

C54

N1

C11

C24

Zn1

C16

N52

C40

C22

O1

C55

C12

C23

C30

Fe1

C15

O20

C51

C5

N4

C56

C13

C14

O62

C50

C31

O61

C3

N32

C63

C36

C33

C64

C35

C34

Fe(1)-O(20) 1.890(3)

Fe(1)-O(61) 1.967(3)

Fe(1)-O(1) 2.006(3)

Fe(1)-O(71) 2.034(3)

Fe(1)-N(32) 2.182(4)

Fe(1)-N(1) 2.214(3)

Fe(1)-Zn(1) 3.490(10)

Zn(1)-O(72) 2.030(3)

Zn(1)-O(1) 2.105(3)

Zn(1)-O(62) 2.137(3)

Zn(1)-N(52) 2.142(4)

Zn(1)-N(4) 2.185(4)

Zn(1)-N(42) 2.190(4)

Novas Hidrolases Sintéticas FeZnNovas Hidrolases Sintéticas FeZn

Fe

O

ZnO

OH2

NNN

NNO H

OH


Titulação espectrofotométrica – espécies em solução300 400 500 600 700 800 900

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

A

nm

300 400 500 600 700 8000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A

nm

300 400 500 600 700 8000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A

nm

pH 4,3-5,6 pH 5,6-7,2

pH 7,2-10,0

300 400 500 600 700 8000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A

nm

Fe

O

ZnO

OH2

NNN

NNO H

OHTitulação EspectrofotométricaTitulação Espectrofotométrica


Fe

O

Zn

OH2

NN

N

NNO O O

OH

Distribuição das Espécies a partir da Distribuição das Espécies a partir da Titulação EspectrofotométricaTitulação Espectrofotométrica

Fe

O

ZnO

OH2

NNN

NNO H

OH

pKa = 4,86 pKa = 6,00 pKa = 7,22

Fe

O

Zn

OH

NN

N

NNO OH

OH


FeO

MO O

O O

FeO

MO

OH OH2H

FeO

M

OH OH2

OH2

FeO

MO O

OH2 OH2

FeO

MO O

OH OH2

FeO

MO

OH OHH

pKa1

pKa2pKa3

III IIIII III

IIIIIIIII

II II

II II II


Velocidade inicial (vo) em função do pH. Solvente água/acetonitrila 50%, tampões MES, HEPES e CHES 25 mM, LiClO4 0,1 M, [Complexo] = 4,0.10-5 M e [substrato] = 2,0.10-3 M.

3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

v 0(.1

09 ) m

ol-1

.L.s

-1

pH

pKa1= 4,63 pKa2 = 7,84

Fe

O

ZnO

OH2

NNN

NNO H

OHCinética de Hidrólise do 2,4-BDNPPCinética de Hidrólise do 2,4-BDNPPEfeito do pH (pKa cinético)Efeito do pH (pKa cinético)

Neves et al. Inorg. Chem. 2002, 41, 5643

pKa1 = 4.86 pKa2 = 7.22 Potenciométrico

O

NO2

NO2

P

O

OO

NO2

O2N -

+ catalisador

O

NO2

NO2

-

+catalisador + PO43-2


0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,0100,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

V0

(x10

8 ) m

ol.L

-1.s

-1

[S] (x103) mol.L

-1

0 500 1000 1500 20000

1

2

3

4

5

6

1 / V

0 (x

10-8)

mol

-1.L

.s

1 / [S] (x103) mol

-1.L

VVmáxmáx = 2,92.10 = 2,92.10-8-8 mol.L mol.L-1-1.s.s-1-1

KKmm = 8,10.10 = 8,10.10-3-3 mol.L mol.L-1 -1 kkcatcat = 7,31.10 = 7,31.10-4-4 s s-1-1

(k(khidrólise espontâneahidrólise espontânea = 1,8.10 = 1,8.10-7-7 s s-1-1 a 25 a 25ooCC

Fe

O

ZnO

OH2

NNN

NNO H

OHCinética de Hidrólise em Função da Cinética de Hidrólise em Função da Concentração do 2,4-BDNPPConcentração do 2,4-BDNPP

Velocidade inicial (vo) em função da conc. de substrato. Solvente água/acetonitrila 50%, MÊS 25 mM, LiClO4 0,1 M, [Complexo] = 4,0.10-5 M e [substrato] = 0,5 a 9,0 x 10-3 M, T = 25 oC. kkcatcat/k/khidrólise espontâneahidrólise espontânea = 4061 = 4061

KKassass = 123 mol.L = 123 mol.L-1-1


H2O / EtOHO

Fe ZnAc

Ac

III IIO

Fe ZnAc

OH2 OH2

III II

pKa1 = 4.86

O

Fe ZnAc

OH OH2

III IIpKa2 = 6.0O

Fe ZnOH

OH OH2

III IIpKa2 = 7.22O

Fe ZnOH

OH OH

III II

(RO)2PO2-

III II

+NO2

O2N

O

PO

OR

OR

O

Fe ZnX

HO

-ORR =

III II

O

O

Fe ZnX

OP

ORO

PO3-(O-R)2-

H2O/OH

(4,63 cinético)

(7,84 cinético)

Mecanismo PropostoMecanismo PropostoFe

O

ZnO

OH2

NNN

NNO H

OH


C52

C53

C51

C54

N5

C55

O3

O4

O2

C42

C41Zn

C43

Fe

C56

N3

C31

C46

C36

C32

C47

C35 C44

N1 O1C45

C33

C34 C21

N4

N2

C19

C14

C22

C18

C13

C25

C15

C26

C23

C12

C24

C16

C11

C17

1 H2L1 + 1 ZnII(ClO4)2 + 1 FeIII(ClO4)3 + 3 NaOH 2+

3+

Zn

N

N

NOH

O

CH3

Fe

N

N

OH2

O

2+(ClO4

-)2

FeIII....ZnII = 3,05 Å – 3,1 Å na enzima

Primeiro exemplo de complexo FeIII-OH-ZnII


2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,00

20

40

60

80

100

pKa2pKa1

CBA

%

-Log[H+

]

FeO

MO

OH2 OH2H

FeO

MO

OH OH2H

FeO

MO

OH OHH

pKa1 pKa2III II II IIIII III


Eletroquímica

600 400 200 0 -200 -400 -600 -800 -1000-10,0

-8,0

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

I (

A)

E (mV)

E1/2 (pH = 4,0) = - 0,06 V vs NHE

E1/2 (pH = 6,3) = - 0,18 V vs NHE

[FeIIIZnIIL1(OH)(H2O)](ClO4)2

H2O pH = 4,0 - 6,3

(H2O)Fe(OH)Zn(H2O) (HO)Fe(OH)Zn(H2O)

pK = 4,7 comparável aos pKas cinético e termod.

de 4.66.

46


FeIII....ZnII = 3.05 Å – 3.1 Å na enzima

His 325His 323

OH

His 286

FeZn

OH

H2O

Asn 201

Asp 164

Asp 135

Tir 167

2+3+

Zn

N

N

NOH

O

CH3

Fe

N

N

OH2

O

2+(ClO4

-)2

OH2


3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

B

V0

x 10

9 (m

ol.L

-1

.s-1

)

pH

0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,0100,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

1 / [S]

(1 /

V0 )

x 1

0-8

V0

x 10

8 (m

ol.L

-1

.s-1

)

[S] (mol.L-1

)

0 200 400 600 800 10000,0

1,0

2,0

3,0

Efeito isotópico do deutério kH / kD = 0,93

kkcatcat/k/khidrólise espontâneahidrólise espontânea = 10 = 1044

KKassass = 62.5 mol.L = 62.5 mol.L-1-1

No. de turnovers = 180No. de turnovers = 180


Zn

N

Fe

NO

N

O

N

NOH

O OP

O O

NO2O2N

III II

Zn

N

Fe

NO

N

O

N

NO

OHH

OH2

2,4-dinitrofenolato

BDNPP

Zn

N

Fe

NO

N

O

N

NO

OHH

P

O

O

O

NO2

O

NO2O2N

O2N

BDNPP

2,4-dinitrofenilfosfato(monoéster)

III

III

II

II

Mecanismo Proposto em função dos dados experimetais



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

N S

Figure X. Cleavage profile of plasmid DNA in the presence of increasing concentrations of complex 1. Complex 1 concentration (M) varied from 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5,

and 0 (lanes 1 to 9, respectively). Nicked (N) and supercoiled (S) plasmid DNA are depicted in the figure. Lane 10, 11, 12, 160 M complex 1 in the presence of 20%

glycerol (lane 10), 20% DMSO (lane 11) or control buffer (lane 12).

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH.

Reação de FentonFe

O

CuO

N

N

NNO

N

OH2H

OH


Prof. Dr. Hernán Terenzi – Dpto. Bioquímica – UFSCProf. Dr. Wilson Ortiz – Dpto. Física – UFSCarProf. Dr. Antônio S. Mangrich - UFPRProf. Dr. Valderes Drago – Dpto. Física – UFSCDra. Marciela Scarpellini (USA)Dra. Liane Márcia Rossi”(USA)Dr. Adolfo Horn Jr. (UENF – RJ)Dr. Mauricio Lanznaster (Detroit – USA)Dra. Rosmari Hörner (Santa Maria _UFSM)MSc. René Nome – USA – ChicagoDra. Christine Fernandes – UFRJ

AgradecimentosAgradecimentos

NicholasAdemir “Piu”AlessandraRicardoRosely PeraltaAnnelliseRafaelPatriciaMaurícioIvanRenata

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HIDROLASES SINTÉTICAS