Curso de Postgrado

“Histología Animal Comparada:

Técnicas Básicas de Microscopía Óptica

y Electrónica”

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental

Marzo 2018

Métodos de estudio en Histología Animal

1. Conocer la metodología general aplicada al proceso histológico de los tejidos

animales.

2. Conocer las distintas etapas del método mediato o postmortem.

Objetivos:

MÉTODOS DE ESTUDIO

Procedimientos que permiten realizar estudios de células,

tejidos, órganos y organismos.

I) INMEDIATO II) MEDIATO O POST

MORTEM

Sobre organismos VIVOS! Es necesario la muerte previa

del elemento a estudiar

I) ESTUDIO INMEDIATO:

A) AL ESTADO FRESCO : Se utilizan líquidos indiferentes que permiten

mantener vivas a las células. No se recurre a reactivos modificadores.

Artificiales Solución Fisiológica (cloruro de sodio al 9‰ o 7‰)

Líquido de Ringer (cloruro de sodio, cloruro de potasio,

cloruro de calcio, bicarbonato de sodio, agua destilada)

In vivo

Líquidos

indiferentes

B) CON COLORACIÓN VITAL (siguiente diapositiva)

Naturales

Plasma sanguíneo

Líquido amniótico

Humor acuoso

Al estado

fresco

Cultivos de tejidos en cámaras asépticas sobre plasma sanguíneo o extracto

embrionario.

a) Animales pequeños transparentes: Protozoos, Rotíferos, Crustáceos,

larvas, etc.

b) Membranas transparentes: mesenterios de sapos, cola de renacuajos,

branquias, atc.

c) Delgados cortes de órganos o tejidos como cartílago, hígado, riñón, etc.

d) Órganos opacos, observados con iluminación incidente: circulación

capilar, etc.

In vitro

B) CON COLORACIÓN VITAL: Se utilizan colorantes que actúan respetando la vida del

elemento sin imponer modificaciones estructurales, aumentando el contraste y facilitando la

observación microscópica. Se emplean soluciones muy diluidas de sustancias colorantes no

tóxicas (colorantes vitales).

Ej. de Colorantes

vitales

Azul de metileno

Azul brillante de Cresilo

Verde Jano

Rojo Neutro

INTRAVITAL

a) Por ingestión

b) Por inyección (endovenosa, linfático, subcutánea)

c) Por inmersión (animales acuáticos vivos como Protozoos,

Rotíferos, larvas, etc.)

SUPRAVITAL

Se emplean colorantes que se aplican a células aisladas o porciones

de órganos extraídos de un animal recientemente sacrificado. Ej.:

mitocondrias (verde de Jano), ramificaciones nerviosas (azul de

metileno), DNA y RNA (naranja de acridina).

PREPARADOS NO DURADEROS!!!!

Sangre humana coloreada con rojo neutro-verde jano.

Método in vitro. Microscopio de campo claro.

A=400x

Sangre humana: método in vitro. Microscopio de contraste por

interferencia diferencial o microscopio Nomarski.

II) ESTUDIO MEDIATO O POST MORTEM

COLORACIÓN

Detener procesos de degradación que ocurren durante o tras la muerte celular debido

a un proceso de autólisis y putrefacción.

Insolubilizar los componentes celulares, principalmente las proteínas, de modo

que se preserven en el corte.

Preservar la morfología y la capacidad inmunoantigénica del tejido/órgano.

Dotar al tejido de la consistencia necesaria para las manipulaciones posteriores.

Facilitar técnicas de coloración o análisis posteriores.

Fijadores: son sustancias químicas que coagulan o precipitan las

proteínas celulares, endurecen los tejidos y facilitan el

tratamiento ulterior.

Finalidad de la fijación: conservar la estructura, en algunos

casos la función del tejido, lo más parecido posible a su estado

in vivo.

¿ Por qué es necesario fijar un órgano?

9

Dijo Marlene Benchimol, microscopista brasilera:

«Esto tiene más de brujería que de ciencia”

Condiciones que debe reunir un fijador

Depende del tamaño de la pieza y del tiempo de

fijación y del fijador.

Actuar con rapidez.

Preservar los detalles estructurales que presentaban in vivo así como su

composición química (Grizzle 2001, Grizzle et al, 2007).

Alto poder de penetración

Velocidad de fijación

Impedir la desaparición de los elementos solubles o insolubilizar los

constituyentes celulares que se pretenden estudiar.

Evitar retracciones excesivas, ni volverlos friables o quebradizos a los

tejidos.

Debe ser irreversible.

Debe de ser de fácil manipulación, económico, estable y con baja toxicidad.

Grizzle WE. The use of fixatives in diagnostic pathology. J.

Histotechnol. 2001;24:151–152.

Grizzle WE, Fredenburgh J, Myers RB. Fixation of tissues. In:

Bancroft J, Gamble M, editors. Theory and Practice of Histological

Techniques. 6th ed. Edinburgh, UK: Churchill Livingstone; 2007.

pp. 53–74.

¿Cómo actúa un fijador?

Los fijadores utilizados tienen la capacidad de interactuar con los componentes del tejido,

tales como proteínas, glicoproteínas, proteoglicanos, lípidos, glicolípidos, lipoproteínas,

pigmentos, ácidos pécticos y nucleicos; como así también, la capacidad de preservar la

composición y localización de carbohidratos: celulosa y almidón en vegetales, quitina en

insectos o glucógeno en tejidos animales y depósitos metálicos (Fe+2, Cu+2, Al+3, Cd+2,

Pb+2, As-3, Cr+2).

En función al mecanismo de acción se pueden distinguir dos grupos principales de fijadores

químicos:

FIJADORES COAGULANTES: desnaturalizan las proteínas modificando su estructura

terciaria y su estado coloidal, por el cual las proteínas se convierten en compuestos

insolubles. Este tipo de fijadores estabilizan al tejido y aumentan la consistencia mecánica en

mayor grado. Pobre preservación de la ultraestructura (mitocondrias, gránulos de secreción).

No son buenos para MET.

FIJADORES NO COAGULANTES (cross linking): interactúan con diferentes sitios

químicos de las macromoléculas tisulares para establecer puentes, uniones químicas,

originando una trama espacial que preserva la posición relativa inicial de las proteínas, a la

vez que dotan al tejido de consistencia mecánica.

La conservacion de los componentes tisulares es mejor. Ideal para MET.

Tasa de penetración o difusión, velocidad de fijación, tiempo de

fijación y tamaño de las piezas

Velocidad de fijación: es la velocidad a la que se producen los fenómenos

químicos implicados en la fijación. Equivale al tiempo necesario para la

precipitación o insolubilización de los constituyentes celulares.

El tiempo en que dure la fijación dependerá de la velocidad de fijación.

Tasa de penetración o poder de difusión: es específica para cada fijador. Está

relacionado con la distancia que un fijador recorre en un determinado tiempo, en

un tejido uniforme.

El tamaño de la muestra dependerá de la velocidad de penetración

El tamaño y grosor de las muestras deben ser pequeñas y delgadas, de 1cm2 a 2

cm2 y con un espesor de 2 mm a 5 mm, especialmente si se emplean fijadores

con escaso poder de penetración.

Tamaño de la muestra:

Fijador Velocidad de

penetración

Velocidad de

fijación

Tamaño de

las piezas

Tiempo de

fijación

Tetróxido de

osmio

Lenta Rápida

Reducida Poco

Formaldehído

4%

Rápida Lenta Relativamente

grandes Mucho

Temperatura de fijación

Variable, dependerá del material a fijar y del fijador. Tradicionalmente a Tº ambiente.

Se propone para acelerar la difusión del fijador, efectuar la fijación durante la primera

media hora a temperatura superior a la ordinaria, para lo cual se pone el material en

estufa a 37-40°C.

Otras opciones: colocar el material a fijar en el fijador calentado (tibio). Ideal para

INVERTEBRADOS!!!! Para vertebrados no es recomendable.

Para M.E. o técnicas histoquímicas el rango de temperatura del fijador se extiende de

los 0-4°C.

Es recomendable efectuar la fijación a bajas temperaturas (4ºC) y con la solución

fijadora enfriada previamente. Este procedimiento retarda las reacciones del fijador

pero alarga el tiempo de fijación aunque se disminuye de manera notable la autólisis.

Variaciones del volumen del tejido

Durante la fijación los tejidos cambian de volumen, las retracciones no son

homogéneas y muchas veces conducen a distorsiones de las estructuras celulares.

En general se produce una contracción del tejido, por ende una disminución del

volumen que se ve aumentado frecuentemente por los posteriores pasos en el

proceso de preparación del material para su coloración (deshidratación e

inclusión).

Ej. Tejido fijado en formaldehído 4% e incluido en parafina sufre una contracción

del 33% del tamaño original.

Los núcleos observados en secciones congeladas son usualmente de tamaño más

grandes que los observados en material que fue procesado por métodos

convencionales de preparación histológica.

Atención!! Factores de contracción deben ser tenidos en cuenta cuando se realizan

comparaciones entre estructuras en preparados histológicos y material fresco, como

por ejemplo cuando se realizan estudios morfométricos.

Journal of Zoology (2010): 282, 238–245.

Osmolaridad del fijador

Soluciones fijadoras hipertónicas dan lugar a la contracción de las células.

Soluciones fijadoras hipotónicas aumentan la turgencia de las células.

La presión osmótica de la pieza y del fijador tiene que ser lo más parecido al

suero fisiológico.

Mejores resultados, corroborados para M.E. es usar soluciones fijadoras

ligeramente hiperosmóticas (alrededor de 400 mOsm, soluciones isotónicas en

mamífero es 340 mOsm).

Órganos sensibles a la osmolaridad del fijador: riñón, órganos relacionados con

la osmorregulación del organismo, porción exocrina del páncreas (acinos).

En MET se añade sacarosa, glucosa, cloruro de sodio, cloruro de magnesio a las

soluciones fijadoras para ajustar su osmolaridad.

En M.O. se puede añadir a los fijadores cloruro de sodio (Ej. 0.9% para animales

terrestres) o utilizar soluciones tamponadas a un pH semejante al del tejido e

isosmóticas con dicho tejido.

Evitar cambios de volumen en las células debido

a una osmolaridad diferente a la del tejido..

pH del fijador

pH de la solución fijadora a pH fisiológico: entre 6-8. Fuera de este rango se

producen artefactos de fijación que son especialmente visibles a nivel

ultraestructural.

Ej: mucosa gástrica para una óptima preservación, fijador a pH 5.5

Preservación de gránulos de adrenalina y noradrenalina, formaldehído 4% a pH 6.5

Uso de soluciones tampones como disolventes del fijador.

Las más usadas: tampón fosfato, Tris, cacodilato, acetato de veronal.

Atención!!! Hay que tener cuidado que el tampón elegido no reaccione con el

fijador, de tal forma que reduzca el accionar del tampón (buffering power) y las

propiedades del fijador.

Ej: veronal y Tris reaccionan con los aldehídos.

Otros tampones reaccionan con enzimas y metabolitos del tejido, tener en cuenta

para la interpretación de resultados. Ej: tampón fosfato inhibe la glucosa-6-fosfato

Clasificación de los fijadores según su mecanismo de acción

FÍSICOS

Congelación rápida o criofijación

(congelación con isopentano enfriado

previamente hasta su punto de congelación (-

170°C) en nitrógeno líquido.

Criodesecación o liofiliación (1° congelación

en nitrógeno líquido, 2° desecación por

sublimación del agua).

Criosustitución (1° nitrógeno líquido o

isopentano a -50°C, 2° sustitución con una

mezcla de alcohol etílico–acetona-propilen-glicol

a -40°C).

Calor.

Frío

Microondas

20

QUÍMICOS Formaldehído

Ácido acético

Ácido pícrico

Ácido crómico

Alcohol etílico

Bicromato potásico

Cloruro mercúrico

Glutaraldehído (para MET - MEB)

Tetróxido de osmio (para MET)

Simples

Mezclas fijadoras

Líquido de Bouin

Líquido de Zenker

Carnoy, etc.

Fijadores simples

Formaldehído al 4%:

Fijador y conservador.

Comercialmente: solución acuosa al 37- 40% de formaldehído = «formalin» (presenta

impurezas de metanol y ácido fórmico).

Se lo utiliza en distintas concentraciones («formal»). Ej. 4% o 10% (Ver Guía Curso, Pág. 8)

Velocidad de penetración/difusión: rápida. Velocidad de fijación: lento.

Tiempo de fijación: variable, entre 24 y 48 h, depende del tamaño de la pieza.

Óptimo: 48 h

Endurece considerablemente los tejidos.

Lavado: 1 a 2 h con agua corriente. Si la fijación es reciente, acortar el tiempo de lavado.

Conserva los lípidos, mitocondrias y aparato de Golgi.

Es necesario neutralizarlo porque contiene normalmente ácido fórmico. (Ver ( ( (

( Ver Guía Curso, Pág. 9).

Pigmento formólico en tejidos que contienen mucha sangre: tinte negro o

pardo oscuro. Solución: se puede eliminar en los cortes sumergiéndolos en una solución

una solución saturada de ácido pícrico en ROH 100º durante 24h.

CH2=O

Ideal para el estudio del sistema nervioso y aplicación de técnicas de impregnación

argéntica.

Deja a los tejidos con carga negativa, por ende los tejidos se vuelven afín por aquellos

colorantes básicos (exponen cargas positivas).

Ideal para estudios histológicos topográficos (biopsias).

No interfiere en la coloración ulterior de los preparados. Ideal para llevar en

campañas, luego en el laboratorio se puede re-fijar el material.

Peligros que presenta el formaldehído según las hojas de Seguridad T: Tóxico

Frases R:

R 25: Tóxico por ingestión.

R 43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.

R 40: Nocivo

R 34: Provoca quemaduras.

S 23: No respirar los vapores.

Frases S:

S 36/ 37: Úsese indumentaria y guantas de protección adecuados.

S 26: En caso de contacto con los ojos, lávese inmediatamente con agua abundante y acúdase a

un médico.

Puede post-fijarse las piezas utilizando otros fijadores como Bouin, Zenker.

Previamente se recomienda lavar las piezas durante 6 horas en agua corriente.

Paraformaldehído (PFA) 4% (CH 2 O) n (n tiene un valor entre 6 y100)

Paraformaldehído …….. 4g

Agua destilada ………....90 ml a 65 ºC (usar máscara y preparar bajo campana)

2 gotas de NaOH 2N (1M).

Mezclar con agitador hasta disolver.

10 ml de PBS 10x , ajustar a pH 7.2

Filtrar y enfriar a 4 ºC antes de usar.

Se puede preparar alícuotas en tubos falcon y freezarlos a -20ºC.

Tiempo de fijación: toda la noche

Temperatura: 4 ºC

Lavado de las piezas en PBS 1x a 4ºC, 20-30 min (2 veces).

Lavado de las piezas en 0.85% NaCl a 4ºC, 20-30 min (2 veces).

Lavado de las piezas en 0.85% NaCl en ROH 50% a Tº ambiente, 20-30 min, 2

veces.

Lavado de las piezas en ROH 50% a Tº ambiente, 20-30 min, 2 veces.

Lavado de las piezas en ROH 70% a Tº ambiente, 20-30 min, 2 veces. Conservar

hasta su procesamiento.

Recomendado para técnicas de inmunolocalización o hibridización in situ..

Peligros que presenta el paraformaldehído según las hojas de Seguridad

XI Irritante

Frases R:

R 22: Nocivo por ingestión.

R 36/37: Irrita los ojos y las vías respiratorias.

R 40: Posibles efectos cancerígenos.

Frases S:

S 16: Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas - No fumar.

S 22: No respirar el polvo.

S 25: Evítese el contacto con los ojos

Líquido claro, transparente o incoloro, volátil, inflamable y de olor agradable.

Como fijador se lo utiliza en las concentraciones entre el 70 y 100%.

Tiempo de fijación: rápido. Piezas pequeñas (1-2 mm): 20 y 30 min.

(2-3 mm): 1- 3 horas.

Penetración: lenta en el caso del ROH 100º

Si la pieza tiene que conservarse en alcohol, es necesario pasarla a ROH 90° y

después a 80°.

Se conserva en los tejidos: sustancias albuminoideas, gránulos de mucina, gránulos

de mastocitos, glucógeno, algunos pigmentos, hierro, calcio, etc.

Se lo utiliza hirviendo (2-10 min) para la fijación de invertebrados. (Ver próxima

teórica).

Buen fijador para técnicas inmunocitoquímicas ya que casi no altera la estructura

antigénica de los tejidos. Ideal para estudios de ácidos nucleicos.

CH3-CH2-OH

Alcohol etílico

Entre sus inconvenientes:

Altera considerablemente la morfología del tejido, produciendo retracción.

Mitocondrias no se conservan.

Es incompatible con muchos fijadores: como el bicromato potásico o el tetróxido

de osmio. lo que limita su participación en muchas mezclas fijadoras.

No fija adecuadamente la cromatina y además disuelve parcialmente las grasas,

compuestos de colesterina, sustancia cromafín, etc.

Una acción prolongada en ROPH 100°, dificulta la confección de buenos cortes

histológicos, además de provocar la contracción y endurecimiento del material. Para piezas mayores NO ES RECOMENDABLE.

A medida que realiza la fijación se va diluyendo al incorporar el agua que extrae de

los tejidos por lo cual pierde actividad progresivamente.

Prepara mal a los cortes para su ulterior coloración porque carece de efecto

mordiente.

Puede dar origen a fenómenos de desplazamiento de sustancias.

Peligros que presenta el alcohol etílico según las hojas de Seguridad

Afecta el tracto respiratorio, sistema nervioso central causa dolor

de cabeza.

Ingestión: Sensación de quemadura. Actúa al principio como

estimulante seguido de depresión, dolor de cabeza, visión borrosa,

somnolencia e inconsciencia.

Piel: Resequedad. Irritación.

Ojos: Irritación, enrojecimiento, dolor, sensación de

quemadura.

Inflamable. Se evapora fácilmente.

Utilizar guantes para su manipulación y anteojos de protección.

Acido acético 1% - 5%

CH3COOH

Penetración: rápida

Produce aumento del volumen del tejido, pero no endurece al tejido.

No fija proteínas citoplasmáticas, pero precipita las del núcleo, por ende resalta

claramente los núcleos.

Destruye las mitocondrias y no fija bien las membranas.

Inhibe actividad enzimática.

Reporta grandes ventajas cuando se lo utiliza formando parte de otras mezclas

fijadoras, en soluciones diluidas entre el 0.3 y 5% o en soluciones descalcificantes.

R10: Inflamable

R34: Provoca quemaduras

R35: Provoca quemaduras graves.

Frases S:

S1/2: Consérvese bajo llave y manténgase fuera del alcance de

los niños.

S23: No respirar los vapores / aerosoles.

S26: En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y

abundantemente con agua y acúdase a u

Peligros que presenta el ácido acético según las hojas de Seguridad

Frases R:

Acido pícrico

Es muy recomendable sobre todo en compañía del formaldehído y el ácido acético.

Se lo utiliza en solución saturada, preferentemente acuosa al 0.5-5%.

Es un excelente fijador estructural que conserva adecuadamente la composición

proteica de los tejidos.

Tiene penetración lenta, pero buena velocidad de fijación.

Tiempo de fijación: 1 a 24 h (depende del tamaño de la pieza).

Se trata de un compuesto con propiedades precipitantes al formar sales (picratos) con

algunas proteínas con grupos básicos que las hace insolubles.

Acción ligeramente descalcificante, entonces CUIDADO con los órganos que

contienen calcio.

NO LAVAR EN AGUA, porque los picratos se solubilizan en el agua, además de

producir un gran hinchazón de las piezas.

Conservación: en ROH 70°, debe ser renovado varias veces.

Inconvenientes

Si se prolonga el tiempo de fijación pueden aparecer una excesiva retracción tisular.

Colorea los tejidos/órganos de color amarillo. Se recomienda eliminarlo, previo a la

coloración porque en algunos casos puede interferir con la técnica.

La utilización de soluciones de ácido pícrico muy diluido ejerce una acción maceradora.

Explosivo en estado seco. Muy tóxico.

Riesgo de explosión por choque, fricción, fuego u otras fuentes de ignición.

Forma compuestos metálicos explosivos muy sensibles.

Tóxico por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.

Consérvese el recipiente bien cerrado y en lugar fresco.

Manténgase el recipiente bien cerrado y en lugar bien ventilado.

Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las

precauciones posibles.

Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.

En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta).

Peligros que presenta el ácido pícrico según las hojas de Seguridad

Acido crómico

Se emplea en diluciones acuosas entre el 0.5 y 2%.

Es un fuerte oxidante, por lo que es incompatible con el formol y el alcohol.

Velocidad de penetración lenta, por lo que las piezas deben ser de pequeño tamaño y el

tiempo de fijación algunas horas. Para piezas grandes varios días o semanas, renovando

repetidas veces el fijador.

Precipita todas clases de proteínas.

Actúa como mordiente en coloraciones que emplean colorantes básicos.

Debe eliminarse totalmente, lavando con abundante agua ya que impregna a los tejidos de

una coloración amarillenta/verdosa.

Sólo es empleado muy pocas veces, generalmente se lo utiliza combinado con otros

fijadores como ácido acético 5%.

R 49: Puede causar cáncer por inhalación.

R 8: Peligro de fuego en contacto con materias combustibles.

R 25: Tóxico por ingestión.

R 35: Provoca quemaduras graves.

R 43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.

R 50/53: Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en

el medio ambiente acuático.

Frases S:

S 53: Evítese la exposición –recábense instrucciones especiales antes de su uso.

S 45: En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico

S 60: Elimínese el producto y su recipiente como residuos peligrosos.

S 61: Evítese su liberación al medio ambiente.

Peligros que presenta el ácido crómico según las hojas de Seguridad

Bicromato Potásico (cromato ácido de potasio, cromato doble de potasio, dicromato de potásico)

No se recomienda que se lo utilice solo. Si se lo utiliza como único fijador, se deben

poner las piezas en una solución acuosa al 1-2%.

Velocidad de Penetración: baja

No se producen cambios en el volumen del tejido.

Poco endurecimiento del tejidos lo que dificulta la obtención de buenos cortes.

La forma de las células se conserva pero se pierde detalles estructurales de los

núcleos.

Se utiliza para el estudio del sistema nervioso y de ojo.

Combinado con otros líquidos fijadores da muy buenos resultados, como con el ácido

acético. Es incompatible con el formaldehído 40% y el alcohol.

Se forman frecuentemente pigmentos de color verde debido a la acción de la luz

durante la fijación, suelen confundirse con pigmentos naturales. Por eso durante la

fijación las piezas se mantienen en oscuridad.

Frases R:

R 45: Puede causar cáncer por inhalación.

R 46: Puede causar alteraciones genéticas hereditarias.

R 21: Nocivo en contacto con la piel.

R 25: Tóxico por ingestión.

R 26: Muy tóxico por inhalación.

R 37/38: Irrita las vías respiratorias y piel.

R 41: Riesgo de lesiones oculares graves.

R 43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.

R 50: Muy tóxico para los organismos acuáticos.

R 53: Puede provocar a largo plazo efectos negativas en el medio ambiente acuático.

Frases S:

S 53: Evítese la exposición-recábense instrucciones especiales antes de su uso.

S 45: En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible,

muéstrele la etiqueta).

S 60: Elimínese el producto su recipiente como residuos peligrosos.

S 61: Evítese su liberación al medio ambiente.

Peligros que presenta el bicromato potásico según las hojas de Seguridad

Provoca artefactos tisulares como la aparición de vacuolas citoplasmáticas, retracciones u

cambios en la morfología nuclear.

Lavar con abundante agua.

Sublimado o cloruro de mercurio

Se lo utiliza en soluciones del 5-6% o formando parte de mezclas fijadoras como el líquido

de Zenker.

Es un excelente fijador de los caracteres morfológicos celulares por lo que es el de

elección para patologías hematopoyéticas y renales.

Es un excelente mordiente por lo que produce una intensa y brillante coloración nuclear y

citoplasmática.

Tiene una velocidad de penetración muy rápida, pero una velocidad de fijación lenta

entonces el tamaño de las piezas no debe exceder de 3-5 mm.

Tiempo de fijación: 4 a 6 h. Cuando las piezas se tornan de color blanco, entonces deben

ser retiradas del fijador. No prolongar el tiempo porque se contrae y endurece el tejido.

No lavar con agua. Pasar el material directamente a ROH 70°.

Se forman en las piezas precipitados metálicos de mercurio de color pardo, lo cual dificulta

la observación. Se pueden eliminar, durante el proceso de deshidratación, colocando en el

ROH 70° o 80° algunas gotas de una solución alcohólica de yodo e ioduro potásico. Se

deja en esta solución hasta que el alcohol tome un color pardo (color del coñac) (Ver Guía

del Curso, Pág. 14).

Frases R: 28-34-48/24/25-50/53

Muy tóxico por ingestión.

Provoca quemaduras.

Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada

por contacto con la piel e ingestión.

Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos

negativos en el medio ambiente acuático.

Frases S: 36/37/39-45-60-61

Utilizar indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos-la cara.

En caso de accidente o malestar, acuda inmediatamente al médico.

Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos.

Evítese su liberación al medio ambiente.

Peligros que presenta el cloruro mercúrico según las hojas de Seguridad

Otra dificultad: hay que eliminar el iodo de las preparaciones porque puede interferir con

las coloraciones, especialmente con las anilinas. Para decolorar los cortes, utilizar una

solución de hiposulfito sódico 0.25%, durante algunos minutos.

Evitar utilizar instrumentos metálicos cuando se manipula fijadores que contienen

sublimado.

Mezclas fijadoras

Mezclas que contienen principalmente formaldehído en su composición

«Formol » Calcio o Líquido de Baker (Ver Guía del Curso Pág.9)

Formaldehído 37-40% ….…… ………. 10 ml

Cloruro de calcio anhidro10%.............. 10 ml

Agua destilada………………. . ………80 ml

Ideal para la preservación de lípidos y estudios histoenzimáticos. La presencia de

iones calcio aumenta la preservación de algunos tipos de lípidos, por ejemplo

fosfolípidos.

Cortes por congelación.

Tiempo de fijación: 24 a 72 h. Si se prolonga el tiempo de fijación puede debilitarse

la coloración de fosfolípidos, por ejemplo.

Preparar un día antes de utilizar.

Formaldehido Tamponado al 10%

Ideal para prevenir el choque osmótico cuando se prepara la solución de

formaldehído al 10% en agua destilada y los pigmentos formólicos que

ocurren a un pH inferior a 6.

Velocidad de penetración: lenta (1mm/h) para una pieza de 0.5 cm.

Tiempo de fijación: 12 a 24h. Funciona con 18 h

Recomendable: lavado en agua 30 min para remover sales.

Ideal para estudios inmunohistoquímicos.

(Ver Guía del Curso Pág. 8)

(Ver Guía del Curso Pág.10)

«Formol » Salino

Formaldehído 37-40%............ 100 ml

Cloruro de Sodio………………. 9 g

Agua destilada..……….. …….900ml

Se utiliza para prevenir el efecto osmótico que provoca el empleo de disoluciones

de formaldehído en agua destilada.

Esta solución debe ser hecha al menos un día antes de usar para dar tiempo a la

depolimarización de polímeros del formaldehído.

Puede guardarse por varios meses.

El material no puede conservarse ahí por más de una semana porque pueden formarse

pigmentos formólicos.

(Ver Guía del Curso Pág. 9)

Mezclas que contienen alcohol

Líquido de Carnoy (1886) (Ver Guía del Curso Pág. 11)

Acción rápida.

Velocidad de fijación: rápida.

Tiempo de fijación: corto, de 2 a 4 h. Para piezas de 5 mm de grosor como máximo 6 h.

Transferir directamente a ROH 100° o una mezcla de ROH 100 – cloroformo (1:1).

Es un buen fijador de la cromatina. Es un eficiente fijador para técnicas histoquímicas.

Los lípidos son disueltos. Fijador ideal para conservación de glucógeno.

Dan buenos resultados las coloraciones topográficas.

Desventaja: produce retracción de los tejidos, hemólisis masiva de eritrositos, pobre

conservación del ADN.

ROH 100°………………..60 ml

Cloroformo ……………...30 ml

Ác. acético glacial……….10 ml

Sol. acuosa saturada de ácido pícrico …. 70 ml

Formaldehído 37-40% ……………… 25 ml

Ácido acético glacial……………………. 5 ml

Ideal para estudios morfológicos y de anatomía microscópica.

Es muy penetrante (por acción del ácido acético y el formaldehído 40%).

Las piezas pueden ser relativamente voluminosas hasta 1 cm de espesor.

Tiempo de fijación: 12 a 18 h., aunque una permanencia de hasta 8 días no perjudica a las

piezas. Recordar que no es un líquido de conservación.

De empleo fácil, no exige cuidados especiales.

No se lavan las piezas con agua (las proteínas coaguladas por la acción del ácido pícrico,

se solubilizan en el agua de lavado).

Se trasladan las piezas directamente a ROH 70º y se las conserva hasta el momento de su

procesamiento.

Color amarillento de las piezas.

Líquido de Bouin (1902) (Ver Guía del Curso Pág.10)

Poder de

Penetración

Efecto

Ác. Pícrico Contrae y

ablanda

Formaldehído

40%

Endurece

Ác. acético Hincha y

ablanda

Mezclas que contienen ácido pícrico

Líquido de Gendre (1937) (Ver Guía del Curso)

Sol. saturada de ácido pícrico en ROH 96°…. 85 ml

Formaldehído 37-40% ………………………10 ml

Ácido acético glacial……………………. ….. 5 ml

Tiempo de fijación : 1 a 12 h a temperatura ambiente o de 18 a 24 h en heladera.

Este fijador tiene que ser enfriado a -73°C antes de usar.

Realizar varios lavados con ROH 96º, conservar en ROH 100°.

Ideal para la conservación de glucógeno y pigmentos derivados de la hemoglobina.

Para órganos que contienen glucógeno 4 h de fijación a temperatura ambiente da muy

buenos resultados.

Líquido de Zenker (1884) (Ver Guía del Curso Pág. 11)

Cloruro mercúrico…………5 g

Bicromato potásico……….....5 g

Sulfato de sodio……………..1g

Agua destilada……………100 ml

Ácido acético glacial….….. …5 ml

Bicromato de K: Las piezas fijadas deben

lavarse durante 24 h. en agua corriente

con circulación continua para evitar la

formación de precipitados de óxido crómico.

Mezcla que contiene sublimado

Componentes Poder de

Penetración

Cl2Hg

Bicromato de K

Ácido Acético

Cl2Hg (sublimado corrosivo): Es muy tóxico, se absorbe por piel USAR GUANTES!!!!

Usar para manipular las piezas espinas de cactus .

Es necesario eliminar el precipitado de mercurio metálico o de cloruro mercurioso en

los tejidos, entonces debe lavarse las piezas con alcohol iodado. El mercurio precipita

como ioduro de mercurio. Luego tratar los cortes con una solución de hiposulfito de sodio

al 0.25% para eliminar el iodo.

Tiempo de fijación: de 4 a 24 h.

Tamaño de las piezas: pequeño

No es compatible con algunas técnicas histoquímicas

Fijadores para Microscopía Electrónica

Fijadores simples: glutaraldehído, paraformaldehído,

tetróxido de osmio.

Glutaraldehído

Se lo suele comprar concentrado al 25% en solución acuosa a pH 3. Se conserva en la

heladera a 4ºC. Controlar su pH, si cae por debajo de 3.5, descartar. También si se pone

amarillo.

Se emplea al 1-3% diluido en soluciones tampón, (pH 7.2-7.4) debido a la baja

osmolaridad que tiene. Acepta el agregado de Cl2Ca.

Velocidad de penetración: baja, por ende los fragmentos de tejidos tiene que ser muy

pequeños, pocos milímetros cúbicos.

Gran capacidad de retracción y endurecimiento tisular, por ende el tiempo de fijación no

debe superar las 4 h, si se trabaja a 4°C. Se prolongan los tiempos si se realiza a

temperatura ambiente.

Tiene una excepcional capacidad para preservar la morfología celular.

No es recomendable para técnicas de inmunolocalización porque enmascara epitopes, se

utiliza a muy baja concentración.

(Ver Guía del Curso Pág. 19).

Peligros que presenta el glutaraldehído según las hojas de Seguridad

Frases R: 22-23-34-42/43-50

Nocivo por ingestión. Tóxico por inhalación.

Provoca quemaduras. Posibilidad de sensibilización por inhalación y en

contacto con la piel. Muy tóxico para los organismos acuáticos.

Frases S: 26-36/37/39-45-61

En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua

y acúdase a un médico.

Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. En

caso de

accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico.

Evítese su liberación al medio ambiente.

Tetróxido de Osmio (OsO4)

Solución óptima de trabajo al 1-2% en tampón fosfato pH 6 (Ver Guía del Curso Pág.

19).

Se lo utiliza en la MET como 2° fijador o post-fijador ya que fija las cadenas insaturadas

de lípidos. Se deposita en la región hidrofílica de los fosfolípidos y se une a las histonas.

Velocidad de penetración: baja por ende las muestras deben tener un pequeño

volumen.

No contrae.

Fija adecuadamente las mitocondrias, aparato de Golgi y las grasas.

Debe ser cuidadosamente eliminado mediante un lavado con agua.

Peligros que presenta el tetróxido de osmio según las hojas de Seguridad

Afecta vías respiratorias al inhalarlo. Irrita garganta, nariz, pulmones.

En contacto con la piel causa irritación, salpullido, quemaduras.

En los ojos ocasiona irritación, quemaduras e incluso pérdida de visión

(opacidad córnea). Es carcinogénico.

Puede causar daño en el riñón. No usar con buffer TRIS: explota!!!!

Usar guantes, ropa de protección y anteojos de protección.

LA FIJACIÓN … EN LA PRÁCTICA

1. Elección del fijador:

a) Según el tipo de estudio a realizar

Topográfico

Histoquímico

Inmunocitoquímico

Microscopía electrónica

b) Según la coloración que se piensa realizar

c) Según el tipo de animal y/o tipo de órgano.

2. Elección del tipo de procedimiento de fijación: inmersión o perfusión

3. Preparación de fijadores:

Tener en cuenta que el volumen del fijador sea por lo menos 20 veces el de la pieza.

Fijador simple: Formaldehído 4% previa neutralización (Ver Guía del Curso, Pág.

8) y Glutaraldehído 3% en tampón fosfato pH 7.2 (para MET).

Soluciones fijadoras: Formol-Ca, Líquido de Bouin, Líquido de Gendre, Zenker

(Ver Guía del Curso, Pág. 8-11).

Los fijadores sólo se emplean una vez.

4. Preparación de recipientes:

Frascos extremadamente limpios (sobre todo en las fijaciones a base de osmio), de vidrio.

Para fijación con glutaraldehído se pueden utilizar

Muestras pequeñas. Tener en cuenta la morfología interna

del órgano (macizo o hueco).

MÉTODOS

DE

FIJACIÓN

INMERSIÓN

PERFUSIÓN (Ver Guía del Curso Pág. 12-14)

5. Preparación de etiquetas. Datos del especimen.

Escribir con lápiz o tinta china: Nº de identificación, órgano; animal, sexo, fijador.

Los fijadores a base de ácido ósmico no permite la colocación de etiquetas en los frascos

porque las ennegrece, por lo que se puede pegar provisoriamente una etiqueta en el exterior.

Con el líquido de Zenker, poner un papel adentro y otro afuera (alcohol iodado ennegrece la

etiqueta).

6. Narcotización o anestesia del animal:

INVERTEBRADOS (Ver explicación teórica de la tarde)

VERTEBRADOS

Dilución en el medio para peces y anfibios: benzocaina,

MS222.

Inhalación de vapores. Para organismos terrestres:

tetracloruro de carbono.

Inyección intraperitoneal, intramuscular o endovenosa:

nembutal sódico.

Hipotermia.

Desmedulación.

7. Disección:

Conocimiento previo de la anatomía. Consulta bibliográfica.

Tener en cuenta qué órganos se quieren fijar.

RECORDAR tener en cuenta más que el volumen de la pieza, su grosor.

Cuando los animales son fijados in toto, es conveniente hacer incisiones en la pared del

cuerpo, sin ser destruida conexiones anatómicas importantes, para que el fijador pueda

penetrar. Sino lo mejor es perfundir y luego sumergir el animal en el fijador.

8. Extracción de órganos:

Los órganos no deben sufrir ninguna lesión mecánica, ni ser aplastados con la pinza.

1° con una tijera obtener el órgano. Sobre una placa de cera con una Gillette afilada

o una cuchilla de descarte u hoja de bisturí fraccionar el material en porciones menores.

Los extremos que fueron cortados con tijera, se seccionan y se desechan.

Gota de fijador

Placa de cera

Órgano

blando

A. Para la extracción de los órganos/ tejidos considerar las siguientes prioridades:

Glándulas endocrinas y exocrinas (lo más rápido posible)

Riñón,

Páncreas

Adrenal,

Intestino delgado

Intestino grueso

Estómago

Hígado

Músculo esquelético

Hueso

Piel

Encéfalo

Médula espinal

Ganglios nerviosos

5 min. post-mortem

No más allá de los 10 min.

No deben extraerse más allá de los 15 min. post-mortem.

B. Órganos con contenido (Ej: intestino): tener en cuenta orientación (A-P)

1) Lavado del interior con solución fisiológica.

2) Se ata un extremo.

3) Se agrega fijador en el interior.

4) Se ata el otro extremo.

5) Se fija por inmersión.

C. Órganos con gran desarrollo de la musculatura (Ej: estómago):

Para evitar la contracción se estira un pedacito del órgano (un cuadrado) sobre un papel

de filtro y se introduce dentro del recipiente con el fijador.

D. Pulmón: Se inyecta el fijador por la tráquea.

E. Órganos macizos (Ej: hígado, testículo): Se sumerge el órgano entero en el fijador

5-10 min y luego se lo corta en pequeñas muestras.

F) Piel: Se depilan los pelos y se adhiere su cara externa a un papel de filtro. Se sumerge

en el fijador.

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9. Sumergir la pieza directamente en el fijador y no en un recipiente vacío, en el que luego

se pondrá el fijador, a fin de evitar cualquier adherencia de una superficie de la pieza al

vidrio.

Asegurarse que todas las caras de la pieza estén en contacto con el fijador, sino envolverla en

una gasa y colocarle un hilo sujeto a la tapa para que quede suspendida o bien colocar en el

fondo del recipiente una capa de algodón .

10. Las piezas serán depositadas en el fijador con la ayuda de un pincel. Recordar que si

la mezcla fijadora contiene sublimado no se puede manipular el material con instrumental

metálico.

RECORDAR

“NO EXISTE EL FIJADOR IDEAL; TODOS TIENEN SUS

FORTALEZAS Y DEBILIDADES”

EN LA TÉCNICA HISTOLÓGICA UN DEFECTO DE

FIJACIÓN NO PUEDE SER SUBSANADO;

ES INÚTIL PRETENDER HACER UN ESTUDIO

HISTOLÓGICO DE UN MATERIAL CON DEFECTOS

DE FIJACIÓN.

Dijo Marlene Benchimol, microscopista brasilera:

«Esto tiene más de brujería que de ciencia”

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OJO!!!!

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Fijación por inmersión.

Fijación por perfusión.

Inadecuada fijación con tetróxido.

Note que las membranas no se visualizan.

Inadecuada preparación del tetróxido 65

Tres ejemplos de mitocondrias mal fijadas

por deficiencia en el proceso.

Porciones de mitocondrias aparecen vacías.

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Debido a una pobre fijación, la membrana aparece discontinua.

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Obsérvese un artefacto en la

membrana nuclear producto de una

pobre fijación.

Se evidencia el espacio perinuclear.

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