Ardi betarretrobirus endogenoen (enJSRVen) dinamika ebolutiboa: karakterizazioa,

hedapena eta adierazpen ikerketa

Jakintza-arloa: Biologia

Egilea: MAIALEN SISTIAGA POVEDA

Urtea: 2014

Zuzendaria: BEGOÑA JUGO ORRANTIA

Unibertsitatea: UPV/EHU

ISBN: 978-84-8438-561-5

Hitzaurrea

Tesi honek ardi betarretrobirus endogenoen (enJSRVen) jakintzan sakontzeko helburua du. Bertan parte hartu dugun guztiok (artiledun zein artile-gabeak) genetikaren munduaren garapen harrigarriaren lekuko izan gara eta askotan, baita protagonistak ere. Tesi honetan behin baino gehiagotan azpimarratzen den bezala, erretrobirusek ugaztunon zelulak infektatu behar dituzte ugaldu ahal izateko. Bada, ugaztunon ugaltzeko sistema, behintzat ezagutzen dugun moduan, erretrobirus endogenoetatik jasotako sekuentziatan oinarriturik dago eta beraz, ugaztunak ez ginateke ugaltzeko gai izango erretrobirus endogenorik izango ez bagenu.

Erretrobirus endogenoek bideratutako ugal ezaugarrien adibide polit bat ardietan aurki dezakegu. Ardiaren genoman integraturik enJSRV izeneko erretrobirus endogenoak daude eta ardien ugal biologiaren alderdi garrantzitsuak betetzen dituztela behatu da. 2007. urtean Washingtongo Unibertsitateko Thomas E. Spencer ikerlariak behatu zuen enJSRVak ardia ugaldu eta 12 egunera aktibatzen zirela eta honekin batera enbrioia handitu egiten zela, beraz, erretrobirus endogeno hauek ezinbestekoak dira ardi enbrioien garapenerako. Gainera, zenbait esperimenturen bidez enJSRVak inaktibatzen direnean, ardien kumaldiaren galera gertatzen da.

Gainera, tesi honetan lehen aldiz enJSRVen gain-adierazpena behatzen da aharien ugal-organoetan. Ugaztun arretan ez dago argi zein den erretrobirus endogenoek betetzen duten papera honelako prozesu fisiologikoetan. Hala ere, zenbait giza eta sagu erretrobirus endogenoek espermatogenesiarekin erlazionatutako paper biologiko garrantzitsuren bat joka dezaketela iradoki izan da eta hau izan liteke enJSRVen kasua ere.

Baina oro ez da urre eta erretrobirus endogenoek badute ere ugaztunen berezkoak diren beste ezaugarri batzuetan eragina, esate baterako, zenbait gaixotasunen garapenean. Tesi honetan aipatzen den moduan, erretrobirus endogeno gehienek akats genetikoak metatu dituzte eta ondorioz adierazteko gaitasuna galdu dute askok, baina ez denek. Zenbait ikerketek argi erakutsi dute erretrobirus endogenoen eta gaixotasunen arteko lotura eta dirudienez, elementu hauek bereziki aktiboak dira zenbait minbizi, gaixotasun autoimmune eta prionek eragindako gaixotasunetan.

Gizakiotan, erretrobirus endogenoak esklerosi anizkoitzean eragina izan dezaketela deskribatu izan da eta 2004. urtean egindako ikerketa batean eskizofreniarekin lotura azaldu zuten mota honetako elementuek. Tesi honetan, ardia erabili dugu erretrobirus endogeno eta gaixotasun hauen arteko lotura ikertzeko animalia eredu moduan. Ardien biriketako adenokartzinoma, erretrobirusek eragindako minbizia da eta bestalde, Scrapie izeneko gaixotasun prionikoa pairatzen dute ardiek, nerbio-sistema kaltetzen duen entzefalopatia espongiformea. Hemen, enJSRV motako erretrobirus endogenoak erabili dira elementu hauen lotura aztertzeko ardien bi gaixotasun hauen kasuan. Minbiziaren kasuan lotura hain argia ez bada ere, enJSRV motako erretrobirus endogeno batzuek efektu babesgarria dutela dirudi eta ondorioz, enJSRV hauek dituzten ardiek ez dutela minbizirik garatzen. Azkenik, Scrapie gaixotasunak enJSRV motako erretrobirus endogenoak aktibatzen zituela behatu zen ardien bizkar-muin kranialean.

Beraz, ardi erretrobirus endogenoak era berean artzain eta otso direla esan daiteke eta gauza bera gertatzen da “ugaztundu” gintuzten birusekin: ugaldu ahal izateko ezinbestekoak bilakatu zaizkigun arren, nolabaiteko zehar-kalteak jasan behar izan ditugu trukean, esate baterako, zenbait gaixotasunen garapena.

Maialen Sistiaga2015eko iraila

ARDI BETARRETROBIRUSEN (enJSRVen)

DINAMIKA EBOLUTIBOA

Karakterizazioa, hedapena eta

adierazpenaren ikerketa

Maialen Sistiaga Zuzendaria: Begoña M. Jugo

Leioa, Euskal Herriko Unibertsitatea

2014

Nere gurasoentzat

1

Dirulaguntzak Euskal Herriko Unibertsitateak (UPV/EHU) eman ditu honako proiektuen bitartez:

UPV/EHUko GIU10/22 Ikerkuntza Taldea

CLUMBER (Cluster for Molecular Biology, Education and Research) Ikerkuntza eta Formakuntza Unitateko UFI11/20

M Sistiaga-Poveda Eusko Jaurlaritzako Hezkuntza, Hizkuntza Politika eta Kultura Saileko Doktoretza-aurreko Programako beka baten onuraduna izan da eta Eusko Jaurlaritzako Egonlabur beka baten laguntzaz egin du 3 hilabeteko egonaldia D. Mager doktorearen Terry Fox laborategian (British Columbia Cancer Institute, Vancouver).

Lan hau ezinezkoa izango zen erakunde eta ikerlari hauen kolaboraziorik gabe:

Leongo Unibertsitatea: V Pérez eta J Benavides doktoreak.

Zaragozako Unibertsitatea: R Bolea, I Martín-Burriel, JJ Badiola eta J Herrero doktoreak.

Oviedoko Unibertsitatea: A Dominguez doktorea.

Centre de Recerca Agrigenòmica (CRAG) - UAB Barcelona: M Amills eta A Noce doktoreak.

Neiker-Teknalia. I Beltrán de Heredia, RA Juste eta E Minguijón doktoreak.

eta UPV/EHU. Matematika Aplikatua eta Estatistika eta Ikerkuntza Operatiboa Saila: I Arostegi doktorea eta MM Mateo-Abad.

2

3

SAILAREN ADOSTASUNA

Genomika, Antropologia Fisikoa eta Animalia Fisiologia Saileko Kontseiluak,

___________________________________________________________(e)ko bileran, “Ardi

betarretrobirus endogenoen (enJSRVen) dinamika ebolutiboa: karakterizazioa,

hedapena eta adierazpenaren ikerketa” izenburua duen doktorego-tesia aurkeztearen alde

dagoela adierazi du.

BEGOÑA MARINA JUGO ORRANTIA andrearen zuzendaritzapean egin den tesi hori

MAIALEN SISTIAGA POVEDA andreak aurkeztu du sail honetan.

Leioan, 2014(e)ko ______________aren ______a

O. E. SAILEKO ZUZENDARIA SAILEKO IDAZKARIA

Iz.: __________________________ Iz.:______________________

4

5

TESIKO ZUZENDARIAREN BAIMENA TESIA AURKEZTEKO

BEGOÑA MARINA JUGO ORRANTIA andreak, 38589150-R I.F.Z. zenbakia

duenak “Ardi betarretrobirus endogenoen (enJSRVen) dinamika ebolutiboa:

karakterizazioa, hedapena eta adierazpenaren ikerketa” izenburua duen doktorego-

tesiaren zuzendari naizenak, tesia aurkezteko baimena ematen dut, defendatua

izateko baldintzak betetzen dituelako. MAIALEN SISTIAGA POVEDA

doktoregai andreak egin du aipaturiko tesia, Genetika, Antropologia Fisikoa eta

Animalia Fisiologia Sailean.

Leioan, 2014(e)ko _____________aren ____a

TESIKO ZUZENDARIA

Iz.: ..............................

6

7

DOKTORE GRADUAREN AKTA

DOKTOREGO TESI DEFENTSAREN AKTA

Doktoregai jn./and.: MAIALEN SISTIAGA POVEDA

TESIAREN IZENBURUA: “Ardi betarretrobirus endogenoen (enJSRVen) dinamika

ebolutiboa: karakterizazioa, hedapena eta adierazpenaren ikerketa”

UPV/EHUko Graduondoko Batzordeak goian adierazitako doktorego tesia kalifikatzeko

aukeratutako epaimahaiak, eta adierazitako egunean bilduta, behin doktoregaiak defentsa eginda eta

egin zaizkion objekzioak edota iradokizunak erantzunda, ___________________ (Aho batez edo

gehiengoaz) eman du honako kalifikazioa:

BIKAIN / OSO ONGI / GAI / EZ GAI

Defentsan erabilitako hizkuntzak (hizkuntza bat baino gehiago erabili badira, zehaztu hizkuntza

bakoitzean defendatutako ehunekoak):

Leioa (e)n, 2014 (e)ko aren (e)an

PRESIDENTEA, IDAZKARIA

Sin.: Sin.:

Dk: ____________________ Dk: ______________________

1. mahaikidea, 2. mahaikidea, 3. mahaikidea,

Sin.: Sin.: Sin.:

Dk: Dk: Dk:

DOKTOREGAIA,

Sin.: _____________________

8

9

EDUKIEN TAULA

Laburduren zerrenda Laburpena Esker onak Argitalpenen zerrenda

1. KAPITULUA: SARRERA ETA LITERATURAREN BERRIKUSPENA

Ostalaria: Caprinae subfamilia

o Ardia (Ovis orientalis aries) Latxa Merino Rasa aragonesa Assaf

o Mufloia (Ovis orientalis musimon) o Pirinioetako sarrioa (Rupicapra pyrenaica) o Ahuntza (Capra aegagrus hircus)

Ahuntz alpetarra Azpigorria Malagarra Murtziar-granadarra Payoya Ahuntz pigmeoa Arbi ahuntza

Erretrobirusak o Erretrobirus endogenoak (ERVak) o ERVen genomaren egituraketa

Gag Pol/Pro Env Bestelako geneak LTRak

o ERVen sailkapena eta banaketa I klaseko ERVak II klaseko ERVak III klaseko ERVak Sailkatu gabeko ERVak

o Erretrobirus endogenoen bizi-zikloa Txertatzea

Ugaritzea

Finkatzea

o ERV eta ostalariaren arteko elkarrekintzak o ERVen isilarazpen epigenetikoa: DNAren metilazioa

27

28

30

31

32

33

34

35

37

13

17

21

23

25

38

39

39

39

40

40

40

41

42

43

44

44

45

45

46

47

49

49

52

52

53

54

55

55

56

58

10

o Ardi erretrobirus endogenoak Jaagsiekte ardi erretrobirusa Ardi betarretrobirus endogenoak (enJSRVak) enJSRVen historia ebolutiboa enJSRVen karakterizazioa enJSRVen banaketa enJSRVen adierazpena enJSRVen eta ostalariaren arteko ko-eboluzioa

enJSRVen papera enbrioiaren garapenean eta karenaren morfogenesian

enJSRVak murrizketa-faktore modura

Ardien Biriketako Adenokartzinoma, erretrobirusek eragindako gaixotasuna

Kasu-kontrol asoziazio-analisiak

Hitz batzuk ardien ongizatearen inguruan eta OPAren gainean ikertzearen inguruko etikan

TESIAREN HELBURUAK ETA LABURPENA

2. KAPITULUA: ARDI BETARRETROBIRUS ENDOGENOEN (enJSRVen)

INGURUNE GENOMIKOA ETA TXERTATZE INTRONIKOEK

ERAGINDAKO EFEKTU TRANSKRIPZIONALAK

Laburpena

Hitz-gakoak

Sarrera

Material eta metodoak o Animalia eta laginak o DNA erauzketa o enJSRVen detekzio esperimentala

Ezabatze-PCRa Alderantzizko-PCRa (iPCRa)

o enJSRVen eta hauen txertatze-lekuen in silico azterketa o ERV-gene kimeren in silico azterketa o enJSRVen eta albo-geneen bisulfito-sekuentziazioa

Emaitzak o Txertatze paisaia o enJSRVen albo-sekuentzien ingurune genomikoa o Usteko enJSRV-gene kimeren identifikazioa o enJSRV-gene kimera kandidatuen metilazio analisiak

Eztabaida

3. KAPITULUA: JAAGSIEKTE BIRUSAK ERAGINDAKO ARDIEN

BIRIKETAKO ADENOKARTZINOMAREN ETA enJSRV KOPIA

POLIMORFIKOEN ARTEKO ASOZIAZIO-ANALISIAK

59

60

61

61

62

64

66

68

68

68

72

74

77

81

83

83

84

87

87

88

89

89

90

91

93

93

94

96

98

98

103

73

91

92

11

Laburpena

Hitz-gakoak

Sarrera

Material eta metodoak o Laginak eta arrazak o DNAren prestaketa o enJSRV polimorfikoen presentzia/Absentziaren detekzioa o enJSRVak genotipatzeko sistema berri baten garapena o Analisi estatistikoak

Emaitzak o Presentzia/Absentzia eta beste arraza batzuekin konparaketa o Presentzia/Absentzian oinarritutako asoziazio-analisiak o Genotipazioa eta genotipoetan oinarritutako asoziazio-

analisiak o Genotipazio sistema berri baten garapena

Genotipatutako enJSRVen asoziazio-analisiak Banakako asoziazioa Erretrotipoak

Eztabaida

4. KAPITULUA: ARDI BETARRETROBIRUSEN (enJSRVen) ADIERAZPEN

ETA METILAZIO ANALISIAK ARDIEN ORGANO DESBERDINETAN:

SCRAPIE GAIXOTASUN PRIONIKOAK enJSRVen ADIERAZPENA

SUSTATZEN DU BIZKAR-MUIN KRANIALEAN

Laburpena

Hitz-gakoak

Sarrera

Material eta metodoak o Animaliak eta laginak o RNA erauzketa, DNAsa tratamendua eta cDNA sintesia o enJSRVen adierazpen analisiak o Geneen adierazpenaren normalizazioa o enJSRVen adierazpenaren kuantifikazio erlatiborako analisi

estatistikoak o Analisi bioinformatiko bidezko enJSRVen adierazpenaren

detekzioa o enJSRV kopia-kopuruaren kuantifikazioa o DNA erauzketa eta bisulfito-sekuentziazioa

Emaitzak o enJSRVen RNA adierazpena ardi ehun desberdinetan

RT-qPCRaren efizientzia enJSRVen adierazpen-analisiak ehun desberdinetan enJSRV kopia-aldakortasunaren kuantifikazioa

105

105

105

107

107

108

108

109

109

110

110

111

112

112

113

113

114

114

119

121

121

122

123

123

124

125

126

127

127

128

130

130

131

133

130

129

12

o env eta orf-x probiralen CpG metilazio globala ardi ehunetan o enJSRVen adierazpen analisia ezohiko egoera fisiologikoan:

Scrapiez gaixotutako ardiak

Eztabaida

4. kapituluko datu gehigarriak

5. KAPITULUA: ARDI BETARRETROBIRUS ENDOGENOEN (enJSRVen)

UGARITZEAREN DINAMIKA EBOLUTIBOA ARDIAN, MUFLOIAN,

PIRINIOETAKO SARRIOAN ETA AHUNTZAN

Laburpena

Hitz-gakoak

Sarrera

Material eta metodoak o Laginak eta arrazak o DNAren prestaketa o enJSRVen detekzio esperimentala o enJSRVen in silico detekzioa o Nomenklatura eta sailkapena o Klonazioa eta sekuentziazioa o Analisi bioinformatikoak

Sekuentzien egiaztapena eta lerrokapena Analisi filogenetikoak Populazioen genetikako analisiak

Emaitzak o enJSRVen sekuentzia dibertsitatea o Esperimentalki detektatutako enJSRVen analisi filogenetikoak o enJSRVen arteko konparaketak espezie barruan eta espezieen

artean

Eztabaida o enJSRV dibertsitatea ardiaren lerroko espezieen artean

Datuen bilketa

6. KAPITULUA: EZTABAIDA OROKORRA ETA ONDORIOAK

Eztabaida orokorra

Ondorioak

Datu gehigarriak

Bibliografia

134

136

139

141

143

143

143

145

145

147

147

148

148

148

149

149

149

150

150

150

152

154

156

156

158

159

161

167

173

183

134

13

LABURDUREN ZERRENDA

5mC = 5-metilzitosina

A = Adenosina

AECII = II motako zelula albeolarrak

AI = Intseminazio artifiziala

ALV = Hegaztien leukosi birusa

AMV = Hegaztien mieloblastosi birusa

ATPasa = Adenilpirofosfatasa

BAC = Kartzinoma bronkoalbeolarra

BDV = Mugako gaixotasun birusa

BFV = Behien birus apartsua

BIV = Behi immunoeskasiaren birusa

BLAST = Tokiko Lerrokatzerako Oinarrizko Bilatzailea

BLV = Behi leuzemia birusa

C = Zitosina

CA = Kapsula

CAEV = Ahuntzen artritis-entzefalitis birusa

cDNA = Azido desoxirribonukleiko osagarria

CnEV = Crocodylus niloticusen birus endogenoa

CT = Isats zitoplasmatikoa

DGPA = Nekazaritza eta elikadurako Politiken Zuzendaritza Orokorra

DNA = Azido desoxirribonukleikoa

Dnmt = DNA metiltransferasa

DU = Desoxiuridina trifosfatasa

EIAV = Zaldien anemia birus kutsakorra

enJSRV = Jaagsiekte ardi erretrobirus endogenoa

ENTV = Tumore birus enzootiko nasala

ERV = Erretrobirus endogenoa

EST = Adierazitako sekuentzia ituak

exJSRV = Jaagsiekte ardi erretrobirus exogenoa

FAOSTAT = Nazio Batuetako Jaki eta Nekazaritza Erakundea

FelV = Katuen leuzemia birusa

FFPE = Formalinan Fixatutako Parafinan Txertatutako ehuna

FFV = Katuen birus apartsua

FISH = In situ hibridazio fluoreszentea

FIV = Katu immunoeskasiaren birusa

G = Guanina

GALV= Giboien leuzemia birusa

GAPDH = Glizeraldehido 3-fosfato deshidrogenasa

GKN2 = 2-Gastrokina

14

GO = Geneen Ontologia

GPCOV = C-motako akurien onkobirusa

HERV = Giza erretrobirus endogenoa

GIB = Giza immunoeskasiaren birusa

HPRT = Hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa

HTLV = Giza T-linfotrofiko birusa

hyal-2 = Hialuronidasa-2 genea

IAP = A-motako partikula intrazisternala

IN = Integrasa

iPCR = Alderantzizko Polimerasaren kate-erreakzioa

ISGC = Ardien Genomika Partzuergo Internazionala

JSRV = Jaagsiekte ardi erretrobirusa

LCM = Laser bidezko mikrodisekzioa

LINE = Bukaera-luzeko elementu tartekatuak

LTR = Bukaera-luzeko errepikapena

MA = Matrizea

MARM = Nekazaritza, Elikagai eta Ingurumen Ministerioa

MHC = Histobateragarritasun Konplexu Nagusia

MIQE = Denbora-errealeko PCR kuantitatiboko esperimentuak publikatzeko Gutxieneko Informazioa

ML = Probabilitate Maximoa

MLV= Saguen leuzemia birusa

MMTV = Saguen ugatzetako tumore birusa

MPMV= Mason-Pfizer tximinoen birusa

mRNA = azido erribonukleiko mezularia

MS-PCR = Metilazio-espezifikoa den Polimerasaren kate-erreazkzioa

mtDNA = Azido desoxirribonukleiko mitokondriala

MuLV = Saguen leuzemia birusa

MVV = Visna-maedi birusa

My = Milioi urte

NC = Nukleokapsula

NCBI = Informazio Bioteknologikorako Zentro Nazionala

NJ = Aldameneko lotura

NOS3 = 3-Oxido nitriko sintetasa

NPGA = Ahuntz pigmeoaren elkarte nazionala

OERV = Ardien erretrobirus endogenoa

OPA= Ardien biriketako adenokartzinoma

OR = Arrisku-faktorea

ORF = Irakurketa Marko Irekia

PBS = Hasleen lotura gunea

PCR = Polimerasaren kate-erreakzioa

PERV = Txerrien erretrobirus endogenoa

PIC = Txertatze aurreko konplexua

15

PolyA = Poliadenilazio seinalea

PPT= Polipurina eremua

PR = Proteasa

Prm = Promotorea

PRNP = Prion proteina

RARS2 = 2-Arginil-tRNA sintetasa

RIN = RNA osotasun zenbakia

RNA = Azido erribonukleikoa

RSV = Rous Sarkoma birusa

RT = Alderantzizko Transkriptasa

RT-qPCR = Denbora-errealeko polimerasaren kate-erreakzio kuantitatiboa

SA = Moztitsasketa hartzailea

SAM = Zahartzaro aurreratuko saguak

SCC = Zelula somatikoen zenbaketa

SD = Moztitsasketa emalea

SDS = Sodio dodezil sulfatoa

SFV = Tximinoen birus apartsua

SINE = Elementu tartekatu motza

SIV = Tximinoen immunoeskasiaren birusa

SRV = Tximinoen D-motako erretrobirusa

SU = Gainazala

T = Timina

TE = Elementu Higikorra

TM = Mintz-artekoa

TMIE-201 = Belarri barruko 201-mintz-artekoa

VR = Eskualde Aldakorra

WDSV = Walleye azaleko sarkoma birusa

XRV = Erretrobirus exogenoak

YWHAZ = Tirosina 3-Monooxigenasa

16

17

LABURPENA

18

19

LABURPENA

Erretrobirusek euren genoma ostalariaren DNAren baitan txertatu behar dute erreplikatu

ahal izateko. Normalean, erretrobirusak zelula somatikoetan txertatzen dira eta beraz,

kutsatutako ostalarietatik kutsatu gabekoetara hedatzen dira erretrobirus “exogeno” modura.

Zenbaitetan, aldiz, hozi-zelulak kutsatzen dituzte eta ostalariaren genomaren parte bilakatu

erretrobirus “endogeno” (ERV) modura, ondorengoetara bertikalki transmitituko direnak eta

lege mendeliarren arabera heredatu. Eboluzioan zehar, ERV gehienek akasdun bilakatu

dituzten mutazioak pilatu dituzte eta ondorioz, ez dira gai partikula biral kutsakorrak

sortzeko. Hala ere, zenbait ERVek gene batzuetarako irakurketa marko irekiak mantendu

dituzte eta ostalariak ko-hautatuak izan dira funtzio biologiko garrantzitsuak betetzeagatik.

Ardi betarretrobirusak, ostalariaren eta patogenoaren arteko elkarrekintza ebolutibo

konplexuak modu naturalean ikertzeko eredu hobeezina dira. Kutsatutako ardietan,

Jaagsiekte ardi erretrobirus (JSRV) exogeno eta patogenikoa, ahaidetutako JSRV

endogenoekin (enJSRVekin) batera agertzen da. Orain arte, hogeita zazpi enJSRV locus

aurkitu dira ardiaren genoman eta ematen duenez, endogenizazio prozesua oraindik ere

gertatzen ari da gaur egun. PCRetan oinarritutako saiakera sentikorren eta hibridazio-

analisien bidez, enJSRVen itzulpena deskribatu izan da zenbait ardi ehunetan baina hauen

sekuentzia eta txertatze-polimorfismoak direla-eta, transkripzionalki aktiboak diren edota

isilarazita dauden kopia probiralen identifikazioa ez da erraza suertatzen ardiaren genoman.

Gainera, enJSRVen itzulpenean erregulazio epigenetikoak jokatzen duen papera ezezaguna

da.

Lan honetan, bilaketa genomiko sakon bat burutu zen ardien betarretrobirus endogeno

(enJSRV) berriak karakterizatzeko helburuz eta 63 enJSRV txertatze desberdin aurkitu ziren,

horietarik 22 intronikoak izan zirelarik. Bi hurbilketa desberdin erabilita, enJSRV kopiaren

batek Ardien Biriketako Adenokartzinoma (OPA) infekzioarekin lotura ote zuen aztertu

genuen. Env eta orf-x gene biralen adierazpena deskribatu genuen ardien organo

desberdinetan eta Scrapie gaixotasun prionikoaren ondorioz ematen den enJSRVen

erregulazio eza, RNA mailan detektatu daitekeela frogatu genuen. Azkenik, enJSRV

polimorfismo maila aztertu genuen zenbait ardi populazioetan eta honekin ahaidetutako hiru

espezieetan: mufloia, Pirinioetako sarrioa eta ahuntza.

20

RESUMEN

Los retrovirus son parásitos obligados que precisan de la integración de su ADN en el genoma

del hospedador para poder replicarse. Normalmente, los retrovirus se integran en células

somáticas y se transmiten de hospedadores infectados a hospedadores no infectados como

retrovirus “exógenos”. Sin embargo, a veces los retrovirus pueden infectar células germinales,

pasando a formar parte, en consecuencia, del material genético del hospedador como retrovirus

“endógenos” (ERVs), que se transmitirán generación tras generación siguiendo las leyes

mendelianas. Durante la evolución, la mayoría de los ERVs ha acumulado mutaciones que

han inhabilitado su capacidad de producir partículas virales infecciosas. Aun así, algunos

ERVs han mantenido marcos abiertos de lectura para uno o más genes y han sido cooptados

por el hospedador por cumplir funciones biológicas importantes.

Los betaretrovirus ovinos son un modelo único para estudiar las interacciones entre

hospedador y patógeno en el medio natural. En ovejas infectadas, el retrovirus exógeno y

patogénico ovino Jaagsiekte (JSRV) convive con betaretrovirus endógenos emparentados a éste

(enJSRVs). Por el momento, sólo han sido descritos 27 loci enJSRV en el genóma ovino y al

parecer el proceso de endogenización ha sido contínuo hasta la fecha. Mediante ensayos

sensibles basados en la PCR y análisis de hibridación, la transcripción de estos enJSRVs ha

sido confirmada en varios tejidos ovinos pero debido a su secuencia y la presencia de

polimorfismos de inserción, la identificación de copias provirales transcripacionalmente

activas o silenciadas mediante mecanismos epigenéticos resulta dificultosa. Además, se

desconoce el papel que juega la regulación epigenética en la transcripción de éstos enJSRVs.

En el presente trabajo, se ha realizado una extensa búsqueda genómica con el objetivo de

caracterizar nuevos betaretrovirus endógenos ovinos, y se han descubierto 63 inserciones

provirales diferentes, de las cuales 22 han resultado ser intrónicas. Mediante dos

aproximaciones se ha analizado si alguna de las copias de enJSRV aparecía asociada a la

presencia de Adenocarcinoma Pulmonar Ovino (OPA). Por otro lado, se describe la expresión

de los genes provirales env y orf-x en diferentes órganos ovinos y se ha comprobado que la

desregulación de enJSRVs que se da tras el desarrollo de la enfermedad priónica Scrapie (o

tembladera) puede ser detectada a nivel de RNA. Finalmente, se ha analizado el nivel de

polimorfismo de enJSRVs en varias poblaciones ovinas y en tres especies emparentadas con la

ovina: el muflón, el rebeco pirenaico y la cabra.

21

ESKER ONAK

Goroldioa bezala hedatzen dira oroitzapenak hondar artean, aparrak jandako harkaitzak dira.

Aldrebes ikasitako hitzak, propio nahasitako izenak, mapak behar dituzten oihartzunak,

usainaz ere ezagun ditudan ahotsak. Bidean utziko ez nauten mamuak, damutuko ez zaizkidan

malko ederrak, etorkizunetik ekarritako loreak, lilurak belztutako minak.

Eta oroitzapen horien artean zenbait izen gailentzen dira. Aipamen berezia nire zuzendariari,

Bego, bidai hau hasteko aukera luzatu zidalako, eta Amaia eta Koldori, batak laborategian

trebatu ninduelako eta bestea, ordenagailuetan trebatzen saiatu zelako (sentitzen dut Koldo

baina ez diot inoiz pelmada emateari utziko!). Gerora etorri zirenei ere, Aitor, Leire, Alaine,

Nekane, Orhi, Unai… zuek ere zaretelako tesi hau osatzearen arduradunak.

Laborategiko jendeari, bereziki Iratxe eta Urtzi-Pantxori, populazioen genetikako emaitzekin

laguntzeagatik eta JAR taldeari, tesi honetan ezinbestekoa den klonazio teknika beraiek

erakutsi zidatelako. Naiarari, eskerrak norbaitek mantentzen duen laborategia txukun eta

formal! Irantzu, Irati eta Ferri, beraien esperientzia nirekin konpartitzeagatik. Estatistikarekin

lagundu didazuen guztioi, ez zaretela gutxi izan! Eta Giltzero jaunari, genetikako solasaldi

luzeengatik. I will be forever grateful to the guys from the Terry Fox Lab, special thanks to

Dixie, Rita, Frances and Artem. I greatly miss your warm friendship, humour and advices, and

I also miss Vancouver’s fatty food (specially cookies!).

Noizean behin biologoa ere naizela gogorarazten didazuenoi, Iras (bueno, zuk gehiegi ez

didazu gogorarazten!), limnologoak, Ibon eta Maite, xaguxarrologoak, Lide, Ostaizka, Aitor

eta Antton, botaniko-mikologoak, Iñaki, Nerea eta Ana, abandonatu gintuzuenak, Eneko, Axi

eta Urtzi, euskalnaturako jubentudeak eta beste diziplina batekoak izanda ere nolabait tesi

honetan zuen oinazea utzi duzuenak, Miren eta Martin. Kuadrilako jendeari, tesiaz gain beste

mundu bat existitzen dela gogoratzen dudalako zuekin, Garazi, Ane, Lander, Boboli, Aitor.

Senitartekoei, a la yaya, que aunque no entiendas mucho de lo que he hecho estás siempre muy

orgullosa de lo trabajadoras que somos. Eta Maitetxu eta nola ez Txurikitori!

Beñati. Bide honetan ezinbesteko euskarria izan zara. Beti laguntzeko prest, askotan askorik

ulertu gabe. Eskerrik asko pitxin!

Aitari, ama eta Albari. Zientziaren munduan zuek barneratu ninduzuen eta Albito, zuk tesi

honetan ezinbestekoak izan diren irudien munduan.

Lagundu didazuen guztien laburpena naizelako eta delako tesi hau. Eskerrik asko.

22

23

Argitalpenen zerrenda

1. KAPITULUA

SARRERA ETA LITERATURA BERRIKUSPENA

Garcia-Etxebarria K, Sistiaga-Poveda M, Jugo BM (2014). Endogenous retroviruses in domestic

animals. Current Genomics 15: 256-265.

2. KAPITULUA

ARDI BETARRETROBIRUS ENDOGENOEN (enJSRVen) INGURUNE

GENOMIKOA ETA TXERTATZE INTRONIKOEK ERAGINDAKO

EFEKTU TRANSKRIPZIONALAK

Partzialki publikatua: Sistiaga-Poveda M, Jugo BM (2014). Evolutionary dynamics of endogenous

Jaagsiekte Sheep Retrovirus proliferation in the domestic sheep, mouflon and Pyrenean chamois. Heredity 112: 571-578.

4. KAPITULUA

ARDI BETARRETROBIRUSEN (enJSRVen) ADIERAZPEN ETA

METILAZIO ANALISIAK ARDIEN ORGANO DESBERDINETAN:

SCRAPIE GAIXOTASUN PRIONIKOAK enJSRVen ADIERAZPENA

SUSTATZEN DU BIZKAR-MUIN KRANIALEAN

Sistiaga-Poveda M, Moreno-Cugnon L, Bernales I, Beltrán-de Heredia I, Benavides J et al. (prestaketan). Expression and methylation analyses of endogenous ovine betaretroviruses

(enJSRVs) in different sheep organs: Scrapie prion infection influences enJSRV expression in

mesenteric lymph nodes.

5. KAPITULUA

ARDI BETARRETROBIRUS ENDOGENOEN (enJSRVen) UGARITZEAREN

DINAMIKA EBOLUTIBOA ARDIAN, MUFLOIAN, PIRINIOETAKO

SARRIOAN ETA AHUNTZAN

Partzialki publikatuta: Sistiaga-Poveda M, Jugo BM (2014). Evolutionary dynamics of

endogenous Jaagsiekte Sheep Retrovirus proliferation in the domestic sheep, mouflon and

Pyrenean chamois. Heredity 112: 571-578. Garcia-Etxebarria K*, Sistiaga-Poveda M*, Jugo BM (prestaketan). Revealing the endovirome of

goat. * Lehen autoreak

24

25

1. KAPITULUA

SARRERA ETA LITERATURA

BERRIKUSPENA

26

27

1. KAPITULUA

SARRERA ETA LITERATURA BERRIKUSPENA

Kapitulu honetan ostalarien (ardia, mufloia, Pirinioetako sarrioa eta ahuntza), patogenoaren (Ardi betarretrobirus endogenoak) eta Ardien Biriketako Adenokartzinomaren (OPA) inguruan egun dagoen ezaguerari buruzko informazioa bildu da, eta aipamen berezia egiten da animalien gaineko ikerkuntzaren etikaren inguruan.

1. Ostalaria: Caprinae subfamilia

Cetartiodactyla (Mammalia, Laurasiatheria) ugaztunen arteko ordena anitzenetako

bat da, 332 espezie bizi dituelarik 132 generotan zehar banaturik (IUCN, 2014).

Hala ere, talde taxonomiko honetako kideak tradizionalki bi ordenatan banaturik

egon dira: Artiodactyla eta Cetacea (Wilson & Reeder, 2005).

Artiodactyla ordenak apatxak dituzten 247 espezie biltzen ditu, 10 familietan

multzokaturik (IUCN, 2014). Bi gorputz-adar nagusi dira hauen bereizgarriak: (i)

animaliaren pisuari eusten dion oin-egitura paraxonikoa (oin bakoitzaren simetria-

ardatza hirugarren eta laugarren hatzaren artetik pasatzen da); eta (ii) “txirrika

bikoitz” modura diharduen astragaloa orkatilan (tibia eta eskafoidearen arteko

giltzadura troklea da, oposatuki kokatzen dena), atzeko hanken flexio eta luzapen

mugimenduak baimentzen dituena, baina trukean oinaren albo-errotazioa asko

mugatzen duena. Artiodaktiloek Australia eta Antartika ez ezik, gainontzeko

kontinenteak ere kolonizatu dituzte. Gainera, ganadu gehiena talde honetakoa da,

behiak, bufaloak, ardiak, ahuntzak, txerriak eta gameluak barne.

Ikerketa molekularrek artiodaktiloen parafilia frogatu dute, Cetacea eta

Hippopotamidae talde-ahizpekin duten harremana dela-eta (Montgelard et al.,

1997; Gatesy et al., 1999; Matthee et al., 2001). Filogenia berri honi oinarri

taxonomiko bat emate aldera, Montgelard eta kideek (Montgelard et al., 1997)

Artiodactyla eta Cetacea taldeko espezie guztiak ordena berdinaren baitan

barneratzea proposatu zuten, Cetartiodactyla izenekoa.

28

1.1. Taula. Bovidae familia osatzen duten subfamilien filogenia, subfamilia bakoitzeko genero arruntenak eta espezie kopurua. Harreman filogenetikoak Hernandez-Fernandez & Vrba, 2005; Ropiquet & Hassanin, 2005; eta Bibi, 2013tik ondorioztatu dira. Aurrekari fosilen arabera taldea duela ia 18.5 My sortu zen (Vrba & Schaller, 2000). Bovidae familiak (Mammalia, Ruminantia) 141 espezie bizi ditu, 47 generoetan zehar banaturik (Grubb, 1993).

Zetartiodaktilo bizi guztietan aurkitzen diren bi gorputz-adar nagusiak, “txirrika

bikoitz” modura diharduen astragaloa eta oin-egitura paraxonikoa, Eozenoko

baleetan identifikatu izan dira (Gingerich et al., 2001), moldaketa hauek

zetartiodaktiloen aitzindari komunean gertatu zirela iradokiz.

Caprinae, Bovidae familiako subfamilia bat da eta kapridoak barneratzen ditu, ardi

eta ahuntzak barne. Caprinae subfamiliako lehen fosilak Goi Miozenokoak dira,

duela 10 milioi urtekoak (Alcalá & Morales, 1997; Gentry, 2000). Hala ere, beste

bobidoetan ez bezala, Caprinae taldeko aztarna fosilak eskasak dira mendi

inguruetan bizi zirelako (Simpson, 1945). Paleontologo gehienen ustez kapridoak

Asian sortu ziren, baina autore batzuen arabera euren jatorria ez da hain argia

Pleistozenoan egon ziren glaziazio eta aldaketa klimatikoak direla eta (Ropiquet &

Hassanin, 2005). Hala ere, talde honen dibertsifikazio handiena azken

glaziazioetan zehar eman da, kide asko muturreko ingurune isolatuetara moldatu

baitziren orduan: mendialde, basamortu eta ingurune subartikoetara.

1.1. Ardia (Ovis orientalis aries)

Dirudienez ardia (Ovis aries bezala laburtua maiz) izan zen etxekotzen lehen

abereetako bat, ahuntzarekin batera (Ryder, 1983). Froga arkeologikoen arabera

lehen ardiak duela ~12.000 urte etxekotu ziren, Asiako hego mendebaldean (Zeder

et al., 2006). Hala ere, DNA mitokondrialean egindako ikerketek etxeko ardian

Subfamilia

Taldearen genero adierazgarriak

Espezie kopurua

Boselaphinae Bosephalus 2 Tragelaphinae Tragelaphus 9 Bovinae Bos, Bubalus 18 Aepycerotinae Aepyceros 1 Neotraginae Neotragus, Nesotragus 3 Hippotraginae Addax, Hippotragus, Oryx 8 Alcelaphinae Alcelaphus, 5 Caprinae Capra, Ovis, Rupicapra 35 Reduncinae Redunca 9 Cephalophinae Cephalophus 18 Antilopinae Antilope, Gazella 33

29

gutxienez bi lerro nagusi daudela iradokitzen dute (Wood et al., 1996; Hiendleder

et al., 1998; Hiendleder et al., 2002) baina lerro hauetatik batek ere ez du erlazio

adierazgarria azaltzen ardi basatien DNA mitokondrialarekin (Singh et al., 2013).

Beranduago egin diren ikerketek (Guo et al., 2005; Pedrosa et al., 2005; Tapio et

al., 2006; Meadows et al., 2007) ardiak etxekotze historia konplexua duela frogatu

dute, bi lerro amatiar nagusi eta hiru lerro sekundario azaltzen omen baititu.

Tradizionalki ardiak ingurune-baldintza gogorrak dituzten lekuetan hazi izan dira,

edo ekonomikoki interesgarriagoak ziren espezieen osagarri modura (Haenlein,

2001). Egungo abeltzaintzan ardiak paper garrantzitsua betetzen du garrantzi

ekonomiko handiko ezaugarri heredagarri ugari baititu, besteak beste, haragia,

esnea eta artilea (Gao et al., 2010). Horrez gain, gaixotasun heredagarrien animalia

eredu izan da, esate baterako asma edo distrofia muskularra (Bischof et al., 2003),

baina baita minbizia bezalako gaixotasun konplexuetarako (de las Heras, 2000) edo

gaixotasun kutsakorretarako ere: Rift Haraneko Sukarra (Weingartl et al., 2014),

Scrapie (Tabouret et al., 2010), oineko eta ahoko gaixotasuna (Jamal & Belsham,

2013), visna-maedi (Larruskain et al., 2013), orf gaixotasuna (Hosamani et al.,

2009), akainek transmititutako entzefalomielitisa (Marin et al., 1995), peste-des-

petits-ruminants (Balamurugan et al., 2014), pox (Yeruham et al., 2007), ardien

biriketako adenokartzinoma (Minguijón et al., 2013) edo mihi-urdina (Sánchez-

Cordón et al., 2013). Gainera, ardiaren tamainak, fisiologiak, izaerak eta bizialdiak

animalia eredu aproposa bilakatzen du ugaztunen funtzio biologiko ugari ikertzeko,

hala nola, biriken fisiologia, immunologia, endokrinologia, ugalketa eta enbriologia

(Maddox et al., 2001; Meeusen et al., 2009). Bestalde, berriki ardien erreferentzia-

genomaren muntaketa publikatu da (Jiang et al., 2014) eta eskuragarri dago Ardien

Genomika Partzuergo Internazionalaren (ISGC) webgunean (http://www.

sheephapmap.org). Erreferentzia honi esker gaur egun espezie honen in silico

azterketa ere bideragarria da.

Azken urteotan zehar, gaixotasun genetikoen ikerketa asko emendatu da

hausnarkari txikien artean, batik bat hiru arrazoi nagusi direla-eta: 1) gaixotasunen

kontrolean ostalariaren genetikak duen garrantziaren ulermena; 2) gaixotasunen

erresistentzian ostalariaren aldakortasun genetikoa aztertzeko tresna egokien

garapena; eta 3) gaixotasun kutsakor eta metabolikoen aurrean animaliarik

30

osasuntsu eta erresistenteenak aukeratzeko hautespen presio handia (Bishop &

Morris, 2007). Hala ere, ardien baliabide genetikoen ezagutza nahiko mugatua da

beste etxe-abere batzuenekin alderatuz gero (esate baterako, behia). Gainera,

hazkuntza bideratuak ardi-arraza desberdinak sortu ditu helburu jakinekin eta gaur

egun 1.400 arraza daude mundu osoan zehar banaturik (Kijas et al., 2009). Hori

dela-eta, arraza gehienek euren sinadura genetikoa izan ohi dute (Lawson-Handley

et al., 2007).

Lan honetan, lau ardi-arraza ikertu dira Iberiar penintsulako iparraldekoak direnak

izatez: Latxa, Rasa Aragonesa, Merino eta Assaf arrazak.

1.1.1. Latxa

Latxa ardiek Euskal Herrian dute jatorria (Ugarte et al., 1995; Alfonso et al., 2006).

Gutxi gora behera 53.000 latxa buru daude Euskal Autonomia Erkidegoan, 31.000

Nafarroan eta 45.000 Ipar Euskal Herrian (http://www.marm.es/es). Latxa

baliabide ekonomiko handiko arraza den arren, garrantzi handikoa ere bada euskal

ekologian, gizartean, kulturan eta historian (Urarte et al., 1999). Arraza hau

tamaina txiki-ertainekoa da (ikusi 1.1 irudia) eta bi barietate ditu, muturbeltza eta

muturgorria. Biek dituzte antzeko ezaugarri morfologikoak eta ezaugarri funtzional

berdinak (Alfonso et al., 2006). Arraza hau Iberiar penintsulako zaharrena da eta

historiaurreko garaietatik hazi izan da bertan. Ondorioz, oso ondo dago moldatuta

euskal klima eta geografiara, eta egokia da bertako baliabide naturalak ustiatzeko

(Ruiz et al., 2002; Gabiña & Ugarte, 2001; Marijuán et al., 2004).

Latxa arrazaren ezaugarririk garrantzitsuena esne-ekoizpena da, gehiena Idiazabal

gazta sortzeko erabilia (Ugarte & Legarra, 2003). Latxa artaldeen ia % 90ek 100

arditik behera ditu eta gutxi gora behera % 10ek 100-600 ardi. Parekatze- eta

ekoizpen-sistemak tradizionalak dira eta batik bat, sistema intentsibo-estentsiboan

oinarrituak. Neguan eta udaberrian, animaliak baserrietako larreetan mantendu ohi

dira, orduan ematen baitira kumaldi eta jezteak (Gabiña & Ugarte, 2001; Berriatua

et al., 2004; Alfonso et al., 2006).

80. hamarkadan esne-ekoizpena handitzeko programa bat hasi zen arraza honen

etekin ekonomikoa handitzeko helburuarekin, eta beranduago esnearen

konposaketa, ugatzaren morfologia eta zelula somatikoen zenbaketak (SCC)

31

bezalako ezaugarriak ere hartu ziren kontutan. Programa honen barruan, ardi

onenek erditutako arkume arrak hautatzen dira eta intseminazio artifizial (AI)

bidez ugaltzeko erabili (Gabiña et al., 1993; Ugarte et al., 1995; Ugarte & Legarra,

2003). Gaixotasunen erresistentziari dagokionez, Scrapieren aurkako kontrol

genetiko bat ere burutzen da (Hurtado et al., 2002; Alfonso et al., 2006). Azkenik,

hautespen programarik plazaratu ez den arren, zenbait gaixotasun monitorizatzen

dira, besteak beste visna-maedi eta Ardien Biriketako Adenokartzinoma, Brucella

melitensis eta Brucella ovis, mastitisa, mugako gaixotasuna eta urdail-hesteetako

parasitoak (González, 1989; Berriatua et al., 2003; Leginagoikoa et al., 2006a;

2006b).

Horrez gain, latxa ardiak ikerketa genetiko ugariren aztergai izan dira, gehienak

ekoizpena areagotzearekin lotutakoak (adibidez esnearen ekoizpena eta kalitatea),

ugalketan, morfologian eta populazio eta filogenetika analisietan oinarritzen

direnak (Alvarez et al., 2004; Rendo et al., 2004) baina baita aldagarritasun

genetiko eta erantzun immuneko geneetan ere (Jugo & Vicario 2000, 2001; Jugo et

al., 2002; Hurtado et al., 2002; Alvarez-Busto et al., 2004; Arrieta-Aguirre et al.,

2006; Alfonso et al., 2006; Larruskain et al., 2010, 2012).

1.1.2. Merino

Merino arraza ekonomikoki arrakastatsua da bere artile bikaina dela-eta. Jatorriz

Espainia erdialdekoa da eta jada Erdi Aroan zen bere artileagatik ezaguna.

Aurkikuntza arkeologikoek frogatzen dutenez (ile-mozketa tresnak eta adar espiral

handiak azaltzen dituzten aharien eskulturak), arraza honetako ardiak

historiaurretik egon dira Espainiako hegoaldean (Sánchez & Sánchez, 1986).

Erromatarrak Iberiar penintsulara iritsi zirenean populazioa artzaina zen.

Erromatarren inbasio aurreko idatzizko dokumentuak daude, kalitate bikaineko

artile iluneko ardi-arraza baten inguruan hitz egiten dutenak. Ustez hau da merino

arrazaren sortzailea (Ryder, 1983; Sánchez & Sánchez, 1986).

Autore ugariren ustetan merino arrazaren aitzindaria Ovis aries vignei izan zen,

Espainiara kostalde mediterraneoan zehar iritsi zena (Esteban & Tejón, 1980).

Denbora luzez merinoak euren itxuragatik hautatuak izan dira baina egun, arraza

honen artilea oraindik munduko onenetako eta leunenetako bat dela uste da.

32

Horrez gain, Espainian merinoaren hazkuntza esne-ekoizpenarekin loturik dago

oraindik, eta gazta erregionalak egiten dira honekin. Izan ere, hau da Iberiar

penintsulako ardirik ugariena, 150.000 buru ingururekin Espainian (http://www.

marm.es/es).

1.1. Irudia. Ikerketa honetan erabili diren Caprinae subfamiliako espezieetako batzuk. Ezkerretik eskuinera eta goitik behera: Ovis aries (Latxa, Merino, Assaf eta Rasa Aragonesa); Ovis orientalis musimon; Rupicapra pyrenaica. Ahuntzak 1.2. Irudian gehitu dira.

1.1.3. Rasa Aragonesa

Rasa Aragonesa Espainiako ipar-ekialdean hazten den arraza da, batik bat Aragoin

eta inguruan. Iberiar penintsulako bigarren arrazarik ugariena da, merinoa eta gero

(Arruga et al., 2001; Martinez-Royo et al., 2008). Arraza honek ez du adarrik,

kolorerik gabeko artilea du eta tamaina ertainekoa da, nahiz eta ezaugarri batzuk

eskualdearen arabera aldatzen diren (1.1 irudia) (www.feagas.com).

Rasa aragonesa arrazako ardiak landatarrak dira eta baldintza gogorretara nahiko

ondo moldaturik daude, muturreko habitat lehorretan bizi daitezkeelarik. Euren

erabilera nagusia arkumearen kontsumoarekin lotuta dago. Intentsiboki hazten da

33

artalde handietan, egunean zehar larreetan eta gauez ukuiluetan mantenduz

(Arruga et al., 2001; Martinez-Royo et al., 2008; Pérez et al., 2010).

Ikerketa genetikoak ardi honen ugalketarekin erlazionatutako geneetan oinarritu

dira batik bat eta 90. hamarkadatik, ezaugarri hauek hobetzeko hautespen

programak erabiltzen dira (Martinez-Royo et al., 2008). 2001. urtean publikatutako

lan batek gainera urdail-hesteko nematodoekin asoziazio-analisiak burutu zituen

(Dervishi et al., 2011). Hala ere, arraza hau bereziki gaixotasun prionikoen

azterketarekin lotuta egon da, batik bat Scrapierekin (Acín et al., 2004; Ponz et al.,

2006; Serrano et al., 2011; Dervishi et al., 2011; Toledano et al., 2012; Hedman et

al., 2012; Filali et al., 2011, 2012, 2013, 2014; Hernández et al., 2014).

1.1.4. Assaf

Assaf arraza Awassi x Ekialdeko frisiar (Milchschaf) gurutzamendutik eratorritako

arraza egonkorra da, jatorriz Israelekoa, eta 70. hamarkadan sartu zena Iberiar

penintsulan (2005. urtean arraza ofizialtzat onartua izan zen) (1.1 irudia). Ardi

hauek esne- eta haragi-ekoizpenerako erabili izan dira eta euren esne-ekoizpen

handiagatik inportatu izan dira bereziki (de la Fuente et al., 2006).

Assaf populaziorik handienak Gaztela eta Leongo eskualdean kokatzen dira,

600.000-700.000 ardirekin, eta arraza hau eskualde horretako artaldeen % 86n

aurkitzen da (de la Fuente et al., 2006). Assaf ardien kudeaketa intentsiboa da,

modu ia iraunkorrean aterperatzen diren sistema batean oinarritutakoa. Artalde

bakoitzak 200-1.000 ardi ditu eta urtean 1-2 kumaldi eta 7-8 hilabeteko jezte-aldia

(Leginagoikoa et al., 2006; Benavides et al., 2006).

90. hamarkada bukaeran hobekuntza genetiko programa bat hasi zen ardi honekin

eta helburu nagusia esne-ekoizpena handitzea eta hobetzea izan zen. Horretarako,

intseminazio artifiziala, pedigri datuen bilketa eta jezte-sistema ofizial bat garatu

ziren (Jimenez & Jurado 2005). Assaf arrazan egindako ikerketa genetiko gehienak

gaixotasun birikoen analisian oinarritu dira, bereziki visna-maedi gaixotasunean

(Leginagoikoa et al., 2006a, 2006b; Benavides et al., 2007; Leginagoikoa et al.,

2010; Polledo et al., 2012).

34

Tesi honetan landuko diren lau ardi arrazen arteko erlazio genetikoa populazio

mailan ikertu izan da (Arranz et al., 1998), baina berriki 18 mikrosatelite-

sekuentzietako genotipo indibidualak aztertu ziren (Arranz et al., 2001) eta DNA

mitokondrialean oinarrituz (Pedrosa et al., 2007), arrazen arteko eta arraza barruko

erlazioen inguruan informazio gehiago lortu zen. Dendrogrametan oinarrituz,

arraza-egituraketa sendoa ikusten da, taldekapenik sendoenak latxa arrazako

indibiduoen artean ematen direlarik (ez dago beste arrazekin taldekatzen den latxa

bakar bat ere) eta ahulenak merinoen artean. Emaitza hauek latxa arraza barruko

uniformetasunaren adierazgarriak dira, arraza honen jatorri historiko konplexua eta

prozesu ebolutiboan zehar izan duen isolamendua erakusten baitituzte (Arranz et

al., 2001; Pedrosa et al., 2007).

1.2. Mufloia (Ovis orientalis musimon)

Mufloia, Europan lehen aldiz etxekotutako ardien ondorengoa dela uste da (Groves

& Leslie, 2011). Gaur egun, mufloien subespezie desberdinak daude Kaukason,

Irakeko iparraldean eta Iran ipar-mendebaldean bizi direnak. Jatorriz, mufloiaren

banaketak Anatolia gainditzen zuen, Krimeako penintsula eta Balkanak, baina

duela 3.000 urte inguru desagertu zen handik (Santiago-Moreno et al., 2004).

Mufloiak Korsika, Sardinia, Rodas eta Zipre irletan sartuak izan ziren Neolitikoan

zehar, agian etxe-abere modura. Leku horietako geografia malkartsura moldatu

ziren eta mufloi europar modura ezagutzen den subespeziea sortu zen: O. orientalis

musimon. Beranduago Europa kontinentalean sartuak izan ziren, arrakasta handiz

(Santiago-Moreno et al., 2004).

Mufloia Espainiara 1953. urtean iritsi zen, Chambordetik (Frantzia) ekarritako bi ar

eta hiru eme korsikar eta Luxenburgoko bikote bat Sierra de Cazorlan sartzearekin

batera. Populazioa Alemaniatik ekarritako bi bikoterekin osatu zen 1956an

(Niethammer, 1963; Weller, 2001). Espezie honek habitat desberdinekiko azaltzen

zuen moldagarritasunak bere banaketa azkarra baimendu zuen. 1970-1975. urte-

tartean, gainera, birpopulaketa lanak egin ziren Alemania eta Austriatik ekarritako

indibiduoekin. Hala ere, 1975. urteaz geroztik birpopulaketa lanak El Hosquilloko

(Cuenca) eta San Pedro Navako (Jaén) aleekin egin ziren (Santiago-Moreno et al.,

2004).

35

Gaur egun Espainiako mufloi populazio gehienak Puertos de Tortosa y Beceite

(Teruel, Tarragona) eta Muela de Cortes (Valencia) erreserba naturaletan, El

Hosquillo parkean eta Serranía de Cuenca erreserba nazionalean (Cuenca) eta

Toledo, Extremadura eta Sierra Morenako eskualde menditsuetan daude.

Populazioa 15.000 indibiduo ingurukoa dela estimatu da (Santiago-Moreno et al.,

2004).

Mufloiarengan egindako lehen analisi biokimikoek odol-taldeak ikertzea zuten

helburu, ardiaren etxekotze prozesua ulertzeko asmoz (Wilson et al., 1970; Nadler

et al., 1971, 1974; Bunch et al., 1978; Bunch & Nadler, 1980; Nguyen & Bunch,

1982; Hawkey et al., 1984; Godovac-Zimmermann et al., 1987; Masala et al.,

1991). Hala ere berriki egindako analisi molekularrak espezie honen ugal-

ezaugarriak (Lincoln, 1998; Gonzalez-Bulnes et al., 2001; Landete-Castillejos et al.,

2001; Santiago-Moreno et al., 2000a, 2000b, 2001a, 2001b, 2004, 2005a, 2005b;

Dixon et al., 2006; Berlinguer et al., 2003, 2005, 2007; Toledano-Díaz et al., 2007;

Carcangiu et al., 2009; Ferrari et al., 2012) eta gaixotasun kutsakorrak ikertzera

bideraturik egon dira, hala nola, nematodiasiak (Meana et al., 1996; Lamka et al.,

1997; Pisanu & Bain, 1999), ardien biriketako adenokartzinoma (Sanna et al.,

2001), ardien oin usteltzea (Volmer & Hecht, 2006; Belloy et al., 2007),

dikroelosiak (Skálová et al., 2007) edo mihi-urdina (Rodríguez-Sánchez et al.,

2010).

1.3. Pirinioetako sarrioa (Rupicapra pyrenaica)

Sarrioa Pirinioetan, Mendikate Kantabriarrean eta Apeninoetan bizi den kapridoa

da (García-González & Herrero, 2002, 2007). Rupicapra generoko bi espezieetako

bat da hau, bestea Rupicapra rupicapra izanik. Neurriz 80 cm inguru luze da eta ilaje

gorri-arrea du udan. Neguan, aldiz, beltza edo marroia da, marra ilunagoekin

begien inguruan. Ar zein emeek adar beltzak dituzte, 20 cm ingurukoak (1.1

irudia). Animalia bizkorra eta trebea da eta eskualde menditsuetan bizi ohi da,

3.000 metroko altueraraino (Cabrera, 1914).

Lehen Rupicapra fosilak Pirinio frantsesean topatu ziren, Caune d' Arago

kobazuloan, eta Erdi Pleistozenokoak direla uste da. Azken ikerketen arabera

sarrioa edo honen aitzindari zuzena Europara Erdi Pleistozenoan edo

36

Pleistozenoan iritsi zen (duela 800.000 urte), ekialdeko Europatik migratuz

denboraldi hotz batean zehar, fosilak klima hotzeko faunarekin batera agertu

baitira (Lovari, 1987).

Iberiar penintsulan Riss-Würm glaziazioarteko denboralditik egon da sarrioa, duela

127.000-115.000 urtetik hona (Altuna, 1992). Euskal Herrian Holozenora arte egon

zela uste da, duela 10.000 urte arte (Baldeón, 1993), bereziki Pleistozenoko arorik

hotzenetan eskualde baxuak betez. Azken 10.000 urteetan zehar eta ziur asko

aldaketa klimatikoen ondorioz eta mendietara moldaturik dagoela ikusita

(Couturier, 1958), sarrioa mendietako eskualderik malkartsuenetara mugatu da eta

bertan aurki daiteke egun. Beste sarrio espezie batzuk bezala ia desagertu arte

ehizatu izan da Pirinioetako sarrioa ere, bereziki 1940ko hamarkadan, bere larrua

erabiltzeko helburuz. Ordutik populazioa berreskuratu da eta 2002. urtean 25.000

indibiduokoa zela estimatu zen (Pérez et al., 2002).

Azken ikerketa molekularren arabera hiru Rupicapra pyrenaica subespezie daude:

Pirinioetako sarrioa (R. p. pyrenaica), sarrio kantauriarra (R. p. parva) eta Aruzzo

sarrioa (R. p. ornata) (Lovari, 1987). Analisi molekularren bidez, sarrio populazioen

arteko dibergentzia aztertzeko, aldagarritasun genetikoa neurtu da: alozima locusak

(Nascetti et al., 1985; Randi et al., 1991; Schaschl et al., 2003), minisateliteak

(Perez et al., 1996), DNA mitokondrialeko RFLPak (Hammer et al., 1995;

Schaschl et al., 2003; Fajardo et al., 2007) eta histobateragarritasun konplexu

nagusia (Schaschl et al., 2004; Schaschl et al., 2005; Alvarez-Busto et al., 2007;

Mona et al., 2008; Schaschl et al., 2012; Cavallero et al., 2012).

Hala ere, epidemiek sarrioaren populazio dinamikak baldintzatu dituzte. Esate

baterako, Alpe ekialdeko sarrioa (R. p. parva), Sarcoptes scabiei var. rupicaprae

sortutako sarna sarkotikoarekin kutsatuta dago (Rossi et al., 1995, 2007;

Fernández-Moran et al., 1997; Pence and Ueckermann, 2002). Aldiz, Pirinioetako

sarrioan ez da patogeno hau aurkitu (Arnal et al., 2004), baina bai beste mota

bateko patogenoak. Bestalde, Espainia ipar ekialdeko Pirinioetako sarrioan

egindako ikerketen arabera, populazio hauek border edo mugako gaixotasuna

sortzen duen birusak (BDV) kutsatuta daude eta birus honek ekialdeko populazio

gehienengan eragina du 2001. urtetik, endemikotzat jotzen delarik bertan.

37

Ekialdeko sarrioen populazioak % 40-85en murriztu dira infekzioen ondorioz

(Hurtado et al., 2004; Marco et al., 2007, 2008, 2009; Pioz et al., 2007).

Populazioaren murrizte izugarri honek aldakortasun genetikoaren galera

ikaragarria ekarri du. Hau bereziki larria da sarrioa bezalako espezie menditarretan,

betetzen dituzten habitat isolatu, zatikatu eta hauskorretan kolonizazio-tasak eta

populazioen arteko fluxu genetikoa txikiak baitira (Brown, 2001).

1.4. Ahuntza (Capra aegagrus hircus)

Ahuntza (gehienetan Capra hircus modura laburtuta) etxekotzen lehen animalietako

bat izan zen eta froga arkeologikoen arabera duela 10.000 urte inguru etxekotu zela

uste da (Zeder & Hesse, 2000). Berriki Naderi eta kideek egindako ikerkuntza

molekular batean iradokitzen denez, C. aegagrus izan zen etxeko ahuntzaren

arbasoa eta lehen etxekotzeak Asia mendebaldean eman ziren (Naderi et al., 2008).

Gerora, ahuntzak mundu osora hedatu ziren eta paper garrantzitsua bete zuten

Neolitikoko nekazaritza-iraultzan eta giza zibilizazioen garapenean. Gaur egun,

ahuntzak kontinente guztietan zehar zabalduta daude, Antartikan eta zenbait irla

isolatuetan izan ezik. 840 milioi ahuntza inguru daude, oihan tropikal hezeetan,

eskualde lehorretan, basamortu beroetan eta altitude handiko eskualde hotz eta

hipoxikoetan zehar banaturik (FAOSTAT, 2014). Gainera, haragi-, esne- eta larru-

iturri garrantzitsuak bilakatu dira leku hauetako askotan.

Azken hamarkadan zehar, ikerketa filogeografiko molekular ugari burutu dira

ahuntzen jatorria eta etxekotze prozesuan zehar emandako garraio-ibilbideak

argitzeko asmoz (Luikart et al., 2001; Mannen et al., 2001; Sultana et al., 2003;

Joshi et al., 2004; Chen et al., 2005; Naderi et al., 2007, 2008; Amills et al., 2009;

Nomura et al., 2013), gehienak D-begizta sekuentzia mitokondrialetan

oinarritutakoak. Ikerketa hauek argitu dutenez, sei haplotalde nagusi daude

ahuntzen lerro mitokondrialetan, A, B, C, D, F eta G deitutakoak. Naderi et al.-en

arabera, A haplotaldea zabalduen dagoena da eta ahuntzen %90ek heredatu du

talde hau, Mundu Zahar osoan zehar agertzen da, lehen etxekotzea talde honetako

ahuntza batekin egin zela iradokiz (Naderi et al., 2007). Gainera, Mundu Berriko

(Hego Amerika eta Erdialdeko Amerika) ahuntza guztiek ere A haplotaldea dute

38

(Amills et al., 2009). Aldiz, bestelako haplotaldeek eskualdekako banaketa azaltzen

dute (Naderi et al., 2007).

1984. urtean, Barbancho eta kideek zenbait polimorfismoren maiztasun alelikoak

argitaratu zituzten lau ahuntz arrazetarako: granadarra, murtziarra, malagarra eta

menditar andaluza (Barbancho et al., 1984). Horrez gain, Tuñón eta kideek (1989)

zazpi markatzaile dialeliko aztertu zituzten 14 ahuntz arrazatan eta ondo

bereizitako bi talde deskribatu zituzten. Lehen taldean beltz menditarra, zamorarra,

guadarrama, retinta, zuri andaluza, bierzarra eta ahuntz piriniarra taldekatzen

ziren. Aldiz, bigarren taldean kanariarra (orain majorera bezala ezaguna),

murtziarra, zuri zeltiberiarra, verata, palmarra, malagarra eta granadarra azaldu

ziren. Berriki, Amills eta kideek (2004) sei ahuntz arrazen (palmarra, majorera,

tenerifetarra, murtziar-granadarra, malagarra eta guadarrama) HVR1 eskualde

mitokondriala aztertu zuten, 34 indibiduotan. Erlazio fiologeografiko sendoa

behatu zuten lehen hiru arrazen artean, dirudienez Kanariar Uharteetako isolatze

luzearen ondorioz. Azkenik, Azor eta kideek (2005) sei ahuntz arrazen egitura

genetikoaren inguruko datuak bildu zituzten: ahuntz piriniarra, moncayotarra,

azpigorria, zuri zeltiberiarra, zuri andaluza eta menditar beltza.

Lan honetan zazpi ahuntz arraza desberdin aztertu dira, batik bat Iberiar

Penintsulakoak direnak jatorriz: ahuntz alpetarra, azpigorria, malagarra, murtziar-

granadarra, palmarra, payoya, ahuntz pigmeoa eta arbi ahuntza (1.2. irudia).

Gainera, 2013. urtean ahuntzaren erreferentzia genoma publikatu egin zen (Dong

et al., 2013) eta tesi honetan ahuntzaren in silico analisiak ere egin ahal izan dira.

1.4.1. Ahuntz alpetarra

Ahuntz alpetarrak Suitzako Alpeetan du jatorria baina Frantziako Alpeetara asko

hedatu zen eta bertako ahuntzekin gurutzatu, “alpetar frantsesa” izena hartuz.

Espainian lehen artaldea 70. hamarkadaren bukaeran agertu zen, Villarcayon

(Burgos) baina gerora, Nafarroan zenbait artalde sartu ziren. 80. hamarkadan zehar

arraza hau Gaztela eta Leongo iparraldean zehar hedatu zen, baita Asturiasko

eskualdeko mendialdean zehar ere. Ahuntz alpetarraren ezaugarri garrantzitsuena

esne-ekoizpena da (MARM, 2014).

39

1.4.2. Azpigorria

Ahuntz honek Pirinioetan du jatorria eta batik bat haragiaren ekoizpenerako

erabiltzen da. Gaur egun Euskal Herrira dago mugatuta eta desagertze arriskuan

dagoen arraza bat da, mundu osoan 1.470 buru baino ez baitira gelditzen. Bere

izenak dioen moduan, ahuntza honek azpialdea gorrixka du, bai sabelaldea eta

baita hankak ere (MARM, 2014).

1.4.3. Malagarra

Ahuntz malagarraren jatorria Malagako Axarquia eskualdean kokatzen da, honek

ematen dio hain zuzen ere izena arrazari. Ahuntz malagarra Espainiako berezko

arrazatzat jotzen da eta zenbait autoreren arabera, bi ahuntz arbasoren arteko

gurutzamendua da: Pirinioetako ahuntzak eta ahuntz maltarraren antzeko Afrikako

ahuntzak (Aparicio-Sánchez, 1960). Hala ere, beste autore batzuek uste dute Prisca

enborrak ere ahuntz honen jatorrian parte hartu zuela (Sarazá-Ortiz, 1956). Ahuntz

hauek esne- eta haragi-ekoizpenerako hazten dira. Gutxi gora behera 38.000 ahuntz

malagar daude, bereziki Andaluziako eskualdean zehar kokaturik (MARM, 2014).

1.4.4. Murtziar-granadarra

Ahuntz hau enbor piriniarretik aurrera sortu zen eta Andaluzia, Murtzia eta

Levantera zabaldu. Ahuntz murtziar-granadarrak Jatorrizko Izendapen Babestua

du (JIB) eta batik bat Murtzian erabiltzen da, ardo-gazta, gazta ondua eta gazta

freskoa egiteko. Arraza honetako 95.000 baino ahuntz gehiago daude (MARM,

2014).

1.4.5. Palmarra

Ahuntz palmarrak La Palmako uhartean du jatorria (Kanariar Uharteak). Uharte

hau Ameriketara joaten ziren belaontzientzako bidegurutzea zenez, ahuntz

palmarra Iberiar Penintsulako hego-mendebaldeko bestelako arrazekin asko

gurutzatu da. Arraza palmarra batik bat esne-ekoizpenerako erabiltzen da eta

populazioa 9.000 buru ingurukoa dela uste da (MARM, 2014).

40

1.4.5. Payoya

Payoya ahuntz arraza Villaluenga del Rosario izeneko herri batekoa da jatorriz,

Cadizen, eta hortik datorkio, hain zuzen izena, bertako biztanleei payoyo deitzen

baitzaie. Arraza hau enbor Piriniarraren eta eskualdeko berezko ahuntzen arteko

gurutzamendua dela uste da. Payoyaren ezaugarririk garrantzitsuena esne-

ekoizpena da eta gutxi gora behera 6.800 payoya buru daudela uste da, batik bat

Andaluzian zehar banaturik (MARM, 2014).

1.4.6. Ahuntz pigmeoa

Ahuntz nano hau Afrika mendebaldeko Cameroon Haranean sortu zen eta Europa

eta Estatu Batuetako zoologikoetara zabaldu 50. hamarkadan, baita ikerkuntzarako

animalia modura erabiltzeko ere. Hala ere, izaera zintzoa eta tamaina txikia zuela-

eta, segituan egin zen etxe-abere modura ezagun. Gehienetan maskota modura

hazten bada ere, zenbaitek esne-ekoizpenerako ere erabiltzen dute. Ahuntz

pigmeoa arraza txikia da eta baldintza ugarietara molda daiteke (NPGA, 2014).

1.2. Irudia. Ikerketa honetan erabilitako ahuntz arrazak. Ezkerretik eskuinera eta goitik behera: ahuntz alpetarra, azpigorria, malagarra, murtziar-granadarra, palmarra, payoya, ahuntz pigmeoa eta arbi ahuntza.

1.4.7. Arbi ahuntza

Arbi ahuntza Tunisiako arraza autoktonoa da eta izenak bertakoa esan nahi du

arabieraz, inportatutako ahuntza arrazengandik bereizteko. Afrika iparralde osoan

zehar bizi den ahuntz-populazioa ahuntz arraza honi dagokio. Ile luzeko eta

tamaina ertaineko ahuntza da, sistema misto estentsiboetan hazten dena ardi eta

41

behiekin batera, edo oasi erdiintentsiboetan. Arraza honetatik batik bat haragia

ekoizten da baina esne-ekoizpenerako ahalmen genetikoa ere badu (Gaddour et al.,

2008; Vacca et al. 2009). Gaur egun, Tunisian bertako ahuntzen biodibertsitatearen

kontserbaziorako proiektu nazionalak garatzen ari dira marruskari txikien

sektorean (FAOSTAT, 2014). Hala ere, arbi ahuntzaren populazioa %23 handitu

da azken hamarkadan zehar (2004-2014), gaur egun 1,5 milioi Arbi ahuntz baino

gehiago daudelarik (DGPA, 2014).

2. Erretrobirusak

Erretrobirusak kate bakarreko RNA birusak dira, nukleoaren baitan mRNA

motako azido nukleikoak gordetzen dituztenak (5’ estalkia eta 3’-PolyA isatsa

barne). Ondorioz, erreplikatzeko zelula ostalariak erabiltzen dituzte eta

derrigorrezko parasitoak dira. Birus hauen erreplikatzeko sistema alderantzizko

transkripzioan oinarritzen da: behin zelularen baitan barneratu denean, birusak

alderantzizko transkriptasa entzima erabiltzen du bere RNA genomatik DNA

sortzeko, prozesu normala alderantzikatuz (hortik datorkio, hain zuzen, izena).

DNA berri hau orduan zelula-ostalariaren genomaren baitan txertatzen da

integrasa izeneko entzimaren bitartez. Puntu honetan dagoen DNA erretrobiralari

probirus deritzo. Puntu honetatik aurrera, zelula-ostalariak DNA birala bere

genomaren parte balitz bezala jokatuko du, jatorri biraleko geneak itzuliz eta

transkribatuz, eta birus kopia berriak berriro biltzeko beharrezkoak izango diren

proteinak sintetizatuz.

Erretrobirusaren txertatzeak garrantzi handiko ondorioak ditu eboluzioan, DNA

erretrobiralaren eta genomikoaren elkarrekintza modu konplexuan baimentzen

delako (Coffin et al., 1997). Gehienetan erretrobirusek zelula somatikoak

infektatzen dituzte eta, beraz, DNA genomikoan txertatutako gene erretrobiralak ez

dira ondorengoetara hedatuko. Hala ere, zenbaitetan erretrobirusek hozi-zelulak

infekta ditzakete eta ondorioz, hozi-lerroa (Vogt, 1997). Infektatutako hozi-

zeluletatik sortzen diren ondorengoek probirusa euren genoman txertatuta izango

dute eta beraz, erretrobirus hauek bertikalki transmitituko dira ostalarien belaunaldi

batetik hurrengora. Modu honetan hozi-lerroan txertatzen diren erretrobirusei

42

erretrobirus endogeno deritze (ERV), horizontalki transmititzen diren erretrobirus

exogenoengandik bereizteko (Vogt, 1997).

2.1. Erretrobirus endogenoak

Eboluzioan zehar, erretrobirus exogenoak hozi-lerroko zeluletan txertatuak izan

dira eta ostalariaren geneekin batera erreplikatu, erretrobirus endogeno bilakatuz

eta lege mendeliarren arabera heredatuz (Boeke et al., 1997). Milioika urteetan

zehar eman den txertatze erretrobiralen pilaketa jarraituak (endogenizazio izenez

ere ezaguna), ornodun guztien genomak ERV infekzio ugariren eramaileak izatea

eragin du (1.2. taula). Erretrobirus endogeno gehienek akats genetikoak metatu

dituzte, mutazioak edota delezioak kasu, eta egitura aldaketa hauen ondorioz

proteina kutsakorrak adierazteko gaitasuna galdu dute askok. Aldaketa genetiko

hauen eraginez, erretrobirus endogeno gehienak ez dira ez kutsakorrak eta ezta

patogenikoak ere (Gifford & Tristem, 2003; Boeke & Stoye, 1997). Hala ere,

zenbait erretrobirus endogenok transkribatzeko ahalmena mantendu dute, nolabait

ere ostalariarentzako onuragarriak suertatu direla iradokiz (Stoye, 2001).

1.2. taula . ERVen presentzia ornodun espezie desberdinetan.

Espeziea Genomaren % Erreferentziak

Danio rerio %0,8 Barrio et al., 2011 Xenopus laevis >% 0,1 Kambol et al., 2003 Gallus gallus %2 Huda et al., 2008 Monodelphis domestica ∼%10 Gentles et al., 2007 Myotis lucifugus %4,9 Zhuo et al., 2013 Mus musculus %10 Stocking & Kozak, 2008 Canis lupus familiaris %4,8 Tarlinton et al., 2012 Felis catus %4,44 García-Etxebarria et al., 2014 Sus scrofa %4,48 García-Etxebarria et al., 2014 Equus caballus %6,19 García-Etxebarria et al., 2014 Capra aegagrus hircus %4,66 García-Etxebarria et al., 2014 Bos taurus %3,20 García-Etxebarria & Jugo, 2010 Homo sapiens ~%8 Lander et al., 2001

Elementu genomikoen artean, ERVak elementu higikortzat (TE) jotzen dira. Bi TE

talde nagusi daude: transposonak eta erretroelementuak, era berean beste bi talde

handitan banatzen direnak: LTR-rik gabeko elementuak (Long Terminal Repeat

izeneko sekuentzia bat duten elementuak) eta LTR elementuak (1.3. irudia). LTR-

rik gabeko elementuetatik bi oso zabalduta daude ugaztunen hozi-lerroan: SINEak

(short interspersed elements) eta LINEak (long-terminal interspersed elements)

43

(Lower et al., 1996). SINE-ek ez dute proteinak kodetzeko ahalmenik eta LINE-en

menpe daude anplifikatu ahal izateko. Aldiz, LTR klaseko elementuen baitan

erretrotransposonak, erretrobirus endogenoak eta HERV jatorriko elementu

errepikakorrak biltzen dira (1.3. irudia) (Bannert & Kurt, 2004).

1.3. Irudia. Elementu higikorren sailkapena eta ezaugarriak. Elementu bakoitzaren portzentajea genoman eta talde nagusietako elementuen kopuruak daude zehaztuta. Kolore berdinek errepikatutako sekuentziak adierazten dituzte, txertatze prozesuan zehar sortutakoak. Elementu bakoitzaren luzera adierazita dago. Promotorea (Prm), Poliadenilazio seinalea (PolyA), LTRa (Long Terminal Repeat) (Bannert & Kurt, 2004tik moldatua).

2.2. ERVen genomaren egituraketa

ERVek eta erretrobirus exogenoek (XRV) antzeko ezaugarriak dituzte. Gutxienez

hiru gene dituzte: gag genea, birusaren nukleoko egitura-proteinak kodetzen

dituena; pol genea, entzima biralak kodetzen dituena (alderantzizko transkriptasa

barne); eta env genea, birusaren estalkiaren gainazaleko glikoproteinak kodetzen

dituena. Alderantzizko transkripzioan zehar ematen den proteina birikoen

adierazpena, elementu promotore eta areagotzaileek, poliadenilazio seinaleek eta

LTRek kontrolaturik dago. Horrez gain, bestelako elementu erregulatzaileak daude

birusaren genoman, esate baterako moztitsasketa emaile (SD) eta onarleak (SA)

(enven adierazpenerako). Birus prototipikoek, erretrobirus sinple deiturikoek,

informazio genetiko horren kopuru txiki bat baino ez dute garraiatzen. Aldiz,

lentibirusak bezalako erretrobirus konplexuek (esate baterako Giza

Elementu higikorrak

(~%45)

Transposonak (%2,8)

Erretroelementuak (%42,2)

LTRrik gabeak (%33,9)

LTR (%8,3)

Erretrobirus endogenoak

Erretrotransposonak

SINEak Alu %10,6 MIR %2,5 80-630 bp 80-630 bp

LINEak L1 %16,9 L2 %3,2

OrfA

Prm PolyA LTR PolyA

Prm OrfB (pol) PolyA

6-8 kb

Prozesatutako pseudogeneak <%1

LTR OrfA (gag) OrfB (pol) LTR

4-8 kb

LTR gag pro pol LTR env

7-12 kb

44

Immunoeskasiaren Birusek edo GIBek) gene gehigarri erregulatzaile hauek dituzte

(Pfeifer & Verma, 2001).

Gene hauek eta LTRak alde batera utzita, erretrobirusek bestelako egitura

ezaugarriak partekatzen dituzte: hasleen lotura gunea (PBS) eta polipurina traktua

(PPT). Erretrotranskripzioa PBS eskualdean hasten da, DNA (-) katearen

transkripzioarekin batera, tRNAren 3’-muturrarekiko homologoa baita eskualde

hori. Azkenik PPT, DNA (+) katearen sintesirako hasle moduan diharduen

sekuentzia motza da (Champoux, 1993) (1.4. eta 1.6. irudiak).

2.2.1. Gag

Gag geneak birusaren egitura-proteina kodetzen du (Gag proteina, “group-specific

antigen” izenetik, proteina honen propietate antigenikoei erreferentzia eginez). Gag

proteolitikoki prozesatua denean MA (matrize), CA (kapsula) eta NC (nukleo-

kapsula) proteina helduak ematen ditu, eta zenbaitetan baita funtzio ezezaguneko

bestelako proteinak ere, zenbaki bidez izendatzen direnak (Vogt, 1997).

U3 R U5 MA CA NC PR RT IN SU TM U3 R U5

PBS PPT

1.4. Irudia. Genoma erretrobiralaren egitura. DNA probirus arrunt bat erakusten da. Lau eskualde kodetzaile nagusi daude: gag, pro, pol eta env, kokapen berdina dutelarik erreplikatzeko gai diren erretrobirus guztietan. Erretrobirusak konplexuak direla esaten da genoman gene gehigarriak badituzte. Genoma erretrobiralaren alde bietara LTR sekuentzia errepikakorrak kokatzen dira, alderantzizko transkripzio bidez sortzen direnak. Era berean, LTRek hiru eskualde dituzte (U3, R eta U5 deitutakoak) RNA extrazelularreko mutur ez-kodetzaileetatik eratorriak direnak (Gifford & Tristem, 2003tik moldatuta).

2.2.2. Pol/Pro

Polek alderantzizko transkriptasa (RT) kodetzen du, DNA polimerasa eta

asoziatutako RNAsa-H aktibitatea duena, baita integrasa (IN) ere, genomaren

erreplikazioan bitartekari lanak egiten dituena. Prok proteasa birala kodetzen du

(PR), gag, pro, eta pol geneek (batzuetan envek) kodetutako proteinak proteolitikoki

prozesatzen dituena, partikula biralen bilketaren azkeneko urratsetan zehar (Vogt,

1997).

LTR pro pol LTR gag env

45

2.2.3. Env

Env geneak kodetzen ditu birionaren gainazaleko glikoproteina (SU) eta mintz-

arteko proteina (TM). Bi proteina hauek konplexu berean batzen dira, zelula-

hartzaileekin modu espezifikoan lotuz. Elkarrekintza honen eraginez, mintz

biralaren eta zelula-mintzaren arteko fusioa ematen da (Vogt, 1997).

2.2.4. Bestelako geneak

Zenbait talde erretrobiralek bestelako geneak azaltzen dituzte. Esate baterako dut

izeneko geneak deoxidiurina trifosfatasa (dUTPase edo DU) proteina kodetzen du.

Beste geneak ez bezala, dut kokapen desberdinean ager daiteke, β- eta δ-motako

birusetan pro geneko irakurketa markotik itzultzen delarik eta lentibirus gehienetan

(primateenetan ez) pol geneko markotik (Vogt, 1997).

Konplexu modura sailkatuta dauden zenbait erretrobirusek ere (lentibirus

generoak, espumabirus generoak, HTLV/behiaren leuzemia birus (BLV) generoak

eta berriki deskribatutako arrain-birus genero batek) gene gehigarriak dituzte, dut

geneaz gain. Gene gehigarriek birusaren geneen adierazpena erregulatu eta

koordinatzen dute eta zenbaitetan bestelako funtzio sekundarioak dituzte. Gene

hauek pol eta env artean kokaturik daude, envetik ur-behera hain zuzen, LTRko U3

eskualdea barneratuz edo enven eskualdeari gainjarriz (Vogt, 1997).

Beste adibide bat, orf-x deituriko irakurketa-marko ireki gehigarri bat da, pol geneari

guztiz gainjartzen zaiona eta Ardien Jaagsiekte Erretrobirusean (JSRV) eta tumore-

birus Enzootiko Nasalean (ENTV) agertzen dena (1.5. Irudia). JSRV exogeno eta

endogenoen gene guztietatik, orf-x hoberen kontserbatzen dena da (Rosati et al.,

2000). Hala ere, gene honen funtzioa ezezaguna da (York et al., 1992). JSRV

biruserako 179 aminoazidoko proteina bat deskribatu da tumore-zelula eta

transfektatutako zelula-kultiboetan, orf-x genearen itzulpenaren produktua izan

litekeena, baina oraingoz ez da topatu orf-x genearen adierazpenaren zantzurik

(Palmarini et al., 2002).

Zenbait erretrobirusek beste mota bateko geneak dituzte: onkogeneak edo onc

geneak. Erretrobirus asko (birus transformatzaile modura izendatuak izan direnak

gerora) animalietan modu azkar batean tumoreak sortzeko zuten ahalmenagatik

46

egin ziren ezagun eta behatu zen kultiboetako zelulak onkogenikoki

transformatzeko gai zirela. RSV leinu batzuk izan ezik, onkogeneak dituzten

birusak akasdunak dira eta delezioak jasan dituzte erreplikaziorako beharrezkoak

diren geneetan. Ondorioz, onkogene erretrobiral asko gag-onc fusio-proteina

modura adierazten dira, gag genearen zati handi bat ezabatua izaten delarik. Beste

zenbaitetan, aldiz, orf-xek env ordezkatzen du edo genomaren beste leku batean

kokatzen da.

Berrantolaketa hauek pairatzen dituzten erretrobirusak ere akasdunak dira eta soilik

beste birus akatsgabe batek (birus laguntzaile izenekoak) infektatzen dituenean

izango dira adierazteko gai. RSV birusaren leinu ez-akasdunetan, v-scr onkogenea

envetik ur-behera independentea da eta modu desberdinean moztitsatsitako mRNA

batetik aurrera adierazten da (Vogt, 1997).

1.5. Irudia. Betarretrobirus generoaren dibertsitatea azaltzeko proposatutako urratsen segida. Proposatutako urrats ebolutibo hauek zortzi azpi-talde sortu zituzten betarretrobirusen barruan, Gag,

Pol eta Env proteina sekuentzien analisi filogenetikoek, eta betarretrobirusen berezko ezaugarriek iradokitzen dutenez. Hayward et al., 2013tik moldatua.

2.2.5. LTRak

DNA biraleko geneen alde bietara bukaerako errepikapen luzeak daude (LTRak),

hiru elementu barneratzen dituzten sekuentzia berdinak. U3 eskualdea RNAko 3’-

muturreko sekuentziatik eratorria da; R eskualdea RNAren mutur bietan

errepikatzen den sekuentziatik; eta U5 RNAren 5’-muturretik. LTR elementuen

sintesiak alderantzizko transkripzio prozesuan du jatorria, entzima honek harizpi

Betarretrobirusen aitzindaria

NP9

Rec

B Mota B eta D moten dibergentzia

D mota

LTR luzeak Lys 3 aldaketa

γ- Gainazala

5’ORF Naf Rem Sag

3’ORF Rej

ORF-X 3’ORF 5’ORF ORF

gag pro

ORF pro

3’ORF

HERV-K, 1 mota

HERV-K, 2 mota MIERV-βC MIERV-βD

MIERV-βE MMTV PvERV-βB

Eq-ERV JSRV

ENTV PvERV-βD

PvERV-βE PvERV-βG

PvERV-βC PvERV-βF PvERV-βH PvERV-βI

MIERV-βF TvERV

ORF env

ORF pol

ORF gag pro

MPMV PvERV-βJ PvERV-βK PvERV-βA

I II

PvERV-βA, MIERV-βA, MIERV-βB II

III

IV

V

VI

VII

VIII

47

baten muturretik bestera “salto” egiten baitu. Hiru elementuon tamaina aldakorra

da erretrobirus desberdinen artean: U3-k ehunka nukleotido gutxi batzuetatik

milaka batzuetara izan ditzake; R-k dozena batetik ehunka gutxi batzuetara; eta

U5-ek 100-200 nukleotido. Definizioz, transkripzioaren hasiera gunea U3 eta R-ren

arteko mugan kokatzen da eta poly(A) gehitzeko gunea R eta U5en arteko mugan.

U3 eta U5en beste mugak DNA (+) eta (-) harizpien sintesirako hasiera guneak

zehaztuta daude. U3-k probirusaren elementu transkripzional gehienak barneratzen

ditu, promotorea eta sekuentzia areagotzaile asko barne. Birusa erreplikatuko den

ehunaren espezifizitatearen arduradun nagusia da areagotzailea eta ondorioz, baita

patogenesiarena ere. U3-n ematen den aldaketarik txikienak ere birus patogeniko

bat ez-patogeniko bihur dezake, edo alderantziz (Vogt, 1997).

moztitsatsitako mRNA batetik aurrera adierazten da (Vogt, 1997).

1.6. Irudia. Erretrobirus sinple baten genomaren egitura. Gene bakoitzak kodetutako proteinak, erretrobirus birion bat eta osagarri biralak adierazita daude (Leroux & Mornex, 2008tik moldatuta).

2.3. ERVen sailkapena eta banaketa

Sailkapen berriari jarraituz, Birusen Taxonomiarako Komite Internazionalak

(ICTV) zazpi erretrobirus genero bereizten ditu erretrobirus familiaren baitan:

Alpharretrobirusak, Betarretrobirusak, Deltarretrobirusak, Gammarretrobirusak,

Epsilonerretrobirusak, Espumabirusak eta Lentibirusak (van Regenmortel, 2000).

Sailkapen honen aurretik bestelako ezaugarriak erabiltzen ziren taxonomiarako,

hala nola, gene gehigarrien presentzia, ostalariak, eta nukleo biralaren morfologia

(Coffin, 1992). Hala ere, sailkapen modu hauek genoman oinarritzen diren

konparaketa filogenetikoengatik ordezkatuak izan dira. Nahiz eta erretrobirus

batzuk eboluzio-tasa azkarrekin erlazionatzen diren (Williams et al., 1992),

Nucleocapsid (NC)

Nukleokapsula (NC)

ez-patogeniko bihur dezake, edo alderantziz (Vogt, 1997).

Matrizea (MA)

RNA genomikoa

Bigeruza lipidikoa

Integrasa (IN)

Mintz-artekoa (TM)

Gainazala (SU)

Glik

opro

tein

a

Gene erregulatzaileak: vif, tat, rev

Gainazala SU gp105-135 Mintz-artekoa TM gp45-50

env

Proteasa PR p12-16 Alderantzizko trans. RT p66-70 dUTPasa - ? Integrasa IN p32-46

pol

Kapsula CA p24-27 Matrizea MA p16 Nukleokapsula NC p14

gag

Egitura-proteina biralak Geneak

Alderantzizko transkriptasa (RT)

48

polimerasa erretrobiralaren (RT) geneak ez du aldaketa ez-sinonimorik onartzen eta

ondorioz, oso ondo kontserbatuta dago zazpi erretrobirus generoen artean. Hori

dela-eta, RT sekuentzia erretrobirikoak lerrokatuta konfiantza handiko erlazio

filogenetikoak inferitu daitezke (Doolittle et al., 1989). Bestelako sekuentzia

erretrobirikoetan (RNasa H, IN) oinarritzen diren zuhaitz-filogenetikoak

gehienetan bat datoz RTan oinarritutakoekin (McClure et al., 1988), baina badira

zenbait salbuespen ere (Bénit et al, 2001). Batzuetan, gainera, erretrobirus

exogenoen RT geneak eta erretrobirus zaharren RT pseudogeneak ere lerroka

daitezke, erretrobirus berri eta zaharren arteko erlazioak ikertzeko.

1.3. Taula. Retroviridae familiaren sailkapena eta hauek sortzen dituzten gaixotasunak (genero bakoitzerako soilik birus espezie nagusiak adierazten dira). Weiss et al., 2001; eta MacLachlan & Dubovi, 2011tik moldatuta.

Generoa Genomaren

egitura Birus espezie nagusiak Ostalaria Gaixotasuna

Alpharretrobirus

Sinplea

ALV Txorien leukosi birusa

Txoriak

Gaixotasun ugari,

leukosia, sarkoma

eta anemia barne

RSV Rous sarkoma birusa

AMV Txorien mielolastosi birusa

Betarretrobirus

Sinplea

MMTV Saguen ugatzetako tumore birusa Saguak,

ardiak,

ahuntzak eta

tximinoak

Ugatzetako eta

biriketako

adenokartzinomak,

sistema immuneko

disfuntzioak

JSRV Jaagsiekte ardi erretrobirusa

SRV D-motako tximinoen erretrobirusa

MPMV Mason-Pfizer tximinoen birusa

ENTV Tumore birus enzootiko nasala

Gammarretrobirus

Sinplea

MLV Saguen leuzemia birusa Karraskari,

katu eta

tximinoak

Leuzemia, sarkoma,

immunosupresioa

FelV Katuen leuzemia birusa

GPCOV Akurien C-motako onkobirusa

GALV Giboien leuzemia birusa

Deltarretrobirus Konplexua BLV

HTLV

Behien leuzemia birusa

Gizakien birus T-linfotrofikoa

Behia,

primateak

B edo T zelulen

leuzemia/linfoma

Epsilonerretrobirus Sinplea WDSV Walleye azaleko sarkoma birusa Arrainak Azaleko lesioak

Lentibirus

Konplexua

GIB-1 Giza immunoeskasiaren 1 birusa Gizakiak,

katuak,

primateak,

behiak,

ardiak,

ahuntzak,

zaldiak

Immunoeskasi

sindrome

kutsagarriak,

hanturazko

gaixotasun

kronikoak

FIV Katuen immunoeskasiaren birusa

SIV Tximino immunoeskasiaren birusa

BIV Behien immunoeskasiaren birusa

MVV Visna-maedi birusa

CAEV Kapridoen artritis entzefalitis birusa

EIAV Zaldien anemia birus kutsakorra

Espumabirus

Konplexua

SFV Tximinoen birus apartsua Tximinoak,

katuak,

behiak

Ez da

gaixotasunekin

asoziatu

FFV Katuen birus apartsua

BFV Behien birus apartsua

49

Zoritxarrez, erretrobirus endogeno eta exogenoetarako sailkapen sistemak

independenteki garatu dira eta ez daude guztiz txertaturik (Jern et al., 2005).

Zenbait ERVrako argi dago erretrobirus exogenoen aldaki endogenoak direla eta

beraz, zazpi genero horien barruan sailka daitezke hauek. Esate baterako Jaagsiekte

ardi betarretrobirusa (JSRV) forma exogeno zein endogenoan ematen da modu

naturalean (Palmarini et al., 1996). Hala ere, ERV gehienetarako ez da homologo

kutsakorrik topatu eta gaur egun, ez dago ERV hauek (horietako asko ERV zatiak

soilik) orain arteko taxonomia-sisteman sailkatzeko adostasunik. Egoera oraindik

gehiago zailtzen da ERV batzuetarako sailkapen-sistema desberdinak eta askotan

desegokiak erabiltzen direnean, esate baterako, ostalariaren arabera sailkatzen

direnean (1.3. taula).

Hala ere, nahiz eta ERV asko ez dauden genero jakin baten baitan barneraturik,

hauek klasetan biltzeko joera handia dago, erretrobirus exogenoekin daukaten

antzekotasunetan oinarrituz (Wilkinson et al., 1994). Sailkapen-sistema hau

erabilita Gamma- eta epsilonerretrobirusekin ahaidetutako ERVak, I klasearen

baitan barneratzen dira; lenti-, alpha- beta- eta deltarretrobirusekin batera

taldekatzen direnak II klasearen baitan; eta espumabirusekin taldekatzen direnak

III klasearen baitan (Wilkinson et al., 1994). Arrazoi desberdinengatik nahaste

handia dagoenez ERV familia/taldeen izendapenari dagokionean, 2009-an

Blomberg eta kideek ERV indibidualak sailkatzeko sistema berri bat proposatu

zuten, antzekotasunean, ezaugarrietan, (inferitutako) funtzioan eta aurreko

nomenklaturan oinarritutakoa (Blomberg et al., 2009) (1.3. taula eta 1.7. irudia).

2.3.1. I klaseko ERVak

I klaseko ERVek ostalari-heinik zabalena azaltzen dute (Herniou et al., 1998).

Gammarretrobirus generoa gainera, berezia da gainontzeko genero guztien artean,

ia ornodun klase guztietan zehar banaturik azaltzen delako (Martin et al., 1999).

Kide guztiek antolaketa genetiko sinplea dute eta akasdunak ez diren birusek ez

dituzte gene gehigarriak kodetzen (erreplikazioan akasdunak diren kide askok

onkogeneak kodetzen dituzte). Adibiderik ezagunenen artean saguen leuzemia

birusa (MuLV), giboien leuzemia birusa (GaLV), katuen leuzemia birusa (FeLV)

eta txerrien erretrobirus endogenoak (PERV) daude (Shinnick et al., 1981; Delassus

et al. 1989; Donahue et al., 1988 and Patience et al., 2001).

50

Epsilonerretrobirusen artean soilik arrainen erretrobirus exogenoak daude eta

ematen duenez, ez dute homologo endogenorik. Hala ere, arrainen

epsilonerretrobirusekin taldekatzen den erretrobirus endogeno bat deskribatu izan

da Xenopus laevis anfibioan (Gifford & Tristem, 2003).

2.3.2. II klaseko ERVak

Ematen duenez II klaseko ERVek nahiko ostalari-hein txikia dute, batik bat

ugaztun eta hegaztiz osaturik dagoena (Herniou et al., 1998). Alpharretrobirusak

Gallus generoan baino ez dira identifikatu. Genero honetako kide prototipikoa

Hegaztien Leukosi Birusa da (ALV), genoma antolaketa sinple batetik isolatu zen

lehenengo birusa, hain zuzen (Ellerman & Bang, 1908). Alpharretrobirusen

erreplikazioaren ostean genomaren zati bat galtzen duten aldakiak sor daitezke eta

galera hau maiz onkogene zelularrekin ordezkatzen da. Birus motz hauek “birus

laguntzaile” oso baten presentzia behar dute, erreplikatzeko beharrezko funtzioekin

lagunduko diena. Hala ere, Rous sarkoma birusa (RSV) berezia da alpharretrobirus

guztien artean, erreplikatzeko behar dituen geneez gain onkogene (scr) bat azaltzen

baitu (Swartz et al., 1983).

Horrez gain, alpharretrobirusekin antza duten zenbait familia aurkitu dira oiloen

(Gallus gallus) genoman (Boyce-Jacino et al., 1992). ALVE familia, adibidez, ALV

birus exogenoarekin ahaidetuta dagoela ematen du eta bankiva oilarrean topatu da,

oilo arruntaren aitzindari basatia, baina ez ordea horren ahaidetuak ez dauden

hegazti galliformeetan. Hori dela eta, uste da ERV honek berriki infektatu duela

hozi-lerroa (Frisby et al., 1979). EAV-0 familia, alpharretrobirusekin ahaidetutako

bigarren familia bat da (Boyce-Jacino et al., 1989). ALVErekin ahaidetutako

infekzioekin ez bezala, EAV-0 birusen txertatze-filogenia eta Gallus generoaren

filogenia bat datoz, antzinako jatorria iradokiz (Boyce-Jacino et al., 1992; Sacco et

al., 2001; Resnick et al., 1990). Hala ere, beste zenbait ikerketaren arabera uste da

alpharretrobirusekin ahaidetutako kide gehiago daudela hegazti taxonen artean

banaturik (Hanafusa et al., 1976; Dimcheff et al., 2000). Izan ere, Bonasa umbellus

hegaztiaren sekuentzia probiral oso bat deskribatu da berriki (Dimcheff et al., 2001)

eta tetraornina birus endogeno (TERV) izena eman zaio. Gainera, azken analisien

arabera alpharretrobirus generoarekin ahaidetutako ERV sekuentziak gutxienez 15

hegazti ordenatan agertzen dira (Gifford et al., 2005).

51

1.7. Irudia. Zazpi genero erretrobiralak barneratzen dituen errotu gabeko neigbor joining (NJ)

dendrograma (500 bootstrap-eko adostasuna), pol genean oinarritutakoa: alpha-, beta-, gamma-,

delta-, epsilon-, lenti-, eta espuma-antzeko erretrobirusak. Kanpoaldean erretrobirus endogenoei

dagozkien klaseak adierazita daude. Ostalari espezie desberdinak sinboloekin adierazi dira. Adar

beltzek forma exogeno kutsakorrean (XRV) baino existitzen ez diren birusak adierazten dituzte;

gorriek XRV zein ERV formetan azaltzen direnak eta urdinek ERVdunak (Jern et al., 2005).

Betarretrobirusak ugaztunetatik baino ez dira isolatu eta gehienek, genoma

egituraketa sinplea dute. Genero honetako zenbait erretrobirus, forma exogeno zein

endogenoan ematen dira batera, esate baterako, Jaagsiekte ardi erretrobirusa

(JSRV) eta saguen ugatzetako tumore birusa (MMTV). Hala ere, homologo

exogeno ezagunik gabeko betarretrobirus ugari daude. Gainera, nahiz eta

ugaztunetara mugatuta egon, oso zabalduta daude talde honen barruan (49 ugaztun

taxonetatik 25ean agertzen da genero hau). Azkenik, saguek A-motako partikula

Beta

Beta-

antzeko

Alpha

Lenti

Delta

Errantibirusak

Spuma-

antzeko

Epsilon-

antzeko

Epsilon

Gamma

I KLASEA

III KLASEA

II KLASEA

ERVak soilik XRVak soilik ERV/XRVak

Primateak Ungulatuak Arrainak Felidoak Hegaztiak Anfibioak Karraskariak Narrastiak Intsektuak

52

intrazisternala (IAP) izeneko elementua dute, betarretrobirusekiko homologia altua

azaltzen duena (Herniou et al., 1998; Gifford & Tristem, 2003; Gifford et al., 2005).

Deltarretrobirus eta lentibirusek ezaugarri komun asko dituzte. Biak daude

ugaztunetara mugatuta, deltarretrobirusak primateetan eta behietan azaltzen dira

eta aldiz, lentibirusak primate, felido eta ungulatu desberdinetan (ahuntzak, ardiak,

behiak eta zaldiak). Hauen kasuan ez da homologo endogenorik ezagutzen. Bi

generoek genoma antolaketa konplexua dute eta ez dago kide onkogenedunik

taldean (Gifford & Tristem, 2003).

2.3.3. III klaseko ERVak

Espumabirusena, erretrobirus exogenoen talde bat da, ugaztun askoren artean

zabalduta dagoena (felidoak, hausnarkariak, primateak). Genoma egitura

konplexua dute eta ez dute modu hurbilean ahaidetutako homologo endogenorik.

Hala ere, analisi filogenetikoetan ugaztunen HERVL elementuekin, hegaztien

elementuekin, narrastien SpEV elementuekin eta anfibioen elementuekin

taldekatzen dira (Herniou et al., 1998; Cordonnier et al., 1995; Bénit et al., 1997).

Southern eta slot blot analisiak burutu direnean, testatutako ugaztun guztien DNA

genomikoek ERVL sekuentziak dituztela ikusi da baina kopia-kopuru txikian.

Sekuentzia hauek erretrobirusen antzekoak dira eta gutxienez sei ordenatan topatu

dira (primateak, Rodentia, Carnivora, Lagomorpha, Perissodactyla eta

Artyodactila), kontserbazio-maila altuarekin gainera. Honek frogatzen du ERVL

motako elementuek erradiazioaren aurretik kolonizatu zutela ugaztun karenadunen

lerroa, duela 70 milioi urte; hau da, ziurrenik aitzindari komun batetik/batzuetatik

aurrera eratorri ziren (Bénit et al., 1999). Bestelako ornodunetan berriki egin diren

bilaketetan oinarrituz, hala ere, espumabirusen eta ERVLen antzeko elementuen

aitzindaria ugaztunen lerrotik kanpo egon litekeela dirudi, besteak, hegazti edo

anfibioetan topatu baitira mota honetako elementuak (Herniou et al., 1998).

2.3.4. Sailkatu gabeko ERVak

Deskribatutako ERVetatik dibergenteenetako batzuk CnEV elementuak (Cocodylus

niloticusen birus endogenoak) eta pitoien ERVak dira, krokodiloen taldeko zenbait

narrastietan deskribatutakoak (Martin et al., 2002; Huder et al., 2002; Gifford et al.,

2005).

53

2.4. Erretrobirus endogenoen bizi-zikloa

Erretrobirus baten endogenizazio prozesua zenbait faktoreren menpekoa da:

besteak beste, erretrobirusak zelula guztien errestrikizio-faktoreei uko egin beharko

die, ugal-ehunak infektatu, hozi-zelulak kolonizatu, hozi-lerroan hedatu ahal

izateko ondorengoek bizirautea ahalbidetu eta, azkenik, finkatu eta zama-lepoen

bidez iraun, espezie ostalarian. Oso patogenikoak diren ERVek ezingo dute ondo

saretutako iragazki hau gainditu (Blikstad et al., 2008).

Ondorioz, gene bilduman barneratzen diren ERV gehienak negatiboki hautetsita

daude eta beraz, ez dute populazio ostalarian luze irauten. Gainera, kolonizazio-

prozesuak eragin kaltegarriak izan ditzake ostalariarengan, bereziki ERVa

geneengandik hurbil txertatzen bada, bere adierazpenak ondorio patogenikoak izan

ditzakeelako, ostalaria ahulduz (Stoye, 2001).

Aldiz, ostalariengan eragin oso kaltegarria ez duten ERVak bertikalki transmitituko

dira ondorengoetara eta jito genetikoaren ondorioz, euren maiztasuna populazioan

handitu ahal izango da (Maynar-Smith and Haigh, 1974). Era berean, ERVek

erreplikatzeko gaitasuna mantendu dezakete eta denborarekin, hozi-lerroa

berrinfektatu dezakete erretrotransposizio edo birkutsatze izeneko prozesuaren

bidez (Boeke & Stoye, 1997). Bi mekanismo hauen bidez populazio mistoak sortzen

dira, finkatutako eta finkatu gabeko ERV elementuek lerro monofiletiko bakarra

osatzen baitute (1.8. irudia).

Hala ere, ematen duenez ERVen ugaritze-tasa handiagoa da lehen kolonizazioa

gertatu eta gutxira, eta denboran zehar moteltzen joaten da. Hori azaltzeko bi

arrazoi daude: lehenengoaren arabera, ERVen aktibitateak ondorio kaltegarriak

ditu ostalariarentzako eta honek, defentsa-mekanismoak martxan jarriko ditu ERVa

isilarazteko, esate baterako metilazioa (Yoder et al., 1997). Bigarren teoriaren

arabera, erretrobirus endogenoak ez daude hautespen purifikatzailepean

(erretrobirus exogenoek mutazio eta hautespen bidez mantentzen dute euren fitnessa

baina ez, ordea, endogenoek). Ondorioz, ez da hautespen presiorik egoten ERV

sekuentziak osorik mantentzeko erreplikazioan zehar (nahiz eta zenbait eskualde

mantendu egiten diren) eta errekonbinaziorik gertatu ezean, lerro biralaren fitnessa

murriztuz joango da denborarekin (Gifford & Tristem, 2003).

54

1.8. Irudia. ERV lerro baten bizi-zikloa. Gifford & Tristem, 2003tik moldatua.

ERVak belaunaldi batetik bestera mutazioak pilatzen doazela-eta, ez-funtzionalak

bilakatzen dira eta ezingo dira erreplikatu edo generik adierazi, azkenik lerro birala

desagertuko den arte.

2.4.1. Txertatzea

Txertatze erretrobirala birusaren gainazala eta zelula gaineko hartzaileak lotzen

direnean gertatzen da. Birusa lotu ostean konformazio aldaketa bat ematen da

zelularen gainazalean eta birionak zitoplasmara askatzen dira. Fusio honen

ondorioz, erretrobirusaren RNA genomak alderantzizko transkripzioa hasiko du

eta harizpi bikoitzeko DNA bilakatu (birioneko nukleotik eratorritako egitura baten

barruan, txertatze aurreko konplexua edo PICa eratzeko). Ondoren, DNA nukleora

garraiatua izango da eta DNA kromosomikoaren baitan txertatutako, birusak

kodetutako IN proteinaz baliaturik (Jern & Coffin, 2008).

Erretrobirus endogenoa

Zel

ula

-ost

ala

ria

Inaktibazioa

Finkatzea

Finkatzea eta galtzea

Ostalariak hautespen-presioa eragiten dio ERVari eta

populazioan lortuko duen maiztasuna baldintzatzen du.

Zenbait erretrobirus endogeno mutazioak pilatzearen

ondorioz galdu egiten dira baina gutxi batzuk

populazioan finkatu.

Kolonizazioa eta ugaritzea

Erretrobirusak zelularen baitan txertatu ostean partikula

biriko exogeno infekziotsuak askatzen dira.

Erretrobirus exogenoa

Kolonizazioa

55

ERVak moderno edo aitzinako bezala sailkatu daitezke, euren txertatzea gertatu zen

momentuaren arabera (espeziazioaren aurretik edo ondoren) (Gifford & Tristem,

2003). ERV modernoak eta hauen homologo exogeno kutsakorrak oso antzekoak

dira, oraindik ez baitituzte delezio edo mutazio ugari pilatu eta, are gehiago,

oraindik partikula infekziotsuak sortzeko gaitasuna mantentzen dutelako maiz.

ERV hauetako asko polimorfikoak dira, hau da, ez daude populazio batean guztiz

finkatuta eta oraindik endogenizazio-prozesua pairatzen ari dira, esate baterako,

koalen eta ardien ERVak (Arnaud et al., 2007a; Tarlinton et al., 2006). Aitzinako

ERVek ostalarien genomak espeziazioaren aurretik inbaditu zituzten eta beraz,

espezie bateko indibiduo guztietan finkatuta daude. Normalean mutazio edo

delezio ugari pilatu dituzte eta ez dira erreplikatzeko gai izaten (Gifford & Tristem,

2003).

2.4.2. Ugaritzea

Arestian aipatu bezala, bi mekanismo nagusi daude ERVen ugaritzea baimentzen

dutenak: birkutsatzea eta erretrotransposizioa. Erretrotransposizioaren bitartez

ERV kopia-kopurua handitu egiten da eta ahaidetutako ERVez osatutako ERV

lerroa eratzen da. Aldiz, ERV berri bat birtxertatuz, hozi-lerroko zelulak birkutsatu

egiten dira eta, ondorioz, birus exogenoaren antzekoagoa den kopia berri bat

eratzen da. Mekanismo hauetaz gain, ERVak elkarren artean edo XRVekin

errekonbinatu daitezke, batzuetan funtzionaltasuna berreskuratuz (Gifford &

Tristem, 2003; Belshaw et al., 2004).

2.4.5. Finkatzea

Zenbaitek proposatu dutenez, genomaren eskualde jakin bateko errekonbinazio-

tasa, kromosometako elementu higikorren dentsitatearekin korrelazionatuta dago

(Duret et al., 2000; Eickbush & Furano, 2002; Biemont & Vieira, 2006). Hala ere,

finkatze-prozesua baldintzatzen duen faktore nagusia ERV dentsitatea omen da eta

ez errekonbinazio-tasa, nahiz eta errekonbinazio-tasak ERVaren iraunkortasuna eta

osotasuna baldintzatuko dituen (Katzourakis et al., 2007).

56

2.5. ERV eta ostalariaren arteko elkarrekintzak

Birusek ostalariaren makineria manipulatu eta bahetzeko estrategia ugari garatu

dituzte, honela euren geneen adierazpena kontrolatuz. Ondorioz, eboluzioan zehar

lortutako oreka baten emaitza da ERVen iraupena genoman. ERV gehienak

akasdunak badira ere (mutazio, delezio eta birkokapenen edo eraldaketa

epigenetikoen ondorioz), zenbaitek gene baterako edo gehiagorako irakurketa-

marko irekiak (ORFak) mantendu dituzte milioika urtetan zehar, nolabait

ostalariarentzako onuragarriak direla iradokiz (Kurth & Bannert, 2010).

Orokorrean uste da ERVek genomaren itxuran eta geneen adierazpenean eragina

dutela, locus urrunen arteko errekonbinazio homologoak eta ondorioz,

berrantolaketa kromosomikoak eragiten dituztelako (Hughes & Coffin, 2001) edo

zuzenean geneen adierazpena eraldatzen dutelako (Ting et al., 1992). Gainera,

ERVek erretrobirus exogeno homologoen infekzioen aurrean babestu dezakete

ostalaria. Esate baterako oiloen ev locus erretrobiralak, Rous sarkoma birusaren

aurrean erresistentzia ematen dioten E-azpitaldeko env proteinak adierazten ditu,

antza, hartzaile bidezko interferentziagatik (Payne & Pani, 1971). Zenbait sagu

basatitan antzeko egoera bat behatu izan da, fv-4r locusak saguen leuzemia

birusaren (MLV) hartzaile ekotropikoak blokeatzen baititu, gp70 ekotropiko

endogeno baten sintesiaren bidez (Kozak et al., 1984).

Birus exogenoaren infekzioen aurrean babesa emateaz gain, zenbait proteina biral

bestelako funtzio fisiologiko garrantzitsuak izanagatik ko-hautatuak izan dira.

Adibiderik ezagunena sinzitina izeneko proteinena da, karenaren garapenean

betetzen duten paper garrantzitsuagatik (1.9. irudia). Gizakion sinzitina-1 proteina,

HERVW probirus ezagunaren env genearen produktu dena, trofoblastoetan

adierazten da (Mallet et al., 2004), karenaren kanpoko geruza eratzen duten

zeluletan, eta sinzitioaren eraketa eta zelulen fusioa gidatzen ditu bertan (Mi et al.,

2000). Primate guztiotan horrelako bi gene identifikatu dira jada (Mi et al., 2000;

Blond et al., 2000; Mallet et al., 2004; Bonnaud et al., 2005; Caceres & Thomas,

2006), eta saguetan (sinzitina-A eta –B) (Dupressoir et al., 2005), leporidoetan

(Ory1-sinzitina) (Heidmann et al., 2009), karniboroetan (Car1-sinzitina) (Cornelis

et al., 2012) eta berriki hausnarkarietan (Rum1-sinzitina) (Palmarini et al., 2001b;

Cornelis et al., 2013) erlazionaturik ez dauden sinzitina desberdinak aurkitu dira

57

(1.9. irudia). Gainera, hausnarkarien karenazio sinepiteliokoriala berezia da euterio

guztien artean, zelula-fusio heterologoa ematen baita fetuaren eta amaren zelulen

artean, eta sinzitializazioaren hedadura oso txikia baita. Bost sinzitina hauek ez

daude elkarren artean ahaideturik, txertatze-leku desberdinak dituzte eta, beraz,

hiru ugaztun ordena horietan independenteki garatu behar izan dira (Dunlap et al.,

2006; Esnault et al., 2008; Frendo et al., 2003; Mangeney et al., 2007; Sugimoto &

Schust 2009).

1.9. Irudia. Sinzitina-aniztasuna ugaztun euterioen egitura karenarioen adierazgarria da. Sinzitina baten egitura generikoa eta honek kodetutako proteinak erakusten dira. SP, seinale peptidoa; FP, fusio peptidoa; ISD, usteko domeinu immunosupresiboa; TMD, mintz-arteko domeinua. Karenazio-mota desberdinak koloretako zirkuluekin adierazita daude. Sinzitina desberdinen txertatze denbora erakusten da. Adarren luzera denborarekiko proportzionala da (milioi urteetan, My). Cornelis et al., 2013tik moldatua.

ERVek alboko geneen adierazpena kontrolatu dezaketen sekuentzia-

erregulatzaileak dituzte, ornodunen genomaren funtzio eta eboluzioarengan

eraginez. LTR elementuak, hain zuzen ere, geneei sekuentzia promotoreak

helarazteagatik dira ezagunak (Samuelson et al., 1990; Medstrand et al., 2001;

Dunn et al., 2003; van de Lagemaat et al., 2003; Bannert and Kurth, 2004;

Medstrand et al., 2005; Dunn et al., 2006; Romanish et al., 2007; Conley et al.,

2008; Cohen et al., 2009). ERVen LTRek, II RNA polimerasarako promotore basal

Gainazaleko azpi-unitatea

TMD ISD FP SP

5’-LTR gag pol env 3’-LTR

Mintz-arteko azpi-unitatea

Karena hemokoriala

Karena sinepiteliokoriala

Ory1 sinzitina

A eta B sinzitinak 1 eta 2 sinzitinak

Rum-1 sinzitina

Karena endotelikoriala

Ruminantia

150 100 50 0 Mya

Lagomorpha

Rodentia

Primates

Carnivora

Perissodactyla

Chiroptera

Cetacea

Suina

Insectivora

Afrotheria

Xenarthra

Car1 sinzitina

Karena epiteliokoriala

58

bat eta sekuentzia areagotzaileak dituzte, seinale askoren eragile direnak eta beraz,

transkripzio-faktore askorekin lotuko direnak. Ezaugarri hauei esker, probirusaren

adierazpenaren espazioa eta denbora kontrolatzen dira, baita transkripzioaren

bukaera momentua eta poliadenilazio seinaleak ere (Cohen et al., 2009).

LTRen efektu “gene-erregulatzailea” gene jakinen gaineko zenbait ikerketatan

behatu zen lehen aldiz. Esate baterako, HERVEren LTRak amilasa geneari

parotida-espezifikoa zen adierazpen-gaitasuna helarazten zion, elementu

areagotzaile modura jokatuz (Ting et al., 1992; Samuelson et al., 1990); ERV9ren

LTRak, primateetan oso kontserbatuta dagoen zink-atzamar sekuentzia (ZNF80)

kontrolatzen duela frogatu da (di Cristofano et al., 1995), eta beste zenbait LTR-ren

sekuentzia-erregulatzaileek zitokromo konplexuetako sekuentzia-erregulatzaileekin

lotura dutela behatu da (Suzuki et al., 1990). Fenomeno hau “LTRen exaptazio”

modura ezagutzen da. Cohen eta kideek LTRetatik eratorritako promotoreen

zerrenda bat egin zuten, datu esperimentaletan oinarritutako 24 kasu biltzen

dituztelarik (Cohen et al., 2009). LTRen exaptazioaren azken adibidea berriki

argitaratu da, frogatu baita HERVHren LTRek giza ama-zelula enbrionarioek

identitatea mantentzeko beharrezko RNA ez-kodetzaile modura funtzionatzen

dutela (Lu et al., 2014a).

2.6. ERVen isilarazpen epigenetikoa: DNAren metilazioa

ERVen erretrotransposizio-aktibitateak geneen adierazpenean efektu kaltegarriak

eragiteko gaitasun handia du. Aktibitate honen ondorioetako batzuk hozi-lerroaren

mutagenesia eta minbizi-zelulen transformazioa izan daitezke. Ondorioz,

ugaztunen genomek ERVen transkripzioa eta mugikortasuna mugatzeko estrategia

ugari garatu dituzte. Elementu higikorren eta oro har azido nukleiko arrotzen aurka

ostalariak garatzen dituen defentsa-mekanismoak, erretrobirusen eboluzioan eragin

handia duten indar hautesle garrantzitsuak dira. ERVen erretrotransposizio-

aktibitatea mugatzen duten mekanismo ugari daude (hala nola, mozketa, mutazioa,

RNA isilarazpena, isilarazpen heterokromatikoa, gag eta env geneek bideratutako

murrizketa, ubikitinilazioa, histona eraldaketak, RNA txikiak…), baina isilarazpen

transkripzionalen artean mekanismorik ezagunena DNA-metilazioarena da

(Blikstad et al., 2008).

59

Metilazioa, zitosinaren bosgarren karbonoari metil talde bat gehitzean datza.

Ondorioz, 5-metilzitosina (5mC) base eraldatua sortzen da, CpG dinukleotidoa

dagoen lekuetan. Erreakzio hau DNA metiltransferasek (Dnmts) katalizatzen dute,

eta ugaztunetan lau DNA metiltransferasa identifikatu dira, entzimatikoki

funtzionalak direnak (Latham et al., 2008): Dnmt1 (Li et al., 1992), Dnmt3a,

Dnmt3b (Okano et al., 1999) eta Dnmt2 (Yoder & Bestor, 1998).

Gainera, proposatu izan da jatorriz DNA-metilazioaren funtzio nagusia, hain

zuzen, elementu higikorren aurkako defentsa dela, eta zehatz-mehatz ERVen

kontrakoa (Yoder et al., 1997). Zenbait autoreren arabera, geneen erregulazioa eta

X kromosomaren inaktibazioa gerora etorri ziren moldaketak izango ziren, zenbait

espezie gai baitira geneen adierazpena erregulatzeko eta X kromosomaren desoreka

konpentsatzeko DNA-metilazioaren beharrik gabe (Matzke et al., 2000; Lucchesi et

al., 2005; Maksakova et al., 2008).

2.7. Ardi erretrobirus endogenoak

ERV eta ostalariaren arteko ko-eboluzio eredu gisa erabili izan da ardia, hain zuzen

ere Jaagsiekte ardi erretrobirusarekin (JSRV) eta honen homologo endogenoarekin,

enJSRVarekin, bi formak oraindik aktibo daudelako eta bien artean elkarrekintza

sendo bat ematen delako (Arnaud et al., 2008).

2003-an, Klymiuk eta kideek ardi erretrobirus endogenoen (OERV) pro-pol

sekuentziak anplifikatu eta aztertu zituzten Bergschaf arrazako ardien DNA

genomikoaz baliatuz, eta ERV hauek familietan taldekatu zituzten, txerrien ERVei

jarritako izenetan oinarrituz. Guztira, hiru OERV familia eta bederatzi OERV

familia deskribatu zituzten.

OERV familien artean, 1-ek irakurketa marko desberdina azaltzen zuen pro eta

pol geneetarako, eta enJSRVen subfamiliak osatzen zuen. Hala ere, 2 eta 3

familiak oso kontserbatuta zeuden eta, bereziki 2 familiako kideek, homologia oso

altua (% 96) azaltzen zuten txerrien 5 ERVekin (PERV).

Horrez gain, bi familiek (OERV 1 eta 2) ere oso homologia altua (%98)

aurkezten zuten lehenago deskribatutako PERV 8-rekin. OERV 2 familiako kide

60

bat MiEVIrekiko oso antzekoa zen (%95), eta ardien I erretrobirus endogeno

(OvEVI) bezala izendatua izan zen. Gainontzeko OERVak leuzemia-birusekin

ahaidetuta azaldu ziren eta, ondorioz, saguen leuzemia-birusen antzeko

superfamiliarekin taldekatuak izan ziren, zenbait ugaztunen ERVak taldekatzen

dituena (saguak, txerriak, bisoiak eta tximinoak barne) (Klymiuk et al., 2003).

2.7.1. Jaagsiekte ardi erretrobirusa (JSRVa)

Jaagsiekte ardi erretrobirusa (JSRV), ardien biriketako adenokartzinomaren (OPA)

eragilea da, ardien gaixotasun biriko garrantzitsuenetako bat. Beraz, ardia

biriketako minbizia aztertzeko animalia-eredu handi bakarrenetako bat da

(Palmarini et al., 1997; Palmarini et al., 1999; Palmarini & Fan, 2001; Fan, 2003).

Tximinoen eta saguen zenbait birusekin ahaidetutako betarretrobirusa da JSRV,

esate baterako tximinoen Mason-Pfizer birusarekin eta saguen ugatzetako tumore

birusarekin eta tumore birus enzootiko nasalarekin (ENTV) (Cousens et al., 1996;

Cousens et al., 1999; Palmarini et al., 1999; Alberti et al., 2002; Palmarini & Fan,

2003; Liu et al., 2003a; Ortin et al., 2003).

JSRVren genoma 7,5 Kb-koa da eta gene erretrobiral tipikoak gordetzen ditu: gag,

pro, pol eta env. Gag, pro eta pol geneek betarretrobirusetan ohikoak diren irakurketa-

markoak azaltzen dituzte. Hala ere, JSRVen genomak funtzio ezezaguneko ORF

gehigarri bat du, orf-x bezala ezagutzen dena eta pol genearekin gainjartzen dena

(Palmarini et al., 1999; Rosati et al., 2000; Palmarini & Fan, 2003). Orain arte

sekuentziatu diren JSRV leinu guztiek antzekotasun maila oso handia dute, ia

presio ebolutiborik pairatzen ez dutela iradokiz (Palmarini & Fan, 2003).

JSRV berezia da birus onkogenikoen artean. Bere gainazaleko env glikoproteina,

onkoproteina dominantea da eta honen adierazpena nahikoa da zelulen

transformazioa eragiteko, bai in vitro (Maeda et al., 2001; Rai et al., 2001; Allen et

al., 2002; Zavala et al., 2003; Liu & Miller, 2005) zein in vivo (Wootton et al., 2005;

Caporale et al., 2006). JSRVren hartzaile zelularra Hyaluronidasa-2 izeneko

proteina da (Rai et al., 2001). Envek induzitutako zelulen transformazioa

baldintzatzen duen eskualde nagusia TM domeinuko isats zitoplasmatikoan (CT)

kokatuta dago. Hain zuzen ere, Enveko 590-593 posizio aminoazidikoetan Y-X-X-

M motiboa dago, transformazioa gertatzeko ezinbestekoa dena, karraskari eta

61

oiloen lerro zelularretan behintzat (Palmarini et al., 2001a; Zavala et al., 2003; Liu

et al., 2003b; Cousens et al., 2007).

2.7.2. Ardi betarretrobirus endogenoak (enJSRVak)

JSRV forma kutsakor exogenoak homologo endogeno bat du, Caprinae

subfamiliako espezie gehienen artean zabalduta dagoena, Jaagsiekte ardi

erretrobirus endogeno edo enJSRV deitutakoa. Nukleotido mailan enJSRV eta

JSRVek %85-89-ko identitatea gordetzen dute. Desberdintasun nagusiak LTRko

U3 eskualdean kokatzen dira eta Gag eta Enveko hiru eskualdetan, 1-, 2- eta 3-

eskualde aldakorrak bezala ezagunak (VR1, -2, -3) (Palmarini et al., 2004). VR1 eta

VR2, Gag geneko matrizean (MA) kokatzen dira, elkarrengandik 50 aminoazidoko

distantziara. Aldiz, VR3-ak Env glikoproteinaren azken 67 aminoazidoak betetzen

ditu. Hain zuzen ere, enJSRVen TMko CT domeinuak ez du Y-X-X-M motiborik

azaltzen eta, horrenbestez, ez da zelulen transformazioa induzitzeko gai, oiloen eta

karraskarien lerro zelularrekin frogatu izan den moduan (Palmarini et al., 2001b;

Arnaud et al., 2007a)

enJSRVak 1992. urtean deskribatu ziren lehen aldiz. York eta kideek animalia

gaixoen biriketako exudatuetatik isolatutako JSRV baten genoma osoa klonatu eta

sekuentziatu zuten eta Southern blot analisien bidez, ardien eta ahuntzen DNA

genomiko normalean JSRVekin ahaidetutako sekuentziak zeudela frogatu zuten,

ardi eta ahuntz espezieetan endogenoak izan zitezkeela iradokiz (York et al., 1992).

2003. urtean, Carlson eta kideek enJSRVen kokapen kromosomikoa mapatu zuten

ardi eta ahuntzen kromosometan FISH teknikaren bidez, zunda modura Hego

Afrikako leinuko JSRV baten genoma osoa zeraman plasmido bat erabilita. Ardien

28 kromosometatik 15etan gag sekuentziak topatu zituzten eta enJSRV probirusak

ardi eta ahuntzen kromosometan zehar zoriz banatuta zeudela ondorioztatu zuten

(Carlson et al., 2003).

2.7.3. enJSRVen historia ebolutiboa

enJSRVek duela 5-7 milioi urte hasi zuten ardien genomaren inbasioa, Ovis (etxeko

ardia eta honen ahaide basatiak) eta Capra (etxeko ahuntza eta ahaide basatiak)

generoen banaketa gertatu aurretik (Hernández-Fernández & Vrba, 2005). Hala ere,

enJSRV probirusek ostalarien genoma inbaditzen jarraitu dute Caprinae lerroaren

62

eboluzioarekin batera, baita ardiaren etxekotze prozesua gertatu ondoren ere. Izan

ere, Ovis generora mugatutako zenbait enJSRV locus, espezie guztietan agertzen

dira (hala nola, Ovis nivicola, Ovis canadensis, Ovis orientalis eta Ovis dalli) baina beste

zenbait soilik etxeko ardietan (Ovis aries). Gainera, etxeko ardian agertzen diren

probirusetatik gutxienez sei, intserzionalki polimorfikoak dira (hau da, ez daude

populazioan guztiz finkatuta eta soilik indibiduo batzuetan agertzen dira) (Arnaud

et al., 2007a; Chessa et al., 2009).

Ardien etxekotzea duela 12.000 urte inguru gertatu zen Asiako hego-mendebaldean

(Zeder et al., 2006) eta, beraz, ondorioztatu daiteke intserzionalki polimorfikoak

diren enJSRVak duela 10.000 urte baino gutxiago txertatu zirela ardiaren genoman.

Gainera, duela 200 urte baino gutxiago txertatu den enJSRV probirus bat

deskribatu da (Arnaud et al., 2007a). Hori dela eta, esan daiteke ardiaren

genomaren inbasioa oraindik gertatzen ari den fenomenoa dela.

2.7.4. enJSRVen karakterizazioa

Orain arte enJSRVekin erlazionatutako 27 kopia deskribatu dira ardi, ahuntz eta

Ovis eta Capra generoko kide basati gehienetan (Arnaud et al., 2007a) (1.10. irudia).

Hala ere, identifikatu gabeko kopia gehiago daudela proposatu izan da (Chessa et

al., 2009). ERV hauen hedadura maila altua azaltzeko arrazoi posible bat, antzeko

erretrobirus patogenikoen infekzioen aurrean enJSRVek ostalaria babesteko duten

gaitasuna litzateke.

Frogatu izan denez, fetuaren garapenean zehar ematen den enJSRVen

adierazpenak, antzeko JSRV exogenoen aurrean tolerante bilakatzen ditu ardi

jaioberriak (Spencer et al., 2003). Izan ere, OPArekin gaixotutako ardiek ez dute

erantzun immune humoralik garatzen JSRVekiko. Hala ere, ezezagun zaizkigu

oraindik adierazten diren locusak eta adierazpen honen ondorioak espekulatu baino

ezin dira egin. Gainera, nahiz eta enJSRVen presentzia aspalditik ezaguna den

(ardien DNA genomikoarekin egin ziren lehen Southern blot probetatik), teknika

honek ez du probirusen kokapenaren inguruko informaziorik ematen eta ez du

locus indibidualak bereiztea ahalbidetzen, azken hau interesgarria litzatekeelarik

enJSRVek ostalariaren fisiologian duten eragina ebaluatzeko edo JSRV

exogenoarekin elkarri eragiteko duten gaitasuna aztertzeko.

63

In situ hibridazio fluoreszente bidez (FISH) locus probiralen banaketa ikertu da

ardiaren genoman. Hibridazio seinaleak 7 lerro zelularretako 7 ardi-kromosomatan

eta 8 ahuntz-kromosomatan topatu ziren. Gainera, ardi-hamster lerro zelular

hibridoetan egindako Southern blot analisien bidez JSRVen gag sekuentziak ardien

28 kromosomatik 15etan topatu ziren, FISH bidez identifikatutakoak barne

(Carlson et al., 2003; Chessa et al., 2009; Armezzani et al., 2011) (1.11. irudia).

1.10. Irudia. enJSRV taldearen antolaketa genomikoa. Lehen bost probirusek antolaketa genomiko tipikoa dute, erreplikatzeko gai diren JSRV exogenoen berdina. enJS56A1 eta enJSRV-20 kopien gag geneko irakurketa markoan agertzen ‘‘W’’ ikurrak R21W ordezkapen aminoazidikoa adierazten du, bi probirus transdominante hauetan agertzen dena. enJSRV-20 kopiak LTR proximalaren aurretik env gene zati bat azaltzen du, lauki laranja baten bidez adierazita. Stop-kodonak lerro bertikal eta izartxoen (*) bidez adierazita daude. Delezio handiak lauki marradunen bidez adierazten dira. enJSRV-6 kopiaren M letrak lehen metioninaren posizioa adierazten du, gainontzeko enJSRVetan eta exJSRVetan hasiera kodon arrunta dena baino geroago kokatzen dena. Gainera kopia honek egitura konbinatu bat azaltzen du, kontrako norabidean kokatuta baititu geneak (gezi horizontalen bidez adierazita). Kopia guztiek bik izan ezik (enJSRV-2 eta enJSRV-20) 5-’ eta 3’-LTRak azaltzen dituzte. Azkenik, erretrobirus tipikoetan DNA genomikoaren 6bp-ko bikoizketa topatu da probirusaren txertatze-lekuan (Arnaud et al., 2007a).

5´-LTR gag

pol

orf-x

env 3´-LTR

*

*

*

*

*

*

* *

*

* *

W

W

JSRV enJSRV-26 enJSRV-7 enJSRV-15 enJSRV-16 enJSRV-18

enJSRV-20

enJS56A1

enJSRV-11

enJSRV-13

enJSRV-19

enJSRV-23

enJS5F16

enJSRV-6 M

enJSRV-9

enJSRV-5

enJSRV-8

* *

* *

*

*

*

*

* * *

* *

*

*

* * *

*

* *

* *

enJSRV-10

enJSRV-14

enJSRV-3

enJSRV-2

LINE

enJSRV-1

enJSRV-21

enJS59A1

enJSRV-25

enJSRV-17

enJSRV-4

enJSRV-24

64

1.11. Irudia. JSRV probirusdun ardi kromosomen in situ hibridazio fluoreszentea (FISH). Irudi bakoitzean hibridazioa zein enJSRV kopiari dagokion adierazten da. FITC seinaleak (berdez) probirusen kokapen kromosomikoa adierazten du, gezi zurien bidez irudikatuta. Gezien ondoko zenbakiek kromosoma adierazten dute. Xingolak RPBI bidez markatu ziren (BrdU-berantiarra eta propidio iodido bidezko tindaketa bidez markatutako R-xingolak), gorriz adierazita. Ohartu enJSRV-7 kopiaren mapaketa ez dela fidagarria autosometako zentromeroekin modu inespezifikoan lotzen delako. Ardi kromosometako ideogramak adierazten dira irudi bakoitzaren eskuinean, R-xingola bidezko patroiarekin. Ideogrametako gezi beltzak enJSRV bakoitza mapatzen deneko kokapen kromosomikoa irudikatzen du (Chessa et al., 2009; Armezzani et al., 2011).

2.7.5. enJSRVen banaketa

enJSRV locus gehienak ardietan finkatuta daude baina gutxi batzuk arraza eta

indibiduoen artean desberdin banatuta daude (hau da, intserzionalki polimorfikoak

dira). 2009 urtean, Chessa eta kideek 133 arrazako 1.362 animaliatik bildutako

lagin genomikoak aztertu zituzten. Laginak etxeko ardi eta honen ahaide hurbilenei

zegozkien eta 65 taldetan banatuak izan ziren, eskualde geografiko berdinekoak

ziren erlazionatutako arrazak elkarrekin multzokatuz (Chessa et al., 2009).

65

1.12. Irudia. enJSRVen banaketa. (A) Caprinae subfamiliako espezie adierazgarrienen zuhaitz filogenetiko sinplifikatua (adarren luzera ez dago eskalan). Espezie bakoitzaren alboan agertzen diren koloretako zirkuluak enJSRV taldearen adierazgarriak dira eta espezie jakin horretako indibiduo

batean agertzen dira gutxienez (Arnaud et al., 2007tik moldatua). (B) enJSRV probirusen

konbinaketak (erretrotipoak) etxeko ardian. Irudiko sektore-diagramek erretrotipo bakoitzaren maiztasuna adierazten dute, aztertutako 65 populazioetan. Aztertutako ardi populazio bakoitzari erretrotipo bat egokitu zitzaion genoman azaltzen zituen enJSRV polimorfikoen arabera. Erretrotipo bakoitza kolore desberdin batez adierazten da. Asiako hego-mendebaldeko, erdialdeko, Europa iparraldeko eta Afrikako populazio gehienek enJSRV-18 probirusa azaltzen zuten (berde iluna), erretrotipo nagusi modura. Eskualde mediterraneoan enJSRV-7 eta -18ren presentzia handia dago (horiz). Arraza primitiboek ez dute enJSRV polimorfikorik azaltzen (zuriz) edo soilik enJSRV-7 probirusa azaltzen dute (gorriz) (Chessa et al., 2009tik moldatua).

Aztertutako laginek gainera Urial ardia (Ovis vignei) eta mufloi mediterraneo eta

asiarrak (Ovis orientalis musimon, Ovis orientalis ophion, eta Ovis orientalis orientalis)

biltzen zituzten. Ikertutako arraza gehienek historikoki eskualde batekin lotura

A B

Capra hircus

Capra falconeri

Hemitragus jemlahicus

Ovis ammon

Ovis aries

Ovis canadensis

Ovis dalli

Budorcas taxicolor

enJSRV-20 enJSRV-18 enJSRV-11 enJSRV-16 enJSRV-8 enJSRV-26 enJSRV-15 enJSRV-7 enJSRV-14 enJSRV-23 enJS5F16

enJSRV-17 enJSRV-19 enJSRV-9

enJSRV-13 enJSRV-5 enJSRV-3 enJS59A1 enJSRV-25 enJSRV-24 enJSRV-4 enJS56A1

enJSRV-21 enJSRV-1

enJSRV-6 enJSRV-10

enJSRV-7 + enJSRV-18 + enJS5F16 enJSF16 + enJSRV-18 enJSRV-7 + enJSRV-16 enJSRV-7 + enJSRV-18 enJS5F16 enJSRV-18 enJSRV-7 ERV polimorfikorik ez

enJSRV-2 ?

66

zuten eta ez zeuden artalde komertzial edo hazkuntza programa baten barruan

sarturik. Ikusi zutenez, enJSRV-18 probirusak askoz maiztasun altuagoa zuen

(%85); enJSRV-7 eta enJS5F16 probirusak laginen %27 eta %30ean topatu ziren,

hurrenez hurren; eta enJSRV-15, enJSRV-16, eta enJSRV-8 probirusak laginen %3-

5ean baino ez ziren azaltzen (1.12B. irudia). Ikerketa honetan gainera, laginetan

independenteki heredatutako sei enJSRV polimorfikoen (enJSRV-18, enJSRV-7,

enJSRV-8, enJSRV-15, enJSRV-16 eta enJS5F16) presentzia edo Absentzia aztertu

zen eta enJSRV hauen konbinaketa desberdinak aztertu ziren, “erretrotipo” deitu

zirenak. R2 erretrotipoa (enJSRV-18ren presentzia soilik), aztertutako populazio

gehienetan erretrotipo nagusia zela frogatu zuten, R4 erretrotipoarekin batera

(enJSRV-18 eta enJSRV-7), historikoki Fenizia izandako eskualdean eta Europa

hegoaldean arrunta zena. Erretrotipo hauetan oinarriturik, ardi populazio

primitiboak deskribatu zituzten (ardi-arraza modernoetan arrunta den enJSRV-18

azaltzen ez zuten populazioak, enJSRV-7 probirusa maiztasun handian azaltzen

zutenak edo enJSRV polimorfikorik azaltzen ez zutenak). Aldiz, ardi-arraza

gehienen erretrotipoak elkarrekin taldekatzen zirela ikusi zuten eta enJSRV-18

probirusa maiztasun handian azaltzen zutela edo populazioan finkatuta agertzen

zela (Chessa et al., 2009).

Beste ikerketa batean, Arnaud eta kideek Jaagsiekte ardi erretrobirusen banaketa

aztertu zuten Caprinae subfamiliako genero desberdinetan (1.12. irudia) (Arnaud et

al., 2007a). Bi probirus (enJSRV-10 eta enJSRV-6) genero gehienetan agertzen

zirela behatu zuten, Ovis eta Capra generoaren banaketaren aurretik txertatu zirela

iradokiz. Hamar probirus Ovis generoko ardien artean komunak ziren, ardi

kanadarra (O. canadensis), Dall aharia (O. dalli) eta argalia (O. ammon) barne. Aldiz,

hiru probirus etxeko ardian eta argalian baino ez ziren azaltzen. Azkenik, enJSRV-

20 ardi kanadarrean, argalian eta etxeko ardian agertzen zen (1.12A. irudia).

2.7.6. enJSRVen adierazpena

enJSRVek paper garrantzitsua betetzen dute ardien garapenean, karenaren

morfogenesian eta JSRV kide exogenoaren blokeoan eta beraz, ardian egindako

adierazpen analisi gehienak erretrobirus honetan oinarritu dira (Arnaud et al.,

2008). Hala ere, analisi gehienak in situ hibridazio probetan (Palmarini et al., 2000)

edo alderantzizko transkripzioko PCRetan (Cousens et al., 1996) oinarritu dira eta

67

oso analisi gutxi daude enJSRVen adierazpena kuantifikatzeko denbora-errealeko

PCR analisiak erabiltzen dituztenak (Qi et al., 2013).

enJSRV locus gehienek genoma akasdunak dituzte mutazioak, delezioak eta

errekonbinazioak pilatzearen ondorioz. Hala ere, 27 enJSRVetatik bostek (enJSRV-

7, -15, -16, -18 eta -26k) antolaketa genomiko osoa dute, gene erretrobiral

guztietarako ORF osoekin.

enJSRV jatorriko RNA baliorik altuenak uteroko epitelio endometrial lumilalean

eta glandularrean topatzen dira, baita obiduktuan eta uteroko lepoan ere (Palmarini

et al., 1996; Spencer et al., 1999; Palmarini et al., 2000; Palmarini et al., 2001b).

Hala ere, baginako epitelioko atze- eta aurre-eskualdean maila baxuagoak topatu

dira eta enJSRV gehienak ardi fetuetan asko adierazten dira. Fenomeno honek

jaiotze osteko patogenesiaren zenbait aspektu azal ditzake (Spencer et al., 2003).

In situ hibridazio bidez ere ikertu da enJSRVen adierazpena ardien fetuetan

(Spencer et al., 2003). Esperimentu hauetan hesteko lamina propriako zelula

linfoideetan eta timoko elkarketa kortiko-medularrean ikusi ziren seinale

positiboak, azken hau izanik T-linfozitoen azken hautespena ematen den lekua.

enJSRVak ehun horietan adieraztearen ondorioz ardiak mota bereko

betarretrobirus exogenoekiko tolerante bilakatu litezkeela proposatu izan da.

Litekeena da horregatik OPArekin gaixotutako ardiek ez aurkeztea JSRVen

aurkako antigorputzik (Sharp & Herring, 1983; Ortin et al., 1998).

In situ hibridazio bidez ardi helduen adierazpenik altuenak uteroan detektatzen dira

baina baita hesteko lamina proprian eta biriketako epitelio bronkioalbeolarrean ere

(Palmarini et al., 2000). Hala ere, alderantzizko transkripzioko PCR proba

sentikorren bidez egindako bestelako ikerketetan, enJSRVen adierazpen maila

baxuak organo ugaritan detektatzen dira, birikak, giltzurrunak, timoa, hezur-

muina, bare, heste erdialdeko bizkar-muin eta leukozitoak barne (Cousens et al.,

1996; Palmarini et al., 1996; Spencer et al., 1999; Palmarini et al., 2000; Palmarini

et al., 2001b).

Azkenik, enJSRV aldaki polimorfiko batzuk II motako zelula albeolarretan

(AECII) adierazten direla frogatu da, zelula hauek JSRV exogenoen itu nagusia

izanik (Viginier et al., 2012). Gainera, aldaki hauen env geneko seinale peptidoak

68

oso paper garrantzitsua betetzen du JSRV exogenoaren sarrera blokeatuz

(Armezzani et al., 2011).

2.7.7. enJSRVen eta ostalariaren arteko ko-eboluzioa

enJSRVek paper garrantzitsua bete izan dute ardiaren eboluzioan. JSRV exogenoen

erreplikazio-zikloa blokeatzeko gai dira eta funtzio garrantzitsua betetzen dute

ardien enbrioiaren eta karenaren morfogenesian (Arnaud et al., 2008). Zenbait

enJSRV probirusek, JSRVa blokeatzeko gai den locus transdominante bat dute eta

hauen erreplikazioa positiboki hautetsia izan da eboluzioan zehar. Gainera, berriki

(duela 200 urte baino gutxiago) enJSRVen locus transdminante honi ihes egiteko

gai diren birus exogenoak sortu dira (Arnaud et al., 2008).

2.7.7.1. enJSRVen papera enbrioiaren garapenean eta karenaren morfogenesian

enJSRVek ezinbesteko funtzioa betetzen dute ardien enbrioi eta endometrioaren

garapenean, peri-inplantazio denboraldian eta karenaren morfogenesi goiztiarrean

zehar batik bat (Dunlap et al., 2005; Dunlap et al., 2006a; Dunlap et al., 2006b).

Ugal-traktuko organoetan enJSRVen RNA ugaritasuna ikusi zenean pentsatu zen

lehen aldiz enJSRVek paper garrantzitsuren bat bete behar zutela utero-karenaren

biologiaren aspekturen batean. Gainera, enJSRVen env produkzioa inhibitzeak

kumaldiaren galera dakar (Dunlap et al., 2006a). Beraz, ardien ugal biologia

enJSRVen env genearen adierazpenaren guztiz menpekoa bilakatu da.

2.7.7.2. enJSRVak murrizketa-faktore modura

enJSRVek JSRV exogenoen erreplikazioa oztopatzen dutela deskribatu da,

erretrobirusaren bizi-zikloaren etapa goiztiar zein berantiarretan. Blokeo goiztiarrak

birus exogenoaren sarrera oztopatzen du hartzaile interferentzia bidez; aldiz,

berantiarrak partikula biralen garraioa eta irteera blokeatzen ditu (1.13 irudia).

Lehen oztopoa enJS5F16 probirusaren env geneak eragiten du. JSRVren hartzaile

zelularra hialuronidasa-2 (hyal-2) proteina da (Rai et al., 2000, 2001), eta JSRV

exogeno patogenikoekin elkar eragiten du birusaren sarrera unean, baina baita env

endogenoarekin ere, mintz zein zitoplasma mailan. Env-Hyal-2 elkarrekintzak JSRV

hartzaile eskuragarritasuna murrizten du zelularen gainazalean, modu honetan

69

birusaren sarrera inhibituz (Spencer et al., 2003). Bigarren oztopoa zenbait enJSRV

locusen (enJS56A1 eta enJSRV-20) gag genearen adierazpenak eragiten du. 2004.

urtean Mura eta kideek JS56A1 partikula endogenoek antolaketa erregularra zutela

deskribatu zuten eta nukleo akasdunen presentzia frogatu zuten talde honetan,

bildutako partikulak zelularen mintzean zehar garraiatzea ezinezko bilakatzen

zutenak. Partikula hauek, hain zuzen, lehen aipatutako Gag proteina dominantea

zuten, exJSRVak oztopatzen dituena.

1.13. Irudia. enJSRVek JSRV exogenoen erreplikazioa blokeatzen dute. enJSRVak adierazten

dituzten zelulak antzeko exJSRVen infekzioen aurrean babestuta daude. Lehen oztopoa env genearen adierazpenaren ondorioa da. Env–Hyal-2 elkarrekintzak (mintzean zein zitoplasman) JSRV hartzaile eskuragarritasuna murrizten du, birusaren sarrera inhibituz. Bigarren blokeoa zenbait enJSRVren (adibidez, enJS56A1 eta enJSRV-20) gag genearen emaitza da. enJS56A1en Gag proteinarekin sortutako partikula biralek ezin izango dute zelulatik ihes egin eta JSRVren irteera inhibituko dute bi probirusak zelula berdinaren baitan adierazten direnean (Palmarini et al., 2000).

enJS56A1ek induzitutako blokeoaren arduradun nagusia erretrobirusaren

matrizeko 21. aminoazidoa da (triptofanoa), nahiz eta C98 eta V102 aldaketek ere

gag endogenoaren aktibitate dominante negatiboa eragiten duten. Transfektatutako

zeluletan enJS56A1 ez da gai partikula biralak sortzeko baina Gag intrazelular

70

kopuru handiak adierazten ditu (Palmarini et al., 2000). Gainera, enJS56A1ek

partikulak askatzeko duen akatsa transdominantea da eta JSRVek partikula biral

osoak sortzea ekiditen du. Ondorioz, partikula biral horiek ezin izango dute

zelulatik ihes egin eta gainera, JSRVen irteera inhibituko dute bi probirusak zelula

berdinaren baitan adierazten badira. Adibide honek ondo erakusten du ERVek

ostalaria antzeko birus patogenikoen infekzioen aurrean babesteko duten gaitasuna

(Mura et al., 2004).

3. Ardien biriketako adenokartzinoma, erretrobirusek eragindako

gaixotasuna

Ardien biriketako adenokartzinoma (OPA) Hego Afrikan deskribatu zen lehen

aldiz, 19. mendean. Ardiei arnasestua eragiten zien gaixotasun modura deskribatu

zen, leku batetik bestera azkar hedatzen zena eta horregatik eman zitzaion

Afrikaans hizkuntzan daukan izena, gaixotasun (=ziekte) ehiztaria (=jaagt) (Tustin,

1969), gaur egun mundu osoan ezaguna bada ere. OPA, jaagsiekte ardi

erretrobirusak eragindako ardien, ahuntzen eta mufloien biriketako minbizia da (De

las Heras et al., 2003). JSRVa erretrobirus guztien artean berezia da, biriketako

desberdindutako zelula epitelialekiko tropismoa azaltzen duelako eta biriketako

adenokartzinoma sortzen duen erretrobirus bakarra delako. Onkogene biralek

onkoproteinak sintetizatzen dituzte, zelula normalak minbizi-zelula bihurtzeko gai

direnak. Hain zuzen ere, onkogene erretrobiral gehienek gene zelularrekin (proto-

onkogeneekin) homologia azaltzen dute.

Askotan OPA gaixotasuna gizakiaren kartzinoma bronkioalbeolarrarekin alderatu

izan da, edo zehatz-mehatz, adenokartzinoma periferikoarekin. Bai OPAn eta baita

kartzinoma bronkioalbeolarrean ere (edo honen hurrengo fasea den

adenokartzinoma periferikoan), lesioak multifokalak izaten dira eta biriketako

kanpoaldean kokatuta azaldu ohi dira; eta minbizi zelulak II motako

neumozitoetatik eta Clara zeluletatik eratorriak izaten dira (Palmarini & Fan,

2001). Are gehiago, JSRVrekin ahaidetutako proteina bat topatu da gizakien

kartzinoma bronkioalbeolarrean (de las Heras, 2000). Ondorioz, ardietan

induzitutako neoplasmen transformaziorako JSRVek erabiltzen dituzten

mekanismo molekularren ikerketak, biriketako kartzinogenesia gidatzen duten

oinarri molekularrak argitzen lagundu lezake.

71

OPA sakonki aztertu egin da azken 100 urteetan eta literatura berrikustean,

denborarekin deskribapen patologikoa gutxi aldatu dela ondorioztatu daiteke (De

las Heras et al., 2003). Modu naturalean kutsatutako animaliari post-mortem azterlan

arrunt bat eginda, biriketan kaltetuta dauden eskualdeak ilunago azaltzen direla

behatzen da (grisak edo morexkak), behintzat gaixotasunaren fase aurreratuenetan.

Hala ere, pleura inguruko gainazal leuna gehienetan osorik mantentzen da (1.14A

irudia). Lesioak zatikatzean tumorearen gainazal pikortsu, gris eta solidoa agertzen

da, fluido apartsu bat jariatzen duena maiz (1.14B irudia).

1. 14. Irudia. OPAren kanpo-itxura. (A) OPA kasu natural bat adierazten da, ardi heldu batean.

Ikusi eskuin birikako lobulua handituta azaltzen dela tumorearen presentziagatik. Birika honetan,

kaltetutako eskualdeak ehun normala baino ilunagoak dira. (B) Birikako ebakia A irudiko geziaren

mailan. Tumore trinko grisa ikusten da, itxura mailakatuarekin, lobuluaren eskualde dortsalean

agertzen den birika normal arrosarekin alderatuta (Griffiths et al., 2010).

1. 15. Irudia. OPAren itxura histopatologikoa. (A, B) OPArekin kaltetutako ardi birikak

hematoxilina-eosinarekin tindatuta. Tumore-nodulu tipikoa azaltzen da, bronkiolo terminal bateko

albeolo distaletan zabalduz. Ohartu foku neoplasikoaren inguruan makrofagoak zabaltzen ari direla,

batzuek zitoplasma, bakuola bilakatu dutelarik. Makrofagoen infiltrazio maila kasuz-kasu aldatzen

da eta baita kasu berdineko nodulu tumoral ezberdinen artean ere. (C, D) JSRV proteinak anti-env

(SU) antigorputz monoklonalarekin markatuta, OPA lesioetan. JSRV SU marka handia ikusten da

mintzaren plasman (D) (Griffiths et al., 2010).

OPAren azterketa histologikoak enkapsulatu gabeko foku neoplasiko bat azaltzen

du, epitelio albeolar eta bronkiolarretik jariatzen dena, alboko egituretara zabaltzen

diren ugaritze papilarioak osatuz (1.15A eta B irudiak). JSRVren kontrako

antigorputzekin immunohistokimikoki markatzen denean birika, transformatutako

72

zeluletan JSRVen presentzia ikusten da (1.15C eta D irudiak) (Palmarini et al.,

1995; Salvatori et al., 2004; Wootton et al., 2006b) eta JSRVetarako hasle

espezifikoekin polimerasaren kate-erreakzioa (PCR) egiten bada, OPA lesioak

azaltzen dituzten laginetan emaitza beti izaten da positiboa (Palmarini et al., 1996).

OPA, 2 hilabeteko arkumeetan zein 11 urteko ardietan deskribatu izan da, nahiz

eta kasu kliniko gehienak 2-4 urteko animaliatan topatu diren (Hunter & Munro,

1983). Gaixotasuna, ardiak dituzten herrialde gehienetan topatu izan da,

salbuespen bakarrenetakoak Zeelanda Berria, Australia eta Falkland Irlak izanik

(1.16. irudia). Gaur egun Islandia ere OPA gaixotasunik gabea da, 1950.

hamarkadatik aurrera gaixotasun hau erradikatzeko programa batean sartu baitzen,

ardi gaixoak sakrifikatuz (Pálsson, 1985). Zeelanda Berrian eta Australian

biriketako tumoreen kasu solteak deskribatu dira baina ematen duenez, ez omen

dute JSRVen infekzioekin loturarik (Dalefield eta Alley, 1988; Hooper eta Ellard,

1995).

1.16. Irudia. OPAren banaketa geografikoa. OPA, ardiak hazten dituzten herrialde gehienetan azaltzen da. OPA deskribatu deneko herrialdeak grisez irudikaturik daude eta beltzez, OPArik gabeko herrialdeak. Zuriz irudikatu diren herrialdeetako OPAren egoera ezezaguna da (Griffiths et al., 2010).

3.1. Kasu-kontrol asoziazio-analisiak

Kasu-kontrol asoziazio-analisiak gaixotasun/infekzio baterako sentikortasuna/

erresistentzia ematen duten aldagai genetikoak identifikatzeko erabiltzen dira.

73

Laginaren eta ikerketan erabiliko den markatzailearen arabera, mota

desberdinetako asoziazio-analisiak daude. Analisi hauek bi talde handitan sailka

daitezke: 1) familiatan oinarritutako diseinuak (pedigriak, ahaide-pareak, guraso-

seme-alaba hirukoteak, familia taldeak); eta 2) familiatan oinarritzen ez diren

ikerketak (kasu-kontrolak, kohorteak) (Cardon & Palmer, 2003). OPA bezalako

gaixotasun konplexuek gehienetan heterogeneitate genetikoa (erresistentzian/

sentikortasunean eragina duten aldagai genetiko ugari) eta multilocus efektua (gene

batek baino gehiagok eragiten du gaixotasunaren garapena) azaltzen dute, baina

ingurugiro faktoreek ere eragina izaten dute gehienetan (Silverman & Palmer, 2000;

Hirschhorn et al., 2002; Goddard et al., 2009).

Kasu-kontroletan oinarritutako asoziazio-analisiak asko erabili dira eragin genetiko

txikiak dituzten sentikortasun locusak identifikatzeko (Hirschhorn & Daly, 2005;

Daly & Day, 2001) eta latxa arrazako ardietan, histobateragarritasun konplexu

nagusiko γ-interferon eta 12p35-interleukina molekuletako zenbait aleloren eta

OPAren arteko erlazioa ikertzeko erabili izan dira (Larruskain et al., 2012a, b).

Asoziazio-analisien helburua, beraz, polimorfismo genetikoen eta gaixotasunen

fenotipoen artean asoziazioa aurkitzea da. Kontrol eta kasuen artean aldakortasun

handia azaltzen duten polimorfismoak topatzen badira, hauek alelo babesgarrien

edo arriskutsuen adierazgarri izan daitezke (Carlson et al., 2004; Balding, 2006).

Ahaidetasunetan oinarritzen ez diren kasu-kontrol hurbilketek diseinurik sinpleena

dute eta abantailen artean, erabilera zabaleko metodologia ezaguna eta laginen

bilketa errazagoa daude. Gainera, familietan oinarritutako hurbilketak baino

eraginkorragoak izaten dira (Cardon & Palmer, 2003).

Hala ere, asoziazio-emaitza positiboak baldintza desberdinen ondorio izan

daitezke: 1) gehienetan polimorfismoa bera da benetan gaixotasunaren eragilea eta

zuzenean eragiten du fenotipoaren adierazpena; 2) zenbaitetan, aldiz, aleloak

aztertutako polimorfismoarekin Lotura Desoreka (LD) azaltzen du; eta (3) gutxi

batzuetan asoziazioa zorizkoa edo artefaktuala da (Silverman & Palmer, 2000;

Cordell & Clayton, 2005).

Estatistikoki esangarria den emaitza, beraz, zorizkoa izan daiteke, nahiz eta oso

probabilitate txikiz. Ondorioz, emaitza faltsuak egiazkoetatik bereizteko, oso

garrantzitsua da baldintzak ondo definitzea (Balding, 2006).

74

3.2. Hitz batzuk ardien ongizatearen inguruan eta OPAren gainean

ikertzearen inguruko etikan

Animalien ongizatea, indibiduoen edo animalia taldeen ongizateaz arduratzen den

kontzeptu zabala da, adierazle legal eta emozionalak, patologikoak eta fisikoak

barneratzen dituena (Frewer et al., 2005; Roger, 2008; Dwyer & Lawrence, 2008).

Animalien ongizatearen inguruko kezka, animaliak ikerkuntza biomedikoan

erabiltzearen arazo polemikoarekin batera garatu zen (www.nuffieldbioethics.org).

Hala ere, animaliak ikerkuntzan erabiltzeari esker egin dira egungo medikuntzako

aurrerapauso garrantzitsuenetako batzuk, gaixotasun kutsakorren aurkako guda

barne. Abeltzaintza, albaitaritza eta ingurugiroa izan dira, besteak beste,

ikerkuntza biomedikoari etekina atera dioten arloak. Baina irabaziak handiak

badira ere, animaliak ezin dira kontrolik gabe erabili eta animaliak erabiltzen dituen

edozein ikerkuntzak ezin du inoiz ahaztu izaki bizidunekin lanean ari dela (Frewer

et al., 2005).

Ikerketa honetan ardiak (baita ahuntzak, mufloiak eta sarrioak ere) erabili ziren,

OPA gaixotasunarekin erlazionatutako erretrobirus endogenoak asoziazio-analisien

bidez ikertzeko asmoz. Abereen artean, ardiak bereziki sentikorrak dira beraien

tamaina, izaera eta indibiduoen finantza-balio eskasa direla eta. Ardien

ongizatearen inguruko ikerketa gutxi egin dira eta beste abere batzuenak baino

beranduago (Dwyer & Lawrence, 2008). Hau azaltzeko bi arrazoi nagusi daude (1)

mendebaldeko herrialdeetan ardien ekoizpena gainontzeko abeltzaintzarekin

alderatuta txikia da; eta (2) ardiak lanerako animalia zailtzat jo dira, ingurune

baldintza gogorrei aurre egiteko dute gaitasunagatik (Webster, 1994; Goddard et

al., 2006; Kendrick, 2008; Dwyer & Lawrence, 2008). Hori dela eta, artaldeetan

gainontzeko animalia taldeetan baino askoz galera handiagoak egoten dira

gaixotasunekin erlazionatutako arazoen ondorioz. Arazo hauen eragin eta

erigarritasun mailak ardien ongizatearen inguruko kezka piztu zuen (Roger, 2008).

Ikerketa honetan prozesu ugari jarraitu dira, horietako batzuk abeltzaintzan

arruntak direnak eta ardien ongizatearekin bat datozenak. Ardien manipulazioa eta

kontrola zenbait prozesuetan beharrezkoa da, esate baterako osasunaren

monitorizazioan eta odol analisietan. Animalia hauek gehienetan belarrietako

etiketa eta tatuaje bidez izendatuta daude, momentuan mina eragin diezaiekeelarik.

75

Hala ere, indibiduoak identifikatzeko gaitasuna ezinbestekoa da animalia

erresistenteenak hautatu nahi direnean. Ikerketa askoren bidez odol laginak

jasotzen dira eta dirudienez, prozedura honek oso kalte txikia eragiten die

animaliei, giza pazienteetan bezala nolabaiteko mina eta estresa eragin badiezaieke

ere (Dwyer & Lawrence, 2008).

Ikerketa honetan erabilitako animaliak artalde pribatu eta esperimentaletakoak dira

eta ondorioz, ugalketarako garraiatuak izan dira edo hiltegietara eramanak.

Garraioa ardientzako oso estresagarria da, familiako animaliengandik bereizten

dituztelako, giltzapean sartu, kargatu eta deskargatu, soinu eta bibraziopean jarri,

espazio txikietan itxi eta bidaia luzeetan ur eta elikagairik gabe garraiatu.

Garraioaren aurretik egiten den bilketak eta manipulazioak ere estresa eragin ohi

die animaliei (Kent, 1997).

OPA gaixotasunaren diagnosiak, post-mortem berrespena behar du eta beraz,

animalien hilketa dakar. Hala ere, gaixotasun hau agertzen denean animaliaren

bizi-kalitatea murrizten da, heriotza saihestezina den puntua arte. Beraz, OPArekin

gaixotutako animalien kasuan eutanasia justifikatuta dago, heriotzak sufrimendua

txikiagotuko dielako eta ongizatea handitu. Orokorrean onartuta dago ongizatearen

izenean animaliak eutanasiatzea (gizakia izan ezik), sendaezina den gaixotasun

batekin kaltetuta daudenean eta euren bizi-kalitateak etorkizun iluna duela

aurreikusten denean. Eutanasia animalien ongizatearen zientzian ikerkuntza arlo

garrantzitsua da eta bere izenak “heriotza ona” esan nahi du, beraz, ez lieke

animaliei inolako kalterik, estresik edo sufrimenduri eragin beharko (Yeates, 2010).

Ikerketarako kontrolak, egoera teoriko idealean, artalde beretik hartu beharko

lirateke, asoziazio-analisietan bat egiten duten laginak edukitzeko. Hala ere,

askotan eztabaidatzen da ia animalia osasuntsuen kasuan heriotza goiztiarra

etikoki zuzena ote den (www.nuffieldbioethics.org). Ikerketa honetan ardi

osasuntsu helduak ere erailak izan dira. Etikoki zalantzagarria bada ere, animalia

hauen patua ardi askok euren bizitza komertzialean zehar gizakiarengandik

sufritzen duten berdina litzateke eta beraz, ez askoz hobea.

76

77

TESIAREN HELBURUAK ETA

LABURPENA

78

79

TESIAREN HELBURUAK ETA LABURPENA

Ardia (Ovis orientalis aries) elementu higikorren ikerketarako animalia-eredu

interesgarria da; bere etxekotzearen historia eta arraza desberdinen eraketa ondo

ezagunak dira (Ryder, 1983). Gainera, Jaagsiekte ardi erretrobirus onkogenikoa

(JSRVa) Ardien Biriketako Adenokartzinomaren (OPAren) eragile nagusia da eta

birus honekin ahaidetutako elementu higikorrak daude txertaturik ardiaren

genoman, enJSRV deiturikoak (Hetch et al., 1996; Palmarini et al., 2001, 2004).

OPA, birusek eragindako ardien gaixotasun arruntenetako bat da eta mundu osoan

zehar agertzen da, askotan maiztasun handiz. Arazo ekonomiko handiak eragiten

ditu baita ardien ongizate eta albaitaritza arazoak ere. Gainera, OPA giza

kartzinoma bronkoalbeolarraren (BAC) eredu modura erabili izan da, biek

baitituzte ezaugarri kliniko, histologiko eta egitura antzekoak. Hala ere, OPAren

kontrola eta ezabapena ia ezinezkoak dira, gaixotutako ardiek ez baitute JSRVen

aurkako antigorputzik azaltzen. Are gehiago, zenbait PCR protokolo garatu izan

dira birusaren detekziorako baina gehienek arazoak azaltzen dituzte, DNA

exogeno eta endogenoak nahasi egiten direlako. Esperimentalki frogatu izan denez,

elementu hauetako batzuek efektu babesgarriak dituzte birus patogeniko

exogenoaren aurrean, bai hartzailearen bidezko lehiagatik edota partikula biralen

askapenak eragindako lehiagatik ere (Palmarini et al., 2004). Gainera, ardiaren

genoman berriki txertatutako enJSRVak ere aurkitu izan dira.

enJSRVek zenbait ezaugarri biologiko dituzte ostalariarekiko harreman

“sinbiotiko” bat iradokitzen dutenak. Berriki frogatu denez, enJSRVak

ezinbestekoak dira ardiaren ugalketarako eta zenbait enJSRV, JSRVaren

erreplikazioarekin nahasten dira in vitro (Arnaud et al., 2007a). Beraz, ardien

betarretrobirusen ikerketa lagungarria suerta daiteke Jaagsiekte erretrobirusak

eragindako neoplasmen sorreran parte hartzen duten mekanismo molekularren

ulermenean.

Gure hipotesiak honako hauek dira: 1) oraindik karakterizatu gabeko enJSRVak

daudela ardiaren eta honekin ahaidetutako espezieen genomatan eta 2) enJSRV

hauek Ardien Biriketako Adenokartzinoma gaixotasunaren edo Scrapie bezalako

gaixotasun prionikoen garapenean eragina izan dezaketela.

80

Beraz, lan honen helburu nagusiak hurrengoak dira:

1. Bilaketa genomiko sakon bat burutzea orain arte deskribatu diren ardien

betarretrobirusak karakterizatzeko eta enJSRV berriak kromosometan mapatzeko,

hauen alboko-geneak eta enJSRV/gene elkarrekintzak identifikatzeko asmoz.

2. enJSRVen aldakortasuna detektatu eta karakterizatzea eta asoziazio-analisiak

burutzea ardi populazio jakin batean, elementu hauek Ardien Biriketako

Adenokartzinomaren (OPAren) patogenesian eragina ote duten ikusteko.

3. enJSRVen adierazpena kuantifikatzea eta metilazio-eredua aztertzea ardi organo

desberdinetan; eta gene erretrobiral jakin batzuen adierazpena ikertzea estres

egoeratan, eta zehatzago, Scrapie gaixotasun prionikoaren garapenean.

4. enJSRV berriak detektatu eta karakterizatzea arraza desberdinetako animalia

osasuntsuetan eta ardiaren genoman agertzen ez diren enJSRV azpi-talde

gehigarriak aurkitzea.

Helburu jakin bakoitza 2, 3, 4 eta 5. kapituluetan sakontasunean landu da.

81

2. KAPITULUA

ARDI BETARRETROBIRUS

ENDOGENOEN (ENJSRVEN)

INGURUNE GENOMIKOA ETA

TXERTATZE INTRONIKOEK

ERAGINDAKO EFEKTU

TRANSKRIPZIONALAK

82

83

2. KAPITULUA

ARDI BETARRETROBIRUS ENDOGENOEN (enJSRVen)

INGURUNE GENOMIKOA ETA TXERTATZE INTRONIKOEK

ERAGINDAKO EFEKTU TRANSKRIPZIONALAK

Maialen Sistiaga-Poveda, Dixie L. Mager, Begoña M. Jugo

Laburpena

Antzinako txertatze erretrobiralen aztarnak ugariak dira ugaztunon genomatan.

Erretrobirus endogeno (ERV) hauek motibo erregulatzaile ugariren eramaileak dira

eta beraz, gene ostalariaren adierazpenean aldaketak eragiteko gai dira. ERVek

geneen erregulazioan betetzen duten paper garrantzitsua geroz eta nabarmenagoa

da eta, hain zuzen, geneen erregulazioaren aldaketa, espezieen eboluzioa

bultzatzen duen faktore nagusietako bat dela uste da. Are gehiago, ko-hautatuak –

edo exaptatuak – izan diren ERV txertaketek geneen patroi erregulatzaile berrien

eboluziorako aukerak sortzen dituzte. Kapitulu honetan, genoma osoko bilaketa

bat burutu zen, Jaagsiekte ardi erretrobirus endogeno (enJSRV) berriak topatzeko

eta hauen alboko geneen izaera identifikatzeko asmoz. enJSRVak kokatzeko bi

hurbilketa desberdin erabili ziren: (1) berriki publikatu den Ardiaren Erreferentzia

Genomaren Muntaketan (OARv3.0) oinarritutako in silico bilaketa bat eta (2)

hurbilketa esperimental bat, Ezabapen- eta Alderantzizko-PCR tekniketan

oinarritutakoa. Guztira, 63 txertatze desberdin deskribatu ziren eta horietatik 59,

lehenagotik deskribatu gabeko kokapenetan azaldu ziren. Txertatzeetatik 22

intronikoak izan ziren eta gehienak zentzu berean orientaturik zeuden, zentzu

zuzeneko txertaketen gain eragin kaltegarriak sortzeko arrisku-faktore bat izan

daitekeelarik hau. Emaitza hauek Ensembl-ko RNAseq datuekin alderatuta,

enJSRV-gene kimera kandidatuen zerrenda bat ezarri genuen eta kimera posible

hauek metilazio analisien bidez aztertu. Ehun arruntetan aktibitate kimerikoa

detektatzerik izan ez bagenuen ere, interesgarria izango litzateke Ardien Biriketako

Adenokartzinomatik (OPA) eratorritako minbizi ehunean ERV-gene kimeren

parekatutako irakurketak ebaluatzea.

Hitz-gakoak

Erretrobirus endogenoak / Jaagsiekte ardi erretrobirusa / Ardien Biriketako

Adenokartzinoma / Geneen erregulazioa / Aldizkako promotoreak

84

1. Sarrera

Artoarekin burutu zuen lan aitzindariaren bidez, Barbara McClintock genoma

eukariotikoak entitate estatikoak ez direla behatzen lehena izan zen, kromosomen

eskualde batetik bestera mugitzeko gaitasuna duten Elementu Higikorrak (TE)

deskribatu baitzituen (McClintock, 1950). McClintocken eta beste zenbaiten lanek

TE aktibitateari lotutako arriskuak agerian utzi zituzten (Kazazian et al., 1988;

McClintock, 1951), eta argi dago TEk fenotipoan aldaketak eragiteko gaitasuna

dutela.

Izan ere, TEk genoma eukariotikoa zenbait modutan eraldatu dute. Ugaztunon

eboluzioan TEk eragin nabarmena izan zuten, dibertsitate genetikoa, hedapen

genomikoa, eduki genomikoa eta berrantolaketa genomikoak helarazi

baitzizkiguten ugaztunoi (Deininger et al., 2003; Hedges & Batzer, 2005).

Gaixotasunak edo fenotipo anormala sortzen duten TE txertaketak gehienetan

geneen barruan ematen dira eta exonen asaldatzea dakarte edo transkripzio

prozesuan akatsak eragiten dituzte intronen barruan kokatuta daudenean

(Kazazian et al., 1988; Maksakova et al., 2006; Lamprecht et al., 2010; Zhang et

al., 2013; Shukla et al., 2013; Kassiotis, 2014). Agian arrazoi hau dela eta, erakutsi

izan da bai LINEak zein LTR elementuak azpi-adierazita daudela genomako

eskualde genikoetan, exonetan emandako txertaketen aurkako hautespena dagoela

iradokiz (Medstrand et al., 2002). Hala ere, Oliver & Greenen TE-ahokatze

hipotesiak dioenez, TEk paper garrantzitsua jokatu dute eboluzioan eta TErik

gabeko espeziek eboluzio estatikoa izango lukete edo desagertu egingo lirateke,

TEk espeziazioan jokatu duten paper garrantzitsua iradokiz (Rebollo et al., 2010;

Oliver & Greene, 2011).

TE-sekuentzien baitan, transkribatzeko beharrezkoak diren motibo guztiak

gordetzen dira: promotoreak, transkripzio-faktoreak lotzeko lekuak, poliadenilazio

seinaleak eta abar. Ostalariaren genomak seinale guzti hauek eta TEn irakurketa

marko irekiak ko-hautatu edo hezi ditzake eta ondorioz, zenbait TEk geneen

adierazpenean eragin dezakete. TEk eragin handia izan dute giza genomaren

eboluzio eta funtzioan, albo-geneak kontrolatzen dituzten sekuentzia

erregulatzaileak helarazi baitizkigute. Prozesu hau TE-exaptazio bezala ezagutzen

85

da eta TEn promotoreen bitartez adierazten diren geneei TE-gene kimera deritze

(Rebollo et al., 2012). Literaturan espezie desberdinetan eman diren TE-

exaptazioaren adibide ugari biltzen dira, zeintzuetan TEak geneen sekuentzia-

erregulatzaile modura diharduten. Adibide hauetako asko C-GATE katalogoan

bildu dira (catalog of genes affected by transposable elements,

https://sites.google.com/site/tecatalog) (Rebollo et al., 2012).

TEn efektu gene-erregulatzailea gene jakinen gainean egindako ikerketen bidez

topatu zen lehenengoz (Brosius, 1999; Makalowski, 2000; Bannert & Kurth, 2004;

Medstrand et al., 2005; Levy et al., 2008; Cohen et al., 2009), baina beranduago,

giza genomaren analisi sistematiko eta konputazionalagoek frogatu dutenez, giza

gene ugarik TEtatik eratorritako eskualde erregulatzaileak dituzte (Jordan et al.,

2003; van de Lagemaat et al., 2003). Hain zuzen ere, Giza Promotoreen Datu

Basean (http://zlab.bu.edu/~mfrith/HPD.html) egindako bilaketek erakutsi

dutenez, eskualde promotoreen %25k TEtatik eratorritako sekuentziak ditu (Jordan

et al., 2003) eta ikerketa desberdinek TEn paper garrantzitsua frogatu dute giza

geneen transkripzioan (Murane & Morales, 1995; Brosius, 1999; Hamdi et al.,

2000; Medstrand et al., 2001; Nekrutenko & Li, 2001; Nigumann et al., 2002). Are

gehiago, berriki egin den 29 ugaztun-genomen arteko konparaketa batean ikusi da

1,1 milioi elementu kontserbatuetatik ia %20 antzinako TEtatik eratorria dela

(Lindblad-Toh et al., 2011), TEk erregulazioan jokatzen duten paper garrantzitsua

indartuz. Metodo konputazionalak sofistikatuago bilakatu diren heinean, TEtatik

eratorritako genomen ehunekoak handitu egin dira (de Koning et al., 2011), eta

beraz, logikoa da pentsatzea gene-promotoreen kopuru handi bat antzinako cis-

motibo erregulatzaileak mantendu dituzten TEtatik eratorri dela. Hala ere,

elementu hauek TE modura ezagutzea zaila suertatzen dela, denborarekin

degradatuak izan direlako.

Ostalariaren egitura genetikoan eta eboluzioan elementu higikor guztiek izan duten

ekarpena asko ikertu bada ere, LTR-erretroelementuen (ERV taldeko elementuak)

gaineko ikerketa espezifikoak mugatuagoak dira. ERVetatik eratorritako

promotoreen bilaketa jarraituari esker, zenbait kasu argitaratu egin dira azken

urteotan zehar (Dunn et al., 2003, 2006; Romanish et al., 2007; Cohen et al., 2009;

86

Lamprecht et al., 2010; Shukla et al., 2013; Lock et al., 2014). Zenbait ikerketek

ERVek giza geneen promotore modura jokatzen duten papera azpimarratu dute

(Britten & Davidson, 1969; Bringaud et al., 2007; Bourque et al., 2008; Brennecke

et al., 2008; Brady et al., 2009; Lock et al., 2014), eta ERV promotoreen garrantzia

ezagutzera eman da RNA ez-kodetzaileen adierazpen eta ama-zelulen

pluripotentzian (Kelley & Rinn, 2012; St Laurent et al., 2013; Lu et al., 2014a; Fort

et al., 2014). Hala ere, ERV sekuentziek giza genomaren transkripzioaren hasieran

egiten duten ekarpena oraindik hautemateke dago.

Antzinako erretrobirusetatik eratorritako sekuentziak ugariak dira ardiaren

genoman eta geneen adierazpenean eragin dezakete. Ardi betarretrobirus

endogenoen (enJSRV) banaketa in situ hibridazio fluoreszente bidez (FISH) aztertu

egin da ardiaren genoman eta gutxienez 28 kromosomatik 15ean kokatzen direla

behatu da, honako hauetan, hain zuzen: enJSRV-8 (3q21), enJSRV-16 (10q24),

enJSRV-18 (11q17), enJS5F16 (15q23), enJSRV-15, enJSRV-20, enJS56A1 (6q13)

eta enJSRV-6 (1q41) (Chessa et al., 2009; Armezzani et al., 2011). Urrats ugariko

gene-ibilketa tekniken bidez, JSRVen txertatze-lekuak ikertu izan dira ardi

osasuntsu eta OPA tumore lerro-zelularretan baina ikusi denez, txertatze-lekuek

zorizko banaketa azaltzen dute (ardien 28 kromosomatik 20ean aurkitu baitziren).

Hala ere, lau tumore desberdinek txertatze-leku bera azaltzen zuten 16.

kromosoman (Cousens et al., 2004). Gainera, JSRVetako bat γ-tirosina fosfatasa

genearen alboan txertatuta azaldu zen (Philbey et al., 2006).

Metodo tradizionalen bidez, erretroelementu polimorfikoen aldakortasun genetiko

osoaren lagin txiki bat baino ez da lortzen (Boissinot et al., 2004). Alderantzizko-

PCR (iPCR) teknika birusen txertatze-puntuak ikertzeko edo elementu higikorren

albo-sekuentziak deskribatzeko asko erabili izan da (Ochman et al., 1988), baina

2000. urtean, ezabapen-PCR izeneko teknika berri bat erabili zen txertatze/delezio

polimorfikoak detektatzeko sekuentziatu gabeko espezieen genomatan, eta albo-

eskualde hauen liburutegi espezifiko bat eratzea baimentzen zuen (Siebert et al.,

1995; Lebedev et al., 2000; Mamedov et al., 2002). Gainera, berriki ardiaren

erreferentzia-genomaren muntaketa argitaratu da (Jiang et al., 2014). Erreferentzia-

genoma honi esker, orain enJSRV sekuentzien banaketa in silico ere azter daiteke.

87

Hurrengo belaunaldiko sekuentziazioak genoma kodetzaileko mutazioen detekzioa

goitik behera eraldatu badu ere (Meyerson et al., 2010; Schweiger et al., 2011),

gene-erregulazioaren gaineko ikerketa oraindik mugatua da (Farazi et al., 2011;

Guil & Esteller, 2012). LTR probiralek dituzten transkripzio-faktoreentzako lotura-

gune potentzialek alboko geneen aktibitate traskripzionala eralda dezakete (Leib-

Mösch et al., 2005). Gainera, zenbait faktoreek ere, besteak beste, txertaketa

erretrobiral intronikoen tamainak edota exon eta intronen tamainak, geneen

transkripzioan eragin dezakete (Zhang et al., 2013). LTRek promotore eta

areagotzaile modura jokatzen dutenean, jatorrizko promotoreen funtzioa asalda

dezakete, nahiz eta 100 kb baino gehiagoko distantziara kokaturik egon

(Bartholomew & Ihle, 1991; Whitelaw & Martin, 2001).

“Epigenomaren” erregulazio eza, DNAren metilazioa barne, egoera kaltegarri

baten adierazgarri izan daiteke, azpitik erregulazio-aldaketa ugari daudela iradokiz

(Timp & Feinberg, 2013) eta polimorfikoak diren ERV kopiek aldakortasun hori

areagotu dezakete, erregulazio epigenetikoaren itu garrantzitsuak baitira (Lippman

et al., 2004; Rebollo et al., 2011). Hain zuzen, proposatu izan da erregulazio

epigenetikoaren funtzioetako bat ERVen aktibitate transkripzionala ezabatzea izan

daitekeela (Levin & Moran, 2011).

Hau guztia aipatuta, ikerketa honen helburuak honako hauek izan dira: 1) genoma

osoko bilaketa sakon bat egitea enJSRV berriak karakterizatu eta mapatzeko; 2)

albo-geneen izaera eta enJSRV/gene elkarrekintzak identifikatzea; eta 3) geneen

adierazpenean eragin dezaketen modulu erregulatzaile berriak topatzea. Helburu

hauek bideratzeko, enJSRV txertaketak mapatu ziren metodo esperimental eta

konputazionalen bidez eta enJSRV horien eta albo-geneen metilazio egoera aztertu

zen ardien ehun desberdinetan.

2. Material eta Metodoak

2.1. Animaliak eta laginak

Birika, barrabil eta hesteetako lagin osasuntsuak Merino arrazako sei ardietatik

hartu ziren hiltegiratze momentuan bertan, Mendiko Abeltzaintza Institutuan

88

(CSIC-León) eta karena laginak Latxa arrazako sei lagin jaioberrietatik hartu ziren

Animalien Produkzio Sailean (NEIKER, Arkaute).

Ardien Biriketako Adenokartzinomarako positiboak ziren birika laginen DNA,

Formalinan Fixatutako Parafinan Txertatutako (FFPE) zortzi ehunetatik erauzi

zen. Lehenengo, laginak 5-8 mikrako zatietan moztu ziren eta hematoxilina-

eosinarekin tindatu, minbizi ehuna eta osasuntsua bereizteko asmoz. Laser Bidezko

Mikrodisekzioz (LCM) ehun tumorala eta ehun osasuntsua espezifikoki banatuak

izan ziren eta etanoletan gorde ziren. OPA ehuna modu arrakastatsuan isolatu zen

(2.1. Irudia).

2.2. DNAren erauzketa

Ehun osasuntsuetako DNA fenol:kloroformo metodo tradizionalaren bidez erauzi

zen. Aldiz, FFPE ehunetako DNA erauzketa, deskribatutako protokoloei jarraiki

burutu zen (Kotorashvili et al., 2012). Laburbilduz, ehunak 1 ml xileno bidez

desparafinatuak izan ziren %100 eta %75 etanolez garbituak, hurrenez hurren.

Laginak PBSrekin garbitu ziren 15 minutuz eta lisi tanpoiaren 500 µl gehitu

zitzaizkien (50 µl proteinasa K 20 mg/ml, 1 M Tris-HCl soluzioa 10 µl, 0,5 M

EDTA 2 µl, %10 SDS 100 µl, eta 838 ml ur destilatu), 52ºC-ra inkubatuz, zatiak

guztiz disolbatu ziren arte. Ondoren, erauzketa eta garbitze urrats gehiago jarraitu

ziren 500 µl fenol:kloroformo:isopropanol alkohola gehituta (Invitrogen, Life

Technologies; Carlsbad, CA) 25:24:1 proportzioan, laginari argizaria kentzeko.

Hauspeakina %75 etanolez garbitu zen. Hala ere, FFPE ehunetatik eratorritako

DNA ezin izan zen metilazio analisietan erabili, lortutako kontzentrazio txikien

ondorioz.

2.1. Irudia. OPA ehunen hematoxilina-eosina tindaketa. A) Irudian gorriz inguratuta agertzen da tumorea eta B) irudian Laser Mikrodisekzioaren bidezko mozketa. Tumore-nodulu tipikoa azaltzen da, bronkiolo terminal bateko albeolo distaletan zabalduz.

A B

89

2.3. enJSRVen detekzio esperimentala

2.3.1. Ezabatze-PCRa

JSRV endogenoen 5’-LTRaren alboko sekuentzia batzuk ezabatze-PCRaren bidez

anplifikatuak izan ziren (Siebert et al., 1995; Lebedev et al., 2000; Mamedov et al.,

2002). Teknika honek lau urrats nagusi ditu: (1) itu-sekuentziak murrizketa-

entzima bidez digeritzen dira, (2) moztutako sekuentziak tamaina desberdinetako

egokitzaile pare batekin ligatzen dira, (3) egokitzailea duten eskualdeen ugaritzea

burutzen da, eta (4) anplikoien liburutegiak eratzen dira. Egokitzaileak dituzten

eskualdeen PCRa bi hasle bikoteekin burutzen da: A haslea, egokitzailearekiko

osagarria dena, eta T haslea, itu-sekuentzian osatzen den begiztarekiko osagarria

dena. Beraz, teknika honek sekuentzia ezagun baten albo-sekuentzia ezezaguna

anplifikatzea baimentzen du (Siebert et al., 1995; Lebedev et al., 2000; Mamedov et

al., 2002).

Egokitzaileak soilik eraginkorrak dira aztertzen den genomak ez badu hauekiko

sekuentzia homologorik (I. Mamedov, komunikazio pertsonala), beraz, BLAST

bilaketa bat burutu genuen egokitzaileen sekuentzia ardiaren genoman ez zegoela

ziurtatzeko. Erabilitako mozketa-entzimek ez zituzten enJSRVen LTRak mozten

baina era berean, mozketa-leku arruntak zituzten, enJSRVen barruko aldearen zein

aldameneko sekuentziaren mozketa baimentzen zutenak. Entzima hauek

aukeratzeko, Bioteknologiako Informaziorako Zentro Nazionaletik (NCBI)

lehendik deskribatutako enJSRV sekuentziak lortu ziren (GenBank sarbide

zenbakiak: AF136224, AF136225, AF153615 eta EF680296-319) eta WebCutter

2.0. bertsioarekin aztertu (Heiman, 1997). Guztira, bost mozketa-entzima aukeratu

ziren: VspI, DraI, MspI, TspRI eta BsmAI.

Ezabatze-PCR teknikarako A eta T hasleak erabili ziren (Mamedov et al., 2002;

2.1. Taula). LTR hasleak (Chessa eta kideek (2009) diseinatutakoa eta LTRR

deitutakoa) 5’-LTRaren albo-sekuentzia eta 5’-LTRa bera anplifikatzen ditu,

hurrenez hurren (ostalariaren alboko DNA sekuentzia genomikoak barne). PCR

nahasketak ligatuaren 10 ng zituen 25 µl-tan, 1µl Advantage 2 PCR tanpoiarekin

(BD Biosciences, Clontech) 200 mM dNTP, 0,4 mM hasle bakoitzetik eta 50 µl-ko

Advantage 2 polimerasa nahasketatik (BD Biosciences, Clontech) 0,5 µl. PCRa

90

hurrengo baldintzetan burutu zen: 72ºC 4 min; 95ºC 25 s, 65ºC 25 s eta 72ºC 25 s-

ko 23 ziklo, eta amaierako elongazio urratsa 72ºC 30 min, 3’-A-poli-isatsaren

presentzia ziurtatzeko. Lortutako PCR produktuak PureLink erauzketa kitaren

bidez (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) purifikatuak izan ziren, xingola

desberdinak tamainaren arabera banatzeko. Azkenik, hauek ur esteriletan

hauspeatu eta disolbatu ziren.

2.3.2 Alderantzizko PCRa (iPCR)

iPCR teknika DNA mozketa-entzimekin digeritzean datza, moztutako produktuen

zirkularizazioa ematen da eta azkenik, alderantzizko zentzuan orientatutako hasle

batzuekin anplifikatu. Kasu honetan ere, zirkularizatutako harizpi batean

alderantzizko hasleak erabilita, ezaguna den eskualde baten albo-sekuentzia

ezezaguna anplifikatu daiteke in vitro (Tsuei et al., 1994).

iPCR teknika burutzeko, lehendik deskribatutako hasleak erabili ziren (Chessa et

al., 2009) baina kontrako norabidean sintetizaturik (hau da, hasle zuzena

alderantzizko haslea balitz bezala eta alderantzizko haslea zuzena balitz bezala).

Norabide arruntean sintetizatu ziren hasle bakarrak LTRarekiko osagarriak zirenak

izan ziren. ProvR_R eta ProvF_R (Chessa eta kideek (2009) diseinatutakoak eta

ProvR eta ProvF deitutakoak) 5’- eta 3’-LTRen albo-sekuentziak anplifikatzen

zituzten, hurrenez hurren. Aldiz, LTRR eta LTRF hasleek LTRa bera anplifikatzen

zuten. Hasle guztiak enJSRV-18 anplifikatzeko moduan diseinatu ziren,

intsertzionalki polimorfikoa bada ere, Latxa arrazan ia guztiz finkatuta agertzen

baita (Chessa et al., 2009). Erabilitako mozketa-entzimak, ezabatze-PCR-rako

erabilitakoen berdinak izan ziren.

PCR nahasketak ligatuaren 10 ng zituen 25 µl-tan, 1µl Advantage 2 PCR

tanpoiarekin (BD Biosciences, Clontech) 200 mM dNTP, 0,4 mM hasle

bakoitzetik eta 50 µl-ko Advantage 2 polimerasa nahasketatik (BD Biosciences,

Clontech) 0,5 µl. iPCR-rako kontrol positibo moduan, hasleak honela konbinatu

ziren: ProvR_R eta 5’-FlankF_R hasleak 5’-LTRaren albo-sekuentzia

anplifikatzeko; eta ProvF_R eta 3’-FlankR_R hasleak 3’-LTRaren alboko eskualdea

anplifikatzeko.

91

PCRa hurrengo baldintzetan burutu zen: 95ºC 1 min; 95ºC 15 s, 65ºC (5’-LTR

eskualderako) edo 60ºC (3’-LTR eskualderako) 15 s eta 72ºC 30 s-ko 35 ziklo, eta

amaierako elongazio urratsa 72ºC 30 min.

1. Taula. PCRa burutzeko beharrezko oligonukleotido hasleak eta egokitzaileak (A eta T hasleak). Egokitzaileak eratzeko hasle guztiak eta hauen osagarriak (A hasleak), aurretik deskribatuta zeuden (Mamedov et al., 2005). LTRarekiko osagarria zen T haslea Chessa eta kideek diseinatua izan zen (Chessa et al., 2009) eta azkenik, ikerketa honetan Alderantzizko Traskriptasarekiko (RT) osagarria zen haslea diseinatu zen.

Ezabatze-PCRa

Egokitzaileak eratzeko hasleak

12 egokitzailea Luze12 – TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT Motz12 – ACCGCCCTCC

34 egokitzailea Luze34 - AGCAGCGAACTCAGTACAACAAGTCGACGCGTGCCCGGGCTGGT Motz34 – ACCAGCCC

56 egokitzailea Luze56 – GTAATACGACTCACTGGAGGGCGAGCGTGGTCGCCGCCGAGGTG Motz56 – CACCTCGGC

A hasleak (zuzena)

A12 - AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT LTR -GTAGTGGCGAGGAAAACTGTCGAGC

T hasleak (alderantzizkoa)

A34 - AGTCGACGCGTGCCCGGGCTGGT A56 - GTAATACGACTCACTGGAGGGC RT - TAACACTTTGCCGTGCAGCTTCA

Alderantzizko-PCRa iPCRko hasleak LTR_F: CTCCGTTCTCTCCCTGTGCAGGTG

LTR_R: AGACAAAAGATGGGGTTGAGAGGATCA

2.4. enJSRVen eta hauen txertatze-lekuen in silico azterketa

Lan honetan esperimentalki anplifikatutako enJSRV kopien luzera laburregia

izanik, aurretik deskribatutako enJSRVen sekuentzia osoetan oinarritu genuen

mapaketa (GenBank sarbide zenbakiak: AF136224, AF136225, AF153615 eta

EF680296-319) (Palmarini et al., 2000; Arnaud et al., 2007). Estrategia hau

sekuentzien antzekotasunean oinarritu zen eta lehendik sekuentziatutako

enJSRVak bilatu ziren. Gene segmentu homologoak ardi kromosoma bakoitzean

bilatu ziren (GenBank sarbide zenbakiak: CM001582-CM001608), BLAST

lerrokapen erreminta erabiliz (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Ez genuen Ardien

Erreferentzia Genomako BLAST funtzioa erabili, bilaketaren luzera 2000 bp-ra

mugatuta baitzegoen, eta soilik bilatutako probirusaren luzera berdineko sekuentzia

homologoak onartu baitziren. Lortutako sekuentzia homologoak orduan input

modura erabili ziren Ardien Genomako Nabigatzailean, hauen albo-sekuentziak

ezagutzeko helburuz. Albo-geneen karakterizazio funtzionalerako Gene Ontology

(GO) Partzuergoa (geneontology.org) erabili zen. Hala ere, ardiaren genoma ez zen

GO oharpenen artean agertzen eta bilaketa Bos taurusen oharpenen aurka egin zen.

92

2.5. ERV-gene kimeren in silico azterketa

Publikatutako RNAseq datuak ardien Ensembl!-tik (www.ensembl.org/Ovis_aries)

eskuratuak izan ziren (Flicek et al., 2014) eta transkribatutako enJSRV sekuentzien

parekatutako bukaera irakurketak lehertuz identifikatu ziren. Gene kandidatu

adierazgarriak lortzeko asmoz, soilik hurrengo baldintzak betetzen zituzten

enJSRVak aukeratu ziren: 1) genearekiko zentzu berean txertaturik egotea; 2)

hurbileneko exondik <10 kb-ko distantziara eta 3) <10 kb-ko intron baten baitan

(Zhang et al., 2013). Gene kandidatuen azken zerrenda eskuz birpasatua izan zen,

exonizazioak, trunkatzeak eta definitu gabeko kasuak ekiditeko eta zazpi enJSRV

potentzialeko zerrenda bat lortu zen. Horietatik hiru gene kandidatu hautatu ziren,

Genome Browsereko profilean, funtzioan eta minbiziarekin izan zezaketen

inplikazio potentzialean oinarrituz.

2.6. enJSRVen eta albo-geneen bisulfito-sekuentziazioa

Hurbilketa esperimental eta konputazionalen bidez aurkitutako albo-geneen

metilazio egoera bisulfito-sekuentziazio bidez aztertu zen, aldizkako promotore

moduan ziharduten enJSRVetatik eratorritako sekuentzia erregulatzaileak

identifikatzeko asmoz. Laburki, DNAren bisulfito bihurketa egin zen EZ DNA-

metilazio kita erabilita (Zymo Research), ekoizlearen protokoloari jarraiki baina

hurrengo eraldaketarekin: DNA genomikoa CT bihurtze erreaktiboarekin 4 orduz

inkubatu zen 50ºC-tan, 95ºC-tako pultsuak aplikatuz 15 minuturo. Bihurtutako

DNA, 20 µl eluzio tanpoia erabilita eluitu zen eta Metilazio-espezifikoa den PCR-

rako (MS-PCR) 2 µl erabili ziren. MS-PCRa metilatu gabeko zitosinen bisulfito

bihurketan oinarritzen da eta CpG nukleotidoetarako osagarriak diren hasleak

diseinatzen dira (2.2. Taula). MS-PCRa hurrengo baldintzetan burutu zen HotStar

Taq DNA polimerasa (Qiagen) erabilita, ekoizleak gomendatutako gidalerroak

jarraituz: 94ºC 5 min, 94ºC eta 30 s 40 ziklo, hasleen araberako epeltze tenperatura

desberdinak eta 72ºC 1 min. Erreakzio guztietan 10 minutuko luzapen urrats bat

gehitu zen. Produktuak gel elektroforesi bidez aztertu ziren eta MiniElute (Qiagen)

bidez purifikatu. Azkenik, purifikatutako produktuak TOPO-TA bektorearen baitan

klonatu ziren eta One Shot TOP10 Escherichia coli zeluletan (Invitrogen) hazi.

93

Sekuentziak alderantzizko eta zentzuzko hasleak erabilita sortu ziren BigDye v.3.1

(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sekuentziazio kitaren bidez, edo

GTPBigDye (Applied Biosystems) sekuentzia zailen kasuan. Analisietan erabilitako

sekuentzia guztiek metilazio patroi bakarrak azaltzen zituzten edo C-T ez-bihurtze

errore bakarrak (gainontzeko Cak ez ziren CpG dinukleotidoen menpekoak)

bisulfito bidezko tratamendu ostean. Honek molde beretik eratorritako PCR-

anplifikatuak kontutan hartzea saihesten du. Sekuentzia guztiek > %95ko bihurtze-

ratioa azaltzen zuten. Sekuentziak doako Quma programarekin aztertu ziren

(Kumaki et al., 2008).

2.2. Taula. Bisulfito-sekuentziaziorako erabilitako oligonukleotido hasleak, 2.4. Irudiko hiru enJSRV-gene kimerak aztertzeko erabili zirenak.

3. kromosoma ERV3_F: TTGTTTGTATTTATAAGGTTGTGGTTT ERV3_R: TAAAAAACCAAAAACAAACTTCCTC GKN2_F: GGGAATTTGAAGTTTAATTTTTTTT GKN2_R: CACATATCCTATATCTCCTACCTTCC

8. kromosoma

ERV8_F: ATTTTTTAGTGTGAAGGGAGGTTAT ERV8_R: CCATTTAAAACTAATCCTCTCAACC RARS2_F: AGTTTTGGATTTTTTAGTTGGAATT RARS2_R: AAAATTCACCTACTCAAACACCTTC

19. kromosoma

ERV19_F: ATTGTATTTTTTTTGGGGAATTAAG ERV19_R: CCAACCCAACATTTCACATAATATAC TMIE_F: TTTAGGGTAAAAGAAAGGGAAAAAT TMIE_R: AACTCCTTCAAAAACCTTCTATCAC

3. Emaitzak

3.1. Txertatze paisaia

OARv3.0 Ardien Erreferentzia Genoma Muntaketa erabilita, aurretik

deskribatutako enJSRV kopiak mapatu genituen eta ardien kromosoma guztietan

aurkitu ziren, 22. kromosoman izan ezik. Bost kopiek antolaketa genomiko tipiko

osoa azaltzen zuten, erreplikatzeko gai diren JSRV exogenoen berezkoa den gag,

pro, pol, orf-x eta env geneekin. Hala ere, gainontzeko 51 txertatzeak LTR-bakarrak

ziren edo gene gehienak faltan zituzten.

Sekuentzia probiral osoen edo >1000 bp-koen artean (LTRaren tamaina ~800 bp-

koa da), aurkitutako enJSRV kopiarik arruntena enJSRV-20 izan zen, 9 kopia

azaldu zituelarik 6 kromosomatan zehar barreiaturik. enJS56A1 ere oso hedatuta

azaldu zen, bi kromosoma desberdinetan azaldu zituelarik kopiak. Azkenik,

enJS5F16ren kopia bakarra aurkitu genuen 15. kromosoman, enJSRV-14ren kopia

94

bakarra 19. kromosoman eta enJSRV-5en kopia bakarra 20. kromosoman (2.2.

Irudia, 1. Irudi gehigarria). enJSRV-14 eta enJS5F16 izan ziren in silico aurkitutako

enJSRV polimorfiko kopia bakarrak.

Txertatze-lekuak lehendik deskribatutakoekin alderatu genituenean (Carlson et al.,

2003; Chessa et al., 2009; Armezzani et al., 2011), berriki txertatutako eta beraz,

polimorfikoak izan zitezkeen enJSRV gehienek txertatze-leku desberdinak azaltzen

zituztela behatu genuen edota ez zirela OARv3.0-an agertzen (2.2. Irudia, 1. Irudi

gehigarria). Esate baterako, 10. kromosoman enJSRV-16ren kopia bat txertaturik

dago (Chessa et al., 2009) eta guk ez genuen horrelakorik topatu. Lehendik

deskribatutako (Carlson et al., 2003; Chessa et al., 2009; Armezzani et al., 2011)

txertatze-lekuekiko desberdintasunak ere 1, 2, 3, 4, 14 eta 18. kromosomatan topatu

ziren. Hala ere, zenbait enJSRV kopia lehendik deskribatutako kokapenetan ere

topatu ziren 6, 11 eta 15. kromosomatan, hain zuzen, gure emaitzak balioetsiz (2.2.

Irudia, 18, 27, 39 eta 40. zenbakiak).

3.2. enJSRVen albo-sekuentzien ingurune genomikoa

Hiru metodologia independente erabili ziren ardi enJSRVen ingurune genomikoa

aztertzeko: bi metodo esperimental (Ezabatze- eta Alderantzizko-PCRak) eta

OARv3.0 Ardien Erreferentzi Genomaren muntaketan oinarritutako metodo

konputazionala (ikusi material eta metodoak).

Ezabatze-PCR eta iPCRko klonetatik lortutako 98 sekuentzien artean soilik 32 izan

ziren nahikoa luzeak edo izan zuten enJSRVen alboko-sekuentziak identifikatzeko

adina informazio. Hala ere, lortu genituen albo-sekuentzietatik batzuk, aurretik

deskribatutakoekin bat zetozen (Carlson et al., 2003; Chessa et al., 2009;

Armezzani et al., 2011), gure emaitzen sinesgarritasuna frogatuz. Metodo

konputazionalen bidez 61 albo-sekuentzia sortu ziren eta beraz, hurrengo analisiek

enJSRVen albo-sekuentzia barneratu zituzten. Lortutako sekuentzien luzera 97 bp

eta 5 kb artekoa izan zen (azken hau konputazionalki lortutako sekuentzien artean).

Sekuentzia guztiak BLAST erremintan lerrokatuak izan ziren: luzeenak

(konputazionalki lortutakoak) hautatu ziren eta esperimentalki lortutakoak hauek

gainjartzen ote zituzten ikusi zen. Esperimentalki lortutako 32 sekuentzietatik soilik

95

2.2. Irudia. enJSRV kopien banaketa kromosomikoa. Zenbaki batekin adierazitako xingolak lan honetan topatutakoak dira eta zenbaki bakoitzak 1. Irudi gehigarriari erreferentzia egiten dio. Lehenagotik deskribatutako enJSRV kopiak Ca, Ch eta A izendatu dira (Carlson et al., 2003; Chessa et al., 2009 eta Armezzani et al., 2011,

hurrenez hurren). Ikusi in silico bilaketan ez zela enJSRV kopiarik topatu 22. kromosoman.

1

2 3

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18 19

20

21

22

23

24

25 26 27

28

29 30

31

32

33 34

35 36

37 38

39 40

41

42 43 A

Ch

A

A Ch

Ch

Ch

Ch

Ca

Ca

4

Ca Ca Ca

Ca

44

45

46

47

48 49 50 51 52

53

54 55

56

57

58

59

60

61

96

bi izan ziren Erreferentziazko Genomatik lortutakoen desberdinak (1. Irudi

gehigarria): Oxido Nitriko 3-Sintasa (NOS3) eta Prion-proteina (PRNP), 4. eta 13.

kromosomatan, hurrenez hurren. NOS3ren eraldaketak minbizirako arriskuaren

igoerarekin asoziaturik daude (Zhang et al., 2014) eta PRNPren aldagai alelikoek

Scrapie gaixotasunerako arriskua gehitzen dute Zipreko ahuntzetan (Ortiz-Pelaez et

al., 2014).

enJSRV kopia bakoitzaren 5-kb ur-gora eta ur-behera lortutako sekuentziak

lerrokatzean, kopien %65 eskualde ez-kodetzailean kokatuta azaltzen zirela behatu

genuen, %35 intronikoa zen bitartean (2.3. Irudia). enJSRVekin harremana zuten

geneek ezaugarri komunik azaltzen ote zituzten ikusteko, Gene Ontology (GO)

erabili zen Babelomics programaren bidez (Al-Shahrour et al., 2006). Hala ere, GO

datu-basean ez zen ardiaren informaziorik agertzen (behiaren oharpenak erabili

ziren analisi honetarako) eta gene-kopuru txikia kontutan hartuta, ez zen emaitza

adierazgarririk lortu.

2.3. Irudia. Aurkitutako enJSRVen izaera. Ohartu enJSRV gehienak eskualde ez-kodetzaileetan topatu zirela,

soilik % 35 izanik intronikoa.

3.3. Usteko enJSRV-gene kimeren identifikazioa

enJSRV-gene kandidatu kimerikoak, geneen transkripzioa eraldatzeko arrisku-

faktore nagusiak azaltzen zituztenen zerrendatik hautatu ziren (Zhang et al., 2013):

geneen orientazio bera, hurbileneko exondik <10 kb distantzia eta <10 kb-ko

intronetan txertaturik egotea. Hiru faktore hauek kontutan hartuta, enJSRVen

%41,9 geneekiko orientazio berdina azaltzen zuela behatu genuen, %19

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ez-kodetzailea Kodetzailea

Alderantzizko zentzua

Zentzu zuzena

97

hurbileneko exondik <10 kb distantziara zegoen eta %11 <10 kb-ko intronetan. Are

gehiago, zazpi sekuentzia erretrobiralek hiru arrisku-faktoreak azaltzen zituzten

batera.

Zazpi enJSRV hauek irakurketa kimeriko parekatuetarako bahetu ziren Ensembl!-

ko RNAseq datuak erabilita, irakurketetako bat ERV bati zegokiolarik eta bestea

albo-genearen exonari. Analisian transkribatutako hiru enJSRV-kimera identifikatu

ziren, zeinetan enJSRVak promotore funtzioa burutzen zuela ematen zuen eta

gene-kodetzaileekin elkarrekintzak izan (2.4. Irudia). Geneak honakoak izan ziren:

2-Gastrokina (GKN2), gene honi Epstein-Barr birusa lotzen zaio desregulazio

epigenetikoa eraginez eta ondorioz, minbizi gastrikoaren garapena erraztuz (Lu et

al., 2014b); Arginil-tRNA 2-sintetasa (RARS2), entzefalopatia eta hipoplasia

pontozerebelarrekin lotura duena (Cassandrini et al., 2013); eta Barruko Belarriko

Mintzartekoa (TMIE-201), kokleako esterozilioen garapenerako beharrezkoa dena

(Gleason et al., 2009).

2.4. Irudia. Ardien Ensembl! programatik (www.ensembl.org) moldatutako irudia hiru enJSRV-gene kimera kandidatuetarako, parekatutako irakurketa adierazgarriak erakutsiz. enJSRVen bidea RepeatMaskerretik eraldatua izan da (Smit et al., 2004).

19. kromosoma

Ardien biriketako RNAseq

Aharien barrabiletako RNAseq

enJSRV

8. kromosoma 49.48 Mb 49.49 Mb 49.50 Mb 49.51 Mb 49.52 Mb 49.53 Mb 49.54 Mb 49.55Mb

Ardien biriketako RNAseq

RARS2

enJSRV

ANTXR1 GKN2

TMIE-201

enJSRVLTR

52.68Mb 52.69Mb 52.70Mb 52.71Mb

3. kromosoma

98

3.3. enJSRV-gene kimera kandidatuen metilazio analisiak

Hiru enJSRV kandidatuen eta albo-geneen berezko promotoreen metilazio-mailak

aztertu genituen, metilazio-maila aktibitate kimerikoarekin bat zetorren ikusteko 12

ehun osasuntsuetan (ez zen OPA minbizi ehunik anplifikatzea lortu).

8. kromosomako probirusa ez zen 12 laginetatik bakar batean topatu. Aztertutako

egoeran, GKN2 eta TMIE-201 geneen alboko enJSRVen promotore erretrobiralak

ehun guztietan sakonki metilatuta agertu ziren, karenean izan ezik (2.5. Irudia).

Hala ere, gene hauen berezko promotoreak hipometilatuta zeuden ehun honetan,

adierazpen kimeriko eza iradokiz.

enJSRV GKN2

2.5. Irudia. 3. eta 19. kromosometako promotore probiralen eta albo-geneen DNA-metilazio-maila, hurrenez hurren. Eskualde kandidatuen DNA-metilazio egoera bisulfito-sekuentziazioaren bidez konfirmatu zen lau ardi ehunetan. Zirkulu beltzek metilatutako CpGak adierazten dituzte eta zuriek, aldiz, metilatugabeak. Ilera bakoitzak klon independente bat adierazten du.

4. Eztabaida

Lan honetan, enJSRVen eta hauen albo-geneen arteko elkarrekintzak aztertu ziren

bi hurbilketa desberdin erabilita, ardien erreferentzia genomaren muntaketan

oinarritutako in silico hurbilketa; eta Ezabatze- eta Alderantzizko-PCRetan

oinarritutako hurbilketa esperimentala. Teknika esperimentalak erabilgarriak

suertatu ziren enJSRVen alboko-geneen detekziorako eta in silico lortutako

sekuentziez gain, bi txertaketa berri ere topatu ziren hurbilketa esperimentalak

Bar

r.

Hes

. B

irik

. P

laz.

TMIE-201 enJSRV

Bar

r.

Hes

. B

irik

. P

laz.

99

erabilita, polimorfikoak izan daitezkeela iradokiz. Hala ere, Ezabatze- eta

Alderantzizko-PCRen bidez, enJSRV kopien identifikazioa zaila suertatzen da,

probirusaren zati bat baino ez delako anplifikatzen. Edonola ere, probirusaren

identifikazioa ardien erreferentziazko genoma erabilita burutu zitekeen.

ERV sekuentziek kokapen berrietara ‘salto’ egiteko gaitasuna dutenez,

berrantolaketa desberdinak eragiteko gai dira transposizio eta errekonbinazioen

bidez eta beraz, elementu higikorrak orokorrean eta ERVak bereziki, eboluzio

iturria dira, gene-familien dibertsifikazio funtzionala gidatzen baitute (Deininger et

al., 2003).

Gure enJSRV kopien analisiak, elementu komunak ezagutzera eman zituen

ardiaren genoman, hauetatik batzuek gene eta domeinuekin homologia handia

azaldu zutelarik. Are gehiago, sekuentzia hauetatik batzuk, lehendik Carlson eta

kideek (2003) deskribatutakoak ziren, gure emaitzak balioetsiz. Litekeena da ERV

hauen transposizio eta birtxertatze prozesuan zehar, aurreko itu-guneetako

sekuentzia laburrak moztu izana eta kokapen berrietan txertatu. Gainera,

enJSRVek alderantzizko-transkriptasa kodetzeko duten gaitasunari esker azal liteke

zergatik agertzen diren albo-sekuentzia hauek bi zentzuetan orientaturik.

enJSRVen kokapena kromosomen baitan aztertu zenean, OARv3.0 ardiaren

genomako enJSRV kopiarik arruntenak enJSRV-20 eta enJS56A1 zirela behatu

genuen, hain zuzen, Gag poliproteina akasduna dutenak Jaagsiekte erretrobirus

exogenoaren (exJSRV) erreplikazio-urratsak oztopatuz (Armezzani, 2011). enJSRV

polimorfiko asko agertu ez izanak bi azalpen posible izan ditzake: (1)

sekuentziatutako genomarako erabili diren Texel arrazako bi animalia horiek (Jiang

et al., 2014), benetan ia kopia polimorfikorik ez edukitzea izan daiteke, aurkitutako

enJSRV-14 eta enJS5F16z gain; edo (2) erreferentzia-genoma honen anotazioa

oraindik ere burutzen ari denez, izan daiteke birusen karakterizazioa oraindik

guztiz egokia ez izatea. Azken hau bada kasua, lan honetan deskribatutako

kokapen-lekuak egokiak izango lirateke baina ezingo genuke ziurtasun osoz esan

zein enJSRV kopia espezifiko dagoen leku bakoitzaren baitan txertaturik.

Lan desberdinek emaitza eztabaidagarriak lortu dituzte ERVen orientazioari

dagokionean. TEn alderantzizko txertatzea gizaki (van de Lagemaat et al., 2003),

sagu (van de Lagemaat et al., 2003) eta txakurren (Barrio et al., 2011) intronetan

100

deskribatu da; gizakiotan LTRen alderantzizko txertatzeak intronetan behatu dira

batez ere (Medstrand et al., 2002), exonetatik hurbil dauden elementuetan (Zhang

et al., 2011) baina hegaztien genomatan, ERV txertatze gehienak zentzu zuzenean

topatu dira (Bolisetty et al., 2012). Hala ere, giza eta saguen LTR elementu

aldakorrek ez dute inolako lehentasunik azaltzen (Nellaker et al., 2012).

Lan honetan aurkitutako ERVetatik %58,1 alderantzizko zentzuan orientaturik

azaldu zen. Aurkikuntza hau Bos taurusen lortutako emaitzekin bat dator (Almeida

et al., 2007; Garcia-Etxebarria & Jugo, 2014), espezie horren ERVen %52,49

alderantzizko orientazioan topatzen baita. Behirako iradoki izan denez, aurkako

hautespen presioa dago txertatze zuzenengan eta hautespenaren erlaxazioa adierazi

lezake pseudogeneetako txertatzeengan (Garcia-Etxebarria & Jugo, 2014).

Azkenik, ardiaren gene zelularren promotore modura jardun zezaketen enJSRV-

LTR kasuak berrikusi ziren ardiaren erreferentzia genoman. Joerarik arruntena

LTRek gidatutako adierazpen kasuetan, berezko promotorearen funtzioa islatzea

da eta beraz, efektu txikia dute genearen adierazpen mailan. Gizakiotan deskribatu

izan dira LTRa exaptatu izan deneko kasuak, promotore nagusia bilakatuz (Britten

& Davidson, 1969; Bringaud et al., 2007; Bourque et al., 2008; Brennecke et al.,

2008; Brady et al., 2009) baina adierazpen patroia saguek dutenaren berdina da.

LTRek gidatutako adierazpen patroi berriak gehienetan karenera mugatuta daude

(Taruscio & Mantovani 2004; Seifarth et al., 2005; Blikstad et al., 2008; Cohen et

al., 2009). Lan honetan ere hipometilatutako enJSRVak topatu genituen karena

laginetan. Hala ere, berezko promotorearen metilazio egoera aztertu genuenean

hipometilazio sakona behatu genuen, adierazpenaren gidari nagusia hau zela

iradokiz. Hala ere, ehun panel hau gaixotasun egoera desberdinetan aztertzea

litzake egokiena, ehun osasuntsuetan geneen adierazpenak promotore-aktibitate

ohartezina izan baitezake.

LTRen aktibazioa ez da gehiegi ikertu minbizi eszenatan, zeinetan kromatinaren

egoera errepresiogilea eten egiten den (Shukla et al., 2013; Lock et al., 2014). Izan

ere, ERVen transkripzioa ugaztunen ehun desberdinetan isilarazita egoten da

DNA-metilazioaren, histonen eraldaketen edo interferentziazko RNAren bidez

(Maksakova et al., 2008). ERVen etete transkripzional epigenetiko hau minbizi

egoeratan garrantzitsua izan daiteke, argi baitago akats genetikoek egoera

101

kaltegarrietan paper garrantzitsua betetzen dutela (Berdasco & Esteller, 2010).

Transkribatutako sekuentzien mihiztadura eta RNAseq bidezko kuantifikazioa

eszenario desberdinetan aldakorrak diren isoformak detektatzeko erabili izan dira,

horien artean minbizi egoera desberdinak (Trapnell et al., 2010; Lock et al., 2014).

Beraz, interesgarria litzateke enJSRV-LTRen metilazio egoera Ardien Biriketako

Adenokartzinoma (OPA) tumoreetan aztertzea, transkriptoma osoko sekuentzien

(RNA-seq) datu-base handien berrazterketaren bidez, minbizi laginak eta ehun

osasuntsua alderatzeko eta ondorioz, ERVetatik eratorritako promotoreek

bideratutako geneen adierazpena identifikatzeko, lehenago B-zelula handi lausoko

linfoman egin izan den moduan (Lock et al., 2014).

Esker onak

J. Benavides doktorea ardi osasuntsuen laginengatik eta R. Juste eta E. Minguijón

doktoreak APO laginengatik. R. Rebollo eta D. Mager doktoreak (British Columbia

Cancer Agency, Vacouver) laguntza teknikoagatik eta K. García-Etxebarria

doktorea analisi bioinformatikoetan laguntzeagatik.

102

103

3. KAPITULUA

JAAGSIEKTE BIRUSAK ERAGINDAKO

ARDIEN BIRIKETAKO

ADENOKARTZINOMAREN ETA

ENJSRV KOPIA POLIMORFIKOEN

ARTEKO ASOZIAZIO-ANALISIAK

104

105

3. KAPITULUA

JAAGSIEKTE BIRUSAK ERAGINDAKO ARDIEN

BIRIKETAKO ADENOKARTZINOMAREN ETA enJSRV KOPIA

POLIMORFIKOEN ARTEKO ASOZIAZIO-ANALISIAK

Maialen Sistiaga-Poveda, Amaia Larruskain, Maider Mateo-Abad, Begoña M. Jugo

Laburpena

Ardien Biriketako Adenokartzinoma (OPA) erretrobirusek eragindako ardien

berezko biriketako minbizia da eta honen eragilea, Jaagsiekte ardi erretrobirusa

(JSRV), biriketako adenokartzinoma natural bat eragiteko gai den birus ezagun

bakarra da. JSRV onkogenikoak zenbait ahaide endogeno ditu enJSRV deiturikoak

eta batzuek JSRVaren erreplikazioa oztopatzeko gaitasuna dutela frogatu da,

erretrobirusaren bizi-zikloko fase goiztiar zein berantiarretan. Oztopatze hau dela-

eta JSRVa ezin da zelulatik irten eta beraz, enJSRVek ardia infekzioen aurrean

babesten dutela esan daiteke. Lan honetan, Latxa arrazako ardiak bi multzotan

bereizi ziren biriketan OPAren berezkoak diren lesio klinikoen presentziaren

arabera. PCR bidezko genotipazioan eta erregresio-logistikoan oinarritutako

asoziazio-analisien bidez, bost enJSRV polimorfiko aztertu ziren 49 OPA ardi

gaixoetan eta 124 ardi kontroletan. Gure emaitzek erakutsi zutenez, enJSRV-16

probirusaren maiztasuna gainontzeko arrazetan baino askoz handiagoa da Latxa

arrazan, probirus honek berriki ugaritze bat jasan duela iradokiz, aztertutako

populazioetan. Asoziazio-analisietan, enJSRV polimorfikoek ez zuten APOren

garapenarekiko sentikortasun/erresistentziarik azaldu modu esangarrian.

Hitz-gakoak

Erretrobirus endogenoak / Ardien Biriketako Adenokartzinoma / Jaagsiekte Ardi

erretrobirusa / Gaixotasunekin asoziazioa

1. Sarrera

Ardien Biriketako Adenokartzinoma (OPA) mundu osoan hedatu den arnas

gaixotasun kronikoa da, jatorri erretrobirala duena ardi, ahuntz eta mufloiak

kutsatuz (De las Heras et al., 2003) eta intzidentzia handia izan dezakeena zenbait

106

artaldeetan. OPA, tumore kutsakorra da, birika distalean sortzen dena Jaagsiekte

ardi erretrobirusaren (JSRVaren) infekzioaren ondorioz eta ardien tumore nagusi

eta ugariena da, kalte handiak eragiten dituelarik artaldea kutsatzen denean

(Griffiths et al., 2010).

JSRV onkogenikoak enJSRV deituriko zenbait ahaide endogeno ditu, batzuek

JSRVaren erreplikazioa oztopatzen dutelarik bizi-zikloaren fase goiztiar zein

berantiarretan eta ondorioz, ardia infekzioen aurrean babestu. Hain zuzen ere,

enJSRVek JSRVa bi mailatan blokeatzen dutela deskribatu izan da. Blokeo

goiztiarrak birusaren sarrera oztopatzen du hartzaile interferentzia bidez; aldiz,

berantiarrak partikula biralen garraioa eta irteera blokeatzen ditu (Palmarini et al.,

2004). Berriki frogatu denez, JSRV/enJSRV taldeak eragindako ardiaren

genomaren inbasioa oraindik gaur egun ematen ari da (Arnaud et al., 2007a) eta

berriki txeratu diren zenbait probirusek Gag poliproteina akasdun bat dute fenotipo

transdominantea helarazten diena, erretrobirus exogenoen erreplikazio berantiarra

oztopatuz (Mura et al., 2004; Murcia et al., 2007; Arnaud et al., 2007a; Armezzani

et al., 2011). Hala ere, enJSRVek OPA gaixotasunaren garapenean jokatzen duten

papera oraindik ezezaguna da, nahiz eta txertatze-mutagenesia eta JSRVarekin

errekonbinazioa proposatu izan diren (Cousens et al., 2004; Philbey et al., 2006;

Arnaud et al., 2007a, b; Armezzani et al., 2011).

Probirus endogeno gutxi batzuk baino ez dira ezagutzen gaixotasunen eragile

zuzenak direnak animalia ereduetan, esate baterako MMTV betarretrobirusa,

saguen ugatzetako kartzinomaren eragilea dena (Medstrand et al., 1998; Barbulescu

et al., 1999; Turner et al., 2001; Belshaw et al., 2005; Hughes & Coffin., 2004;

Subramanian et al., 2011), MaLR erretrobirusen THE1 subfamilia, B zeluletatik

eratorritako Hodgkin’s linfomaren eragilea dena gizakian (Lamprecht et al., 2010)

edo HERV-E familiako LTR2 elementuak, B-zelula handi lausoko linfoman (Lock

et al., 2014). Hala ere, zenbait ikerkuntzek genoma osoko probirus polimorfiko

indibidualen eta minbiziaren arteko lotura ikertu dute. Lehenengoz 2013. urtean

erabili ziren asoziazio-genetiko analisiak giza erretrobirus endogeno polimorfikoen

eta biriketako minbiziaren arteko lotura aztertzeko eta HERV probirus batek

biriketako adenokartzinomarako sentikortasuna ematen zuela behatu zen,

emakume ez-erretzaileetan, adinarekin menpekotasuna azalduz (Kahyo et al.,

107

2013). Beranduago, bularreko minbizirako diagnosia aztertzeko 50 gizakiekin

egindako kasu-kontrol analisi batean ez zen desberdintasun esangarririk topatu

gaixo eta osasuntsuen artean, HML-2 probirus polimorfiko arruntek bularreko

minbiziarekin loturarik ez dutela iradokiz (Wildschutte et al., 2014).

Ardietan, sei enJSRV polimorfikoen (enJSRV-7, enJSRV-8, enJSRV-15, enJSRV-

16, enJSRV-18 eta enJS5F16) presentzia/Absentzia analisiak burutu izan dira

mundu osoko arraza eta espezie desberdinetan (Chessa et al., 2009). Ikerketa

horretan 20 Latxa lagin barneratu ziren eta enJSRV-18, probirusik arruntena zela

deskribatu zen, enJSRV-7 eta enJS5F16 probirusak jarraituta, hurrenez hurren

(Chessa et al., 2009). Hala ere, oraingoz ez da probirus hauen eta OPA lesioen

arteko lotura aztertu, ezta enJSRV dosiak gaixotasunaren garapenean izan

dezakeen eragina ere.

Kasu-kontrol asoziazio-analisiak gaixotasun/infekzio baten aurrean sentikortasuna

/erresistentzia eman dezaketen aldagai genetikoak identifikatzeko erabiltzen dira.

Latxa arrazako ardietan, MHCko II klaseko DRB1 genearen eta OPAren arteko

lotura ikertu izan da mota honetako analisien bidez (Larruskain et al., 2010, 2012)

baina enJSRVak ez dira inoiz markatzaile genetiko modura erabiliak izan. Ikerketa

honen helburua, beraz, kasu-kontrol asoziazio-analisi bat burutzea izan da, enJSRV

polimorfiko desberdinek OPArako sentikortasun/erresistentziarekin lotura azaltzen

ote duten aztertzeko.

2. Material eta metodoak

2.1. Laginak eta arrazak

Ikerketa honetako animalia guztiak ardi helduak izan ziren. 173 lagin Arabako eta

Gipuzkoako artalde esperimentaletatik lortu ziren, laginak animaliak erail ziren

momentuan bertan batuz. Birikak makroskopikoki aztertuak izan ziren OPAren

bereizgarriak diren lesioak identifikatzeko, %10 formalinan finkatu, parafinatan

sartu, 4-5 μm-ko ebaketak egin eta hematoxilina-eosinarekin tindatu, behaketa

mikroskopikorako. Ikerketa honetarako hautatutako 173 laginetatik 49k OPA

lesioak azaltzen zituzten eta gainontzeko 124ek ez. Analisian zenbait Merino lagin

ere barneratu ziren, emaitzak alderatzeko helburuz.

108

2.2. DNAren prestaketa

Laburki, biriketako ehunak TES (0.01M Tris, 0.1M EDTA eta %0,5 sodio dodezil

sulfatoa) gehituta apurtu ziren, RNasarekin (100 mg/ml) eta proteinasa K-rekin

digeritu eta fenol-kloroformo erauzketa tradizionalaren bidez erauzi. DNAren

kalitatea PCR bidez aztertu zen, lagin guztietan enJSRV-6 probirusa anplifikatzeko

hasle bikote espezifikoa erabilita, probirus hau finkatuta baitago ikertutako espezie

guztietan (Chessa et al., 2009).

2.3. enJSRV polimorfikoen presentzia/Absentziaren detekzioa

Lan honetan enJSRV-7, enJSRV-8, enJSRV-15, enJSRV-16, enJSRV-18 eta

enJS5F16 probirus polimorfikoak aztertu ziren, guztiak erreplikatzeko gai den

JSRV exogenoaren egituraketa genomiko tipikoarekin nahiz eta enJSRV-8

probirusak stop-kodon bat azaltzen duen env genean eta enJS5F16 probirusak

delezio handiak pol genean. Ikerketan ez zen enJSRV-26 probirus polimorfikoa

ikertu, oso maiztasun txikia azaltzen duelako (indibiduo bakarrean deskribatu izan

da) (Arnaud et al., 2007a). Aztertutako probirus polimorfikoetatik soilik enJS5F16k

du JSRVa bizi-zikloaren fase goiztiarretan oztopatzeko gaitasuna env-Hyal-2

elkarrekintzak JSRV hartzaile eskuragarritasuna murrizten baitu zelularen

gainazalean (Spencer et al., 2003). Hala ere, probirus horietako bakar batek ere ez

darama bizi-zikloaren fase berantiarrak oztopatzeko gai den W21, C98 eta V102

Gag locus dominante negatiborik (Mura et al., 2004).

enJSRV-7, -8, -15, -16, -18 eta enJS5F16 probirusen presentzia aurretik

deskribatutakoaren arabera aztertu zen lagin bakoitzean (Chessa et al., 2009).

Laburbilduz, lagin bakoitzaren DNA genomikoko 10-40 ng erabili ziren bi PCR-

erreakzioetan (5’- eta 3’- PCRak) HotStar Taq DNA polimerasa sistema erabilita,

fabrikatzaileak gomendatu bezala (Qiagen). Hasleak aurretik Chessa eta kideek

deskribatutakoak izan ziren eta probirus bakoitzaren 5’- eta 3’-LTRko albo-

eskualdeari eta probirusaren barruko aldeari lotzen zitzaizkion espezifikoki (Chessa

et al., 2009). Lagin baterako 5’- eta 3’-PCR erreakzio biak positiboak izan zirenean

soilik hartu zen kontutan probirus jakin horien presentzia.

109

2.4. enJSRVak genotipatzeko sistema berri baten garapena

Dakigunez, lagin bakoitzerako probirusen zigositatea (homozigoto/heterozigoto)

ez da inoiz ikertua izan ardietan. Lan honetan, probirusen dosiak gaixotasunaren

garapenean nolabaiteko efektua ote zuen aztertu genuen. Horretarako 5’- eta 3’-

albo-eskualdeetako hasleak konbinatu genituen enJSRV jakin baterako positiboak

izan ziren laginetan (35 APO eta 47 kontrol). PCRan xingola txiki bat (kopiarik ez)

eta itxarotako tamainako (~7000 bp) xingola bat azaltzen zuten laginak

heterozigototzat jo ziren eta soilik xingola handia azaltzen zutenak

homozigototzat, probirus jakin horretarako (3.2A irudia).

Azkenik, probirus desberdinen konbinazioa (erretrotipoak, Chessa eta kideek

izendatu bezala) aztertu zen Fisher Probabilitate eta Erregresio Baldintzatuko test

zehatzen bidez. Honako konbinazio hauek ikertu genituen eta aurreko lanen

arabera izendatu (Chessa et al., 2009): enJSRV-7 soilik (R1), enJSRV-18 soilik

(R2), enJSRV-16 soilik, enJSRV-7 + enJSRV-18 (R4), enJSRV-7 + enJSRV-16,

enJSRV-16 + enJSRV-18, eta enJSRV-7 + enJSRV-16 + enJSRV-18.

2.5. Analisi estatistikoak

enJSRV bakoitzerako presentzia/Absentziaren eta OPA lesioen arteko asoziazioa,

erregresio logistikoen bidez aztertu zen R programako (http://www.r-project.org)

SNPassoc liburutegia erabilita (González et al., 2007). Laginak artalde

desberdinetakoak zirenez jatorriz, asoziazio-analisi guztiak aldagai honetara doitu

ziren.

enJSRV aleloen efektu dominanteak gaixotasunaren sentikortasunean eraginik ote

zuen aztertzeko, genotipoetarako kasu-kontrol testak erabili ziren SAS/

SAS/Genetics™ 13.1 programan. 2x3-ko arrisku-taula arrunta erabili zen

estatistikoa eratzeko honako formularen arabera:

Formulak efektu aleliko desberdinak frogatzen ditu, dominantzia gehigarria eta ez-

gehigarria kontutan hartuta (Nielsen & Weir, 1999).

110

Kasu-kontrol analisietan arrisku-faktore (OR) aukera zehaztu zen. Arrisku-

faktoreak markatzaile bialelikoetarako kalkulatzen dira 2x2-ko tauletan oinarriturik

eta alelo-ezaugarriko zenbaketetan, arrisku-faktorea honela estimatuz: θ = ab/(cd).

Arrisku faktorerako (θ) estimatutako ehuneko konfiantza-tartea (1-α) honakoa da:

Non,

eta z, banaketa estandarreko 100 (1 – α/2) pertzentila den. Honek tarte zuzenak eratzen

ditu, genotipo heterozigoto eta homozigotoak konbinatzerakoan, gaixotasun errezesibo

edo dominanteetarako arrisku-faktoreak lortzerako orduan.

3. Emaitzak

3.1. Presentzia/Absentzia eta beste arraza batzuekin konparaketa

enJSRV kopia desberdinen maiztasunak aztertu ziren eta ardien batez besteko

maiztasunekin alderatu (Chessa et al., 2009) (3.1. irudia).

3.1. Irudia. Ikerketa honetan aztertutako bost probirus polimorfikoen presentzia (%) OPA eta kontroletan. Ardien batez besteko maiztasunarekin konparaketa, Chessa eta kideetatik ondorioztatuta (Chessa et al.,2009).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

enJSRV-7 enJSRV-8 enJSRV-16 enJSRV-18 enJS5F16

Latxa APO

Latxa kontrol

Merino kontrol

Ardien batezbestekoa Ardien batez bestekoa

111

enJSRV-15 ezin izan zen lagin bakar batean anplifikatu. Probirus hau

anplifikatzeko hasleen espezifikotasuna aurrez frogatua izan da (Chessa et al.,

2009) eta beraz, ematen du enJSRV-15 ez dela ikertutako Latxa populazioetan

azaltzen. Probirus guztietarako lortu ziren maiztasunak, ardien batez besteko

maiztasunekiko oso antzekoak izan ziren, enJSRV-16 probiruserako izan ezik.

enJSRV-16, ezohiko probirus polimorfiko modura sailkaturik dago (batez besteko

ardi populazioan <%5eko maiztasuna azaltzen duena) baina aztertutako Latxa

populazioetan maiztasun altuagoa azaltzen du (%41,86 eta %49 APO eta

kontroletarako, hurrenez hurren) (3.1. irudia).

3.2. Presentzia/Absentzian oinarritutako asoziazio-analisiak

Probirus bakoitzerako maiztasun indibidualak kasu eta kontrolen artean alderatuak

izan ziren Erregresio-baldintzatuko analisi zehatzen bidez (Michell et al., 1980).

Presentzia/Absentzian oinarritutako asoziazioetarako, enJSRV probirusek

OPArako arrisku-faktore bat suposatzen ez dutela iradokitzen dute emaitzek. Hala

ere, R4 erretrotipoak 4 bider arrisku-faktore handiagoa azaltzen du, nahiz eta ez

modu esangarrian (3.1. Taula).

3.1. Taula. Kasu-kontrol asoziazio-analisiak enJSRV locusen presentzia/Absentzian oinarriturik eta erretrotipoak kontutan hartuta, banaketa geografikoarekin (artaldea) doitu ondoren. Arrisku-faktorea (OR), %95eko Konfiantza-tartea (CI) eta P-balioak kalkulatu ziren analisi guztietan. >1 OR balioak lortu zirenean probirusa sentikortzat jo zen <1 balioekin erresistentetzat. p<0,05eko esangarritasun maila erabili zen. Probabilitate baldintzatua maximizatzeko, Erregresio-baldintzatuko analisi zehatza erabili zen (Michell et al., 1980).

enJSRV kopia (Erretrotipoa)

Presentzia/Absentzia OR CI 95% P

enJSRV-7 Absentzia - 0,596 Presentzia 1,263 (0,533-2,993)

enJSRV-16

Absentzia - 0,857 Presentzia 1,081 (0,463-2,521)

enJSRV-18

Absentzia - 0,813 Presentzia 1,117 (0,447-2,788)

enJSRV-7 + enJSRV-18 (R4)

Absentzia + Absentzia - - Absentzia + Presentzia 4,526 (0,515-39,76) 0,173 Presentzia + Absentzia 1,310 (0,367-4,680) 0,678 Presentzia + Presentzia 1,322 (0,381-19,186) 0,214

enJSRV-7 + enJSRV-16

Absentzia + Absentzia - - Absentzia + Presentzia 0,802 (0,253-2,543) 0,708 Presentzia + Absentzia 0,761 (0,239-2,424) 0,664 Presentzia + Presentzia 1,449 (0,407-20,534) 0,359

enJSRV-16 + enJSRV-18

Absentzia + Absentzia - - Absentzia + Presentzia 1,442 (0,175-11,88) 0,734 Presentzia + Absentzia 1,059 (0,334-3,359) 0,922 Presentzia + Presentzia 1,217 (0,324-16,322) 0,847

112

3.3. Genotipazioa eta genotipoetan oinarritutako asoziazio-analisiak

Genotipoetan oinarritutako asoziazio-analisietarako soilik enJSRV-7, enJSRV-16

eta enJSRV-18 probirusak erabili ziren, gainontzeko probirusetarako lortutako lagin

positibo kopurua oso txikia izan baitzen eta ondorioz, ez nahikoa esangarritasun

estatistikoa lortzeko asoziazio-analisi genetikoetan. Asoziazio emaitza guztiak

eremu geografikoekiko (artaldea) doitu ziren.

3.3.1. Genotipazio sistema berri baten garapena

Dakigunez, inoiz ez da ardi laginen zigositatearen (homozigoto/heterozigoto)

efektua aztertu (3.2. Irudia). Lan honetan, probirusen dosiak gaixotasunaren

garapenean nolabaiteko efekturik ote zuen aztertu genuen. Gainera, Fisher

Probabilitate Test Zehatzen bidez probirus desberdinen konbinaketak

(erretrotipoak) aztertu ziren.

Hiru probirusak modu arrakastatsuan anplifikatu ziren 5’- eta 3’-albo hasleak

konbinatuaz (ikusi material eta metodoak) (3.2A irudia). Maiztasun handienean

3.2. Irudia. Lagin positiboen zigositaterako lortutako emaitzak, soilik maiztasun handienean

agertzen ziren hiru probirusak kontutan hartuta. A) Bi xingolak azaltzen zituzten laginak heterozigototzat jo ziren (7, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 16, 17) eta xingola bakarrekoak homozigototzat (1, 2,

3, 5, 6, 18, 19, 20). Lagin negatiboek <100 bp-ko xingola txiki bat azaltzen dute soilik (4, 12, 13). B) enJSRV-7, enJSRV-16 eta enJSRV-18 probirusen zigositatea.

0

20

40

60

80

100

enJSRV-7 enJSRV-16 enJSRV-18

Heterozigotoa

Homozigotoa

enJSRV-16 enJSRV-7 enJSRV-18

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

A

B

113

zeuden probirusak (e.b., enJSRV-18) lagin gehienetarako homozigotoak zirela

behatu genuen eta aldiz, txertatze berriagoek heterozigositate handiagoa azaltzen

zutela (ikusi 3.1 eta 3.2 irudiak). Gainera, zenbait probirusek ez zuten Hardy-

Weinberg oreka betetzen (HWrako doikuntza-egokitasuneko p-balioak enJSRV-7,

enJSRV-16 eta enJSRV-18 probirusetarako 0,06, 0,00046 eta 0,0068, izan ziren,

hurrenez hurren).

3.3.2. Genotipatutako enJSRVen asoziazio-analisiak

3.3.2.1. Banakako asoziazioa

Presentzia/Absentzian oinarritutako asoziazio-analisietarako egin zen moduan,

probirus bakoitzaren maiztasun indibiduala kasu eta kontrolen artean konparatu

egin zen Erregresio-baldintzatuko analisi zehatzen bidez eta asoziazio guztiak

eskualde geografikoarekiko (artaldea) doitu ziren. Hala ere, genotipoetan

oinarritutako asoziazioetan ere ez zen enJSRV probirusik OPArekin asoziaturik

agertu, behintzat modu esangarrian (3.2. Taula).

3.2. Taula. Genotipoetan oinarritutako erregresio-logistikorako emaitzak, eskualde geografikoarekiko (artaldea) doituta. Hiru probirusetarako emaitzak erakusten dira. AIC balioak, datuak ereduari zenbateraino doitzen zaizkion adierazten du. Arrisku-faktorea (OR), %95 Konfiantza-tartea (CI) eta P-balioak kalkulatu ziren analisi guztietan. OR >1 balioak lortu zirenean probirusa sentikortzat jo zen eta OR<1 balioekin erresistentetzat. p<0,05eko esangarritasun maila erabili zen. Probabilitate baldintzatua maximizatzeko, Erregresio-baldintzatuko analisi zehatza erabili zen (Michell et al., 1980).

enJSRV kopia Dominantzia (AIC) Genotipoak OR CI 95% P enJSRV-7 Kodominantea (104) -/- - (0,37-2,71) 0,09968

-/+ 1 enJSRV-16

Kodominantea (104,9) -/- - (0,36-6,04)

0,5704 -/+ 1,87

+/+ 1,40 Dominantea (103,0) -/- - (0,61-4,51) 0,3209

-/+ +/+ 1,66 Errezesiboa (104,0) -/- -/+ - (0,31-4,23) 0,8422

+/+ 1,14 Gaindominantea (103,1) -/- +/+ - (0,56-5,35) 0,3458

-/+ 1,72 enJSRV-18

Kodominantea (103,9) -/- 0,40 (0,06-5,48)

0,3520 -/+ 1,67

+/+ - Dominantea (104,0) -/- - (0,39-3,11) 0,8567

-/+ +/+ 1,10 Errezesiboa (102,6) +/+ -/+ - (0,06-2,17) 0,2402

-/- 0,35 Gaindominantea (103,0) -/- +/+ - (0,57-5,93) 0,3091

-/+ 1,84

114

3.3.2.1. Erretrotipoak

Azkenik, probirus desberdinen konbinaketa (erretrotipoak) ikertu zen OPArekiko

lotura aztertzeko helburuarekin, Fisher Probabilitate Test Zehatzen bidez eta

Erregresio-baldintzatu zehatzen bidez (3.3. Taula). Probirus desberdinen

konbinaziorako alelo positibo kopurua kuantifikatu genuen (esate baterako, bi

probirusak heterozigotoak baziren, bi alelo, homozigoto eta heterozigoto baterako

hiru, etab.).

3.3. Taula. Genotipoetan oinarritutako erregresio logistikoko analisiak, eskualde geografikoarekiko (artaldea) doituta. Arrisku-faktorea (OR), %95 Konfiantza-tartea (CI) eta P-balioak kalkulatu ziren analisi guztietan. OR >1 balioak lortu zirenean probirusa sentikortzat jo zen eta OR<1 balioekin erresistentetzat. p<0,05eko esangarritasun maila erabili zen. Probabilitate baldintzatua maximizatzeko, Erregresio-baldintzatuko analisi zehatza erabili zen (Michell et al., 1980).

Erretrotipoa Alelo positibo

zkia.

N - kontrolak (%)

N - OPA (%)

OR CI 95%

P

P Totala

enJSRV-7 + enJSRV-18 (R4)

0-1 11 (13,58) 9 (11,11) - - 0,917 2 23 (28,39) 16 (19,75) 0,781 (0,243-2,508) 0,679

3 12 (14,81) 10 (12,34) 0,825 (0,217-3,132) 0,777

enJSRV-7 + enJSRV-16

0 22 (27,16) 11 (13,58) - - 0,995

1 15 (18,52) 12 (14,81) 1,254 (0,410-3830) 0,692 2 6 (7,41) 9 (11,11) 1,323 (0,305-5,739) 0,708 3 3 (3,70) 3 (3,70) 1,555 (0,232-10,431) 0,650

enJSRV-18 + enJSRV-16

0-1 11 (13,58) 7 (8,64) - - 0,245 2 27 (33,33) 14 (17,28) 0,705 (0,207-2,407) 0,577

3 2 (2,47) 9 (11,11) 3,792 (0,568-25-310) 0,169 4 6 (7,41) 5 (6,17) 0,930 (0,185-4,663) 0,930

enJSRV-7 + enJSRV-16 + enJSRV-18

1 9 (11,11) 5 (6,17) - - 0,871

2 20 (24,69) 9 (11,11) 1,028 (0,973-1,250) 0,969 3 10 (12,34) 13 (16,05) 1,660 (0,374-7,365) 0,505

4-5 7 (8,64) 8 (9,87) 1,363 (0,277-6,708) 0,703

4. Eztabaida

Ikerketa honetarako, Jaagsiekte ardi erretrobirus exogeno eta patogenikoarekin

ahaidetutako ERV familia bat erabili genuen (enJSRVak) markatzaile genetiko

madura, Ardien Biriketako Adenokartzinoma (OPA) gaixotasunaren garapenarekin

eta sentikortasun/erresistentziarekin loturarik azaltzen ote zuten ikertzeko asmoz.

Ardiaren genomak gutxienez 27 enJSRV kopia desberdin azaltzen ditu eta

gehienak finkatuta badaude ere, zenbaitek arraza eta aleen artean banaketa

desberdina azaltzen dute (hau da, polimorfikoak dira) (Arnaud et al., 2007a).

enJSRVak oso markatzaile informatiboak izan daitezke analisi filogenetikoetan,

erretrobirus bakoitzaren presentzia ostalariaren genoman txertatze-gertakizun bakar

115

baten ondorioa baita eta beraz, probirus jakin hori elkarbanatzen duten

populazioak filogenetikoki ahaidetuak egongo baitira. Hala ere, enJSRVak ez dira

inoiz markatzaile genetiko modura erabili kasu-kontrol analisietan.

Zenbait artaldeetako animaliek bost enJSRV polimorfikoetarako (enJSRV-18,

enJSRV-7, enJSRV-8, enJSRV-16 eta enJS5F16) azaltzen zuten presentzia/

Absentzia aztertu genuen eta probirus guztietarako, enJSRV-16 kopiarako izan

ezik, gure emaitzak aurrekoekin bat zetozela behatu genuen (Chessa et al., 2009).

Hala ere, aurreko lanetan ikertutako mundu osoko ardi populazioetan, enJSRV-16

probirusa oso maiztasun txikian (%3-5) azaldu zen, Latxa arrazan barne (Chessa et

al., 2009) eta aldiz, gure Latxa populazioetan probirus honen batez besteko

maiztasuna %41,86-koa izan zen ardi osasuntsuetan. Dirudienez, aztertutako Latxa

populazioek jito genetiko bat jasan dute berriki, honek ere Hardy-Weinberg

desoreka azalduko lukeelarik. Interesgarria da gainera, enJSRV-16 eta enJSRV-18

probirusak barneratzen dituen erretrotiporako, hiru alelo positiborekin,

infekziorako arriskua handituta azaltzen dela (OR=3,792), nahiz eta ez modu

esangarrian. enJSRV-16 probirusak egituraketa genomiko tipikoa du, erreplikatzeko

gai diren JSRVen berezkoa dena baina berriki mutazioren bat jasan ahal izan du

aztertutako Latxa populazioan, ardia OPA gaixotasunarekiko sentikorragoa

bihurtuz. Hala ere, hipotesi hau frogatzeko analisi gehiago egin beharko lirateke.

Horrez gain, hiru probirus polimorfikoen heterozigositatean desberdintasun

handiak topatu genituen: %100, %40,62 eta %22,97 enJSRV-7, enJSRV-16 eta

enJSRV-18 probirusetarako, hurrenez hurren. enJSRV polimorfikoen txertatzea

genoman, ardiaren etxekotze prozesu ostean gertatu zen, duela ~ 10.000 urte baino

gutxiago (Arnaud et al., 2007a). Hala ere, hauen maiztasunetan oinarriturik esan

dezakegu enJSRV-18 kopia polimorfikorik zaharrena dela (Chessa et al., 2009),

enJSRV-16 eta enJSRV-7 probirusek jarraituta. Lan honetan,

homozigoto/heterozigoto proportzioa probirusen maiztasunekin bat datorrela

behatu genuen (hau da, txertatze zaharrenek (maiztasun handienean daudenek) bi

kopia aleliko azaltzen dituzte eta berrienek soilik bat). Dirudienez, txertatzeek bi

kromosomatan finkatzeko joera azaltzen dute eta beraz, txertatze zaharrak

homozigotoak dira eta aldiz, berrienak heterozigotoak.

116

Kasu-kontrol asoziazio-analisiak Latxa arrazako ardian erabili izan dira MHC II

klaseko DRB1 genearen aldagaiek OPAren patogenesiarekin loturarik ote duten

ikusteko (Larruskain et al., 2010, 2012, prestaketan) baina enJSRVak ez dira inoiz

markatzaile genetiko modura erabiliak izan. Biriketako minbiziarekiko

sentikortasuna ematen duten faktoreen bilaketan sakondu beharko litzatekeela

proposatu da (Sugimura et al., 2011), eta beraz, txertatze polimorfismoak aztertzen

dituzten hurbilketak, minbizi-arriskua ebaluatzeko baliagarriak izan daitezke. Hala

ere, jatorri biraleko gaixotasunen ikerketa maiz zaila suertatzen da, aldagai askoren

menpekoak izaten baitira. Berriki proposatu denez, artaldea bezalako faktoreak

garrantzitsuak dira etxe-abereen gaixotasun eta infekzioetan, eta zehatzago ardietan

(Herrmann-Hoesing et al., 2008). OPAren prebalentzia animalien hazkuntza- eta

nekazaritza-sistemekin lotuta dago eta altuagoa da intentsiboki hazitako

artaldeetan, artalde txikiagoetan baino. Bestelako faktore batzuk ere kontutan

hartzekoak dira, esate baterako, ardien sentikortasun genetikoa, erretrobirusaren

birulentzia eta beste gaixotasun batzuen agerpena (Leginagoikoa et al., 2006a, b,

2010).

ERV eta gaixotasunen arteko asoziazioa eztabaidagarria da (Burmeister et al.,

2004; Moyes et al., 2005; Moyes et al., 2008; Ruprecht et al., 2008; Wildschutte et

al., 2014). Gizakian egindako ikerketetan, ez seminomak eta ezta bularreko

minbiziak ere ez zuten asoziazio esangarririk azaldu HML-2 probirusen

polimorfismoekin (Burmeister et al., 2004; Ruprecht et al., 2008; Wildschutte et al.,

2014). Hala ere, esklerosi anizkoitza eta Sjögren sindromea HERV-K113

probirusaren polimorfismoekin lotuta azaldu ziren modu esangarrian, populazio

txiki batean (Moyes et al., 2005), baina esklerosi anizkoitzak ez zuen asoziaziorik

azaldu populazio handiagoetan (Moyes et al., 2008). Ikerketa hauetan, geneen

maiztasuna kontutan hartu zen baina ez genotipoen banaketa. HERV locus hauen

aleloen maiztasunak oso txikiak izango ziren estatistikoki asoziazio genetikoa

ebaluatu ahal izateko. Hain zuzen ere, HERV-K113 eta HERV-K115 probirusak ez

dira inoiz homozigositatean topatu (Burmeister et al., 2004; Ruprecht et al., 2008).

Berriki gainera, HML-2_sLTR(1p13.2) probirusaren homozigositatearen eta

biriketako adenokartzinomaren arteko asoziazioa deskribatu da emakume ez-

erretzaileetan (Kahyo et al., 2013).

117

Lan honetan, bai presentzia/Absentzia eta baita genotipoen banaketa aztertuak

izan dira baina ez da desberdintasun esangarririk topatu kontrol eta OPA gaixoen

enJSRV probirusen artean. Emaitzek beraz, erretrobirus endogeno hauen eta

OPAren artean asoziazio genetikorik ez dagoela iradokitzen dute. Izan liteke, hain

zuzen ere, ez egotea inolako asoziazio genetikorik enJSRVen eta OPAren artean.

Hala ere, ikerketa hau aurretik deskribatutako enJSRV polimorfikoetara mugatu da

soilik (Arnaud et al., 2007a) eta ez dira enJSRV locus berriak bilatu minbizi

ehunetan, aurreko lanetan egin den moduan (Kahyo et al., 2013; Wildschutte et al.,

2014). Beraz, ikerketa honek argi uzten du locus polimorfiko berrien

karakterizazioa ezinbestekoa dela ERV polimorfiko eta gaixotasunen arteko

asoziazioa ikertzerako orduan.

Esker onak

Alaine Zubeldia laguntza teknikoagatik, R. Juste eta E. Minguijón doktoreak, ardi

laginengatik eta I. Arostegui doktorea, laguntza estatistikoagatik.

118

119

4. KAPITULUA

ARDI BETARRETROBIRUSEN (ENJSRVEN)

ADIERAZPEN ETA METILAZIO

ANALISIAK ARDIEN ORGANO

DESBERDINETAN: SCRAPIE

GAIXOTASUN PRIONIKOAK ENJSRVEN

ADIERAZPENA SUSTATZEN DU BIZKAR-

MUIN KRANIALEAN

120

121

4. KAPITULUA

ARDI BETARRETROBIRUSEN (enJSRVen) ADIERAZPEN ETA

METILAZIO ANALISIAK ARDIEN ORGANO

DESBERDINETAN: SCRAPIE GAIXOTASUN PRIONIKOAK

enJSRVen ADIERAZPENA SUSTATZEN DU BIZKAR-MUIN

KRANIALEAN

Maialen Sistiaga-Poveda, Leire Moreno-Cugnon, Irantzu Bernales, Ignacia Beltrán-de

Heredia, Julio Benavides, Rosa Bolea, Inmaculada Martín-Burriel, Juan José Badiola,

Begoña M. Jugo

Laburpena

Ardiaren genomaren baitan txertaturik, Jaagsiekte ardi erretrobirus (JSRV) exogeno

onkogenikoarekin ahaidetutako 20 kopia endogeno baino gehiago daude. PCRtan

oinarritutako saiakera sentikorren eta in situ hibridazio analisien bidez, enJSRVen

itzulpena deskribatu izan da ardien ehun desberdinetan, baina hauen sekuentziak

eta txertatze polimorfismoek, transkripzionalki aktiboak diren edo isilarazita

dauden kopia probiralen identifikazioa zailtzen dute ardiaren genoman. Gainera,

ardien betarretrobirus endogenoen (enJSRVen) itzulpenaren inguruko erregulazio

epigenetikoa ezezaguna da. Lan honetan, env eta orf-x gene biralen adierazpena

detektatu dugu ardi organo desberdinetan eta infekzio prionikoek enJSRVen

adierazpenean duten eragina aztertu. Adierazpen altua eta gutxi metilatutako gene

probiralak aharien barrabiletan topatu ditugu baina enJSRVen etete

transkripzionala gainontzeko ardi ehunetan. Gainera, enJSRVen adierazpena

Scrapie infekzioaren aurrean desregulatu egiten dela erakusten dugu eta

desregulazio hori RNA mailan detekta daitekeela. Gure ikerketak erakusten

duenez, zenbait enJSRV kopia Scrapie gaixotasunarekin lotuta egon litezke eta

enJSRVek bideratutako itzulpena metilazioarekiko sentikorra da, ardien enJSRV

probirus gehienak DNA-metilazioaren bidez egonkorki isilarazita baitaude.

Hitz-gakoak

Ardien betarretrobirus endogenoak / Jaagsiekte ardi erretrobirusa / Adierazpena /

Metilazioa / Scrapie gaixotasun prionikoa

122

1. Sarrera

JSRV birusa, Ardien Biriketako Adenokartzinomaren (OPAren) eragile nagusia da

(Maeda et al., 2001; Palmarini et al., 2004; Viginier et al., 2012) eta enJSRV

deituriko 20 kopia endogeno baino gehiago ditu ardiaren genoman txertaturik. Bi

formak biologikoki funtzionalak dira eta elkarren artean elkarrekintzak dituzte,

maiz paper garrantzitsua jokatuz OPAren patogenesian.

enJSRV locus gehienek genoma akasdunak dituzte, zentzugabeko mutazioen,

delezioen edo errekonbinazio sakonen ondorioz; hala ere, 27 enJSRV

probirusetatik bostek (enJSRV-7, -15, -16, -18 eta -26) egituraketa genomiko tipikoa

azaltzen dute, gene erretrobiral guztietarako Irakurketa Marko Irekiekin (ORFekin)

(Gifford & Tristem, 2003).

PCRtan oinarritutako saiakera sentikorren eta in situ hibridazio analisien bidez,

enJSRVen itzulpena deskribatu izan da ardien utero, obiduktu, bagina, karena,

hesteko lamina propria, timo, biriketako epitelio bronkiolar, hezur-muin, bizkar-

muin mediastinal eta leukozitoetan (Palmarini et al. 1996; DeMartini et al., 2003;

Caporale et al., 2006; Dakessian & Fan, 2007; Qi et al., 2012, 2013). Aldiz,

adierazpen baxua edo eza deskribatu da bestelako ehunetan: giltzurrunak, barea,

amigdalak eta bizkar-muin periferikoetan (DeMartini et al., 2003; Caporale et al.,

2006; Dakessian & Fan, 2007; Qi et al., 2012, 2013). Hala ere, ikerketa gutxik

aztertu dute enJSRV probirusen adierazpena RT-qPCR bidez eta erretrobirus

endogenoen DNA-metilazioa parasito genomiko hauen aurkako defentsa-

mekanismo bat dela onartzen bada ere (Rowe & Trono, 2011), ez da askorik ikertu

enJSRVen DNA-metilazioari buruz.

ERV kopiak geneen erregulazioan eragin dezaketen sekuentzia ezkutuak dira, ko-

hautatuak edo exaptatuak izateko prest daudenak barne- (organismoaren garapena

eta testuinguru genomikoa) edo kanpo- (espeziaren demografia eta ingurune

aldaketak) seinaleen arabera. ERVek hormonekiko erantzun elementuak bezalako

motiboak dituzte eta beraz, ingurune aldaketa kimiko eta molekularren itu izan ohi

dira (Ono et al., 1987; Schiff et al., 1991). Hori dela-eta, ERVen itzulpenaren

erregulazioa ingurune presioen ondorioz asalda daiteke (Fablet et al., 2009;

Carareto et al., 2014).

123

ERVei funtzio positibo zein negatiboak aitortu zaizkie, baldintza fisiologiko normal

eta ezohikoetan, esate baterako, gaixotasun egoeratan. Beste gaixotasun konplexu

batzuekin gertatzen den moduan, gaixotasun prionikoetan ere ERVen aktibazioa

behatu da (Lee et al., 2013). Hain zuzen ere, elementu erretrobiral exogeno zein

endogenoak gaixotasun prionikoen patogenesia eragiten duten ko-faktoreetako bat

direla hipotetizatu izan da. Gaixotasun prionikoak, ugaztunok pairatzen ditugun

gaixotasun motel eta endekatzaileak dira (Nunziante et al., 2003; Aguzzi et al.,

2004). Ostalariak ekoiztutako prion proteinaren (PrPc) isoforma patologikoaren

(PrPSc) metaketarekin lotura dute, bereziki ostalariaren nerbio-sisteman. PrPSc

isoformak lotura estua azaltzen du kutsakortasunarekin eta ikerketa desberdinek

gaixotasun prionikoen agente nagusia dela iradoki dute (Legname et al., 2004).

Zenbait ikerketek frogatu dutenez, erretrobirusen infekzioak Scrapieren

kutsakortasun maila areagotzen du zelula-kultiboetan (Leblanc et al., 2006) eta

saguen leuzemia birus endogenoak (enMuLV) gaixotasunaren inkubazio-epea

aldatzen du zahartzaro aurreratuko saguetan (SAMetan), MuLVen potentzia

handitzen delarik Scrapiez infektatutako saguen burmuinetan (Carp et al., 1999,

2000).

Hori guztia dela-eta, ikerketa honen helburuak honakoak izan dira:

1. enJSRVen adierazpen-maila aztertzea ardi organo desberdinetan, bereziki

aharien barrabiletan, ERVen adierazpen altua ikusi izan baita hormonak

jariatzen dituzten ehunetan baina enJSRVen adierazpena ez baita inoiz

sakontasunean ikertu arren ugal-organoetan.

2. DNA-metilazioak enJSRVen adierazpenean jokatzen duen papera aztertzea.

3. enJSRVen adierazpena estres baldintzetan aztertzea, eta bereziki, Scrapie

gaixotasun prionikoaren erantzun gisa.

2. Material eta metodoak

2.1. Animalia eta laginak

Lagin osasuntsuak birika, barrabil, heste (CSIC-Leongo Mendiko Abeltzaintza

Institutuan), ugatz (Iruñeko Institutu Agrobioteknologikoan) eta karenetik

(NEIKER-Arkauteko Animalia Ekoizpen Saila) hartu ziren. Birika laginak

makroskopiko zein mikroskopikoki aztertuak izan ziren OPA tumoreen

124

presentzia/Absentzia frogatzeko. Ikerketa honetan erabilitako animalia guztiak

OPArako negatiboak izan ziren.

Bizkar-muin kranialeko laginen artean (Zaragozako Unibertsitatetik) Scrapiez

kutsatutako Aragoiko artaldeetatik eratorritako bost animalia gaixo zeuden, guztiak

ARQ/ARQ genotipodun emeak. Gaixotasunaren fase klinikoan zeuden ardiak

gaixotasunarekin asoziatutako sintoma klinikoak aztertuta identifikatu ziren

(Vargas et al., 2006). Hirugarren betazala (Vargas et al., 2006) eta ondesteko

mukosako biopsiak (Monleon et al., 2011) erabili ziren diagnosi hau baieztatzeko

eta gaixotasunaren fase aurre-klinikoan zeuden animaliak identifikatzeko. Ardien

PRNP genearen genotipazioa lehenago deskribatu izan den bezala burutu zen

(Acín et al., 2004). Postmortem azterketak ez zuen bestelako ezaugarri patologikorik

azaldu.

36 laginak RNAlater-etan gorde ziren (Austin, TX, USA) 4ºC-tan 24 orduz,

fabrikatzailearen gidalerroak jarraituz. Ondoren, RNAlater-a kendu egin zitzaien

eta laginak -80ºC-tan gorde ziren.

2.2. RNA erauzketa, DNAsa tratamendua eta cDNA sintesia

RNA totala birika, heste, bizkar-muin kranial, karena eta ugatz laginetako 100 mg-

tik erauzi zen. Ehunak homogeneizatzeko Precellys®24 homogeneizatzailea

(Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France) erabili zen, homogenizazio

baldintzak ehun bakoitzerako doitu ostean. RNA TRIzol (Life Technologies) bidez

purifikatu zen, metodo estandarrari zenbait eraldaketa eginda (kloroformo

erauzketak eta etanol bidezko garbiketak birritan egin ziren).

RNAren kuantifikazioa eta purutasunaren neurketa NanoDrop 1000

espektrofotometroa erabilita egin ziren (Thermo Scientific Inc, Bremen, Germany).

Ikerketa honetako RNA lagin guztiek >1,8-ko OD260/280 proportzioa azaldu

zuten. RNA integritatea eta kontzentrazioa 2100 Bioanalyzer gailua erabilita

(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) aztertu ziren. RNAren integritateari

dagokiola, bi parametro aztertu ziren, 28/18S proportzioa (RNA erribosomikoak)

eta RNA integritate zenbakia (RIN balioa). RNA, I DNAsarekin (Invitrogen,

Basel, Switzerland) digeritu ostean, RNA totalaren 600 ng-ren alderantzizko

transkripzioa burutu zen, gaitasun handiko cDNAren Alderantzizko Transkripzio

125

kita erabilita (Applied Biosystems, Foster City, CA). Azkenik, cDNA nukleasik

gabeko uretan disolbatu zen eta -20ºC-tan mantendu.

2.3. enJSRVen adierazpen analisiak

enJSRVen adierazpena detektatzeko helburuarekin, env eta orf-x gene erretrobiralak

espezifikoki anplifikatzen zituzten hasleak diseinatu genituen. Hasle hauek

txertatze berri zein antzinakoen ugaritzea baimentzen zuten. Diseinurako, v3.0

Primer Express® Softwareko (Applied Biosystems, Foster City, CA) parametro

lehenetsiak erabili ziren. BLAST bidez (Altschul et al. 1990), hasleen

espezifikotasuna frogatu zen, sekuentzia homologoen ugaritzea ekiditeko

(sinzitinak env genearen kasuan edo A3 hartzailea orf-x genearen kasuan (Bai et al.,

1999)).

IDTko Oligo Analyzer erreminta (http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/

OligoAnalyzer) begizten eta dimeroen eraketa saihesteko erabili zen, parametro

termodinamikoetan oinarrituz. ∆G:–7kcal/mol baino balio baxuagoak azaltzen

zituzten hasleak baztertu egin ziren. Hasle guztiak 4.1. irudian agertzen dira.

RT-qPCRa 7000 Sequence Detection System (ABI PRISM, Applied Biosystems)

gailuan burutu zen Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,

Foster City, CA) erreaktiboa erabilita, 10 µl-ko erreakzio-bolumenean, ziklo

baldintza estandarrak eta urtze-kurba analisiak eginda. Lagin bakoitzerako kontrol

egokiak erabili ziren, hau da, alderantziz transkribatu gabeko eta material

genetikorik gabeko kontrolak.

Hasleen efizientziarik altuenak hasle zuzenaren eta alderantzizkoaren hiru

kontzentrazio desberdin konbinatuta lortu ziren: 50 nM, 300 nM eta 900 nM.

Konbinazio posible guztietatik, Ct baliorik baxuenak eratzen zituztenak aukeratu

ziren. Azkenik, anplikoiak agarosa gel batean migratu ziren hasleen

espezifikotasuna frogatzeko.

Ehun eta hasle bikote bakoitzerako, kurba-estandarra sortu zen elkarren segidako

cDNA diluzioak erabilita (diluzio-faktorea=5). PCRaren ugaritze-efizientzia,

kurba-estandarren maldatik kalkulatu ziren, lehenago deskribatu izan den bezala

(Larruskain et al., 2013), hurrengo formula erabilita: E= –10 (–1/malda) –1, “E”-k

126

efizientzia adierazten duelarik eta maldak, kurba-estandarrari hoberen doitzen

zaion gradientea. Gainera, parametro guztiak Denbora-errealeko PCR

kuantitatiboko esperimentuak publikatzeko Gutxieneko Informazioari (MIQE)

doitu zitzaizkion (Bustin et al., 2009).

A

B

Bisulfitorako hasleak

Env_F: TTGTTTATTTAGAGGTAAATTGAGG Lan hau Env_R: TCCAAAAAATATCTATTCCTATACC Orf-x_F: TTGTTTTTAATTTTTTGTTTTTTTT Lan hau Orf-X_R: TTCCACAATACCTTATCCCTATAAATTATA

C

RT-qPCRko itu-geneetarako hasleak

Env_F: GCAACGCATGACACTGAGTGA Lan hau Env_R: CATTCCAAGCATAACGCATCA Orf-x_F: GAATCAACACGTCACTGTATTCAACA Lan hau Orf-x_R: GGGTTTGTGGGATTCCTGAAG

D

RT-qPCRko erreferentzia-geneetarako hasleak (ez dira irudian

adierazi)

ATPasa_F: GACTTGAACCGAGGCTTAACAAC ATPasa_R: TCTGGCTAGGATCTCAGCAGC

Larruskain et al., 2013

β actin_F: AGAAGAGCTACGAGCTGCCG β actin_R: CCAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAGC

Lan hau

GAPDH_F: GGCGTGAACCACGAGAAGTATAA GADPH_R: CCCTCCACGATGCCAAAGT

Larruskain et al., 2013

HPRT_F: TGGTGGAGATGATCTCTCAACTTTAA HPRT_R: TTCGACAATCAAGACATTCTTTCC

Larruskain et al., 2013

YWHAZ_F: TCCGCCGCCACCTACTC YWHAZ_R: GCCTTCTGTACCAGCTCGTTTT

Larruskain et al., 2013

4.1. Irudia. JSRV endogenoaren egitura, anplifikatu diren eskualdeak adierazi direlarik, baita hasleen lotura-guneak ere. Lerro horizontalek GpC irlak adierazten dituzte. (a) enJSRV probiralaren genoma, hasle bikote desberdinek anplifikatutako eskualdeak adierazten direlarik. (b) Bisulfito tratamendu osteko DNAren sekuentziazioan erabilitako hasleak. (c) RT-qPCR teknikaren bidez cDNA probirala anplifikatzeko erabilitako hasleak. (d) RT-qPCR teknikaren bidez erreferentzia geneak anplifikatzeko erabilitako hasleak.

2.4. Geneen adierazpenaren normalizazioa

env eta orf-x geneen adierazpena bi modutara normalizatu zen, erreferentzia-

geneekiko eta cDNA kontzentrazioarekiko. Orokorrean, erreferentzia-geneak

gomendatzen dira RT-qPCRaren normalizaziorako, Ct metodo konparatiboa

erabiltzen denean (Bustin et al., 2005; Huggett et al., 2005; Pfaffl, 2001;

Vandesompele et al., 2002), zenbait abantaila eskaintzen baitituzte kuantifikazio

absolutuaren gain (esate baterako, cDNA edukia, RNA eduki totala ehun mg-ko,

etab.). Hala ere, egoera esperimental zailetan ez bada erreferentzia-gene egokirik

topatzen, cDNA kuantifikazioa proposatu da ordezko aukeratzat (Libus &

Storchova, 2006).

Orf-x env

127

Transkribatutako enJSRV kopuruaren normalizaziorako, bost erreferentzia-gene

erabili ziren, lehendik ardietan egindako analisietan oinarritutakoak (Larruskain et

al., 2013) (4.1. Irudia). Frogatutako bost erreferentzia-geneen (ATPasa, β-aktina,

GADPH, HPRT eta YWHAZ) egonkortasun-faktorea (M) zehazteko, geNorm

algoritmoa erabili zen (Vandesompele et al., 2002). RQ datuak adierazpenaren

neurri modura erabili ziren eta itu-genearen eta erreferentzia-genearen binakako

batez bestekoa bezala definitu. M-balio baxuak, beraz, itu-genearen egonkortasun

handia adierazten du (Coulson et al., 2008).

Erreferentzia-generik egokiena hautatzeko NormFinder algoritmoa erabili zen

(Andersen et al., 2004). Lagin eta ehun desberdinen arteko itu-geneen adierazpen

diferentziala REST programarekin aztertu zen (Pfaffl et al., 2002), 2.000

zorizkotasun erabilita. REST programak binaka finkatutako birbanatzearen

zorizkotasuna aztertzen du eta efizientzia zuzendu. Erabiltzen duen eredu

matematikoa, aukeratutako taldeen arteko itu- eta erreferentzia-geneen PCR

efizientzietan eta Ct desbideratzean oinarritzen da.

Azkenik, laginak cDNA kopuru totalarekiko normalizatuak izan ziren. Hau egin

ahal izateko, harizpi bakarreko cDNAren fluoreszentzia estimatu zen Quant-iT™

OliGreen® ssDNA Reagent tindatzailea erabilita (Invitrogen), fabrikatzailearen

gidalerroak jarraituz.

2.5. enJSRVen adierazpenaren kuantifikazio erlatiborako analisi

estatistikoak

Datu gordinak v.22 SPSS softwarearekin landu ziren. Scrapie gaixoen eta kontrolen

arteko adierazpen desberdintasunak aztertzeko T-Test bat erabili zen eta

Bariantzaren analisia (ANOVA), ehun desberdinen arteko esangarritasun

estatistikoa ondorioztatzeko. Azkenik, ehunen arteko konparaketak Tukey

Konparaketa Anizkoitzerako Testa aplikatuta ere burutu ziren (Tukey, 1940).

Desberdintasunak estatistikoki esangarritzat jo ziren P-balioa <0,05 izan zenean,

Bonferroni zuzenketen ostean.

128

2.6. Analisi bioinformatiko bidezko enJSRVen adierazpenaren detekzioa

Adierazten ziren enJSRV sekuentziak bioinformatikoki topatu ziren, lehenago

deskribatu izan den moduan (Deloger et al., 2009; Garcia-Etxebarria & Jugo,

2014). Laburbilduz, enJSRV-26 (GenBank: EF680297), adierazten diren itu-

sekuentzien datu-baseko (EST) BLAST (Altschul et al. 1990) bilaketarako erabili

zen. Probirus honek antolaketa genomiko osoa du eta beraz, JSRV familiaren

adierazgarria da. Ovis aries bilaketa organismo bezala zehaztu zen eta ESTak datu-

base modura. Soilik >200 kalifikazio eta %100eko identitatea azaltzen zuten

emaitzak hartu ziren kontutan. Aurreko lanetan oinarriturik (Stauffer et al., 2004),

EST-R balioa honela kalkulatu zen:

Proportzio honek detektatutako EST kopurua, ehun jakin bakoitzerako EST

kopuru totalarekiko normalizatzen du.

2.7. enJSRV kopia-kopuruaren kuantifikazioa

enJSRV kopia-kopurua kuantifikatu nahi izan genuen, enJSRV dosiak adierazpen

mailan eraginik ote zuen ikusteko. Horretarako, bi metodologia ezberdin erabili

ziren. Lehenik eta behin, lagin guztiak enJSRV polimorfiko arruntenetarako

genotipatu genituen: enJSRV-7, enJSRV-16, enJSRV-18 eta enJS5F16. Probirus

hauek erreplikatzeko gai den JSRV birusaren berezkoa den antolaketa genomiko

osoa dute eta beraz, adierazteko aukera gehiago azaltzen dituzte.

Bigarrenik, qPCR saiakerak diseinatu ziren lagin bakoitzak YWHAZ eta GAPDH

erreferentzia-geneekiko azaltzen zuen enJSRV dosia ikertzeko helburuz. Kopia-

kopuru aldakortasuna lehendik deskribatu izan den bezala aztertu zen (Armezzani,

2012). Honela, env eta orf-x geneak adierazpen analisietarako erabilitako hasle

berdinekin anplifikatu ziren (4.1C irudia) eta TOPO bektore baten baitan klonatu

(Invitrogen).

qPCR erreakzioak plasmidoko DNAren elkarren segidako diluzioak erabilita

burutu ziren, molekula kopuru jakin bat zutenak (102 - 107 kopia artean), eta ardien

DNA genomikoko laginekin batera aztertu ziren. DNA molekula arruntetako

kopia-kopurua honako formula hau erabilita kalkulatu zen (Godornes et al., 2007):

129

Kopia-kopurua =

Lortutako Ct balioak hasierako plasmido kontzentrazioaren log10-aren funtzio

modura ezarri ziren. Lerroaren malda, PCRaren efizientzia eta aldaketa-maila

kalkulatzeko erabili zen ardiaren DNA genomikoko locus bakoitzerako.

2.8. DNA erauzketa eta bisulfito-sekuentziazioa

DNA, birika, barrabil, heste eta karenatik erauzi ahal izan zen, fenol:kloroformo

metodo estandarraren bidez. DNAren bisulfito bihurtzea EZ DNA-metilazio

kitaren bidez burutu zen (Zymo Research), ekoizlearen protokoloari jarraiki baina

hurrengo eraldaketarekin: DNA genomikoa CT bihurtze erreaktiboarekin 4 orduz

inkubatu zen 50ºC-tan, 95ºC-tako pultsuak aplikatuz 15 minuturo. Bihurtutako

DNA, 20 µl eluzio tanpoia erabilita eluitu zen eta Metilazio-espezifikoa den PCR-

rako (MS-PCR) 2 µl erabili ziren. MS-PCRa metilatu gabeko zitosinen bisulfito

bihurketan oinarritzen da eta CpG nukleotidoetarako osagarriak diren hasleak

diseinatzen dira (4.1. Irudia).

Hala ere, ardi bakoitzeko enJSRVen txertatze ugariek, polimorfikoek eta sekuentzia

desberdinek, arazo bat suposatzen dute enJSRV metilazio mailaren analisian eta

ardien arteko konparaketetan. Itzulpen probiralaren eta birusaren transmisiorako

gaitasunaren ikuspuntutik, env eta orf-x gene osoak dituzten probirusak dira

interesgarrienak eta beraz, garatu genuen MS-PCR teknika, kopia polimorfiko

hauen ugaritzean oinarritu zen.

MS-PCRa hurrengo baldintzetan burutu zen HotStar Taq DNA polimerasa

(Qiagen) erabilita, ekoizleak gomendatutako gidalerroak jarraituz: 94ºC 5 min eta

40 ziklo honako baldintzetan: 94ºC 30 s, hasleen araberako epeltze-tenperatura

desberdinak eta 72ºC 1 min. Erreakzio guztietan 10 minutuko luzapen urrats bat

gehitu zen. Produktuak gel elektroforesi bidez aztertu ziren eta MiniElute (Qiagen)

bidez purifikatu. Azkenik, purifikatutako produktuak TOPO-TA bektorearen baitan

klonatu ziren eta One Shot TOP10 Escherichia coli zeluletan (Invitrogen) hazi.

Sekuentziak alderantzizko eta zentzuzko hasleak erabilita sortu ziren BigDye v.3.1

(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sekuentziazio kitaren bidez, edo

130

GTPBigDye (Applied Biosystems) sekuentzia zailen kasuan. Analisietan erabilitako

sekuentzia guztiek metilazio patroi bakarrak azaltzen zituzten edo C-T ez-bihurtze

errore bakarrak (gainontzeko Cak ez ziren CpG dinukleotidoen menpekoak)

bisulfito bidezko tratamendu ostean. Honek molde beretik eratorritako PCR-

anplifikatuak kontutan hartzea saihesten du. Sekuentzia guztiek > %95ko bihurtze-

proportzioa azaltzen zuten. Sekuentziak doako Quma programarekin aztertu ziren

(Kumaki et al., 2008).

3. Emaitzak

3.1. enJSRVen RNA adierazpena ardi ehun desberdinetan

enJSRVen RNAren adierazpen totala aztertu genuen ardien birika, heste, barrabil,

ugatz eta bizkar-muin kranialean, eta lortutako emaitzak DNA-metilaziokoekin

alderatu. Karena ezin izan genuen adierazpen analisietan erabili lortutako RNA

integritate balioak (RIN balio) baxuak izan zirela-eta. RT-qPCR hasleak diseinatu

ziren env eta orf-x geneetarako eta hauen eta erreferentzia-geneen kontzentrazioak

optimizatu ziren, hasle biak kontzentrazio desberdinetan konbinatuz: 50nM,

100nM, 300nM eta 900nM (4.1. Taula).

4.1. Taula. Ikertutako eskualde bakoitzerako hasleen kontzentrazio optimoak. Geneak Hasleen kontzentrazio optimoa (nM) Zuzena Alderantzizkoa Erreferentzia-geneak ATPasa 900 100 Β-aktina 300 300 GAPDH 900 300 HPRT 300 900 YWHAZ 900 900 Itu-geneak Env 900 300 Orf-x 900 50

3.1.1. RT-qPCRaren efizientzia

Hasleen efizientziak kurba-estandarretako maldetatik kalkulatu ziren cDNA

kontzentrazioaren diluzio jarraituak erabilita ehun bakoitzerako. Erreferentzia-gene

guztiek efizientzia altuak azaldu zituzten β-aktinak izan ezik, eta beraz, gene hau

baztertu egin zen. Itu-gene gehienak %90-110 efizientzia-tarte barruan zeuden,

onargarritzat jo ohi dena MIQE gidalerroen arabera eta tarte honetatik kanpokoak

131

ez ziren analisietarako kontutan hartu. Azkenik, R2 balioa kasu guztietan > 0,9

izan zen, eta kurba-estandarraren egokitasuna kalkulatzeko erabili zen (4.2. Taula).

Hasieran aukeratutako erreferentzia-geneetatik lau (HPRT, YWHAZ, ATPasa eta

GAPDH) geNorm algoritmoarekin aztertuak izan ziren erreferentzia-gene egokiena

aukeratzeko helburuarekin (β-aktina ez zen analisietan erabili, efizientzia baxua

azaldu baitzuen (%41,90)). Hala ere, erreferentzia-gene egonkorrenen M-balioa

proportzio onargarrien (0,7-1) azpitik zegoen (Vandesompele et al., 2002) eta beraz,

normalizaziorako cDNA kontzentrazioa soilik erabili zen.

4.2. Taula. Erreferentzia- (goian) eta itu-geneen (behean) PCR efizientziak. Ehuna Genea Malda Efizientzia Ugaritze-

faktorea R2 Erreferentzia

Erreferentzia-genea Nahastuta ATPasa -3.358 98.52 1.985 0.956 Larruskain et al., 2013 β-aktina -6.578 41.90 1.419 0.985 Lan hau GAPDH -3.270 102.21 2.022 0.974 Larruskain et al., 2013 HPRT -3.305 100.36 2.003 0.992 Larruskain et al., 2013 YWHAZ -3.319 100.06 2.000 0.987 Larruskain et al., 2013 Itu-genea Hestea Env -3.598 89.64 1.896 0.889 Lan hau Orf-x -3.304 100.75 2.007 0.953 Lan hau Birika Env -3.052 112.64 2.126 0.934 Lan hau Orf-x -3.346 99.00 1.990 0.993 Lan hau Ugatza Env -3,498 93.01 1.931 0.966 Lan hau Orf-x -3.355 98.60 1.986 0.988 Lan hau Barrabilak Env -3.484 93.60 1.936 0.917 Lan hau Orf-x -3.315 100.2 2.002 0.966 Lan hau Nodulu linf. (kontrolak)

Env -3.342 99.17 1.992 0.944 Lan hau Orf-x -3.336 99.41 1.994 0.937 Lan hau

3.1.2. enJSRVen adierazpen-analisiak ehun desberdinetan

Adierazpen emaitzak env zein orf-x locusetarako lortu ziren. RNA totalaren

adierazpen mailarik altuena, gainontzeko ehunen batez bestekoa baino 2 bider

altuagoa, barrabiletako env eta orf-x locusetarako lortu zen. Aldiz, gainontzeko

ehunetan adierazpena nabarmenki azpiadierazita zegoela behatu genuen (4.2.

irudia).

Analisi estatistikoak bi modutara burutu ziren SPSS erreminta erabilita: (1) Ct

balioen binakako konparaketak eginda Tukey Konparaketa Anizkoitzeko Testen

bidez (Tukey, 1940); eta (2) ANOVA test bat burututa aztertutako ehun guztiak

elkarren artean alderatzeko. Binakako konparaketetan env locusaren adierazpena

gainadierazita azaldu zen modu esangarrian (4.3. taula) eta P-balio adierazgarriak

132

lortu ziren env locuserako barrabil eta hesteen arteko konparaketetan, Bonferroni

zuzenketen ostean (4.3. taula).

4.3. Taula. Ehunen env eta orf-x geneetarako binakako konparaketak. Errore-estandarra (EE), %95 konfiantza-tartea (C.I) eta P-balioak adierazten dira (gene bakoitzerako eta ehun bakoitzerako), ANOVA eta Tukey Konparaketa Anizkoitzeko testak erabilita, Bonferroni zuzenketen ostean.

** P<0,005

0,0078125

0,015625

0,03125

0,0625

0,125

0,25

0,5

1

2

4

8

orf

env

1. ehuna 2. ehuna Batezb. Des. EE %95 CI P < 0,05

Env P-balioa (ANOVA)= 0,004 **

Birika Hestea -1,571 1,278 -5,49 — 2,35 1 Barrabila -3,375 1,240 -7,18 — 0,43 0,115 Ugatza 0,250 1,483 -4,30 — 4,80 1

Nodulu linf. 1,833 1,326 -2,23 — 5,90 1 Hestea Barrabila -1,804 1,189 -5,45 — 1,84 1

Ugatza 1,821 1,440 -2,59 — 6,24 1 Nodulu linf. 3,405 1,278 -0,51 — 7,32 0,131

Barrabila Ugatza 3,625 1,407 -0,69 — 7,94 0,160 Nodulu linf. 5,208 1,240 1,40 — 9,01 0,003 **

Ugatza Nodulu linf. 1,583 1,483 -2,96 — 6,13 1 Orf-x P-balioa (ANOVA) = 0,053 Birika Hestea 0,167 0,988 -2,86 — 3,20 1

Barrabila -1,708 0,959 -4,65 — 1,23 0,865 Ugatza 1,417 1,146 -2,10 — 4,93 1

Nodulu linf. 0,667 1,025 -2,48 — 3,81 1 Hestea Barrabila -1,875 0,919 -4,69 — 0,94 0,516

Ugatza 1,250 1,113 -2,16 — 4,66 1 Nodulu linf. 0,500 0,988 -2,53 — 3,53 1

Barrabila Ugatza 3,125 1,087 -6,46 — 6,46 0,080 Nodulu linf. 2,375 0,959 -4,26 — 5,32 0,01

Ugatza Nodulu linf. -0,750 1,146 -2,76 — 2,76 1

BIRIKA HESTEA

NODULU LINFATIKO

KRANIALA (kontrolak)

BARRABILAK

UGATZA

Ald

ak

eta-

mai

la

4.2. Irudia. Aztertutako bost ehunen adierazpenerako emaitzak. Datuek lagin guztien adierazpenaren batez bestekorako aldaketa-maila adierazten dute. Datuak eskala logaritmikoan adierazita daude. Batez bestekoaren Errore Estandarra (SEM) errore-barren bidez adierazita dago.

133

Analisi bioinformatikoen bidez, lehendik deskribatutako enJSRVen adierazpena

(Arnaud et al., 2006) aztertu zen. enJSRV-26 probirusaren mRNA uteroan, ugatz-

guruinetan, maskurrean, enbrioian eta endometrioan topatu zen (4.6. Irudi

gehigarria).

3.1.3. enJSRV kopia-aldakortasunaren kuantifikazioa

enJSRV locusen dosi erlatiboa bi metodologia desberdinen bidez ondorioztatu zen:

1) lagin bakoitzeko lau probirus polimorfiko genotipatuz eta kuantifikatuz; eta 2)

qPCR saiakeren bidez (4.3. irudia). qPCR-rako, datuak lagin bakoitzeko

erreferentzia- eta itu-geneetarako estimatutako kopia-kopuru proportzioaren

arabera irudikatu ziren. Emaitzen zehaztasuna handitzeko, bi erreferentzia gene

erabili ziren barne-kontrol gisa eta saiakerak estandarizatzeko helburuarekin,

YWHAZ eta GADPH.

4.3. Irudia. A) Kopia-kopuruaren aldakortasuna erakusten duen grafikoa, YWHAZ eta GAPDH geneekiko, aurretik deskribatutako (Armezzani, 2012) kuantifikazio erlatibo metodo batean oinarriturik. B) Aztertutako lau probirus polimorfikoetarako kopia-kopuruaren aldakortasuna, 3. kapituluko hasleetan oinarriturik. Barra bakoitzak lagin independente bat adierazten du. M=Merino lagina (barrabil, birika eta hestetik lortutako datuak).

Espero zitekeen moduan, analisiak desberdintasun handiak azaldu zituen

aztertutako laginen artean, zenbait laginetan enJSRVen ugaritze genomikoa gertatu

dela iradokiz (4.3. irudia). Gainera, qPCR analisien bidez aztertutako ehun guztiek

orf-x locusaren dosi altuagoa azaldu zuten (4.3. irudia). Hala ere, enJSR-dosi

erlatiboa lagin bakoitzerako mantendu egiten zen, erreplika eta ehun desberdinek

0

100

200

300

400

M8 M14 M15 M17 M19 M22

Orf-x Env

0

2

4

M8 M14 M15 M17 M19 M22

Itu

- /

erre

fere

ntz

ia-g

ene

pro

po

rtzi

oa

A

B

Ko

pia

po

lim

orf

iko

ko

p.

134

frogatu zutenez. Gainera, kopia-kopuruaren aldakortasuna aurretik enJS56A1

kopia transdominanterako deskribatutakoren antzekoa izan zen (Armezzani et al.,

2012).

Genotipaziorako, ia laginen erdiak (%45,45) bi probirus polimorfiko baino ez

zituela azaltzen behatu genuen, hiru laginek 3 probirus azaldu zituzten eta beste

hiruk 4 (4.3B irudia). Hala ere, ez qPCR-rako eta ezta probirus polimorfikoen

kopia-kopururako ere, enJSRV-dosiak ez zituen laginen arteko adierazpen-

desberdintasunak azaldu, kopia-kopururik altuenak zituzten laginek (adibidez, M22

eta M19) ez baitzuten adierazpen altuagoa azaltzen.

3.2. env eta orf-x probiralen CpG metilazio globala ardi ehunetan

MS-PCR teknika erabilita, hipometilatutako env eta orf-x sekuentzien kopurua

aztertu zen 27 ardi indibidualen birika, heste, karena eta barrabiletan (ugatzak eta

bizkar-muin kraniala ezin izan ziren aztertu, material genetiko ezagatik) (4.4.

irudia).

Gure hurbilketak desberdintasun handiak azaldu zituen ardi ehunetako enJSRVen

metilazio patroietan. Aukeratutako organoen bisulfito-sekuentziazio estandarraren

bidez enJSRV metilazio-maila altuak detektatu genituen ehun guztietan, karena eta

barrabiletan izan ezik. Barrabiletan aztertutako sekuentzia ugarik CpGak

hipometilatuta azaldu zituzten (%50 eta %41,66 env eta orf-x locusetarako, hurrenez

hurren) eta kareneko env eta orf-x sekuentziak ia guztiz metilatu gabe azaldu ziren

(%19,79 eta %5,55, env eta orf-x geneen CpG metilazio portzentajea, hurrenez

hurren) (4.4. irudia). Metilazio maila hori batez besteko ehunen metilazio

portzentajea (%57 ingurukoa) baino 3 bider baxuagoa izan zen env generako eta 11

bider baxuagoa orf-x generako.

3.3 enJSRVen adierazpen analisia ezohiko egoera fisiologikoan: Scrapiez

gaixotutako ardiak

RT-qPCR bidez, fase klinikoan zeuden Scrapiez gaixotutako ardien enJSRVen

adierazpena neurtu genuen eta infektatu gabeko ardienarekin alderatu. Bizkar-muin

kranialean burututako konparaketa kuantitatibo honen bidez, desberdintasun

nabariak ikusi genituen Scrapiez gaixotutako ardien eta kontrolen artean, env zein

135

orf-x locusak gainadierazita azaldu zirelarik Scrapie indibiduoetan (4.5. irudia).

Desberdintasun hauek estatistikoki esangarriak izan ziren gainera env genearen

kasuan, T-Test bidezko konparaketek adierazi bezala (P-balioak = 0,039 eta 0,143

env eta orf-x geneetarako, hurrenez hurren).

4.4. Irudia. Env eta orf-x gene erretrobiralen DNA-metilazioa, ardi ehun desberdinetan. Env eta orf-x

eskualdeen DNA-metilazio maila bisulfito-sekuentziazio bidez aztertu zen, aukeratutako lau ardi

ehunetan. Zirkulu beteek metilatutako CpGak adierazten dituzte, hutsek metilatu gabeko CpGak eta

lerro bakoitzak klon indibidual bat.

4.5. Irudia. Env eta orf-x locusen kuantifikazio erlatiboa bizkar-muin kranial kontrol eta Scrapie gaixoetan. Datuek kontrol taldearekiko aldaketa-maila adierazten dute eta eskala logaritmikoan adierazi dira. Batez bestekoaren Errore Estandarra (SEM), errore barren bidez adierazi da. 4. Eztabaida

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Control

Scrapie

ENV ORF-X

Ald

ak

eta-

mai

la

*

Bir

ika

Hes

tea

Barr

ab

ila

Kare

na

ENV ORF-X

Kontrola

136

ERVak ornodun klase guztietan aurkitu dira eta erretrobirus exogenoengatik

bereizten dituen ezaugarri nagusia, belaunaldiz belaunaldi modu bertikalean

transmititzeko ahalmena da. ERVek ostalariaren aurkako efektu patogenikoak

mantentzen badituzte, negatiboki hautatuak izango dira eta genomatik ezabatuak

errekonbinazio edo delezio prozesuen bidez. Hala ere, mutazioak pilatu arren

oraindik batzuek ostalarian adierazteko eta erreplikatzeko gaitasuna mantentzen

dutela argi dago.

Lan honetan, env eta orf-x gene erretrobiralak aztertu dira ardi ehun desberdinetan

eta Scrapiez gaixotutako ardietan. Birika, heste eta barrabiletan ikusi den bezala,

enJSRV adierazpen baliorik altuenak bat datoz env eta orf-x geneen metilazio

baxuagoekin, metilazioa enJSRVen adierazpena aurresateko baliagarria izan

daitekeela iradokiz.

ERVak, hormonak jariatzen dituzten ehunetan aktiboki transkribatzen direla

proposatu izan da (Kim et al., 2004) eta enJSRVek endometrio-enbrioiaren

garapenean jokatzen duten paper garrantzitsua sakonki ikertua izan da (Dunlap et

al., 2005; Dunlap et al., 2006a, b; Spencer & Palmarini, 2012). Hala ere, dakigunez

hau da enJSRVen adierazpena arren ugal-organoetan (aharien barrabilak) aztertzen

duen lehen lana. Giza eta saguen erretrobirus endogenoak zelulen desberdintze

normalarekin eta garapenarekin asoziaturik agertu dira baina gizakietan, HERV-K

familiak adierazpen-maila altua azaltzen du eta hozi-lerroko zeluletako tumoreekin

erlazionatu izan da, nahiz eta ERV3 familiaren env genea giza barrabila normaletan

ere adierazten den (Sichangi et al., 2002). Beste adibide bat giza sinzitina genearena

da (HERV-W env genea), aktiboki adierazten dena giza karena eta barrabiletan (Mi

et al., 2000). Gainera, ERV familiek espermatogenesiarekin erlazionatutako paper

biologiko garrantzitsuren bat joka dezaketela iradoki izan da eta hau izan liteke

enJSRVen kasua ere.

Gaur egun arte, ez da orf-x locusaren adierazpen analisirik egin ardietan. Locus hau

gene-transformatzailetzat jo izan den arren (Maeda et al., 2001), momentu honetan

bere adierazpenaren esanahia espekulatu baino ezin da egin. Gure lanaren

emaitzek iradokitzen dutenez, orf-x geneak espermatogenesiari loturiko funtzioren

bat burutu lezake. Hala ere, gene honen adierazpen altua, alboko geneen

adierazpenaren ondorio ere izan liteke.

137

Egoera normal eta ezohikoetan, esaterako, gaixotasun egoeratan, ERVek funtzio

positibo eta negatiboak betetzen dituztela iradoki izan da. ERVak ostalariaren

genomaren erregulaziopean daudela-eta, ingurune-aldaketa bortitzen aurrean

elementu hauen higikortasuna erraztu dezaketen elementuak sortzen dira (esate

baterako, estresarekiko erantzun-elementuak), eta ERVek elementu hauek euren

mesedetan erabiltzeko aukera dute, kopia-kopurua handituz. Ostalariaren

ikuspuntutik, shock genomiko baten ondorioz ERVek prozesu mutazional azkar bat

hasteko gaitasuna dute eta hautespen-naturalerako lagungarria izan daitekeen

ingurune genomiko berria sortu, estresaren ondorioz (Wessler, 1996). Hori dela eta,

shock genomikoaren kasuan ERV-gene kimerek transkriptoman aldakortasuna

eragin dezakete, ostalariaren estres-erantzun elementuen aldakortasuna areagotuz

(Fablet & Vieira, 2011). Hain zuzen ere, hainbat ikerketek erakutsi dute ERVen eta

baldintza estresagarrien arteko lotura (esate baterako esklerosi anizkoitz, lupus

eritematoso sistemiko, bularreko minbizi eta erredurak bezalako prozesuetan) eta

estres-seinaleek zenbait ERV locusen aktibazioa sustatzen dutela ikusi izan da.

Aktibazio hau, ostalariaren albo-geneen erregulazioarekin batera saretu daiteke eta

patogenesia eragiten duten seinale-segida bat piztu (Cho et al., 2008). ERVek estres

egoeratan betetzen dituzten funtzioen ulerpenak, infekzioen patogenesia gidatzen

duten mekanismoen identifikazioan lagun lezake.

Beste gaixotasun konplexuekin gertatzen den moduan, ERVen aktibazioa

gaixotasun prionikoetan ere ikusi izan da (Lee et al., 2013). Hain zuzen ere,

erretrobirus exogeno eta endogenoak gaixotasun prionikoen patogenesia eragiten

duten ko-faktoreetako bat direla iradoki izan da. Tesi honetan, enJSRVen

erregulazioa aztertu genuen ezohiko egoera batean, hain zuzen ere fase klinikoan

zeuden Scrapiez gaixotutako ardiak erabilita. Momentuz, prionekin infektatutako

ardiak ez dira inoiz erabiliak izan ERVen adierazpen maila aztertzeko. Lan

honetan, adierazpen datuek eta RT-qPCR analisiek iradokitzen dutenez, prionen

bidezko infekzioak enJSRVen adierazpena sustatzen du bizkar-muin kranialean.

Gure aurkikuntzak aurreko lanekin bat datoz, giza (Jeong et al., 2010) eta saguen

ERVetan (Carp et al., 1999, 2000; Lee et al., 2006) gaixotasun prionikoek eragina

dutela behatu izan baita. Saguetan, autoreek MuLV birus endogenoaren

adierazpena altuagoa zela behatu zuten Scrapiez gaixotutako saguen burmuinetan

eta lerro-zelular neuronaletan (Stengel et al., 2006). enJSRVetarako, probirusetako

138

bat PRNP genearen alboan txertatuta zegoela behatu genuen 13. kromosoman

(ikusi 2. kapitulua). Litekeena da beraz, probirus honek PRNP genearen

adierazpena sustatzea ezohiko baldintzetan. Hala ere, ezin dugu esan enJSRVen

erregulazio eza gaixotasun prionikoaren arrazoia edo ondorioa den.

Laburbilduz, enJSRVen adierazpen- eta metilazio-mailak aztertu genituen bost ardi

ehunetan eta Scrapiez gaixotutako ardietan. Aharien barrabiletan, enJSRVen

adierazpen maila bereziki altua ikusi genuen, beste ehunen adierazpen mailarekin

alderatuta. Gainera, fase klinikoan zeuden Scrapiez gaixotutako ardietan ere

adierazpenaren erregulazio eza gertatzen dela behatu genuen. Epigenetika

ingurunearen menpekoa denez, eta inguruneak ERVen adierazpena eralda

dezakeenez, etorkizuneko ikerketek analisi epigenetikoak barneratu beharko dituzte

prion eta enJSRVen arteko harremana zein den aztertzeko eta neuroendekapenean

jokatzen duten papera ikertzerako orduan.

Esker onak

R. Rebollo doktorea (Terry Fox Laboratory, British Columbia Cancer Agency,

Vacouver) iradokizunengatik. Lluís Luján (Zaragozako Unibertsitatea) eta Damián

de Andrés doktoreak (CSIC-UPNAko Agrobioteknologia Institutua) ugatz

laginengatik. Iratxe Rojo-Bartolomé, Maren Ortiz-Zarragoitia doktorea, Ibon

Cancio doktorea (Zoologia eta Animalia Zelulen Biologia Saila, UPV/EHU),

Antón Gómez eta Alberto Ouro (Biokimika eta Biologia Molekularra Saila,

UPV/EHU) laguntza teknikoagatik.

139

4. Kapituluko datu gehigarriak

4.6. Irudi Gehigarria. enJSRVen adierazpena ehun desberdinetan, BLAST eta EST datu-basea erabiliz

lortutako emaitzen arabera.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Endometrioa Uteroa Enbrioia Maskurra Ugatz-guruina

ES

T-R

140

141

5. KAPITULUA

ARDI BETARRETROBIRUS

ENDOGENOEN (ENJSRVEN)

UGARITZEAREN DINAMIKA

EBOLUTIBOA ARDIAN,

MUFLOIAN, PIRINIOETAKO

SARRIOAN ETA AHUNTZAN

142

143

5. KAPITULUA

ARDI BETARRETROBIRUS ENDOGENOEN (enJSRVen)

UGARITZEAREN DINAMIKA EBOLUTIBOA ARDIAN,

MUFLOIAN, PIRINIOETAKO SARRIOAN ETA AHUNTZAN

Maialen Sistiaga-Poveda, Koldo Garcia-Etxebarria, Begoña M. Jugo

Laburpena

Jaagsiekte ardi erretrobirus onkogenikoa (JSRV) ardien biriketako

adenokartzinomaren arduradun nagusia da eta homologo endogeno ugari ditu,

enJSRV deitutakoak. Elementu hauetako asko denborarekin inaktibatuak izan dira

LTR-bakarrak sortuz (mutazio akasdunak pilatzeagatik edo errekonbinazioen

ondorioz), baina euren egitura osorik mantentzen duten zenbait enJSRV kide

identifikatu dira, hauen txertatzea berriki eman dela iradokiz. Lan honetan, ardi

populazioan eta ahaidetutako espezieetan enJSRV polimorfismo maila aztertzeko

ikerketa bat burutu genuen, enJSRV kopiak aztertuz ardietan eta ardiaren lerroko

hiru espezie basatietan. enJSRV kopiak esperimentalki zein konputazionalki

detektatu ziren, PCR bidez env-LTR eskualdea anplifikatuz lehenengo eta lortutako

sekuentziak in silico bilatuz geroago. Guztira, 208 enJSRV sekuentzia lortu ziren 32

indibiduoen artean. Aurkikuntza hauek oraindik karakterizatu gabeko enJSRVak

daudela iradokitzen dute, baita txertatzeak espezieen, subespezieen, arrazen edo

eskualde geografiko desberdinen artean aldakorrak direla ere.

Hitz-gakoak

Erretrobirus endogenoak / Jaagsiekte ardi erretrobirusa / Pirinioetako sarrioa/

Mufloia / Ahuntza / Ardiaren genoma

1. Sarrera

Erretrobirusen erreplikazio-zikloko urrats garrantzitsuenetako bat euren genoma

ostalariaren DNA genoman txertatzean datza. Eboluzioan zehar, zenbait

erretrobirus exogenok ostalariaren hozi zelulak infektatu dituzte, egonkorki

txertatutako erretrobirus endogeno (ERV) bilakatuz, hurrengo belaunaldietara

144

transmititzen direnak lege mendeliarrei jarraiki (Gifford and Tristem, 2003).

Urteetan zehar erretrobirus berriak txertatu eta pilatzearen ondorioz, ornodun

guztien genomak mota honetako sekuentziekin kolonizatuta daude.

ERV gehienek akats genetikoak pilatu dituzte eta ondorioz, ez dira gai proteina

kutsakorrak adierazteko. Hala ere, zenbait ERV transkripzionalki aktiboak dira eta

gene batzuetarako irakurketa marko irekia mantendu dute, nolabait ere ostalariari

mesedegarriak suertatzen zaizkiola iradokiz (Stoye, 2001). Ornodunek ERV batzuk

mantentzeko azalpen posible bat, ahaidetutako erretrobirus patogenikoen aurreko

babesa litzateke. Esate baterako, zenbait enJSRVek JSRV exogenoa bi mailatan

blokeatzeko gaitasuna dute. Lehen oztopoa birusaren sarrera-mailan ematen da,

hartzaile bidezko lehiagatik; aldiz, bigarren blokeoak partikula biralen garraioa edo

askapena oztopatzen du. Lehenengoa zenbait enJSRVren env genearen

adierazpenaren ondorioa da. JSRVen zelula-hartzailea hialuronidasa-2 proteina da

eta JSRV exogenoarekin elkarrekintzak izaten ditu birusaren sarrera-mailan

(Spencer et al., 2003), baina baita env exogenoarekin ere, zitoplasma- zein mintz-

mailan. Env-hialuronidasa-2 elkarrekintzak JSRV-hartzaile eskuragarritasuna

murrizten du, birusaren sarrera inhibituz. Bigarren blokeoa zenbait enJSRV locusen

gag genearen adierazpenak eragiten du (adibidez, enJS56A1 eta enJSRV-20). 2004.

urtean Mura eta kideek JS56A1 erretrobirus endogenoaren partikulek (homologo

exogenoarekin elkarrekintzak zituen Gag proteina transdominante bat zutenak)

antolaketa erregularra zutela erakutsi zuten eta talde honetan nukleo akasdunen

presentzia frogatu zuten, honela bildutako partikulak ez baitziren zelula-mintzean

zehar garraiatzeko gai.

Ardia (Ovis orientalis aries) erretroelemetuak ikertzeko animalia-eredu interesgarria

da. Jaagsiekte ardi erretrobirusak ardien gaixotasun infekziotsu nagusienetako bat

eragiten du, ardien biriketako adenokartzinoma (OPA) (York et al., 1992).

Erretrobirus hau, hain zuzen, enJSRVekin ahaideturik dago. OPA giza kartzinoma

bronkioalbeolarrarekin alderatu izan da eta beraz, Jaagsiekte erretrobirusaren

ikerketak, gizakian biriketako kartzinogenesia gidatzen duten oinarri genetikoen

inguruko ideiak argitzen lagun lezake (Archer et al., 2007).

Berriki frogatu denez, JSRV/enJSRV familiako ERVak ardiaren genomaren

kolonizatzen dabiltza oraindik ere (Arnaud et al., 2007). Gainera, aipatu bezala

145

duela 200 urte baino gutxiago txertatutako probirus batzuek Gag poliproteina

akasduna dute, fenotipo hau transdominante bilakatzen delarik, JSRV exogenoen

erreplikazio berantiarraren urratsak blokeatuz (Mura et al., 2004; Arnaud et al.,

2007; Murcia et al., 2007; Armezzani et al., 2011).

Hala ere, gaur egun arte Jaagsikete erretrobirusarekin ahaidetutako 30 kopia

endogeno baino gutxiago identifikatu dira 65 ardi-arraza desberdinetan eta

ardiarekin ahaidetutako 8 espezieetan: Capra hircus, C. falconeri, Ovis orientalis aries,

O. orientalis musimon, O. ammon, O. canadensis, O. dalli, Bos taurus eta Budorcas

taxicolor (Arnaud et al., 2007; Mozorov et al., 2007; Wang et al., 2008; Chessa et

al., 2009). Gainera, kopia hauetako asko polimorfikoak direla ikusi izan da eta

beraz, euren banaketa ez da guztiz ezaguna Caprinae taldeko espezieen artean.

Sekuentziatu berri diren ahuntzaren (Dong et al., 2013) eta ardiaren (Jiang et al.,

2014) genomek, hala ere, erretroelementu hauen in silico azterketa ere baimentzen

dute.

Proiektu honen helburua beraz, metodo esperimental zein konputazionalen bidez

enJSRV kopia berriak topatzea izan da, oraindik karakterizatu gabeko espezie

berriak barneratuz analisian. Guztira, gutxienez 40 enJSRV kopia desberdin aurkitu

ziren eta aurkitutako aldakortasun handiak, oraindik ere karakterizatu gabeko

enJSRVak daudela iradokitzen du.

2. Material eta metodoak

2.1. Laginak eta arrazak

Laginak espezie, subespezie eta eskualde geografiko desberdinetatik lortu ziren

(5.1. Taula). DNA erauzketak Caprinae subfamiliako lau espezietik egin ziren,

horietako batzuk enJSRV eramaileak zirela jakinda (Arnaud et al., 2007; Chessa et

al., 2009): lau ardi-arraza (Latxa, Assaf, Rasa aragonesa eta in silico aztertutako

Texel ardi-arraza), bi mufloi (O. orientalis musimon), 8 ahuntz arraza (Arbi, Payoya,

Alpetarra, Palmarra, Murtziar-granadarra, Malagarra, ahuntz pigmeoa eta

Azpigorria) eta bi Pirinioetako sarrio (Rupicapra pyrenaica). Ardien laginak

arnasbideko gaixotasunen monitorizaziopean zeuden artalde esperimentaletatik

lortu ziren, baita beste zenbait artaldeetatik ere, ardiak erailak izan zirenean lortu

146

zirelarik laginak. Biriketako laginak makroskopikoki eta mikroskopikoki aztertu

ziren, OPA tumoreen presentzia/Absentzia baieztatzeko.

Ehunetako laginak %10 formalina tanpoietan gorde ziren, parafina inklusiorako

prozesatu, 4-5 µm-ra moztu eta hematoxilina-eosinarekin tindatu, mikroskopio

bidezko azterketarako. Ikerketa honetan erabilitako ardi guztiak OPA negatiboak

izan ziren, Jaagsiekte birus exogenoaren ugaritzea saihesteko, honen bukaerako

errepikapen luzea (LTRa) berriki txertatutako enJSRVen homologoa baita.

5.1.Taula. Ardiaren lerroko espezieak: laginen informazioa eta sortutako sekuentziak.

Dibergentzia Hernandez-Fernandez & Vrba, 2005; eta Ropiquet & Hassanin, 2005tik atera

dira.

Espeziea Laginak Jatorri geografikoa Klon kopurua Sekuentzien aldakortasuna

D.E.

Rupicapra pyrenaica

RUP141 Pirinioetako sarrioa, Pirinioak 13 0,007 0,001 RUP142 10 0,058 0,007

Ovis o. aries

LAT-44 Latxa arraza, Euskal Herria 20 0,064 0,006 LAT-445 10 0,055 0,008 RAS-8 Rasa aragonesa arraza, Espainiako

ipar-mendebaldea 16 0,042 0,005

RAS-10 12 0,060 0,005 AS-18 Assaf arraza, jatorriz Israelekoa,

Espainian naturalizatuta 10 0,067 0,007

AS-54 10 0,054 0,005 OAR Texel arraza, Herbehereak ! In silico: 57 sek. 0,060 0,006

Ovis o. musimon

MOU-1 Mufloia, Tarragona 13 0,229 0,014 MOU-15 4 0,170 0,013

Capra aegagrus hircus

ARB-117 Arbi arraza, Tunisia 2 0,052 0,006 ARB-120 3 PAY-77

Payoya arraza, Cadiz 1

0,052

0,006 PAY-78 1 PAY-79 1 PAY-80 1 ALP-89 Ahuntz alpetarra, Alpetarra baina

Frantziako Alpeetara asko hedatu zen eta bertako ahuntzekin

gurutzatu

1

0,039

0,006 ALP-92 1 ALP-93 1 ALP-94 2 PAL-E3G2

Ahuntz palmarra, La Palmako uhartea

1 0,008

0,004 PAL-E2G5 1

PAL-E1G2 1 PYG-1 Ahuntz pigmeoa, Afrika

mendebaldea 3 0,065 0,009

MG-49 Ahuntz murtziar-granadarra,

Andaluzia, Murtzia eta Levante

2 0,021

0,007 MG-50 1

MG-51 2 MG-54 2 MAL-348 Ahuntz malagarra, Malaga 1 0,006 0,006 MAL-372 1 AZP-1 Azpigorria arraza, Euskal Herria 2 0,030 0,005 AZP-2 1

Sekuentziatutako klon kopuru totala: 208

5-7 My

0.5 My

147

2.2. DNAren prestaketa

Laburki, biriketako ehunak TES (0.01M Tris, 0.1M EDTA eta 0.5% sodio dodezil

sulfatoa) gehituta apurtu ziren, RNasarekin (100 mg/ml) eta proteinasa K-rekin

digeritu eta fenol-kloroformo erauzketa tradizionalaren bidez erauzi. Pirinioetako

sarrioaren, ahuntzen eta mufloien DNA odol-laginetatik erauzia izan zen.

2.3. enJSRVen detekzio esperimentala

Aztertutako espezie eta subespezieen artean enJSRV sekuentzien aniztasuna

ikertzeko, env-LTR izeneko hasle pare bat erabili zen, enJSRVen env sekuentzian

oinarritutako hasle zuzena, eta aldamenean eskualde kodetzaile bat zuten

probirusen 3’-LTRa anplifikatzen zuen alderantzizko haslea. LTR hasle hauen

diseinua, aurretik ardian deskribatutako enJSRVen LTRen eskualde

kontserbatuetan oinarritu zen (GenBank sarbide zenbakiak: AF136224, AF136225,

AF153615 and EF680296-319) (Palmarini et al., 2000; Arnaud et al., 2007).

PCR guztiak 25 µl-ko bolumenean egin ziren, PCR-rako Advantage 2 tanpoia (BD

Biosciences, Clontech, Palo Alto, CA, USA), 0,2 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2, hasle

bakoitzeko 0,4 mM eta 0,5 U Advantage 2 polimerasa nahasketa barneratuz. PCR

metodoak hasierako desnaturalizazio urrats bat zuen 95ºC-ra 3 minutuz, jarraian

95ºC 30 s, 64ºC 30 s eta 72ºC 1 minutuko 35 ziklo, eta azkenik luzapen urratsa, 5

minutu 72ºC-ra. PCRak fidelitate handiko Advantage 2 polimerasa erabilita egin

ziren, polimerasak eragindako erroreak txikitzeko asmoz. PCR produktuak

elektroforesi bidez aztertu ziren, purifikatu eta zuzenean sekuentziatu,

anplifikatutako eskualdearen identitatea baieztatzeko.

R. pyrenaicarekiko monofiletikoak ziren zenbait enJSRV kopia topatu ziren.

enJSRV talde hau O. orientalis aries-en ere agertzen zela pentsatu zen baina agian

detektatuta izateko nahikoa ez zen maiztasunean. Horregatik sarrioetan agertzen

ziren enJSRVak anplifikatzeko hasle bikote bat diseinatu genuen ikerketa honetan,

lortutako sarrioaren sekuentziatan oinarrituz (GenBank sarbide zenbakia

KC407957). Hasle hauek ‘Sarrioen antzeko enJSRV’ bezala izendatuak izan ziren:

5’-TTTGTTTAGCTCCTTGCCTTATTCG_F-3’ eta 5’-GTCCTGGAGCCTTAA

GGGTAATAAA_R-3’.

148

2.4. enJSRVen in silico detekzioa

Esperimentalki lortutako sekuentziak Query bezala erabili ziren OARv3.0 ardiaren

(Jiang et al., 2014) eta ahuntzaren (Dong et al., 2013) genomen kontra. Estrategia

hau sekuentzien antzekotasunean oinarritu zen eta gene segmentu homologoak

kromosoma bakoitzean bilatu ziren, BLAST lerrokapen erreminta erabiliz

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1990; Mount, 2007).

2.5. Nomenklatura eta sailkapena

Palmarini eta kideek (2000) eta Arnaud eta kideek (2007) erabilitako nomenklatura

jarraitu genuen lehendik karakterizatutako enJSRVetarako. Lehenago Palmarini

eta kideek identifikatutako bi talde nagusiak, enJSRV-A eta enJSRV-B deitutakoak,

bi talde filogenetiko nagusiak deskribatzeko erabili ziren. enJSRV kopiarik

zaharrenak enJSRV-A taldearen baitan taldekatzen dira eta berriki txertatutakoak

(enJSRV polimorfikoak barne) enJSRV-B taldearen baitan. Azkenik, ikerketa

honetan lehenago deskribatu gabeko enJSRVak topatu ziren eta ‘enJSRV Berri’

bezala izendatuak izan ziren.

A

B

env-LTR hasleak Env_F: CCTAGCCTTCATTCACTGTGGCGA LTR_R: GCGGCCAGCACAAYCAAGAG

C

Sarrioen enJSRVak anplifikatzeko hasleak

Sarrio-antzeko_F: TTTGTTTAGCTCCTTGCCTTATTCG Sarrio-antzeko_R: GTCCTGGAGCCTTAAGGGTAATAAA

5.1. Irudia. JSRV endogeno baten egitura, ikerketa honetan sekuentziatutako eskualdeak eta hasleen lotura-guneak erakutsiz. (a) enJSRV probiral baten genomaren egitura, bi hasle bikoteen lotura guneak erakutsiz. (b) enJSRVak sekuentziatzeko erabilitako hasleak. (c) Sarrioen antzeko enJSRVak beste espezieetan anplifikatzeko erabilitako hasleak.

2.6. Klonazioa eta sekuentziazioa

Laginen arteko polimorfismo maila aztertzeko, purifikatutako produktuak TOPO-

TA bektore baten baitan klonatuak izan ziren eta One Shot TOP10 kimikoki

konpetenteak ziren Escherichia coli zeluletan hazi (Invitrogen). Transformatuen

txertatze zuzena frogatzeko, M13 hasle zuzenarekin (-20) eta M13 alderantzizko

LTR gag pro pol orf-x env LTR

149

haslearekin frogak egin ziren. PCR produktuak gel bidezko elektroforesi bidez

testatu ziren. Sekuentziazioa BigDye v.3.1 sekuentziazio-kiteko hasle biekin burutu

zen sekuentzia arrunten kasuan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) edo

GTPBigDye kitarekin sekuentzia zailen kasuan (Applied Biosystems).

2.7. Analisi bioinformatikoak

2.7.1. Sekuentzien egiaztapena eta lerrokapena

Sekuentziak NCBIko BLAST algoritmoaren bidez egiaztatu ziren. Sekuentzia

guztiak Mafft 5.531 bertsioarekin lerrokatu ziren (Katoh et al., 2002, 2005).

2.7.2. Analisi filogenetikoak

Indibiduo berdinen baitan sekuentzia berdinak sortzen dituzten klonak, locus

berdinaren ugaritze errepikatuaren ondorio izan daitezke. Hori dela eta, indibiduo

berdinaren baitan bi klonek sekuentzia berdinak ematen zituztenean, bikoiztutako

sekuentziak baztertzen ziren, sekuentzia bakar batekin geldituz gainontzekoen

adierazgarri bezala indibiduo horren analisi filogenetikoetan.

enJSRV sekuentzien historia filogenetikoa Probabilitate Maximo (ML)

inferentziaren eta inferentzia Bayesiarraren bidez aztertu zen. ML analisiak

RAxML VIHPCrekin burutu ziren (Stamatakis, 2006), 1.000 bootstrap erreplikekin

eta inferentzia Bayesiarrerako, MrBayes 3 erabili zen (Huelsenbeck & Ronquist,

2001). Metropolis-bikotekako Marcov-kate Monte Carlo metodoetarako segida

zenbaki zuzena aukeratzeko, 106 belaunaldietako balioa erabili zen. Emanaldi

kopuruaren desbideratzearen zatiketa <0,1 izan zenez, simulazioa 106 belaunaldiko

bi emanalditan burutzea pentsatu genuen, zuhaitzak 100 belaunaldiro lagindu

zirelarik GTR+I+G sekuentzien eboluzio eredupean. Lehen 2.500 zuhaitzak

baztertu egin ziren eta gainontzeko zuhaitzekin %50 gehiengoaren erregela

kontsentsua ezarri zen. Azkenik, ‘burn-in’ luzera finkatzeko, zuhaitzen %25 balio

lehenetsia erabili zen, belaunaldi gutxi batzuetan lortutako zuhaitzen ML balioen

oinarri bezala.

Detektatu genituen enJSRV kopiak zuhaitz filogenetikoen arabera definitu ziren.

Taldekapen oso bat, aurretik deskribatutako enJSRV kopia bat kontsideratu zen,

150

gutxienez bi metodo filogenetikoetatik batean adierazgarria bazen (bootstrap

balioak 70 MLrako eta 95 inferentzia Bayesiarrerako).

2.7.3. Populazioen genetikako analisiak

enJSRVen aldakortasun genetikoa (batik bat, lehenago ardian deskribatutako

enJSRVetan oinarritutakoa) ostalarien taxon bakoitzerako kalkulatu zen MEGA4

programan (Tamura et al., 2007), env-LTR datuekin lortutako 118 sekuentziak

erabilita. Batez besteko dibertsitatea (d) Kimura 2-parametro ordezkapen modeloa

(Kimura, 1980) erabilita kalkulatu zen taxon bakoitzerako, honela:

xi izanik igarren sekuentziaren maiztasuna i taxonko laginean; q taxon bakoitzaren

sekuentzia desberdin kopurua; eta dij i eta j sekuentzien arteko binakako distantzia

(Tamura et al., 2007). Azkenik, Kimura 2-parametrorako distantzia kalkulatu zen

hiru taxon bikoteetarako, taxon bakoitzaren enJSRV sekuentzietan oinarrituz.

Lau taxon paretarako FSTa kalkulatu zen, taxon bakoitzeko enJSRV sekuentzietan

oinarrituz. Analisi hauek Arlequin 3.11 programarekin egin ziren (Excoffier et al.,

2005). Konparaketa anizkoitzetarako Bonferroni zuzenketa bat egin zen eta

adierazgarritasun estatistiko maila 0,001ean ezarri zen.

3. Emaitzak

3.1. enJSRVen sekuentzia-dibertsitatea

Esperimentalki enJSRVen env eta 3’-LTR eskualdea anplifikatu eta

sekuentziatzeko, kontserbatutako hasle bikote bat erabili zen (‘env-LTR’

deitutakoa). PCRa 32 indibiduotan burutu zen eta sekuentziak espezie guztietarako

sortu ahal izan ziren (5.1. Taula). Guztira 168 sekuentzia lortu ziren enJSRV

klonetarako, baina indibiduo-barruko 10 sekuentzia berdinak izan ziren.

Bikoiztutako sekuentzia hauek analisi gehienetatik kendu ziren, soilik sekuentzien

dibertsitatea (d) aztertzeko erabili zirelarik. Zortzi sekuentzia datu bildumatik

ezabatu ziren, akasdunak zirela eta. Aldiz, in silico analisien bidez 57 sekuentzia

151

lortu ziren ardiaren genoman eta bakar bat ahuntzaren genoman. Beraz, enJSRVen

hurrengo analisiek env-LTR eskualderako 208 sekuentzia izan zituzten guztira.

Lerrokatzeek frogatu zutenez, dibertsitate handia zegoen espezieen artean, espezie

barruko indibiduoen artean eta baita indibiduoen barruan ere. Dibertsitate honen

baitan mutazio puntualak eta txertatze/delezioak topatu ziren. Aztertutako

espezieen artean, mufloiak enJSRV dibertsitate altuena zuen (d: 0,06589 eta d.e.:

0,00689), eta aldiz, Pirinioetako sarrioak dibertsitate baliorik baxuenak (d: 0,03309

eta d.e.: 0,00412). Esperimentalki aztertutako hiru ardi arrazen artean ere

desberdintasun adierazgarriak topatu ziren. Latxa arrazak dibertsitate mailarik

altuena azaltzen zuen (d: 0,0644 eta d.e.: 0,00815), berriz, Rasa Aragonesaren

dibertsitatea nahiko baxua zen (d: 0,04905 eta d.e.: 0,00435), O. o. ariesen batez

besteko dibertsitatearekin alderatuz gero behintzat (d: 0,0569 eta d.e.: 0,00673). In

silico lortutako Texel arrazako sekuentzien dibertsitatea O. o. ariesen batez

bestekoaren oso antzekoa izan zen (0,06001 eta d.e.: 0,00651) (5.1. Taula, 5.2.

irudia).

Ahuntz arraza desberdinen artean ere dibertsitate aldaketa nabarmena aurkitu zen

(5.1. Taula). Arraza malagar (d: 0,006 eta d.e.: 0,006) eta palmarrak (d: 0,008 eta

d.e.:0,004) oso dibertsitate baxua azaldu zuten eta ahuntz pigmeoak dibertsitate

indizerik altuena (d: 0,065 eta d.e.: 0,009), ahuntzaren batez besteko

dibertsitatearen gainetik (d: 0,042 eta d.e.:0,005) (5.1 Taula, 5.2. Irudia).

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

Dib

erts

itate

a

Espezieen arteko batez besteko distantziak

O.o.aries

O. o. musimon

R. pyrenaica

Rasa aragonesa

Latxa Assaf

C. hircus

5.2. Irudia. enJSRVen artean aurkitutako dibertsitatearen laburpena taxonka.

152

3.2. Esperimentalki detektatutako enJSRVen analisi filogenetikoak

Analisi filogenetikoak env-LTR hasle bikotearekin lortutako 150 sekuentziekin eta

in silico lortutako 58 sekuentziekin burutu ziren (57 ardirako eta soilik bat

ahuntzerako). Analisiak aurretik publikatutako O. orientalis ariesen enJSRV

sekuentziak barneratzen zituen, GenBanken eskuragarri daudenak eta enJSRVen

intereseko eskualdea guztiz gainjartzen dutenak (GenBank sarbide zenbakiak:

AF136224, AF136225, AF153615 and EF680296-319) (Palmarini et al., 2000;

Arnaud et al., 2007a). Lortutako sekuentzia probiralekin egindako analisi

filogenetikoek bi talde nagusi erakutsi zituzten (5.3 eta 5.4. irudiak), lehendik

Palmarini eta kideek (2000) deskribatu eta izendatu bezala: enJSRV-A eta enJSRV-

B, txertatze zaharrak eta modernoak taldekatzen dituztenak, hurrenez hurren

(Arnaud et al., 2007a).

enJSRV-A taldearen barruan, R. pyrenaicaren sekuentzia guztiak talde berdinaren

baitan batzen ziren eta beraz, talde hau “Sarrioen-antzeko” bezala izendatua izan

zen. Sarrioen-antzeko taldea txertatze erretrobiral bakarraren emaitza zela zirudien.

Aztertutako sei ardietan ez zen lan honetan diseinatutako sarriorako hasle

espezifikoekin anplikoirik lortu eta beraz, kopia honen espezie-espezifikotasuna

frogatu genuen esperimentalki. Ahuntzen txertatze guztiak enJSRV-A taldearen

barruan azaltzen ziren baina espezie honetarako, taldekatzea ez zen hain

nabarmena izan. Lan honetan gutxienez 40 enJSRV kopia berri detektatu ziren.

Hala ere, enJSRV-B taldeko (txertatze berriak) enJSRVak elkarren artean

antzekoegiak dira oraindik probirus berriak ote diren ondorioztatzeko (behintzat

aztertutako env-LTR sekuentzian oinarriturik).

0.5829

0.8847

0.5303 0.9983

5.3. Irudia. Ardiaren lerroko espezieetatik lortutako 208 sekuentzien erlazio filogenetikoa, enJSRVen env eta 3’-LTRa barneratzen zituen 727-bp-ko lerrokatze bat erabilita. Sekuentziak env-LTR hasle bikotea erabilita lortutako PCR anplikoien klonetatik eta in silico lortutako 58 sekuentzietatik eratorri ziren (5.1. Taula) eta GenBanketik lortutako 27 sekuentzia barneratzen dira erreferentzia modura (zuriz) (GenBank sarbide zenbakiak: AF136224, AF136225, AF153615 eta EF680296-319). Sekuentzien izendapenak espeziearen izena, lagin zenbakia eta klon zenbakia barneratzen ditu, hurrenez hurren (LAT, Latxa ardirako; RAS, Rasa Aragonesa ardirako; AS, Assaf ardirako; OAR in silico lortutako sekuentzietarako; MOU, Mufloirako; RUP, Sarriorako; ARB, Arbi ahuntzerako; PAY, Payoya ahuntzerako; ALP, ahuntz Alpetarrerako; PAL, ahuntz Palmarrerako; PYG, ahuntz pigmeorako; MG, ahuntz murtziar-granadarrerako; MAL, ahuntz malagarrerako; eta AZP, ahuntz azpigorrirako), eta taxonka koloretu dira: O. o. aries (berde iluna; ohartu in silico lortutako sekuentziak ere berde ilunez adierazita daudela), O. o. musimon (berde argia), R. pyrenaica (laranja) eta C. a. hircus (urdin iluna). Filogenia ML eta analisi Bayesiarretik inferitu da. Adarren gainean probabilitate Bayesiarrerako balioak erakusten dira (gorriz balio onak eta urdinez baxuak). Antzinako enJSRV kopiak enJSRV-A taldearen baitan barneratzen dira eta kopia modernoak (polimorfikoak barne), enJSRV-B taldearen baitan (Palmarini et al., 2000).

153

AS-18-1 LAT-44-21 enJSRV-24

AS-18-10 enJSRV-23 enJSRV-4 enJSRV-8 LAT-44-84

OAR18-677

RAS-10-36 LAT-445-12 AS-18-2

AS-18-7 AS-18-5

AS-54-36 enJSRV-15 AS-54-10 AS-54-32 RAS-8-117 AS-54-16 AS-54-27 enJSRV-14 OAR3-3926 AS-54-28 LAT-44-94 RAS-8-102 AS-54-36 AS-54-6 enJS56A1 enJS516 enJSRV-11 enJSRV-13 MOU-1-12 enJSRV-2 RAS-8-74 enJSRV-16 enJSRV-18 enJSRV-19 enJSRV-20 enJSRV-26 enJSRV-9 enJSRV-7 MOU-1-4 MOU-1-9 LAT-44-100 LAT-44-18 LAT-445-18 RAS-10-12 OAR13-375 LAT-445-17 MOU-1-7 LAT-44-45 LAT-44-49 RAS-8-94 LAT-445-38 LAT-445-42 LAT-445-68 LAT-44-59 MOU-15-3 LAT-44-92 LAT-44-98 RAS-10-14 RAS-10-26 RAS-10-27 RAS-10-29 RAS-10-37 RAS-10-6 RAS-10-7 RAS-8-101 RAS-8-110 RAS-8-123 RAS-8-50 RAS-8-74 RAS-8-75 RAS-8-88 RAS-8-9 RAS-8-19 OAR1-2537 OAR1-1762 OAR3-3927 OAR3-1517 OAR3-5368 OAR5-6122 OAR6-1301 OAR6-6798 OAR8-4949 OAR8-3200 OAR11-320 OAR17-488 OAR13-169 OAR15-423 OAR20-489 OAR20-299 OAR21-670 OAR23-469 OAR25-379 OAR26-262 OARX-1052 OARX-4137 ARB-120-2 PAL-E2G5-1

PAL-E3G2-1 PAY-80-2 PYG-1-2 MG-49-1 OAR20-811 AS-18-6 OAR14-150 AS-54-29 enJSRV-25 OARX-1105 enJSRV-17 LAT-44-25 LAT-44-39 MOU-1-1 MOU-1-10 RAS-10-17 OAR19-526 enJSRV-21 LAT-44-91 MOU-1-3 OAR13-268 OARX-4824 OAR8-1313 enJS59A1 OARX-1261 OAR11-282 OAR16-673 enJSRV-6 LAT-44-82 LAT-44-83 RAS-8-25 MOU-1-2 OAR1-2400 LAT-44-24 LAT-44-86 LAT-44-87 OAR1-2333 OAR16-493 OAR20-276 OAR5-4520 OAR15-441 OAR3-5379 OAR6-1153 OAR10-421 OAR14-138 OAR12-619 OARX-8085 enJSRV-5 OAR20-291 OAR2-1704 OAR3-1827 OAR19-160 OAR24-907 AS-18-3 enJSRV-3 LAT-44-38 LAT-445-31 MOU-1-5 MOU-15-4 MOU-1-6 OAR14-572 OAR20-310 AS-18-4 enJSRV-1 LAT-44-85 RUP-142-5 LAT-44-88 RAS-8-103 RAS-8-94 OAR23-165 AS-18-9 AS-54-38 MOU-1-11 RAS-10-36 OAR13-669 MAL-348-3 PAY-80-1 ALP-94-3 AZP-1-4 PAY-77-3 AZP-2-3 CAHI25 ALP-94-7 ALP-92-5 ARB-120-1 MG-51-2 ARB-120-4 ARB-117-1 ARB-117-2

-2

-1

AZP-1-1

-2

-1

MAL-372-1

-2

-1

MG-50-2

-2

-1

PAY-79-1

-2

-1

PAY-76-1

-2

-1

PYG-1-1

-2

-1

RUP-141-13

-2

-1

RUP-141-15

-2

-1

RUP-141-16

-2

-1

RUP-141-17

-2

-1

RUP-141-18

-2

-1

RUP-141-20

-2

-1

RUP-141-21

-2

-1

RUP-141-4

-2

-1

RUP-141-14

-2

-1

RUP-142-18

-2

-1

RUP-142-2

-1

RUP-142-4

-1

RUP-142-7

-1

RUP-141-22

-1

ALP-89-2

-1

MG-51-3

-1

MG-49-7

-1

AS-54-31

-1

enJSRV-10

-1

OAR7-3593

-1

0.3

enJSRV mota

enJSRV-13 antzeko Polimorfikoa enJSRV-20 enJSRV-19 antzeko enJSRV-2 enJSRV-10 enJSRV berria enJSRV-21 antzeko enJSRV-6

Ovis o. aries

OARv3.0 Ovis o. musimon

Rupicapra pyrenaica

Capra a. hircus

CAHI

ESPEZIEAK

enJSRV-B

enJSRV-A

Sarrioen-antzeko kladoa

0.735

0.8234

0.6049

0.9282

0.8346

0.9349

0.7898

0.7140

0.9695

1

0.5823

0.5051

0.6476

0.7528

0.5091

0.9417

0.8206 1

0.9993

0.5044

0.9209 0.8552

0.9559

0.9883

0.5847 0.8126

0.7316 0.9332 0.5021 0.7335

0.9980

0.8263 0.8666

0.6452

0.8853

0.9843 0.9112

0.9990 0.7606

0.5017

0.7612 0.9817 0.9541 0.9515

0.9983 0.9968 0.9402

0.8425 0.9889 0.6153

0.6104 0.8129 0.9652 0.6340

0.500

0.6340

0.5442

0.7006

0.8968

0.9799

0.8821

0.5284

0.8630 0.6109

0.6996

0.9703

1 0.6878

1 0.9909 0.9708

0.5939 0.5939 0.5111

0.9879

0.9111 0.6826

0.9991

1

1

0.9972

1

0.9869 0.6790

154

3.3. enJSRVen arteko konparaketak espezie barruan eta espezieen artean

Espezie barruan, R. pyrenaicak dibertsitate genetiko baliorik baxuenak azaldu

zituen, enJSRV sekuentzien homogeneotasun altua iradokiz (5.2. Irudia). Emaitza

hau bat zetorren espezie honen taldekapenarekin env-LTR filogenian (5.3. Irudia),

bertan R. pyrenaica sekuentzien %93 talde bakarraren baitan azaltzen baitzen.

Gainera, Pirinioetako sarrioan soilik bi enJSRV kopia desberdin aurkitu ziren eta

sekuentzietatik 14, lehendik deskribatu gabeko enJSRV bati zegozkion (5.4. Irudia).

Espezie eta arraza barruan ikusten zen enJSRV sekuentzia-dibertsitatea ere bat

zetorren taxon bakoitzaren enJSRV proportzioarekin eta dibertsitate honek,

zuhaitzaren baitan taxonek azaltzen zuten taldekapen maila islatzen zuen (5.4.

Irudia). Ahuntzetan ez zen aurretik deskribatutako enJSRV kopiarik aurkitu

(enJSRV-6 eta enJSRV-10), kopia guztiak berriak izan zirelarik eta denak enJSRV-

A taldekoak eta ahuntzen espezifikoak (5.4. Irudia). Azkenik, mufloiek eta ardiek

ia enJSRV kopia-kopuru berdina azaltzen zuten baina O. orientalis musimonen

enJSRV-A kopia-proportzioa zertxobait altuagoa zen.

Horrez gain, Kimura 2-parametro distantzia estimatu zen, espezie eta subespezie

desberdinen enJSRV sekuentziak alderatzeko. Distantziarik altuenak R. pyrenaica

eta O. orientalis aries arteko konparaketei zegozkien (0,07915±0,01833) eta baxuenak

C. a. hircus eta R. pyrenaica (0,05338±0,01175) eta O. orientalis aries eta O. orientalis

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 enJSRV berria enJSRV-18 antzeko enJSRV-2 enJSRV-17 antzeko enJSRV-13 antzeko enJSRV-21 antzeko enJSRV-6 enJSRV-10

O. o. aries O. o. musimon R. pyrenaica

enJSRV-B

C. a. hircus

5.4. Irudia. Taxon bakoitzerako env-LTR sekuentzien eta talde bakoitzaren proportzioa. enJSRV mota

guztiak Arnaud eta kideek (2007) publikatutako taldeen arabera izendatu dira, enJSRV kopia bakoitza

ardiaren lerroko espezie jakin batzuetan duen presentzia/absentziaren arabera taldekatuz. enJSRV-A eta

enJSRV-B kopien proportzioa ere erakusten da.

enJSRV-A

155

musimonen arteko konparaketei (0,05386±0,01068). Hala ere, analisia arrazaka egin

zenean distantziarik altuenak ahuntz arraza palmarra barneratzen zuten

konparaketekin lortu ziren eta bereziki ahuntz palmarraren eta ahuntz murtziar-

granadarraren arteko konparaketekin (0,11516±0,02895). Aldiz, distantziarik

baxuenak ahuntz malagarraren eta murtziar-granadarraren arteko konparaketei

zegozkien (0,00703±0,00703) (5.5. Irudia).

5.5. Irudia. Taxon desberdinetan aurkitutako enJSRV sekuentzien arteko erlazioa, kaprido taxonen enJSRV sekuentziak binaka konparatzetik sortutako distantzia matrize batetik aurrera sortua MEGAn. (A) Binakako konparaketa espezie guztietako arrazak konparatuz Kimura 2-parametro distantziaren arabera. (B) Binakako konparaketa espezie guztiak binaka konparatuz Kimura 2-parametro distantziaren arabera. * P<0,05.

Azkenik, taxonen arteko enJSRV sekuentziak konparatzean, FST baliorik altuenak

ardia eta sarrioa, edo mufloia eta sarrioaren arteko konparaketetan lortu ziren (FST

Ovis o. aries-R. pyrenaica: 0,569 [p=0] eta FST Ovis o. musimon-R.pyrenaica: 0,522

[p=0]). Etxeko ardia eta mufloien arteko konparaketetan edo sarrio eta ahuntzen

arteko konparaketetan ez zen desberdintasun esangarririk topatu (5.2. Taula).

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

PA

L-R

UP

M

G-P

AL

M

AL

-PA

L

AL

P-P

AL

A

RB

-PA

L

AS

-MG

A

S-R

UP

A

RB

-AS

M

G-R

AS

LA

T-P

AL

A

S-M

AL

L

AT

-MG

R

AS

-RU

P

LA

T-R

UP

A

LP

-AS

P

YG

-RU

P

MO

U-M

G

MO

U-R

UP

A

RB

-LA

T

MG

-PY

G

AR

B-R

AS

A

RB

-MO

U

AZ

P-P

AL

M

OU

-PA

L

PA

L-R

AS

L

AT

-PY

G

AL

P-R

AS

A

LP

-LA

T

AS

-PA

L

MA

L-R

AS

L

AT

-MA

L

AS

-AZ

P

AL

P-M

OU

A

S-P

YG

M

AL

-MO

U

AL

P-P

YG

P

YG

-RA

S

MA

L-P

YG

M

OU

-PY

G

AZ

P-L

AT

A

ZP

-RA

S

AZ

P-M

OU

A

S-P

AY

A

RB

-PY

G

LA

T-P

AY

P

AY

-RA

S

MO

U-P

AY

M

G-P

AY

P

AY

-RU

P

PA

L-P

AY

A

ZP

-PY

G

AS

-LA

T

LA

T-M

OU

A

RB

-PA

Y

AZ

P-M

G

AL

P-P

AY

A

ZP

-RU

P

AR

B-A

ZP

A

S-M

OU

P

AY

-PY

G

LA

T-R

AS

A

LP

-AZ

P

MA

L-P

AY

M

OU

-RA

S

AL

P-A

RB

A

S-R

AS

A

ZP

-PA

Y

AZ

P-M

AL

A

LP

-RU

P

PA

L-P

YG

A

RB

-RU

P

AR

B-M

G

AL

P-M

G

AL

P-M

AL

A

RB

-MA

L

MG

-RU

P

MA

L-M

G

MA

L-R

UP

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1

A

Dis

tan

tzia

* *

*

* *

*

*

*

*

*

* * *

*

* *

*

* *

*

B

*

Dis

tan

tzia

* * *

156

5.2. Taula. FST balioak espezieen arteko enJSRV sekuentziak erabilita. Adierazgarritasun maila p<0,001ean ezarri zen Bonferronirekin zuzendu eta gero. FST P-balio adierazgarriak azaltzen dituzten espezie bikoteak letra lodiz adierazita daude.

Konparaketa FST balioa P-balioa

C. aegagrus hircus – O. o aries 0,38304 0 ***

C. aegagrus hircus – O. o. musimon 0,18995 0,00098 ***

C. aegagrus hircus – R. pyrenaica 0,19396 0,00586

O. o. aries – O. o. musimon 0,04972 0,06836

O. o. aries – R. pyrenaica 0,56878 0 ***

O. o. musimon – R. pyrenaica 0,52188 0 ***

*** P<0,0001

4. Eztabaida

4.1. enJSRV dibertsitatea ardiaren lerroko espezieen artean

Analisi esperimentalen bidez, enJSRV sekuentziak modu arrakastatsuan anplifikatu

ziren espezie guztietan eta 208 sekuentzia sortu ziren, in silico lortutako 58

sekuentziak barneratuz. Ikerketa honetan lehen aldiz aztertu da enJSRVen

dibertsitatea modu kuantitatibo batean eta hau izan da R. pyrenaica populazioetan

enJSRV dibertsitatea ikertzen lehen lana. Behatu genuenez, enJSRV dibertsitatea

nahiko desberdina zen aztertutako lau espezieen artean, baina baita espezie bereko

indibiduoen artean zein indibiduo barruan ere.

enJSRV sekuentzietan desberdintasunik handienak, ardi eta mufloiak sarrio eta

ahuntzekin alderatzean ikusi ziren. Behatu genuenez, R. pyrenaicak dibertsitate

patroirik baxuenak azaltzen zituen eta emaitza hau bat zetorren espezie honetan

aurkitutako enJSRV kopia dibertsitate baxuarekin. Dirudienez, R. pyrenaicak batik

bat enJSRV infekzio bakarra jasan du eta bestelako enJSRV kopien bidezko

sarrioaren genomaren kolonizazioa anekdotikoa izan da. Honen arrazoia,

sarrioaren isolatze maila izan liteke, behintzat beste hiru espezieenarekin alderatuz,

hauek artaldeetan bizi baitira. Lehenago ere iradoki izan da taldearen tamaina

arrisku-faktore bat izan litekeela zenbait gaixotasunen transmisioan (Gardner et al.,

2002).

O. orientalis aries eta O. orientalis musimonek ia enJSRV kopia berdinak zituzten baina

antzinako kopien proportzioa altuagoa zen O. orientalis musimonen. Izan ere,

proposatu izan da mufloia lehen aldiz etxekotutako ardien aitzindaria izan

157

litekeela, berriro ere bizitza basatira birmoldatutakoa (Hiendler et al., 2002). Beraz,

litekeena da mufloiak infekzio horiek lehen aldiz etxekotua izan zenean pairatu

izana, duela ~9.000 urte (Harris, 1996).

Azkenik, O. orientalis aries enJSRV kopia moderno gehien zituen espeziea izan zen,

ardiak berriki enJSRV hauen ugaritzea jasan duela iradokiz, Arnaud eta kideek

(2007) lortutako emaitzak indartuz. Gainera, hautespen positibopean dagoen

probirus nagusia, enJS56A1 probirusa (eta honen kopia transdominantea, W21

Gag aldakia duen enJSRV-20 probirusa) berriki txertatu da (Armezzani et al.,

2011). enJSRV modernoen artean kopia desberdinak definitzea zaila suertatzen da

elkarren artean antzekoegiak direlako eta beraz, baliteke hauetako asko, hain zuzen

enJS56A1 kopiak izatea, eta ondorioz, hauek ere hautespen positibopean egotea.

Izan ere, frogatu izan denez, ardiak probirus honen kopia ugari lortu ditu

genomaren ugaritze bidez (Armezzani et al., 2011). Ondorioz, honek azal lezake

enJSRV-B taldearen baitan aurkitutako enJSRV kopia-kopuru handia. Hala ere,

hipotesi hau frogatzeko sekuentzia osoak (W21 Gag transdominantea barne) behar

izango lirateke.

Emaitza hauek bat datoz lau espezieetarako behatutako env-LTR filogeniaren

taldekapenarekin, bi talde nagusietan azaltzen baitira, enJSRV-A eta enJSRV-B

deitutakoak (Palmarini et al., 2000) (5.3. Irudia): O. orientalis aries eta O. orientalis

musimon espezieen sekuentziak enJSRV-A zein enJSRV-B taldeetan agertu ziren.

Aldiz, R. pyrenaicaren enJSRV sekuentzietatik guztiak, bat izan ezik, Sarrioen-

atzeko probirusen taldean (enJSRV-A) taldekatu ziren eta antzeko patroi bat behatu

zen C. aegagrus hircusen probirusekin, guztiak azaltzen baitziren enJSRV-A

taldearen baitan. Gainera, ahuntzaren genoman enJSRV-6 eta enJSRV-10

probirusak daudela deskribatu izan da (Arnaud et al., 2007a), baina lan honetan ez

da horietako bakar bat ere anplifikatu ez in silico eta ezta esperimentalki ere, nahiz

eta erabilitako hasleek probirus horiek anplifikatzeko gaitasuna izan (ikusi AS-54-

31 klona enJSRV-10 probiruserako; eta MOU-1-2, LAT-44-82, LAT-44-83 eta

RAS-8-25 klonak enJSRV-6 probiruserako). Azkenik, ahuntz palmarraren

probirusak nabarmenki desberdinak zirela behatu genuen Kimura 2-parametro

distantziaren bidez. Ahuntza arraza hau Kanariar Uharteetan bizi da eta ematen

duenez, ahuntz palmarrak jasandako infekzioak, ingurune isolatu horretan

158

garatutako enJSRV probirus baten infekzioaren ondorio izan daitezke. Ahuntz

pigmeoak dibertsitate indizerik altuenak aurkeztu zituen eta etxe-abere moduan

erabiltzen den arraza bat izanik, honen dibertsitate altuagoa espero zitekeen.

Azkenik, eskualde geografiko berdineko Latxa ardi-arrazak eta ahuntz azpigorriak

desberdintasun esangarriak azaltzen zituztela ikusi genuen, espezie desberdinen

artean probirusaren hedapena zailagoa dela iradokiz (5.5. Irudia).

Ikerketa hau Caprinae lerroko enJSRV kopia guztien proportzioaren lehen analisi

kuantitatiboa bada ere, zenbait presentzia/Absentzia analisi egin izan dira enJSRV

kopia bakoitzerako (Palmarini et al., 2000; Arnaud et al., 2007a). Etxeko katuaren

eta honekin ahaidetutako Felis generoko espezie basatien hozi lerroan katuen

leuzemia birusarekin (FeLV) egin diren ikerketetan, lan honetan deskribatutako

antzeko emaitzak lortu dira, FeLVen eta espezie hauen hozi lerroen arteko

elkarrekintza historia konplexua iradokiz (Polani et al., 2010). Aurkikuntza hauek

gainera analogoak dira primateetan ikusitako patroi desberdinekin, gizakian ere

agertzen diren ERVak ikertzean (Bannert and Kurth, 2006). Hain zuzen, ardiaren

lerroko arraza eta espezieetan detektatutako enJSRV patroi desberdinak, ostalari

hauen genomaren enJSRVen inbasio, ugaritze edo homogeneizazio desberdinen

ondorioa dira.

5. Datuen bilketa

Sekuentzien datuak GenBanken publikatu dira (sarbide zenbakiak KC407956-93

eta KC414197). Soilik adar desberdinetan taldekatu diren sekuentziak eta beraz,

berritzat jo ditugun sekuentziak aukeratu dira GenBanken publikatuak izateko.

Esker onak

JA Rodriguez doktorea teknika esperimentalekin laguntzeagatik eta A Larruskain

doktorea iruzkinengatik. I Montes doktorea iradokizunengatik eta populazio

analisiekin laguntzegatik eta F Lock doktorea (Terry Fox laboratory, British

Columbia Cancer Agency, Vancouver) ingeles zuzenketengatik. Azkenik, M Amills

doktorea, A Noce doktorea, J Salinas eta izeba Maitetxu ahuntz laginengatik. R

Bolea, I Martín-Burriel, JJ Badiola, RA Juste eta E Minguijón doktoreak ardi

laginengatik eta J Herrero eta A Dominguez doktoreak sarrio laginengatik.

159

6. KAPITULUA

EZTABAIDA OROKORRA ETA

ONDORIOAK

160

161

6. KAPITULUA

EZTABAIDA OROKORRA ETA ONDORIOAK

Eztabaida orokorra

Erretrobirus exogeno tumorigenikoekiko analogiaz, ERVek minbiziaren

patogenesiarekin lotura azaldu izan dute (Nakagawa & Harrison, 1996; Löwer,

1999; Blomberg et al., 2005; Ruprecht et al., 2008). Animalia-ereduetan lortutako

emaitzek ondorioztatzen dutenez, ERVek transformazio gaiztoa edo tumoreen

hazkuntza eragin dezakete, bai txertatze-mutagenesi bidez edo tumorearen

immunobiziraupena indargabetuz.

Jaagsiekte Ardi Erretrobirusa (JSRV), Ardien Biriketako Adenokartzinoma (OPA)

gaixotasunaren eragile nagusia da, erretrobirusek eragindako ardien gaixotasun

arruntenetako bat eta mundu osoan zehar hedatuta dagoena. Gainera, OPA giza

Kartzinoma bronkioalbeolar (BAC) minbizirako eredutzat proposatu da, bi

gaixotasunek baitituzte ezaugarri kliniko eta estruktural antzekoak. Hori dela eta,

enJSRVen ikerketa ardian, giza birikako minbiziaren kartzinogenesia gidatzen

duten mekanismo molekularren ulemenean lagungarria izan daiteke.

Tesi honen 2. eta 3. kapituluetan, bi hurbilketa desberdin erabili ziren enJSRVek

OPAren patogenesian jokatzen zuten papera ikertzeko helburuz. Alde batetik,

enJSRV polimorfikoak erabili genituen markatzaile genetiko modura, hauen eta

OPAren arteko asoziazioa ikertu ahal izateko. Bestalde, bi hurbilketa esperimental

eta in silico bilaketa bat erabili genituen enJSRVak ardien kromosomen baitan

kokatzeko helburuarekin eta enJSRV/gene elkarrekintzak identifikatzeko asmoz.

ERVak gaixotasun desberdinekin asoziatutako polimorfismoen markatzaile

genetiko modura erabili daitezkeen genomako elementuak dira baina

inguruneko/barneko estresaren markatzailetzat ere erabilgarriak izan daitezke

(Clausen, 2003). Hala ere, oso ikerketa gutxik erabili dituzte ERVak gaixotasunen

markatzailetzat eta gehienek, analisi filogenetikoetarako eskualde informatibo gisa

erabili dituzte. Hain zuzen ere, ERVen presentzia edo absentzia, espeziazioa

162

ikertzeko erabili daiteke, erretrobirus bakoitzaren presentzia ostalariaren genoman

txertatze gertakizun bakar baten emaitza baita eta beraz, eskualde genomiko

berdinean probirus jakin bat elkarbanatzen duten populazioak filogenetikoki

ahaideturik egongo baitira (Minghetti & Dugaiczyk 1993; Zhu et al. 1994; Arnaud

et al., 2007a).

Gure taldean OPA gaixotasun klinikoa ikertzeko burututako esperimentuetan

(Larruskain et al., 2010, 2012) MHCa, zitokina bat (IFNγ), eta sortzetiko

immunitate locusak (TLR4 eta SP-A) identifikatu ziren gaixotasunaren

patogenesiaren eragile modura (Arnaud et al., 2008; Griffith et al., 2010;

Larruskain et al., 2013) eta gizakietan, HML-2_sLTR(1p13.2) probirusaren

homozigositateak birikako adenokartzinomarekin lotura azaldu zuen emakume ez-

erretzaileetan (Kahyo et al., 2013). Hala ere, tesi honen emaitzek enJSRVen eta

OPAren artean loturarik ez dagoela iradokitzen dute. Izan liteke, hain zuzen ere,

benetan ez egotea asoziazio-genetikorik enJSRV polimorfikoen eta OPAren artean.

Hala ere, ikerketa honen mugak lagin-tamaina eta probirusen aukeraketa izan dira,

analisi guztiak aurretik deskribatutako markatzaile polimorfikoetara mugatu

baikenituen (Arnaud et al., 2007a) eta ez baikenuen enJSRV locus berririk bilatu

minbizi-ehunetan, beste lan batzuetarako egin izan den moduan (Kahyo et al.,

2013; Wildschutte et al., 2014). Beraz, lan honek argi uzten du garrantzitsua dela

locus polimorfiko berrien bilaketa sakon bat egitea gaixotasunen eta ERV

polimofikoen arteko lotura posiblea ikertzerako orduan.

enJSRV/gene elkarrekintzak identifikatzerakoan, kontutan hartu behar da ERV

txertatze batzuek sekuentzia jakinekiko lehentasuna azaltzen dutela. Zenbait

probirusek eta horien artean GIB edo MLV birusek, sekuentzia palindromiko

ahuletan txertatzeko joera azaltzen dute (Wu et al., 2005) eta lehentasun hauek

DNA egituraren menpekoak izan ohi dira. Zenbaitetan aldiz, txertatzea prozesu

oportunistago baten ondorio izan daiteke, infekzioari asoziatutako gene jakinen

adierazpenarekin lotutakoa.

enJSRVen txertatze-joera OPA gaixotasunaren testuinguruan aztertua izan da,

txertatze-mutagenesia eta Env proteinak gidatutako mutagenesia baitziren ustez,

JSRV birusak OPA gaixotasuna eragiteko zituen mekanismo nagusiak (Cousens et

al., 2004; Philbey et al., 2006). Ikerketa horietan hala ere, albo-sekuentzien BLAST

163

analisien bidez ez zen inolako motibo onkogenikorik edo txertatze-leku berdin-

berdinik topatu tumore desberdinen artean, zorizko banaketa zutela iradokiz

(Cousens et al., 2004). Aurkikuntza hauek aditzera ematen dutenez, OPA

gaixotasuna gertakizun onkogeniko desberdin eta independenteen ondorioz

garatzen da eta ezin da baieztatu txertatze-mutagenesiaren ondorio denik (Philbey

et al., 2006). Hain zuzen ere, ez dirudi enJSRVek sekuentzia jakinetan txertatzeko

joera azaltzen dutenik baina lan honetan, infekzioari asoziatutako geneen

adierazpena eraldatzeko arrisku-faktoreak betetzen zituzten txertatzeak topatu dira.

Zenbait ikerketek ERVek giza geneen promotore modura jokatzen duten paper

garrantzitsua frogatu dute (van de Lagemaat et al., 2003; Conley et al., 2008;

Cohen et al., 2009; Faulkner et al., 2009; Nigumann et al., 2012), eta ama-zelulen

eta zelula pluripotenteen kasuan ERVen promotoreek, bereziki LTRek, RNA ez

kodetzaileen adierazpenean betetzen duten funtzio garrantzitsua azaleratu dute

(Kelley & Rinn, 2012; St Laurent et al., 2013; Lu et al., 2014; Fort et al., 2014).

ERV gehienak transkripzionalki isilarazita daude zelula somatiko arruntetan baina

minbizi egoeratan, ERVek muga epigenetikoa gainditu dezakete aktibo bihurtuz

(Szpakowski et al., 2009; Ross et al., 2010; Belancio et al., 2010) eta minbizi

transkriptometan eraginez. Gainera, enJSRV probirus batzuek JSRV exogenoa

blokeatzeko gai den locus transdominante baten eramaileak dira eta hauen

erreplikazioa positiboki hautatua izan da eboluzioan zehar (Arnaud et al., 2007a, b;

Mura et al., 2004; Murcia et al., 2007; Armezzani et al., 2011). Berriki (duela 200

urte baino gutxiago) enJSRV transdominanteari ihes egiteko gai diren birusak

garatu dira (Arnaud et al., 2008). Beraz, pentsatzekoa da enJSRVen papera

garrantzitsua dela OPA minbiziaren testuinguruan.

Hain zuzen ere, 2. kapituluan ustezko hiru enJSRV-gene transkrito kimeriko

aurkitu ziren, zeintzuetan enJSRVak promotorearen funtzioa betetzen zuen eta

gene-kodetzaileekin elkarrekintzak izan, Ensembl!-ko datuen arabera. Hala ere,

elkarrekintza hau ezin izan zen esperimentalki frogatu ardien ehun osasuntsuetan,

eta beraz, etorkizunean analisiek OPA tumore laginak barneratu beharko dituzte

enJSRV/gene elkarrekintzak aztertzeko minbizi-ingurune genomikoan.

Ondorioz, ez dirudi enJSRVak, berez, onkogenikoak direnik eta are gehiago,

probirus gehienak gutxienez gene baterako akasdunak dira. Hala ere, hauen RNA

164

edota proteinen adierazpen-maila altua da, bereziki emeen ugal-organoetan eta

fetu-ehunetan (Palmarini et al., 2001b; Spencer et al., 2003). Garapenean zeharreko

enJSRVen adierazpena garrantzitsua izan daiteke timoan, JSRV exogenoarekiko

immunotolerantzia eragin baitezake (Griffiths et al., 2010). Gainera, enJSRV

probirusek RNA eta proteinak ekoizteko duten gaitasuna dela-eta, asko ikertuak

izan dira bete ditzaketen funtzio fisiologiko eta patologikoengatik.

Tesi honen 4. kapituluan aurkezten diren emaitzek enJSRVen biologiaren alderdi

garrantzitsuak biltzen dituzte, lehendik ezezagunak zirenak. ERVak hormonak

jariatzen dituzten ehunetan bereziki aktiboak direla dakigun arren (Kim et al.,

2004), enJSRVen adierazpen analisiak emeen ugal-organoetara mugatu dira batik

bat (Dunlap et al., 2005; Dunlap et al., 2006a; Dunlap et al., 2006a; Dunlap et al.,

2006b; Spencer & Palmarini, 2012) eta gizaki eta saguetan, zenbait ERV familiek

espermatogenesiarekin loturiko funtzio biologikoren bat izan dezaketela iradoki

izan da (Mi et al., 2000; Sichangi et al., 2002). Lan honetan, lehen aldiz enJSRVen

env eta orf-x geneen gain-adierazpena behatu da arren ugal-organoetan (aharien

barrabiletan). enJSRVen env genearen funtzioa ezaguna da endometrio-enbrioiaren

garapenean (Dunlap et al., 2005; Dunlap et al., 2006a; Dunlap et al., 2006b) eta

frogatu izan denez, enJSRVen env genearen produkzioa eteteak kumaldiaren galera

dakar (Dunlap et al., 2006a). Hala ere, orf-x genearen funtzioa oraindik ezezaguna

da. Gene hau gene-transformatzailetzat jo izan bada ere (Maeda et al., 2001),

oraingoz bere funtzioaren inguruan espekulatu baino ezin da egin. Gure lanaren

emaitzek orf-x geneak barrabiletako espezifikoa den funtzioren bat bete dezakeela

iradokitzen dute.

Funtzio positibo zein negatiboak aitortu zaizkie ERVei baldintza normal zein

ezohikoetan, esate baterako estres baldintzetan edo gaixotasunetan. Interesgarria da

ugaztunetan, immunitatearekiko erantzun-geneek TE sekuentziak izateko joera

handiagoa azaltzen dutela 5’- edo 3’-UTRetan, beste gene batzuekin alderaturik

behitzat (van de Lagemaat et al., 2003). ERVek efektu biologikoak eragiteko

gaitasuna dute euren gene propioen edo albo-geneen erregulazioaren bidez

txertatze-lekuetan, baina ez dago argi prozesu hauetan parte hartzearen bidez

ostalariari onuragarri edo kaltegarri suertatzen zaizkion. Hain zuzen ere, genoma

akasduna zuten ERV talde jakinen berraktibazioa deskribatu da estres-seinaleen

165

ondorioz, erreplikatzeko gai den birus exogenoarekin errekonbinatzearen bidez edo

luzera osoko birus-laguntzaileen bidez (Cho et al., 2008). Beste gaixotasun

konplexuekin gertatzen den moduan, ERVen aktibazioa gaixotasun prionikoetan

ere behatu izan da (Lee et al., 2013). Gainera, elementu erretrobiral exogeno zein

endogenoak gaixotasun prionikoen garapenerako ko-faktoreetako bat izan

daitezkeela iradoki izan da (Jeong et al., 2010).

Lan honen 4. kapituluan, adierazpen eta RT-qPCR emaitzen bidez, Scrapie

gaixotasun prionikoak enJSRVen adierazpenean eragiten duela behatu dugu bizkar-

muin kranialean. Hala ere, ezin dugu ziurtasunez esan ERVen adierazpen altua

Scrapie gaixotasunaren arrazoia edo ondorioa den. In vivo ikerketa desberdinak

burutu diren arren, agente prioniko kutsakorraren harreran eta gaixotasunaren

garapenean eragiten duten mekanismo molekularrak oraindik ere ezezagunak dira

(Filali, 2014). Burmuineko eskualde desberdinetako PrPSc metaketen banaketa

espaziala ez dator beti bat eskualde horretako neuronen endekapenarekin. Beraz,

ematen du neuroendekapena bera, proteinen metaketa baino bidezidor biologiko

konplexuagoen ondorioa izan daitekeela, seguraski erretrobirus

neurotropikoetarako deskribatu diren antzeko mekanismo analogoen bidez.

Hain zuzen ere, jakin badakigu zenbait erretrobirusek neuroendekapena eragin

dezaketela prion kutsakorren beharrik gabe. Leuzemia-erretrobirus klase

desberdinak, esate baterako CasBrE, 10A1-MuLV, ts1MoMuLV-TB eta

MoAmphoV erretrobirusak, entzefalopatia espongiforme hilgarriak eragiteko gai

dira (Szurek et al., 1968; Jolicoeur et al, 1966; Munk et al., 2003). Sintomen artean

dardarak, ahultasuna eta astrogliosia daude, gaixotasun prionikoetako patologien

oso antzekoak direnak (Clase et al., 2006). Beraz, ERVen adierazpen-aldaketek

neuroendekapenaren ondorio patologikoak eragin edo gaizkiagotu ditzakete.

HERV-E elementuen LTR-eskualde erregulatzailea Opitz-sindromearekin

asoziatutako mid1 genearen adierazpena erregulatzen duela deskribatu izan da

(Landry et al., 2002), eta erregulazio hau ezinbestekoa da vermis cerebelli organoaren

garapenerako (Lancioni et al., 2010). Beraz, elementu erretrobiralen berpiztea,

gaixotasun prionikoen ondorioa izan daiteke eta neuroendekapeneraren ur-behera

dagoen mekanismo bat (Jolicoeur et al, 1966).

166

Hausnarkari txikiak sistema hobeezina dira erretrobirus eta ostalarien arteko

elkarrekintzak aztertzeko. Harrigarria da azken 5-7 milioi urteetan zehar ardiak

JSRV infekzio jarraituak pairatu dituen arren, ardiarekin eremu geografikoa

partekatzen duten bestelako espezieek ez dutela JSRV infekziorik jasan (Caporale

et al., 2013). Birusen transmisiorako espezie-ostalariaren muga ezartzen duten

faktoreen ikerketa garrantzitsua da birusaren patogenesia ulertu ahal izateko eta

birusaren biologia eta patologiaren ezinbesteko alderdiak agerian utzi ahal izateko.

Tesi honen 5. kapituluan, enJSRV sekuentziak modu arrakastatsuan anplifikatu

ziren ikertutako lau espezieetarako: Ovis aries orientalis, Ovis aries musimon, Capra

aegagrus hircus and Rupicapra pyrenaica. Gainera, lan hau enJSRVen dibertsitatea

modu kuantitatibo batean ikertzen lehena izan da, baita R. pyrenaica populazioetan

enJSRV dibertsitatea aztertzen lehena ere. Hala ere, nahiz eta enJSRVek espezie

hedapen zabala azaldu, OPA gaixotasunak batik bat etxe-ardiei eta baserrietako

mufloiei eragiten die (Ovis orientalis musimon; etxe-ardiaren ahaide primitiboa,

zenbait irla mediterraneoetan berriro ere basati bihurtu dena) (Fan, 2003). Modu

naturalean OPAz gaixotutako zenbait ahuntzen (Capra aegagrus hircus) kasuak ere

deskribatu izan dira baina lehen aipuek, 1960. urtean, gaixotasunaren inguruko

informazio gutxi ematen zuten eta ez zuten adenokartzinoma eta epitelizazio

albeolarra bereizten (Nobel, 1958; Rajya & Singh, 1964). Beranduago, ikerketa

zuhurragoek OPA kasuak deskribatu zituzten ahuntzetan, nahiz eta oso maiztasun

txikian (Banerjee & Gupta, 1979; Stamp & Nisbet, 1963). 1980ko hamarkadan, bi

ikerketa independenteek OPAren transmisioa aztertu zuten esperimentalki, inokulu

modura OPAz kutsatutako animalien birika-jariakinak erabilita. Sharp eta kideek,

inokulatutako hiru antxumeetatik bakar baten OPA transmisioa iragarri zuten

(Sharp et al., 1986). Aldiz, Tustin eta kideek, tumore lesioak inokulatutako sei

antxumeetatik bitan garatzea lortu zuten, baina kasu honetan inokulua lentibirus

batekin ere kutsatua izan zen (Tustin et al., 1988).

Ahuntzetan, JSRVak birika tumoreak eragiten dituela behatu izan da berriki baina

hauek ardiarekiko ezaugarri makroskopiko eta histopatologiko desberdinak dituzte

(Caporale et al., 2013). Hala ere, ahuntzetan JSRVaren bizi-zikloan mugatuta

dagoen urratsa ezezaguna da, muga hori transkripzio-osteko mailan egon

daitekeela proposatu izan den arren, Env genea ere modu eraginkorrean adierazten

167

baita ahuntzen zeluletan (Caporale et al., 2013). Teorian, JSRVaren bizi-zikloko

edozein urrats egon daiteke murrizketa-faktoreen menpe, birus hau ardia

infektatzeko garatu ahal izan delako baina ez ahuntza. Zenbait murrizketa-faktore

daude erretrobirusen infekzioen aurrean eraginkorrak direnak (esaterako,

APOBEC3G, Trim-5/TRIMCyp eta teterina) eta faktore hauek espezieen arteko

transmisioari mugak jartzen dizkiote (Hatziioannou & Bieniasz, 2011). Gainera,

enJSRV locus transdominanteak ere egon litezke ardiaren genoman eta beraz,

ahuntzen tumore zeluletako Env genearen adierazpena, blokeo goiztiarrari ihes

egin dioten birion hauen ondorioa baino ez litzateke izango. Hala ere, hau honela

balitz, enJSRV txertatze berriak ere aurkitu beharko genituzke ahuntzaren

genoman.

Laburbilduz, lan honek ardi betarretrobirus endogenoen (enJSRVen) alderdi

funtzional eta ebolutiboak ikertzea izan du helburu baita probirus hauen eta

genoma-ostalarien arteko elkarrekintzak ere. Gure hasierako hipotesiak bi izan

ziren: ardiaren genoman eta honekin ahaidetutako espezieetan oraindik

karakterizatu gabeko enJSRV gehiago zeudela eta enJSRV hauek Ardien Biriketako

Adenokartzinoma eta Scrapie gaixotasunen garapenean funtzio patogenikoren bat

joka zezaketela. enJSRVen karakterizazioan eta ulermenean sakontzeko, probirus

hauen biologiaren zenbait alderdi sakondu ditugu. Hala ere, ezin izan dugu

enJSRVek OPAren patogenesian jokatzen duten funtziorik aurkitu. Gure datuek

iradokitzen dutenez, oraindik karakterizatu gabeko enJSRVak daude eta probirus

hauetako batzuk Scrapie gaixotasunean desregulatuta agertzen dira. Beraz, gure

hasierako hipotesiak konfirmatzen dira.

Ondorioz, tesi hau abiapuntu garrantzitsua izan daiteke Jaagsiekte-erretrobirusak

eragindako neoplasmen eta birika kartzinogenesia gidatzen duten mekanismo

molekularren ulemenerako, hurbilketa berriak erabilita. Gainera, tesi honek ERVek

indar ebolutibo modura jokatzen duten ezinbesteko funtzioa agerian uzten du,

elementu hauek genomak eraldatzeko duten gaitasunaren bidez, eta ardien

eboluzioan enJSRVek izan duten garrantzia azpimarratzen du, dibertsitate genetiko

iturri bat izan baitira.

168

169

Ondorioak

1. Ardi betarretrobirusen (enJSRVen) karakterizazioa eta mapatzea

a. Lan honetan, erretrobirus endogenoak hurbilketa esperimental eta

konputazionalen bidez mapatu ziren ardiaren genoman. Guztira, 63

enJSRV-txertatze desberdin deskribatu ziren, horietarik 59, kokapen

berrietan azaldu zirelarik. Bi hurbilketen konbinaketa erabilgarria

suertatu zen enJSRV berrien kokapena detektatzeko.

b. Txertatze guztietatik 22 intronikoak izan ziren, arrisku-faktore bat

izan daitekeelarik albo-geneen transkripzioan eragiteko orduan. Hala

ere, ezin izan zen enJSRV/gene elkarrekintzarik deskribatu ehun

osasuntsuetan eta beraz, etorkizunean OPA tumoreak erabili beharko

dira enJSRV/gene elkarrekintzak minbizi egoeratan aztertzeko.

2. Aldakortasun genetikoa, genotipazioa eta OPA bilakaerarekin asoziazio-

analisiak

a. Gure emaitzek erakutsi dutenez, enJSRV-16 probirusaren

maiztasuna askoz altuagoa da aztertutako Latxa arrazan gainontzeko

arrazatan baino, berriki probirus honen ugaritze bat gertatu dela

iradokiz. Gainera, enJSRVak bi kromosomatan finkatzeko joera

azaltzen dutela behatu dugu, antzinako txertatzeak homozigotoak

direlarik eta berrienak, aldiz, heterozigotoak.

b. enJSRVak eta OPA tumoreen presentzia/absentzia ez ziren modu

esangarrian asoziaturik azaldu. Etorkizunean, ERV polimorfiko eta

gaixotasunen artean lotura posibleak ikertzerako orduan

garrantzitsua izango da kopia polimorfiko berriak bilatzea.

3. enJSRVen adierazpen eta metilazio analisiak

a. RT-qPCR bidez enJSRVen gain-adierazpena behatu genuen

barrabiletan eta azpi-adierazpena birika, heste, bizkar-muin kranial

eta ugatzetan. Orf-x genearen adierazpena lehen aldiz aztertu da eta

barrabiletan gain-adierazirik azaldu da. Gene honen funtzioa

170

ezezaguna den arren, lan honek hormonekin erlazionatutako

funtzioren bat iradokitzen du.

b. Gure ikerketak enJSRVek bideratutako itzulpena metilazioarekiko

sentikorra dela adierazten du, enJSRV probirus gehienak DNA-

metilazioaren bidez isilarazita daudelarik birika eta hesteetan.

Barrabiletako hipometilazioa adierazpen-analisietan islatzen da.

c. Scrapie infekzio osteko enJSRVen erregulazio eza RNA mailan

detekta daitekeela frogatu dugu. Ondorioz, zenbait enJSRV Scrapie

gaixotasunaren garapenarekin erlazionatuta egon litezke.

Dirudienez, elementu erretrobiralen sustapena gaixotasun

prionikoaren ondorioa izan daiteke eta analisi epigenetikoak behar

izango dira etorkizunean hipotesi hau frogatu ahal izateko.

4. enJSRVen dinamika ebolutiboa

a. Metodo esperimental zein konputazionalen bidez, 208 enJSRV

sekuentzia desberdin karakterizatu genituen ardi eta honekin

ahaidetutako hiru espezieko (mufloi, sarrio eta ahuntza) 32

indibiduotan. Aurkikuntza hauek oraindik karakterizatu gabeko

enJSRVak daudela aditzera ematen dute eta txertatzeetako batzuk

aldakorrak direla espezie desberdinen, arraza desberdinen eta

eskualde geografiko desberdinen artean.

b. Analisi filogenetikoek Pirinioetako sarrioaren probirus guztiak

antzinako txertatze bakar baten ondorioa direla iradokitzen dute.

Pirinioetako sarrioan aurkitutako probirusa lehen aldiz karakterizatu

izan da lan honetan.

c. Txertatze berriak soilik ardi (Ovis orientalis aries) eta mufloietan (Ovis

orientalis musimon) aurkitu ziren baina ez ahuntzetan (Capra aegagrus

hircus) aurretik proposatu izan den JSRV birusaren ostalari-mugak

Caprinae genomako enJSRV dibertsitatea ere mugatzen duelarik.

171

1. Kromosoma

1. Kromosoma

2. Kromosoma

2. Kromosoma

2. Kapituluko datu gehigarriak

Genea Izena Funtzioa Oharrak

TOPBP1

II Topoisomerasa (DNA) proteina-lotzailea 1

II beta topoisomerasaren amaierako C-eskualdearekin lotzen den proteina bat kodetzen du. Elkarrekintza honek, II beta topoisomerarak erreakzio-katalitikoa duela iradokitzen du, DNA harizpien suntsiketen bidez.

Genoma integritatearen zaindaria

Forma et al. (2013)

Genea Izena Funtzioa Oharrak

PLSCR2

Rapamizinarekiko sorra den MTORen laguntzailea/2-Fosfolipido Eskranblasa

Kaltzioaren menpeko fosfolipidoen mugimendu ez-espezifikoa eta fosfatidilserina esposizioa bideratzen ditu.

Odolaren koagulazioan eta apoptosian funtzioren bat burutu lezake.

Genea Izena Funtzioa

P2RY1

1-P2Y purinohartzailea ADPra lotzen diren plaketetan, kaltzio-ioi intrazelularren mugimendua biderazten du fosfolipasa C proteinaren aktibazioaren bidez, plaketen itxuraldaketa eta plaketen metaketa.

Genea Izena Funtzioa

BOC

CDOren anaia Zelula-zelula elkarrekintzak bideratzen ditu, zelulen prekutsorearen bidez, eta desberdintzapen miogenikoa sustatzen du.

Genea Izena Funtzioa

FARSB Fenilalanila-tRNA sintetasa beta katea

ATP dagoenean, tetramero honek L-fenilalaninak erakartzen ditu tRNA egokiaren adenosina terminalera.

Genea Izena Funtzioa

NXPH2 2-Neurexofilina Jariatutako glikoproteina bat da, neurona azpi-talde batean eratzen dena eta neurexinen lotailua izan daitekeena.

Genea Izena Funtzioa

IZUMO3 IZUMO familiako 3-kidea

Konplexu luzeak eratzen ditu ugaztunen esperman.

BOC LTR

enJS56A1 PLSCR2 2

5

4

60 kbp

3

21.70 kbp

1. Kromosoma

44.33 kbp

TOPBP1 LTR

1

5 kbp 0.4 kbp

LTR FARSB

LTR

1. Kromosoma

26 kbp

P2RY1

7 2. Kromosoma

IZUMO3

LTR

47 kbp

6 LTR NXPH2

32 kbp

172

3. Kromosoma

Genea Izena Funtzioa

C12ORF35 12. kromosomako 35. Irakurketa marko irekia ?

Genea Izena Funtzaio Oharrak

ANTXR1

1-Antrax toxina hartzailea

Gene honek I motako mintzarteko proteina bat kodetzen du, markatzaile endotelial tumore-espezifikoa dena, eta ondesteko minbizian inplikatu izan dena.

Minbizi mota desberdinekiko erantzun tumorizida sustatzen du.

Lim et al. (2012)

GKN

Gastrokina

Gene honek kodetutako proteina azpi-adierazita dago giza minbizi gastrikoan, mukosa gastriko normalarekin alderatuz gero.

Minbizi gastrikoa

Xiao et al. (2012)

Genea Izena Funtzioa

AMN1

1-Sare mitotikotik irtetzeko antagonistaren homologoa

Zelulari mitositik irteten laguntzen dio eta zelularen bizi-zikloa berriro hasi.

Genea Izena Funtzioa

KEL

Kell odol-taldea, metalo-endopeptidasa

Kell glikoproteina kx antigenoa daraman XK-mintz proteinari lotzen zaio, disulfito bakar baten bidez. Proteina honek zink endopeptidasen familiako neprilsinarekiko (M13) antzekotasun estrukturalak azaltzen ditu.

Genea Izena Funtzioa Oharrak

NOS3

Oxido Nitriko 3- Sintasa

Prozesu desberdinetan dihardu, esate baterako neurotransmisioa eta mikrobioen eta tumoreen aurkako aktibitateak.

Minbizirako arriskuaren igoera

(Zhang et al., 2014)

Gene Izena Funtzioa

NOTCH3

Notch locus neurogenikoaren 3-proteina homologoa

Garapen neuralean paper garrantzitsua jokatzen duen seinale-bidezidor intrazelularra eratzen du.

Gene Izena Funtzioa

NMUR2

Neuromedinaren 2-U hartzailea

G-proteinaren hartzaile parekatua, U- eta S-neuromedina hormona neuropeptidoak lotzen ditu, nerbio-sistema zentralean eta hesteetan zehar banatuta daudenak.

20 kbp LTR

AMN1 3. Kromosoma

50.52 kbp 33.39 kbp

ANTXR1 GKN enJSRV-20

3. Kromosoma

4. Kromosoma

KEL LTR

NMUR2 5 kbp

5. Kromosoma

LTR

enJSRV-20 C12ORF35

30 kbp

8

10

11

12

NOTCH3 LTR

5 kbp

5. Kromosoma

13

14

X NOS3 LTR 4. Kromosoma

173

Genea Izena Funtzioa Oharrak

TRPC7

Hartzaile iragankor kaltzio-kanal potentziala, C subfamilia, 7. kidea

Tentsioaren-menpeko katioi-kanal Ca2+-iragazkorra, ioi-kate eta proteina kinasen egiturazko-elementuak konbinatzen ditu.

TRPM7 kateak zelulen ugaritze eta biziraupenarekin erlazionatu izan dira.

Nadler et al. 2001

Genea Izena Funtzioa

ANXA5 A5-Anexina Odol-koagulazioaren inhibizioan funtzioren bat bete lezakeela proposatu da.

Genea Izena Funtzioa Oharrak

SH3BP2

SH3-Domeinuko 2-Proteina-lotzailea

Seinale-transdukzioko zenbait proteinen SH3 domeinuei lotzen zaie.

Kerubismoa

Bell et al. (1997)

Genea Izena Funtzioa Oharrak

SPATA18

Espermatogenesiarekin asoziatutako 18. proteina

Mitokondrien kalitatearen funtsezko erregulatzailea, mitokondria gaixoen konponketa edo degradazioa bideratzen duena, min-mitokondriala dagoenean.

P53 eta p63ren itu-transkripzionala

Bornstein et al. (2010)

Genea Izena Funtzioa

SCARNA17

Cajal-gorputz txikiekiko 17-RNA espezifikoa

Cajal-gorputzekin batera agertzen den RNA nuklear txikia da eta II RNA polimerasak transkribatutako esplizeosomatako (U1, U2, U4, U5 eta U12) RNAen eraldaketak gidatzen dituela iradoki izan da.

Genea Izena Funtzioa

EIF2S2

Itzulpen eukariotikoa hasten duen 2-faktorea, 2 beta azpi-unitatea

Proteinen sintesien urrats goiztiarretan, GTP eta tRNA hasleekin konplexu bat eratzen du eta 40S azpi-unitate erribosomikoari lotzen zaio. GDP-GTP aldaketa katalizatzen du.

Genea Izena Funtzioa Oharrak

RARS2

2-Arginil-tRNA sintetasa

Arginina-tRNA ligasa aktibitatea

Hipoplasia pontozerebelarra

6. Kromosoma

29.84 kbp

SH3BP2 LTR

35 kbp

TRPC7 LTR

5. Kromosoma

45.56 kbp

LTR

121.3 kbp

SCARNA17

6. Kromosoma

1, 120 kbp

8kbp

EIF2S2 7. Kromosoma

1, 120 kbp

LTR

RARS2

8. Kromosoma

1, 120 kbp

enJSRV-20

6. Kromosoma

SPATA18 LTR

15

6. Kromosoma

ANXA5 LTR

63 kbp

16

17

18

19

20

21

174

12. Kromosoma

SRGAP2D LTR

LTR PMP22

Genea Izena Funtzioa Oharrak

POPDC3

3-Popeye domeinuduna

Gene hau muskulu-eskeletiko eta kardiakoan adierazten da eta garapenean zehar, funtzio garrantzitsuren bat bete lezake ehun hauetan.

Minbizi gastrikoa

Luo et al. (2012)

BVES

Odol-hodietako substantzia epikardiala

Zelulekiko lotura molekula, zelulen integritatearen mantenuaz arduratzen dena. Zelula epitelialen kontaktua eta metaketa sustatzen du.

Minbizi gastrikoa, ondesteko kartzinoma

Luo et al. (2012)

LIN28B Lin-28ren B Homologoa

mikroRNAren (miRNA) biogenesia ezabatzen du let-7 aitzindari (pre-let-7) lotuaz.

Bularreko adenokartzinomaren hazkuntza eragiten du.

Ye et al. (2012).

Genea Izena Funtzioa

RNF217

217-Eraztun-hatz proteina

E3 ubikitina-proteina ligasa honek E2-ubikitinarekin elkartzen diren tioester entzimak onartzen ditu eta zuzenean itu-substratuei ubikitina transferitu.

Genea Izena Funtzioa

RIM2 Exozitosia erregulatzen duen 2-Mintz sinaptikoa Aldamio-proteina funtzioa izan lezake

Genea Izena Funtzioa Oharrak

NTN1

1-Netrina

Axoiak eta zelulen migrazioa gidatzen ditu garapenean zehar.

Netrinaren mutazioek eta adierazpen galerek minbizia eragin dezakete.

Kefeli et al. (2012)

STX8

8-Sintaxina

Endosoma goiztiarretatik berantiarretarako proteinen garraioa bideratzen du, besikulen fusio eta exozitosiaren bidez.

Crohn gaixotasuna

Genea Izena Funtzioa

PMP22 22-Mielina proteina periferikoa

Mielina konpaktuaren osagai nagusia da nerbio-sistema periferikoan.

Genea Izena Funtzioa

SRGAP2D SLIT-ROBO Rho GTPasa aktibatzen duen 2D proteina

SLIT-ROBO Rho GTPasaren antagonistatzat jokatzen duen proteina bat kodetzen du, neurona kortikalen garapenean zehar 2 proteina aktibatuz.

8. Kromosoma

1, 120 kbp

39.07 kbp 7.54 kbp 173.1 kbp

BVES LTR LIN28B POPD

C3

250.8 kbp

11. Kromosoma

NTN1 STX8 LTR

8. Kromosoma

RNF217 LTR

RIM2 LTR

9. Kromosoma

17.33 kbp 13.33 kbp

22

23

24

26

11. Kromosoma

229 kbp

27

28

175

DHX9

NPL LTR 12. Kromosoma

61.94 kbp

PDSS1

LTR

13. Kromosoma

60 kbp

35 kbp

LTR

ZNF133 13. Kromosoma

20 kbp

80 kbp

LTR

13. Kromosoma

enJSRV-20

ZNF

13. Kromosoma

Genea Izena Funtzioa

NPL

N-Azetilneuraminato Pirubato Liasa (Dihidrodipikolinato Sintasa)

Azido N-azetilneuraminikoaren (azido sialikoaren) bikoizketa katalizatzen du, pirubatoa eta N-azetilmanosamina eratzeko, Schiff-bitartekari bat erabilita.

DHX9

DEAH (Asp-Glu-Ala-His) kutxako 9-helikasa

Harizpi bikoitzeko RNA eta DNA-RNA konplexuen zabaltzea katalizatzen du, ATPa dagoenean. RNA erretrobiralen adierazpen eta garraioa ere bidera lezake.

Genea Izena Funtzioa Oharrak

LBP Lipopolisakaridoen proteina-lotzailea

Bakteria gram-negatiboen aurreko erantzun immune larria sortzen du.

Ondesteko kartzinoma

Chen et al (2011)

Genea Izena Funtzioa

CSRP2BP CSRP2 proteina-lotzailea

Proteina-egokitzaile gisa dihardu, bi proteina ala gehiago batuz proteina-konplexu handiagoak eratzeko.

ZNF133 133-zink atzamar proteina

Erregulazio trasnkripzionala erreprimitu lezake.

Genea Izena Funtzioa

PRNP Prion proteina Gaixotasun neuroendekatzaile askorekin lotura azaltzen du, esate baterako, Scrapierekin.

Genea Izena Funtzioa Oharrak

OPTN

Optineurina

Tentsio normaleko glaukoma eragin lezake. Gainera, E3-14.7K adenobirusen proteinarekin elkarrekintzak eratzen ditu.

Apoptosia, hantura eta basokonstrikzioa

Turturro et al. (2014)

MCMC10

Minikromosomaren mantenu konplexuko 10 kidea

Genoma eukariotikoaren erreplikazioaren hasiera gidatu.

Genea Izena Funtzioa Oharrak

PDSS1

Prenil (dekaprenil) difosfato sintasa, 1 azpi-unitatea

Q-koentzimen edo ubikinonen prenilen albo-katea luzatzen du, arnas kateko funtsezko elementua.

Linfomarekiko sentikortasuna

Skibola et al. (2008)

Genea Izena Funtzioa

ZNF

Zink-atzamarra

Zink-atzamar proteinak eratzen ditu, funtzio zelular desberdinak erregulatzen dituzten proteinak.

13. Kromosoma

1, 120 kbp

LTR LBP

CSRP2BP

OPTN MCMC10

14. Kromosoma

35

PRNP LTR

30

31

32

33

34

X

176

LTR

CYP2B6

Genea Izena Funtzioa

CYP2B6 P450 zitokromo 2B azpi-familia

Amaierako-oxidasa entzima, elektroien garraio kateetan.

Genea Izena Funtzioa

NET02 2- Neuropilina (NRP) eta toloide (TLL)-antzekoa

Aurresandako trans-mintz proteina bat kodetzen du, zelulaz kanpoko bi CUB domeinu eta A klaseko dentsitate baxuko lipoproteina (LDLa) domeinu bat dituena.

Genea Izena Funtzioa Oharrak

ACSF3

Azil-CoA sintetasa familiako 3 kidea

Gantz-azidoak aktibatzen ditu, gatz-azidoen eta A koentzimaren arteko tioester lotura bat katalizatuz.

Aziduria maloniko eta metilmalonikoa.

Salaverria et al. (2012 ).

CDH15

15-Kaderina

Kaltzio-dependentea den zelularteko lotura-glikoproteina bat kodetzen du.

Minbizirekin asoziatutako heterozigositate galera.

Kremmidiotis et al. (1998)

ANKRD11 Ankirin 11 domeinu errepikakorra

Ligandoen menpeko transkripzioaren aktibazioa burutzen du.

Bularreko minbizia

Lim et al. (2012)

Genea Izena Funtzioa

OR10A6

Arnas hartzailea, 10. Familia, A azpi-familia, 6. kidea

Arnas hartzaileak sudurreko usain-molekulekin lotzen dira, usainaren pertzepzioa ahalbidetzen duen erantzun neuronal bat eratuz. Proteina arnas hartzaileak, parekatutako G-proteina-hartzaileen familiakoak (GPCR) dira, gene exon-kodetzaile bakarretik eratorritakoak.

OR10A3

Arnas hartzailea, 10. Familia, A azpi-familia, 3. kidea

Genea Izena Funtzioa Oharrak

SBF2

SET 2-Faktore-lotzailea

Guanina nukleotido elkartruke-faktorea (GEF) da, RAB28 aktibatu dezakeena. GTP-GDP elkartrukea bideratzen du, Rab proteina-zubi GDP inaktiboak, GTP-zubi aktibo bihurtuz.

Pankreako adenokartzinoma

Wu et al. (2012)

Genea Izena Funtzioa

ICE1 CBFren adierazpenaren 1-sustatzailea

CBF geneen transkripzioa erregulatzen du baldintza hotzetan.

14. Kromosoma

19.45 kbp

36.64 kbp 49.37 kbp

ACSF3 CDH15 ANKRD11 LTR

253.7 kbp

15. Kromosoma

SBF2 enJS5F16

14. Kromosoma

14. Kromosoma

enJSRV-20 NET02

36

37

OR10A6 OR10A3 LTR

35 kbp 10 kbp

15. Kromosoma

38

39

40

ICE1 LTR

16. Kromosoma 42

177

Genea Izena Funtzioa TMEM132B

132B Mintz-arteko-proteina ?

Genea Izena Funtzioa Oharrak

SIVA1

Apoptosiaren 1-faktore eragilea

Bidezidor apoptotikoan funtzio berezia betetzen duen proteina bat kodetzen du CD27 antigenoaren bitartez, a tumore nekrosi faktoreen (TFNR) hartzaileen superfamiliakoa

P53ren funtzioa inhibitzen du

Wang et al. (2013)

Genea Izena Funtzioa Oharrak

PRSS50

50-Serina proteasa

Serina-motako aktibitate endopeptidikoa

Zenbait bular minbizietan adierazpen desberdina azaltzen du.

Huang et al. (2008)

Genea Izena Funtzioa

TOPAZ1 Barrabil eta obario espezifikoa den PAZ domeinudun 1 proteina

Gonada ar zein emeetan adierazten da eta oso kontserbatua dago ornodun talde desberdinen artean

Genea Izena Funtzioa

ECI2

2-enoil-CoA delta isomerasa Saturatu gabeko gantz-azidoen metabolismoan paper garrantzitsua betetzen du.

PRPF4B

PRP4 mRNA prozesatu-aurreko 4 faktorearen B homologoa

mRNAren aurre-moztitsasketa eta seinale-transdukzioa bideratzen ditu

Genea Izena Funtzioa Oharrak

SCGN

Sekretagogina, EF-Esku Kaltzio proteina-lotzailea

KCLek sustatutako kaltzio-fluxua eta zelulen ugaritzea

Giltzurrunetako zelulen kartzinoma

Ilhan et al. (2011)

Genea Izena Funtzioa

SCAND3 SCAN domeinudun 3-proteina Azido nukleikoen lotzailea

54.93 kbp LTR SCGN

20. Kromosoma

19. Kromosoma

PRSS50 enJSRV-14

20. Kromosoma

LTR SCAND3

18. Kromosoma

SIVA1 80.2 kbp

enJS56A1

90.2 kbp

TMEM132B 17. Kromosoma

LTR 43

44

45

enJSRV-20 ECI2 PRPF4B

35 kbp 60 kbp

46

47

48

49

20. Kromosoma

19. Kromosoma

40 kbp TOPAZ1

LTR

178

Genea Izena Funtzioa Oharrak

TRIM39

Motibo tripartitodun 39 proteina

p53ren ubikitilazioa Zhang et al. (2012)

HLA-B52

Histobateragarritasun Konplexu Nagusia, I kalsea, B

I klaseko molekulek paper garrantzitsua betetzen dute sistema immunean, lumeneko erretikulu-endoplasmikoko peptidoak aurkeztuaz

Genea Izena Funtzioa

LEMD2

LEM domeinudun 2 proteina

Antolaketa nuklearra

MLN

Motilina Digestioko uzkurdurak kontrolatzen dituen faktorerik garrantzitsuena da eta

pankrea endokrinoko askapen endogenoa ere bideratzen du

Genea Izena Funtzioa

GRM5

Glutamato hartzailea, 5-metabotropikoa

Nerbio-sistema zentraleko neurotransmisore nagusia da eta hartzaile ionotropiko zein metabotropikoak aktibatzen ditu.

CTSC

C Katepsina Serina-proteasa eta zelula immune ugari aktibatzeko faktore garrantzitsua da

Genea Izena Funtzioa

HDHD2

Dehalogenasa haloazido-antzeko domeinudun 2 proteina

Metal-ioien lotzailea: azpi-unitateko magnesio-ioi bat lotzen du

Genea Izena Funtzioa

U6Sp mRNA

U6 esplizeosomako RNA

Beste snRNP batzuekin, eraldatu gabeko aurre-mRNArekin eta beste zenbait proteinekin konbinatzen da esplizeosomak eratzeko, RNA-proteina konplexu molekular handiak, aurre-mRNAren moztitsasketa bideratzen dutenak.

Genea Izena Funtzioa

NRG3 3-Neuregulina Zelula barruko seinalizazio-bidezidorrak aktibatzen ditu eta zeluletan erantzunak sortu, ugaritzea, migrazioa, desberdintzapena, biziraupena eta apoptosia barne.

184.9 kbp 70.1 kbp

20. Kromosoma

TRIM39 enJSRV-20 HLA-B52

U6Sp mRNA LTR 24. Kromosoma

85 kbp 110 kbp

20. Kromosoma LEMD2 MLN

50

72.1 kbp 67 kbp

CTSC GRM5

21. Kromosoma

enJSRV-20

51

52

LTR

54

55

HDHD2 LTR 23. Kromosoma

NRG3 LTR 25. Kromosoma

21 kbp

56

179

Genea Izena Funtzioa Oharrak

ZMAT1

Zink atzamarra 1-motako matrina

Gene honek hiru zink-atzamar domeinu dituen proteina eta kokaleku-seinale nuklearra eratzen ditu.

P53ren menpeko hazkuntza bidezidorra susta lezake.

Prahl et al. (2008)

TCEAL4

A transkripziorako luzapen faktorearen (SII)-4. antzekoa

Transkripzioa modulatzen duten fosfoproteina nuklear bezala dihardu, promotore testuinguruaren menpe.

Tiroideetako minbizi anaplastikoa

Akaishi et al. (2006)

BEX5

Burmuinean adierazten den Xari loturiko 5. proteina

Ugaztunen nerbio-sistemaren garapenen eta funtziorako ezinbestekoa.

Genea Izena Funtzioa Oharrak

SBF2

SET 2-Faktore-lotzailea

Guanina nukleotidoen elkartruke faktorea (GEF), RAB28 aktiba lezake. GTP-GDP elkartrukea bideratzen du, Rab proteina-zubi GDP inaktiboak, GTP-zubi aktibo bihurtuz.

Pankreako adenokartzinoma

Wu et al. (2012).

Genea Izena Funtzioa Oharrak

MAGEA

10

Melanoma antigenoenA familiako 10 kidea

Ezezaguna baina uste da enbrioien garapenean eta tumoreen transformazioan funtzioren bat bete dezakeela.

Melanoma, kolangiokartzinoma intrahepatikoa, zelula eskuamosoen kartzinoma, urdaileko minbizia, mieloma anizkoitza, birikako kartzinoma, bularreko minbizia, adenokartzinoma

Schultz-Thater et al. (2011)

Genea Izena Funtzioa Oharrak

GNL3L

Guanina Nukleotidoen antzeko 3-Proteina lotzailea (nukleolarra)

Aurre-rRNA prozesatzeko eta zelulen ugaritzerako ezinbestekoa. TERF1ren asoziazio telomerikoa egonkortzen du, TERF1en erreklutatzea ekidinez.

GNL3Lren murrizteak MDM2 egonkortzen du eta p53ren menpekoa den G2/M etetea eragin

Meng et al. (2010)

FGD1

Displasia faziogenitaleko 1-proteina

GTP-proteina lotzaile txikien Rho familiarekiko antzekoa

Prostata eta bularreko minbizietan gain-adierazita

Ayala et al. (2009)

1. Irudi Gehigarria. 2.1. irudiko enJSRVen kokapen genomikoa, albo-geneei dagokielarik. Zenbaki bakoitzak

2.1.irudiko zenbakiei egiten die erreferentzia. Zenbaki batzuk ez dira irudi honetan irudikatuak izan, ez baitzen

alboan generik topatu. Geziek enJSRV zein geneen orientazioa adierazten dute. Esperimentalki aurkitutako bi

enJSRVak X batekin adierazi dira. LTR-bakartiak (LTR), enJSRV osoak eta geneak, irudi eskematiko

bakoitzaren gainean izendaturik agertzen dira. Gorriz irudikatutako geneek, minbiziarekin nolabaiteko lotura

azaltzen dute. Irudi bakoitzaren azpian, geneen ezaugarri bereizgarriak azaltzen dituen taula bat agertzen da.

202 kbp

X Kromosoma

LTR DOCK11

FGD1 LTR GNL3L X Kromosoma

49.31 kbp

115.9 kbp

110 kbp 70 kbp 80 kbp

ZMAT1 enJSRV-20 TCEAL4 BEX5 X Kromosoma

78.42 kbp

X Kromosoma

MAGEA10 LTR

58

60

61

59

180

181

BIBLIOGRAFIA

Acín C, Martín-Burriel I, Goldmann W, Lyahyai J, Monzón M et al. (2004). Prion protein gene polymorphisms in healthy and Scrapie-affected Spanish sheep. J Gen Virol 85: 2103-2110. Aguzzi A, Polymenidou M (2004). Mammalian prion biology: one century of evolving concepts. Cell 116: 313-327. Akaishi J, Onda M, Okamoto J, Miyamoto S, Nagahama M et al. (2006). Down-regulation of transcription elogation factor A (SII) like 4 (TCEAL4) in anaplastic thyroid cancer. BMC Cancer 6: 260. Al-Shahrour F, Minguez P, Tarraga J, Montaner D, Alloza E (2006). BABELOMICS: a systems biology perspective in the functional annotation of genome-scale experiments. Nucleic Acids Res 34: W472–W476. Alberti A, Murgia C, Liu SL, Mura M, Cousens C et al. (2002). Envelope induced cell transformation by ovine betaretroviruses. J Virol 76: 5387-5394. Alcalá L, Morales J (1997). A primitive caprine from the Upper Vallesian of La Roma 2 (Alfambra, Teruel, Aragón, Spain). CR Acad Sci Paris 324: 947-953. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403-410.

Alfonso L, Parada A, Legarra A, Ugarte E, Arana A (2006). The effects of selective breeding against Scrapie susceptibility on the genetic variability of the Latxa Black-Faced sheep breed. Genet Sel Evol 38: 495-511. Allen TE, Sherrill KJ, Crispell SM, Perrott MR, Carlson JO et al. (2002). The Jaagsiekte sheep retrovirus envelope gene induces transformation of the avian fibroblast cell line DF-1 but does not require a conserved SH binding domain. J Gen Virol 83: 2733-2742. Almeida LM, Silva IT, Silva WA, Castro JP, Riggs PK et al. (2007). The contribution of transposable elements to Bos taurus gene structure. Gene 390: 180-189. Altuna J (1992). El medio ambiente durante el Pleistoceno Superior en la región cantábrica con referencia especial a sus faunas de mamíferos. Munibe 44: 13-29. Álvarez I, Royo LJ, Fernández I, Gutiérrez JP, Gómez E et al (2004). Genetic relationships and admixture among sheep breeds from Northern Spain assessed using microsatellites. J Anim Sci 82: 2246-52. Álvarez-Busto J, Ruiz-Nunez A, Mazon LI, Jugo BM (2004). Detecting of polymorphisms in tumour necrosis factor alpha candidate gene in sheep. Eur J Immunogenet 31: 155-158. Álvarez-Busto J, García-Etxebarria K, Herrero J, Garin I, Jugo BM (2007). Diversity and evolution of the Mhc-DRB1 gene in the two endemic Iberian subspecies of Pyrenean chamois, Rupicapra pyrenaica. Heredity 99: 406-413.

182

Amills M, Capote J, Tomás A, Kelly L, Obexer-Ruff G et al. (2004). Strong phyleogeographic relationships among three goat breeds from the Canary Islands. Journal of Dairy Research 71: 257-62. Amills M, Ramírez O, Tomás A, Badaoui B, Marm J et al. (2009). Mitochondrial DNA diversity and origins of South and Central American goats. Anim Genet 40: 315-322. Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF (2004). Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res 64: 5245-5250. Aparicio-Sánchez G (1960). Zootecnia especial, Etnología compendiada. 4ª de. Imp. Moderna. Córdoba. Archer F, Jacquier E, Lyon M, Chastang J, Cottin V et al. (2007). Alveolar type II cells isolated from pulmonary adenocarcinoma: a model for JSRV expression in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol 36: 534-540. Armezzani A, Arnaud F, Caporale M, di Meo G, Iannuzzi L et al. (2011). The signal peptide of a recently integrated endogenous sheep betaretrovirus envelope plays a major role in eluding gag-mediated late restriction. J Virol 85: 7118-7128. Armezzani A (2012). The evolutionary interplay between exogenous and endogenous sheep betaretroviruses. PhD thesis. Arnal MC, Fernandez-De-Luco D, Riba L, Maley M, Gilray J et al. (2004). A novel pestivirus associated with deaths in Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica). J General Virol 85: 3653-3657. Arnaud F, Caporale M, Varela M, Biek R, Chessa B et al (2007a). A paradigm for virus-host coevolution: sequential counter-adaptations between endogenous and exogenous retroviruses. PLoS Pathogens 3, e170. Arnaud F, Murcia PR, Palmarini M (2007b). Mechanisms of late restriction induced by an endogenous retrovirus. J Virol 81: 11441-11451. Arnaud F, Varela M, Spencer TE, Palmarini M (2008). Coevolution of endogenous betaretroviruses of sheep and their host. Cell Mol Life Sci 65: 3422-3432. Arranz JJ, Bayón Y, San Primitivo F (1998). Genetic relationships among Spanish sheep using microsatellites. Anim Genet 29: 435-440. Arranz JJ, Bayón Y, San Primitivo F (2001). Differentiation among Spanish sheep breeds using microsatellites. Genet Sel Evol 33: 529-542. Arrieta-Aguirre I, García-Etxebarria K, Jugo BM (2006). Optimization of the MhcOvar-DRB1 gene typing. Tissue Antigens 67: 222-228.

183

Arruga MV, Monteagudo LV, Tejedor MT, Barrao R, Ponz R (2001). Analysis of microsatellites and paternity testing in Rasa Aragonesa sheep. Res Vet Sci 70: 271-273. Ayala I, Giacchetti G, Caldieri G, Attanasio F, Mariggiò S et al. (2009). Faciogenital dysplasia protein Fgd1 regulates invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation and is up-regulated in prostate and breast cancer. Cancer Res 69: 747-752. Azor PJ, Monteagudo LV, Luque M, Tejedor MT, Rodero E et al. (2005). Phylogenetic relationships among Spanish goats breeds. Anim Genet 36: 423-425. Bai J, Bishop JV, Carlson JO, DeMartini JC (1999). Sequence comparison of JSRV with endogenous proviruses: envelope genotypes and a novel ORF with similarity to a G-protein-coupled receptor. Virology 258: 333-343. Balamurugan V, Hemadri D, Gajendragad MR, Singh RK, Rahman H (2014). Diagnosis and control of peste des petits ruminants: a comprehensive review. Virus disease 25: 39-56. Baldeón A (1993). El yacimiento de Lezetxiki (Guipuzcoa, País Vasco). Los niveles musterienses. Munibe 45: 3-97. Banerjee M, Gupta PP (1979). Note on maedi and Jaagsiekte in sheep and goats in Ludhiana area of Punjab. Indian J Anim Sci 12: 1102-1105. Balding DJ (2006). A tutorial on statistical methods for population association studies. Nat Rev Genet 7: 781-791. Bannert N, Kurth R (2004). Retroelements and the human genome: new perspectives on an old relation. Proc Natl Acad Sci USA 101 Suppl 2: 14572-14579. Bannert N, Kurth R (2006). The evolutionary dynamics of human endogenous retroviral families. Annu Rev Genomics Hum Genet 7: 149-173. Barbancho M, Llanes D, Morera L, Garzón, R, Rodero A (1984). Genetic markers in the blood of Spanish goat breeds. Animal Blood Groups and Biochemical Genetics 15: 207-212. Barbulescu M, Turner G, Seaman MI, Deinard AS, Kidd KK et al. (1999). Many human endogenous retrovirus K (HERV-K) proviruses are unique to humans. Curr Biol 9: 861-868. Barrio ÁM, Ekerljung M, Jern P, Benachenhou F, Sperber GO (2011). The first sequenced carnivore genome shows complex host-endogenous retrovirus relationships. PLoS One 6: e19832. Bartholomew C, Ihle JN (1991). Retroviral insertions 90 kilobases proximal to the Evi-1 myeloid transforming gene activate transcription from the normal promoter. Mol Cell Biol 11: 1820–1828. Belancio VP, Roy-Engel AM, Deininger PL (2010). All y’all need to know ’bout retroelements in cancer. Semin Cancer Biol 20:200–210.

184

Bell SM, Shaw M, Jou YS, Myers RM, Knowles MA (1997). Identification and characterization of the human homologue of SH3BP2, an SH3 binding domain protein within a common region of deletion at 4p16.3 involved in bladder cancer. Genomics 44: 163-170. Belloy L, Giacometti M, Boujon P, Waldvogel A (2007). Detection of Dichelobacter nodosus in wild ungulates (Capra ibex ibex and Ovis aries musimon) and domestic sheep suffering from foot rot using a two-step polymerase chain reaction. J Wildl Dis 43: 82-88. Belshaw R, Pereira V, Katzourakis A, Talbot G, Paces J et al. (2004). Long-term reinfection of the human genome by endogenous retroviruses. Proc Natl Acad Sci USA 101: 4894-4899. Belshaw R, Dawson AL, Woolven-Allen J, Redding J, Burt A et al. (2005). Genomewide screening reveals high levels of insertional polymorphism in the human endogenous retrovirus family HERV-K(HML2): implications for present-day activity. J Virol 79: 12507-12514. Benavides J, Gomez N, Gelmetti D, Ferreras MC, Garcia-Pariente C et al. (2006). Diagnosis of the nervous form of Maedi-Visna infection with a high frequency in sheep in Castilla y Leon, Spain. Vet 158: 230-235. Benavides J, García-Pariente C, Ferreras MC, Fuertes M, García-Marín JF et al. (2007). Diagnosis of clinical cases of the nervous form of Maedi-Visna in 4- and 6-month-old lambs. Vet J 174: 655-658. Bénit L, De Parseval N, Casella JF, Callebaut I, Cordonnier A et al. (1997). Cloning of a new murine endogenous retrovirus, MuERV-L, with strong similarity to the human HERV-L element and with a gag coding sequence closely related to the Fv1 restriction gene. J Virol 71: 5652-5657. Bénit L, Lallemand JB, Casella JF, Philippe H, Heidmann T (1999). ERV-L elements: a family of endogenous retrovirus-like elements active throughout the evolution of mammals. J Virol 73: 3301-3308. Bénit L, Dessen P, Heidmann T (2001). Identification, phylogeny, and evolution of retroviral elements based on their envelope genes. J Virol 75: 11709-11719. Berdasco M, Esteller M (2010). Aberrant epigenetic landscape in cancer: how cellular identity goes awry. Dev Cell 19: 698-711. Berlinguer F, Ledda S, Rosati I, Bogliolo L, Leoni G, Naitana S (2003). Superoxide dismutase affects the viability of thawed European mouflon (Ovis g. musimon) semen and the heterologous fertilization using both IVF and intracytoplasmatic sperm injection. Reprod Fertil Dev 15: 19-25. Berlinguer F, Leoni GG, Bogliolo L, Bebbere D, Succu S, Rosati I, Ledda S, Naitana S (2005). In vivo and in vitro fertilizing capacity of cryopreserved European mouflon [Ovis gmelini musimon] spermatozoa used to restore genetically rare and isolated populations. Theriogenology 63: 902-911.

185

Berlinguer F, Leoni GG, Succu S, Mossa F, Galioto M, Madeddu M, Naitana S (2007). Cryopreservation of European Mouflon (Ovis Gmelini Musimon) semen during the non-breeding season is enhanced by the use of trehalose. Reprod Domest Anim 42: 202-207. Berriatua E, Álvarez V, Extramiana B, González L, Daltabuit M (2003). Transmission and control implications of seroconversion to Maedi-Visna virus in Basque dairy-sheep flocks. Prev Vet Med 60: 265-79. Berriatua E, Barandika J, Aduriz G, Atxaerandio R, Garrido J et al (2004). Age-specific seroprevalence of Border disease virus and presence of persistently infected sheep in Basque dairy-sheep flocks. Vet J 168: 336-342. Bibi F (2013). A multi-calibrated mitochondrial phylogeny of extant Bovidae (Artiodactyla, Ruminantia) and the importance of the fossil record to systematics. BMC Evol Biol 13: 166. Biémont C, Vieira C (2006). Genetics: junk DNA as an evolutionary force. Nature 443: 521-524. Bischof RJ, Snibson K, Shaw R, Meeusen EN (2003). Induction of allergic inflammation in the Birikas of sensitized sheep after local challenge with house dust mite. Clin Exp Allergy 33: 367-375. Bishop SC, Morris CA (2007). Genetics of disease resistance in sheep and goats. Small Ruminant Res 70: 48-59. Black SG, Arnaud F, Palmarini M, Spencer TE (2010). Endogenous retroviruses in trophoblast differentiation and placental development. Am J Reprod Immunol 64: 255-264. Blikstad V, Benachenhou F, Sperber GO, Blomberg J (2008). Evolution of human endogenous retroviral sequences: a conceptual account. Cell Mol Life Sci 65: 3348- 3365. Blomberg J, Ushameckis D, Jern P (2005). Evolutionary aspects of human endogenous retroviral sequences (HERVs) and disease. In Sverdlov ED, Retroviruses and Primate Genome Evolution (eds), 204–238. Blomberg J, Benachenhou F, Blikstad V, Sperber GR, Mayer J (2009). Classification and nomenclature of endogenous retroviral sequences (ERVs): Problems and recommendations. Gene 448: 115-123. Blond JL, Lavillette D, Cheynet V, Bouton O, Oriol G et al. (2000). An envelope glycoprotein of the human endogenous retrovirus HERV-W is expressed in the human placenta and fuses cells expressing the type D mammalian retrovirus receptor. J Virol 74: 3321-3329. Boeke JD, Stoye JP (1997). Retrotransposons, Endogenous Retroviruses, and the Evolution of Retroelements. In Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE (eds.). Retroviruses. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. Boissinot S, Entezama A, Young L, Munson PJ (2004). The insertional history of an active family of L1 retrotransposons in humans. Genome res 14: 1221-1231.

186

Bolisetty M, Blomberg J, Benachenhou F (2012). Unexpected diversity and expression of avian endogenous retroviruses. MBio 3: e00344-12. Bonnaud B, Beliaeff J, Bouton O, Oriol G, Duret L et al. (2005). Natural history of the ERVWE1 endogenous retroviral locus. Retrovirology 2: 57. Bomben VC, Turner KL, Barclay TT, Sontheimer H (2011). Transient receptor potential canonical channels are essential for chemotactic migration of human malignant gliomas. J Cell Physiol 226: 1879-1888. Bornstein C, Brosh R, Molchadsky A, Madar S, Kogan-Sakin I et al (2011). SPATA18, a spermatogenesis-associated gene, is a novel transcriptional target of p53 and p63. Mol Cell Biol 31: 1679-1689. Bourque G, Leong B, Vega VB, Chen X, Lee YL et al. (2008). Evolution of the mammalian transcription factor binding repertoire via transposable elements. Genome Res 18: 1752-1762. Boyce-Jacino MT, Resnick R, Faras AJ (1989). Structural and functional characterization of the unusually short long terminal repeats and their adjacent regions of a novel endogenous avian retrovirus. Virology 173: 157-166. Boyce-Jacino MT, O'Donoghue K, Faras AJ (1992). Multiple complex families of endogenous retroviruses are highly conserved in the genus Gallus. J Virol 66: 4919-4929. Brady T, Lee YN, Ronen K, Malani N, Berry CC et al. (2009). Integration target site selection by a resurrected human endogenous retrovirus. Genes Dev 23: 633-642. Brennecke J, Malone CD, Aravin AA, Sachidanandam R, Stark A et al. (2008). An epigenetic role for maternally inherited piRNAs in transposon silencing. Science 322: 1387-1392. Bringaud F, Muller M, Cerqueira GC, Smith M, Rochette A et al. (2007). Members of a large retroposon family are determinants of post-transcriptional gene expression in Leishmania. PLoS Pathog 3: 1291-1307. Britten RJ, Davidson EH (1969). Gene regulation for higher cells: a theory. Science 165: 349-357. Brosius J (1999). Genomes were forged by massive bombardments with retroelements and retrosequences. Genetica 107: 209-238. Brown JH (2001). Mammals on mountainsides: elevational patterns of diversity. Glob Ecol Biogeogr 10: 101-109. Bunch T, N'guyen T, Lauvergne J (1978). Hemoglobins of the Corsico-Sardinian Mouflon (Ovis musimon) and their implications for the origin of Hb A in domestic sheep (Ovis aries). Ann Genet Sel Anim 10: 503-506. Bunch T, Nadler C (1980) Giemsa-band patterns of the tahr and chromosomal evolution of the tribe Caprini. J Hered 71: 110–116.

187

Burmeister T, Ebert AD, Pritze W, Loddenkemper C, Schwartz S et al. (2004). Insertional polymorphisms of endogenous HERV-K113 and HERV-K115 retroviruses in breast cancer patients and age-matched controls. AIDS Res Hum Retroviruses 20: 1223-1229. Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW (2005). Quantitative real-time RT-PCR- a perspective. J Mol Endocrinol 34: 597–601. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 55: 611-22. Cabrera A (1914). Fauna Ibérica. Mamíferos. Museo Nacional de Ciencias Naturales, Madrid, 441. Cáceres M, Thomas JW (2006). The gene of retroviral origin Syncytin 1 is specific to hominoids and is inactive in Old World monkeys. J Hered 97: 100-106. Caporale M, Cousens C, Centorame P, Pinoni C, De las Heras M et al. (2006). Expression of the Jaagsiekte sheep retrovirus envelope glycoproteins is sufficient to induce Birika tumor in sheep. J Virol 80: 8030-8037. Caporale M, Martineau H, De las Heras M, Murgia C, Huang R et al. (2013). Host species barriers to Jaagsiekte sheep retrovirus replication and carcinogenesis. J Virol 87: 10752-10762. Carareto CM, Hernandez EH, Vieira C (2014). Genomic regions harboring insecticide resistance-associated Cyp genes are enriched by transposable element fragments carrying putative transcription factor binding sites in two sibling Drosophila species. Gene 537: 93-99. Carcangiu V, Mura MC, Vacca GM, Dettori ML, Pazzola M, Daga C, Luridiana S (2010). Characterization of the melatonin receptor gene MT1 in mouflon (Ovis Gmelini Musimon) and its relationship with reproductive activity. Mol Reprod Dev 77: 196. Cardon LR, Palmer LJ (2003). Population stratification and spurious allelic association. Lancet 361: 598-604. Carlson J, Lyon M, Bishop J, Vaiman A, Cribiu E et al. (2003). Chromosomal distribution of endogenous Jaagsiekte sheep retrovirus proviral sequences in the sheep genome. J Virol 77: 9662-9668. Carlson CS, Eberle MA, Kruglyak L, Nickerson DA (2004). Mapping complex disease locus in whole-genome association studies. Nature 429: 446-452. Carp RI, Meeker HC, Caruso V, Sersen E (1999). Scrapie strain-specific interactions with endogenous murine leukaemia virus. J Gen Virol 80: 5-10. Carp RI, Meeker HC, Kozlowski I, Sersen EA (2000). An endogenous retrovirus and exogenous Scrapie in a mouse model of aging. Trends Microbiol 8: 39-42.

188

Cassandrini D, Cilio MR, Bianchi M, Doimo M, Balestri M et al. (2013). Pontocerebellar hypoplasia type 6 caused by mutations in RARS2: definition of the clinical spectrum and molecular findings in five patients. J Inherit Metab Dis 36: 43-53. Cavallero S, Marco I, Lavín S, D'Amelio S, López-Olvera JR (2012). Polymorphisms at MHC class II DRB1 exon 2 locus in Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica). Infect Genet Evol 12: 1020-1026. Champoux JJ (1993). Role of ribonuclease H in reverse transcription. In Skalka AM, Goff SD (eds.). Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (NY), 103–117. Chaudhary A, Hilton MB, Seaman S, Haines DC, Stevenson S et al. (2012). TEM8/ANTXR1 blockade inhibits pathological angiogenesis and potentiates tumoricidal responses against multiple cancer types. Cancer Cell 21: 212-226. Chen SY, Su YH, Wu SF, Sha T, Zhang YP (2005). Mitochondrial diversity and phylogeographic structure of Chinese domestic goats. Mol Phylogenet Evol 37: 804-814. Chen R, Luo FK, Wang YL, Tang JL, Liu YS (2011). LBP and CD14 polymorphisms correlate with increased colorectal carcinoma risk in Han Chinese. World J Gastroenterol 17: 2326-2331. Chessa B, Pereira F, Arnaud F, Amorim A, Goyache F et al. (2009). Revealing the history of sheep domestication using retrovirus integrations. Science 324: 532-536. Cho K, Lee YK, Greenhalgh DG (2008). Endogenous retroviruses in systemic response to stress signals. Shock 30: 105-116. Clase AC, Dimcheff DE, Favara C, Dorward D, McAtee FJ et al. (2006). Oligodendrocytes are a major target of the toxicity of spongiogenic murine retroviruses. Am J Pathol 169: 1026-1038. Clausen J (2003). Endogenous retroviruses and MS: using ERVs as disease markers. Int MS J 10: 22-28. Coffin JM (1992). Retroviral DNA integration. Dev Biol Stand 76: 141-151. Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE (1997). The Interactions of Retroviruses and their Hosts. In Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE (eds.). Retroviruses. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cohen CJ, Lock WM & Mager DL (2009). Endogenous retroviral LTRs as promoters for human genes: a critical assessment. Gene 448: 105–114.

Cordell HJ, Clayton DG (2005). Genetic association studies. Lancet 366: 1121-1131.

Cordonnier A, Casella JF, Heidmann T (1995). Isolation of novel human endogenous retrovirus-like elements with foamy virus-related pol sequence. J Virol 69: 5890-5897.

Cornelis G, Heidmann O, Bernard-Stoecklin S, Reynaud K, Véron G et al. (2012). Ancestral capture of syncytin-Car1, a fusogenic endogenous retroviral envelope gene

189

involved in placentation and conserved in Carnivora. Proc Natl Acad Sci USA 109: E432-E441.

Cornelis G, Heidmann O, Degrelle SA, Vernochet C, Lavialle C et al. (2013). Captured retroviral envelope syncytin gene associated with the unique placental structure of higher ruminants. Proc Natl Acad Sci USA 110: E828-837.

Coulson DT, Brockbank S, Quinn JG, Murphy S, Ravid R (2008). Identification of valid reference genes for the normalization of RT qPCR gene expression data in human brain tissue. BMC Mol Biol 9: 46.

Cousens C, Minguijon E, Garcia M, Ferrer LM, Dalziel RG et al. (1996). PCR-based detection and partial characterization of a retrovirus associated with contagious intranasal tumors of sheep and goats. J Virol 70: 7580-7583.

Cousens C, Minguijon E, Dalziel RG, Ortin A, Garcia M et al. (1999). Complete sequence of enzootic nasal tumor virus, a retrovirus associated with transmissible intranasal tumors of sheep. J Virol 73: 3986-3993.

Cousens C, Bishop JV, Philbey AW, Gill CA, Palmarini M et al. (2004). Analysis of integration sites of Jaagsiekte sheep retrovirus in ovine pulmonary adenocarcinoma. J Virol 78: 8506-8512.

Cousens C, Maeda N, Murgia C, Dagleish MP, Palmarini M et al. (2007). In vivo tumorigenesis by Jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) requires Y590 in Env TM, but not fulllength orfX open reading frame. Virology 367: 413-421.

Couturier MAJ (1958). Parallèle anatomique, physiologique et écologique entre le pied du bouquetin des Alpes (Capra aegagrus ibex ibex) et celui du chamois (Rupicapra rupicapra) en rapport avec l'adaptation à la montagne de ces deux espèces. Mammalia 22: 76-89.

Dakessian RM, Fan H (2007). Specific in vivo expression in type II pneumocytes of the Jaagsiekte sheep retrovirus long terminal repeat in transgenic mice. Virology 372: 398-408.

Dalefield RR, Alley MR (1988). An ovine pulmonary tumour of alveolar epithelial type II cells. N Z Vet J 36: 25-27.

Daly AK, Day CP (2001). Candidate gene case-control association studies: advantages and potential pitfalls. Br J Clin Pharmacol 52: 489-499.

de Koning AP, Gu W, Castoe TA, Batzer MA, Pollock DD (2011). Repetitive elements may comprise over two-thirds of the human genome. PLoS Genet 7: e1002384.

De La Fuente LF, Gaiña D, Carolino N, Ugarte E (2006). The Awassi and Assaf Breeds in Spain and Portugal. European Association for Animal Production (EAAP), Anatalya, Turkey.

De las Heras M, Barsky SH, Hasleton P, Wagner M, Larson E et al. (2000). Evidence for a protein related immunologically to the Jaagsiekte sheep retrovirus in some human Birika tumours. Eur Respir J 16: 330-332.

De las Heras M, González L, Sharp JM (2003). Pathology of ovine pulmonary adenocarcinoma. Curr Top Microbiol Immunol 275: 25-54.

190

Deininger PL, Moran JV, Batzer MA, Kazazian HHJ (2003). Mobile elements and mammalian genome evolution. Curr Opin Genet Dev 13: 651-658.

Delassus S, Sonigo P, Wain-Hobson S (1989). Genetic organization of gibbon ape leukemia virus. Virology 173: 205-213.

Deloger M, Cavalli FM, Lerat E, Biémont C, Sagot MF, Vieira C (2009). Identification of expressed transposable element insertions in the sequenced genome of Drosophila melanogaster. Gene 439: 55-62.

DeMartini JC, Carlson JO, Leroux C, Spencer T, Palmarini M (2003). Endogenous retroviruses related to Jaagsiekte sheep retrovirus. Curr Top Microbiol Immunol 275: 117-137.

Dervishi E, Sánchez P, Alabart JL, Cocero MJ, Folch J et al. (2012). A suitable duplex PCR for ovine embryo sex and genotype of PrnP gene determination for MOET-based selection programmes. Reprod Domest Anim 46: 999-1003.

DGPA, 2014. Statistiques de la Direction de la Production et du Développement Agricole. Ministère de l’Agriculture.

Di Cristofano A, Strazzullo M, Parisi T, La Mantia G (1995). Mobilization of an ERV9 human endogenous retroviral element during primate evolution. Virology 213: 271-275.

Dimcheff DE, Drovetski SV, Krishnan M, Mindell DP (2000). Cospeciation and horizontal transmission of avian sarcoma and leukosis virus gag genes in galliform birds. J Virol 74: 3984-3995.

Dimcheff DE, Krishnan M, Mindell DP (2001). Evolution and characterization of tetraonine endogenous retrovirus: a new virus related to avian sarcoma and leukosis viruses. J Virol 75: 2002-2009.

Dixon TE, Hunter JW, Soler JP (2007). Interspecific embryo transfer from mouflon (Ovis gmelini musimon) to domestic Corriedale sheep in Argentina. Anim Reprod Sci 101: 158-62.

Donahue PR, Hoover EA, Beltz GA, Riedel N, Hirsch VM et al. (1988). Strong sequence conservation among horizontally transmissible, minimally pathogenic feline leukemia viruses. J Virol 62: 722-731.

Dong Y, Xie M, Jiang Y, Xiao N, Du X, Zhang W et al. (2013). Sequencing and automated whole-genome optical mapping of the genome of a domestic goat (Capra hircus). Nat Biotechnol 31:135-141.

Doolittle RF, Feng DF, Johnson MS, McClure MA (1989). Origins and evolutionary relationships of retroviruses. Q Rev Biol 64: 1-30.

Dunlap KA, Palmarini M, Adelson DL, Spencer TE (2005). Sheep endogenous betaretroviruses (enJSRVs) and the hyaluronidase 2 (HYAL2) receptor in the ovine uterus and conceptus. Biol Reprod 73: 271-279.

Dunlap KA, Palmarini M, Varela M, Burghardt RC, Hayashy K et al. (2006a). Endogenous retroviruses regulate peri-implantation conceptus growth and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA 103: 14390-14395.

Dunlap KA, Palmarini M, Spencer TE (2006b). Ovine endogenous betaretroviruses (enJSRVs) and placental morphogenesis. Placenta Suppl. A: S135-S140.

191

Dunn CA, Medstrand P, Mager DL (2003). An endogenous retroviral long terminal repeat is the dominant promoter for human beta1,3-galactosyltransferase 5 in the colon. Proc Natl Acad Sci USA 100: 12841–12846.

Dunn CA, Romanish MT, Gutierrez LE, van de Lagemaat LN, Mager DL (2006). Transcription of two human genes from a bidirectional endogenous retrovirus promoter. Gene 366: 335-342. Dupressoir A, Marceau G, Vernochet C, Bénit L, Kanellopoulos C et al. (2005). Syncytin-A and syncytin-B, two fusogenic placenta-specific murine envelope genes of retroviral origin conserved in Muridae. Proc Natl Acad Sci USA 102: 725-730.

Dupressoir A, Lavialle C, Heidmann T (2012). From ancestral infectious retroviruses to bona fide cellular genes: role of the captured syncytins in placentation. Placenta 33: 663-671.

Duret L, Marais G, Biémont C (2000). Transposons but not retrotransposons are located preferentially in regions of high recombination rate in Caenorhabditis elegans. Genetics 156: 1661-1669.

Dwyer CM, Lawrence AB (2008). Introduction to Animal Welfare and the Sheep. The Welfare of Sheep. Ed Dwyer CM. Springer Science.

Eickbush TH, Furano AV (2002). Fruit flies and humans respond differently to retrotransposons. Curr Opin Genet Dev 12: 669-674.

Ellerman V, Bang O (1908). Experimentalle leukemia bei huhnern. Centre Bakteriol Abt I Orig 46: 595-609. Esnault C, Priet S, Ribet D, Vernochet C, Bruls T et al. (2008). A placenta-specific receptor for the fusogenic, endogenous retrovirus-derived, human syncytin-2. Proc Natl Acad Sci USA 105: 17532-17537. Esteban C, Tejón D (1980). Catálogo de razas autóctonas españolas. Ministerio de Agricultura. Dirección General de la Producción Agraria, Madrid.

Excoffier L, Laval G, Schneider S (2007). Arlequin (version 3.0): an integrated software package for population genetics data analysis. Evol Bioinform Online 1: 47-50. Fablet M, Lerat E, Rebollo R, Horard B, Burlet N et al. (2009). Genomic environment influences the dynamics of the tirant LTR retrotransposon in Drosophila. FASEB J 23: 1482-1489. Fablet M, Vieira C (2011). Evolvability, epigenetics and transposable elements. Biomol Concepts 2: 333-341. Fajardo V, González I, López-Calleja I, Martin I, Rojas M et al. (2007). Analysis of mitochondrial DNA for authentication of meats from chamois (Rupicapra rupicapra), Pyrenean ibex (Capra pyrenaica), and mouflon (Ovis ammon) by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. J AOAC Int 90: 179-86.

192

Fan H (2003). Jaagsiekte Sheep Retrovirus and Birika Cancer. In Fan H, Hung Y (eds.) Springer-Verlag (Berlin). FAOSTAT (Food and Agriculture Organization of the United Nations). Available: faostat.fao.org/. (Accessed 2014 September 29). Farazi TA, Spitzer JI, Morozov P, Tuschl T (2011). miRNAs in human cancer. J Pathol 223: 102-115. Federación Española de Asociaciones de Ganado Selecto (FEAGAS). http://feagas.com/ Fernández-Moran J, Gomez S, Ballesteros F, Quiros P, Benito JL et al. (1997). Epizootiology of sarcoptic mange in a population of Cantabrian chamois (Rupicapra pyrenaica parva) in Northwestern Spain. Vet Parasitol 73: 163–171. Ferrari MR, Spirito SE, Giuliano SM, Cisale HO (2012). DNA content of Ovis musimon spermatozoa. Andrologia Suppl 1: 804-806. Filali H, Martin-Burriel I, Harders F, Varona L, Lyahyai J et al. (2011). Gene expression profiling and association with prion-related lesions in the medulla oblongata of symptomatic natural Scrapie animals. PLoS One 6: e19909. Filali H, Martin-Burriel I, Harders F, Varona L, Serrano C et al. (2012). Medulla oblongata transcriptome changes during presymptomatic natural Scrapie and their association with prion-related lesions. BMC Genomics 13: 399. Filali H, Vidal E, Bolea R, Márquez M, Marco P et al. (2013). Gene and protein patterns of potential prion-related markers in the central nervous system of clinical and preclinical infected sheep. Vet Res 44: 14. Filali H, Martín-Burriel I, Harders F, Varona L, Hedman C et al. (2014). Gene expression profiling of mesenteric Nodulu linf. from sheep with natural Scrapie. BMC Genomics 15: 59. Flicek P, Amode MR, Barrell D, Beal K, Billis K et al. (2014). Ensembl 2014. Nucleic Acids Res 42: D749-D755. Forma E, Wójcik-Krowiranda K, Bieńkiewicz A, Bryś M (2013). Molecular basis of gynecological oncology - TopBP1 protein as the guardian of genome integrity. Ginekol Pol 84: 373-376. Fort A, Hashimoto K, Yamada D, Salimullah M, Keya CA et al. (2014). Deep transcriptome profiling of mammalian stem cells supports a regulatory role for retrotransposons in pluripotency maintenance. Nat Genet 46: 558-566. Frendo JL, Olivier D, Cheynet V, Blond JL, Bouton O et al. (2003). Direct involvement of HERV-W Env glycoprotein in human trophoblast cell fusion and differentiation. Mol Cell Biol 23: 3566-3574. Frewer LJ, Kole A, van de Kroon SMA, de Lauwere C (2005). Consumer attitudes towards the development of animal-friendly husbandry systems. J Agr Environ Ethic 18: 345-367.

193

Frisby DP, Weiss RA, Roussel M, Stehelin D (1979). The distribution of endogenous chicken retrovirus sequences in the DNA of galliform birds does not coincide with avian phylogenetic relationships. Cell 17: 623-634. Gabiña D, Arrese F, Arranz J, Beltran De Heredia I (1993). Average milk yields and environmental effects on Latxa sheep. J Dairy Sci 76:1191-8. Gabiña D, Ugarte E (2001). Milking and milk production of dairy sheep in Spain. Archiv für Tierzucht 44: 315-321. Gaddour A, Najari S, Ouni M (2008). Productive performance of pure breeds and cross-bred goat genotypes in southern Tunisia. Options Méditerranéennes 79: 435-438. Gao J, Liu K, Liu H, Blair HT, Li G et al. (2010). A complete DNA sequence map of the ovine Major Histocompatibility Complex. BMC Genomics 11: 466. Garcia-Etxebarria K , Jugo BM (2014). Genomic environment and digital expression of bovine endogenous retroviruses. Gene 548: 14-21. Garcia-Etxebarria K, Sistiaga-Poveda M, Jugo BM (2014). Endogenous retroviruses in domestic animals. Current Genomics 15: 256-265. García-González R, Herrero J (2007). Rupicapra pyrenaica Bonaparte, 1845. In Palomo LJ, Gisbert J, Blanco JC (eds.). Atlas y libro rojo de los mamíferos de España. Dirección General para la Biodiversidad-SECEM-SECEMU (Madrid), 586. Gardner A, Willeberg P, Mousing J (2002). Empirical and theoretical evidence for herd size as a risk factor for swine diseases. Anim Health Res Rev 3: 43-55. Gatesy J, Milinkovitch M, Waddell V, Stanhope M (1999). Stability of cladistic relationships between Cetacea and higher-level artiodactyls taxa. Syst Biol 48: 6-20. Gene Ontology Consortium (geneontology.org) Gentles AJ, Wakefield MJ, Kohany O, Gu W, Batzer MA (2007). Evolutionary dynamics of transposable elements in the short-tailed opossum Monodelphis domestica. Genome Res 17: 992-1004. Gentry AW (2000). The Ruminant radiation. In Vrba ES, Schaller GB (eds.). Antelopes, Deer, and Relatives. Fossil Record, Behavioral Ecology, Systematics, and Conservation. Yale University Press (New Haven), 11-25. Gifford R, Tristem M (2003). The evolution, distribution and diversity of endogenous retroviruses. Virus Genes 26: 291-315. Gifford R, Kabat P, Martin J, Lynch C, Tristem M (2005). Evolution and distribution of class II-related endogenous retroviruses. J Virol 79: 6478-6486. Gingerich PD, Haq MU, Zalmout IS, Khan IH, Malkani MS (2001). Origin of whales from early artiodactyls: hands and feet of Eocene Protocetidae from Pakistan. Science 293: 2239-2242.

194

Gleason MR, Nagiel A, Jamet S, Vologodskaia M, López-Schier H et al. (2009). The transmembrane inner ear (Tmie) protein is essential for normal hearing and balance in the zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA 106: 21347-21352. Goddard P, Waterhouse T, Dwyer C, Stott A (2006). The perception of the welfare of sheep in extensive systems? Small Ruminant Res 62: 215-225. Goddard ME, Hayes BJ (2009). Mapping genes for complex traits in domestic animals and their use in breeding programs. Nat Rev Genet 10: 381-391. Godornes C, Leader BT, Molini BJ, Centurion-Lara A, Lukehart A (2007). Quantitation of Rabbit Cytokine mRNA by Real-Time RT-PCR. Cytokine 38: 1-7. Godovac-Zimmermann J, Conti A, Napolitano L (1987). The complete amino-acid sequence of dimeric beta-lactoglobulin from mouflon (Ovis ammon musimon) milk. Biol Chem Hoppe Seyler 368: 1313-1319. González L (1989). El Maedi o neumonía progresiva en el conjunto de las enfermedades respiratorias crónicas del ganado ovino en la Comunidad Autónoma Vasca. Universidad de Zaragoza de Veterinaria, Departamento de Patología Animal. González JR, Armengol L, Solé X, Guinó E, Mercader JM, Estivill X, Moreno V (2007). SNPassoc: an R package to perform whole genome association studies. Bioinformatics 23: 644-645. González-Bulnes A, Santiago-Moreno J, Garcia-Garcia RM, del Campo A, Gómez-Brunet A, Lopez-Sebastian A (2001). Origin of the preovulatory follicle in Mouflon sheep (Ovis gmelini musimon) and effect on growth of remaining follicles during the follicular phase of oestrous cycle. Anim Reprod Sci 65: 265-72. Guil S, Esteller M (2012). Cis-acting noncoding RNAs: friends and foes. Nat Struct Mol Biol 19: 1068-1075. Guo J, Du LX, Ma YH, Guan WJ, Li HB et al. (2005) A novel maternal lineage revealed in sheep (Ovis aries). Anim Genet 36: 331-336. Griffiths DJ, Martineau HM, Cousens C (2010). Pathology and pathogenesis of ovine pulmonary adenocarcinoma. J Comp Pathol 142: 260-283. Groves CP, Leslie DM (2011). Bovidae (Hollow-Horned Ruminants). In Wilson DE, Mittermeier RA (eds.). Handbook of the Mammals of the World. Volume 2. Hoofed Mammals. Lynx Edicions (Barcelona), 444-774. Grubb P (1993). Mammal species of the world. A taxonomic and geographic reference. In Wilson DE, Reeder DM (eds.). Johns Hopkins University Press (Washington), 393-414. Haenlein GFW (2001). Past, present, and future perspectives of small ruminant dairy research. J Dairy Sci 84: 2097-2115.

195

Hamdi HK, Nishio H, Tavis J, Zielinski R, Dugaiczyk A (2000). Alu-mediated phylogenetic novelties in gene regulation and development. J Mol Biol 299: 931-939. Hammer S, Nadlinger K, Hartl GB: Mitochondrial DNA differentiation in chamois (genus Rupicapra) (1995). Implications for taxonomy, conservation, and management. Acta Theriologica Suppl. 3: 145-155. Hanafusa T, Hanafusa H, Metroka CE, Hayward WS, Rettenmier CW et al. (1976). Pheasant virus: new class of ribodeoxyvirus. Proc Natl Acad Sci USA 73: 1333-1337. Harris DR (1996). The Origins and Spread Of Agriculture and Pastoralism in Eurasia. In: Harris DR (ed.). Smithsonian Institution Press: Washington, DC, USA. Vol. 5, 552–573. Hatziioannou T, Bieniasz PD (2011). Antiretroviral restriction factors. Curr Opin Virol 1: 526-532. Hawkey CM, Hart MG, Fitzgerald AK (1984). Haematological values in mouflon (Ovis musimon): influence of age, sex, season and vitamin E status. Res Vet Sci 36: 37-42. Hayward JA, Tachedjian M, Cui J, Field H, Holmes EC et al. (2013). Identification of diverse full-length endogenous betaretroviruses in megabats and microbats. Retrovirology 10: 35. Hecht SJ, Stedman KE, Carlson JO, DeMartini JC (1996). Distribution of endogenous type B and type D sheep retrovirus sequences in ungulates and other mammals. Proc Natl Acad Sci USA 93: 3297-3302. Hedges DJ, Batzer MA (2005). From the margins of the genome: mobile elements shape primate evolution. Bioessays 27: 785–794. Hedman C, Lyahyai J, Filali H, Marín B, Serrano C et al. (2012). Differential gene expression and apoptosis markers in presymptomatic Scrapie affected sheep. Vet Microbiol 159: 23-32. Heidmann O, Vernochet C, Dupressoir A, Heidmann T (2009). Identification of an endogenous retroviral envelope gene with fusogenic activity and placenta-specific expression in the rabbit: a new "syncytin" in a third order of mammals. Retrovirology 6: 107. Heiman M (1997). Webcutter 2: 0 rna.lundberg.gu.se/cutter2 Hernández RS, Sarasa R, Toledano A, Badiola JJ, Monzón M (2014). Morphological approach to assess the involvement of astrocytes in prion propagation. Cell Tissue Res 358: 57-63. Hernández-Fernández M, Vrba ES (2005). A complete estimate of the phylogenetic relationships in Ruminantia: a dated species-level supertree of the extant ruminants. Biol Rev Camb Philos Soc 80: 269-302. Herniou E, Martin J, Miller K, Cook J, Wilkinson M, Tristem M (1998). Retroviral diversity and distribution in vertebrates. J Virol 72: 5955-5966.

196

Hiendleder S, Mainz K, Plante Y, Lewalski H (1998). Analysis of mitochondrial DNA indicates that domestic sheep are derived from two different ancestral maternal sources: no evidence for contributions from urial and argali sheep. J Hered 89: 113-120. Hiendleder S, Kaupe B, Wassmuth R, Janke A (2002). Molecular analysis of wild and domestic sheep questions current nomenclature and provides evidence for domestication from two different subspecies. Proc Biol Sci 269: 893-904. Hirschhorn JN, Lohmueller K, Byrne E, Hirschhorn K (2002). A comprehensive review of genetic association studies. Genet Med 4: 45-61. Hirschhorn JN, Daly MJ (2005). Genome-wide association studies for common diseases and complex traits. Nat Rev Genet 6: 95-108. Hooper PT, Ellard KA (1995). A pulmonary adenoma in an Australian sheep. Aust Vet J 72: 477. Hosamani M, Scagliarini A, Bhanuprakash V, McInnes CJ, Singh RK (2009). Orf: an update on current research and future perspectives. Expert Rev Anti Infect Ther 7: 879-893. Huang Y, Wang Y, Wang M, Sun B, Li Y et al. (2008). Differential methylation of TSP50 and mTSP50 genes in different types of human tissues and mouse spermatic cells. Biochem Biophys Res Commun 374: 658-661. Huda A, Polavarapu N, Jordan IK, McDonald JF (2008). Endogenous retroviruses of the chicken genome. Biol Direct 3: 9. Huder JB, Böni J, Hatt J-M, Soldati G, Lutz H, Schüpbach J (2002). Identification and characterization of two closely related unclassifiable endogenous retroviruses in pythons (Python molurus and Python curtus). J Virol 76: 7607-7615. Huelsenbeck J, Ronquist F (2001). MrBayes: Bayesian inference of phylogeny. Bioinformatics 17: 754-755. Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A (2005). Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes Immun 6: 279-284. Hughes JF, Coffin JM (2001). Evidence for genomic rearrangements mediated by human endogenous retroviruses during primate evolution. Nat Genet 29: 487-489. Hughes JF, Coffin JM (2004). Human endogenous retrovirus K solo-LTR formation and insertional polymorphisms: implications for human and viral evolution. Proc Natl Acad Sci USA 101: 1668-1672. Huh JW, Ha HS, Kim DS, Kim HS (2008). Placenta-restricted expression of LTR-derived NOS3. Placenta 29: 602-608. Hunter AR, Munro R (1983). The diagnosis, occurrence and distribution of sheep pulmonary adenomatosis in Scotland 1975 to 1981. Br Vet J 139: 153-164.

197

Hurtado A, García-Pérez AL, Beltrán de Heredia I, Barandika J, Sanz-Parra A (2002). Genetic susceptibility to Scrapie in a population of Latxa breed sheep in the Basque Country, Spain. Small Ruminant Res 45: 255–259. Hurtado A, Aduriz G, Gomez N, Oporto B, Juste RA et al. (2004). Molecular identification of a new pestivirus associated with increased mortality in the Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica) in Spain. J Wildl Dis 40: 796-800. Ilhan A, Neziri D, Maj M, Mazal PR, Susani M et al. (2011). Expression of secretagogin in clear-cell renal cell carcinomas is associated with a high metastasis rate. Hum Pathol 42: 641-648. Integrated DNA Technologies (IDT) - Oligo Analyzer tool. eu.idtdna.com/analyzer /Applications/OligoAnalyzer International Sheep Genomics Consortium (ISGC). www.sheephapmap.org International Union for Conservation of Nature (IUCN). www.iucn.org Jamal SM, Belsham GJ (2013). Foot-and-mouth disease: past, present and future. Vet Res 44: 116. Jeong BH, Lee, YJ, Carp RI, Kim YS (2010). The prevalence of human endogenous retroviruses in cerebrospinal fluids from patients with sporadic Creutzfeld-Jakob disease. J Clin Virol 47: 136-142. Jern P, Sperber GO, Blomberg J (2005). Use of endogenous retroviral sequences (ERVs) and structural markers for retroviral phylogenetic inference and taxonomy. Retrovirology 2: 50. Jern P, Coffin JM (2008). Effects of retroviruses on host genome function. Annu Rev Genet 42: 709-732. Jiang Y, Xie M, Chen W, Talbot R, Maddox JF et al. (2014). The sheep genome illuminates biology of the rumen and lipid metabolism. Science 344: 1168-1173. Jiménez MA, Jurado JJ (2005). Esquema de selección en la raza Assaf en León. ITEA 26: 99-101. Jolicoeur P, Masse G, Kay DG (1996). The prion protein gene is dispensable for the development of spongiform myeloencephalopathy induced by the neurovirulent Cas-Br-E murine leukemia virus. J Virol 70: 9031-9034. Jordan IK, Rogozin IB, Glazko GV, Koonin EV (2003). Origin of a substantial fraction of human regulatory sequences from transposable elements. Trends Genet 19: 68-72. Joshi MB, Rout PK, Mandal AK, Tyler-Smith C, Singh L et al. (2004). Phylogeography and origin of Indian domestic goats. Mol Biol Evol 21: 454-462.

198

Jugo BM, Vicario A (2000). Single-strand conformational polymorphism and sequence polymorphism of Mhc-DRB in Latxa and Karrantza sheep: implications for Caprinae phylogeny. Immunogenetics 51: 887–897. Jugo BM, Vicario A (2001). Lymphocyte antigens in sheep: linkage to the MHC class II DRB1 gene. Eur J Immunogenet 28: 451-458. Jugo BM, Joosten I, Grosfeld-Stulemeyer M, Amorena B, Hensen EJ (2002). Immunoprecipitation and isoelectric focusing of sheep MHC class I antigens reveal higher complexity than serology. Eur J Immunogenet 29: 391-399. Kahyo T, Tao H, Shinmura K, Yamada H, Mori H et al. (2013). Identification and association study with Birika cancer for novel insertion polymorphisms of human endogenous retrovirus. Carcinogenesis 34: 2531-2538. Kamat A, Alcorn JL, Kunczt C, Mendelson CR (1998). Characterization of the regulatory regions of the human aromatase (P450arom) gene involved in placenta-specific expression. Mol Endocrinol 12: 1764-1777. Kambol R, Kabat P, Tristem M (2003). Complete nucleotide sequence of an endogenous retrovirus from the amphibian, Xenopus laevis. Virology 311: 1-6. Kassiotis G (2014). Endogenous retroviruses and the development of cancer. J Immunol 192: 1343-1349. Katoh K, Misawa K, Kuma K-I, Miyata T (2002). MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform. Nucleic Acids Res 30: 3059-3066. Katoh K, Kuma K, Toh H, Miyata T (2005). MAFFT version 5: improvement in accuracy of multiple sequence alignment. Nucleic Acids Res 33: 511-518. Katzourakis A, Pereira V, Tristem M (2007). Effects of recombination rate on human endogenous retrovirus fixation and persistence. J Virol 81: 10712-10717. Kazazian HH Jr,Wong C, Youssoufian H, Scott AF, Phillips DG et al. (1988). Haemophilia A resulting from de novo insertion of L1 sequences represents a novel mechanism for mutation in man. Nature 332: 164-166. Kefeli U, Yildirim ME, Aydin D, Madenci OC, Yasar N et al. (2012). Netrin-1 concentrations in patients with advanced gastric cancer and its relation with treatment. Biomarkers 17: 663-667. Kelley D, Rinn J (2012). Transposable elements reveal a stem cell-specific class of long noncoding RNAs. Genome Biol 13: R107. Kendrick KM (2008). Sheep Senses, Social Cognition and Capacity for Consciousness. The Welfare of Sheep. Ed Dwyer C. Springer. Kent JE (1997). Stress in Transported Sheep. Comp Haematol Int 7: 163-166.

199

Kijas JW, Townley D, Dalrymple BP, Heaton MP, Maddox JF et al (2009). International Sheep Genomics Consortium. A genome wide survey of SNP variation reveals the genetic structure of sheep breeds. PLoS One 4: 4668. Kim TH, Jeon YJ, Yi JM, Kim DS, Huh JW et al. (2004). The distribution and expression of HERV families in the human genome. Mol Cells 18: 87-93. Kim BJ, Kim SY, Lee S, Jeon JH, Matsui H, Kwon YK et al. (2012). The role of transient receptor potential channel blockers in human gastric cancer cell viability. Can J Physiol Pharmacol 90: 175-186. Kimura M (1980). A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 16: 111-120. Klymiuk N, Müller M, Brem G, Aigner B (2003). Characterization of endogenous retroviruses in sheep. J Virol 77: 11268-11273. Kotorashvili A, Ramnauth A, Liu C, Lin J, Ye K et al. (2012). Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One 7: e34683. Kozak CA, Gromet NJ, Ikeda H, Buckler CE (1984). A unique sequence related to the ecotropic murine leukemia virus is associated with the Fv-4 resistance gene. Proc Natl Acad Sci USA 81: 834-837. Kremmidiotis G, Baker E, Crawford J, Eyre HJ, Nahmias J et al. (1998). Localization of human cadherin genes to chromosome regions exhibiting cancer-related loss of heterozygosity. Genomics 49: 467-471. Kumaki Y, Oda M, Okano M (2008). QUMA: quantification tool for methylation analysis. Nucleic Acids Res 36: W170-W175. Kunarso G, Chia NY, Jeyakani J, Hwang C, Lu X et al. (2010). Transposable elements have rewired the core regulatory network of human embryonic stem cells. Nat Genet 42: 631-634. Kurth R, Bannert N (2010). Beneficial and detrimental effects of human endogenous retroviruses. Int J Cancer 126: 306-314. Lamka J, Duchácek L, Nevole Z, Hejralová R, Sesták J (1997). Parenteral administration of ivermectin: effectiveness against nematodes in wild sheep (Ovis musimon). Vet Med 42: 369-372. Lamprecht B, Walter K, Kreher S, Kumar R, Hummel M et al. (2010). Derepression of an endogenous long terminal repeat activates the CSF1R proto-oncogene in human lymphoma. Nat Med 16: 571-579. Lancioni A, Pizzo M, Fontanella B, Ferrentino R, Napolitano LM et al. (2010). Lack of Mid1, the mouse ortholog of the Opitz syndrome gene, causes abnormal development of the anterior cerebellar vermis. J Neurosci 30: 2880-2887.

200

Landete-Castillejos T, Garcia A, Langton S, Inglis I, Gallego L, Garde J (2001). Opposing offspring sex ratio variations with increasing age and weight in mouflon mothers (Ovis musimon). Acta Vet Hung 49: 257-268. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860-921. Landry JR, Rouhi A, Medstrand P, Mager DL (2002). The Opitz syndrome gene Mid1 is transcribed from a human endogenous retroviral promoter. Mol Biol Evol 19: 1934-1942. Larruskain A, Minguijón E, García-Etxebarria K, Moreno B, Arostegui I et al. (2010). MHC class II DRB1 gene polymorphism in the pathogenesis of Maedi-Visna and pulmonary adenocarcinoma viral diseases in sheep. Immunogenetics 62: 75-83. Larruskain A, Minguijón E, Arostegui I, Moreno B, Juste RA et al. (2012). Microsatellites in immune-relevant regions and their associations with Maedi-Visna and ovine pulmonary adenocarcinoma viral diseases. Vet Immunol Immunopathol 145: 438-446. Larruskain A, Bernales I, Luján L, de Andrés D, Amorena B et al. (2013). Expression analysis of 13 ovine immune response candidate genes in Visna/Maedi disease progression. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 36: 405-413. Latham T, Gilbert N, Ramsahoye B (2008). DNAvmethylation inmouse embryonic stem cells and development. Cell Tissue Res 331: 31–55. Lawson-Handley LJ, Byrne K, Santucci F, Townsend S, Taylor M et al. (2007). Genetic structure of European sheep breeds. Heredity 99: 620-631. Lebedev YB, Belonovitch OS, Zybrova NV, Khil PP, Kurdyukov SG et al. (2000). Differences in HERV-K LTR insertions in orthologous locus of humans and great apes. Gene 247: 265–277. Leblanc P, Alais S, Porto-Carreiro I, Lehmann S, Grassi J et al. (2006). Retrovirus infection strongly enhances Scrapie infectivity release in cell culture. EMBO J 25: 2674-2685. Lee KH, Jeong BH, Jin JK, Meeker HC, Kim JI et al. (2006). Scrapie infection activates the replication of ecotropic, xenotropic, and polytropic murine leukemia virus (MuLV) in brains and spinal cords of senescence-accelerated mice: implication of MuLV in progression of Scrapie pathogenesis. Biochem Biophys Res Commun 349: 122-130. Lee YJ, Jeong BH, Chol EK, Kim YS (2013). Involvement of endogenous retroviruses in prion diseases. Pathogens 2: 533-543. Leginagoikoa I, Daltabuit-Test M, Álvarez V, Arranz J, Juste RA (2006a). Horizontal Maedi-Visna virus (MVV) infection in adult dairy-sheep raised under varying MVV-infection pressures investigated by ELISA and PCR. Res Vet Sci 80: 235-241. Leginagoikoa I, Juste RA, Barandika J, Amorena B, De Andrés D et al (2006b). Extensive rearing hinders Maedi-Visna Virus (MVV) infection in sheep. Vet Res 37: 767-78.

201

Leginagoikoa I, Minguijón E, Juste RA, Barandika J, Amorena B et al. (2010). Effects of housing on the incidence of visna/maedi virus infection in sheep flocks. Res Vet Sci 88: 415-521. Legname G, Baskakov LV, Nguyen HO, Riesner D, Cohen FE et al. (2004). Synthetic mammalian prions. Science 305: 673-676. Levin HL, Moran JV (2011). Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet 12: 615-627. Levy A, Sela N, Ast G (2008). TranspoGene and microTranspoGene: transposed elements influence on the transcriptome of seven vertebrates and invertebrates. Nucleic Acids Res 36: D47-D52. Leib-Mösch C, Seifarth W, Schön U (2005). Influence of human endogenous retroviruses on cellular gene expression. In: Sverdlov ED, editor. Retroviruses and primate genome evolution. Georgetown (Texas): Landes Bioscience. pp. 123–143. Leroux C, Mornex JF (2008). Retroviral infections in sheep and the associated diseases. Small Ruminant Research 76: 68-76. Li E, Bestor TH, Jaenisch R (1992). Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69: 915–926. Libus J, Štorchová H (2006). Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. Biotechniques 41: 156-160. Lim SP, Wong NC, Suetani RJ, Ho K, Ng JL et al. (2012). Specific-site methylation of tumour suppressor ANKRD11 in breast cancer. Eur J Cancer 48: 3300-3309. Lincoln GA (1998). Reproductive seasonality and maturation throughout the complete life-cycle in the mouflon ram (Ovis musimon). Anim Reprod Sci 53: 87-105. Lindblad-Toh K, Garber M, Zuk O, Lin MF, Parker BJ (2011). A high-resolution map of human evolutionary constraint using 29 mammals. Nature 478: 476-482. Linnerth-Petrik NM, Walsh SR, Bogner PN, Morrison C, Wootton SK (2014). Jaagsiekte sheep retrovirus detected in human Birika cancer tissue arrays. BMC Res Notes 7: 160. Lippman Z, Gendrel AV, Black M, Vaughn MW, Dedhia N et al. (2004). Role of transposable elements in heterochromatin and epigenetic control. Nature 430: 471-476. Liu SL, Duh FM, Lerman MI, Miller AD (2003a). Role of virus receptor Hyal2 in oncogenic transformation of rodent fibroblasts by sheep betaretrovirus env proteins. J Virol 77: 2850-2858. Liu SL, Lerman MI, Miller AD (2003b). Putative phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) binding motifs in ovine betaretrovirus Env proteins are not essential for rodent fibroblast transformation and PI3K/Akt activation. J Virol 77: 7924-7935.

202

Liu SL, Miller AD (2005). Transformation of madindarby canine kidney epithelial cells by sheep retrovirus envelope proteins. J Virol 79: 927-933. Lock FE, Rebollo R, Miceli-Royer K, Gagnier L, Kuah S et al. (2014). Distinct isoform of FABP7 revealed by screening for retroelement-activated genes in diffuse large B-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA 111: E3534-E3543. Lovari S (1987). Evolutionary aspects of the biology of Chamois. Rupicapra spp. (Bovidae, Caprinae). The biology and management of capricornis and related mountain antelopes London: Croom Helm, 51-61. Löwer R, Löwer J, Kurth R (1996). The viruses in all of us: characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences. Proc Natl Acad Sci USA 93: 5177-5184. Löwer R (1999). The pathogenic potential of endogenous retroviruses: facts and fantaisies. Trends Microbiol 7: 350-356. Lu X, Sachs F, Ramsay LA, Jacques P-E, GökeJ et al. (2014a). The retrovirus HERVH is a long noncoding RNA required for human embryonic stem cell identity. Nat Struct Mol Biol 21: 423-425. Lu F, Tempera I, Lee HT, Dewispelaere K, Lieberman PM (2014b). EBNA1 binding and epigenetic regulation of gastrokine tumor suppressor genes in gastric carcinoma cells. Virol J 11: 12. Lucchesi JC, Kelly WG, Panning B (2005). Chromatin remodeling in dosage compensation. Ann Rev Genet 39: 615-651. Luikart G, Gielly L, Excoffier L, Vigne JD, Bouvet J et al. (2001). Multiple maternal origins and weak phylogeographic structure in domestic goats. Proc Natl Acad Sci USA 98: 5927-5932. Luo D, Lu ML, Zhao GF, Huang H, Zheng MY et al. (2012a). Reduced Popdc3 expression correlates with high risk and poor survival in patients with gastric cancer. World J Gastroenterol 18: 2423-2429. Luo D, Huang H, Lu ML, Zhao GF, Chang J (2012b). Abnormal expression of adhesion protein Bves is associated with gastric cancer progression and poor survival. Pathol Oncol Res 18: 491-497. Maddox JF, Davies KP, Crawford AM, Hulme DJ, Vaiman D et al (2001). An enhanced linkage map of the sheep genome comprising more than 1000 locus. Genome Res 11: 1275-89. Maeda N, Palmarini M, Murgia C, Fan H (2001). Direct transformation of rodent fibroblasts by Jaagsiekte sheep retrovirus DNA. Proc Natl Acad Sci USA 98: 4449-4454. Makalowski M (2000). Genomic scrap yard: how genomes utilize all that junk. Gene 259: 61-67.

203

Maksakova IA, Romanish MT, Gagnier L, Dunn CA, van de Lagemaat LN et al. (2006). Retroviral elements and their hosts: insertional mutagenesis in the mouse germ line. PLoS Genet 2: e2. Maksakova IA, Mager DL, Reiss D (2008). Keeping active endogenous retroviral-like elements in check: the epigenetic perspective. Cell Mol Life Sci 65: 3329-3347. Mallet F, Bouton O, Prudhomme S, Cheynet V, Oriol G et al. (2004). The endogenous retroviral locus ERVWE1 is a bona fide gene involved in hominoid placental physiology. Proc Natl Acad Sci USA 101: 1731-1736. Mannen H, Nagata Y, Tsuji S (2001). Mitochondrial DNA reveal that domestic goat (Capra hircus) are genetically affected by two subspecies of bezoar (Capra aegagurus). Biochemical Genetics 39: 145-154. Mamedov I, Batraka A, Buzdin A, Arzumanyan E, Lebedev Y et al. (2002). Genome-wide comparison of differences in the integration sites of interspersed repeats between closely related genomes. Nucl Acids Res 30: e71. Mangeney M, Renard M, Schlecht-Louf G, Bouallaga I, Heidmann O et al. (2007). Placental syncytins: Genetic disjunction between the fusogenic and immunosuppressive activity of retroviral envelope proteins. Proc Natl Acad Sci USA 104: 20534-20539. Marco I, López-Olvera JR, Rosell R, Vidal E, Hurtado A et al. (2007). Severe outbreak of disease in the Southern chamois (Rupicapra pyrenaica) associated with border disease virus infection. Vet Microbiol 120: 33-41. Marco I, Rosell R, Cabezón O, Mentaberre G, Casas E et al. (2008). Epidemiological study of border disease virus infection in Southern chamois (Rupicapra pyrenaica) after an outbreak of disease in the Pyrenees (NE Spain). Vet Microbiol 127: 9-38. Marco I, Rosell R, Cabezón O, Mentaberre G, Casas E et al. (2009). Border disease virus among chamois. Spain. Emerg Infect Dis 15: 448-451. Marijuán S, Mandaluniz N, Ruiz R, Oregui LM (2004). Utilisation of mountain pastures by dairy ewes: Eastern Basque Country situation. CIHEAM - Options Méditerranéennes. Marin MS, McKenzie J, Gao GF, Reid HW, Antoniadis A et al. (1995). The virus causing encephalomyelitis in sheep in Spain: a new member of the tick-borne encephalitis group. Res Vet Sci 58: 11-13. MARM - Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (www.marm.es/es/). Martínez-Royo A, Jurado JJ, Smulders JP, Martí JI, Alabart JL et al. (2008). A deletion in the bone morphogenetic protein 15 gene causes sterility and increased prolificacy in Rasa Aragonesa sheep. Anim Genet 39: 294-297. Martin J, Herniou E, Cook J, O'Neill R, Tristem M (1999). Interclass transmission and phyletic host tracking in murine leukemia virus-related retroviruses. J Virol 73: 2442-2449.

204

Martin J, Kabat P, Herniou E, Tristem M (2002). Characterization and complete nucleotide sequence of an unusual reptilian retrovirus recovered from the order Crocodilia. J Virol 76: 4651-4654. Masala B, Manca L, Cocco E, Ledda S, Naitana S (1991).Kinetics of the ontogenic and reversible hemoglobin switching in the mouflon (Ovis musimon) and sheep x mouflon hybrid. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol 100: 675-680. Matsumine H, Herbst MA, Ou SH, Wilson JD, McPhaul MJ (1991). Aromatase mRNA in the extragonadal tissues of chickens with the henny-feathering trait is derived from a distinctive promoter structure that contains a segment of a retroviral long terminal repeat. Functional organization of the Sebright, Leghorn, and Campine aromatase genes. J Biol Chem 266: 19900-19907. Matthee CA, Burzlaff JD, Taylor JF, Davis SK (2001). Mining the mammalian genome for artiodactyl systematics. Syst Biol 50: 367-390. Matzke MA, Mette MF, Matzke AJJ (2000). Transgene silencing by the host genome defense: implications for the evolution of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates. Plant Mol Biol 43: 401-415. McClintock B (1950). The origin and behavior of mutable locus in maize. Proc Natl Acad Sci USA 36: 344-355. McClintock B (1951). Chromosome organization and genic expression. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 16: 13-47. McClure MA, Johnson MS, Feng DF, Doolittle RF (1988). Sequence comparisons of retroviral proteins: relative rates of change and general phylogeny. Proc Natl Acad Sci USA 85: 2469-2473. Meadows JR, Cemal I, Karaca O, Gootwine E, Kijas JW (2007). Five ovine mitochondrial lineages identified from sheep breeds of the near East. Genetics 175: 1371-1379. Meana A, Luzón-Peña M, Santiago-Moreno J, De Bulnes A, Gómez-Bautista M (1996). Natural infection by gastrointestinal and bronchopulmonary nematodes in mouflons (Ovis musimon) and their response to netobimin treatment. J Wildl Dis 32: 39-43. Medstrand P, Mager DL (1998). Human-specific integrations of the HERV-K endogenous retrovirus family. J Virol 72: 9782-9787. Medstrand P, Landry JR, Mager DL (2001). Long terminal repeats are used as alternative promoters for the endothelin B receptor and apolipoprotein C-I genes in humans. J Biol Chem 276: 1896-1903. Medstrand P, van de Lagemaat LN, Mager DL (2002). Retroelement distributions in the human genome: variations associated with age and proximity to genes. Genome Res 12: 1483-1495.

205

Medstrand P, van de Lagemaat LN, Dunn CA, Landry JR, Svenback D et al. (2005). Impact of transposable elements on the evolution of mammalian gene regulation. Cytogenet Genome Res 110: 342-352. Meeusen EN, Snibson KJ, Hirst SJ, Bischof RJ (2009). Sheep as a model species for the study and treatment of human asthma and other respiratory diseases. Drug Discov Today Dis Models 6:101-106. Meng L, Hsu JK, Tsai RY (2011). GNL3L depletion destabilizes MDM2 and induces p53-dependent G2/M arrest. Oncogene 30: 1716-1726. Meyerson M, Gabriel S, Getz G (2010). Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet 11: 685-696. Mi S, Lee X, Li X, Veldman GM, Finnerty H et al. (2000). Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis. Nature 403: 785-789. Minghetti RR, Dugaiczyk A (1993). The emergence of new DNA repeats and divergence of primates. Proc NatI Acad Sci USA 90: 1872-1876. Minguijón E, González L, De las Heras M, Gómez N, García-Goti M et al. (2013). Pathological and aetiological studies in sheep exhibiting extrathoracic metastasis of ovine pulmonary adenocarcinoma (Jaagsiekte). J Comp Pathol 148: 139-147. Michell HG, Jay HL, Lawrence VR (1980). Likelihood calculations for matched case-control studies and survival studies with tied death times. Biometrika 68: 703-707. Mona S, Crestanello B, Bankhead-Dronnet S, Pecchioli E, Ingrosso S et al. (2008). Disentangling the effects of recombination, selection, and demography on the genetic variation at a major histocompatibility complex class II gene in the alpine chamois. Mol Ecol 17: 4053-4067. Monleon E, Garza MC, Sarasa R, Álvarez-Rodriguez J, Bolea R et al. (2011). An assessment of the efficiency of PrPsc detection in rectal mucosa and third-eyelid biopsies from animals infected with Scrapie. Vet Microbiol 147: 237-243. Montgelard C, Catzeflis FM, Douzery E (1997). Phylogenetic relationships of artiodactyls and cetaceans as deduced from the comparison of cytochrome b and 12S rRNA mitochondrial sequences. Mol Biol Evol 14: 550-559. Mount DW (2007). Using the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). CSH Protoc 2007: pdb.top17. Moyes DL, Martin A, Sawcer S, Temperton N, Worthington J et al. (2005). The distribution of the endogenous retroviruses HERV-K113 and HERV-K115 in health and disease. Genomics 86: 337-341. Moyes DL, Goris A, Ban M, Compston A, Griffiths DJ et al. (2008). HERV-K113 is not associated with multiple sclerosis in a large family-based study. AIDS Res Hum Retroviruses 24: 363-365.

206

Mozorov VA, Mozorov AV, Lagaye S (2007). Endogenous JSRV-like proviruses in domestic cattle: analysis of sequences and transcripts. Virology 367: 59-70. Munk C, Prassolov V, Rodenburg M, Kalinin V, Lohler J, et al. (2003). 10A1-MuLV but not the related amphotropic 4070A MuLV is highly neurovirulent: importance of sequences upstream of the structural Gag coding region. Virology 313: 44-55. Mura M, Murcia P, Caporale M, Spencer TE, Nagashima K et al. (2004). Late viral interference induced by transdominant Gag of an endogenous retrovirus. Proc Natl Acad Sci USA 101: 11117-11122. Murane JP, Morales JF (1995). Use of mammalian interspersed repetitive (MIR) element in the coding and processing sequences of mammalian genes. Nucleic Acids Res 23: 2837-2839. Murcia PR, Arnaud F, Palmarini M (2007). The transdominant endogenous retrovirus enJS56A1 associates with and blocks intracellular trafficking of the JSRV Gag. J Virol 81: 1762-1772. Naderi S, Rezaei HR, Taberlet P, Zundel S, Rafat SA et al. (2007). Large-scale mitochondrial DNA analysis of the domestic goat reveals six haplogroups with high daiversity. PLoS ONE 2: e1012. Naderi S, Rezaei HR, Pompanon F, Blum MGB, Negrini R et al. (2008). The goat domestication process inferred from large-scale mitochondrial DNA analysis of wild and domestic individuals. Proc Natl Acad Sci USA 105: 17659-17664. Nadler CF, Woolf A, Harris KE (1971). The transferrins and hemoglobins of bighorn sheep (Ovis canadensis), dall sheep (Ovis dalli) and mouflon (Ovis musimon). Comp Biochem Physiol B 40: 567-570. Nadler C, Hoffmann RS, Woolf A (1974). G-band patterns, chromosomal homologies, and evolutionary relationships among wild sheep, goats, and aoudads (Mammalia, Artiodactyla). Experientia 30: 744-746. Nakagawa K, Harrison LC (1996). The potential roles of endogenous retroviruses in autoimmunity. Immunol Rev 152: 193-236. Nascetti G, Lovari S, Lanfranchi P, Berducou C, Mattiucci S, Rossi L, Bullini L (1985). Revision of Rupicapra genus. III. Electrophoretic studied demonstrating species distinction of chamois populations of the Alps from those of the Apennines and Pyrenees. Biology and Management of Mountain Ungulates London: Croom Helm, 56-62. Nekrutenko A, Li WH (2001). Transposable elements are found in a large number of human protein-coding genes. Trends Genet 17: 619-621. Nellaker C, Keane TM, Yalcin B, Wong K, Agam A et al. (2012). The genomic landscape shaped by selection on transposable elements across 18 mouse strains. Genome Biol 13: R45. NGPA, National Pygmy Goat Association. www. npga-pygmy.com

207

Nguyen T, Bunch T (1980). Blood groups and evolutionary relationships among domestic Sheep (Ovis aries), domestic Goat (Capra hircus), Aoudad (Ammotragus lervia) and european Mouflon (Ovis musimon). Ann Genet Sel Ani 12: 169-180. Nielsen DM, Weir BS (1999). A classical setting for associations between markers and locus affecting quantitative traits. Genet Res 74: 271-277. Niethammer G(1963). Die Einburgerung von Saugetieren und Vogeln in Europa. Hamburg- Berlin. Publisher Paul Parey. Nigumann P, Redik K, Mätlik K, Speek M (2002). Many human genes are transcribed from the antisense promoter of L1 retrotransposon. Genomics 79: 628-634. Nobel TA (1958). Pulmonary adenomatosies (Jaagsiekte) in sheep with special reference to its occurrence in Israel. Refu Vet (Israel) 15: 98-101. Nomura K, Yonezawa T, Mano S, Kawakami S, Shedlock AM et al. (2013). Domestication process of the goat revealed by an analysis of the nearly complete mitochondrial protein-encoding genes. PLoS ONE 8: e67775. Nuffield Council on Bioethics. www.nuffieldbioethics.org Nunziante M, Gilch S, Schätzl HM (2003). Prion diseases: from molecular biology to intervention strategies. Chembiochem 4: 1268-1284. Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (1988). Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics 120: 621-623. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E (1999). DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99: 247-257. Oliver KR, Greene WK (2011). Mobile DNA and the TE-thrust hypothesis: supporting evidence from the primates. Mob DNA 2: 8. Ono M, KawakamiM, Ushikubo H (1987). Stimulation of expression of the human endogenous retrovirus genome by female steroid hormones in human breast cancer cell line T47D. J Virol 61: 2059-2062. Ortin A, Minguijón E, Dewar P, García M, Ferrer LM (1998). Lack of a specific immune response against a recombinant capsid protein of Jaagsiekte sheep retrovirus in sheep and goats naturally affected by enzootic nasal tumour or sheep pulmonary adenomatosis. Vet Immunol Immunopathol 61: 229-237. Ortin A, Cousens C, Minguijon E, Pascual Z, Villarreal MP et al. (2003). Characterization of enzootic nasal tumour virus of goats: complete sequence and tissue distribution. J Gen Virol 84: 2245-2252. Ortiz-Pelaez A, Georgiadou S, Simmons MM, Windl O, Dawson M et al. (2014). Allelic variants at codon 146 in the PRNP gene show significant differences in the risk for natural Scrapie in Cypriot goats. Epidemiol Infect 20: 1-7.

208

Palmarini M, Dewar P, De las Heras M, Inglis NF, Dalziel RG et al. (1995). Epithelial tumour cells in the Birikas of sheep with pulmonary adenomatosis are major sites of replication for Jaagsiekte retrovirus. J Gen Virol 76: 2731-2737. Palmarini M, Holland MJ, Cousens C, Dalziel RG, Sharp JM (1996). Jaagsiekte retrovirus establishes a disseminated infection of the lymphoid tissues of sheep affected by pulmonary adenomatosis. J Gen Virol 77: 2991-298. Palmarini M, Fan H, Sharp JM (1997). Sheep pulmonary adenomatosis: a unique model of retrovirus-associated Birika cancer. Trends Microbiol 5: 478-483. Palmarini M, Sharp JM, De las Heras M, Fan H (1999). Jaagsiekte sheep retrovirus is necessary and sufficient to induce a contagious Birika cancer in sheep. J Virol 73: 6964-6972. Palmarini M, Hallwirth C, York D, Murgia C, deOliveira T et al. (2000). Molecular cloning and functional analysis of three type D endogenous retroviruses of sheep reveal a different cell tropism from that of the highly related exogenous Jaagsiekte sheep retrovirus. J Virol 74: 8065-8076. Palmarini M, Maeda N, Murgia C, De-Fraja C, Hofacre A et al. (2001a). A phosphatidylinositol 3-kinase docking site in the cytoplasmic tail of the Jaagsiekte sheep retrovirus transmembrane protein is essential for envelope-induced transformation of NIH 3T3 cells. J Virol 75: 11002-11009. Palmarini M, Gray CA, Carpenter K, Fan H, Bazer FW et al. (2001b). Expression of endogenous betaretroviruses in the ovine uterus: effects of neonatal age, estrous cycle, pregnancy, and progesterone. J Virol 75: 11319-11327. Palmarini M, Fan H (2001). Retrovirus-induced ovine pulmonary adenocarcinoma, an animal model for Birika cancer. J Natl Cancer Inst 93: 1603-1614. Palmarini M, Murgia C, Fan H (2002). Spliced and prematurely polyadenylated Jaagsiekte sheep retrovirus-specific RNAs from infected or transfected cells. Virology 294: 180-188. Palmarini M, Fan H (2003). Molecular biology of Jaagsiekte sheep retrovirus. Curr Top Microbiol Immunol 275: 81-115. Palmarini M, Mura M,Spencer TE (2004). Endogenous betaretroviruses of sheep: teaching new lessons in retroviral interference and adaptation. J Gen Virol 85: 1-13. Pálsson PA (1985). Maedi/visna of sheep in Iceland, introduction of the disease in Iceland, clinical features, control measures and eradication. In Sharp JM, Hoff-Jørgensen R (eds.). Slow viruses in sheep, goats and cattle. The Comission of the European Communities Publication (Luxembourg), 3-19. Patience C, Switzer WM, Takeuchi Y, Griffiths DJ, Goward ME et al. (2001). Multiple groups of novel retroviral genomes in pigs and related species. J Virol 75: 2771-2775.

209

Payne LN, Pani PK (1971). Evidence for linkage between genetic locus controlling response of fowl to subgroup A and subgroup C sarcoma viruses. J Gen Virol 13:253-259. Pedrosa S, Uzun M, Arranz JJ, Gutiérrez-Gil B, San Primitivo F et al. (2005). Evidence of three maternal lineages in Near Eastern sheep supporting multiple domestication events. Proc Biol Sci 272: 2211-2217. Pedrosa S, Arranz JJ, Brito N, Molina A, San Primitivo F (2007). Mitochondrial diversity and the origin of Iberian sheep. Genet Sel Evol 39: 91-103. Pence DB, Ueckermann E (2002). Sarcoptic mange in wildlife. Rev Sci Tech Off Int Epiz 21: 385–398. Pérez T, Albornoz J, GarciaVazquez E, Dominguez A (1996). Application of DNA fingerprinting to population study of chamois (Rupicapra rupicapra). Biochemical Genetics 34: 313-320. Pérez T, Albornoz J, Domínguez A (2002). Phylogeography of chamois (Rupicapra spp.) inferred from microsatellites. Molecular Phylogenetics and Evolution 25: 524-534. Pérez M, Biescas E, de Andrés X, Leginagoikoa I, Salazar E et al. (2010). Maedi-Visna virus serology in sheep: survey, risk factors and implementation of a successful control programme in Aragón (Spain). Vet J 186: 221-225. Pioz M, Loison A, Gibert P, Dubray D, Menaut P et al. (2007). Transmission of a pestivirus infection in a population of Pyrenean chamois. Vet Microbiol 119: 19-30. Pisanu B, Bain O (1999). Aonchotheca musimon n. sp. (Nematoda : Capillariinae) from the mouflon Ovis musimon in the sub-antarctic Kerguelen archipelago, with comments on the relationships with A. bilobata (Bhalerao, 1933) Moravec, 1982 and other species of the genus. Syst Parasitol 43: 17-27. Pfaffl MW (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29: e45. Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L (2002). Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res 30: e36. Pfeifer A, Verma IM (2001). Gene therapy: promises and problems. Annu Rev Genomics Hum Genet 2: 177-211. Philbey AW, Cousens C, Bishop JV, Gill CA, DeMartini JC et al. (2006). Multiclonal pattern of Jaagsiekte sheep retrovirus integration sites in ovine pulmonary adenocarcinoma. Virus Res 117: 254-263. Polani S, Roca AL, Rosensteel BB, Kolokotronis S, Bar-Gar GK (2010). Evolutionary dynamics of endogenous feline leukemia virus proliferation among species of the domestic cat lineage. Virology 405: 397-407.

210

Polledo L, González J, Benavides J, Morales S, Martínez-Fernández B (2012). Patterns of lesion and local host cellular immune response in natural cases of ovine maedi-visna. J Comp Pathol 147: 1-10. Ponz R, Tejedor MT, Monteagudo LV, Arruga MV (2006). Scrapie resistance alleles are not associated with lower prolificity in Rasa Aragonesa sheep. Res Vet Sci 81: 37-39. Prahl M, Vilborg A, Palmberg C, Jörnvall H, Asker C et al. (2008). FEBS Lett 582: 2173-2177. Qi JW, Wu XL, Liu SY, Cao GF (2012). Expression of endogenous beta retroviruses and Hyal-2 mRNA in immune organs of fetuses and lambs. Virol Sin 27: 83-92. Qi J-W, Xu M-J, Liu S-Y, Zhang Y-F, Liu Y et al. (2013). Identification of Sheep Endogenous Beta-Retroviruses with Uterus-Specific Expression in the Pregnant Mongolian Ewe. Journal of Integrative Agriculture 12: 884–891. Rajya BS, Singh CM (1964). The pathology of pneumonia and associated respiratory disease of sheep and goats. I. Occurrence of jagziekte and maedi in sheep and goats in India. Am J Vet Res 25: 61-67. Rai SK, DeMartini JC, Miller AD (2000). Retrovirus vectors bearing Jaagsiekte sheep retrovirus Environ transduce human cells by using a new receptor localized to chromosome 3p21.3. J Virol 74: 4698-4704. Rai SK, Duh FM, Vigdorovich V, Danilkovitch-Miagkova A., Lerman MI et al. (2001). Candidate tumor suppressor HYAL2 is a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored cell-surface receptor for Jaagsiekte sheep retrovirus, the envelope protein of which mediates oncogenic transformation. Proc Natl Acad Sci USA 98: 4443-4448. Randi E, Fusco G, Lorenzini R, Toso S, Tosi G (1991). Allozyme divergence and phylogenetic relationships among Capra, Ovis and Rupicapra (Artyodactyla, Bovidae). Heredity 67: 281-286. Rebollo R, Horard B, Hubert B, Vieira C (2010). Jumping genes and epigenetics: towards new species. Gene 454: 1-7. Rebollo R, Karimi MM, Bilenky M, Gagnier L, Miceli-Royer K et al. (2011). Retrotransposon-induced heterochromatin spreading in themouse revealed by insertional polymorphisms. PLoSGenet 7: e1002301. Rebollo R, Farivar S, Mager DL (2012). C-GATE: catalogue of genes affected by transposable elements. Mob DNA 3: 9. Rendo F, Iriondo M, Jugo BM, Mazón LI, Aguirre A et al (2004). Tracking diversity and differentiation in six sheep breeds from the North Iberian Peninsula through DNA variation. Small Rum Res 52: 195-202. Resnick RM, Boyce-Jacino MT, Fu Q, Faras AJ (1990). Phylogenetic distribution of the novel avian endogenous provirus family EAV-0. J Virol 64: 4640-4653.

211

Rodríguez-Sánchez B, Sánchez-Cordón PJ, Molina V, Risalde MA, Pérez de Diego AC, Gómez-Villamandos JC, Sánchez-Vizcaíno JM (2010). Detection of bluetongue serotype 4 in mouflons (Ovis aries musimon) from Spain. Vet Microbiol 141: 164-167. Roger PA (2008). The impact of disease and disease prevention on sheep welfare. Small Ruminant Res 76: 104-111. Romanish MT, Lock WM, van de Lagemaat LN, Dunn CA, Mager DL (2007). Repeated recruitment of LTR retrotransposons as promoters by the anti-apoptotic locus NAIP during mammalian evolution. PLoS Genet 3: e10. Ropiquet A, Hassanin A (2005). Molecular evidence for the polyphyly of the genus Hemitragus (Mammalia, Bovidae). Mol Phylogenet Evol 36: 154-168. Rosati S, Pittau M, Alberti A, Pozzi S, York DF et al. (2000). An accessory open reading frame (orf-x) of Jaagsiekte sheep retrovirus is conserved between different virus isolates. Virus Res 66: 109-116. Ross JP, Rand KN, Molloy PL (2010). Hypomethylation of repeated DNA sequences in cancer. Epigenomics 2: 245-269. Rossi L, Meneguz PG, De Martin P, Rodolfi M (1995). The epizootiology of sarcoptic mange in chamois, Rupicapra rupicapra, from the eastern Alps. Parassitologia 37: 233–240. Rossi L, Fraquelli C, Vesco U, Permunian R, Sommavilla GM et al. (2007). Descriptive epidemiology of a scabies epidemic in chamois in the Dolomite Alps. Italy. Eur J Wildl Res 53: 131–141. Rowe HM, Trono D (2011). Dynamic control of endogenous retroviruses during development. Virology 411: 273–287. Ruprecht K, Mayer J, Sauter M, Roemer K, Mueller-Lantzsch N (2008). Endogenous retroviruses and cancer. Cell Mol Life Sci 65: 3366-3382. Ruiz R, Oregui LM, Elgarresta M, Marijuan S (2002). Environmental and economic aspects of the dairy sheep system in the Basque country. CIHEAM - Options Mediterraneennes. Ryder ML (1983). Sheep and Man. In Duckworth (London), 846. Sacco MA, Howes K, Venugopal K (2001). Intact EAV-HP endogenous retrovirus in Sonnerat's jungle fowl. J Virol 75: 2029-2032. Salaverria I, Akasaka T, Gesk S, Szczepanowski M, Burkhardt B et al. (2012). The CBFA2T3/ACSF3 locus is recurrently involved in IGH chromosomal translocation t(14;16)(q32;q24) in pediatric B-cell lymphoma with germinal center phenotype. Genes Chromosomes Cancer 51: 338-343. Salvatori D, González L, Dewar P, Cousens C, de las Heras M et al. (2004). Successful induction of ovine pulmonary adenocarcinoma in lambs of different ages and detection of viraemia during the preclinical period. J Gen Virol 85: 3319-3324.

212

Samuelson LC, Wiebauer K, Snow CM, Meisler MH. (1990). Retroviral and pseudogene insertion sites reveal the lineage of human salivary and pancreatic amylase genes from a single gene during primate evolution. Mol Cell Biol 10: 2513–2520.

Sanna MP, Sanna E, De Las Heras M, Leoni A, Nieddu AM, Pirino S, Sharp JM, Palmarini M (2001). Association of Jaagsiekte sheep retrovirus with pulmonary carcinoma in Sardinian moufflon (Ovis musimon). J Comp Pathol 125: 145-52.

Sánchez A, Sánchez MC (1986). Razas ovinas españolas. Ministerio de Agricultura, Madrid. Sánchez-Cordón PJ, Pleguezuelos FJ, Pérez de Diego AC, Gómez-Villamandos JC, Sánchez-Vizcaíno (2013). Comparative study of clinical courses, gross lesions, acute phase response and coagulation disorders in sheep inoculated with bluetongue virus serotype 1 and 8. Vet Microbiol 166: 184-194 Santiago-Moreno J, López-Sebastián A, González-Bulnes A, Gómez-Brunet A, Chemineau P (2000a). Seasonal changes in ovulatory activity, plasma prolactin, and melatonin concentrations, in mouflon (Ovis gmelini musimon) and Manchega (Ovis aries) ewes. Reprod Nutr Dev 40: 421-30. Santiago-Moreno J, González-Bulnes A, Gómez Brunet A, del Campo A, Picazo R, López Sebastián AL (2000b). Nocturnal variation of prolactin secretion in the Mouflon (Ovis gmelini musimon) and domestic sheep (Ovis aries): seasonal changes. Anim Reprod Sci 64: 211-219. Santiago-Moreno J, Lopez-Sebastian A, Gonzalez-Bulnes A, Gomez-Brunet A, Tortonese D (2001a). The timing of the onset of puberty, extension of the breeding season, and length of postpartum anestrus in the female mouflon (Ovis gmelini musimon). J Zoo Wildl Med 32: 230-235. Santiago-Moreno J, González-Bulnes A, Gómez-Brunet A, Cocero MJ, del Campo A, García-García R, López-Sebastián A (2001b). Procedure for successful interspecific embryo transfer from mouflon (Ovis gmelini musimon) to Spanish Merino sheep (Ovis aries). J Zoo Wildl Med 32: 336-41. Santiago-Moreno J, López-Sebastián A, del Campo A, González-Bulnes A, Picazo R, Gómez-Brunet A (2004). Effect of constant-release melatonin implants and prolonged exposure to a long day photoperiod on prolactin secretion and hair growth in mouflon (Ovis gmelini musimon). Domest Anim Endocrinol 26: 303-314. Santiago-Moreno J, Gómez-Brunet A, Toledano-Díaz A, González-Bulnes A, Picazo RA, López-Sebastián A (2005a). Influence of age on the relationship between annual changes in horn growth rate and prolactin secretion in the European mouflon (Ovis gmelini musimon). Anim Reprod Sci 85: 251-261. Santiago-Moreno J, González-Bulnes A, Gómez-Brunet A, Toledano-Diaz A, López-Sebastián A (2005b). Prediction of gestational age by transrectal ultrasonographic measurements in the mouflon (Ovis gmelini musimon). J Zoo Wildl Med 36: 457-462. Sarazá-Ortíz R (1956). Raza caprina Malagueña. CSIC. Imp. Moderna (Córdoba).

213

Schaschl H, Kaulfus D, Hammer S, Suchentrunk F (2003). Spatial patterns of mitochondrial and nuclear gene pools in chamois (Rupicapra r. rupicapra) from the Eastern Alps. Heredity 91: 125-135. Schaschl H, Goodman SJ, Suchentrunk F (2004) Sequence analysis of the MHC class II DRB alleles in Alpine chamois (Rupicapra r. rupicapra). Developmental and Comparative Immunology 28: 265-277. Schaschl H, Suchentrunk F, Hammer S, Goodman SJ (2005). Recombination and the origin of sequence diversity in the DRB MHC class II locus in chamois (Rupicapra spp.). Immunogenetics 57: 108-15. Schaschl H, Suchentrunk F, Morris DL, Ben Slimen H, Smith S et al. (2012). Sex-specific selection for MHC variability in Alpine chamois. BMC Evol Biol 12: 20. Schiff R, Itin A, Keshet E (1991). Transcriptional activation of mouse retrotransposons in vivo: specific expression in steroidogenic cells in response to trophic hormones. Genes Dev 5: 521-532. Schultz-Thater E, Piscuoglio S, Iezzi G, Le Magnen C, Zajac P et al. (2011). MAGE-A10 is a nuclear protein frequently expressed in high percentages of tumor cells in Birika, skin and urothelial malignancies. Int J Cancer 129: 1137-1148. Schwartz DE, Tizard R, Gilbert W (1983). Nucleotide sequence of Rous sarcoma virus. Cell 32: 853–869. Schweiger MR, Kerick M, Timmermann B, Isau M (2011). The power of NGS technologies to delineate the genome organization in cancer: from mutations to structural variations and epigenetic alterations. Cancer Metastasis Rev 30: 199-210. Seifarth W, Frank O, Zeilfelder U, Spiess B, Greenwood AD et al. (2005). Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J Virol 79: 341-352. Serrano C, Bolea R, Lyahyai J, Filali H, Varona L et al. (2011). Changes in HSP gene and protein expression in natural Scrapie with brain damage. Vet Res 42: 13. Sharp JM, Herring AJ (1983). Sheep pulmonary adenomatosis: demonstration of a protein which cross- reacts with the major core proteins of Mason-Pfizer monkey virus and mouse mammary tumour virus. J Gen Virol 64: 2323-2327. Sharp JM, Angus KW, Jassim FA, Scott FM (1986). Experimental transmission of sheep pulmonary adenomatosis to a goat. Vet Rec 119: 245. Shen S, Lin L, Cai JJ, Jiang P, Kenkel EJ et al. (2011). Widespread establishment and regulatory impact of Alu exons in human genes. Proc Natl Acad Sci USA 108: 2837-2842. Shinnick TM, Lerner RA, Sutcliffe JG (1981). Nucleotide sequence of Moloney murine leukaemia virus. Nature 293: 543-548.

214

Shukla R, Upton KR, Muñoz-Lopez M, Gerhardt DJ, Fisher ME et al. (2013). Endogenous retrotransposition activates oncogenic pathways in hepatocellular carcinoma. Cell 153: 101-111. Sichangi MW, Langat DK, Mwenda JM (2002). Endogenous retrovirus sequences expressed in male mammalian reproductive tissues: a review. Siebert PD, Chenchik A, Kellogg DE, Lukyanov KA, Lukyanov SA (1995). An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res 23: 1087-1088. Silverman EK, Palmer LJ (2000). Case-control association studies for the genetics of complex respiratory diseases. Am J Respir Cell Mol Biol 22: 645-648. Simpson GG (1945). The principles of classification and a classification of mammals. Bulletin American Museum Natural History 85: 1-350.

Singh S, Kumar SJ, Kolte AP, Kumar S (2013). Extensive variation and sub-structuring in lineage A mtDNA in Indian sheep: genetic evidence for domestication of sheep in India. PLoS One 8: e77858. Skálová L, Krízová V, Cvilink V, Szotáková B, Storkánová L, Velík J, Lamka J. Mouflon (Ovis musimon) dicrocoeliosis: effects of parasitosis on the activities of biotransformation enzymes and albendazole metabolism in liver. Vet Parasitol 146: 254-262. Skibola CF, Bracci PM, Halperin E, Nieters A, Hubbard A et al. (2008). Polymorphisms in the estrogen receptor 1 and vitamin C and matrix metalloproteinase gene families are associated with susceptibility to lymphoma. PLoS One 3: e2816. Smit AFA, Hubley R, Green P (2004) repeatmasker Open-3.0. Available from URL: http://www.repeatmasker.org Smith JM, Haigh J (1974). The hitch-hiking effect of a favourable gene. Genet Res 23: 23-35. Spencer TE, Stagg AG, Joyce MM, Jenster G, Wood CG (1999). Discovery and characterization of endometrial epithelial messenger ribonucleic acids using the ovine uterine gland knockout model. Endocrinology 140: 4070-4080. Spencer TE, Mura M, Gray CA, Griebel PJ, Palmarini M (2003). Receptor usage and fetal expression of ovine endogenous betaretroviruses: implications for coevolution of endogenous and exogenous retroviruses. J Virol 77: 749-753. Spencer TE, Palmarini M (2012). Endogenous retroviruses of sheep: a model system for understanding physiological adaptation to an evolving ruminant genome. J Reprod Dev 58: 33-37. St Laurent G, Shtokalo D, Dong B, Tackett MR, Fan X et al. (2013). VlincRNAs controlled by retroviral elements are a hallmark of pluripotency and cancer. Genome Biol 14: R73. Stamatakis A (2006). RAxML-VI-HPC: Maximum likelihood-based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics 22: 2688-2690.

215

Stamp JT, Nisbet DI (1963). Pneumonia of sheep. J Comp Pathol 73: 319-328. Stauffer Y, Theiler G, Sperisen P, Lebedev Y, Jongeneel CV (2004). Digital expression profiles of human endogenous retroviral families in normal and cancerous tissues. Cancer Immun 4: 2. Stengel A, Bach C, Vorberg I, Frank O, Gilch S et al. (2006). Prion infection influences murine endogenous retrovirus expression in neuronal cells. Biochem Biophys Res Commun 343: 825-831. Stocking C, Kozak CA (2008). Murine endogenous retroviruses. Cell Mol Life Sci 65: 3383-98. Stoye JP (2001). Endogenous retroviruses: still active after all these years? Curr Biol 11: 914-916. Subramanian RP, Wildschutte JH, Russo C, Coffin JM (2011). Identification, characterization, and comparative genomic distribution of the HERV-K (HML-2) group of human endogenous retroviruses. Retrovirology 8: 90. Sugimoto J, Schust DJ (2009). Review: human endogenous retroviruses and the placenta. Reprod Sci 16: 1023-1033. Sugimura H, Tao H, Suzuki M, Mori H, Tsuboi M et al. (2011). Genetic susceptibility to Birika cancer. Front Biosci (Schol Ed): 1463-1477. Sultana S, Mannen H, Tsuji S (2003). Mitochondrial DNA diversity of Pakistani goats. Anim Genet 34: 417-421. Suzuki H, Hosokawa Y, Toda H, Nishikimi M, Ozawa T (1990). Common protein-binding sites in the 5'-flanking regions of human genes for cytochrome c1 and ubiquinone-binding protein. J Biol Chem 265: 8159-8163. Szpakowski S, Sun X, Lage JM, Dyer A, Rubinstein J et al. (2009). Loss of epigenetic silencing in tumors preferentially affects primate-specific retroelements. Gene 448: 151-167. Szurek PF, Yuen PH, Jerzy R, Wong PK (1988): Identification of point mutations in the envelope gene of Moloney murine leukemia virus TB temperaturesensitive paralytogenic mutant ts1: molecular determinants for neurovirulence. J Virol 62: 357-360. Tabouret G, Lacroux C, Lugan S, Costes P, Corbière F et al. (2010). Relevance of oral experimental challenge with classical Scrapie in sheep. J Gen Virol 91: 2139-2144. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24: 1596-1599. Tapio M, Marzanov N, Ozerov M, Cinkulov M, Gonzarenko G et al. (2006). Sheep mitochondrial DNA variation in European, Caucasian, and Central Asian areas. Mol Biol Evol 23: 1776-1783.

216

Tarlinton RE, Meers J, Young PR (2006). Retroviral invasion of the koala genome. Nature 442: 79-81. Tarlinton RE, Barfoot HK, Allen CE, Brown K, Gifford RJ (2013). Characterisation of a group of endogenous gammaretroviruses in the canine genome. Vet J 196: 28-33. Taruscio D, Mantovani A (2004). Factors regulating endogenous retroviral sequences in human and mouse. Cytogenet Genome Res 105: 351-362. Timp W, Feinberg AP (2013). Cancer as a dysregulated epigenome allowing cellular growth advantage at the expense of the host. Nat Rev Cancer 13: 497-510. Ting CN, Rosenberg MP, Snow CM, Samuelson LC, Meisle MH. (1992). Endogenous retroviral sequences are required for tissue-specific expression of a human salivary amylase gene. Genes Dev 6: 1457-1465. Toledano A, Alvarez MI, Monleón E, Toledano-Díaz A, Badiola JJ et al. (2012). Changes induced by natural Scrapie in the calretinin-immunopositive cells and fibres of the sheep cerebellar cortex. Cerebellum 11: 593-604. Toledano-Díaz A, Santiago-Moreno J, Gómez-Brunet A, Pulido-Pastor A, López-Sebastián A (2007). Horn growth related to testosterone secretion in two wild Mediterranean ruminant species: the Spanish ibex (Capra pyrenaica hispanica) and European mouflon (Ovis orientalis musimon). Anim Reprod Sci 102: 300-307. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, Mortazavi A, Kwan G et al. (2010). Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol 28: 511-515. Tsuei DJ, Chen PJ, Lai MY, Chen DS, Yang CS et al. (1994). Inverse polymerase chain reaction for cloning cellular sequences adjacent to integrated hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinomas. J Virol Methods 49: 269-284. Tukey JW (1940). Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics 5: 99-114. Tuñón MJ, Gonzalez P, Vallejo M (1989). Genetic relationships between 14 native Spanish breeds of goat. Animal Genetics 20: 205-12. Tustin RC (1969). Ovine Jaagsiekte. J Afr Vet Med Assoc 1: 3-23. Tustin RC, Williamson AL, York DF, Verwoerd DW (1988). Experimental transmission of Jaagsiekte (ovine pulmonary adenomatosis) to goats. Onderstepoort J Vet Res 55: 27-32. Turner G, Barbulescu M, Su M, Jensen-Seaman MI, Kidd KK et al. (2001). Insertional polymorphisms of full-length endogenous retroviruses in humans. Curr Biol 11: 1531-1535. Turturro S, Shen X, Shyam R, Yue BY, Ying H (2014). Effects of mutations and deletions in the human optineurin gene. Springerplus 3: 99.

217

Ugarte E, Urarte E, Arrese F, Arranz J, Beltrán de Heredia I et al (1995).Technical organization and economic needs of the breeding programme of Latxa and Carranzana dairy sheep in the Spanish Basque Country. CIHEAM - Options Mediterraneennes. Ugarte E, Legarra A (2003). Scientific background of the selection program in the Latxa breed. CIHEAM - Options Méditerraneennes. Urarte E, Arranz J, Ugarte E, Arrese F, Oregi L et al (1999). Organization of development structures in dairy Latxa (breed) sheep in the Autonomous Community of the Spanish Basque Country. CIHEAM - Options Mediterraneennes. Vacca GM, Ouled Ahmed Ben Ali H, Carcangiu V, Pazzola M, Dettori ML (2009). Genetic structure of the casein gene cluster in the Tunisian native goat breed. Small Rumin Res 87: 33-38. van de Lagemaat LN, Landry JR, Mager DL, Medstrand P (2003). Transposable elements in mammals promote regulatory variation and diversification of genes with specialized functions. Trends Genet 19: 530-536. van Regenmortel MH, Mayo MA, Fauquet CM, Maniloff J (2000). Virus nomenclature: consensus versus chaos. Arch Virol 145: 2227-2232. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N et al. (2002). Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 3: 34. Varela M, Chow YH, Sturkie C, Murcia P, Palmarini M (2006). Association of RON tyrosine kinase with the Jaagsiekte sheep retrovirus envelope glycoprotein. Virology 350: 347-357. Vargas F, Lujan L, Bolea R, Monleon E, Martin-Burriel I et al. (2006). Detection and clinical evolution of Scrapie in sheep by 3rd eyelid biopsy. J Vet Intern Med 20: 187-193. Viginier B, Dolmazon C, Lantier I, Lantier F, Archer F et al. (2012). Copy number variation and differential expression of a protective endogenous retrovirus in sheep. PLoS One 7: e41965. Vogt V (1997). Retroviral virions and genomes. In Coffin J, Hughes S, Varmos H (eds.). Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 343-435. Volmer K, Hecht W (2006). Disease monitoring in European mouflon (Ovis gmelini musimon) populations by clinical blood tests: aspects of epidemiology and treatment control of claw diseases. Berl Munch Tierarztl Wochenschr 119: 410-415. Vrba ES, Schaller GB (2000). Phylogeny of Bovidae based on behavior, glands, skulls, and postcrania. In Vrba ES, Schaller GB (eds.). Antelopes, deer, and relatives. Yale University Press (New Haven), 203–222. Wang Y, Liu S, Li J, Han M, Wang Z (2008). Cloning and sequence analysis of genome from inner Mongolia strain of the endogenous betaretroviruses (enJSRV). Virol Sinica 23: 15-24.

218

Wang X, Zha M, Zhao X, Jiang P, Du W et al. (2013). Siva1 inhibits p53 function by acting as an ARF E3 ubiquitin ligase. Nat Commun 4: 1551. Webster AJF (1994). Comfort and injury. In Wathes CM, Charles DR (eds.). Livestock Housing. CAB International (Wallingford), 49-68. Weingartl HM, Miller M, Nfon C, Wilson WC (2014). Development of a Rift Valley fever virus viremia challenge model in sheep and goats. Vaccine S0264-410X: 273-274. Weller KE (2001). The status of Mouflon in Europe. In Nálik A, Uloth W (eds.). Proceedings of the third International Symposium on Mouflon, Sopron (Hungary), 114-140. Wessler SR (1996). Turned on by stress. Plant retrotransposons. Curr Biol 6: 959-961. Wildschutte JH, Ram D, Subramanian R, Stevens VL, Coffin JM (2014). The distribution of insertionally polymorphic endogenous retroviruses in breast cancer patients and cancer-free controls. Retrovirology 11: 62. Wilkinson D, Mager D, Leong J (1994). Endogenous human retroviruses. In Levy J (eds.). The Retroviridae, vol. 3. Plenum Press (NY), 465–535. Wilson JB, Miller A, Huisman TH (1970). Production of hemoglobin C in the Moufflon (Ovis musimon Pallas, 1811) and the Barbary sheep (Ammotragus lervia Pallas, 1777) during experimental anemia: amino acid composition of tryptic peptides from the beta B and bet C chains. Biochemi Genet 4: 677-688. Whitelaw E, Martin DI (2001). Retrotransposons as epigenetic mediators of phenotypic variation in mammals. Nat Genet 27: 361–365 Wood NJ, Phua SH (1996). Variation in the control region sequence of the sheep mitochondrial genome. Anim Genet 27: 25-33. Wootton SK, Halbert CL, Miller AD (2005). Sheep retrovirus structural protein induces Birika tumours. Nature 434: 904-907. Wootton SK, Metzger MJ, Hudkins KL, Alpers CE, York D et al. (2006). Birika cancer induced in mice by the envelope protein of Jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) closely resembles Birika cancer in sheep infected with JSRV. Retrovirology 3: 94. Wu X, Li Y, Crise B, Burgess SM, Munroe DJ (2005). Weak palindromic consensus sequences are a common feature found at the integration target sites of many retroviruses. J Virol 79: 5211-5214. Wu C, Kraft P, Stolzenberg-Solomon R, Steplowski E, Brotzman M et al. (2014). Genome-wide association study of survival in patients with pancreatic adenocarcinoma. Gut 63: 152-160. Xiao JW, Chen JH, Ren MY, Tian XB, Wang CS (2012). Relationship between expression of gastrokine 1 and clinicopathological characteristics in gastric cancer patients. Asian Pac J Cancer Prev 13: 5897-5901.

219

Ye Y, Madison B, Wu X, Rustgi AK (2012). A LIN28B polymorphism predicts for colon cancer survival. Cancer Biol Ther 13: 1390-1395. Yeates JA (2010). Death is a Welfare Issue. J Agric Environ Ethics 23: 229-241. Yeruham I, Yadin H, Van Ham M, Bumbarov V, Soham A et al. (2007). Economic and epidemiological aspects of an outbreak of sheeppox in a dairy sheep flock. Vet Rec 160: 236-237. Yoder JA, Walsh CP, Bestor TH (1997). Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends Genet 13: 335-340. Yoder JA, Bestor TH (1998). Acandidate mammalian DNA methyltransferase related to pmt1p of fission yeast. Hum Mol Genet 7: 279-284. York DF, Vigne R, Verwoerd DW, Querat G (1992). Nucleotide sequence of the Jaagsiekte retrovirus, an exogenous and endogenous type D and B retrovirus of sheep and goats. J Virol 66: 4930-4939. Zavala G, Pretto C, Chow YH, Jones L, Alberti A et al. (2003). Relevance of Akt phosphorylation in cell transformation induced by Jaagsiekte sheep retrovirus. Virology 312: 95-105. Zeder M, Hesse B (2000). The initial domestication of goats (Capra hircus) in the Zagros Mountains 10,000 years ago. Sciences 287: 2254-2257. Zeder MA, Emshwiller E, Smith BD, Bradley DG (2006). Documenting domestication: the intersection of genetics and archaeology. Trends Genet 22: 139-155. Zhang Y, Romanish MT, Mager DL (2011). Distributions of transposable elements reveal hazardous zones in mammalian introns. PLoS Comput Biol 7: e1002046. Zhang L, Huang NJ, Chen C, Tang W, Kornbluth S (2012). Ubiquitylation of p53 by the APC/C inhibitor Trim39. Proc Natl Acad Sci USA 109: 20931-20936. Zhang Y, Babaian A, Gagnier L, Mager DL (2013). Visualized computational predictions of transcriptional effects by intronic endogenous retroviruses. PLoS One 8: e71971. Zhang Y, Jia Q, Xue P, Liu Y, Xiong T et al. (2014). The -786T > C polymorphism in the NOS3 gene is associated with increased cancer risk. Tumour Biol 35: 3535-3540. Zhu ZB, Jian B, Volanakis JE (1994). Ancestry of SINE-R.C2: a human specific retroposon. Hum Genet 93: 545-551. Zhuo X, Rho M, Feschotte C (2013). Genome-wide characterization of endogenous retroviruses in the bat Myotis lucifugus reveals recent and diverse infections. J Virol 87: 8493-501

220

221

222

223

224

225

226