HLA Et Transplantation Renale

M. Benhalima, Y. Meddour

CHUAbdelkader HASSANI

SIDI BEL ABBES

rejet de l’organe greffé = Obstacle majeur à la transplantation allogénique

Introduction (1)

Rejet: résultat de la réponse immune du receveur à des molécules de surface polymorphes portées par le greffon et différentes de celles du receveur

Ces molécules = Antigènes majeurs de transplantation ou d’histocompatibilité codées par les gènes du complexe majeur d’Histocompatibilité =CMH

Complexe HLA chez l’homme (Human Leucocyte Antigen)

J Dausset 1958 décrit le premier Ag sur les leucocytes =Ag Mac (Ag HLA A2 ) suite à la mise en évidence de leucoagglutinines dans le sérum de patients transfusés et de femmes multipares en 1952.

Majeur : -Rapidité du rejet - Forte réponse humorale et cellulaire (production d’Ac et de CTL ) en cas d’incompatibilité

HLA entre D et R

Histo : Reconnaissance des molécules du CMH détermine la compatibilité ou l’incompatibilité entre les tissus

HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

Introduction (2)


Autres alloantigènes :

• Antigènes ABO: Exprimés sur l’endothélium vasculaire forte réponse humorale

• Antigènes mineurs d’Histocompatibilité rejet aigu cellulaire

• Antigènes spécifiques des monocytes et des cellules endothéliales

cibles des Ac préformés ou induit par la greffe.

Région I Télomérique : Gènes classe I : classiques A,B,C Non classiques E,F,G

Région II Centromérique : Gènes DR, DQ, DP

Région III Intermédiaire : plusieurs Gènes dont C2 ,C4, TNF

Le Complexe HLA

chromosome 6


Seuls gènes A,B,C ,DR, DQ, DP impliqués dans:le rejet de greffe d’organes ou de tissusla présentation de peptides antigéniques aux lymphocytes T initiant la réponse immune.

Gènes HLA

Chaîne α


Gène A et B codant pour la chaînes α et ß

Cellules Molécules de Classe II

Distribution restreinte (CPA)

Molécules de Classe I

Distribution ubiquitaire

Ly T - ++++

Ly B +++ ++++

Ly T activés ++ +++

Plaquettes - +++++

Monocytes, MΦ ++++ ++++

Cellules dendritiques +++++ +++++

DP DQ DR

β1 α1 β1 α1 β1 β3 β4 β5 α

DP DQ DR 51

1 à 6 1 à 9 DR 53 DR 52 DR 1 à 18

Gènes HLA classe II

Locus DR -DRA non polymorphique : Chaînes α -DRB en nombre variable :

DRBI chez tous les individusDRB3, 4 ou 5 variable


Liaison étroite

Père Mère

A1 B8 DR3 a A29 B44 DR2 c

A3 B7 DR4 b A2 B51 DR5 d

A1 B8 DR3 a A1 B8 DR3 a A3 B7 DR4 b A3 B7 DR4 b

A29 B44 DR2 c A2 B51 DR5 d A29 B44 DR2 c A2 B51 DR5 d

E1 E2 E3 E4

E5La probabilité pour deux enfants d’une même fratrie de :

- partager deux haplotypes en commun est de 25% : HLA génoidentique E1 et E5 - partager 1 haplotype en commun est de 50 % : HLA haploidentique E2 et E3

- ne partager aucun haplotype est de 25% : HLA différent E4


Transmission des gènes HLA en bloc des parents aux enfants (sauf rares recombinaisons ≈ 0,8 à 1%)

Chaque enfant hérite des deux haplotypes parentaux dont l’expression est codominante.

Expression Codominante

B A2 B8 DR5 DQ3 DP2

A A3 B7 DR 4 DQ2 DP1

A3

A2

DR5DR4

DQ2

DP1

B8

DQ3

DP2

B7

chaque individu exprime 2 molécules A, 2B, 2C, 2 à 4 DR, 2DQ 2DP


En terme de transplantation ce polymorphisme se traduit par la difficulté à apparier deux individus HLA compatibles en dehors de la fratrie

Polymorphisme extrême

100 Antigènes

Plus de 1700 allèles

6 9 19 46 10 21

111 59 463 617 179 388


B38(16) B*38 01 B*38 15

B39(16) B*39 01 B*39 041

B16 splits sérologiques splits alléliques

A1 B5 B50(21) DR1 DQ1A2 B7 B51(5) DR2 DQ2A3 B8 B52(5) DR7 DQ7(3)A23(9) B16 B53 DR3 DQ3A9 B12 B54(22) DR4 DQ4A10 B13 B55(22) DR5 DQ5(1)A11 B14 B56(22) DR6 DQ6(1)A19 B15 B56(17) DR8 DQ8(3)A24(9) B17 B58(17) DR9 DQ9(3)A25(10) B18 B59 DR10A26(10) B21 B60(40) DR11(5)A28 B22 B61(40) DR12(5)A29 B27 B62(15) DR13(6)A30 B35 B63(15) DR14(6)A31 B37 B63(15) DR17(3)A32 B38(16) B64(14) DR18(3)A33 B39(16) B65(14) DR15(2)A34(10) B40 B67 DR16(2)A36 B41 B70A43 B42 B72(70) A66(10) B44(12) B73 A68(28) B45(12) B75(15)A69(28) B46 B76(15) A74 B47 B77(15) A80 B48 B78

B49(21) B81 B82B83

Polymorphisme HLA

A B DR DQ

HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour Spécifici

tés s

érologiques

α1 α2

α3 β2m

α1

α3 β2

β1

membrane cytoplasmique

E2

E3

E4

E2

E3

Gènes Molécule Classe II Gènes Molécule Classe I


Glycoprotéines membranaires : superfamille des immunoglobulines.

Molécules HLA

Gène A5exons

Gène B6 exons

Gène A, B, C8 exons

Polymorphisme chaine Béta ++ DRA monomorphe


Molécules HLAStructure tridimensionnelle

Domaine α 1 α 2 : cavité du peptidefond: feuillet bétaBord: hélice alpha

Domaine α1β1 : cavité du peptidefond: feuillet bétaBord: 2 hélices alpha

Fonction des molécules HLA


α1 β1

α2 β2

Cα

VβVα

Cβ

• Contribution à la réponse immunitaire par la sélection, le transport et la présentation de peptides immunogènes au TCR trio moléculaire (TCR-Peptide-CMH) impliqué dans la réponse immunitaire

Ly TCD 4

CPA

α1 α2

α3β2m

Cα

VβVα

Cβ

Toutes cellules

α1 β1

α2 β2

Cα

VβVα

Cβ

α1 α2

α3β2m

Cα

VβVα

Cβ

Peptide du soi

Tolérance

Peptide endogène

(viral, tumoral)

Peptide éxogène

RI : CTL RI T helperCtk + Ac

Ly TCD 8

Le TCR reconnait l’ensemble CMH-Peptide restriction par CMH

Molécules HLA dans la réponse allogénique


α1 α2

α3β2m

α1 β1

α2 β2

Cα

VβVα

Cβ Cα

VβVα

Cβ

Peptides allogénique +

CMH allogénique

Ly TCD 8 Receveur Ly TCD 4 Receveur

Cellule Dendritique Donneur

Peptides allogénique +

CMH allogénique

Allo-reconnaissance directe


IMPLICATIONS

Lors du rejet les Ag HLA II induisent la réaction immunologique de prolifération d’où l’importance des Ag HLA DR entre D/R.

Les Ag HLA I constituent la cible des anticorps anti HLA et des cellules cytotoxiques

Rôle dans l’immunosurveillance lors -Transformation malignes-Infections

Réactions allogénique de rejet en transplantation

La connaissance de l’histocompatibilité entre D/R est primordiale soulignant la place du bilan immunologique dans tout programme

de transplantation

Techniques de typage HLA

B A2 B8 DR5 DQ3 DP2

A A3 B7 DR 4 DQ2 DP1

A3

A2

DR5DR4

DQ2

DP1

B8

DQ3

DP2

Sérologique spécificitésMicrolymphocytotoxicité (LCT)


Biologie moléculaire : ADN allèles - PCR-SSO (PCR-sequence specific probes) - PCR-SSP (PCR-sequence specific primers) - PCR- SBT (Sequence Based Typing)

Typage HLA: Ag inconnu, Cross Match: Ac inconnus… Les plaquettes, peuvent être utilisées pour l’adsorption des anticorps anti-HLA de classe I.

Typage HLA de classe I

Recherche d’anticorps anti-HLA de classe I

Cross Match anti-classe I

Typage HLA de classe II

Recherche d’anticorps anti-HLA de classe II

Cross Match anti-classe II

Cellules mononucléaires: CMN Lymphocytes T Lymphocytes B

TYPAGE HLA PAR SEROLOGIE


La technique de référence : Microlymphocytotoxicité = LCT (Terasaki et Mac Clelland 1964). Détecte des Ac IgG et IgM. trouve son application :

LE TYPAGE HLA PAR SEROLOGIE

Complément de lapin

Batterie d’Anticorps anti-HLA (I, II) connus Cellules a typer

Principe:

Cellule vivante=

Réaction négative

+ colorant

Cellule morte=

Réaction positive


0–10% Cells

“6” Reaction

“4” Reaction“2” Reaction

“8” Reaction

11–20% Dead Cells 21–50% Dead Cells

51–80% Dead Cells 81–100% Dead Cells

“1” Reaction


Résultat : Score selon l’échelle standard ASHI

L’interprétation du phénotype HLA se fait grâce aux plans de batteries indiquant la localisation et la spécificité des sérums.

Le génotype est déterminé à travers l’étude de la famille. HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour


Inconvénients:

Non expression des antigènes HLA dans certaines proliférations malignes

• Antisérums utilisés reconnaissent des épitopes essentiellement conformationnels privés ou publics • Réactivités croisées sur de nombreuses molécules HLA(CREG) rendent nécessaire l’utilisation de plusieurs sérums monospécifiques

• Difficulté d’obtenir des sérums monospécifiques

• Rareté de certaines spécificités Un seul antigène détecté



Deux niveaux de résolution:

Typage HLA : niveau générique ou basse résolution (2 digits)Donne l’équivalent du résultat obtenu par sérologie.

Typage HLA de niveau allélique ou de haute résolution ( 4 digits) détermine les sous variants alléliques

HLA B* 27 05

Motif allélique (BM) Motif générique (Sérologie ou BM)

Gène étudié

Typage HLA par biologie moléculaire

Le typage de niveau générique des gènes HLA –A, B et DRB1 : Suffisant en transplantations d’organes

TYPAGE HLA PAR BIOLOGIE MOLECULAIRE

La connaissance des séquences spécifiques des allèles HLA permet le génotypage directement au niveau de l’ADN après son amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction)

La mise en évidence du polymorphisme peut se faire par deux techniques principales :

PCR-SSP (Sequence Specific Primer) : TYPAGE HLA générique et allélique classe I et II

PCR-SSO/SSO reverse (PCR Sequence specific Oligoprobe) : TYPAGE HLA générique classe I et II

PCR SSO/SSO REVERSE

Techniques basées sur l’analyse du profil d’hybridation de sondes oligogonucléotidiquesspécifiques complémentaires à certains motifs polymorphiques portés par un produit PCR contenant par le ou les exons polymorphique du géne :

-exon 2 + 3 typage HLA I -exon 2 typage HLA I Les sondes peuvent être libres dans un tampon d’hybridation et le produit PCR fixé: PCR-SSOLe produit PCR est libre dans le tampon d’hybridation et les sondes fixéés sur un support bandelettes de nitrocellulose/ Billes :PCR SSO reverse


Technique PCR - SSO reverse

ADN pure100ng/ml

Basée sur l’hybridation de sondes spécifiques fixées sur un support solide avec le produit d’amplification marqué : ( Dynal®, LIPA)

Avantages : systéme automatisable rapide


Streptavidine marquée à la Phosphatase Alcaline permet la détection

colorimétrique (LIPA)

Séquences amplifiées et marquées au cours de la PCR par incorporation de nucléotides biotinylés.

Séquences complémentaires fixées sur des Bandelettes (strip) de Nitrocellulose

Produit de PCR marqué

Lecture au scanner Numérisation des résultats

Interprétation

Une amplification réalisée à l’aide d’amorces spécifiques biotinylées

le produit d’amplification est dénaturé pendant 10 minutes à température ambiante

Le produit d’amplification dénaturé est mis en contact avec le mélange de billes contenant les sondes fixées. Après lavage , seul persistent les fragment hybridés sur leur sonde spécifique

Marquage des fragments fixés sur les billes par la SAPE puis analyse de la fluorescence émise par la phycoérythrine exitée au cytométre de flux


Nouvelle technologie de cytométrie de flux = PCR SSO Réverse en milieu liquide Sur chaque type de microsphére est fixé une sonde unique( jusqu’à 100 types de microsphères par puits)

Luminex:


Etapes:

La lecture en tubes ou en microplaques de 96 puits

La positivité des réactions graduée de 1 à 8 correspond à une fluorescence plus ou moins importante

Avantages :

Lecture automatisée et adaptée aux grandes séries comme au typage ponctuel

Un seul tube ou puits réactionnel par locus

On peut tester en même temps dans une seule plaque de 96 puits 32 typages A+ B + ou 24 typages A+B+DR+DQ

Technique PCR - SSP

• Technique non basée sur l’hybridation d’oligosondes

• Amorces spécifiques d’un Allèle ou d’un groupe d’Allèles à étudier

• Discrimination entre les différents allèles pendant la PCR

• Le typage est déterminé par la présence ou l’absence du produit de PCR visualisé sur gel d’agarose avec Ethidium bromide sous UV

ADN pure100ng/ml Préparation des mélanges:

ADN + amorces + dNTP + Taq polymérase+ Mg Cl2

Placer dans le thermocycleur et

couvrir pour éviter l’évaporation

Amplification≈ 1h40mn

Photo d’archivageEt Interprétation

Lecture sous lampe à UV


Méthode -simple rapide adaptée à l’urgence -ne détecte pas de nouveaux allèles - inadaptée aux typages en séries


Documents

HLA Et Transplantation Renale