Upload
nhung
View
72
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Hmotnostní spektrometrie (1). Josef Chudoba. OBSAH. Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrum – základní pojmy, molekulová hmotnost, izotopy prvků způsoby měření spekter Rozlišovací schopnost spektrometru - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Hmotnostní spektrometrie (1)
Josef Chudoba
20
40
60
80
100120
140160
180200
220240
260280
300320
340360
380400
m/z
0
100
%
12_Chudoba_HCVDGrigsby_1ACC 12 (0.677)
Magnet EI+
7.22e4
57
43
41
28
27
2932
55
54
71
69
67
67
9785
83
81
79
95
93
111
99
105
125
113 127 137 153 155 165183
197211
225
OBSAH
Hmotnostní spektrometrie
Hmotnostní spektrum – základní pojmy, molekulová hmotnost, izotopy prvků
způsoby měření spekter
Rozlišovací schopnost spektrometru
Ionizační techniky v hmotnostní spektrometrii
Typy hmotnostních spektrometrů
Součásti hmotnostního spektrometru – iontový zdroj
separátor iontů
vakuový systém
způsob dávkování vzorku
Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry – MS)
Analytická technika pro analýzu organických sloučenin
Kvalitativní analýza – identifikace sloučenin (především nízkomolekulární sloučeniny), pomoc při odvození resp. potvrzení struktury molekuly (výšemolekulární sloučeniny)
Kvantitativní analýza – sledování obsahu vybraných analytů v různých matricích
Ale i sledování obsahu kovů (ICP MS)
Speciální aplikace pak např. ISOTOPE RATIO MS
Podstatou MS je detekce nabitých částic (iontů), které vznikají z molekul vzorku při IONIZACI – jedná se o destruktivní metodu – vzorek je při analýze znehodnocen
VZORKY JAKÉHO SKUPENSTVÍ A S JAK VELKOU MOLEKULOU LZE POMOCÍ MS ANALYZOVAT ?
V hmotnostní spektrometrii se používají různé ionizační techniky, ale v praxi lze ionty vytvořit i z vysokovroucích, vysokomolekulárních sloučenin
Od vodíku (1 Da) po proteiny s molekulovou hmotností v řádech 10 000 Da, záleží na ionizační technice a hmotnostním spektrometru
CO LZE ROZLUŠTIT Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA
1) Hmotnost iontu (popř. molekulovou hmotnost sloučeniny)
2) Přítomnost prvků, které mají výrazné zastoupení izotopů (např. Cl, Br)
3) Při pokročilé fragmentaci molekuly informace o struktuře sloučeniny
4) Je-li hmotnost molekulového resp. pseudomolekulového iontu měřena s dostatečnou přesností tak i možné elementární složení sloučeniny
VZORKY JAKÉHO SKUPENSTVÍ A S JAK VELKOU MOLEKULOU LZE POMOCÍ MS ANALYZOVAT
Hmotnostní spektrum
1 ul, split 1:20
mass731 732 733 734 735 736 737 738 739
%
0
100
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C37H68NO13 Magnet EI+ 6.35e12734.4691
735.4691
736.4769
[ M + H ]+
Izotopické příspěvky
Molekulový resp. pseudomolekulový ion
Osa x: m/z – hmotnost iontu dělena jeho nábojem
Osa y: intenzita (četnost) fragmentů, které detekuje detektor – je vždy normalizována na nejvyšší změřenou intezitu ve spektru – nejvyšší pík má výšku 100 %
m/z
Intenzita
centrovaný (centroid) – především u GC/MS instrumentace - intenzity m/z iontů tvar „čáry“
kontinuální (continous) – u LC/MS instrumentace intenzity m/z iontů tvar chromatografického píku
1 ul, split 1:20
mass731 732 733 734 735 736 737 738 739
%
0
100
%
0
100
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C37H68NO13 Magnet EI+ 6.35e12734.4691
735.4691
736.4769
07_Blazek_PO5_1 (15.245) Is (1.00,1.00) C37H68NO13 Magnet EI+ 6.35e12734.4691
735.4725
736.4753
737.4780
O O
OO
O
OH OH
OHCH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
O
O
OH
CH3 CH3CH3
O
CH3
OH N CH3
CH3
Erythromycin
[ M + H ]+
Hmotnostní spektrum Režim záznamu dat
MOLEKULOVÁ HMOTNOST
Molekolová hmotnost - jednotka dalton (Da)
1 Da = 1 amu (atomic mass unit) = hmotnost 1/12 izotopu 12C
1 Da = 1,660 338 782 x 10-27 kg
Molekulová hmotnost – hmotnost molekuly /prvků/ (jednotka amu)
Molární hmotnost – hmotnost 1 molu molekul (jednotka g/mol)
číselně molární hmotnost a molekulová hmotnost shodné
monoisotopická - v praxi počítána z hmotností nejstabilnějších (nejvíce zastoupených izotopů prvků),
průměrná - zohledňuje hmotnosti všech izotopů prvků
nominální – zaokrouhlená (celočíselná) monoisotopická hmotnost
(m a in lib ) Be n ze n e , b ro m o -10 30 50 70 90 110 130 150 170
0
50
100
12 27 38
51
60
77
104 113 128 143
156Br
(m a in lib ) Be n ze n e10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
50
100
15 2639
51
63 74
78
Br
Monoisotopic Mass = 155.957455 Da
Average Mass = 157.0079 Da
Nom inal Mass = 156 Da
Molecular Form ula = C 6H 5Br
bromobenzene
Monoisotopic Mass = 78.04695 Da
Nom inal Mass = 78 Da
Average M ass = 78.1118 Da
Molecular Form ula = C 6H 6
benzene
V MS spektrech vždy MONOISOTOPICKÁ hmotnost
MOLEKULOVÁ HMOTNOST
Nutné doplňující informace k hmotnostnímu spektru
1) Jaká ionizační technika byla při měření použita
tvrdé ionizační techniky – vlivem přebytku dodané energie se vzniklý molekulový ion dále štěpí
měkké ionizační techniky – malá nebo skoro žádná fragmentace
2) S jakým rozlišením bylo spektrum měřeno
hmotnost s přesností celého čísla (jednotkové rozlišení) – v praxi nejvíce rozšířené u GC/MS přístrojů
hmota s přesností na desetinná místa
3) Jaký experiment
(MS vs MS/MS nebo IN SOURCE fragmentace MS)
Rozlišovací schopnost spektrometru (R) – jak se rozdělí ionty s blízkou hmotností
R = m/ m m … m/z iontu, m . . . rozdíl m/z dvojice sledovaných iontů
Různé definice rozlišení: „valley“ definice vycházející s překryvu píků
„FWHM“ (Full Width at Half Maximum) definice vycházející ze šířky píku
Převzato z materiálu Fischer Scientific
VYSOKÉ rozlišení (HIGH RESOLUTION)
Jsou-li MS spektra měřena s vysokým rozlišením je možné rozdělit sloučeniny se stejnou nominální, ale odlišnou monoisotopickou hmotou
[ M + H ]+
Je naměřená hmotnost iontu (m/z) správná?
Před měřením se provádí kalibrace hmotnostní stupnice pomocí kalibračních standardů – chyba naměřené m/z a skutečné m/z závisí na rozlišovací schopnosti resp. typu spektrometru a kvalitě kalibrace
Chyba při měření hmoty ( macc) macc = m MEASURED - m
TRUE
macc (ppm) = 106 x macc / m TRUE
Kalibrace externí nebo interní - přidavek referenční (lockovací) látky přímo při měření vzorku
Hmotnostní spektrum sloučeniny je vždy závislé na použité IONIZAČNÍ TECHNICE
IONIZACE – měkká (dodaná energie stačí většinou pouze na vytvoření iontu z neutrální molekuly)
Příklad: ionizační techniky rutinně používané při LC-MS analýzách
Elektrosprejová ionazace / ESI /. chemická ionizace za atmosferického tlaku / APCI /
IONIZACE – tvrdá (vysoká energie stačí na vytvoření iontu z neutrální molekuly a na další štěpení vzniklých iontů)
Elektronová ionizace (Electron Impact) s energií elektronů 70 eV / EI + 70 eV / - rutinně používaná při GC-MS analýzách, proměřeny statisíce látek – databáze spekter (NIST, WILLEY)
- kladný i záporný mód (tvorba kladně resp. záporně nabitých iontů)
V praxi pouze kladný mód (tvorba kladně nabitých iontů)
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption) – pro vysokomolekulární sloučeniny
Vliv použité ionizační techniky na MS spektrum
GC/MS analýza efedrinu
Prvek Izotop % rel. Izotop % rel. Izotop % rel.
Uhlík 12C 100 13C 1,11
Vodík 1H 100 2H 0,016
Dusík 14N 100 15N 0,38
Kyslík 16O 100 17O 0,04 18O 0,20
Síra 32S 100 33S 0,78 34S 4,40
Chlor 35Cl 100 37Cl 32,5
Brom 79Br 100 81Br 98,0
Relativní zastoupení izotopů prvků v přírodě
A+1 prvkyA+2 prvky
A prvky
F, I, P, H(vzhledem k nízké intenzitě A+1)
Informace z MS spektra – zastoupení izotopů prvků
1 ul, split 1:20
mass70 75 80 85 90
%
0
100
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br5.07e1278.9183
80.9163
Br
I (m/z 79) : I (m/z 81) cca 1:1
Cl
I (m/z 35) : I (m/z 37) cca 3:1
1 ul, split 1:20
mass25 30 35 40 45
%
0
100
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Cl7.58e1234.9689
36.9659
1 ul, split 1:20
mass66 68 70 72 74 76 78 80
%
0
100
07_Blazek_PO5_1 (12.550) Is (1.00,1.00) Cl25.74e1270
72
74
Cl2
1 ul, split 1:20
mass100 110 120
%
0
100
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Cl34.35e12105
107
109
111
Cl3
Br2
1 ul, split 1:20
mass150 160 170
%
0
100
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br25.00e12160
158162
1 ul, split 1:20
mass230 235 240 245 250
%
0
100
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br33.80e12239
237
241
243
Br3
(m a in lib ) Be n ze n e , c h lo ro -20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
0
50
100
25 32 38 4351
56 61 74
77
84 97
112
C l
(m a in lib ) Be n ze n e , b ro m o -10 30 50 70 90 110 130 150 170
0
50
100
12 27 38
51
60
77
104 113 128 143
156Br
(m a in lib ) Be n ze n e , io d o -20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
0
50
100
27 37
51
60
77
127 152 176
204I
m/z 77 45,3 %
m/z 112 100 %
m/z 113 6,9 %
m/z 114 32,9 %
m/z 77 100 %
m/z 156 61,8 %
m/z 157 4,1 %
m/z 158 59,8 %
m/z 77 100 %
m/z 204 74,5 %
m/z 205 4,4 %
(m a in lib ) Be n ze n e10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
50
100
15 2639
4049
51
5363 74
78A:m/z 78 100 %
A+1:m/z 79 6,5 %
(m a in lib ) Bip h e n yl20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
0
50
100
27 3951 63
76
89 102 115 128139
154
A:m/z 154 100 %
A+1:m/z 155 12,9 %
Přibližný počet atomů uhlíku ve sloučenině (Cn)
100*1,1*)(
)1(
A
A
I
ICn
Molekulový ion v hmotnostním spektru
Rozpoznání molekulového iontu v MS spektru není vždy jednoduché
EI+ 70 eV u některých látek chybí (vysoký stupeň fragmentace) nebo je jeho intenzita velmi nízká (možnost záměny s ionty pozadí MS spektra)
ESI – tvorba vícenásobně nabitých iontů, tvorba aduktů iontů s Na, K, tvorba dimerů
APCI – možné štěpení (vlivem vyšší teploty ve zdroji)
Existují však pravidla a postupy, které určení molekulového iontu usnadní
EI+ 70 eV: Počet kruhů a dvojných vazeb (RINGS + Double Bonds R+DB); zakázané ztráty iontů, pořadí eluce látek na GC koloně (obvykle vyšší molekulová hmotnost – vyšší bod varu – delší retenční čas)
ESI: Známé adukty, výpočet molekulové hmotnosti ze série vícenásobně nabitých iontů
Chemická pravidla: Dusíkové pravidlo
žádný nebo sudý počet atomů dusíku v molekule-> molekulová hmotnost látky je SUDÉ číslo
lichý počet atomů dusíku v molekule-> molekulová hmotnost látky je LICHÉ číslo
Dusík – m= 14 Da, třívazný prvek
EI+70 eV: 0 nebo sudý počet N: m/z molekulového iontu sudé číslo m/z fragmentů liché číslo
lichý počet N: m/z molekulového iontu liché číslo
m/z fragmentů sudé číslo
ESI+: 0 nebo sudý počet N: m/z [M+H]+ iontu liché číslo
lichý počet N: m/z [M+H]+ iontu sudé číslo
ESI-: 0 nebo sudý počet N: m/z [M-H]- iontu liché číslo
lichý počet N: m/z [M-H]- iontu sudé číslo
Počet kruhů a dvojných vazeb – Rings + Double Bonds (R + DB)Vyjadřuje stupeň nenasycenosti molekuly
R+DB = C – ½ H + ½ N +1
C = počet čtyřvazných atomů – C, SiH = počet jednovazných atomů - H, Cl, Br, F … (halogeny)N = trojvazných atomů N, P, As
Počet dvouvazných se neuvažuje (dvouvazebná S, O), ale třeba DMSO – síra je čtyřvazná
Příklad: fenol C6H5OH R+DB = 6 –1/2*6+1/2*0+1 = 4
1 kruh
3 dvojné vazby
Aromáty : R+DB = minimálně 4
Chemická pravidla:
Využití R+DB a dusíkového pravidla
EI+ 70 eV:
Celočíselná hodnota R+DB ion s lichým počtem elektronů může být molekulový ion
Neceločíselná hodnota R+DB ion se sudým počtem elektronů nemůže být molekulový ion
Využití při strukturní analýze
Elementární analýza z High Res MS spektra
Vždy nutné předpokládat jaké prvky a kolik kterého maximum – org. látky C, H, N, O, popř. S, přítomnost halogenů lze zjistit z izotopického zastoupení, hrubý odhad max. počtu uhlíků (Cn) Cn (max) = Mw/14 (přesněji z izotop. zastoupení)
ELEMENTÁRNÍ ANALÝZA Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA
O O
OO
O
OH OH
OHCH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
O
O
OH
CH3 CH3CH3
O
CH3
OH N CH3
CH3 Erythromycin C37H67NO13
Mw monoiso = 734,4691 Da
Přesnost měření hmoty: High-RES MS spektrometry 1 – 3 ppm
Příklad vstupní parametry:
Cmax = 52, Hmax = 106, Nmax = 15, Omax = 15
Přesnost měření - chyba hmoty (ppm)
10
5
2
1
38 výsledků
17 výsledků
9 výsledků
4 výsledky
Aplikace „chemických“ pravidel (max. počet kruhů a dvoj.vazeb, dusíkové pravidlo, izotopické zastoupení prvků) snižuje počet nalezených kombinací !! – řešeno softwarově
Výsledek: navržené kombinace CxHy(Nz,Oz,Sz …)
Jakou ionizační techniku vybrat pro jaké sloučeniny?
Elektronová ionizace (EI+ 70 eV) - v praxi hmotnost do cca 1000 Da, nutná teplotní stálost sloučeniny, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua, není vyrazně omezena přítomností nějakých funkčních skupin ale např. problematické skupiny NH2-CO- (teplotně labilní)
Chemická ionizace (CI) - v praxi hmotnost do cca 1000 Da, nutná teplotní stálost, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua s přídavkem ionizačního plynu (methan, isobutan) – většinou pouze na vybrané typy sloučenin
GC/MS
Elektrosprejová ionizace (ESI) – pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze), sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu (např. mají kyslík nebo dusík v molekule), vhodný pro iontové sloučeniny
Atmosferická chemická ionizace (APCI) - pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze) ale při vyšší teplotě než ESI, sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu
MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION (MALDI) – ionizace vzorku v přítomnosti pevné matrice vzorku laserem – vhodné pro vysokomolekulární, teplotně nestálé sloučeniny i nepolární (polymery, proteiny)
LC/MS
Existuje celá řada dalších ionizačních technik – cílem je vždy vytvořit nabitou částici, která je následně analyzována.
Jak velké molekuly lze analyzovat
Zdroj: Agilent Technologies
Jak velké molekuly lze analyzovat
Kvadrupol (Q)
Iontová past (IT)
V praxi většinou jednotkové rozlišení, maximální m/z cca 1000 – 2000, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter)
TOF (Time of Flight)
Měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~ 40000), maximální m/z až 500 kDa, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter)
ORBITRAPměří i s vysokým rozlišení (Rmax ~100000), maximální m/z ~4 kDa, pomalejší frekvence sběru dat (spekter)
Magnetický sektorměří i s vysokým rozlišení (Rmax ~40000), maximální m/z ~2000, pomalejší frekvence sběru dat (spekter),
GC/MS
GC/MS LC/MS
GC/MS LC/MS
LC/MS
Přístroje hybridní – umožňují provedení tzv. MS/MS měření (více iontových separátorů)
Tripple Quad (QQQ)
Q-TOF
Ion Trap – ORBITRAP
Trojitý quadrupol
Quadrupol – Time Of Flight
iontová past - Orbitrap nebo IT-TOF
GC/MS LC/MS
LC/MS
LC/MS
MALDI 100 - 1000 kDa
ESI až 100 kDa
APCI až 2 kDa
EI+ 70 eV / CI až 1 - 2 kDa
Jak velké molekuly lze analyzovat ?
TOF
ORBITRAP
ION TRAP QUADRUPOLE
Plynový chromatograf
Kapalinový chromatgraf
Direct Insertion (Infussion) Probe
MALDI destička
Iontový zdroj
Iontový separátor
Detektor
AnalyzátorInlet
vakuum
Ionizační techniky:
EI+, CI, APCI, ESI, MALDI
Schéma hmotnostního spektrometru
Režimy snímání dat: MS experiment
SIM (SIR)
TIC
m/z
čas
Intenzita
Full SCAN (Total Ion Current TIC) cyklicky se snímá celé MS spektrum požadovaného rozsahu m/z
Rekonstruovaný chromatogram (RIC) z TICu se vybere požadovaný ion a vykreslí se chromatografický záznam
Selected Ion Monitoring (SIM) cyklicky se snímají jen vybrané ionty citlivější než TIC režim
např. u kvadrupolu detegované absolutní množství analytu činí: TIC řádově ng (10–9g) SIM řádově pg (10–12g) až fg (10-15 g)
Režimy snímání dat: MS/MS experimenty
Kolizní celaIontový zdroj
Detektor
Pouze hybridní MS spektrometry a tripple Quad
Product Ion Scan: Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC detekce
Instrumentace: Tripple Quad, Q-ToF (MS2); Ion Trap (až MS10) s vyšším MSn klesá citlivost!
Precursor Ion Scan: Q1:TIC (m/z1 – m/z2) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce
Instrumentace: nelze na Ion Trap
Constant Neutral Loss Scan: Q1:TIC (m/z1 – m/z2) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC ((m/z1- N) – (m/z2-N)) detekce; N – rozdíl hmotností iontů – hmotnost
odpadající neutrální částice z iontu Instrumentace: nelze na Q-ToF a Ion Trap
Selective Reacrion Monitoring (SRM): Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce
Fragmentace probíhá srážkou iontů s molekulami kolizního plynu (Argon)
Které vlastnosti MS spektrometru jsou v praxi důležité …
Cena, provozní náklady, účel využití !!!
Napojení na separační techniku: GC/MS X LC/MS
Technické parametry:
Single (jeden iont. separátor) x hybridní (více separátorů)
Rozsah scanování m/z (nejnižší a nejvyšší m/z)
Rychlost scanování (počet scanů/s)
Citlivost, dynamický rozsah (pro kvantitativní analýzu)
Rozlišovací schopnost (vysokorozlišující X jednotkové rozlišení)
Kompatibilita s ionizačními technikami (dostupné iontové zdroje)
Vakuum (je-li třeba vyšší stupeň vakua – vyšší cena)
Požadavky na instalaci:
Chlazení pump vakuového systému (vodní nebo vzdušné)
Velikost systému - přenosné x stolní (BENCH-TOP) x velké (hmotnost > 500 kg)
Plyny – např. LC-MS průtok N2 až 500 l/min – nutný generátor N2 nebo zdroj kapalného N2
MS - iontový zdroj a ionizační technika
Electron Impact (EI + 70 eV) – elektronová ionizace
nejpoužívanější u GC/MS, nejvíce prozkoumaná ionizační technika
U většiny látek se hodnota energie pro tvorbu moleku-lového iontu pohybuje okolo 10 eV 70 eV přebytek energie dostatečný pro tvorbu moleku-lového iontu a také pro tvorbu fragmentů z molekulového iontu
Dnes jsou k dispozici obsáhlé databáze (knihovny) spekter
EI+ dnes běžně ve spojení s GC
Látka je ionizována proudem elektronů ve vakuu z plynné fáze
Ionizace probíhá ve vakuuSchéma EI+ ionizačního zdroje
MS - iontový zdroj a ionizační technika
ESI (Electrospray)
V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde v elektrickém poli k tvorbě spreje. V kapičkách kapaliny dojde k povrchové lokalizaci náboje a následné tvorbě iontu. Při této ionizaci vznikají často i vícenásobně nabité ionty a adukty např. (M+Na)+ - ionizace probíhá za atmosferického tlaku
MS - iontový zdroj a ionizační technika
APCI (Chemická ionizace za atmosferického tlaku)
V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde k tvorbě spreje a vypařování látky i mobilní fáze. Na jehlu je vloženo vysoké napětí, výbojem vzniká plazma a v ní ionty zmlžovacího plynu (N2) , mobilní fáze a analytu. Ionty plynu reagují s molekulami mobilní fáze a vzniklé ionty předají náboj analytu.
MS - iontový zdroj a ionizační technika
Zdroj pro APCI a ESI je prakticky konstrukčně shodný, liší se v přítomnosti jehly pro koronový výboj (APCI). Existují i kombinované zdroje ESI/APCI.
U sprayových ionozací vždy záleží na povaze analytu – nutno zvolit pozitivní nebo negativní mód
APCI – první komerční využití – 1986oproti ESI lze použít vyšší průtok mobilní fáze, vyšší teplota, vyšší stupeň fragmentace
ESI – první komerční využití – 19882002 – Nobelova cena za chemii: John Bennett FennKompatibilní pouze s LC s reverzním uspořádáním fází (polární mobilní fáze), tvorba vícenásobně nabitých iontů, ionizace z roztoku, lze analyzovat i soli
MS - iontový zdroj a ionizační technika
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption)
Roztok vzorku je smíchán s roztokem matrice (nízkomolekulární UV absorbující látka) na spotovací destičce. Ta je vložena do zdroje, kde dochází k tvorbě „pevné směsi“ matrice a vzorku. Účinkem energie dodané laserovým pulzem dochází k ionizaci aduktu matrice-vzorek a následně odtržení matrice. Ionty analytu jsou měřeny obvykle TOF analyzátorem.
Příklad matrice: 2,5-dihydroxybenzoová kyselina, laser 337 nm. Vzorek M roztok, matrice 100 mM roztok
Tvorba obvykle jednonásobně nabitých iontů (M+H)+, (M+K)+, (M+Na)+
Spotovací destičkaNELZE spojit s HPLC!!!
Zdroj:Agilent Technologies
Zdroj:Agilent Technologies
MS - separátory iontů
lineární kvadrupol konstrukčně se jedná o 4 kovové tyče hyperbolického nebo kruhového průřezu, které jsou připojeny ke zdrojům DC a AC napětí. Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, se dostanou do střídavého elektrického pole a začnou oscilovat.
Při vhodném poměru DC a AC složky napětí a dané hodnotě těchto napětí projdou kvadru-polem pouze ionty o určitém poměru m/z. Zařízení se chová jako filtr nastavený na určitou hodnotu m/z. Změnou vkládaných napětí je možné nechat projít filtrem postupně ionty v celém rozsahu hodnot m/z
Iontová past (ion trap) účinkem elektrického pole jsou ionty uzavřeny v ohraničeném prostoru. Iontová past se skládá ze vstupní a z výstupní elektrody kruhového průřezu a z prstencové středové elektrody. Krajní elektrody jsou uzemněny, na středovou elektrodu je vkládáno vysokofrekvenční napětí s proměnnou amplitudou.
Ionty jsou nuceny pohybovat se uvnitř iontové pasti po uzavřených kruhových drahách s rostoucí amplitudou napětí se ionty s rostoucím m/z dostávají na nestabilní trajektorie a opouštějí prostor iontové pasti směrem do detektoru
MS - separátory iontů
Průletový analyzátor (time of flight TOF) je tvořen prázdnou trubicí. K časovému rozdělení iontů podle m/z dochází na základě jejich odlišné doby letu z iontového zdroje do detektoru.
Hmotnější ionty se pohybují nižší rychlostí než ionty lehčí a dorazí do detektoru později.Dosažené rozlišení závisí na délce dráhy, kterou ionty v průletovém analyzátoru urazí.
Nutná konstatantní stabilní teplota - st
MS - separátory iontů
Magnetický - sektorový hmotnostní analyzátor umožňuje prostorové rozdělení svazku iontů podle hodnoty m/z, konstrukčně se jedná o elektromagnet, mezi jehož pólovými nástavci prochází fokusovaný paprsek iontů z elektrického pole
ionty o rozdílném poměru m/z opisují dráhy o různých poloměrech dochází k prostorové disperzi iontů podle jejich hmotnosti
V
rBzm
.2
./
2
B
V
r
MS - separátory iontů
ORBITRAP
Octapole
Svazek iontů je v C-trapu zbržděn kolizí s molekulami dusíku, stlačen a vystřelen do Orbitrapu. Na jeho centrální elektrodě se postupně zvyšuje napětí a ionty se začínají spirálově pohybovat – generují proudový signál, který je pomocí Fourierovy tranformace převeden na MS spektrum
elektroda
Osa z
zm
konstz /
.~
MS - separátory iontů
MS - detektor iontů
detektor zařízení, které detekuje ionty separované hmotnostním separátorem
Elektronový násobič konverzní dynóda umožňuje konvertovationty na sekundární elektronya ty dále lavinovým jevem, v tzv. channeltronu tvaru rohu, emitují další elektrony. Měří se vzniklý proud. Elektronásobič je citlivý na přetížení.
Fotonásobičkonverzní dynóda umožňuje konvertovat ionty na sekundární elektrony. Tyto elektrony při interakci s fosforem emitují fotony. Fotonový signál je zesílen ve fotonásobiči. Fotonásobič je zataven ve skle a je tak velmi rezistentní vůči poškození.
MS - vakuum
EI+ 70 eV, CI, MALDI – vakuum i ve zdroji spektrometru, všechny spektrometry vakuum v analyzátoru: aby byla zachována dlouhá dráha letu nabitých částic (mohly být detekovány)
1. Stupeň vakua rotační olejové vývěvy – vakuum cca 10-
2 mBar – slouží pro provoz pump 2. stupně vakua
Spektrometry mají vždy dvoustupňový systém vakua
2. Stupeň vakua cca 10-5 až 10-8 mBar (1 mBar = cca 100 Pa)
turbomolekulární pumpa difuzní olejová pumpa
MS - vakuum
MS - způsob vnosu vzorku
EI+ 70 eV: GC/MS – kapilární GC kolona (split, splitless, PTV inlet)
evakuvatelný reservoar se septem kapilárou napojený do iontového zdroje
sonda přímého vstupu (Direct insertion Probe - DIP) – vzorek je v mikrovialce v držáku vyhřívané sondy zaveden přímo do iontového zdroje přes vacuum lockESI, APCI: LC/MS – mobilní fáze je pumpou čerpána přes LC kolonu a (popř. přes celu UV detektoru) kapilárou do zdroje (v případě potřeby se průtok před vstupem do MS splituje)
Direct Infusion (DI) - přímý nástřik robotickou stříkačkou (mechanický posuv pístu) kapilárou do zdroje
Flow Injection Analysis (FIA) nástřik přes vebtil do proudu mobilní fáze čerpané pumpou LC chromatografu kapilárou do zdroje
Hmotnostní spektrometr
Přenosný GC-MS HAPSITE (firma Inficon, Inc. U.S.A)
Nasazení v Afganistánu (britské jednotky)
Hmotnostní spektrometr
Sektorový hmotnostní spektrometr
Hmotnostní spektrometr
Kvadrupolový hmotnostní spektrometr s GC chromatografem
Hmotnostní spektrometr
IT-ORBITRAP hybridní MS spektrometr