Hodnotenie ekotoxikologických vlastností vybraných obzvlášť škodlivých látok

Hodnotenie ekotoxikologických vlastností vybraných obzvlášť škodlivých látok

ACEL Cooperation Agency for Local Authorities

Martina SolenskáEkotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. (ETC)Nádražná 36900 28 Ivanka pri Dunaji

Stanovenie hodnôt environmentálnych noriem kvality pre vodu a posilnenie krajských a obvodných úradov životného prostredia pri

implementácii kontroly a monitorovania vôd

SEMINÁR Modra, Košice 11.-15. decembra 2006

Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o.

Interdisciplinárna veda, ktorá kombinuje poznatky EKOLÓGIE

(študuje ekosystémy) a TOXIKOLÓGIE (interakcie chemických látok

s organizmami)

EKOTOXIKOLÓGIA


Experimentálne (zvyčajne laboratórne) metódy stanovenia toxického pôsobenia stresorov (toxických látok) na organizmy v prírode

Každý biotest v podstate predstavuje zjednodušený model ekosystému

Biotesty akútnej toxicity

Živočíchy- hodnoteným parametrom je letalita a imobilizácia napr. Daphnia magnaAutotrofné organizmy- riasy -rast - delenie množstvo chlorofylu (florescencia) vyššie rastliny - klíčenie a rastRozkladači (deštruenti)- baktérie- rast, metabolická aktivita, bioluminiscencia

Biotesty chronickej toxicity

Živočíchy- neletálne parametre- rast a reprodukčné schopnosti Autotrofné organizmy- vyššie rastliny- klíčenie, rast, tvorba gamét/semien

EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY


Príprava organizmov (kultivačné médium, množstvo- počet, vek organizmov…)Príprava vzoriek (stanovenie sušiny, výluh riedenie vzorky – koncentračná rada, negatívna kontrola)Expozícia - podľa typu organizmu a testu akútne: 24,48,72 hodín, chronické: dni, týždne až mesiace - dávka, koncentrácia, časTestovanie - testovaná látka -kontrola - referenčná látkaVyhodnotenie- stanovenie letality, imobilizácie, Biomasy, štatistické hodnotenie a stanovenie

Praktická realizácia ekotoxikologických testov


Praktická realizácia testov - vyhodnotenie LC50 stredná letálna koncentrácia- štatisticky odvodená jedná dávka látky, pri ktorej sa predpokladá 50% uhynutie počas expozície alebo po určitom čase po expozícii

EC50 koncentrácia, pri ktorej sa predpokladá 50% inhibícia NOAEL „koncentrácia nepozorovaného nepriaznivého účinku“ najvyššia dávka, pri ktorej sa nepozorujú žiadne nepriaznivé účinky NOEC koncentrácia, pri ktorej neboli pozorované žiadne nepriaznivé účinky

LOAEL najnižšia dávka, pri ktorej sa pozorujú nepriaznivé účinky

LOEC najnižšia konc., pri ktorej neboli pozorované nepriaznivé účinky


KôrovceStanovenie inhibície mobility Daphnia magnaStanovenie reprodukčnej toxicity (Daphnia magna)

Ryby Stanovenie akútnej toxicity na rybách (Poecilia reticulata)

Riasy Stanovenie inhibície rastu rias (Scenedesmus quadricauda)

Vyššie rastliny Stanovenie inhibície rastu (Lemna minor) Stanovenie inhibície rastu koreňa vyššej kultúrnej rastliny (Sinapis alba)

Mikroorganizmy Stanovenie inhibície luminiscencie baktérií (Vibrio fisheri)

Stanovenie inhibície spotreby kyslíka aktivovaným kalom

Ekotoxikologické testy


STN EN ISO 6341, OECD 202, C.2

Princíp - stanovenie koncentrácie - EC50, ktorá za presne definovaných podmienok imobilizuje 50 % exponovaných jedincov Daphnia magna po 24 h a 48 h

V skúškach sa používajú organizmy Daphnia magna najmenej tretej generácie, ktoré boli získané acyklickou partenogenézou za špecifikovaných podmienok rozmnožovania

Organizmy používané v skúške majú byť mladšie ako 24 hodín, získavajú sa tak, že sa gravidné samice prenesú do nádob s čerstvou riediacou vodou a počas 24 h sa odlovia novonarodení jedinci

Stanovenie inhibície mobility Daphnia magna, skúška akútnej toxicity


Skúšobné nádoby sa umiestňujú do klimatizovanej komory, v ktorej sú zabezpečené konštantné hodnoty:

intenzita svetla 400 až 800 luxov fotoperióda 16 h svetlo/8 h teplota (21 °C 1°C),

Podmienky skúšky


Rozsah koncentrácií sa zvolí tak, aby aspoň tri hodnoty koncentrácie ležali medzi 10 % a 90 % imobilizácie.

Pre každú koncentráciu a kontrolu je treba použiť minimálne 20 jedincov Daphnia magna, ktoré sa rozdelia do štyroch skupín po 5 jedincov

Bezprostredne po spočítaní imobilizovaných jedincov Daphnia magna sa zmeria koncentrácia rozpusteného kyslíka v skúšobnej nádobe s roztokom s najnižšou koncentráciou, v ktorej boli všetky Daphnia magna imobilizované

(obsahy skúšobných nádob jednej koncentrácie sa zlejú do jednej nádoby tak,

aby nedošlo k zmene obsahu rozpusteného kyslíka)

Priebeh skúšky

Výsledky


Hodnoty 24 h a 48 h EC50 a limity zodpovedajúce 0 % a 100 % imobilizácii sa vyjadrujú:

v mg/l v prípade chemických látok, pesticídov, environmentálne vhodných výrobkov, farmaceutických prípravkov

v ml/l alebo ako percento v prípade povrchových a odpadových vôd, pórovej vody zo sedimentov


Výsledky sa považujú za platné ak sú splnené na konci skúšky nasledovné podmienky:

koncentrácia rozpusteného kyslíka na začiatku testu musí byť najmenej 60 % za danej teploty;koncentrácia rozpusteného kyslíka na konci skúšky je väčšia alebo rovná 2 mg/l testované jedince Daphnia magna nesmú byť v kontrole zachytené na povrchu vodykoncentrácia testovanej vzorky musí byť udržiavaná v rozsahu 80 % pôvodnej koncentrácie počas celého testuhodnota pH sa nesmie meniť o viac ako 1 jednotku pHpercento imobilizácie v kontrolnej vzorke je menšie alebo rovné 10%24 h EC50 dichrómanu draselného je v rozsahu 0,6 mg/l – 2,1 mg/l.

Platnosť výsledkov


STN ISO 10706, OECD 211, C.20

Hlavným cieľom skúšky je zhodnotiť účinok chemických látok a prípravkov, povrchových a odpadových vôd,

pórovej vody zo sedimentov, farmaceutických prípravkov a pesticídov na reprodukciu Daphnia magna

Rodičovské organizmy - samičky Daphnia magna, ktoré sú prítomné na začiatku skúšky a ktorých schopnosť reprodukcie je predmetom štúdie.

Potomstvo - mladé organizmy Daphnia magna, vyprodukované rodičovskými organizmami počas trvania skúšky.

Stanovenie reprodukčnej toxicity (Daphnia magna)

PrincípEkotoxikologické centrum Bratislava s.r.o.

- mladé samice rodu Daphnia (rodičovské organizmy), mladšie ako 24 hodín na začiatku skúšky, exponované rade koncentrácií skúšanej látky - trvanie skúšky je 21 dní - na konci skúšky sa hodnotí celkový počet živého potomstva produkovaného rodičovským organizmom, ktorý prežil do konca skúšky - mladé jedince produkované dospelými jedincami, ktoré uhynuli počas skúšky sú vylúčené z výpočtov - na stanovenie LOEC a NOEC sa porovnáva reprodukcia živočíchov exponovaných skúšanej látke s reprodukčnou schopnosťou organizmov v kontrole - EC50 - koncentrácia, ktorá spôsobí 50 % redukciu reprodukčnej schopnosti zaznamenáva sa i prežívanie rodičovských organizmov, môžu sa sledovať aj iné účinky spojené s pôsobením testovanej látky ako je napr. čas produkcie prvého vrhu


Podmienky testu rovnaké ako pri teste akútnej toxicity

Výmena testovaného média frekvencia výmeny média závisí od stability testovanej látky

a mala by sa vykonávať najmenej tri krát za týždeň

pri semistatických testoch sa médium mení tak, že sa pripraví druhý súbor testovacích nádob a rodičovské organizmy sa do nich prenesú automatickou pipetou so špičkou primeraného objemu, pričom sa minimalizuje objem média, ktorý sa prenesie spolu s jedincami Daphnia magna


Mladé organizmy každý deň, odo dňa, kedy sa objavilo prvé potomstvo (aby sa tak predišlo konzumácii potravy určenej pre dospelé jedince) treba spočítať a premiestniť mladé jedince, vyprodukované rodičovským organizmom počítajú sa len živonarodené jedince, ale mala by sa zaznamenať prítomnosť nevyvinutých vajíčok alebo mŕtvych mladých jedincov

Mortalita Mortalita dospelých organizmov by sa mala zaznamenávať denne, najmenej však vtedy, kedy sa počítajú mladé jedince

Vyhodnotenie a cieľ skúškyEkotoxikologické centrum Bratislava s.r.o.

Cieľom tohto testu je stanoviť účinok testovanej látky na celkový počet mladých, živých organizmov na živý rodičovský

organizmus na konci testu (ak rodičovský organizmus počas testu zahynie alebo sa premení na samčeka, potom sa

tento testovaný súbor z ďalšej analýzy vylúči)

Celkový počet mladých organizmov na rodičovský organizmus sa vypočítava pre každú z testovaných nádob (t.j. paralelne testovaný súbor)

Priemer pre každú koncentráciu sa porovnáva s priemerom v kontrole Pri odhade LOEC a NOEC, pri stanovení účinkov chemickej látky na reprodukciu je nevyhnutné vypočítať priemernú reprodukciu zo všetkých paralelne testovaných súborov pre každú koncentráciu a štandardnú odchýlku, čo je možné vykonať použitím analýzy rozptylu (ANOVA)


Platnosť skúšky

Skúška je platná ak sú dodržané nasledovné kritériá v kontrole:

mortalita u rodičovských

organizmov nesmie na konci skúšky presiahnuť

20 %,

priemerný počet živých jedincov,

vyprodukovaný na 1 živý rodičovský organizmus na konci musí byť 60.

Okrem odhadu reprodukčnej schopnosti, je možné týmto testom stanoviť i iné účinky, napr. čas, ktorý je potrebný na produkciu prvého potomstva, počet a veľkosť potomstva na jedinca, počet nevyvinutého potomstva, počet samčích jedincov a pomer populačného rastu


Stanovenie akútnej toxicity na rybách (Poecilia reticulata)

STN EN ISO 7346 – 1, -2, OECD 203, C.1Princíp skúšky

Ryby sú exponované testovanej látke pridanej do vody v rôznych koncentráciách počas 96 h.

Úmrtnosť sa zaznamenáva po 24 h, 48 h, 72 h a 96 h Skúška môže byť statická alebo semistatická

Statická skúška Skúška bez výmeny skúšobného roztoku počas skúšky.

Semi-statická skúška Skúška s pravidelnou výmenou skúšobného roztoku v určitých

časových intervaloch (napr. každých 24 h)


Skúšobným druhom v EL je Poecilia reticulata, prípadne Brachydanio rerio

celkovú dĺžka 25 mm 5 mm, čo všeobecne zodpovedá hmotnosti 0,3 g 0,1 g.

Ryby sa aklimatizujú pred začiatkom skúšky v riediacej vode 7 dní s nepretržitým vzduchovaním, za rovnakých podmienok kvality vody a osvetlenia ako pri skúške

Ryby sa kŕmia normálne až do 24 hodín pred začiatkom skúšky, kedy sa kŕmenie preruší.

Ryby nesmú trpieť žiadnymi chorobami alebo viditeľnými malformáciami.

Nesmú byť v prípade ochorenia ošetrované počas skúšky ani 2 týždne pred skúškou

Skúšobné organizmy


Skúšobné nádoby sa umiestňujú do klimatizovanej komory v ktorej sú zabezpečené konštantné hodnoty:

teplota (21 °C 1 °C) fotoperióda 16 h svetlo/8 h intenzita svetla 400 až 800 luxov.

Roztoky sa počas skúšky neprevzdušňujú Pri zmene zásobnej populácie rýb sa musí vykonať

skúška toxicity, použitím vhodnej referenčnej látky - dichrómanu draselného (K2Cr2O7)

Podmienky skúšky


Po stabilizácii teploty skúšobných roztokov na 21 °C ± 1 °C sa do každej skúšobnej nádoby umiestni 7 rýb

Ryby sa zo zásobnej nádrže vyberajú náhodne a náhodne sa aj rozdeľujú do skúšobných nádob, (ryby, ktoré počas prenosu padli sa zo skúšky vyradia, prenos – do 30 min)

V prípade semistatickej skúšky sa po 24 alebo 48 h pripravia nové testované roztoky do nových testovacích nádob a ryby sa do nich preložia

Počas skúšky sa zaznamenáva množstvo uhynutých rýb v každej nádobe aspoň raz denne

Uhynuté ryby sa musia odstrániť čo najskôr Treba zaznamenať akékoľvek abnormálne správanie rýb V každej nádobe sa denne sleduje koncentrácia rozpusteného

kyslíka a pH

Priebeh skúšky


Stanovenie LC50 Koncentrácia spôsobujúca 50% úmrtnosť rýb Poecilia reticulata

alebo Brachydanio rerio (LC50) sa vypočítava v každom pozorovanom čase (24 h LC50, 48 h LC50, 72 h LC50 a 96 h LC50)

Platnosť skúšky koncentrácia rozpusteného kyslíka počas skúšky v skúšobných

roztokoch musí byť minimálne 60 % koncentrácii skúšanej látky nesmie významne klesať v priebehu

skúšky (potom sa vykonáva semistatický test) mortalita rýb v kontrole nemôže prekročiť 10 % na nádobu počet rýb v kontrole, ktoré preukazovali abnormálne správanie

nesmie prekročiť 10 % na nádobu 24 h LC50 referenčnej látky - napr. dichrómanu draselného

(K2Cr2O7) pre daný zásobný chov rýb musí byť v súlade s výsledkami LC50 získanými v minulosti.

Výsledky a platnosť skúšky


Princíp skúšky

Cieľom je zistenie účinkov skúšanej vzorky na rast jednobunkových zelených rias: Desmodesmus subspicatus, ktoré sa počas niekoľkých generácií kultivujú v definovanom médiu, ktoré obsahuje rad koncentrácií skúšanej látky alebo vody a inokula exponenciálne rastúcich riasových buniek

Skúšobné roztoky sa inkubujú 72 h ±2h. Za tento čas sa hustota buniek v každom skúšobnom roztoku meria každých 24 h

Inhibícia sa meria ako redukcia rastu alebo rastovej rýchlosti v pomere k rastu kontrolných kultúr kultivovaných za rovnakých podmienok

Stanovenie inhibície rastu rias (Desmodesmus subspicatus) STN EN ISO 8692, OECD 201, C.3


Hustota buniek - počet buniek na jednotku objemu (1 ml).

Rast - zvyšovanie hustoty buniek počas testu. Špecifická rýchlosť rastu – rýchlosť úmerná prírastku

hustoty buniek za jednotky času. Skúšobný roztok – zmes vody, živín a skúšanej látky, v

ktorej sa inkubujú riasové bunky. Kontrolný roztok – zmes vody, živín a riasových buniek bez skúšanej látky.

Skúšobný organizmusDesmodesmus subspicatus (86.81 SAG), Chlorophyta, z Botanického ústavu SAV,

Bratislava

Definície


klimatizovanej miestnosti teplota 24°C ± 1°C nepretržite osvetlenie biele fluorescenčné svetlo Intenzita od 6 000 do 10 000 luxov

Skúška sa vykonáva bez úpravy pH Skúška sa vykonáva bez úpravy pH Hustota buniek sa meria v každej skúš. nádobe (aj kontrola) raz za 24 h Hustota buniek sa meria v každej skúš. nádobe (aj kontrola) raz za 24 h

Tieto merania sa vykonávajú s malými objemami odobratými zo skúšobných Tieto merania sa vykonávajú s malými objemami odobratými zo skúšobných roztokov pipetouroztokov pipetou

Na meranie hustoty buniek sa používa mikroskop s počítacou Bűrkerovou Na meranie hustoty buniek sa používa mikroskop s počítacou Bűrkerovou komôrkou komôrkou

Skúška trvá 72 h Skúška trvá 72 h Na konci skúšky sa zmeria pH skúšobných roztokov v každej koncentrácii Na konci skúšky sa zmeria pH skúšobných roztokov v každej koncentrácii

i v kontrolnej vzorkei v kontrolnej vzorke

Podmienky skúšky

Priebeh skúšky


Zostrojenie rastových krivieko Pre každú skúšanú koncentráciu a kontrolnú vzorku sa zostrojí graf rastových kriviek o Zistené bunkové koncentrácie v skúšaných kultúrach a kontrolách

sa prezentujú vo forme tabuľky spolu s koncentráciami skúšanej vzorky a časom merania.

o Priemery bunkových koncentrácií sa uvádzajú pre každú skúšanú koncentráciu a pre kontrolu v časovom priebehu, čím vzniknú rastové krivky

Výpočet inhibície v percentách sa používa pre stanovenie vzťahu účinku a koncentrácie pre každú testovanú koncentráciu a vypočíta sa na základe rýchlosti rastu (výpočet podľa STN EN ISO 8692).

Stanovenie EC50 Hodnoty EC50 vypočítané z plochy pod rastovou krivkou (biomasa) sa označia

ako EbC50 a z rastovej rýchlosti ako ErC50

Vyhodnotenie výsledkov


Platnosť testu

rastová rýchlosť 1,4 d-1 (67-násobok –zvýšenie hustoty buniek po 72 h

pH nesmie sa zvýšiť o viac ako 1,5 jednotky

variačný koeficient rastovej rýchlosti v kontrole nesmie prekročiť 5%


č. CAS Chemická látka Organizmy Druhy Druh testu Metóda

98-10-2 Benzensulfonamide ryby Poecilia reticulata predĺžený OECD 204

akútny OECD 203, C.1

bezstavovce Daphnia magna chronický OECD 211, C.20

akútny OECD 202, C.2,

riasy Desmodesmus subspicatus

semichronický

OECD 201, C.3,

95-16-9 Benzothiazole bezstavovce Daphnia magna chronický OECD 211, C.20

akútny OECD 202, C.2


semichronický

OECD 201, C.3

128-37-04-methyl-2,6-di-

tertbutylphenol (butylhydroxy-toluene)

ryby Poecilia reticulata akútny OECD 203, C.1

80-05-7 Bisphenol A

bezstavovce Daphnia magna akútny OECD 202, C.2


semichronický

OECD 201, C.3

13684-56-5

Desmediphamriasy Desmodesmus

subspicatussemichronick

ýOECD 201, C.3

84-74-2 Dibutylphthalateriasy Desmodesmus


ýOECD 201, C.3

85-01-8 Phenanthreneriasy Desmodesmus


ýOECD 201, C.3

Čiastkové výsledky akútnych testov


Documents

Hodnotenie ekotoxikologických vlastností vybraných obzvlášť škodlivých látok