HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9) Ở BỆNH …repository.vnu.edu.vn/bitstream/VNU_123/33519/1/01050003441(1).pdf · Phương và các bạn sinh viên làm việc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Hoàng Ngọc Anh

HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9)

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

TRƯỚC VÀ SAU PHẪU THUẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Hoàng Ngọc Anh

HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9)

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

TRƯỚC VÀ SAU PHẪU THUẬT

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trịnh Hồng Thái

TS Đỗ Minh Hà

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Trịnh Hồng Thái, người

thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập,

thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn với những ý kiến đóng góp quý báu của TS.

Đỗ Minh Hà trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn.

Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự

giúp đỡ rất nhiều của ThS. Phạm Thị Bích, ThS. Nguyễn Thị Tú Linh, ThS. Lê Lan

Phương và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc

thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. BS. Phạm Mạnh Cường cùng Khoa Tế

bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quân y 103 và đồng cảm ơn tới Khoa Xét nghiệm

và Sàng lọc máu Viện Huyết học -Truyền máu Trung ương vì đã cung cấp mẫu

những mẫu bệnh phẩm và đối chứng quý giá trong quá trình thực hiện luận văn.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công

nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp

đỡ tôi về trong suốt quá trình làm luận văn này.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và

luôn bên tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, tháng 02 năm 2017

Học viên

Hoàng Ngọc Anh

MỤC LỤC

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... i

DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... ii

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

Chương 1 - TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng ................................................. 3

1.1.1. Ung thư đại trực tràng ................................................................. 3

1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng và các yếu tố nguy cơ. 4

1.1.3. Phân loại ung thư đại trực tràng .................................................. 6

1.1.4. Ảnh hưởng sau phẫu thuật ............................................................... 9

1.2. Tổng quan về các MMP ................................................................... 9

1.2.1. Matrix Metalloproteinases .......................................................... 9

1.2.2. Sự hoạt hóa dạng tiền hoạt động (pro-MMP) ........................... 12

1.2.3. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase .................................. 13

1.3. Tình hình nghiên cứu MMP trong ung thư đại trực tràng ............. 16

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................ 21

2.1. Nguyên liệu .................................................................................... 21

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................... 21

2.1.2. Thiết bị ...................................................................................... 21

2.1.3. Hóa chất .................................................................................... 21

2.2. Phương pháp .................................................................................. 22

2.2.1. Tách chiết protein tổng số từ mẫu mô ...................................... 23

2.2.2. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford ........ 24

2.2.3. Điện di xác định hoạt tính enzyme MMP trên gel

polyacrylamide ................................................................................................. 25

2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di bằng phần mềm Image J .... 27

2.2.5. Phân tích, đánh giá kết quả ....................................................... 28

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................. 29

3.1. Xác định hoạt tính enzyme trên gel polyacrylamide có SDS có bổ

sung cơ chất gelatin .............................................................................................. 29

3.2. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 trong các mẫu mô và huyết tương

của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.................................................................... 33

3.2.1. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 theo vị trí mô ........................ 33

3.2.2. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 trong huyết tương ................. 36

3.3. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 theo một số đặc điểm bệnh học

của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.................................................................... 40

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 46

KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 48

PHỤ LỤC .................................................................................................................... i

i

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APS Ammonium persunfate

CA Kháng nguyên ung thư (Cancer antigen)

CBB Coomassie Brilliant Blue

CEA Kháng nguyên ung thư phôi thai (Carcinoembryonic antigen)

Cs Cộng sự

ECM Chất nền ngoại bào (Extracellular Matrix)

ELISA Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme

(Enzyme-linked immunosorbent assay)

MMP Proteinase kim loại trong chất nền ngoại bào

(Matrix Metalloproteinase)

OD Mật độ quang (Optical density)

RT-PCR Phản ứng khuếch đại chuỗi phiên mã ngược

(Reverse transcription polymerase chain reaction)

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamide có SDS

(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

TIMP Chất ức chế của MMP

(Tissue Inhibitors of Metalloproteinase)

TNM Kích thước khối u - Hạch vùng - Di căn

(Tumor - Node - Metastasis)

UTĐTT Ung thư đại trực tràng

UTVMH Ung thư vòm mũi họng

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sót sau 5 năm ............................. 9

Bảng 1.2. Bảng phân loại các thành viên trong họ MMP theo cơ chất chính ........... 10

Bảng 1.3. Chức năng của một số MMP .................................................................... 14

Bảng 2.1. Thành phần bản gel polyacrylamide 9% có SDS có bổ sung cơ chất ...... 26

Bảng 3.1. Tần suất biểu hiện hoạt tính của MMP-2 và MMP-9 trong các mẫu mô và

huyết tương của 37 bệnh nhân UTĐTT .................................................................... 30

Bảng 3.2. Hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và MMP-9 trong mô T, LCU và U của

bệnh nhân UTĐTT, n=37 .......................................................................................... 33

Bảng 3.3. Hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và MMP-9 trong huyết tương của 37

bệnh nhân UTĐTT và đối chứng .............................................................................. 37

Bảng 3.4. Sự khác biệt hiệu số hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và -9 tại mô u so với

T theo một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân UTĐTT ....................................... 41

iii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu tạo đại trực tràng ................................................................................. 3

Hình 1.2. Cấu trúc các vùng của MMP ..................................................................... 11

Hình 1.3. Sơ đồ hoạt hóa pro-MMP .......................................................................... 13

Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện nghiên cứu MMP-2 và MMP-9 ....................... 23

Hình 3.1. Hình ảnh điện di xác định hoạt tính enzyme trên bản gel polyacrylamide

có SDS, có gelatin ở mẫu mô (T, LCU và U) và huyết tương (HT-1, HT+1, HT+3

và HT+7) của bệnh nhân #10, và mẫu đối chứng. .................................................... 29

Hình 3.2. Hoạt tính gelatinase trong mẫu mô của một số bệnh nhân UTĐTT ......... 31

Hình 3.3. Biểu diễn băng hoạt tính của MMP-2 và MMP-9 trong các mẫu huyết

tương của một số bệnh nhân, đối chứng và giá trị chuẩn hóa của chúng ................. 32

Hình 3.4. Hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và MMP-9 ở các mẫu huyết tương của

bệnh nhân UTĐTT .................................................................................................... 38

Hình 3.5. Hiệu số hoạt độ chuẩn hóa của proMMP-9 giữa U-T của bệnh nhân

UTĐTT theo mức độ xâm lấn và độ biệt hóa ........................................................... 42

Hình 3.6. Hiệu số hoạt độ chuẩn hóa của proMMP-2 giữa HT+7 so với HT-1 và

proMMP-9 giữa HT+3 so với HT-1 theo mức độ xâm lấn và hạch di căn tương ứng

của bệnh nhân UTĐTT .............................................................................................. 43

Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh

1 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm

MỞ ĐẦU

Theo báo cáo của Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Thế giới (International agency

for research on cancer, IARC), năm 2012, ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại

ung thư phổ biến thứ 4 trên toàn thế giới và đứng thứ nhất trong các ung thư đường

tiêu hóa. Tại Việt Nam, dựa trên một số công bố từ năm 2005-2010 cho thấy:

UTĐTT là loại ung thư có tỷ lệ mắc đứng thứ 5 về số ca mắc mới (8768 ca) và thứ

4 về số ca tử vong (5976 ca) [67].

Hiện nay, các phương pháp đang được áp dụng để chẩn đoán UTĐTT như:

chẩn đoán hình ảnh, chẩn đoán nội soi, chẩn đoán tế bào học, chẩn đoán mô bệnh

học thường chỉ phát hiện được bệnh khi bệnh đã ở giai đoạn muộn, gây khó khăn

cho việc điều trị. Một số chỉ thị sinh học như kháng nguyên ung thư (cancer antigen,

CA), kháng nguyên ung thư phôi thai (carcinoembryonic antigen, CEA) chỉ dừng

lại ở tiên lượng sau điều trị bằng phẫu thuật [19, 7]. Nhu cầu đặt ra là phải tiếp tục

tìm kiếm các dấu hiệu sinh học giúp chẩn đoán có hiệu quả cũng như theo dõi điều

trị bệnh trong UTĐTT.

Matrix metalloproteinase (MMP) được biết đến là nhóm enzyme tham gia vào

các quá trình phát triển và xâm lấn của khối u, đặc biệt là MMP-2, MMP-9 và dạng

tiền hoạt động của chúng. Các enzyme này đã được nhiều công bố trên thế giới

chứng minh có biểu hiện khác biệt liên quan đến sự tiến triển khối u của bệnh

UTĐTT. Vì vậy, đề tài “Hoạt tính của protease kim loại (MMP-2, MMP-9) ở bệnh

nhân ung thư đại trực tràng trước và sau phẫu thuật” được thực hiện nhằm mục tiêu:

1. Đánh giá hoạt tính và mức độ biểu hiện hoạt tính của MMP-2, MMP-9 trong

mô và huyết tương của bệnh nhân UTĐTT trước và sau phẫu thuật.

2. Đánh giá mối liên quan giữa hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 với một số đặc

điểm bệnh học của bệnh nhân UTĐTT.



Đề tài được thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.



Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng

Ung thư là nhóm bệnh liên quan tới sự tăng sinh về mặt số lượng một cách

nhanh chóng và không kiểm soát của các tế bào bất thường trong cơ thể. Từ đó, các

tế bào bất thường có thể xâm lấn, chèn ép vào các tế bào, mô lân cận. Ngoài ra,

chúng có thể tách rời và di chuyển đến các mô ở vị trí xa bằng cách xâm nhập vào

mạch máu hoặc hệ bạch huyết. Hơn thế nữa, sự xâm lấn chèn ép của những tế bào

ung thư dẫn tới sự rối loạn các chức năng vốn của cơ quan mà chúng có mặt [68].

Đại trực tràng bao gồm đại tràng lên, đại tràng góc gan, đại tràng ngang, đại

tràng góc lách, đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng (hình 1.1). Chúng

chiếm phần lớn ruột già – phần cuối cùng của hệ tiêu hóa, đóng vai trò hấp thu nước

và các chất dinh dưỡng ở phần đầu đại tràng và dần chuyển thành các chất cặn bã để

đào thải khỏi cơ thể tại trực tràng.

Hình 1.1. Cấu tạo đại trực tràng [68]

1.1.1. Ung thư đại trực tràng

UTĐTT hay còn gọi ung thư ruột già là thuật ngữ để chỉ các loại ung thư

khởi phát có nguồn gốc từ bất kỳ vị trí nào thuộc đoạn đại tràng và trực tràng.

UTĐTT thường bắt đầu với sự phát triển của polyp trong lòng đại trực tràng và theo

thời gian một số polyp có thể sẽ trở thành ung thư [68].



Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization, WHO)

về tình hình ung thư năm 2012, trên thế giới ước tính có 14,09 triệu ca mắc mới ung

thư và 8,20 triệu ca tử vong do ung thư, trong đó, số ca mắc mới UTĐTT là 1,36

triệu (chiếm 9,7%) đứng vị trí thứ ba sau ung thư phổi (vị trí thứ nhất) và ung thư

vú (vị trí thứ hai) và gần 0,7 triệu ca tử vong do UTĐTT (chiếm 8,5%). Cũng theo

báo cáo này, ở Việt Nam, có khoảng 125 nghìn ca mắc mới và 94 nghìn ca tử vong

do ung thư nói chung, trong đó, tính riêng ở UTĐTT có 8,7 nghìn ca mắc mới

(chiếm 7%) và 5,9 nghìn ca tử vong (chiếm 8%). Xét trên cả số lượng ca mắc mới

và số ca tử vong, UTĐTT đứng thứ 5 trong các dạng ung thư tại Việt Nam [67].

1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng và các yếu tố nguy cơ

Có rất nhiều nguy cơ dẫn đến UTĐTT liên quan đến sự biến đổi bệnh học

xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thường. Thống kê các tài liệu tổng

quan cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh này là:

Yếu tố không di truyền

Là các yếu tố như: thói quen ăn uống, hút thuốc lá, theo độ tuổi, bệnh tật,

thể dục ,…

Thói quen ăn uống: nhóm có nguy cơ cao phải đối mặt với UTĐTT thường

sử dụng các loại thịt đỏ (thịt bò, thịt cừu, gan,…), các loại thịt chế biến (như xúc

xích, thịt hun khói) và chế biến thực phẩm ở nhiệt độ rất cao (chiên, nướng) có thể

tạo ra các chất làm tăng nguy cơ ung thư. Bên cạnh đó, sử dụng chế độ ăn thực

dưỡng (rau, củ, quả, ngũ cốc,…) lại làm giảm nguy cơ UTĐTT [49, 24].

Thói quen vận động: những nhóm người năng vận động thể dục mỗi ngày có

tỷ lệ mắc ung thư thấp hơn nhóm lười vận động [61, 29].

Thừa cân: tình trạng rất thừa cân, béo phì làm tăng nguy cơ mắc UTĐTT [61,

12].

Hút thuốc: hầu hết mọi người biết rằng hút thuốc gây ra ung thư phổi, nhưng

nhóm người hút thuốc trong thời gian dài có nguy cơ mắc UTĐTT nhiều hơn nhóm



không hút thuốc. Ngoài ra, hút thuốc cũng làm tăng nguy cơ của nhiều loại ung thư

khác [61, 9].

Sử dụng đồ uống chứa cồn: Có nghiên cứu dịch tễ cho thấy 15% số người

mắc UTĐTT có cường độ sử dụng rượu, bia nhiều và nhóm ít sử dụng đồ uống có

cồn thì nguy cơ thấp hơn nhóm sử dụng nhiều [61, 40].

Tiền sử bệnh lý: Những người có tiền sử mắc bệnh viêm loét đại tràng, bệnh

Crohn và đái tháo đường tuýp 2 trong thời gian dài thường có nguy cơ cao mắc

UTĐTT [54, 63].

Sai hỏng trong điều hòa và biểu hiện gen: các tế bào có thể tăng sinh không

kiểm soát nếu có sai hỏng quá trình điều hòa và biểu hiện gen. Trong đó, những

nhóm gen liên quan trực tiếp đến ung thư gồm: các gen tiền ung thư (proto-

oncogenes), các gen ức chế khối u và các gen sửa chữa ADN [68].

Ngoài các yếu tố kể trên còn có các yếu tố nguy cơ khác như tuổi, giới tính,

hay rối loạn trao đổi chất cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến UTĐTT.

Yếu tố di truyền

Khoảng 5-10% những ca mắc UTĐTT là có những biến đổi về gen được di

truyền lại. Thông thường, những biến đổi này dẫn đến ung thư khi bệnh nhân còn

trẻ.

Hội chứng đa polyp trong gia đình (Familial adenomatous polyposis, FAP):

Những người mắc FAP thường có hàng trăm hoặc hàng ngàn polyp trong ruột kết

và trực tràng. Ung thư thường khởi phát ở một hoặc một vài polyp ở tuổi 20. Đến 40

tuổi, hầu hết những người bị rối loạn này sẽ bị ung thư nếu không được cắt bỏ đoạn

đại tràng. Hội chứng FAP chiếm khoảng 1% trong UTĐTT [68].

Hội chứng Lynch (Hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC) hay

còn gọi UTĐTT không polyp di truyền: chiếm khoảng 3% đến 5% số ca mắc

UTĐTT và thường mắc ung thư khi còn trẻ. Từ những biến đổi trong gen MLH1,

MSH2, MSH6, PMS2, hoặc EPCAM dẫn đến tăng nguy cơ phát triển hội chứng



Lynch. Những người mắc hội chứng này cũng có thể có khối u, nhưng họ chỉ có

một lượng nhỏ và không đến hàng trăm như trong hội chứng FAP. Nguy cơ UTĐTT

ở những người bị tình trạng này có thể lên đến 80% [68].

Chủng tộc hay sắc tộc: một số nhóm chủng tộc như người Mỹ gốc Phi, người

Do Thái gốc Đông Âu (Ashkenazi Do Thái) có nguy cơ UTĐTT cao hơn. Trong số

những người Do Thái Ashkenazi, một số đột biến gen đã được tìm thấy dẫn đến

tăng nguy cơ UTĐTT [35, 11].

1.1.3. Phân loại ung thư đại trực tràng

Việc xác định giai đoạn của ung thư có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa

chọn phác đồ điều trị thích hợp và tối ưu nhất cho bệnh nhân. Đồng thời, phân giai

đoạn cụ thể cũng thuận lợi cho việc nghiên cứu, trao đổi thông tin giữa các trung

tâm điều trị, so sánh và đánh giá các phương pháp điều trị với nhau. Hiện nay, hệ

thống phân giai đoạn ung thư được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trên thế giới

cho UTĐTT là hệ thống phân loại theo khối u, hạch lympho, di căn (Tumor-Node-

Metastasis hay còn gọi là TNM); hệ thống Dukes và hệ thống phân loại theo mô

bệnh học.

Hệ thống phân giai đoạn TNM đã được Ủy ban ung thư Hoa kỳ (American

Joint Committee on Cancer, AJCC) và Hiệp hội phòng chống ung thư quốc tế

(Union for International Cancer Control, UICC) thông qua từ năm 1974 và được

sửa đổi theo các ấn bản mới hơn. Hệ thống phân loại này được áp dụng theo hệ

thống phân loại AJCC phiên bản thứ 7 cho UTĐTT cụ thể như sau [4]:

T cho biết về kích cỡ, mức độ xâm lấn vào thành ruột của khối u nguyên

phát:

- Tx: Không có mô tả do không đầy đủ thông tin;

- Tis: Khối u tại chỗ, khối u chỉ ảnh hưởng đến lớp niêm mạc;

- T1: Khối u đã phát triển và xâm lấn đến lớp hạ niêm mạc;



- T2: Khối u đã phát triển xuyên qua lớp hạ niêm mạc và xâm lấn đến

lớp đệm cơ;

- T3: Khối u đã phát triển xuyên qua lớp đệm cơ và xâm lấn đến các lớp

ngoài cùng của đại tràng nhưng chưa xuyên thủng qua thanh mạc, khối u chưa xâm

lấn đến các cơ quan và mô lân cận;

- T4a: Khối u đã phát triển xuyên qua thanh mạc;

- T4b: Khối u đã phát triển xuyên qua thành đại tràng, dính chặt hoặc

xâm lấn các mô và cơ quan lân cận.

N cho biết cho khối u đã lan đến các hạch bạch huyết chưa và số lượng hạch

bạch huyết:

- Nx: Không có mô tả về liên quan đến hạch bạch huyết;

- N0: Không có tế bào ung thư ở các hạch bạch huyết kề cận;

- N1a: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 1 hạch bạch huyết kề cận;

- N1b: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 2-3 hạch bạch huyết kề cận;

- N1c: Tìm thấy các tập hợp tế bào ung thư nhỏ ở vùng mỡ gần các

hạch bạch huyết nhưng chưa có ở các hạch bạch huyết;

- N2a: Tìm thấy tế bào ung thư trong từ 4 đến 6 hạch bạch huyết kề

cận;

- N2b: Tìm thấy tế bào ung thư trong 7 hạch bạch huyết kề cận trở lên.

M cho biết mức độ di căn của khối u:

- M0: Không có tế bào di căn xa;

- M1a: tế bào ung thư đã di căn đến cơ quan ở xa hoặc một nhóm hạch

bạch huyết ở xa;



- M1b: tế bào ung thư đã di căn đến ít nhất 1 cơ quan xa trở lên hoặc

một nhóm các hạch bạch huyết ở xa, hoặc đã di căn đến các phần phúc mạc ở xa.

Hệ thống phân loại Dukes: Được bác sĩ Cuthbert Dukes người Anh phát

minh ra vào năm 1932 và chỉ dành riêng cho UTĐTT.

Duke A: ung thư xâm lấn tới lớp cơ bị giới hạn ở thành trực tràng, chưa di

căn hạch.

Duke B: ung thư xâm lấn thanh mạc đến tổ chức xung quanh, chưa di căn

hạch.

Duke C: Có di căn hạch.

Duke D: Có di căn xa.

Ngoài cách phân giai đoạn theo TNM, UTĐTT còn được phân thành 5 giai

đoạn, gồm: giai đoạn 0, I, II, III và IV.

- Giai đoạn 0: khối u chỉ được tìm thấy ở lớp niêm mạc trong cùng của

đại tràng hoặc trực tràng.

- Giai đoạn I: khối u đã phát triển vào thành trong của đại tràng hoặc

trực tràng. Khối u chưa phát triển vượt qua thành.

- Giai đoạn II: khối u phát triển sâu hơn vào trong hoặc xuyên qua

thành đại tràng hoặc trực tràng. Các tế bào ung thư có thể đã xâm lấn các mô lân

cận nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết.

- Giai đoạn III: tế bào ung thư đã di căn đến các hạch bạch huyết vùng

lận cận nhưng chưa đến các bộ phận khác của cơ thể.

- Giai đoạn IV: Tế bào ung thư đã lây lan sang các bộ phận khác của cơ

thể, như gan hoặc phổi,…

Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sau 5 năm được thể hiện ở bảng 1.1



Bảng 1.1. Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sót sau 5 năm [4, 69]

Giai đoạn TNM Duke Tỷ lệ sống sau 5 năm

0 TisN0M0 -

I T1N0M0

T N M

A 87-92%

IIA T3N0M0

B

80-87%

IIB T4aN0M0 49-63%

IIC T4bN0M0

IIIA T1,2N1/1cM0

T N M C

84-89%

IIIB T3,4aN1/1cM0

T N M

69-71%

IIIC T4bN2aM0

T N M

53-58%

IVA M1a D 11-12%

IVB M1b

1.1.4. Ảnh hưởng sau phẫu thuật

Phẫu thuật là một phương pháp điều trị cơ bản không bị nhờn, cho phép loại

bỏ các tổ chức ung thư. Nếu như bệnh được chẩn đoán ở giai đoạn sớm và xác định

được vị trí khu trú của tổ chức u thì phẫu thuật có thể loại bỏ tổ chức u triệt để. Tuy

nhiên, những biến chứng không mong muốn vẫn tồn tại do phẫu thuật như tụ máu,

chảy máu, nhiễm trùng tại ví trí phẫu thuật, bên cạnh đó, thuốc dùng trong quá trình

gây mê và các thuốc giảm đau sau phẫu thuật cũng có những ảnh hưởng nhất định

với bệnh nhân sau phẫu thuật [69]. Từ đó, dẫn đến các quá trình của cơ thể như hồi

phục tổn thương, stress oxi-hóa [14, 46].

1.2. Tổng quan về các MMP

1.2.1. Matrix Metalloproteinases

Matrix Metalloproteinases (MMP) là một họ các enzyme có 1 nhân kim loại

kẽm tham gia xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide nội phân tử giúp

phân giải các chất nền ngoại bào (extracellular matrix, ECM) qua đó làm yếu đi các

liên kết giữa tế bào - tế bào; tế bào - ECM [20]. Cho đến nay, các nhà khoa học đã

tìm được 25 loại MMP khác nhau, trong đó, 24 loại cũng được tìm thấy trong cơ thể



con người, chúng được nhận dạng dựa vào các vùng chức năng cơ bản của các

MMP và cơ chất của chúng (bảng 1.2) [33]

Bảng 1.2. Bảng phân loại các thành viên trong họ MMP theo cơ chất chính [33]

Nhóm Tên Cơ chất

Các Archetypal MMP

Collagenases: MMP-1, -8, -13

ECM: collagens, gelatin, fibronectin, aggrecan Non-ECM: pro-iL-1β, pro-iL-8, pro-TNF, MMP khác, PAi, IGFBP

Stromelysins: MMP-3, -10

ECM: collagens, gelatin, elastin, fbronectin, laminin, aggrecan Non-ECM: pro-iL-1β, các MMP, liên kết MMP/ TIMP, fibrinogen, plasminogen, antithrombin III, iGFBP

Các loại khác: MMP-12, -19, -20, -27

ECM: collagen IV, gelatin, elastin, fibronectin, laminin Non-ECM: fibrin, plasminogen, myelin basic protein

Matrilysins MMP-7, -26

ECM: collagen IV, gelatin, elastin, fibronectin, laminin, integrins, … Non-ECM: các MMP khác, liên kết MMP/TIMP, fibrinogen, plasminogen.

Gelatinases MMP-2, -9

ECM: collagens, gelatin, elastin, fibronectin, … Non-ECM: pro-iL-1β, plasminogen, các MMP khác

Furin – Hoạt hóa các MMP

Tiết: MMP-11, -21, -28

ECM: collagen IV, gelatin, laminin, fibronectin Non-ECM: casein, IGFBP

Xuyên màng loại 1: MMP-14, -15, -16, -24

ECM: collagens, gelatin, elastin, laminin, vitronectin Non-ECM: các MMP khác

GPI-anchored: MMP-17, -25

Chưa biết

Xuyên màng loại 2: MMP-23A, -23B

Chưa biết

Chú giải: ECM: chất nên ngoài bào, pro-IL: dạng tiền hoạt động của interleukin (proform of interleukin), pro-TNF: dạng tiền hoạt động của yếu tố hoại tử u (proform of tumor necrosis factor), PAI: ức chế nhân tố hoạt hóa plasminogen (plasminogen activator inhibitor), IGFBP: protein kết hợp với yếu tố sinh trưởng tương tự insulin (insulin-like growth factor-binding protein), TIMP: Chất ức chế của MMP (Tissue Inhibitors of Metalloproteinase)



Hình 1.2. Cấu trúc các vùng của MMP [18]

Mặc dù có một vài khác biệt giữa các MMP nhưng về cấu trúc protein lại

tương đồng khá nhiều (hình 1.2). Nhìn chung, tại đầu N của chúng đều chứa một

đoạn ngắn peptide tín hiệu giúp xác định điểm đến trong quá trình bài tiết, nhưng

chuỗi peptide tín hiệu sẽ được loại bỏ khi phân tử đi qua lưới nội chất. Các phần

tiếp theo của các phân tử MMP gồm một vùng propeptide với khoảng 80 axit amin

có chứa 1 motif bảo thủ PRCGXPD được biết đến như Switch - cysteine với vai trò

khóa trung tâm hoạt động của phân tử và giữ cho chúng ở dạng tiền hoạt động. Phần

tiếp theo của các MMP là vùng hoạt động gồm một chuỗi có 160-170 axit amin

cuộn thành hình khối cầu có chứa trình tự bảo thủ khác là HEXXHXXGXXH và 2

phân tử kẽm tạo thành trung tâm hoạt động cho các enzyme. Hầu hết các MMP (trừ

MMP-7, -23 và -26) đều có 1 vùng bản lề (hinge) với bản chất là 1 chuỗi chứa 10-

30 axit amin với chức năng làm cầu nối cho vùng hoạt động với đầu C của các

MMP – vùng giống hemopexin. Vùng này có khoảng 200 axit amin được xem như

vùng gắn chất ức chế của các MMP (các TIMP) [43]. Bên cạnh đó, đối với các loại



MMP màng (Membrane-type MMP, MT-MMP) có thể có thêm vùng bám màng

glycosylphosphatidylinositol (GPI) gồm MMP-17 và -25 còn được gọi tương ứng là

MT4- và MT6-MMP hoặc xuyên màng loại I với MMP-14, -15, -16, và -24, còn

được gọi tương ứng là MT-1, -2, -3, và -5-MMP [52].

Ngoài các thành phần phổ biến nói trên, một số MMP có chứa một vài phần

độc đáo khác. Ví dụ như fibronectin II giống như chèn vào trong vùng xúc tác chỉ

được được tìm thấy trong MMP-2 và -9. Hay vùng bản lề của MMP-9 chứa 64 axit

amin bị O-glycosyl hóa. Hơn nữa, trong phân tử MMP-23, các peptide tín hiệu được

thay thế bởi vùng xuyên màng loại II, trong khi đó vùng giống hemopexin được

thay thế bằng một đoạn giàu cysteine và tạo thành một vùng giống với

immunoglobulin. Cuối cùng, tất cả các MMP GPI và MMP tiết (MMP-11, -21 và -

28) đều có một motif R(X/R)KR giữa vùng tiền hoạt động và hoạt động. Trình tự

này được nhận diện và cắt bỏ bởi furin, các proteinase serine nội bào, trong đó loại

bỏ các vùng pro từ các phân tử MMP và dẫn đến kích hoạt nó [18]. (hình 1.2)

1.2.2. Sự hoạt hóa dạng tiền hoạt động (pro-MMP)

Các loại enzyme MMP đều được tiết ra dưới dạng tiền hoạt động hay còn gọi

là zymogen hay là pro-MMP. Do đó, chúng cần phải được hoạt hóa trước khi thực

hiện chức năng phân cắt chất nền ngoại bào. Trong cơ thể, các MMP được hoạt hóa

từ dạng tiền hoạt động sang hoạt động nhờ các endoproteinase. Sự hoạt hóa các

MMP có thể được thực hiện bởi nhiều enzyme khác nhau trong chất nền ngoại bào

như protease nhóm cysteine, serine và aspartate hoặc MMP khác. Ngoài ra, quá

trình hoạt hóa nhiều loại MMP cũng được xử lý ngay trong tế bào bởi furin, các

subtilisin như serine proteinase, ở lưới nội chất và thể Golgi. Mặt khác, các MMP

có thể được hoạt hóa bởi tác nhân vật lý và hóa học như amino phenylmercuric

acetate (APMA), sodium dedocyl sunfate (SDS), pH thấp hay xử lý bằng nhiệt [33].

Quá trình hoạt hóa MMP như sau: vùng pro-peptide của các MMP có cystein

ở vị trí 73 tạo ổn định cho dạng pro-enzyme không hoạt động. Trong vùng xúc tác,

Zn2+ được liên kết với cystein ở vị trí 73. Khi liên kết này còn nguyên, MMP không



hoạt động. Các MMP hoạt động khi liên kết Zn2+ với cystein bị phá vỡ. Cơ chế này

được đề cập như là “sự chuyển đổi cystein”. Một phân tử nước đi vào liên kết với

ion Zn2+ thay thế cystein sau khi phân ly khiến enzyme chuyển thành dạng hoạt

động. Sau đó, vùng pro-peptide của các MMP được loại bỏ bằng cách tự cắt hay

nhờ protease khác, quá trình này làm giảm 8-10 kDa của phân tử để trở thành dạng

hoàn chỉnh như hình 1.3 [55].

Pro-MMP không hoạt tính Pro-MMP có hoạt tính Dạng hoạt động MMPs

Hình 1.3. Sơ đồ hoạt hóa pro-MMP [55]

Trong kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-Polyacrylamide

gel electrophoresis, SDS-PAGE), dạng pro-MMP vẫn có hoạt tính như dạng hoạt

động vì SDS đã phá vỡ liên kết Cystein-Zn làm cho phân tử MMP lộ ra trung tâm

hoạt động mặc dù đoạn pro-peptide không bị loại bỏ do không có các

endoproteinase để cắt bỏ đoạn pro [44].

1.2.3. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase

Các MMP đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm suy thoái chất nền

ngoại bào được biết đến như hàng rào bảo vệ tế bào khỏi vi sinh vật, các MMP có

khả năng tái cấu trúc collagen, gelatin, elastin và casein. Ngoài ra, chúng còn tham

gia phân tách thụ thể bề mặt tế bào, giải phóng các phối tử của chết theo chu trình

và bất hoạt chemokine/cytokine. Trong ung thư, Các MMP đóng vai trò quan trọng

trong các quá trình tăng sinh, xâm lấn, biệt hóa, chết theo chu trình, hình thành

mạch và bảo vệ vật chủ (bảng 1.3) [51].



Bảng 1.3. Chức năng của một số MMP [20]

MMP Hoạt động Ảnh hưởng

Sự xâm lấn của tế bào ung thư

MT1-MMP, MMP2,

MMP9 và nhiều loại

khác

Phân giải protein Làm suy giảm hàng

rào bảo vệ vật lý

Tăng sinh tế bào ung thư

MMP-1, -2, -3, -7, -9, -

11, -19.

Phân cắt IGF-BP Tăng sinh tế bào

MMP-3, -7

Phát tán các phối tử bám màng của

EGFR (HB-EGF, TGF-a và

amphiregulin)

MMP-2, -9, -14 Hoạt hóa TGF-β

MMP-7 (CD44) Phát tán của HB-EGF

Chết theo chương trình

MMP-7 Phân cắt phối tử Fas Ngăn chặn

apoptosis Nhiều loại MMP (bao

gồm cả MMP-2 và -9)

Gián tiếp hoạt hóa của Akt thông

qua hoạt hóa EGFR và IGFR

Sinh mạch của khối u

Nhiều loại MMP (bao

gồm MMP-2, -9 MMP-

3, -10, -11 MMP-1, -8, -

13)

Thủy phân COL-IV, perlecan; giải

phóng VEGF và bFGF

Tăng sự hình thành

mạch

Thủy phân COL-IV, COL-XVIII,

perlecan; tạo ra tumstatin,

endostatin, angiostatin và

endorepellin

Giảm sự sinh mạch

Kết dính, di cư và chuyển hóa biểu mô thành trung mô của tế bào

MMP-2 Phân hủy COL IV, hình thành các

peptide lạ

Thúc đẩy xâm lấn

MT1-MMP Phân hủy laminin-5 Cảm ứng của EMT

di chuyển tế bào



MMP-2, -3, -9, -13, -14 Biểu hiện quá mức, liên quan đến

EMT

Cảm ứng mạnh mẽ

của EMT

MMP-1, -7 Giải phóng E-cadherin Xâm lấn tế bào

MMP-28 Kích hoạt phân giải protein của

TGF-β

Giám sát miễn dịch

MMP-9

Phát tán của thụ thể α-interleukin-

2 của tế bào lympho T

Ngăn chặn gia tăng

tế bào lympho T

MMP-9, -2, -14 Giải phóng TGF-b đã hoạt hóa Ngăn chặn phản

ứng của tế bào

lympho T chống lại

tế bào ung thư

MMP-7, -11, -1, -8, -3 Giải phóng các chất ức chế a1-

proteinase

Giảm độ nhạy cảm

của tế bào ung thư

với tế bào giết NK

MMP-7, -8 Phân cắt chemokine α và β Ảnh hưởng đến

bạch cầu và liên

quan đến xâm lấn

Chú giải: EGFR: Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor receptor), EMT:

quá trình chuyển dạng trung - biểu mô (epithelial-mesenchymal transitions), TGF: nhân tố sinh

trưởng chuyển hóa (Transforming growth factor), HB-EGF: yếu tố tăng trưởng thượng bì có gắn

heparin (Heparin-binding EGF-like growth factor)

Theo Gialeli và cộng sự (cs): MMP-2 và MMP-9 có mặt trong tất cả các vai

trò của MMP trong ung thư như: xâm lấn, tăng sinh, chết theo chu trình, sinh mạch,

giám sát miễn dịch và chuyển dạng tế bào. Qua đó, thấy được sự đa dạng về vai trò

của MMP-2 và MMP-9 trong các quá trình thúc đẩy tiến triển của khối u [20].



1.3. Tình hình nghiên cứu MMP trong ung thư đại trực tràng

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Với sự đa dạng và phong phú về số con đường mà các MMP tham gia vào,

các nhà nghiên cứu đã và đang tìm kiếm sự biểu hiện khác biệt của các MMP trong

các bệnh ung thư nói chung và UTĐTT nói riêng. Cho đến nay, trên thế giới đã có

nhiều công bố về kết quả nghiên cứu các MMP ở bệnh nhân ung thư nói chung và

UTĐTT nói riêng.

Với mục tiêu nghiên cứu so sánh ý nghĩa lâm sàng của MMP-9 trong huyết

thanh với TIMP-1 trong chẩn đoán UTĐTT và sự khác biệt giữa polyp thường với

mô UTĐTT, Mroczko và cs đã sử dụng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết

enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) để định lượng MMP-9 và

TIMP-1 trong huyết thanh của 75 bệnh nhân UTĐTT, 35 polyp thường và 70 người

khỏe mạnh. Bên cạnh đó, nồng độ kháng nguyên ung thư CEA và CA 19-9 được

định lượng bằng kỹ thuật miễn dịch enzyme vi hạt (microparticle enzyme

immunoassay). Qua đó, cho thấy mức độ biểu hiện của MMP-9 trong huyết thanh

của bệnh nhân UTĐTT cao hơn rõ rệt với nhóm khỏe mạnh. Bên cạnh đó, mức độ

biểu hiện TIMP-1 cũng cao hơn ở mô ung thư so với polyp tuyến. Ngoài ra, TIMP-1

cũng có liên quan với một số đặc điểm bệnh học lâm sàng như hạch di căn, di căn

xa, giai đoạn khối u (T), tình trạng của bệnh nhân (còn sống và đã chết), tình trạng

của khối u (đã cắt bỏ, chưa cắt bỏ). Kết quả nghiên cứu này cũng cho rằng: TIMP-1

và MMP-9 khi kết hợp với nhau trong chẩn đoán sẽ cho độ nhạy cao hơn các chỉ thị

sinh học CEA và CA19-9 [41].

Daniele và cs đã tiến hành nghiên cứu trên 50 bệnh nhân ung thư vú và 34

người khỏe mạnh bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trên mẫu mô và điện di hoạt tính

enzyme với mẫu huyết thanh. Kết quả thu được cho thấy: các gelatinase biểu hiện

cao rõ rệt trong bệnh nhân ung thư vú di căn so với không di căn và nhóm chứng

trên cả mẫu mô và huyết thanh. Thêm vào đó, kết quả nghiên cứu cho rằng: MMP-9



có tương quan với CA 15.3 và độ mô học. Kết quả này gợi ý rằng: MMP-2 và

MMP9 như dấu hiệu của sự phát triển, xâm lấn và di căn ở ung thư vú [13].

Công bố năm 1999 của Adachi và cs dựa trên 83 mẫu mô của bệnh nhân

UTĐTT, trong đó 5 mẫu mô được lấy từ bệnh nhân đã di căn sang gan. Bằng

phương pháp hóa mô miễn dịch và điện di xác định hoạt tính enzyme trên gel

polyacrylamide có bổ sung casein, kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy: có

46% mẫu mô trong 83 mẫu và hơn 10% tế bào ung thư được nhuộm dương tính với

MMP-7 và sự biểu hiện tăng của MMP-7 có liên quan với sự có mặt của hạch di căn

và di căn xa (p<0,05). Thêm vào đó, kết quả điện di xác định hoạt tính enzyme trên

gel polyacrylamide có bổ sung casein cho thấy sự biểu hiện của MMP-7 có liên

quan đến sự xâm lấn và di căn của khối u (p<0,001) [3].

Shiozawa và cs đã cho thấy sự biểu hiện của enzyme MMP-1 ở bệnh nhân

UTĐTT. Mẫu nghiên cứu gồm: 20 bệnh nhân có khối u tuyến và 142 bệnh nhân ung

thư biểu mô tuyến. Kết quả nghiên cứu cho thấy MMP-1 không biểu hiện trong 20

mẫu khối u tuyến nhưng lại biểu hiện trong 108/142 mẫu ung thư biểu mô tuyến

(76,1%). Cùng với phân tích đặc điểm bệnh học, nhóm nghiên cứu đã nhận định

mức độ xâm lấn, bộc lộ hạch lympho và di căn tăng lên theo mức độ biểu hiện của

MMP-1 [53].

Leeman và cs đã tiến hành nghiên cứu về MMP-13 trên 249 mẫu UTĐTT

được cố định bằng formalin và đúc với parafin bằng phương pháp nhuộm hóa mô

miễn dịch. Mặt khác, nhóm tác giả còn dùng phương pháp điện di trên gel

polyacrylamide có bổ sung cơ chất gelatin đối với 10 bệnh nhân thuộc giai đoạn

Duke C và mẫu mô bình thường. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng 91% số mẫu có

MMP-13 được tìm thấy trong tế bào chất của tế bào ung thư. Đồng thời, nghiên cứu

cho thấy có mối liên hệ giữa kết quả nhuộm hóa mô MMP-13 cao với khả năng

sống sót thấp của bệnh nhân [36].

Waas và cs đã tiến hành nghiên cứu trên 73 cặp mẫu (mô u và mô thường) và

33 mẫu mô lân cận u lấy từ bệnh nhân UTĐTT bằng phương pháp điện di và phân



tích hoạt tính sử dụng phương pháp huỳnh quang. Kết quả cho thấy, tại mô u mức

độ hoạt động của cả dạng hoạt động và tiền hoạt động của MMP-2 và -9 cao hơn so

với mô thường. Thêm vào đó, tỷ lệ giữa dạng hoạt động và tiền hoàn động của

MMP-2 và -9 cũng có sự khác biệt trong từng loại mô (mô u, lân cận u và thường).

Ngoài ra, MMP-2 và proMMP-2 có tương quan nghịch với giai đoạn bệnh, khối u

chưa có với có di căn xa. Đối với proMMP-9, mức độ hoạt động chỉ phụ thuộc vào

vị trí khối u. Từ đó, nhóm tác giả cho rằng có sự khác biệt giữa vai trò của MMP-2

và -9 trong sự phát triển của khối u [60].

Bằng các kỹ thuật phản ứng khuếch đại chuỗi phiên mã ngược (reverse

transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), hóa mô miễn dịch và định lượng

bằng ELISA, Tutton và cs công bố kết quả phân tích 48 mẫu mô u và 13 polyp

thường. Cùng với đó là sự phân tích nồng độ MMP-2 và -9 trong mẫu huyết tương

từ các bệnh nhân trên và thêm 36 bệnh nhân khác bằng phương pháp ELISA tại 2

thời điểm trước và sau phẫu thuật từ 6-12 tháng. Kết quả phân tích ELISA trên mẫu

mô u và polyp thường cho thấy: MMP-2 và -9 biểu hiện tăng đáng kể trong mô u.

Đối với mẫu huyết tương, MMP-2 và -9 biểu hiện cao hơn ở trong mẫu máu trước

mổ. Từ những kết quả trên, nhóm nghiên cứu kết luận rằng mức độ biểu hiện của

các enzyme MMP-2 và MMP-9 có tiềm năng là chỉ thị cho giai đoạn bệnh UTĐTT

[57].

Groblewska và cs công bố kết quả nghiên cứu trên mẫu mô và mẫu huyết

thanh lấy từ 72 bệnh nhân UTĐTT và 68 người bình thường. Hàm lượng MMP-2 và

chất ức chế MMP-2 (TIMP-2) trong huyết thanh được định lượng bằng kỹ thuật

ELISA. Bên cạnh đó, mức độ biểu hiện của MMP-2 và TIMP-2 trong các tế bào

ung thư, tế bào viêm khe và tế bào lân cận niêm mạc ĐTT bình thường được xác

định bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Kết quả cho thấy, nồng độ

MMP-2 và TIMP-2 trong huyết thanh của nhóm người bệnh thấp hơn trong nhóm

người bình thường nhưng tỷ lệ phản ứng miễn dịch của MMP-2 và TIMP-2 trong

những tế bào ung thư, tế bào viêm lại cao hơn trong nhóm tế bào bình thường. Kết



quả này gợi ý rằng MMP-2 và TIMP-2 có liên quan đến quá trình xâm lấn và di căn

của UTĐTT [25].

Dragutinović và cs công bố kết quả phân tích 32 bệnh nhân UTĐTT và 11 ca

u lành làm đối chứng. Bằng phương pháp phân tích hóa mô miễn dịch và điện di

hoạt tính enzyme cho thấy: mức độ biểu hiện của MMP-2 và MMP-9 trong huyết

thanh của bệnh nhân UTĐTT có tỷ lệ cao hơn đáng kể so với ở trong huyết thanh

của nhóm chứng [16].

Như vậy, các phương pháp tiếp cận các MMP trong UTĐTT thường sử

dụng: hóa mô miễn dịch, điện di hoạt tính enzyme, ELISA và RT-PCR.

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải đã công bố nghiên cứu đa hình

nucleotide đoạn điều khiển của gen MMP-2 ở một số bệnh nhân ung thư vòm mũi

họng (UTVMH). Kết quả nghiên cứu trên mẫu sinh thiết của 9 bệnh nhân UTVMH

và 3 người khỏe mạnh đã chỉ ra rằng ngoài biến đổi C1306T đã được công bố trên

ngân hàng dữ liệu gen, còn thấy xuất hiện 4 biến đổi khác như: T1235C, T1339C,

T1440C, T1456C chưa được công bố trên bất kì tài liệu nào. Nhóm nghiên cứu này

nhận định rằng đây có thể là một trong những đa hình trên promoter của gen MMP-

2 của bệnh nhân UTVMH ở Việt Nam dẫn đến sự thay đổi mức độ biểu hiện của

gen MMP-2, một trong những yếu tố liên quan đến sự xâm lấn và di căn của ung

thư [2].

Phan Thị Phi Phi và cs đã tiến hành nghiên cứu xác định sự biểu hiện MMP-

2 và TIMP-2 bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch trên 83 mẫu sinh thiết

của bệnh nhân UTVMH, đồng thời tìm hiểu mối liên quan về mức độ biểu hiện của

các protein này với đặc điểm bệnh học lâm sàng, thời gian sống sót và tỷ lệ tử vong

trong UTVMH. Kết quả nghiên cứu cho thấy: có 86,7% các trường hợp có biểu hiện

MMP-2, trong đó, 22,9% MMP-2 biểu hiện tăng ở bệnh nhân UTVMH. Đồng thời,

có 85,5% các trường hợp có biểu hiện TIMP-2 và 16,7% trường hợp biểu hiện mức

độ mạnh. Số liệu phân tích thống kê cho thấy, biểu hiện tăng của MMP-2 và TIMP-



2 có liên quan đến việc tăng di căn hạch cổ, giai đoạn lâm sàng, tăng tỷ lệ tử vong

và giảm thời gian sống trong UTVMH (p < 0,05), tuy nhiên, chưa tìm thấy mối liên

quan giữa mức độ biểu hiện của MMP-2 và TIMP-2 tại mô sinh thiết ở các giai

đoạn T khác nhau. Kết quả này cho thấy sự tăng mức độ biểu hiện của MMP-2 và

TIMP-2 có thể coi là yếu tố tiên lượng xấu trong UTVMH [1].

Tô Vân Anh và cs đã công bố nghiên cứu đa hình promotor -1306C>T của

MMP-2 trên 120 bệnh nhân UTĐTT và 60 mẫu máu người khỏe mạnh bằng

phương pháp PCR-RFLP. Kết quả cho thấy: tỷ lệ biến đổi -1306C>T thấp hơn ở

bệnh nhận UTĐTT so với nhóm đối chứng (13,6% < 21,7%). Bên cạnh đó, nghiên

cứu này cũng chỉ ra tỷ lệ kiểu gen CT trong mô đại tràng ít hơn trực tràng (p<0,05).

Hơn thế nữa, tỷ lệ kiểu gen CT giảm khi kích thước khối u tăng lên (p<0,05).

Những phát hiện này đã cho thấy tiềm năng của đa hình -1306C>T trong xác định

nhóm người có nguy cơ cao mắc UTĐTT [59].

Đến nay, những nghiên cứu tại Việt Nam có ít công bố về kết quả nghiên

cứu các enzyme MMP tại các vị trí mô khác nhau và các thời điểm lấy máu ở bệnh

nhân UTĐTT. Vậy nên, đề tài “Hoạt tính của protease kim loại (MMP-2, MMP-9) ở

bệnh nhân ung thư đại trực tràng trước và sau phẫu thuật” được tiến hành nghiên

cứu nhằm đánh giá biểu hiện của enzyme MMP-2 và MMP-9 trên mô thường, mô

lân cận u, mô u và các mẫu huyết tương trước và sau phẫu thuật của bệnh nhân

UTĐTT người Việt Nam.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Nguyễn Thị Ngọc Hà, Phan Thị Phi Phi, Nông Văn Hải (2008), "Đa hình

Nucleotide đoạn điều khiển của Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) ở một

số bệnh nhân ung thư vòm mũi họng", Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(2), tr.

145-151.

2. Nguyễn Thị Ngọc Hà, Tạ Văn Tờ, Phan Thị Phi Phi (2010), "Vai trò của

Matrix Metalloproteinase-2 và yếu tố ức chế mô (Tissue inhibitor of

metalloproteinase-2) trong lâm sàng bệnh ung thư vòm mũi họng", Tạp chí Y

học TP.Hồ Chí Minh, 14(4), tr. 115-122.

Tài liệu tiếng Anh

3. Adachi Y., Yamamoto H., Itoh F., Hinoda Y., Okada Y., Imai K. (1999),

"Contribution of matrilysin (MMP-7) to the metastatic pathway of human

colorectal cancers", Gut, 45(2), pp. 252–258.

4. AJCC Cancer Staging Manual 7th editions (2010), Springer, NewYork.

5. Alizadeh A. M., Shiri S., Farsinejad S. (2014), "Metastasis review: from

bench to bedside", Tumor Biol, 35(9), pp. 8483–8523.

6. Baker E. A., Bergin F. G., Leaper D. J. (2000), "Matrix metalloproteinases,

their tissue inhibitors and colorectal cancer staging", Br J Surg, 87(9), pp.

1215–1221.

7. Bast R. C., Bates S., Bredt A. B., Desch C. E., Fritsche H., Fues L., Hayes D.

F., Kemeny N. E., Kragen M., Jessup J., Locker G. Y., Macdonald J. S.,

Mennel R. G., Norton L., Ravdin P., Smith T. J., Taube S., Winn R. J.

(1996), “Clinical practice guidelines for the use of tumor markers in breast

and colorectal cancer”, J Clin Oncol, 14(10), pp. 2843-2877.



8. Bernardo M. M., Fridman R. (2003), "TIMP-2 (tissue inhibitor of

metalloproteinase-2) regulates MMP-2 (matrix metalloproteinase-2) activity

in the extracellular environment after pro-MMP-2 activation by MT1

(membrane type 1)-MMP", Biochem J, 374(3), pp. 739–745.

9. Botteri E., Iodice S., Bagnardi V., Raimondi S., Lowenfels A. B.,

Maisonneuve P. (2008), "Smoking and colorectal cancer: a meta-analysis",

Jama, 300(23), pp. 2765–2778.

10. Bradford M. M. (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye

binding", Anal Biochem, 72(1–2), pp. 248–254.

11. Cancer Facts & Figures 2016 (2016), American Cancer Society, Atlanta.

12. Cancer Trends Progress Report (2015), National Cancer Institute, National

Institutes of Health, Department of Health and Human Services, Bethesda.

13. Daniele A., Zito A. F., Giannelli G., Divella R., Asselti M., Mazzocca A.,

Paradiso A., Quaranta M. (2010), "Expression of metalloproteinases MMP-2

and MMP-9 in sentinel lymph node and serum of patients with metastatic

and non-metastatic breast cancer", Anticancer Res, 30(9), pp. 3521–3527.

14. Dawson D. G., Edelhauser H. F., Grossniklaus H. E. (2005), “Long-term

histopathologic findings in human corneal wounds after refractive surgical

procedures”, Am J Ophthalmol, 139(1), pp. 168–178.

15. Dollery C. M., Libby P. (2006), "Atherosclerosis and proteinase activation",

Cardiovasc Res, 69(3), pp. 625–635.

16. Dragutinović V. V, Radonjić N. V, Petronijević N. D., Tatić S. B.,

Dimitrijević I. B., Radovanović N. S., Krivokapić Z. V (2011), "Matrix

metalloproteinase-2 (MMP-2) and-9 (MMP-9) in preoperative serum as

independent prognostic markers in patients with colorectal cancer", Mol Cell

Biochem, 355(1–2), pp. 173–178.



17. Emmert-Buck M. R., Emonard H., Corcoran M. L., Krutzsch H. C., Foidart

J.-M., Stetler-Stevenson W. G. (1995), "Cell surface binding of TIMP‐2 and

pro‐MMP‐2/TIMP‐2 complex", FEBS Lett, 364(1), pp. 28–32.

18. Fanjul-Fernández M., Folgueras A. R., Cabrera S., López-Otín C. (2010),

"Matrix metalloproteinases: evolution, gene regulation and functional

analysis in mouse models", Biochim Biophys Acta, 1803(1), pp. 3–19.

19. Filella X., Molina R., Grau J. J., Pique J. M., Garcia-Valdecasas J. C.,

Astudillo E., Biete A., Bordas J. M., Novell A.,& Campo E. (1992),

"Prognostic value of CA 19.9 levels in colorectal cancer", Ann Surg, 216(1),

pp. 55.

20. Gialeli C., Theocharis A. D., Karamanos N. K. (2011), "Roles of matrix

metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological

targeting", FEBS J, 278(1), pp. 16–27.

21. Gimeno-García A. Z., Triñanes J., Quintero E., Salido E., Nicolás-Pérez D.,

Adrián-de-Ganzo Z., Alarcón-Fernández O., Abrante B., Romero R., Carrillo

M. (2015), "Plasma matrix metalloproteinase 9 as an early surrogate

biomarker of advanced colorectal neoplasia", Gastroenterol Hepatol, 39(7),

pp. 433-441.

22. Goldberg G. I., Strongin A., Collier I. E., Genrich L. T., Marmer B. L.

(1992), "Interaction of 92-kDa type IV collagenase with the tissue inhibitor

of metalloproteinases prevents dimerization, complex formation with

interstitial collagenase, and activation of the proenzyme with stromelysin.",

Biochem J, 267(7), pp. 4583–4591.

23. Gong Y., Scott E., Lu R., Xu Y., Oh W. K., Yu Q. (2013), "TIMP-1

promotes accumulation of cancer associated fibroblasts and cancer

progression", PLoS One, 8(10), pp. e77366.



24. Gonzalez C. A., Riboli E. (2010), "Diet and cancer prevention: Contributions

from the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition

(EPIC) study", Eur J Cancer, 46(14), pp. 2555–2562.

25. Groblewska M., Mroczko B., Gryko M., Pryczynicz A., Guzińska-

Ustymowicz K., Kędra B., Kemona A., Szmitkowski M. (2014), "Serum

levels and tissue expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) and

tissue inhibitor of metalloproteinases 2 (TIMP-2) in colorectal cancer

patients", Tumor Biol, 35(4), pp. 3793–3802.

26. Heussen C., Dowdle E. B. (1980), “Electrophoretic analysis of plasminogen

activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and

copolymerized substrates”, Anal Biochem, 102, pp. 196–202.

27. Hofmann U. B., Westphal J. R., Waas E. T., Zendman A. J., Cornelissen I.

M., Ruiter D. J., Muijen G. N. (1999), “Matrix metalloproteinases in human

melanoma cell lines and xenografts: increased expression of activated matrix

metalloproteinase-2 (MMP-2) correlates with melanoma progression” Br J

Cancer, 81, pp. 774–782.

28. Hua H., Li M., Luo T., Yin Y., Jiang Y. (2011), "Matrix metalloproteinases

in tumorigenesis: an evolving paradigm", Cell Mol Life Sci, 68(23), pp.

3853–3868.

29. Huxley R. R., Ansary‐Moghaddam A., Clifton P., Czernichow S., Parr C.

L.,& Woodward M. (2009), "The impact of dietary and lifestyle risk factors

on risk of colorectal cancer: a quantitative overview of the epidemiological

evidence", Int J Cancer, 125(1), pp. 171–180.

30. Kim E. Y., Song H. Y., Kim J. C., Yoon Y. S., Ye B. D., Nam D. H., Shin

S.-J. (2014), "Mmp-9 expression after metallic stent placement in patients

with colorectal cancer: association with in-stent restenosis", Radiology,

271(3), pp. 901–908.



31. Kobayashi T., Hattori S., Shinkai H. (2003), "Matrix metalloproteinases-2

and-9 are secreted from human fibroblasts", Acta Derm Venereol, 83(2), pp.

105–107.

32. Kondratiev S., Gnepp D. R., Yakirevich E., Sabo E., Annino D. J., Rebeiz E.,

Laver N. V (2008), "Expression and prognostic role of MMP2, MMP9,

MMP13, and MMP14 matrix metalloproteinases in sinonasal and oral

malignant melanomas", Hum Pathol, 39(3), pp. 337–343.

33. Krejner A., Litwiniuk M., Grzela T. (2016), "Matrix metalloproteinases in

the wound microenvironment: therapeutic perspectives", Dove Med Press,

2016(3), pp. 29-39.

34. Langenskiöld M., Holmdahl L., Falk P., Ivarsson M.-L. (2005), "Increased

plasma MMP-2 protein expression in lymph node-positive patients with

colorectal cancer", Int J Colorectal Dis, 20(3), pp. 245–252.

35. Lansdorp-Vogelaar I., Kuntz K. M., Knudsen A. B., van Ballegooijen M.,

Zauber A. G., Jemal A. (2012), "Contribution of screening and survival

differences to racial disparities in colorectal cancer rates", Cancer Epidemiol

Biomarkers Prev, 21(5), pp. 728–736.

36. Leeman M. F., McKay J. A., Murray G. I. (2002), "Matrix metalloproteinase

13 activity is associated with poor prognosis in colorectal cancer", J Clin

Pathol, 55(10), pp. 758–762.

37. Li B. H., Zhao P., Liu S. Z., Yu Y. M., Han M., Wen J. K. (2005), "Matrix

metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in colorectal

carcinoma invasion and metastasis", World J Gastroenterol, 11(20), pp.

3046.

38. Liabakk N.-B., Talbot I., Smith R. A., Wilkinson K., Balkwill F. (1996),

"Matrix metalloprotease 2 (MMP-2) and matrix metalloprotease 9 (MMP-9)

type IV collagenases in colorectal cancer", Cancer Res, 56(1), pp. 190–196.



39. Meyerhardt J. A., Giovannucci E. L., Holmes M. D., Chan A. T., Chan J. A.,

Colditz G. A.,& Fuchs C. S. (2006), "Physical activity and survival after

colorectal cancer diagnosis", J Clin Oncol, 24(22), pp. 3527–3534.

40. Moskal A., Norat T., Ferrari P.,& Riboli E. (2007), "Alcohol intake and

colorectal cancer risk: A dose–response meta‐analysis of published cohort

studies", Int J Cancer, 120(3), pp. 664–671.

41. Mroczko B., Groblewska M., Okulczyk B., Kędra B., Szmitkowski M.

(2010), "The diagnostic value of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) and

tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 1 (TIMP-1) determination in the

sera of colorectal adenoma and cancer patients", Int J Colorectal Dis, 25(10),

pp. 1177–1184.

42. Murnane M. J., Cai J., Shuja S., McAneny D., Klepeis V., Willett J. B.

(2009), "Active MMP‐2 effectively identifies the presence of colorectal

cancer", Int J Cancer, 125(12), pp. 2893–2902.

43. Nagase H., Visse R., Murphy G. (2006), "Structure and function of matrix

metalloproteinases and TIMPs", Cardiovasc Res, 69(3), pp. 562–573.

44. Oliver G. W., Leferson J. D., Stetler-Stevenson W. G., Kleiner D. E. (1997),

"Quantitative reverse zymography: analysis of picogram amounts of

metalloproteinase inhibitors using gelatinase A and B reverse zymograms",

Anal Biochem, 244(1), pp. 161–166.

45. Oviedo-Orta E., Bermudez-Fajardo A., Karanam S., Benbow U., Newby A.

C. (2008), "Comparison of MMP-2 and MMP-9 secretion from T helper 0, 1

and 2 lymphocytes alone and in coculture with macrophages", Immunology,

124(1), pp. 42–50.

46. Oxidative Stress in Surgery (2014), In Systems Biology of Free Radicals and

Antioxidants, Springer, Berlin.



47. Parsons S. L., Watson S. A., Collins H. M., Griffin N. R., Clarke P. A., Steele R.

J., (1998) “Gelatinase (MMP-2 and-9) expression in gastrointestinal

malignancy”, Br J Cancer, 78(11), 1495-1502.

48. Pittayapruek P., Meephansan J., Prapapan O., Komine M., Ohtsuki M.

(2016), "Role of Matrix Metalloproteinases in Photoaging and

Photocarcinogenesis", Int J Mol Sci, 17(6), pp. 868-872.

49. Potter J. (1996), “Nutrition and Colorectal Cancer”, Cancer Cause Control,

7(1), pp. 127–46.

50. Roderfeld M., Graf J., Giese B., Salguero-Palacios R., Tschuschner A.,

Müller-Newen G., Roeb E. (2007), "Latent MMP-9 is bound to TIMP-1

before secretion", Biol Chem, 388(11), pp. 1227–1234.

51. Sankari S. L., Krupaa R. J., Kumar G. M. K., Balachander N. (2016), "MMP-

Matrix Metalloproteinase", Biomed Pharmacol J, 9(2), pp. 885–888.

52. Sela-Passwell N., Rosenblum G., Shoham T., Sagi I. (2010), "Structural and

functional bases for allosteric control of MMP activities: can it pave the path

for selective inhibition?", Biochim Biophys Acta, 1803(1), pp. 29–38.

53. Shiozawa J., Ito M., Nakayama T., Nakashima M., Kohno S., Sekine I.

(2000), "Expression of matrix metalloproteinase-1 in human colorectal

carcinoma", Mod Pathol, 13(9), pp. 925–933.

54. Smith R. A., von Eschenbach A. C., Wender R., Levin B., Byers T.,

Rothenberger D., Brooks D., Creasman W., Cohen C., Runowicz C. (2001),

"American Cancer Society guidelines for the early detection of cancer:

update of early detection guidelines for prostate, colorectal, and endometrial

cancers: Also: update 2001—testing for early lung cancer detection", CA

Cancer J Clin, 51(1), pp. 38–75.



55. Snoek-van Beurden P.A., Von den Hoff J.W. (2005), “Zymographic

techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors”,

BioTechniques, 38(1), pp.73-83.

56. Spinale F. G. (2011), "Diversity of Myocardial Interstitial Proteolytic

Pathways Gene Deletion Reveals Unexpected Consequences", Circulation,

124(19), pp. 2052–2055.

57. Tutton M. G., George M. L., Eccles S. A., Burton S., Swift R. I., Abulafi A.

(2003), "Use of plasma MMP‐2 and MMP‐9 levels as a surrogate for tumour

expression in colorectal cancer patients", Int J Cancer, 107(4), pp. 541–550.

58. Väisänen A. H., Kallioinen M., Turpeenniemi-Hujanen T. (2008),

"Comparison of the prognostic value of matrix metalloproteinases 2 and 9 in

cutaneous melanoma", Hum Pathol, 39(3), pp. 377–385.

59. Van To A. T., Bui T. P., Vu H. T., Ngo N. T., Le P. L., Pham B. T., Trinh, T.

H. (2016), “The-1306C> T Polymorphism in the Promoter Region of matrix

metalloproteinase (MMP)-2 Gene in Colorectal Cancer Patients”, VNU

Journal of Science: Natural Sciences and Technology, 32(1), pp. 14-20.

60. Waas E. T., Lomme R., DeGroot J., Wobbes T., Hendriks T. (2002), "Tissue

levels of active matrix metalloproteinase-2 and-9 in colorectal cancer", Br J

Cancer, 86(12), pp. 1876–1883.

61. Wei E. K., Giovannucci E., Wu K., Rosner B., Fuchs C. S., Willett W. C.,&

Colditz G. A. (2004), "Comparison of risk factors for colon and rectal

cancer", Int J Cancer, 108(3), pp. 433–442.

62. Yabluchanskiy A., Ma Y., Iyer R. P., Hall M. E., Lindsey M. L. (2013),

"Matrix metalloproteinase-9: many shades of function in cardiovascular

disease", Physiology, 28(6), pp. 391–403.

63. Yin S., Bai H., Jing D. (2014), "Insulin therapy and colorectal cancer risk

among type 2 diabetes mellitus patients: a systemic review and meta-

analysis", Diagn Pathol, 9(1), pp. 1–6.



64. Zeng Z. S., Cohen A. M., Guillem J. G. (1999), "Loss of basement

membrane type IV collagen is associated with increased expression of

metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) during human colorectal

tumorigenesis", Carcinogenesis, 20(5), pp. 749–755.

65. Zhao T., Xia W. H., Zheng M. Q., Lu C. Q., Han X., Sun Y. J. (2008),

"Surgical excision promotes tumor growth and metastasis by promoting

expression of MMP-9 and VEGF in a breast cancer model", Exp Oncol,

30(1), pp. 60–64.

66. Zucker S., Drews M., Conner C., Foda H. D., DeClerck Y. A., Langley K.

E., Bahou W. F., Docherty A. J. P., Cao J. (1998), "Tissue inhibitor of

metalloproteinase-2 (TIMP-2) binds to the catalytic domain of the cell

surface receptor, membrane type 1-matrix metalloproteinase 1 (MT1-

MMP)", Biochem J, 273(2), pp. 1216–1222.

Website

67. http://gco.iarc.fr/ ( 12/12/2016)

68. http://www.cancer.gov/(12/12/2016)

69. http://www.cancer.org/(28/12/2016)

Documents

HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9) Ở BỆNH …repository.vnu.edu.vn/bitstream/VNU_123/33519/1/01050003441(1).pdf · Phương và các bạn sinh viên làm việc