HPLC Primer

Bùi Đặng Thanh -1- Kỹ thuật sắc ký lỏng

Chương 1 - NHỮNG KHÁI NIỆM MỞ ĐẦU VỀ SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

1.1. Phân loại kỹ thuật sắc ký

Nguồn gốc của sắc ký lỏng bắt đầu vào đầu những năm 1900 có trong các nghiên cứu của nhà

thực vật học người Nga, Mikhail S. Tswett. Những nghiên cứu nổi tiếng của ông tập trung vào tách

các chất sắc tố trong lá cây, những sắc tố này được chiết từ thực vật nhờ dung môi.

Ông đã đổ đầy một cột thuỷ tinh với hạt nhồi. Ông đã tìm thấy hai loại vật liệu đặc trưng có ích

là phấn (canxi cacbonat) và alumina. Ông đã rót mẫu của mình (dung môi chiết mẫu thực vật đã qua

đồng thể hoá) vào trong cột. Khi “mẫu” được đưa xuống dọc theo cột nhờ trọng lực có thể thấy xuất

hiện những băng mầu khác nhau được tách ra do có một số di chuyển nhanh hơn số còn lại. Ông đã

mô tả mối liên quan của những tách biệt này, những băng mầu khác nhau với các chất khác nhau.

Ông đã tạo ra một phép tách sắc ký những hợp chất này dựa trên lực hút hoá học của một số hợp

chất với hạt (pha tĩnh). Một số hợp chất gắn vào hạt khi đang chảy xuống, trong khi đó những chất

khác gắn vào dung môi (pha động) sẽ di chuyển nhanh hơn. Quá trình này có thể được mô tả như

sau: Các hợp chất mẫu “phân bố” hay “phân chia” khác nhau giữa “pha động” đang di chuyển và

“pha tĩnh” tạo ra hiện tượng tách các chất. Tswett đặt tên quá trình là “chromatography” [từ Hy Lạp

“chroma” là mầu sắc và “graphy” là viết ra, nghĩa là “color writing” để mô tả thực nghiệm

“colorful”]. Ngày nay, sắc ký lỏng trong nhiều dạng khác nhau đã trở thành một trong những công

cụ mạnh mẽ nhất trong hoá học phân tích.

Cuối những năm 1930 và đầu những năm 1940 Martin và Syng đưa ra một dạng sắc ký lỏng-

lỏng bằng cách dùng silica gel làm vật liệu đỡ pha tĩnh trong môi trường nước, và dưới dạng lớp hạt

nhồi và nó được sử dụng để tách một số dạng acetyl amino acid. Họ đã công bố nghiên cứu của

mình vào năm 1941 và trong đó có đề nghị thay pha động chất lỏng bằng một loại khí phù hợp làm

tăng tốc độ dịch chuyển giữa hai pha và tạo ra hiệu quả tách cao hơn, từ đây khái niệm sắc ký khí ra

đời. Trong một công bố tương tự vào năm 1941, Martin và Synge đề nghị sử dụng hạt nhỏ và áp lực

cao trong sắc ký lỏng để cải thiện khả năng tách, mở đường cho sự phát triển sắc ký lỏng hiệu quả

cao.

“Do đó, sẽ đạt được H.E.T.P nhỏ nhất (hiệu quả cao nhất) nhờ sử dụng những hạt rất nhỏ và áp

lực cao khác nhau qua cột”.

Công bố của Martin đưa ra vào năm 1941 có tất cả các điều kiện để thu được cả hiệu quả cao

lẫn phân giải cao trên các cột LC hiện đại. Tuy nhiên, bất chấp những đề nghị của ông, mãi gần đến

những năm 1950, các khái niệm của ông mới có sự đơm hoa kết trái. Hoạt động của lĩnh vực sắc ký

lỏng bị lu mờ trong những năm 1950 do sự ra đời của sắc ký khí và do hàng loạt nỗ lực cải thiện cải

thiện kỹ thuật LC đã không thực hiện được cho đến khi sự phát triển của sắc ký khí gần như đã

hoàn tất vào giữa những năm 1960. Trở ngại chính đối với sự phát triển LC là thiếu các detector độ

nhạy cao, và nó vẫn là trở ngại cho đến khi A. Tiselius và D. Claesson phát triển detector chỉ số

khúc xạ vào năm 1942, gợi mở khả năng phát triển kỹ thuật LC hiệu quả cao.

Sắc ký lỏng có thể được thực hiện theo 3 cách cơ bản. Trong tất cả các

trường hợp đó thì “mẫu” đã hoà tan vào trong chất lỏng được chuyển lên

trên hoặc vào trong thiết bị, dụng cụ sắc ký nhờ dung môi.

Cách thứ nhất. Mẫu được “đặt” lên trên và sau đó chảy qua một lớp

mỏng các hạt sắc ký đã được cố định trên bề mặt đĩa thuỷ tinh. Mẫu xuất

hiện với mầu đen, nhưng hiện tại đã thành mầu vàng, đỏ và xanh. Cạnh

đáy của đĩa thuỷ tinh được đặt trong một dung môi. Dòng chảy tạo ra

bởi dung môi khuyếch tán qua lớp hạt khô (nhờ lực mao quản) di

chuyển lên trên đĩa thuỷ tinh. Cách này được gọi là sắc ký lớp mỏng

“Thin Layer Chromatography” (TLC).


Cách thứ 2. Mẫu được “điểm” lên trên giấy, dung môi được thêm vào để tạo ra dòng chảy. Cách

này được gọi là sắc ký giấy “Paper Chromatography”.

Cách thứ ba: Theo cách hiệu lực nhất này thì mẫu được đưa qua cột hoặc thiết bị có nạp hạt phù

hợp. Những hạt này được gọi là vật liệu nhồi sắc ký, pha tĩnh hay còn gọi là “chất hấp phụ”. Dung

môi chảy liên tục qua cột. Tại một điểm nào đó trong một thời điểm nào đó, một phép “tiêm” dung

dịch mẫu vào dòng dung môi được thực hiện, dòng dung môi này mang mẫu chạy qua cột. Trong

thực nghiệm của Tswett, các hợp chất trong trong mẫu có thể được tách nhờ di chuyển ở những tốc

độ riêng khác nhau qua thiết bị.

Khi dạng cột hoặc cartridge được sử dụng, có vài cách để tạo ra dòng chảy. Trọng lực hoặc chân

không có thể được sử dụng đối với dạng cột, dạng không được thiết kế để làm việc với áp lực. Điển

hình thì hạt dùng cho dạng cột có kích thước lớn hơn (>50 micron) và vì thế dễ tạo ra dòng chảy

hơn đối với cột thuỷ tinh (thực nghiệm của Tswett). Thêm vào đó các cột nhựa dưới hình dạng tang

xylanh có thể được nạp đầy hạt vật liệu nhồi và được dùng để thực hiện công việc tách mẫu. Kiểu

này được gọi là chiết pha rắn “Solid Phase Extraction ». Ở đây dụng cụ sắc ký còn được gọi là một

‘’Cartridge’’ được dùng với chân không để làm sạch mẫu rất phức tạp trước khi nó được đưa đi

phân tích thêm.

Chú ý đối với loại giấy đặc biệt này khả năng tách là

khác nhau. Mẫu có mầu sắc hoà trộn, một số được tách

và một số khác không được tách. Theo mô hình cơ bản

thì mẫu mầu “đen” có chứa mầu vàng, đỏ và xanh được

áp lên giấy. Chúng ta nhìn thấy một vòng trong mầu

xanh lá cây và một vòng tròn mầu đỏ. Giấy không tách

được mầu vàng và mầu xanh nước biển. Trong ví dụ

dưới cùng mẫu chỉ có mầu vàng và mầu xanh nước

biển. Chú ý giấy không tách hai mầu này. Ví dụ ở giữa

là mẫu chứa mầu đỏ và mầu xanh nước biển và chúng

đã được tách tốt. Có nhiều chọn lựa cho các nhà sắc ký

lựa chọn đáp ứng khả năng tách mong đợi

Để cải thiện năng lực tách, những hạt có kích

thước nhỏ hơn (<10 micron) được sử dụng.

Những hạt nhỏ như thế này gây ra trở kháng với

dòng chảy lớn hơn, dẫn đến cần áp lực cao hơn để

tạo ra dòng chảy dung môi. Cột và bơm được thiết

kế để chống lại áp lực cao. Khi áp lực được dùng

để tạo ra dòng dung môi chảy qua cột sắc ký cao

vừa phải thì được gọi là ‘’HPLC’’.

Sắc ký là một kỹ thuật tách và phân tích các chất

trong một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất

hoá học, vật lý và hoá lý của các chất trong những

điều kiện nhất định. Các tính chất đó có thể là:


- Tính chất hấp phụ,

- Tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion,

- Sự rây phân tử theo kích thước của chúng,

- Sự tạo phức và liên hợp phân tử

- Sự phân bố của các chất giữa hai pha không tan vào nhau,….

Kỹ thuật sắc ký có hai loại có tên gọi dựa theo trạng thái chất mẫu khi tiến hành sắc ký. Đó là loại

sắc ký khí và sắc ký lỏng. Trong kỹ thuật sắc ký lỏng lại được chia thành các nhóm sau:

- Sắc ký lỏng áp suất thường

- Sắc ký lỏng áp suất cao (HPLC) hay sắc ký cột áp suất cao

- Sắc ký lỏng siêu cao áp, hoặc siêu hiệu quả (UPLC)

Về tên gọi cho các kỹ thuật sắc ký lỏng, người ta cũng thường gọi HPLC là sắc ký lỏng hiệu quả cao

và UPLC là sắc ký lỏng siêu hiệu quả.

Nguyên bản thì tên “HPLC” dựa trên một thực tế là cần đế áp lực cao để tạo ra dòng chảy cho

sắc ký lỏng trong cột nhồi. Thời kỳ đầu các cấu kiện thiết bị chỉ có khả năng tạo ra áp lực 500 psi

(35 bar). Và vì thế nó được gọi là sắc ký lỏng cao áp High Pressure Liquid Chromatography

(HPLC). Đầu những năm 1970 đã có bước nhảy to lớn về công nghệ. Các thiết bị “HPLC” mới này

có thể đạt đến áp lực 6000 psi (400 bar). Với những đột phá liên tục về hiệu quả, tên gọi đã được

đổi thành sắc ký lỏng hiệu quả cao High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Bây giờ sắc

ký lỏng hiệu quả cao đã là một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong phân tích hoá học, với khả

năng tách, nhận diện và định lượng các hợp chất có mặt trong bất kỳ mẫu nào có thể được hoà tan

trong chất lỏng. Ngày nay kỹ thuật sắc ký lỏng đã có thể dễ dàng đạt đến khả năng tách và phát hiện

các chất ở dạng vết thấp đến cỡ phần nghìn tỷ “parts per trillion” (ppt). HPLC được dùng trên bất kỳ loại

mẫu nào như mẫu dược phẩm, thực phẩm, nutraceutical, mỹ phẩm, môi trường, y pháp và các chất hoá

học công nghiệp.

Bắt đầu từ năm 2004, những đột phá hơn nữa trong công nghệ thiết bị và cột tách đã gia tăng

đáng kể độ phân giải (Resolution), tốc độ (Speed) và độ nhạy (Sensitivity) trong sắc ký lỏng. Cột

với kích thước hạt nhỏ (1.7 micron) và trang thiết bị được thiết kế để mang đến 15000 psi (1000

bar) cùng với những khả năng đặc biệt để đạt được một mức hiệu quả mới.

Công nghệ mới này được gọi là sắc ký lỏng siêu hiệu quả ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (công nghệ UPLC).

Với thành công này đã bật nảy ý nghĩ vào một thời điểm nào đó trong tương lai những nghiên

cứu cơ bản ngày nay đang được các nhà khoa học tiến hành sẽ đạt đến cột có kích thước hạt chỉ là 1

micron và thiết bị có khả năng làm việc ở áp lực 100000 psi (6800 bar).

Trong sắc ký cột rắn - lỏng, kỹ thuật sắc ký lỏng áp suất thường đã ra đời và được ứng dụng từ

lâu (trên 40 năm). Nhưng hiệu suất tách không cao, độ nhạy thấp và tốn nhiều thời gian cũng như

dung môi. Ngược lại kỹ thuật HPLC tuy ra đời muộn hơn nhưng hiện nay đã và đang phát triển rất

nhanh chóng, ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Vì kỹ thuật này có độ nhạy cao, hiệu suất

tách cao và tốn ít thời gian cũng như lượng mẫu. Nhìn chung trong thời gian vừa qua, kỹ thuật phân

tích HPLC (và thời gian gần đây có thêm sự xuất hiện của kỹ thuật UPLC) chiếm đến 70% trong

tổng số các công trình nghiên cứu và ứng dụng về sắc ký. Đặc biệt với sự phát triển như vũ bão của

kỹ thuật phân tích phổ khối, các kỹ thuật và phương pháp LC/MS đang được ứng dụng rất nhiều

trong lĩnh vực khoa học đời sống (nghiên cứu tìm kiếm thuốc, nghiên cứu chỉ thị sinh học, giải trình

tự và nhận diện protein,….)

Kỹ thuật HPLC lại bao gồm 2 nhóm:

- Sắc ký lớp mỏng áp suất cao (HPTLC),

- Sắc ký lỏng áp suất cao (HPLC),

Trong nhóm HPLC, tuỳ theo bản chất quá trình sắc ký của pha tĩnh trong cột tách người ta lại

chia thành:


1. Sắc ký phân bố (PC) của chất tan giữa 2 pha không trộn lẫn.

2. Sắc ký hấp phụ pha thường (NP-HPLC),

3. Sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC),

4. Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC),

5. Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC).

Trong 5 loại này thì loại thứ 5 chỉ dành cho các chất có phân tử lượng lớn hơn 2000 đơn vị oxy.

Một cách tổng quát chúng ta có minh hoạ trong sơ đồ hình 1.1.

Hình 1.1: Sự phân loại của HPLC

Sự phân chia trên đây là dựa theo tính chất của quá trình sắc ký, tất nhiên đây cũng chỉ là sự

phân chia tương đối. Vì trong nhiều trường hợp quá trình sắc ký xảy ra không phải chỉ theo một tính

chất (một cơ chế), mà đồng thời theo nhiều cơ chế. Ví dụ trong sắc ký cặp ion dùng chất hấp phụ

pha ngược Hypersil ODS để tách các đất hiếm, với pha động là methanol và nước thì sự tách lại xảy

ra theo cả cơ chế trao đổi ion và cơ chế hấp phụ pha ngược.

Mặt khác khi xem xét về trạng thái của pha tĩnh người ta lại chia thành:

- Sắc ký lỏng - lỏng (LLC).

- Sắc ký lỏng - rắn (LSC).

Ở đây trong hệ LLC thì pha tĩnh là chất lỏng, nó được giữ trong cột tách nhờ một chất mang trơ.

Chất mang trơ này thường là các silicagel trơ, ví dụ như Kiselgure của hãng Merck. Còn trong hệ

LSC thì pha tĩnh là một chất rắn, xốp và có cỡ hạt phổ biến từ 3 đến 10 m (đường kính). Ngày nay

với sự phát triển mạnh mẽ của nghành khoa học chế tạo vật liệu pha tĩnh tách sắc ký nói chung và

sắc ký lỏng nói riêng, cỡ hạt đã có thể hạ xuống 1,7m với hiệu quả tách sắc ký lỏng cao hơn nhiều

lần so với kích thước hạt phổ biến từ 3,5m trở lên (cả về độ nhạy, tốc độ và độ phân giải).

Cùng với pha tĩnh, trong kỹ thuật HPLC, các chất lỏng hay hỗn hợp các chất lỏng dùng để rửa

giải các chất phân tích trong quá trình sắc ký được gọi là pha động (MP). Pha động có thể chỉ là một

dung môi hữu cơ như methanol, acetonitril, butanol hay cũng có thể là hỗn hợp của 2 dung môi như

methanol và nước. Hoặc cũng có thể là dung môi có thêm các chất đệm, chất dẫn điện, chất tạo

phức,v…v…

Song song với kỹ thuật HPLC, kỹ thuật sắc ký khí cũng được phát triển và ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực. Đặc biệt là kỹ thuật sắc ký khí mao quản và sắc ký khí phân giải cao ghép nối khối

phổ, phổ hồng ngoại biến đổi fourier…. Các kỹ thuật này được giới thiệu trong các giáo trình về

SẮC KÝ KHÍ của các giáo sư Nguyễn Xuân Dũng và Phạm Hùng Việt (trường Đại học Khoa học

Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội - Việt Nam).

1.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC

Để thực hiện việc tách bằng kỹ thuật HPLC, chúng ta cần có các hệ thống trang bị về kỹ thuật

này. Một hệ thống trang bị HPLC cơ bản và đơn giản để làm việc được theo kỹ thuật HPLC cần có

Kỹ thuật HPLC Kỹ thuật UPLC

HPTLC HPLC

PC NP RP IE PC NP RP IE FG


6 bộ phận chính gồm hệ thống cung cấp pha động, bơm và chương trình pha động, van bơm mẫu,

cột phân tích, detector và cuối cùng là biểu diễn và xử lý kết quả.

1. Hệ thống cung cấp pha động: Hệ thống cung cấp pha động bao gồm một số các bình chứa

(dung tích 200 hoặc 1000 ml). Thông thường cần tối thiểu hai bình chứa được làm từ vật liệu thuỷ

tinh hoặc thép không gỉ và có lỗ hở thông với không khí. Tuy nhiên vật liệu thép không gỉ không

hợp với pha động đệm ở pH thấp và có chứa một số vật liệu nào đó có khả năng gây ăn mòn. Mỗi

bình chứa thường được lắp một bộ khuyếch tán khí qua đó có thể thổi He vào trong dung môi.

Nhiều dung môi và hỗn hợp dung môi (đặc biệt là các hỗn hợp chứa nước) có chứa lượng đáng kể

nitơ và oxy hoà tan từ không khí. Những khí này đi vào hệ thống sắc ký dưới dạng bọt gây ra ồn

detector và làm suy giảm hiệu quả cột. He là khí rất kém hoà tan trong hầu hết các loại dung môi,

nó thổi oxy và nitơ ra khỏi dung môi nhưng bản thân không tạo ra bọt trong hệ thống. Sử dụng chân

không với các bình chứa để loại bỏ khí hoà tan không phải là một giải pháp lâu dài, vào lúc nhả

chân không để cho dung môi đi qua bơm thì không khí lại hoà tan trở lại dung môi. Dung môi được

lọc qua bộ lọc thép không gỉ hoặc bộ lọc thuỷ tinh thiêu kết để loại bỏ bất kỳ chất ô nhiễm nào có

mặt ở dạng rắn. Tuỳ thuộc vào kiểu chương trình dung môi được sử dụng, dung môi từ mỗi bình

chứa có thể được đưa qua hoặc bơm hoặc thiết bị trộn có van. Bình chứa dung môi thường không

được điều nhiệt, nhưng khi cần thiết dung môi có thể được đưa qua cột nhiệt độ nhờ sử dụng một bộ

trao đổi nhiệt phù hợp. Bình chứa dung môi thường được đặt trong một hộp bao kín bảo vệ người

sử dụng khỏi phơi nhiễm với hơi dung môi độc hại (như cloroform hoặc các hydrocacbon thơm).

Những hộp bao kín như vậy cũng cách ly dung môi khỏi hơi ẩm khí quyển

2. Bơm cao áp và bộ chương trình gradient:

Bộ chương trình gradient

Có hai kiểu cơ bản của chương trình dung môi. Ở kiểu thứ nhất, dung môi trộn tại áp lực cao và

ở kiểu thứ hai dung môi trộn tại áp lực thấp và sau đó được đưa qua bơm. Chương trình áp lực cao

là đơn giản nhất nhưng cũng đắt tiền nhất vì mỗi dung môi yêu cầu một bơm riêng của nó. Về lý

thuyết có thể có bất kỳ số lượng dung môi nào có trong một chương trình pha động. Tuy nhiên hầu

hết các phép phân tích LC chỉ yêu cầu 2 dung môi, mặc dù vậy lên đến 4 dung môi vẫn có thể được

sử dụng. Cách bố trí của một hệ thống gradient áp lực cao như chỉ ra trong hình díi, trong ví dụ

này có đến 3 dung môi được trộn theo một chương trình phù hợp.

H×nh 1.2: Mét ch¬ng tr×nh gradient ¸p lùc cao

Dung môi từ mỗi bình chứa được đưa trực tiếp vào

một bơm rồi dẫn đến bộ trộn, từ đây hỗn hợp được

đưa qua van mẫu và cột. Hoạt động điều khiển các

bơm là theo chương trình hiện tại và thường điều

khiển bởi các môto bước. Thể tích phân phối mỗi

dung môi được điều khiển bởi tốc độ các bơm

tương ứng, tốc độ này được xác định chính xác

bằng tần số nguồn cấp năng lượng cho nó. Tần số

điều khiển này được tạo ra hoặc bằng các bộ dao

động ngoại vi hoặc nếu hệ thống sắc ký được điều

khiển máy tính thì sẽ là trực tiếp từ bản thân máy

tính.

Trong một chương trình áp lực thấp, dung môi từ

mỗi bình chứa được đưa qua một van dao động,

đầu ra từ mỗi van được nối đến bộ trộn. Sơ đồ

một chương trình dung môi áp lực thấp như chỉ ra

trong hình dưới.


H×nh 1.3: Mét ch¬ng tr×nh dung m«i ¸p lùc thÊp

Bơm sắc ký lỏng

Làm nhiệm vụ bơm pha động vào cột tách thực hiện quá trình tách sắc ký. Bơm này phải điều

chỉnh được áp suất (trước đây phổ biến các loại 0-400 bar tương đương 0-5600 psi; ngày nay đã có

các hệ thống bơm có dải áp suất làm việc từ 0-1070 bar tương đương 0-15000 psi). Cụ thể hơn có

các loại bơm đồng thể (isocratic) chỉ chuyên bơm một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi có thành

phần không đổi trong suốt quá trình tách sắc ký, bơm sau trộn dung môi hay còn có tên gọi khác là

bơm 4 bậc (quartenary), bơm đôi hay bơm trước khi trộn (binary), các loại bơm cao áp chuyên dụng

cho bơm ở tốc độ dòng nl/phút (bơm mao quản), bơm siêu áp (15000 psi). Trong lĩnh vực sắc ký

lỏng điều chế (preparation) có các loại bơm cho mục đích này, thường đều là các bơm dung tích lớn.

Có một số kiểu bơm khác nhau dung cho sắc ký lỏng có thể tạo ra áp lực và tốc độ dòng cần

thiết mà một hệ thống sắc ký lỏng hiện đại đòi hỏi. Trong những năm đầu thời kỳ của LC, có hai

kiểu bơm phổ biến được sử dụng. Đó là bơm chạy khí nén, đạt được áp lực cần thiết nhờ gián nở

khí nén, và bơm xylanh là một xylanh có cấu trúc lớn, đơn giản với một pittong được điều khiển

bằng moto. Ngày nay, phần lớn các hệ thống sắc ký hiện đại đều trang bị bơm chuyển động qua lại

với loại pittong hoặc loại màng chắn.

Bơm chạy bằng khí nén

B¬m ch¹y khÝ nÐn cã dung tÝch dßng lín h¬n nhiÒu so víi kiÓu b¬m pitt«ng. Nhng ngµy nay nã chØ ®îc sö dông chñ yÕu cho s¾c ký cét nhåi mµ kh«ng dïng cho ph©n tÝch nãi chung. B¬m ch¹y khÝ nÐn cã thÓ t¹o ra ¸p lùc cùc cao vµ t¬ng ®èi rÎ tiÒn. Nhng ®èi víi çc model cao ¸p nã g©y ra chót Ýt sù cång kÒnh vµ ë nh÷ng tèc ®é dßng cao nã cã thÓ kÐo theo c¶ lîng ®¸ng kÓ kh«ng khÝ nÐn. S¬ ®å mét b¬m ch¹y khÝ nÐn gièng nh h×nh díi:

H×nh 1.4: S¬ ®å b¬m ch¹y khÝ nÐn

Bộ trộn tiếp nhận và trộn dung môi từ

mỗi một van lập trình. Các van này

được vận hành bằng điện và được lập

trình đóng mở theo các khoảng thời

gian khác nhau nhờ điều chỉnh tần số và

dạng sóng của nguồn cấp năng lượng.

Theo đó một lượng xác định trước của

từng dung môi chảy vào bộ trộn. Những

van này có thể được điều khiển bằng

các bộ dao động có mặt trong một

chương trình điện tử tách riêng hoặc

nhờ máy tính điều khiển sắc ký, máy

tính hiệu chỉnh dạng sóng và tần số để

điều khiển dòng từng dung môi.

Nh×n vµo h×nh trªn chóng ta thÊy r»ng tæng ¸p lùc khÝ nÐn trªn pit«ng ®êng kÝnh y sÏ ®îc truyÒn vµo pit«ng ®iÒu khiÓn ¸p lùc chÊt láng cã ®êng kÝnh x. Do b¸n kÝnh çc pit«ng kh¸c nhau, sÏ cã mét gi·n në ¸p tæng céng lµ y 2/x2. LÊy vÝ dô nÕu pit«ng trªn cã ®êng kÝnh lµ 5 cm vµ pit«ng díi cã ®êng kÝnh 1 cm th× hÖ sè gi·n në sÏ lµ 25. Nã cho thÊy hÖ th«ng cã thÓ t¹o ra ¸p lùc rÊt cao theo mét çch t¬ng ®èi ®¬n gi¶n.

KiÓu b¬m nµy vËn hµnh theo çch nh sau: Kh«ng khÝ ®i vµo cæng (1) vµ ¸p mét ¸p lùc lªn

pittong trên, áp lực này truyền tiếp xuống

pittong dưới. Nếu được nối với một sắc ký lỏng


hoÆc mét manifold cét nhåi, chÊt láng sÏ ch¶y ra ngoµi qua bªn tr¸i van non -return vµ sÏ tiÕp tôc nh vËy cho ®Õn khi pit«ng ®¹t ®îc sù dÞch chuyÓn tèi ®a. T¹i thêi ®iÓm cùc trÞ cña sù dÞch chuyÓn, mét bé chuyÓn micro kÝch ho¹t, ¸p lùc kh«ng khÝ truyÒn tõ cæng (1) sang cæng (2).

B©y giê pit«ng dÞch chuyÓn theo chiÒu ngîc l¹i vµ kÐo pha ®éng vµo qua van non -return bªn tay ph¶i, n¹p ®Çy dung m«i vµo cylinder. Vµo lóc ®¹t ®îc giíi h¹n cña sù dÞch chuyÓn, mét bé chuyÓn micro thø hai kÝch ho¹t kÐo kh«ng khÝ tõ cæng (2) quay trë l¹i cæng (1) vµ qu¸ tr×nh b¾t ®Çu lÆp l¹i. Qu¸ tr×nh n¹p ®Çy dung m«i lµ cùc nhanh, vµ nÕu sö dông bé dampener xung phï hîp, ¸p lùc ra vÉn kh¸ æn ®Þnh trong chu tr×nh n¹p ®Çy.

Van Non-return

§Ó ho¹t ®éng hiÖu qu¶, ®iÒu quan träng lµ khi pit«ng nÐn dung m«i Ðp vµo cæng ra, th× dßng hoµn toµn dõng l¹i ë cæng vµo. Ngîc l¹i khi b¬m kÐo d ung m«i míi vµo cylinder trong giai ®o¹n n¹p ®Çy th× van non-return ph¶i cho dung m«i ch¶y qua van

vµo nhng dßng ch¶y ngîc (flow-back) tõ van ra ph¶i dõng hoµn toµn. Cã ®îc ®iÒu nµy lµ nhê sö dông çc van non-return ho¹t ®éng hiÖu qu¶. HÇu hÕt çc van non-return lµ cã thiÕt kÕ gièng nhau vµ ®iÓn h×nh cã cÊu tróc nh h×nh díi.

Bé phËn quan träng cña van lµ mét bi b»ng sapphire tæng hîp ®Æt trªn bÖ. BÖ cã thÓ

bằng thÐp kh«ng gØ, b»ng PTFE hoÆc phæ biÕn h¬n lµ còng lµm b»ng sapphire. Khi dßng t¸c ®éng trùc tiÕp vµo bi, bi chuyÓn ®éng xu«i cho phÐp chÊt láng ch¶y qua nã. Khi chiÒu ¸p lùc thay ®æi dÉn ®Õn sinh ra dßng ch¶y ngîc qua van, bi bÞ ®iÒu khiÓn quay trë l¹i vÞ trÝ bÖ cña nã vµ dõng dßng chÊt láng l¹i.

H×nh 1.5: ThiÕt kÕ ®iÓn h×nh

cña mét van non-return

Víi thiÕt kÕ cÈn thËn vµ chÕ t¹o chÝnh x¸c, çc kiÓu van nµy cã thÓ rÊt hiÖu qu¶. Thùc tÕ ®Ó ®¹t ®îc hiÖu qu¶ tèt nhÊt, mét bé l¾p ghÐp van non-return thêng cã hai van bi non-return ®îc nèi thµnh mét d·y nh

trong h×nh trªn.

Bơm syring

B¬m syring lµ mét d¹ng m« pháng vËn hµnh xylanh tiªm, vËn hµnh b»ng ®iÖn vµ cã kÝch thíc lín. MÆc dï ®· ®îc sö dông vµo nh÷ng n¨m ®Çu cña thêi kú LC, nhng ngµy nay hiÕm khi ®îc sö dông do thiÕt kÕ cña nã chØ mang l¹i ¸p lùc cã møc ®é vµ thÓ tÝch pha ®éng h÷u Ých bÞ khèng chÕ bëi thÓ tÝch b¬m. Trõ phi qu¸ tr×nh t¸ch dõng l¹i trong khi b¬m n¹p ®Çy trë l¹i vµ tiÕp tôc qu¸ tr×nh t¸ch khi b¬m ®Èy dung m«i vµo hÖ thèng, b¬m chØ cã thÓ röa gi¶i nh÷ng chÊt tan cã thÓ tÝch lu b»ng hoÆc nhá h¬n dung tÝch b¬m. Mét s¬ ®å b¬m syring ®îc chØ ra trong h×nh díi.

B¬m ®îc chÕ t¹o díi d¹ng mét syringe kim lo¹i cì lín, pit«ng ®îc ®Èy tíi ®Èy lui b»ng mét m«to ®iÖn vµ ®iÒu khiÓn b»ng truyÒn ®éng trôc vÝt. Tèc ®é m«to x¸c ®Þnh thÓ tÝch ph©n phèi dung m«i cña b¬m. Mét m«to kh¸c khëi ho¹t pit«ng b»ng mét hÖ thèng truyÒn ®éng b¸nh r¨ng kh¸c ®Ó nhanh chãng n¹p l¹i syringe khi cã yªu cÇu. Dung m«i hót vµo cylinder qua mét lç ë t©m pit«ng vµ ë gi÷a pit«ng vµ lèi ra cã mét cuén ®ãng vai trß nh mét dampener. §©y vÉn lµ kiÓu b¬m dao ®éng ®îc sö dông ®Ó cÊp pha ®éng cho çc cét microbore cã yªu cÇu thÓ tÝch pha ®éng nhá ®Ó ph¸t triÓn qu¸ tr×nh t¸ch. ThØnh tho¶ng nã còng ®îc sö dông ®Ó ph©n phèi thuèc thö cho qu¸ tr×nh dÉn xuÊt ho¸ hËu cét khi mµ nã cã thÓ thùc hiÖn ph©n phèi mét lîng thuèc thö h»ng ®Þnh t¹i tèc ®é dßng rÊt thÊp.


H×nh 1.6: B¬m syring

§Çu tiªn kiÓu b¬m pit«ng chuyÓn ®éng qua l¹i ®îc sö dông víi çc cét LC hiÖu qu¶ cao (cét ®îc nhåi víi nh÷ng h¹t nhá) vµ cho ®Õn ngµy nay nã vÉn rÊt ®îc a chuéng. Nã cã thiÕt kÕ ®¬n gi¶n vµ t¬ng ®èi rÎ tiÒn. S¬ ®å mét kiÓu b¬m pit«ng ®îc chØ ra trong h×nh díi:

H×nh 1.7: Mét kiÓu b¬m pit«ng

chuyÓn ®éng qua l¹i ®¬n gi¶n

di chuyÓn quay l¹i trªn có ®Ëp n¹p l¹i dung m«i lµ sù di chuyÓn ®ét ngét. Theo çch nµy th× hiÖu øng xung g©y ra do ho¹t ®éng n¹p l¹i dung m«i sÏ ®îc gi¶m ®i. Tuy

nhiªn xung kh«ng ph¶i lµ ®îc lo¹i bá mét çch hoµn toµn vµ ån detector h×nh thµnh

tõ nh÷ng xung nµy gần nh lµ mét bÊt lîi nghiªm träng cña b¬m mét pit«ng duy nhÊt. Tuy nhiªn nhê vµo chi phÝ thÊp mµ nã vÉn lµ mét trong nh÷ng b¬m LC ®îc a chuéng.

Bơm nạp lại nhanh

§Ó tr¸nh gÆp ph¶i xung n¹p l¹i h×nh thµnh tõ b¬m mét pit«ng duy nhÊt, mét sè hÖ thèng n¹p l¹i nhanh ®· ®îc ph¸t triÓn. Çc b¬m nµy cã thiÕt kÕ lÊy tõ çc cam vèn ®· ®îc thiÕt kÕ mét çch khÐo lÐo ®Ó ®iÒu khiÓn pit«ng chuyÓn ®éng nhanh chãng trong chÕ ®é n¹p l¹i, víi sù chuyÓn ®éng pit«ng vËn hµnh ®iÖn tö. Híng gi¶i quyÕt thµnh c«ng vÊn ®Ò nµy ®îc minh ho¹ b»ng thiÕt kÕ b¬m trong h×nh díi.

H×nh 1.8: B¬m n¹p l¹i nhanh

Thªm vµo ®ã nÕu ®ang sö dông gradient dung m«i vµ buång bªn ph¶i ®îc ®æ ®Çy hçn hîp dung m«i, kÕt qu¶ trén sÏ lµ tuyÖt vêi trong qu¸ tr×nh n¹p trë l¹i buå ng bªn tr¸i. Tuy nhiªn cã mét ®iÒu râ rµng lµ sÏ kh«ng cã sù chuyÓn tr¹ng th¸i tr¬n tru tõ mét nång ®é dung m«i nµy sang mét møc nång ®é dung m«i kh¸c, nhng ®©y vÉn lµ mét bíc thay ®æi ®Çy kh«n ngoan.

HÇu hÕt pit«ng cña çc b¬m LC hiÖn ®¹i ®îc lµm tõ sapphire tæng hîp ®Ó gi¶m ¨n mßn vµ kÐo dµi tuæi thä cña b¬m. Cylinder thêng ®îc lµm tõ thÐp kh«ng gØ vµ ®îc g¾n vµo ®ã hai van non-return n»m ngay trong ®êng di chuyÓn cña chÊt láng víi ®Çu vµo vµ ra ®îc nèi víi b¬m. Piston ®îc ®iÒu khiÓn b»ng cam thÐp kh«ng gØ Ðp pit«ng ®i vµo cylinder nÐn dung m«i ®i qua van ra non-return. Sau khi ®¹t ®îc chuyÓn dÞch tèi ®a, pit«ng theo cam

quay trë lại vÞ trÝ ban ®Çu do ¸p lùc tõ lß xo håi

chuyÓn. Trong sù dÞch chuyÓn nµy, cylinder ®îc n¹p thªm dung m«i qua lèi vµo van vµo non-return. H×nh d¸ng cña cam t¹o ra sù dÞch chuyÓn tuyÕn tÝnh

cña pit«ng trong giai đoạn nén dung môi nhưng sự

B¬m cã hai èng h×nh trô vµ mét pit«ng chung duy nhÊt. Qu¸ tr×nh nÐn dung m«i vµo cét ®îc chØ ra trong phÇn trªn cña h×nh vÏ. Khi pit«ng tiÕn sang ph¶i, dung m«i ®îc ®a vµo hÖ thèng cét, dung m«i t¬i kÐo tõ b×nh chøa vµo trong qua buång bªn tay ph¶i. Khi pit«ng ®¹t ®Õn ph¹m vi dÞch chuyÓn cña nã, cam hoµn tÊt bíc cña nã vµ pit«ng nhanh chãng ®¶o chiÒu. KÕt qu¶ lµ çc tr¹ng th¸i buång bªn tay ph¶i ®îc thay b»ng tr¹ng th¸i buång bªn tay tr¸i. Tr¹ng th¸i nµy ®îc chØ ra trong phÇn díi cña h×nh vÏ bªn. Tèc ®é truyÒn dung m«i sang buång bªn tr¸i nhanh h¬n tèc ®é truyÒn vµo cét 100 lÇn vµ gi¶m ®îc rÊt ®¸ng kÓ hiÖu øng sung g©y ra do sù n¹p ®Çy trë l¹i.


Mét çch kh¸c ®Ó lo¹i bá hoÆc gi¶m çc xung b¬m vµ gÇn nh ®©y lµ mét bíc thµnh c«ng h¬n (mÆc dï ®¾t tiÒn h¬n) lµ sö dông çc ®Çu b¬m ®«i. Trong lóc vËn hµnh

b¬m hai ®Çu, mét cylinder ®îc n¹p dung m«i trong khi cylinder cßn l¹i ph© n phèi

dung m«i vµo cét.

Bơm hai đầu bơm

Cylinder vµ pit«ng cña b¬m hai đầu được chÕ t¹o theo cïng kiÓu cña b¬m mét

pit«ng duy nhÊt víi pit«ng sapphire vµ cylinder thÐp kh«ng gØ, l¾p çc van non -return vµo c¶ ®Çu vµo vµ ®Çu ra. Cam ®iÒu khiÓn cña c¶ hai pit«ng ®îc gät giòa m ét çch cÈn thËn ®Ó t¹o ra sù gia t¨ng dßng tõ b¬m nµy trong khi b¬m cßn l¹i ®îc n¹p ®Çy. Quy tr×nh nµy cho phÐp bï ®îc phÇn thiÕu hôt dung m«i ph©n phèi trong qu¸ tr×nh

n¹p l¹i vµ tÊt nhiªn lµ kh¾c phôc ®îc lçi ¸p lùc. Ở bơm hai đầu bơm, c¶ hai b¬m

dïng chung mét nguån cÊp dung m«i tõ b×nh chøa hoÆc tõ ch¬ng tr×nh dung m«i.

§Çu ra cña mçi b¬m khíp vµo nhau vµ sau ®ã dung m«i dÉn qua van b¬m mÉu råi tiÕp theo lµ qua cét t¸ch.

3. Van bơm mẫu: để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những thể tích nhất định không đổi

trong một quá trình sắc ký. Cấu hình đơn giản nhất là bơm mẫu bằng tay với một van 6 chiều và có

các chọn lựa vòng định cỡ dung tích mẫu khác nhau (loop). Tiêm mẫu vào van bằng tay.

4. Cột tách: là cột chứa pha tĩnh, là trái tim của quá trình tách sắc ký, nó là một yếu tố quyết định

đến hiệu quả sự tách một hỗn hợp mẫu. Cột tách có nhiều kích cỡ khác nhau tuỳ thuộc vào mức độ

tách sắc ký (xem bảng 1.1). Nói chung các cột phân tích thường có chều dài từ 10-25cm với đường

kính trong trong dải từ 2-5mm. Hiện nay với sự ra đời hệ thống sắc ký lỏng siêu áp, cột đã được chế

tạo với đường kính trong xuống đến hàng vài chục micromet, độ dài một vài cm và nhồi hạt có kich

thước cỡ micromet.

5. Trang bị phát hiện chất phân tích: Đây thường là các detector dựa theo các tính chất của chất

phân tích, ví dụ như:

- Detector hấp thụ quang phân tử (còn gọi là detector UV-VIS). Về cơ bản detector này có

cấu tạo gồm các cấu kiện chính: nguồn đèn, cách tử/thấu kính và liên quan đến nó là độ dài sóng,

buồng đo dòng chảy, đầu đo tín hiệu (có thể là loại một bước sóng, nhiều bước sóng hoặc mảng

diod).

- Detector phổ nguyên tử. Detector này có hai loại là detector phổ phát xạ nguyên tử AES

và phổ khối ICP-MS. Tuy nhiên cả hai loại này ít dùng do phạm vi ứng dụng tương đối hẹp, thông

tin đưa lại từ những detector này đơn giản. Nhất là detector ICP-MS thường chỉ được ghép với

HPLC để phân tích một số loại hợp chất cơ kim như cơ thiếc, cơ selen, cơ asen trong các đối tượng

mẫu môi trường. Mỗi một detector loại này đều có cấu tạo đầy đủ và hoàn chỉnh theo kỹ thuật của

riêng chúng. Với detector phổ phát xạ nguyên tử là nguồn nguyên tử hoá (nguồn ICP (ICP khí trơ

cháy theo thiết kế đuốc Fassel hoặc khí trơ cháy trong hốc cộng hưởng vi sóng)), hệ thống đơn sắc

(cách tử), bộ phận ghi nhận tín hiệu (nhân quang điện, diod hoặc mảng diod). Với detector ICP-MS

là nguồn ion hoá ICP, hệ thống thấu kính ion (làm nhiệm vụ hội tụ chùm ion, giảm sự phân tán

năng lượng các ion đồng khối lượng, tách chùm ion khỏi các phần tử không tích điện khác), hệ

thống tách khối, bộ phận phát hiện (nhân điện tử hoặc nhân quang điện).

- Detector huỳnh quang. Sóng kích thích tạo ra bức xạ huỳnh quang tại những bước sóng

cao hơn. Detector này chỉ dùng cho những chất phân tích có nhóm phát huỳnh quang hoặc những

chất có khả năng phản ứng với tác nhân huỳnh quang. Là một detector nhạy và chọn lọc. Việc

chuyển đổi các phương pháp với detector này gặp nhiều khó khăn hơn

- Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng),

- Detector chỉ số khúc xạ là một detector cho các chất phân tích phổ thông. Với detector

này dung môi được giữ cố định xuyên suốt quá trình tách, rất nhạy với nhiệt độ và thỉnh thoảng gặp

khó khăn trong vấn đề ổn định đường nền.


- Detector đo độ dẫn nhiệt…..

- Detector phổ khối. Detector này đo tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z), có khả năng

nhận diện tin cậy hợp chất cụ thể. Cấu trúc detector tơ này khá phức tạp và có nhiều cấu hình khác

nhau. Về cơ bản gồm nguồn ion (dùng cho sắc ký lỏng là nguồn phun điện tích ESI, nguồn ion hoá

hoá học tại áp suất khí quyển APCI, nguồn quang ion hoá tại áp suất khí quyển APPI), cầu dẫn ion

(thấu kính ion đa cực, buồng truyền sóng điện từ di động….), bộ tách khối (tứ cực, bẫy ion, thời

gian bay, cộng hưởng ion xoáy trôn ốc kết hợp biến đổi fourrier chuyển hoá từ phổ tần số quỹ đạo

sang phổ khối), bộ phát hiện (nhân điện tử, nhân quang điện, đĩa vi kênh MCP,….)

- Detector tán sắc ánh sáng pha hơi (ELSD). Được sử dụng cho các chất phân tích có khả

năng phản hồi kém hoặc không phản hồi UV-VIS hoặc không có khả năng ion hoá tốt trong các

thiết bị phổ khối. Cấu trúc detector này bao gồm đầu phun sương tạo aerosol, ống trôi cho quá trình

desolvation, buồng tán sắc để phát hiện các hạt đã hình thành và đèn phát ánh sáng.

Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector phù hợp để đạt được độ nhạy cao khi

phát hiện các chất. Trong các loại trên thì detector hấp thụ quang phân tử hiện nay đang được dùng

phổ biến, tiếp theo là các detector huỳnh quang và đặc biệt detector phổ khối ngày càng chiếm giữ

một vị trí quan trọng đối với mọi hệ thống sắc ký lỏng cao áp, từ sắc ký lỏng phân tích cho đến sắc ký

lỏng điều chế.

6. Trang bị chỉ thị kết quả: Có nhiều trang bị dùng để chỉ thị kết quả. Trước đây loại đơn giản và

phổ biến là các máy tự ghi (recorder) để đo tín hiệu dưới dạng píc. Tuy nhiên các hệ thống dữ liệu

tính toán bằng máy tính ngày càng phát triển và ngày nay nó hầu như đã thay thế hoàn toàn hình

thức sử dụng máy ghi. Các hệ thống dữ liệu đã có thể làm được mọi việc mà người phân tích có nhu

cầu. Chúng không chỉ có khả năng tìm kiếm píc, tính tích phân diện tích píc, nhận diện hợp chất

dựa trên cơ sở dữ liệu đã nạp sẵn hoặc tự tạo, định tính, định lượng,…. mà còn có thể xử lý đa chiều,

tương tác với các nguồn dữ liệu khác nhau, đưa ra những dự báo, đánh giá về chiều hướng dữ liệu,….

Trên đây là 6 bộ phận cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống HPLC. Về cơ bản là như vậy,

ngoài ra trong một hệ thống HPLC còn có nhiều bộ phận quan trọng khác, cần có để hỗ trợ phân

tích tự động hoàn toàn và đa nhiệm. Lấy ví dụ đối với bộ phận bơm cao áp còn có thêm trang bị khử

khí dung môi, van lựa chọn dung môi, gradient dung môi, bơm rửa seal pittong của bơm cao áp.

Với trang bị khử khí dung môi có loại sục khí He lôi cuốn, có loại khử khí bằng chân không. Van

lựa chọn và gradient dung môi có thể cho phép gradient đến 4 dung môi với nhiều kiểu đường

gradient khác nhau.

Bộ phận bơm mẫu có thể được tự động hoá ở mức cao với việc lựa chọn lọ mẫu, lấy mẫu, rửa

kim xylanh…. Mẫu có thể được điều nhiệt hoặc bằng thiết bị điều nhiệt tuần hoàn ngoại vi hoặc

bằng thiết bị điều nhiệt theo nguyên lý peltier.

Bộ phận cột tách có thể lắp được nhiều cột tách khác nhau, trang bị van lựa chọn cột và cơ chế

các van phục vụ sắc ký đa chiều. Các cột tách được nhận diện bằng thiết bị điện tử và chúng cũng

có thể được điều nhiệt.

Hình 1.9 là sơ đồ khối về một hệ thống HPLC cơ bản như đã mô tả ở trên. Hình 1.9a là sơ đồ khối

hệ thống trang bị máy ghi, hình 1.9b là hệ thống có trang bị bộ phận gradient dung môi và hình 1.9c là

sơ đồ khối hệ HPLC hoàn chỉnh có thêm máy tính và bộ phận xử lý số liệu.

Hình 1.9a: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đơn giản, bơm cao áp (Bơm), van bơm mẫu (Van), cột sắc ký

(Cột), Detector phát hiện (Detector) và bộ ghi píc sắc ký (Máy ghi)

Bơm Van Cột Detectorr

Máy ghi

Bơm Van Cột Detector Máy ghi Grad

Bơm


Hình 1.9b: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đơn giản có bộ phận gradient dung môi (Grad)

Hình 1.9c: Sơ đồ khối hệ thống HPLC hoàn chỉnh (có thêm máy tính và bộ phận xử lý dữ liệu)

Hình dưới đây là một đồ hoạ sinh động mô tả đơn giản về một hệ thống sắc ký lỏng hiệu quả

cao trang bị bơm đồng thể.

Có một bình chứa (RESEVOIR) dùng để chứa dung môi (dung môi còn được gọi là “pha động”

do trong quá trình thực hiện sắc ký nó di chuyển). Một bơm (PUMP) cao áp (còn được gọi là “Hệ

thống phân phối dung môi” hoặc “Hệ quản lý dung môi”) được dùng để tạo và điều khiển dòng

chảy tại một “Tốc độ dòng” cụ thể, điển hình tính theo mililit/phút. Một “Đầu tiêm” (còn gọi là “Hệ

quản lý mẫu” hoặc “Hệ mẫu tự động”) có thể truyền (“inject’) mẫu (SAMPLE) vào dòng pha động

đang chảy, dòng dung môi này mang mẫu vào trong cột sắc ký lỏng (HPLC SAMPLE). Cột có chứa

vật liệu nhồi sắc ký cần thiết để tạo ra quá trình tách (Vật liệu nhồi này được gọi là pha tĩnh

STATIONARY PHASE do nó được giữ cố định bởi phần cứng cột). Cần đến một “Detector” để

“nhìn” thấy các “băng hợp chất” khi chúng rửa giải khỏi cột HPLC (hầu hết các hợp chất không có

mầu). Pha động ra khỏi DETECTOR và có thể được thải bỏ, hoặc được gom lại nếu cần. Khi pha

động có chứa một “băng” hợp chất tinh khiết, HPLC đưa đến khả năng gom FRACTION rửa giải

này (phần có chứa hợp chất tinh khiết này) để nghiên cứu thêm. Việc làm này được gọi là sắc ký

Bơm Van Cột Detector Máy ghi Grad

Bơm Microcomputer

và xử lý dữ liệu

Int. Print. Digit Rec.


điều chế “Preparative Chromatography”. Kỹ thuật sắc ký điều chế sẽ được thảo luận trong mục

phân loại HPLC.

DETECTOR được kết nối về mặt điện tử đến trạm dữ liệu tính toán COMPUTER DATA

STATION ghi lại những thông tin điện tử cần thiết để tạo ra sắc đồ “Chromatogram”, chúng ta sẽ

sử dụng sắc đồ để nhận diện và định lượng nồng độ các chất. Cấu kiện thiết bị này cảm biến hoặc

“phát hiện” các chất đã tách rửa giải khỏi cột và mang đến tín hiệu điện tử cho trạm dữ liệu tính

toán hoặc đến máy ghi để tạo ra sắc đồ. Do các hợp chất mẫu có những đặc trưng khác nhau nên đi

theo đó có vài kiểu detector khác nhau. Lấy ví dụ nếu hợp chất có khả năng hấp thụ ánh sáng UV

thì detector hấp thụ phân tử UV Absorbance được sử dụng. Nếu hợp chất có khả năng phát huỳnh

quang thì detector huỳnh quang được sử dụng. Nếu các hợp chất không có một trong những đặc

trưng này thì kiểu detector phổ thông hơn sẽ được sử dụng, ví dụ detector tán sắc ánh sáng pha hơi

ELSD. Hướng hữu ích nhất là sử dụng nhiều detector xếp theo dãy. Điển hình thì UV và ELSD

được dùng kết hợp cùng với Mass Spectrometer (MS) để phân tích kết quả tách sắc ký. Sự kết hợp

này mang lại thông tin hợp chất đầy đủ hơn từ duy nhất một lần tiêm mẫu. Khi một thiết bị phổ khối

được sử dụng với một LC, nó được gọi là LC/MS.

1.3. Phân loại mức độ tách của kỹ thuật HPLC

Trong kỹ thuật HPLC người ta cũng chia thành 3 mức độ của quá trình sắc ký tuỳ thuộc vào

mục đích của người làm HPLC. Ba mức độ đó là:

- Mức độ tách phân tích (Analytical Level).

- Mức độ bán điều chế (Semi-preparative)

- Mức độ điều chế (Preparative)

Bảng 1.1 là các tham số và các quy định cho mỗi mức độ sắc ký trong kỹ thuật HPLC. Tất nhiên

đây cũng chỉ là những khái niệm phân chia tương đối.

Bảng 1.1 Phân loại mức độ sắc ký trong HPLC

Các tham số Phân tích Bán điều chế Điều chế

Đường kính cột (mm) 2-5 5-10 10-50

Độ dài cột (cm) 50-5 20-50 25-150

Cỡ hạt pha tĩnh (m) 3-10 10-30 10-60

Tốc độ MP (mL/ph.) 0,5-3 3-10 Hơn 10

Thể tích mẫu (L) 5-50 50-500 Hơn 1000

Lượng mẫu (mg) 0,2-0,5 1-500 Hơn 500

Số đĩa của cột (tối thiểu) 3000 3000 3000

Detector (nhậy) Cao Trung bình Trung bình

Thời gian lưu (ph.) 40 < 120 < 250 <

1.4. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Để tiến hành sắc ký, pha tĩnh phải được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh

là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là

chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha ngược (NP-HPLC hay RP-HPLC). Nếu

pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC). Nếu pha tĩnh là chất lỏng có

tính chất phân bố ta có sắc ký chiết (LLC).

Cùng với pha tĩnh, để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột tách chúng ta phải cần một pha động

(mobil phase). Như vậy nếu ta nạp mẫu phân tích gồm các chất A, B, C thì khi bơm pha động qua

cột tách các quá trình sắc ký sẽ xảy ra. Nghĩa là có sự tách của các chất A, B, C ra khỏi nhau, sau

khi đi qua cột tách. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng các tương tác:

1. Giữa chất phân tích và pha tĩnh,

2. Giữa chất phân tích và pha động và

3. Giữa pha tĩnh và pha động


Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên, nếu lực tương

tác lưu giữ của nó là nhỏ nhất. Còn chất nào có lực tương tác lưu giữ lớn nhất thì sẽ được rửa giải ra sau

cùng. Ta có thể minh hoạ vấn đề này theo sơ đồ trong hình 1.10 sau đây:

(F1) F(2)

F(3)

Hình 1.10: Sự tương tác trong cột sắc ký

Theo sơ đồ trên thì lực tương tác lưu giữ của mỗi chất sẽ là:

Chất A: FA = FA(1) + FA(2) + FA(3)

Chất B: FB = FB(1) + FB(2) + FB(3)

Chất C: FC = FC(1) + FC(2) + FC(3)

Ở đây đối với mỗi chất, sự lưu giữ được xác định bởi 3 lực thành phần: F(1), F(2) và F(3). Trong

đó F(1) và F(2) là những phần quyết định, còn F(3) là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây lực F(1)

giữ chất phân tích trên pha tĩnh của cột tách, trong khi đó thành phần F(2) lại kéo chất phân tích ra

khỏi pha tĩnh. Như vậy với mỗi chất khác nhau thì thành phần F(1) và F(2) là khác nhau. Còn thành

phần F(3) trong một hệ sắc ký của cùng một tệp điều kiện thì F(3) của các chất là không khác nhau

nhiều. Vì thế F(1) và F(2) là hai yếu tố quyết định sự lưu giữ của chất tan trong một hệ pha. Như thế

có nghĩa pha tĩnh và pha động là hai yếu tố quyết định hiệu suất của quá trình tách sắc ký trong kỹ

thuật HPLC. Hình 1.11 là một ví dụ đơn giản để minh hoạ sự tách sắc ký của hai chất A và B theo

thời gian, kể từ lúc nạp hỗn hợp mẫu (AB) vào cột tách cho đến khi hai chất A và B được rửa giải ra

khỏi cột.

MP MP MP MP MP MP

S(AB)

Tiêm mẫu

0 t1 t2 t3 t4 t5 (ph.)

Chất phân tích

A-B-C

Pha tĩnh Pha động

1.5. Cơ chế lưu giữ

Nhìn chung có 3 đặc trưng chính của các chất

hoá học có thể được sử dụng để tạo ra quá trình

tách, chúng là:

- Độ phân cực

- Điện tích

- Kích thước phân tử

Trước tiên chúng ta sẽ thảo luận một cách khái

quát về độ phân cực và hai cơ chế lưu giữ tận dụng

những đặc trưng này; sắc ký pha thường (Normal

Phase) và sắc ký pha ngược (Reversed Phase).

Độ phân cực

Tất cả các chất hoá học đều có một hành vi đặc

trưng duy nhất có liên quan đến cấu trúc phân tử

của chúng. Chúng có thể được mô tả dưới các khái

niệm “Phân cực” hoặc “Không phân cực”, với một

dải các giá trị độ phân cực khác nhau giữa phân

cực nhất và không phân cực nhất.


Hình 1.11: Sơ đồ minh hoạ quá trình tách

Salts Alcohols Ethers Alphatic Hydrocarbons

Chất phân tích

Acids Ketones Halogenated Fluorinated Hydrocarbons

Tuỳ thuộc vào cấu trúc của phân tử và vào sự phân bố điện tích của nó, các phân tử sẽ “rất phân

cực” và một số sẽ “rất không phân cực”. Số còn lại sẽ có mức độ phân cực khác nhau giữa hai mức

này, và vì thế sẽ có một dải độ phân cực. Đối với bất kỳ một phân tử hợp chất riêng biệt nào sẽ có

một “độ phân cực nào đó” nằm trong phạm vi dải. Nước là một ví dụ tốt về chất lỏng rất phân cực

và paraffin gốc dầu là một ví dụ tốt về chất lỏng rất không phân cực.

Chúng ta sử dụng các đặc trưng về “độ phân cực” này để xây dựng “Cơ chế lưu giữ”, cơ chế

được áp dụng để tạo ra nhiều quá trình tách HPLC. Do độ phân cực, có thể có “lực hút”, “không có

lực hút” hoặc “lực đẩy” giữa hai dạng chất hoá học.

Đối tượng phân cực sẽ hút đối tượng phân cực (giống nhau) và đẩy đối tượng không phân cực

(đối ngược). Đối tượng không phân cực sẽ hút đối tượng không phân cực (giống nhau) và đẩy đối

tượng phân cực (đối ngược). Dầu là một ví dụ về đối tượng không phân cực, không trộn lẫn với

nước là một đối tượng phân cực (đẩy ngược chiều) (đây chỉ là sự đảo ngược từ tính, ở đây các cực

đối nhau của nam châm hút nhau, và các cực giống nhau thì đẩy nhau).

Để tạo ra một hệ thống tách sắc ký, cần tạo ra được sự “cạnh tranh” cho các hợp chất mẫu khác

nhau nhờ làm cho pha động và pha tĩnh có độ phân cực khác nhau. Do các hợp chất trong mẫu sẽ có

độ phân cực khác nhau, những hợp chất nào có cùng độ phân cực như pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) sẽ

chảy chậm (do chúng bị hút lên các hạt nhồi). Bất kỳ hợp chất nào có cùng độ phân cực như pha

động đang di chuyển (bị hút) sẽ di chuyển ở một tốc độ nhanh hơn. Chúng ta đã tạo ra được một

phép tách sắc ký nhờ thay đổi lực hút tương đối (và do đó là tốc độ) của mỗi chất.

Người làm sắc ký cần lựa chọn cẩn thận pha động và pha tĩnh để khai thác tính cạnh tranh cần

thiết cho quá trình tách HPLC các hợp chất mẫu.

Pha động

Water Alcohol Acetonitril THF Hexane

Như chỉ ra trong hình trên, nước là một trong những dung môi pha động phân cực nhất trong khi

hexane là một trong những dung môi không phân cực nhất. Những dung môi có tính trộn lẫn có thể

được trộn với nhau theo những tỷ lệ khác nhau để tạo ra hiệu quả tách chính xác theo yêu cầu.

Pha tĩnh

Silica CN C8 C18(ODS)

Hình trên chỉ ra pha tĩnh/dải độ phân cực vật liệu nhồi. Các hạt silica tinh khiết không có tạo

liên kết là vật liệu nhồi phân cực nhất. Các nhà sản xuất cột có thể thay đổi độ phân cực nhờ liên kết

hoá học một chất hoặc nhóm chức hiệu chỉnh lên bề mặt hạt silica. Lấy ví dụ, nhờ liên kết C18 (hoặc

Phân tử

phân cực

Phân tử không phân

cực

Phân tử

phân cực

Phân tử

phân cực

Phân tử không phân

cực

Phân tử không

phân cực


“OctaDecylSilane, ODS) lên bề mặt, hạt tạo thành có thể rất không phân cực (rất “kỵ nước”). Ngày

nay trong HPLC, hạt silica liên kết C18 là kiểu được ưa chuộng nhất.

Chương 2 - CƠ SỞ LÝ THUYẾT KỸ THUẬT HPLC

2.1 Quá trình sắc ký

Nói chung quá trình tách trong kỹ thuật HPLC cũng là những quá trình tổ hợp của nhiều quá

trình vừa có tính chất hoá học lại có cả tính chất lý học. Nó là những cân bằng động xảy ra ở trong

cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động. Nó là sự vận chuyển và phân bố của chất tan (hỗn hợp mẫu)

theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh). Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại

giữa hai pha, khi pha động luôn luôn chảy qua cột với một tốc độ nhất định. Tất nhiên khái niệm sự

vận chuyển chất mẫu theo từng lớp chỉ là tương đối trong một phạm vi nào đó. Vì thực tế khó có thể

phân biệt được dứt khoát từng vùng, từng lớp độc lập nhau trong hai pha. Song chắc chắn rằng

trong những điều kiện sắc ký nhất định thì chất tan luôn luôn phân bố trong hai pha theo những cân

bằng động từ lúc chất tan bắt đầu vào cột cho đến khi nó ra khỏi cột tách. Cho nên ở đây các quy

luật cân bằng động trong hoá học vẫn giúp ta đánh giá được phần nào của mỗi chất tan sẽ đi vào

pha tĩnh và phần nào đi vào pha động. Đồng thời cũng do tính chất cân bằng động mà luôn luôn có

sự vận chuyển của chất tan từ pha này sang pha kia và ngược lại. Nghĩa là đối với một phân tử chất

tan thì trong quá trình sắc ký nó luôn luôn nhảy từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầu cột đến

cuối cột sắc ký. Mặt khác cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất là khác nhau, nên

tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Vì khi ở trong pha động nó chuyển

dịch theo tốc độ của pha động, còn khi ở trong pha tĩnh nó lại không chuyển dịch mà bị lưu giữ.

Như vậy là có một thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột sắc ký. Thời gian chất tan bị pha

tĩnh lưu giữ được quyết định bởi bản chất sắc ký của pha tĩnh cũng như cấu trúc và tính chất của

mỗi chất tan khác nhau. Đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất và thành phần của pha động dùng

để rửa giải chất tan ra khỏi cột. Vì thế trong quá trình sắc ký có chất tan lưu giữ lâu trên cột, có chất

tan kém bị lưu giữ. Điều đó dẫn đến kết quả là quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký.

Nếu ghi lại quá trình tách sắc ký đó của hỗn hợp mẫu phân tích chúng ta có một sắc đồ gồm nhiều

píc. Các píc đó có thể tách khỏi nhau hoàn toàn, hoặc cũng có thể còn có thành phần chập nhau

(hình 2.1.b). Sắc đồ đó phản ánh quá trình tách sắc ký ở trong cột tốt hay không. Nếu quá trình là

tốt thì hỗn hợp mẫu có bao nhiêu chất, trong sắc đồ sẽ có bấy nhiêu píc riêng biệt không chồng chập

nhau. Như vậy trong quá trình sắc ký, chất nào bị lưu giữ mạnh nhất sẽ được rửa giải ra khỏi cột sau

cùng, chất nào bị lưu giữ kém nhất sẽ được rửa giải ra trước tiên. Trở lại sắc đồ trong hình 2.1.b ta

thấy chất A bị lưu giữ kém nhất và chất D bị lưu giữ mạnh nhất. Đồng thời ở đây hai chất C và D

chưa được tách khỏi nhau hoàn toàn.

2.2 Các đại lượng đặc trưng trong HPLC

2.2.1 Các phương trình lưu giữ

A. Thời gian lưu. Các chất tan trong hỗn hợp mẫu, khi được nạp vào cột sắc ký, như chúng ta đã

biết chúng sẽ bị lưu giữ ở trong cột tách theo một thời gian nhất định. Đó là thời gian lưu của nó

trong hệ cột đã cho. Thời gian lưu này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột đến lúc chất tan được rửa

giải ra ở điểm có nồng độ cực đại (hình 2.1.a). Như vậy nếu gọi tRi là thời gian lưu tổng cộng của

chất tan i thì chúng ta luôn có:

tRi = t0 + t’Ri (2.1)

trong đó t0 là thời gian không lưu giữ và t’Ri là thời gian lưu giữ thực của chất i. nếu t0 = 0 thì ta có

tRi = t’Ri. Trường hợp này chỉ có khi tRi là nhỏ. Còn nói chung chúng ta luôn có :

t’Ri = tRi – t0 (2.2)

với hai chất tan A và B kế tiếp nhau trong sắc đồ thì ta có

= (t’B/t’A)


và được gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B hay còn gọi là hệ số tách của hai chất

đó. Đại lượng này càng lớn thì sự tách càng rõ ràng.

tA

tB

(a)

t0

WB WA

0 t (ph.)

Hình 2.1. Sơ đồ hệ thống HPLC

a. : Nguyên lý chung

b. : Giản đồ sắc ký 4 chất A, B, C và D

B C D

(b) A

0 tA tB tC tD t (ph.)

ở đây :

- G : manometer đo áp suất

- C : cột sắc ký

- t0 : thời gian không lưu giữ

- tA, tB, tC, tD : thời gian lưu giữ của các chất A, B, C và D

- WA, WB : chiều rộng đáy của píc sắc ký

Giá trị t’Ri của một chất tan trong quá trình sắc ký phụ thuộc vào nhiều yếu tố như :

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh,

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan,

Bơm

Van

C

Detector

G


- Trong một số trường hợp phụ thuộc vào cả pH của pha động, nồng độ của chất tạo phức,

nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký.

Trong thực tế giá trị thời gian lưu t’Ri có ý nghĩa rất lớn đối với kỹ thuật sắc ký. Nó cho ta biết

các chất tan trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào trong các điều kiện thí nghiệm đã

chọn. Đồng thời đó cũng là đại lượng để chúng ta phát hiện định tính một chất. Mặt khác trong một

hệ sắc ký chúng ta luôn có :

tRi = L/ui (2.3)

t0 = L/u0 (2.4)

tRi = t0 (1 + k’i) (2.5)

Trong đó ui và u0 là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/gy). Còn k’I là hệ số dung tích của chất

tan I ; L là chiều dài của cột sắc ký.

Ở đây phương trình (2.5) cho phép ta biết được hệ số dung tích của chất tan i qua sắc đồ sắc ký,

nghĩa là biết t0 và tRi thì tính được k’i. Ngược lại nếu biết k’I thì chúng ta cũng dự đoán được thời

gian lưu tRi của chất i vì hằng số dung tích k’I của nhiều chất đã được công bố trong các tài liệu

tham khảo.

B. Thể tích lưu. Thể tích lưu của một chất là thể tích của pha chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời

gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến lúc chất tan được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại.

Nghĩa là tuơng ứng với thời gian lưu tRi. Nếu chất tan không bị lưu giữ thì thể tích lưu của nó sẽ

bằng thể tích Vm của pha động chảy qua cột. Như vậy nếu gọi F (ml/ph.) là tốc độ của pha động qua

cột sắc ký thì ta có.

VR0 = Vm = t0.F (2.6)

VRi = F.tRi (2.7)

hay VRi = VR0.(1 + k’i) (2.8)

Nhưng từ phương trình (2.5) ta có : (1 + k’i) = tRi/tR0. Do đó

VRi = VR0.(tRi/tR0) (2.9)

Như vậy từ phương trình (2.6) ta tính được VR0, rồi từ phương trình (2.9) ta lại tính được VRi

theo thời gian lưu đã thu được trên sắc đồ sắc ký.

Mặt khác chúng ta cũng có :

(VS + Vm) = V0 (2.10)

Trong đó V0 là thể tích trống của toàn cột, VS là thể tích của pha tĩnh trong cột.

Nhưng Vm = F.tR0 nên chúng ta có :

VS = (V0 - F.tR0) (2.11)

Nghĩa là nhờ phương trình này chúng ta có thể tính được thể tích thực VS của pha tĩnh trong cột

2.2.2 Hệ số phân bố và hệ số dung tích

Quá trình sắc ký của các chất tan là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha

động. Sự phân bố này được đặc trưng bởi một đại lượng gọi là hệ số phân bố Ki của chất i. Hệ số

này được định nghĩa là tỷ số nồng độ của chất tan I ở trong pha tĩnh và pha động, và nó được tính

theo công thức :

)(

)(

mC

sCK

i

i

i (2.12)

Trong đó Ci(S) và Ci(m) là nồng độ chất tan i trong pha tĩnh và pha động. Hệ số Ki cho ta biết khả

năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha.

Nhưng hệ số Ki này chưa nói lên được sức chứa (dung tích) của cột sắc ký. Vì thế người ta phải

đưa thêm vào hệ số dung tích k’i. Hệ số dung lượng chỉ cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i

phân bố trong mỗi pha; nghĩa là ta có:


)(

)('

M

s

im

mk (2.13)

Nếu gọi tỷ số pha q = Vs/VM thì ta còn có :

ii Kqk .' (2.14)

Đó là mối quan hệ giữa '

ik và Ki. Đồng thời điều này cũng nói lên rằng hệ số phân bố Ki là hệ

số góc của phương trình '

ik liên hệ với tỷ số pha (2.14)

Mặt khác từ các đại lượng Vs, Vm đã biết ở trên chúng ta lại có :

0

0'

R

RRii

t

ttk

(2.15)

và 0

0.R

RRii

t

ttKq

(2.16)

Đến đây nhờ sắc đồ sắc ký và tỷ số pha q ta lại có thể dự tính được hệ số phân bố của chất tan i

trong mỗi pha của điều kiện sắc ký đã chọn.

Nếu trong hỗn hợp mẫu có hai chất A và B thì tương tự như trong khái niệm lưu giữ chúng ta

cũng có :

0

0

'

'

tt

tt

k

k

A

B

A

B

(2.17)

Như vậy từ tỷ số của hệ số dung tích của hai chất cũng cho ta biết khả năng tách của hai chất kề

nhau trong một hệ sắc ký đã chọn. Ở đây khi khác 1 càng nhiều thì sự tách của hai chất càng rõ

rệt.

2.2.3 Tốc độ tuyến tính của pha động

Trong kỹ thuật HPLC, tốc độ thể tích của pha động luôn có liên quan đến tiết diện cột tách. Vì

thế người ta ít dùng đến khái niệm này, mà thường dùng tốc độ tuyến tính (cm/giây). Khái niệm tốc

độ này cho ta biết trong một đơn vị thời gian (giây) thì pha động dịch chuyển được bao nhiêu cm

trong cột. Tốc độ này không phụ thuộc vào tiết diện của cột tách và cũng không phụ thuộc vào độ

giảm áp trong cột tách theo chiều dài từ đầu cột đến cuối cột. Tốc độ này được tính theo công thức :

0t

Lu (2.18)

hay ..

1.

2

TErFu (2.19)

Trong đó L là chiều dài (cm), r là bán kính cột (mm). ET là hệ số về độ xốp của pha tĩnh. Trong

thực tế của các loại pha tĩnh (chất nhồi cột) hiện nay nó chỉ thuộc một trong hai giá trị sau đây : ET

bằng 0,41 hay bằng 0,82.

Như vậy từ hai công thức trên, chúng ta có thể tính được giá trị của tốc độ tuyến tính u trong

điều kiện sắc ký đã chọn, hay giá trị ET vì :

0

0

2

0

2.

..

.

.. V

tF

rL

tF

ru

FET

(2.20)

Ở đây V0 = L.r2. và các giá trị t0, F, V0 chúng ta đã có từ các dữ liệu thực nghiệm và sắc đồ của

quá trình sắc ký.

Nhưng trong thực tế giá trị ET của pha tĩnh các hãng sản xuất chúng thường cho biết trong

catalog. Vì thế công thức (2.20) cho phép chúng ta xác định thời gian không lưu giữ của chất tan

trong hệ sắc ký đã chọn đó.

2.2.4 Độ thấm dung môi của pha tĩnh

Để đánh giá một cột tách HPLC có tốt hay không, sau khi nạp cột người ta phải kiểm tra 3 yếu

tố :

o Số đĩa của cột (hay chiều cao một đĩa),


o Độ cân đối của píc sắc ký và,

o Độ thấm dung môi của hệ pha.

Theo lý thuyết thống kê và để có độ phân giải tốt thì độ bất đối xứng của píc sắc ký ở hai bên

phải nhỏ hơn 1,1. Hệ số bất đối xứng ASyS. Là tỷ số của độ rộng píc sắc ký ở nửa sau và nửa trước

so với vị trí cực đại và tương ứng chiều cao bằng 1/10 của chiều cao cực đại (HMAX). (xem hình 2.2).

Nếu gọi độ rộng của nửa trước là a và nửa sau là b ta có : ASyS= b/a

Hmax

1/10 a b

Hình 2.2. Sự cân đối của píc HPLC

.

..2

2

0

L

Pdpt (2.21)

Trong đó :

- là độ nhớt của pha động (cP),

- dp là đường kính của hạt pha tĩnh (m),

- p là áp suất đặt vào cột sắc ký (Psi)

- L là chiều dài cột sắc ký (cm).

Với một cột tách được nạp tốt thì giá trị của đại lượng thường nằm trong khoảng từ 500 đến

1200, và chính giá trị này nói lên độ trở kháng của một hệ pha trong những điều kiện sắc ký đã

chọn đó.

2.2.5 Số đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc ký

Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký, người ta dùng khái niệm số đĩa N. Đây

là một đại lượng, về hình thức có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc ký như là một lớp chất nhồi có chiều

cao là H. Tất nhiên đây là lớp có tính chất động và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố

như :

- Đường kính của hạt pha tĩnh,

- Độ xốp của hạt pha tĩnh,

- Tốc độ của pha động trong quá trình sắc ký,

- Độ nhớt của pha động,

- Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột sắc ký.

Vì thế với một hệ pha nhất định và trong những điều kiện sắc ký đã chọn thì chiều cao H cũng

có những giá trị xác định ứng với các chất tan. Chiều cao H được xác định theo công thức : 2

Rit

W.

16

LH (2.22)

Đây chính là chiều cao lý thuyết của một đĩa. Như vậy với một cột sắc ký có chiều dài L thì số

đĩa lý thuyết của cột đó là :

H

LN (2.23)

Khác với độ cân đối của píc, độ thấm dung

môi của một hệ pha lại cho chúng ta biết

độ ổn định và tính lặp lại của hệ pha đó

trong quá trình sắc ký. Đồng thời cũng một

phần nào mô tả sự diễn biến của các cân

bằng phân bố trong một hệ pha tốt hay

không tốt. Tất nhiên đó chỉ là một tham số,

mà thực tế còn nhiều yếu tố khác ảnh

hưởng đến vấn đề này.

Theo lý thuyết động học của quá trình sắc

ký, chúng ta có :


hay là :

2

.16

i

Ri

w

tN (2.24)

ở đây wi là chiều rộng đáy píc sắc ký và tRi là thời gian lưu của chất i (xem hình 2.1).

Tuy nhiên trong thực tế của quá trình sắc ký, số đĩa hiệu lực Nef. và chiều cao hiệu lực Hef. của

một cột sắc ký mới là đại lượng chúng ta cần biết. Vì đại lượng này mới cho ta đánh giá đúng được

một khả năng của cột tách và hiệu quả của nó là như thế nào trong mỗi trường hợp cụ thể. Ở đây

chúng ta có:

20

2

.16 tt

wLH

Ri

ief

(2.25)

và

2

2

0.16i

Rief

w

ttN

(2.26)

hay là 2'

2'1.

i

ief

k

kHH

(2.27)

2'

2'

1.

i

ief

k

kNN

(2.28)

Hai công thức này cho thấy chiều cao hiệu lực Hef của một đĩa luôn luôn lớn hơn chiều cao lý

thuyết, và cũng chính vì vậy mà số đĩa hiệu lực Nef của một cột cũng luôn luôn nhỏ hơn số đĩa lý

thuyết. Đồng thời cũng cho ta biết đại lượng Hef và Nef luôn luôn có quan hệ với hệ số dung tích ki’

của chất tan trong quá trình sắc ký. Điều đó có nghĩa trong một hệ pha đã chọn và trong những điều

kiện sắc ký nhất định thì đối với mỗi chất tan i, các đại lượng Hef và Nef đều là những hằng số đặc

trưng cho quá trình tách sắc ký đó.

Nói chung nếu giá trị Nef là quá nhỏ thì không có sự tách của các chất, hoặc sự tách không hoàn

toàn, nhưng nếu Nef là quá lớn thì cũng không cần thiết vì khi đó píc của các chất tách xa nhau quá

và việc rửa giải tốn nhiều pha động. Theo thực tế của kỹ thuật HPLC người ta thấy rằng trong hầu

hết các hỗn hợp mẫu, giá trị của đại lượng Nef nằm trong vùng từ 2500 đến 5500 là vừa đủ.

2.2.6 Khả năng phân giải

Hai đại lượng H và N đã nói ở trên là những hằng số đặc trưng cho một loại cột tách, nhưng

chúng chưa chỉ rõ cho ta biết hai chất A và B được tách ra khỏi nhau đến mức nào khi nó được rửa

giải ra khỏi cột sắc ký. Vì thế để đánh giá độ tách của các chất trong một hệ pha, người ta phải cần

biết thêm đại lượng độ phân giải R và nó được xác định theo công thức:

BA

RBRA

ww

ttR

''.2 (2.29)

ở đây giá trị t’RA và t’RB là thời gian lưu hiệu lực của hai chất A và B; còn wA và wB là chiều rộng

đáy píc sắc ký của hai chất A và B.

Tất nhiên để đủ điều kiện tối thiểu để hai chất A và B có thể tách ra khỏi nhau thì theo quy luât

phân bố Gaoxơ và theo quy tắc Rayley cực tiểu píc sắc ký của chất A nằm gần nhất là ở vị trí cực

đại của chất B (hình 2.3) và đủ để tách hoàn toàn rõ ràng là cực tiểu phía sau píc của B kề với cực

tiểu píc phía trước của A; tức là R = (wA + wB).

Như vậy nếu R càng lớn thì hai chất A và B càng tách xa nhau,. Lúc này giữa hai píc đã có một

đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc ký (hình 2.3c)

Hình 2.3: Giản đồ sự tách của hai píc sắc ký A và B

a) Tối thiểu để có sự tách, b) Đủ để hai chất

tách khỏi nhau

b) Hai chất tách xa hẳn nhau


a b c

Ngược lại khi R lớn hơn nhiều tổng (wA+wB) là không cần thiết. Vì lúc này ta phải rửa giải tốn

nhiều pha động. Trong thực tế nếu gặp trường hợp này chúng ta phải ứng dụng quá trình rửa giải

gradient để cho chất thứ hai ra nhanh hơn (xem mục 2.11).

Mặt khác thời gian lưu tương đối của hai chất = (tA/tB), nên chúng ta có thể viết:

..

1.

4

1efNR

(2.30)

hay

N

k

kR

i

i .1

.1

.4

1'

'

(2.31)

các công thức này cho phép ta xác định được hệ số phân giải R của hệ pha đã chọn theo các

tham số k’I, N và trong mỗi trường hợp cụ thể của sự tách.

Trong công thức (2.31), đại lượng 4/N đại diện cho hiệu quả hệ thống. Khi số đĩa lý thuyết

gia tăng chúng ta sẽ thu được các píc sắc ký cùng nồng độ gọn hơn, cân xứng hơn. Đại lượng

/1 đại diện cho độ chọn lọc, khi đại lượng này gia tăng các píc tách ra xa nhau hơn. Đại

lượng 1/ kk đại diện cho khả năng lưu giữ của cột tách, khi đại lượng này gia tăng các píc rửa

giải ra muộn hơn.

Khởi đầu

Gia tăng N

Gia tăng k

Gia tăng

Bảng (2.1) dưới đây là một ví dụ cụ thể cho chúng ta biết về mối quan hệ giữa các đại lượng R,

Nef, và .

Bảng 2.1: Mối quan hệ giữa R, Nef. và

Giá trị Số đĩa Nef. tối thiểu phải có ứng với

R = 1,00 R = 1,50

1,05

1,10

1,15

1,25

1,50

7000

2500

1200

500

180

16000

4500

2300

1000

500

Mặt khác cũng từ hai công thức trên, chúng ta có thể xác định được chiều dài cần thiết của một

cột sắc ký. Để có được độ phân giải R mong muốn theo pha tĩnh đã biết dp. Nghĩa là : 2

'

'2

2 1.

1..16

i

i

k

kRN

(2.32)

hay

2

'

'2

2 1.

1..16

i

i

k

kR

H

L

(2.33)

2.2.7 Mối quan hệ giữa H và u


Từ lý thuyết đĩa chúng ta có thể tính được các đại lượng N, H của một hệ cột sắc ký. Nhưng

chưa biết được mối quan hệ của nó với các điều kiện sắc ký, ví dụ như khi nào và làm sao để xác

định được tốc độ tối ưu của pha động. Vấn đề này chỉ được giải quyết khi chúng ta ứng dụng lý

thuyết tốc độ cho hệ cột. Ở đây phương trình Van demter chỉ cho ta mối quan hệ giữa đại lượng H

và u.

Nói chung chiều cao H của một đĩa là phụ thuộc rất rõ rệt vào tốc độ của pha động chảy qua cột

sắc ký trong quá trình rửa giải chất tan. Quan hệ này trong một mức độ nhất định nó được mô tả bởi

phương trình Van demter sau đây :

sm CuCuu

BAH .. (2.34)

(H1+H2+H3+H4)

Như vậy phương trình thực nghiệm này gồm có 4 thành phần đóng góp vào chiều cao toàn phần

của một đĩa. Ở đây thành phần H1 chỉ ra quan hệ chiều cao của một đĩa phụ thuộc vào đường kính

hạt pha tĩnh và nó được xác định theo công thức :

dpH ..21 (a)

hệ số đươc gọi là hệ số nạp cột, theo các kết quả thực nghiệm nếu cột được nạp tốt thì luôn luôn

bằng 1,50. Như vậy ta thấy H1 phụ thuộc tuyến tính vào kích thước hạt pha tĩnh.

Thành phần thứ 2, H2 = B/u. Trong đó nếu F 0,5 ml/ph thì

'..2 mDB (b)

Thành phần chỉ ra cho ta biết ảnh hưởng của sự khuyếch tán D’m của chất tan ở trong pha động

theo hướng chiều dài cột. Còn là một hằng số đặc trưng cho sự khuyếch tán này; nó được coi như

là đường đi của sự khuyếch tán trong một đơn vị thời gian và trong điều kiện nạp cột tốt thì giá trị

của hầu như bằng 1. Như vậy thành phần H2 sẽ là :

u

DH m

'

2

..2 (c)

Ngoài hai yếu tố trên trong quá trình sắc ký còn có quá trình khuyếch tán của chất tan (sự di

chuyển) từ pha tĩnh ra pha động và ngược lại. Vì thế xuất hiện thành phần thứ ba H3 bổ sung thêm

vào chiều cao đĩa. Đó chính là hệ số Cm. Trong những điều kiện thực nghiệm nhất định, hệ số này là

một hằng số, nó phụ thuộc vào kích thước hạt pha tĩnh và hệ số khuyếch tán D’m theo phương

trình :

'

2.

m

mD

dpC

(d)

Ở đây là một hệ số thực nghiệm, nó được quyết định bởi hệ số dung tích k’i của chất tan và

trong hầu hết các trường hợp giá trị của nó nằm vào khoảng 0,047 – 1,00.

Bên cạnh ba thành phần chính đã nêu, thành phần thứ tư H4 cũng đóng góp thêm vào chiều cao

đĩa, nhưng thành phần này là rất nhỏ, và hệ số Cs chính là đặc trưng của thành phần này. Nó mô tả

sự chuyển động khối của chất tan ở trong pha tĩnh. Nên trong hầu hết các trường hợp khi F 1

mL/ph thì thành phần H4 này hầu như bằng 0, nghĩa là quá nhỏ so với ba thành phần trên. Do đó

trong thực tế chúng ta có thể bỏ qua. Chỉ có những trường hợp F nhỏ hơn 0,5 mL/ph thì mới phải

chú ý đến giá trị đóng góp của H4 vào chiều cao chung của đĩa. Lúc này chúng ta có :

'

2.

S

SD

kC

(e)

Trong đó là tỷ khối của pha tĩnh; D’s là hệ số khuyếch tán của chất tan trong pha tĩnh; k là một

hằng số phụ thuộc vào điều kiện nạp cột.


Như vậy, từ các nghiên cứu về các yếu tố thành phần đóng góp vào chiều cao chung của một đĩa,

chúng ta có thể viết :

uD

kuD

dp

u

DdpH

Sm

m ......2

..2'

2

'

2'

(2.35)

Nhưng nếu bỏ thành phần thứ 4 thì ta chỉ còn có :

uD

dp

u

DdpH

m

m ....2

..2'

2'

(2.36)

udpcu

bdpaH

2

Theo công thức này thì khi kích thước hạt càng nhỏ (theo đó chiều cao đĩa lý thuyết nhỏ) thì :

- Hiệu quả tách được gia tăng,

- Duy trì được hiệu quả trên một dải tuyến tính rộng hơn,

- Có khả năng tăng thêm độ phân giải và gia tăng tốc độ tách.

Như vậy có thể thấy hạt nhồi là trung tâm chất lượng quá trình tách.

Phương trình (2.36) này cho ta biết mối quan hệ giữa chiều cao của một đĩa và tốc độ tuyến tính

của pha động u. Nếu biểu thị các đường biểu diễn từng thành phần của phương trình này và đường

biểu diễn tổng cộng trong quan hệ của H với u thì chúng ta có được các đường như trong hình 2.4.

Từ đường biểu diễn quan hệ H-u trong đồ thị này chúng ta thấy với tốc độ tuyến tính u biến

thiên :

- Từ 0 đến u0 thì khi u tăng sẽ đưa đến làm giá trị H giảm đến giá trị cực tiểu H0.

- Còn khi u > u0, thì khi u tăng sẽ đưa đến kết quả làm tăng giá trị của H. Nghĩa là sau u0

thì H luôn luôn lớn hơn H0.

Giá trị u0 được gọi là tốc độ tối ưu của pha động trong điều kiện sắc ký đã chọn, và tương ứng

với u0 ta có giá trị H0.

Giá trị u0 được gọi là tốc độ tối ưu của pha động trong điều kiện sắc ký đã chọn, và tương ứng

với u0 ta có giá trị H0. Trong điều kiện này ta có số đĩa trong cột sắc ký là lớn nhất. Nghĩa là hiệu

suất tách của cột là cao nhất ứng với các điều kiện sắc ký đã chọn đó.

Đến đây, theo phương trình (2.36) chúng ta thấy chiều cao của đĩa trong cột tách phụ thuộc rất

phức tạp vào tốc độ tuyến tính u của pha động, vừa tỷ lệ nghịch (thành phần thứ 2) lại vừa tỷ lệ

thuận (thành phần thứ 3). Đối với kích thước hạt pha tĩnh, vừa bậc nhất (thành phần thứ nhất) vừa

bậc 2 (thành phần thứ 3). Đồng thời cũng liên quan chặt chẽ với hệ số khuyếch tán D’m của chất tan

trong pha động.

Mặt khác, cũng theo phương trình trên, số mũ cao nhất của kích thước hạt pha tĩnh dp là bằng 2.

Nhưng theo thực nghiệm với các hạt có dp nhỏ hơn hay bằng 10 m thì số mũ đó chỉ đến cao nhất

là bằng 1,82. Nói chung với cỡ hạt từ 3 đến 10 m thì nó là từ 1,4 đến 1,85. Còn với cỡ hạt pha tĩnh

lớn hơn (10 đến 15 m) thì số mũ đó xấp xỷ bằng 2 như phương trình trên.

Do đó từ những điều đã nêu, chúng ta có thể viết :

'

' .047,0.2.3

m

m

D

u

u

DdpH (2.37)

Cuối những năm 1960 là những hạt nhồi không xốp phủ lớp phim pha tĩnh, kích thước hạt 40

m; áp lực hệ thống trong khoảng 100-500 psi (7-40 bar) và số đĩa lý thuyết là 5000 đĩa/mét. Đầu

những năm 1970 hạt xốp micro không đồng đều kích thước 10 m, áp lực hệ thống trong khoảng

1000-2500 psi (70-180 bar), số đĩa lý thuyết là 40000 đĩa/mét. Từ những năm 1980 đến nay là sự ra

đời và phát triển của hạt hình cầu, xốp micro có kích thước từ 3,5 đến 5 m, áp lực hệ thống trong

khoảng 1500-4000 psi (110-280 bar) và số đĩa lý thuyết trong khoảng 80000-115000 đĩa/mét. Ngày


nay công nghệ chế tạo và sản xuất hạt nhồi đã tạo ra các loại hạt nhồi hybrid kích thước 1,7 m với

áp lực hệ thống lên đến 15000 psi (1064 bar) và số đĩa lý thuyết đạt được là 235000 đĩa/mét.

H

H

H = A +B/u + Cm.u H3

Cm.u

(H0, u0)

A H1

B/u H2

0 u0 u (ph.)

Hình 2.4: Đường biểu diễn quan hệ H – u

theo phương trình Vaan-Deemter

về cột tách, hạt nhồi và hiệu quả cột tách sẽ được thảo luận trong một mục riêng sau.

Trong điều kiện của tốc độ u0 tối ưu thì:

dp

D

dp

Du mm

,

2

2,

0

.25,6

.

.2

Do đó chúng ta có:

H = 3.dp + 0,34.dp + 0,30.dp # 3,7.dp (2.38)

nếu dp nhỏ hơn 15 m

Công thức (2.38) giúp chúng ta tính nhanh được số đĩa của một cột sắc ký hiện có khi đã biết

được đường kính của hạt pha tĩnh dp. Tất nhiên đó là tính gần đúng, để giúp chúng ta dự đoán về

khả năng tách của cột sắc ký.

Song đồng thời nhiều thực nghiệm cũng cho thấy rằng, nếu dp nhỏ hơn 7 m thì chiều cao đĩa H

chỉ nằm trong khoảng:

H = (2,5 đến 3,2).dp

Chính vì thế mà trong vài năm nay người ta thường có xu hướng dùng các chất nhồi cột (pha

tĩnh) có cỡ hạt đường kính từ 3 đến 5 hay 7 m.

2.2.8 Độ phát hiện

Độ phát hiện của một chất trong một hệ pha đã chọn là phụ thuộc vào nhiều yếu tố của quá trình

sắc ký như:

- thể tích, lượng mẫu được nạp vào cột tách,

- tính chất của pha tĩnh,


- tính chất và thành phần của pha động, (khi có cả giá trị pH),

- tốc độ của pha động và kỹ thuật rửa giải,

- độ nhạy phát hiện của detector và các đặc trưng của nó,

- hệ thống ống dẫn (từ van mẫu đến flowcell của detector),

- tính chất của chất phân tích đối với kỹ thuật phát hiện,

- thiết bị để ghi đo tín hiệu của chất phân tích,….

Các yếu tố này đều ảnh hưởng đến độ phát hiện của một chất. Như vậy, nếu ta chọn được các

yếu tố trên ở điều kiện phù hợp nhất thì chúng ta sẽ có độ nhạy (độ phát hiện) tốt nhất, và lúc này

độ phát hiện chỉ còn do bản chất của chất phân tích quyết định mà thôi.

Do thực tế trên cho nên khi nói đến giới hạn phát hiện của một chất trong kỹ thuật phân tích

HPLC là phải luôn luôn gắn liền với những điều kiện thí nghiệm nhất định và với các loại trang

thiết bị đã dùng để xác định nó.

Nói về giới hạn phát hiện của một chất, trong kỹ thuật HPLC người ta thường dùng 2 khái niệm:

- Giới hạn nồng độ (độ nhậy nồng độ): là nồng độ nhỏ nhất của chất tan i trong dung dịch mẫu

bơm vào cột tách sắc ký để còn thu được tín hiệu sắc ký của nó, ví dụ chiều cao píc, bằng ba lần dao

động của tín hiệu nền; nghĩa là phải có:

ncmh .3)( (2.39)

Trong đó n là dao động của tín hiệu nền.

- Giới hạn tuyệt đối (độ nhạy tuyệt đối): là khối lượng nhỏ nhất của chất tan i (tức là q = Vs.Csi)

cần phải nạp vào cột tách sắc ký để cũng thu được tín hiệu sắc ký thoả mãn điều kiện như công thức

(2.39).

Thực tế phân tích, trong hai khái niệm này khái niệm độ nhạy nồng độ được sử dụng phổ biến

hơn. Vì dùng đại lượng độ nhạy nồng độ, người ta dễ dàng so sánh độ phát hiện của các chất trong

điều kiện đã chọn mà không cần phải tính toán ra giá trị tuyệt đối.

2.2.9 Nồng độ chất tan trong quá trình sắc ký

Trong quá trình sắc ký, nếu ta nạp vào cột tách một thể tích mẫu là VS ml thì lượng chất phân

tích i được nạp vào cột tách đó là:

s. iSi CVQ (2.40)

Như thế nồng độ cực đại của chất tan i được rửa giải ra ứng với thời gian lưu tRi sẽ là:

vi

ii

QC

..2max, (2.41)

Trong đó vi là độ lệch chuẩn theo thể tích của chất tan i. Đồng thời biểu thức này cho ta thấy,

nồng độ cực đại của chất tan được rửa giải ra là tỷ lệ nghịch với độ lệch chuẩn vi. Nghĩa là khi độ

lệch chuẩn vi giảm thì giá trị Ci,max sẽ tăng; tức là chất tan i ít bị pha loãng trong quá trình sắc ký

kể từ lúc nó được nạp vào cột cho đến lúc được rửa giải ra khỏi cột. Đó chính là điều mà trong thực

tế chúng ta luôn mong muốn.

Mặt khác, nếu gọi Vmax (ml) là thể tích rửa giải của pha động ứng với nồng độ Cmax thì chúng ta

có:

.2max

0max

N

V

CC (2.42)

Trong đó N là số đĩa lý thuyết của cột tách; C0 là nồng độ của chất tan (tính bằng mol/l) được

nạp vào vòng mẫu.

Còn ứng với thể tích rửa giải Vx (ml) của pha động thì nồng độ chất tan tại thời điểm đó sẽ là:

Bùi Đặng Thanh -26- Kỹ thuật sắc ký lỏng 2

max

.2

max .

xmzx

x

VV

VVN

vx eCC (2.43)

Tất nhiên nồng độ chất tan phân bố trong pha động và pha tĩnh là tuân theo quy luật phân bố

Lăngmuir tuyến tính và cả không tuyến tính (hình 2.6). Ở đây xảy ra theo 3 dạng:

Ci,max NL1 L

NL2

Hmax

tRi

Hình 2.5 Phân bố nồng độ chất tan Hình 2.6 Quy luật phân bố Lăngmuir

- Kiểu đẳng nhiệt tuyến tính (đường L). Trường hợp này hiếm có, đó là trường hợp lý tưởng và

chỉ có được với vùng nồng độ chất tan rất nhỏ. Trong trường hợp này thì k’i = q.Ki. Điều này có

nghĩa là hệ số phân bố Ki chính là hệ số góc của đường L, biểu diễn mối quan hệ giữa hệ số dung

tích và tỷ số pha q. Hay nói cách khác đó là hệ số dung tích không phụ thuộc vào nồng độ và trong

trường hợp này píc sắc ký có hai nhánh hai bên là hoàn toàn cân đối nhau. Đây là trường hợp lý

tưởng, và chỉ có được trong trường hợp nồng độ chất tan rất nhỏ. Ngược lại trong thực tế thường

xảy ra như trong hai đường phân bố NL1 và NL2. Các trường hợp này píc sắc ký sẽ không cân đối,

và mức độ cân đối là phụ thuộc vào từng chất tan, nồng độ của nó và cũng như điều kiện sắc ký đã

được chọn.

2.2.10 Độ lệch chuẩn

Độ lệch chuẩn là một đại lượng đặc trưng cho một píc sắc ký và một quá trình tách sắc ký của

một hỗn hợp. Theo quy luật phân bố Gauxo, độ lệch chuẩn này được định bởi chiều rộng của píc

sắc ký ứng với 0,607 chiều cao của píc sắc ký Hmax (hình 2.7)

Hmax

0,607 Hmax

Và theo một hướng trục zi nào đó thì chúng ta có:

iz zH . (2.44)

Trong đó H là chiều cao lý thuyết của một đĩa.

Hình 2.7 Mô tả độ lệch

chuẩn của píc sắc ký


Như vậy tương ứng với các đại lượng lưu giữ, ở đây chúng ta sẽ có độ lệch chuẩn theo thời gian

t và độ lệch chuẩn theo thể tích v. Đồng thời độ lệch chuẩn theo thời gian sẽ là :

i

Zt

u

(2.45)

Hay Rit tH

L. (2.46)

Còn độ lệch chuẩn theo đơn vị thể tích sẽ là :

N

VRiV (2.47)

Nhưng nên nhớ rằng các công thức tính toán trên không đúng cho quá trình rửa giải gradient mà

chỉ phù hợp cho quá trình rửa giải ở tốc độ pha động không đổi và nồng độ pha động (thành phần

pha động) là không đổi trong suốt quá trình sắc ký.

2.2.11 Sự mở rộng của píc sắc ký

Sự mở rộng píc ngoài các yếu tố và điều kiện tách trong cột sắc ký quyết định, nó còn có sự

đóng góp của các yếu tố khác trong toàn bộ hệ thống HPLC ; ví dụ như : van bơm mẫu, hệ thống

ống dẫn từ van bơm mẫu đến detector, flowcell của detector,…

Như vậy độ rộng tổng cộng của píc sắc ký sẽ là :

22

det

222

lcolinjtot (2.48)

(A) (B) (C) (D)

Ở đây các thành phần (A), (B), (C) và (D) là độ rộng píc sắc ký do các yếu tố van bơm mẫu, cột

tách, detector và đường dẫn quyết định. Trong đó các thành phần (A), (B) và (D) là ta không mong

muốn, nó phải được loại trừ hoặc chọn điều kiện để nó không đổi và ở giá trị nhỏ nhất. Có như thế

chúng ta mới có hiệu suất tách tốt và píc sắc ký mới phản ánh đúng quá trình tách trong cột sắc ký.

Nói chung phải bảo đảm sao cho ba thành phần phụ này không chiếm lớn hơn 10% tổng độ rộng

của píc chung.

Trong van bơm mẫu, độ mở rộng píc ở đây là do vòng chứa mẫu (loop) và đường ống dẫn từ

van vào đến đầu cột tách. Vòng mẫu là yếu tố xác định ta không thể thay đổi được. Vì thế đuờng

ống dẫn phải càng ngắn càng tốt. Nói chung khi thể tích mẫu nhỏ hơn 20 l và đoạn đường dẫn mẫu

này nhỏ hơn 5 cm thì yếu tố (A) gần như bằng 0. Nhưng khi thể tích mẫu VS tăng thì thành phần

(A) cũng tăng theo (hình vẽ 2.8)

inj.

10

5

(A)

a

20 40 60 80 VS (l)

Cùng với van bơm mẫu, khi đường dẫn trong hệ HPLC càng dài, thì nó đóng góp vào sự mở

rộng píc sắc ký càng lớn (hình 2.9). Nghĩa là píc sắc mẫu bị biến dạng càng lớn, khi nó chảy qua

đường dẫn càng dài. Vì thế các ống dẫn trong hệ thống HPLC (từ van bơm đến flowcell) làm càng

ngắn càng tốt và các ống nối đó phải có cùng đường kính trong.

Hình 2.8 Sự phụ thuộc của

thành phần (A) vào thể

tích mẫu nạp vào cột tách


……. ……

Hình 2.9 Sự mở rộng píc do đường dẫn

Thành phần sau cùng là flowcell của detector. Thành phần này chúng ta không thay đổi được,

nó đã được tối ưu bởi các hãng chế tạo máy HPCL sao cho ở mức độ nhỏ nhất cho phép. Như vậy

đối với chúng ta là phải tiêu chuẩn hoá hai thành phần (A) và (D) để có được sự tách tốt nhất.

Nhưng trong phân tích lượng vết, chúng ta thường phải bơm thể tích mẫu VS tương đối lớn để

tăng độ phát hiện của chất. Vì thế phải chọn giá trị VS lớn, nhưng sao cho thành phần (A) vẫn nhỏ

hơn 10% độ rộng tổng. Nghĩa là VS không nằm trong vùng quá dốc của đường (A) trong hình 2.8.

Lúc này độ lệch chuẩn được tính theo công thức:

2222 . SV VKa (2.49)

Trong đó K là một hằng số thực nghiệm, nó nằm trong khoảng từ 0,35 đến 1,00.

Ví dụ với hệ cột tách kích thước 150 x 4 mm, hệ số dung tích k’i = 2 và K = 1 thì giá trị VS có

thể lên đến 50 l ta vẫn thu được độ mở rộng píc nhỏ hơn giới hạn cho phép.

Mặt khác, chúng ta phải luôn luôn nhớ rằng, khi độ mở rộng píc tăng thì nồng độ rửa giải của

chất tan tại thời gian lưu tR sẽ bị giảm. Vì theo công thức:

iV

ii

QC

,

max,2

(2.50)

Trong đó Qi = VS.Ci là lượng mẫu được nạp vào cột tách.

Như vậy trong quá trình sắc ký chất tan luôn luôn bị pha loãng và độ pha loãng đó được tính

theo công thức:

V

SVF

2 (2.51)

Nhưng nhiều kết quả thực nghiệm cho thấy rằng, nếu VS nằm trong khoảng 0,35-0,55 giá trị độ

lệch chuẩn v,i thì hệ số pha loãng mẫu F trong qúa trình sắc ký thường nằm trong vùng từ 2,5 đến

3,2 lần. Đó là điều kiện bình thường và tất nhiên trong quá trình sắc ký chúng ta phải luôn cố gắng

chọn các điều kiện phù hợp để giá trị F nằm trong phạm vi nói trên, hoặc nhỏ hơn càng tốt. Vì nếu

không chúng ta sẽ làm giảm độ nhạy của phương pháp.

2.2.12 Thời gian không lưu giữ t0

Trong quá trình sắc ký, các quá trình hoá lý xảy ra trong cột tách là những quá trình, những cân

bằng động giữa chất tan với pha động và pha tĩnh. Đó là những quá trình phức tạp, sảy ra đồng thời

với nhau và luôn có ảnh hưởng tương hỗ đến nhau kể từ lúc chất mẫu được nạp vào cột tách cho

đến lúc chúng được rửa giải ra khỏi cột tách. Khi chất mẫu được nạp vào cột và trong quá trình sắc

ký như thế, một phân tử của chất tan luôn luôn nhảy từ pha tĩnh vào pha động và ngược lại, kể từ

đầu cột đến cuối cột tách. Như thế trong suốt thời gian lưu tR của nó ở trong cột tách, phân tử chất

tan đã có hàng ngàn lần nó bị pha tĩnh hấp phụ, rồi lại bị rửa giải vào pha động cùng với sự chuyển


dịch của pha động từ đầu cột tách đến cuối cột tách. Trong quá trình đó, lúc chất tan bị pha tĩnh lưu

giữ, tức là lúc nó bị pha tĩnh hấp thu. Còn lúc nó tan trong pha động thì nó chuyển động theo pha

động mà không bị lưu giữ. Như thế thời gian chất tan bị lưu giữ thực sự trong pha tĩnh, tức là trên

cột tách sẽ là:

0

, ttt RRi (2.52)

ở đây t0 được gọi là thời gian không lưu giữ của chất tan.

Như vậy trong mỗi hệ pha, thời gian không lưu giữ của chất tan là khác nhau. Với một pha tĩnh

nhất định thì nó phụ thuộc vào thành phần của pha động. Từ những nghiên cứu thực nghiệm người

ta thấy rằng, trong những hệ pha có thời gian lưu của chất tan không lớn thì giá trị của t0 là rất nhỏ,

có thể gần như bằng 0, nếu tRi nhỏ hơn 5 phút và trong một hệ pha, một điều kiện sắc ký nhất định

thì tất cả các chất trong một mẫu đều có một giá trị của thời gian không lưu giữ t0. Giá trị t0 này đặc

trưng cho các chất mẫu đó trong điều kiện sắc ký của hệ pha đã chọn và nó cũng chỉ thay đổi khi

thành phần của pha động thay đổi.

Việc xác định giá trị thời gian không lưu giữ t0 là một vấn đề hết sức phức tạp và khó khăn. Nó

đòi hỏi phải có trang bị đặc biệt. Đến nay đã có nhiều phương pháp được đề nghị sử dụng để xác

định t0, nhưng chưa có phương pháp nào phù hợp cho tất cả các trường hợp và cho kết quả chính

xác, tất cả chỉ là những số liệu gần đúng. Hơn nữa trong thực tế của kỹ thuật phân tích HPLC, giá

trị thời gian không lưu giữ t0 ít liên quan đến kết quả tách sắc ký và cũng không ảnh hưởng đến sự

tách của môt hỗn hợp mẫu. Vì thế hầu hết các trường hợp khi cần thiết người ta thường xác định

bằng thực nghiệm theo một chất không lưu giữ. Ví dụ như trong hệ pha ngược người ta hay dùng

urasil. Còn ý nghĩa thực tế của việc xác định giá trị thời gian lưu t0 chỉ giúp ta trong việc nghiên cứu

dự đoán khả năng bị lưu giữ của một chất trong hệ pha nhất định.

2.3 Pha tĩnh trong HPLC

Cũng như sắc ký cột ở áp suất thường, pha tĩnh (stationenary phase) trong sắc ký lỏng cao

áp (HPLC) chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích. Nó là những

chất rắn, xốp và có kích thước rạt rất nhỏ. Trước đây và thậm chí hiện nay vẫn phổ biến hạt có kích

thước trong dải 3-10 m với diện tích bề mặt riêng thường từ 50-500 m2/g. Hiện nay với sự ra đời

của kỹ thuật tách sắc ký lỏng siêu hiệu quả UPLC, hạt nhồi cũng đã đạt đến kích thước nhỏ hơn đến

cỡ 1,7 m. Pha tĩnh trong HPLC là một yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp chất

mẫu và căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta thường chia nó

thành nhiều loại như: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử. Tương ứng với loại chất nhồi

như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật tách HPLC. Các loại đó là:

1. Sắc ký hấp phụ

Trong loại này lại có hai hướng là:

- Hấp phụ pha thường (NPHPLC) và

- Hấp phụ pha ngược (RP-HPLC)

Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên tính chất hấp phụ bề mặt của pha

tĩnh. Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ. Vì thế tất cả các tính chất động học hấp phụ đều có ảnh hưởng

đến sự tách của một hỗn hợp chất mẫu.

2. Sắc ký trao đổi ion và cặp ion

Ở đây cơ chế ở trong cột tách là sự trao đổi ion giữa những ion trong hỗn hợp mẫu và ion đối

(ion trao đổi) của pha tĩnh. Cho nên các tính chất của các cân bằng trao đổi ion đều ảnh hưởng đến

kết quả tách.

3. Sắc ký chiết

Bản chất sự tách ở đây là sự phân bố động trong dòng chảy của chất phân tích giữa hai pha, pha

động và pha tĩnh. Pha tĩnh cũng là chất lỏng, nó được “treo” (phủ) trên bề mặt của chất mang trơ


nhồi trong cột tách tạo thành một lớp màng mỏng độ dày từ 2 đến 3 m. Sự tách trong loại sắc ký

này là tuân theo các quy luật phân bố của chất tan giữa hai pha không trộn lẫn với nhau.

4. Sắc ký rây phân tử

Sự tách ở đây là dựa theo kích thước của phân tử các chất mẫu được phân bố khác nhau vào

trong lỗ xốp của pha tĩnh, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui vào sâu bên trong lỗ xốp, nên được

rửa giải ra sau. Còn các phân tử có kích thước lớn nằm ở ngoài nên sẽ được rửa giải ra trước.

Tuy có 4 loại sắc ký như thế trong HPLC, nhưng pha tĩnh chỉ có hai trạng thái hoặc là rắn hoặc

là lỏng. Nếu pha tĩnh là chất rắn người ta có sắc ký LSC (Liquid Solid Chromatography), nếu pha

tĩnh là chất lỏng thì chúng ta có sắc ký LLC (Liquid Liquid Chromatography). Nhưng khi pha tĩnh

là chất lỏng thì bắt buộc nó phải được giữ trong cột tách nhờ một chất mang trơ rắn có cấu tạo hạt

kích thước nhỏ thường từ 5 đến 10 m (đường kính). Nghĩa là pha tĩnh là một lớp màng bao quanh

hạt chất mang trơ. Chất mang trơ thường là các hạt silica hay oxit nhôm trơ đã được chế tạo trong

điều kiện đặc biệt để không còn tính chất sắc ký nữa. Song dù ở dạng nào thì pha tĩnh trong HPLC

cũng phải thoả mãn những điều kiện dưới đây:

- Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký, không có phản ứng hoá học phụ với dung

môi rửa giải hay với chất phân tích, để đảm bảo cơ chế của sự tách là theo đúng bản chất của pha

tĩnh. Ở đây pha tĩnh không chỉ cần bền về mặt hoá học (khi phải chịu đựng pha động là dung môi

hữu cơ và có độ phân cực thay đổi thường xuyên như trong sắc ký gradient) mà còn bền cả về mặt

cơ học. Đặc biệt sự ra đời của kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu quả UPLC thì hạt nhồi cột tách cần

được chế tạo và có những cấu trúc đặc biệt mới có thể chịu được áp suất lỏng cao lên đến 15000 psi.

Chúng ta sẽ tiếp tục thảo luận kỹ hơn về chủ đề này trong mục nói về cột tách và hiệu quả cột tách.

- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong những điều kiện sắc ký

nhất định.

- Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó và không bị thay đổi hay

biến dạng trong quá trình sắc ký. Không bị phân rã dưới áp suất cao của quá trình tách.

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt. Có như thế mới bảo đảm

thu được kết quả tách tốt.

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất, nghĩa là đường kính của hạt lớn nhất so với hạt nhỏ

nhất không hơn kém nhau quá 15%. Có như thế cột tách mới có hiệu lực cao.

Trên đây là các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC.

Nhưng xét về mặt cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, thì pha tĩnh này có hai kiểu xốp: xốp

toàn phần hạt và xốp chỉ lớp vỏ ngoài (còn gọi là xốp bề mặt).

Trong loại xốp toàn phần, toàn bộ hạt chất nhồi là xốp. Còn loại xốp bề mặt thì chỉ có một lớp

vỏ của hạt chất nhồi là xốp, lớp này có bề dày từ 2-3 m và lõi của hạt chất nhồi là viên bi đặc và

trơ. Vì thế loại xốp toàn phần có dung lượng lớn và thông thường các hạt chất nhồi loại này có:

+ Bề mặt riêng lớn, từ 80-500 m2/g,

+ Thể tích xốp lớn, thường là từ 0,5-2 mL/g.

Tiêu biểu cho loại này có Silica- Si40, -Si60, -Si100, RP-18, RP-8 (hãng Merck), Hypersil,

Hypersil ODS (hãng Shandow), -Partisil, ODS-Partisil (hãng Whatman), N-Zôrbax, ODS-Zôrbax

(hãng Du Pont), ODS-Sil-X1, Sil-X1 (hãng Perkin-Elmer),v…v….

Loại xốp bề mặt có dung lượng nhỏ, bề mặt xốp có đặc trưng:

+ Bề mặt riêng nhỏ, thường là từ 15-80 m2/g,

+ Bề dày lớp xốp: từ 2-3 m,

+ Thể tích xốp nhỏ: từ 0,1-0,5 ml/g.

Ví dụ về loại này có: LiChropher-C8, -C18 (hãng merck), C18-Corasil, Phe-Corasil, Corasil-I, -

II (hãng Whatman),


Ngoài các đặc trưng trên, mối quan hệ giữa chiều cao đĩa H và tốc độ tuyến tính u trong hai loại

chất nhồi xốp toàn phần và xốp bề mặt cũng là khác nhau. Điều này chúng ta có thể thấy rõ ràng

trong hình 2.11. Chính vì thế loại xốp toàn phần được sản xuất và sử dụng nhiều hơn.

Bây giờ nếu nghiên cứu về mặt tổng hợp pha tĩnh trong HPLC thì cho đến nay người ta thấy pha

tĩnh thường được chế tạo trên các chất nền sau đây:

- Pha tĩnh trên nền Silica (SiO2),

- Pha tĩnh trên nền oxit nhôm(Al2O3),

- Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ (Polystirene, Cellulo,…),

- Pha tĩnh trên nền mạch cacbon

Trong 4 loại này thì nền Silica được sử dụng nhiều nhất và pha tĩnh chế tạo trên nền này cũng

có nhiều ưu việt hơn, như là khả năng chịu áp cao, độ trương nở nhỏ khi thay đổi dung môi rửa giải,

bền nhiệt.

A. Pha tĩnh trên nền Silica

Trên nền silica các hãng đã chế tạo được rất nhiều chất nhồi cột khác nhau cho kỹ thuật HPLC.

Ở đây có hai loại silica hấp phụ cho NP-HPLC và RP-HPLC. Đó là các silica trung tính và silica đã

alkyl hoá, sulfonic hoá, nitro hoá, amin hoá hay xyal hoá, để tạo ra các chất nhồi cho sắc ký hấp phụ

pha thường, pha ngược, sắc ký trao đổi ion, sắc ký rây phân tử. Sau đây chúng ta sẽ chỉ điểm qua

một vài chất nhồi cho mỗi loại. Về các chất nhồi mới tổng hợp được gần đây, những chất nhồi với

nhiều tính năng ưu việt và chất nhồi cụ thể theo ứng dụng, chất nhồi dùng trong sắc ký lỏng siêu

hiệu qủa UPLC sẽ được đề cập đến trong mục chuyên về cột sau.

Silica trung tính: Đây là chất nhồi cột của sắc ký lỏng cao áp pha thường (NP-HPLC). Loại này

trên bề mặt của nó còn chứa các nhóm OH. Đó là các nhóm hoạt động của silica, các nhóm này

phân cực và thuộc nhóm ái nước (ưa nước). Ví dụ như các LiChrosorb-Si40, -Si60, -Si100, Hypersil,

-Partisil, Micropark-Si,…v…v. Loại chất nhồi này dùng để tách các chất không phân cực và ít

phân cực.

H (mm)

0,8 (2)

0,4

(1)

0 2 4 u Hình 2.10 Mối quan hệ giữa

độ xốp của pha tĩnh với H và u

(1) : Xốp toàn phần. (2) : Xốp bề mặt

Silica đã được alkyl hoá : Đây là pha tĩnh của sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC). Nó được

điều chế từ các silica trung tính qua việc alkyl hoá các nhóm OH trên bề mặt silica bằng các gốc

alkyl-R của mạch cacbon thẳng (-C2, -C8, -C18) hay các cacbon vòng như nhân phenyl. Việc gắn các

gốc alkyl vào phân tử silica có thể là trực tiếp hoặc thông qua một nguyên tố trung gian như oxy.

Chính do bị thế mất các nhóm –OH nên bề mặt của chất nhồi loại này là không phân cực hay rất ít

phân cực. Về chất nhồi loại này có Hypersil ODS (-C18, hãng shandow), LiChrosorb RP-8, RP-18

(hãng Merck), C-18 Corasil, Phenyl-Corasil (hãng Whatman),… Các chất nhồi loại này là pha tĩnh

để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực và có thể cả cho sắc ký cặp ion.

Dung môi cho pha tĩnh loại này là các chất hữu cơ phân cực như methanol, axetonitril, nước hay

hỗn hợp của các chất này với nhau theo tỷ lệ nhất định.

Pha tĩnh loại này là kỵ nước, nghĩa là bề mặt hoạt động của nó không bị ảnh hưởng bởi các phân

tử nước, mà trái lại nước lại là một thành phần của dung môi rửa giải có ý nghĩa thực tế lớn. Sự tách

Pha động của loại hạt này là những chất không

phân cực hay ít phân cực. Nó thường là các

dung môi hữu cơ đơn, hoặc là hỗn hợp của hai

hoặc ba dung môi không trộn lẫn được với

nước (không tan trong nước). Lấy ví dụ như n-

hexane, n-heptane, benzen, toluen, cloroform,

ethyl axetate….

Pha tĩnh loại này nước có ảnh hưởng rất nhiều

đến bề mặt hoạt động của chúng (tức là các

nhóm OH ái nước). Chính yếu tố này có ảnh

hưởng đến độ lặp lại của quá trình sắc ký.


với chất nhồi loại này có độ lặp lại tốt. Do đó hiện nay chất nhồi loại này được ứng dụng nhiều hơn

loại silica trung tính cho việc tách và phân tích nhiều hỗn hợp mẫu khác nhau.

Các silica đã được sulfonic hoá hay nitro hoá : Đây là sản phẩm của sự sulfonic hoá hay nitro hoá

các silica trung tính bằng các nhóm –SO3H hay –NO2H. Pha tĩnh loại này thuộc nhóm sắc ký trao

đổi ion (cation). Vì loại nhóm chức –SO3H và –NO2H có ion H+ có thể trao đổi được với các cation

kim loại khác. Đó là pha tĩnh trao đổi cation mạnh. Nhưng nếu ta thay nhóm OH bằng nhóm –R-

COOH thì ta có pha tĩnh trao đổi cation axit yếu. Trong thực tế, sau khi tạo được các nhóm chức

trên người ta thường để pha tĩnh này ở dạng muối của ion kim loại kiềm Na+. Nghĩa là –SO3Na, -

NO2Na, -R-COONa, và chính nhóm chức này quyết định bản chất sắc ký của loại pha tĩnh này. Ví

dụ về loại này có Lichrosorb KAT (hãng Merck), Partisil SCX (hãng Whatman), Hypersil-CEX

(hãng Shandow) và nhóm chức của –SO3Na.

Pha tĩnh loại này dùng để tách các chất có cấu tạo ion, như ion các kim loại và hợp chất của

chúng, hay các chất khi tan trong pha động thì phân ly thành ion (cation và anion), như các axit, các

bazơ. Pha động của loại sắc ký này là dung dịch nước của các muối, có chứa chất đệm, chất tạo

phức, dung dịch axit hay bazơ, hoặc có thể thêm các chất hữu cơ tan trong nước.

Các silica được amin hoá: Loại này là những silica trung tính đã được thay thế nhóm OH bằng các

nhóm –NH2, -NH, -NR2, -NR3, -CH2(OH). Nó là chất nhồi cột của sắc ký trao đổi anion, để tách các

anion trong hợp chất có cấu trúc ion, hay những chất khi tan trong pha động thì phân ly thành ion

như các bazơ, các axit. Pha động của loại này cũng là dung dịch nước của các muối, chất đệm, dung

dịch axit hay bazơ. Thuộc về loại này có Lichrosorb-NH2, Lichrosorb-CN, Nucleosil-5NH2, -

N(CH3), -SB-N(CH3)2Cl, Partisil-SAX, Micropark-CN, Hyperasil-APS.

Đến nay, pha tĩnh trên nền silica đã có hàng trăm chất khác nhau. Nhưng chỉ thuộc hai loại là

silica trung tính và các silica đã bị alkyl hoá, sulfonic hoá, nitro hoá hay amin hoá các nhóm OH để

thay đổi tính chất bề mặt hoạt động của nó. Trong đó các silica đã được alkyl hoá là được sử dụng

phổ biến hơn cả vì nó có nhiều ưu việt hơn và phục vụ được cho sự tách cả các chất không phân cực,

ít phân cực và phân cực. Mặt khác pha động của nó lại là trên nền dung dịch chứa nước, là dung

môi phổ biến và kinh tế.

B. Pha tĩnh trên nền oxit nhôm

Trên nền oxit nhôm của sắc ký hấp phụ cổ điển, ngày này người ta cũng đã chế tạo được một số

chất nhồi cột cho kỹ thuật HPLC. Nhưng chủ yếu vẫn chỉ là những chất nhồi của sắc ký hấp phụ

pha thường. Bề mặt của loại pha tĩnh này cũng phân cực và có hai trung tâm phân cực. Đó là trung

tâm axit (Al+) và trung tâm bazơ (O-), nhưng trung tâm bazơ mạnh hơn. Vì thế pha tĩnh này có tính

bazơ yếu (pH: 8-12). Do tính chất này, nên pha tĩnh trên nền oxit nhôm phù hợp cho sự tách hỗn

hợp của các axit yếu.

Chất nhồi loại này có bề mặt phân cực, nên cũng ái nước và vì thế nước cũng có ảnh hưởng đến

sự tách. Nghĩa là nó cũng giống như các silica trung tính. Thuộc loại này có Lichrosorb-AloxT

(Merck), MicroParrk-Al (Varian), Perisorb-A5y,-A1Oy (USA), Oxid-Al-18 (Pharma, Thuỵ Điển).

Dung môi của pha tĩnh loại này cũng là cũng là các chất hữu cơ phân tử không phân cực hay ít

phân cực hay hỗn hợp của chúng với nhau theo những tỷ lệ phù hợp. Ví dụ n-hexane, n-heptane,

ethyl acetate, benzene, chloroform. Nó cùng pha các dung môi kỵ nước.

Song hiện nay trong kỹ thuật HPLC, chất nhồi loại này không được dùng nhiều như các silica.

Vì hầu hết các quá trình tách trên chất nhồi nền silica và nền oxit nhôm thì trong nhiều trường hợp

nền oxit nhôm cho kết quả không tốt (độ nhạy và độ lặp lại) như trên nền silica. Mặt khác oxit

nhôm (Al2O3) lại có nhiều dạng thù hình, trong đó chỉ có dạng mới có tính chất sắc ký tốt.

C. Pha tĩnh trên nền các chất cao phân tử hữu cơ

Hiện nay pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC được chế tạo trên nền của các chất cao phân tử hữu cơ

hiện chưa nhiều và việc ứng dụng nó cũng còn hạn chế. Vì pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ có

độ trương nở lớn khi thay đổi thành phần dung môi rửa giải, cũng như là khả năng chịu áp suất của


nó rất kém. Độ trơ với dung môi, kiềm, axit không cao. Các nhóm amin thường lại dễ bị phân huỷ.

Cho nên người ta chỉ sản xuất một vài loại chất nhồi trên nền này cho sắc ký trao đổi ion mà thôi.

Chất cao phân tử hữu cơ hay được dùng là polystyren, polyamid, cellulô. Trên nền cao phân tử này

người ta gắn vào các nhóm chức trao đổi ion như –SO3H, -NO2H, -R-COOH, -NH2, -NH,

-N(CH3)Cl, -N(CH2)Cl,… ví dụ thuộc loại này có: Aminex A4, Aminex A5, Aminex PA35, AA-15

(có nhóm chức SO3Na), Aminex A14, Aminex A25, DAP-8, PA-8 (nhóm chức loại NR3, R là gốc

methyl, ethyl,…)

Là loại chất nhồi của sắc ký trao đổi ion nên pha động ở đây cũng là dung dịch nước của các

muối, có chứa các chất đệm, chất tạo phức, dung môi hữu cơ tan trong nước, cũng như các dung

dịch axit hay bazơ.

D. Pha tĩnh trên nền mạch cacbon

Loại pha tĩnh trên nền của mạch cacbon (than) tinh khiết cũng đã được tổng hợp và nghiên cứu.

Song các kết quả tách sử dụng chất nhồi loại này đều không ưu việt hơn các loại silica. Vì tính chất

sắc ký của nó không tốt, việc điều chế cũng khó khăn. Vì thế hiện tại đang còn trong những nghiên

cứu lý thuyết là chủ yếu.

E. Pha tĩnh lỏng

Pha tĩnh lỏng chính là chất nhồi cột của hệ sắc ký phân bố (LLC) hay còn gọi là sắc ký chiết. Vì

sự tách ở đây thực chất là sự phân bố chiết liên tục của chất tan trong dòng chảy của pha động.

Chúng ta có thể coi pha tĩnh loại sắc ký này gồm 2 phần. Phần lỏng và phần rắn, phần lỏng có tính

chất sắc ký, còn phần rắn là lõi (nhân) trơ, tức là không có tính chất sắc ký. Phần lỏng tạo thành lớp

màng mỏng (0,5-1m) bao quanh phần rắn. Phần rắn trơ được gọi là chất mang. Nó là các hạt silica,

hạt oxit nhôm trơ có đường kính từ 5 -7m. Ví dụ như các loại Kiselkur của hãng Merck. Các chất

mang trơ được nhồi trước vào cột tách, sau đó cho pha tĩnh chảy qua để bão hoà chất mang trơ. Như

vậy pha tĩnh lỏng sẽ phủ lên bề mặt chất mang trơ tạo thành một lớp màng lỏng có tính chất sắc ký.

Pha tĩnh lỏng là một số hợp chất hữu cơ có độ nhớt cao, hay một số chất hữu cơ silicon. Ví dụ:

Cyano-Ethyl-Silicon

Các Glycol (Diethylen-Glycol)

Carbowax 400, 600, 750,

Di-(2-Ethyl-hexyl)-phosphoric acid,

Di-Methyl-Silicone,….

Do cấu trúc của pha tĩnh chỉ là một lớp mỏng, nên pha tĩnh loại này có dung tích nhỏ. Bề dày,

tính chất của lớp màng pha tĩnh này cũng dễ bị ảnh hưởng bởi áp suất cao, sự hoà tan của pha động.

Đó là nhược điểm của pha tĩnh loại này. Nhược điểm này dẫn đến kết quả cuối cùng của quá trình

tách sắc ký là độ lặp lại, độ bền vững của hệ pha. Chính vì thế pha tĩnh loại này cũng chỉ được sử

dụng trong trong một số trường hợp nhất định mà chất nhồi trên nền silica không tốt, hay một vài

trường hợp đặc biệt.

Trên đây là một số khái niệm cơ bản về một số pha tĩnh trong kỹ thuật phân tích HPLC. Những

vấn đề chi tiết hơn sẽ được trình bày trong từng loại sắc ký cụ thể. Nhưng dù là loại sắc ký nào đi

nữa, thì một đặc trưng hết sức quan trọng của pha tĩnh là diện tích bề mặt xốp và tính chất của nó.

Đặc trưng này ảnh hưởng rất rõ rệt đến hệ số dung tích của chất tan trong hệ pha đó. Tức là ảnh

hưởng đến thời gian lưu giữ và kết quả của sự tách sắc ký. Nói chung khi diện tích bề mặt riêng của

pha tĩnh tăng thì hệ số dung tích k’i của chất tan cũng tăng theo. Tất nhiên là trong mức độ khác

nhau.

Như vậy rõ ràng sự lưu giữ của mỗi chất tan trên cột tách là khác nhau đối với các chất nhồi cột

khác nhau về diện tích bề mặt riêng. Ngay trong một loại pha tĩnh có cùng diện tích bề mặt riêng,


nhưng do hai hãng khác nhau chế tạo thì vẫn có hệ số dung tích k’i khác nhau, mặc dù là trong cùng

một điều kiện sắc ký (bảng 2.2)

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của bề mặt xốp đến hệ số dung tích k’i

Chất tan Hệ số dung tích k’i

LiChrosorb Si40 BioSil - Si

Naphthalene 1,27 4,50

Anthracene 2,18 6,77

Trong ví dụ ở bảng 2.2 diện tích xốp của cả hai loại pha tĩnh đều bằng 200 m2/g và đều là loại

pha tĩnh xốp toàn phần, đường kính hạt là 5 m. Nguyên nhân của sự khác nhau này là do khả năng

hoạt động bề mặt của hai loại trên do hai hãng chế tạo là khác nhau, sự phân bố và cấu trúc của lỗ

xốp trong hạt pha tĩnh. Đồng thời cả đến vị trí nhóm hoạt động cũng đóng góp làm ra sự khác nhau

đó của hệ số k’i. Ngoài ra đối với các silica trung tính, sự tương tác của các phân tử nước trên bề

mặt silica cũng là một yếu tố ảnh hưởng không đồng nhất trong mọi trường hợp.

Một yếu tố nữa ảnh hưởng đến kết quả tách sắc ký là đường kính (kích thước) hạt của pha tĩnh.

Nói chung kích thước hạt pha tĩnh càng lớn và không đồng đều, sẽ càng làm ảnh hưởng nhiều đến

kết quả tách, cụ thể làm giảm độ phân giải, làm tăng chiều cao của một đĩa. Nghĩa là làm xấu đi quá

trình sắc ký. Các kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng, các hạt pha tĩnh có đường kính nhỏ và đồng đều

bao giờ cũng cho hiệu suất tách sắc ký cao nhất. Điều này chúng ta có thể thấy được trong bảng 2.3

về mối quan hệ giữa đường kính hạt pha tĩnh và chiều cao của một đĩa tương ứng với loại cỡ hạt đó.

Bảng 2.3 Mối quan hệ giữa đường kính hạt dp (m) và chiều cao đĩa H

Đường kính hạt (m) Chiều cao đĩa H

30-40 (4,5-5,5).dp

20-25 (3,8-4,5).dp

10-15 (3,0-3,8).dp

5-7 (2,5-3,0).dp

3-5 (1,9-2,5).dp

Chính vì thế hiện nay người ta chỉ dùng loại hạt pha tĩnh có đường kính nhỏ hơn 10m cho mục

đích phân tích và loại nhỏ hơn 25m cho mục đích sản xuất (sắc ký điều chế).

Một yếu tố nữa cũng cần phải chú ý là kỹ thuật nhồi cột. Nếu cột được nhồi không tốt sẽ dẫn

đến píc sắc ký không cân đối, như thế sẽ làm giảm hiệu lực cột tách. Vì thế sau khi được nhồi, các

cột tách cần được kiểm tra lại xem đã đủ tiêu chuẩn và có thể cho kết quả tách tốt không. Nghĩa là

phải xác định 3 thông số quan trọng của cột tách là: Chiều cao đĩa H, độ bất đối xứng của píc Ax và

hệ số thấm dung môi .

Cùng với những điều đã nêu trên, khi chúng ta alkyl hoá Silica trung tính bằng những nhóm

chức khác nhau hay biến tính bề mặt silica trung tính bằng những nhóm chức khác nhau, thì mỗi

nhóm chức đó đều gây nên những ảnh hưởng rất khác nhau đến sự tách của một hỗn hợp chất mẫu,

tức là ảnh hưởng đến hệ số dung tích của các chất tan. Vấn đề này chúng ta có thể thấy trong một ví

dụ ở bảng 2.4. Ở đây với cùng hỗn hợp bốn chất mẫu và cùng pha động là n-hexan có chứa 5% n-

propanol, nhưng hệ số dung tích k’i của bốn chất phân tích chỉ ra trong bảng này là rất khác nhau

với mỗi loại nhóm chức đã được thế vào silica trung tính.

Đồng thời cũng chính nhờ tính chất này, người ta đã điều chế được rất nhiều loại chất nhồi khác

nhau cho kỹ thuật HPLC qua việc biến tính silica trung tính bằng những nhóm chức khác nhau

trong những điều kiện nhất định, để tạo ra nhiều loại pha tĩnh khác nhau cho nhiều loại chất mẫu


hay những nhóm chất mẫu khác nhau đa dạng của thực tế. Đây cũng là một hướng nghiên cứu hiện

nay của kỹ thuật HPLC, để tạo ra chất nhồi cột có nhiều ưu việt hơn cho quá trình sắc ký.

Bảng 2.4: Ảnh hưởng của các nhóm chức khác nhau trên nền Silica đến hệ số dung tích k’i của các

chất tan trong cùng điều kiện sắc ký và pha động là n-hexan có chứa 5% n-propanol.

Chất phân tích K’i = f (Loại chất nhồi cột)

Nitrodimethylamin 1,34 1,26 0,77 2,39

m-Chlor anilin 1,35 2,85 1,16 1,54

Chloro benzen 1,37 3,22 1,56 1,76

3-Chloro phenol 1,41 5,02 3,69 0,98

2.4. Pha động trong HPLC

Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện

một quá trình sắc ký. Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ, như methanol,

axetonitril, benzen, n-hexane, nước; hay cũng có thể là hỗn hợp của hai hay ba dung môi trộn với

nhau theo tỷ lệ phù hợp. Ví dụ hỗn hợp của methanol với nước, axetonitril với nước, tetrahydrofural

với acetonitril, methanol trộn với axetonitril và nước. Nó cũng có thể là dung dịch nước của các

muối có chứa chất đệm, chất tạo phức, chất làm chậm. Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung

môi rửa giải riêng cho nó, để có được hiệu quả tách tốt.

Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Nghĩa là

trong một hệ pha, thì pha động và pha tĩnh là hai yếu tố chính của quá trình sắc ký. Nó quyết định

thời gian lưu giữ của chất mẫu và hiệu quả của sự tách sắc ký. Nói chung pha động có thể ảnh

hưởng đến:

- Độ chọn lọc của hệ pha,

- Thời gian lưu giữ của chất tan,

- Hiệu lực của cột tách (đại lượng H)

- Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh,

- Độ rộng của píc sắc ký.

Do đó, trong một pha tĩnh đã có, nếu ta chọn được thành phần pha động phù hợp, thì ta sẽ có

hiệu suất tách sắc ký là tốt nhất đối với hỗn hợp mẫu nghiên cứu. Chính vì thế pha động trong kỹ

thuật HPLC cần phải thoả mãn một số điều kiện sau:

1. Pha động phải trơ với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất kỳ một tính chất nào trong

quá trình sắc ký. Không có sự tương tác phụ với pha tĩnh để sinh ra những sản phẩm khác

làm phức tạp cho quá trình tách.

2. Pha động phải hoà tan được chất mẫu. Có như thế mới làm cho chất mẫu được vận chuyển

tốt từ đầu cột tách (lúc nạp mẫu vào) đến cuối cột tách (lúc chất mẫu ra khỏi cột tách), khi

thực hiện quá trình rửa giải.

3. Pha động phải bền vững theo thời gian, có thành phần khống chế được đúng trong quá trình

sắc ký. Nghĩa là nó không bị phân huỷ khi chạy sắc ký.

4. Phải có độ tinh khiết cao để đảm bảo không làm nhiễm bẩn mẫu phân tích, gây sai số cho

kết quả tách. Nghĩa là các chất để pha chế pha động phải có độ tinh khiết cao. Vì thế người

ta thường dùng các loại hoá chất có độ sạch nanogam (chemicals for HPLC).

5. Phải nhanh chóng đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân bằng hấp phụ, phân

bố, trao đổi ion tuỳ theo bản chất của từng loại sắc ký.


6. Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích, không làm hư hại đến

flowcell của detector. Ví dụ dùng loại detector UV hay UV-VIS thì pha động phải trong suốt

trong các vùng phổ đó, hay dùng detector huỳnh quang thì pha động phải không có tính

huỳnh quang..v..v..

7. Điều kiện cuối cùng là phải có tính chất kinh tế, không hiếm, không quá đắt. Tất nhiên yếu

tố này trong sắc ký điều chế có ý nghĩa rất lớn, nhưng trong phân tích thì không ít trường

hợp ta phải chấp nhận pha động đắt tiền để đảm bảo kết quả phân tích chính xác, theo yêu

cầu đặt ra. Đặc biệt là việc phân tích lượng vết bên một lượng lớn chất khác.

Đó là các yêu cầu đối với một hệ pha động trong kỹ thuật HPLC đối với sự tách và phân tích

một hỗn hợp mẫu nhất định. Tất nhiên các điều kiện đó cần được xem xét một cách cụ thể trong

từng trường hợp của hỗn hợp mẫu để xem có thể bỏ qua được yếu tố nào, và từ đó chọn được một

pha động tốt nhất cho đối tượng nghiên cứu. Trong sắc ký hấp phụ pha thường, dung môi là các

chất hữu cơ kỵ nước; nghĩa là nước không tan được vào các pha động đó. Ví dụ n-hexane, n-

heptane, benzene, chloroform, tetrachlorocarbon,v…v… Nó là những dung môi không phân cực

hay ít phân cực. Trong quá trình sắc ký, để cho quá trình tách ổn định người ta thường bão hoà pha

động bằng nước trước khi chạy. Nếu không như vậy sự ảnh hưởng của thành phần pha động lên kết

quả tách (ở đây là thời gian lưu) là rất rõ rệt và không lặp lại. Với cách bão hoà nước trước, người ta

thu được kết quả tốt hơn, và sự tách ổn định hơn. Nhưng dù sao đó cũng là một nhược điểm của hệ

NP-HPLC. Vì vậy hệ pha NP-HPLC không được dùng phổ biến và vạn năng như hệ pha ngược.

Trong sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC), pha động là hệ dung môi phân cực, nó là những

dung môi tan được trong nước và trong rất nhiều trường hợp, thì nước lại là một thành phần chính

của pha động. Tiêu biểu và được khá phổ biến trong loại hệ pha ngược là các dung môi methanol,

axetonitril hay hỗn hợp của methanol với nước, axetonitril với nước. Nói chung các dung môi để

chuẩn bị pha động cho hệ pha ngược là nước cất, các alcon, các axeton có mạch các bon ngắn, một

số axit hay bazơ hữu cơ tan tốt trong nước, một vài amin hay aminoaxit.

Chính nhờ đặc điểm trên cho nên hệ RP-HPLC được sử dụng rất phổ biến để tách nhiều loại

hỗn hợp mẫu từ vô cơ đến hữu cơ, chất không phân cực đến phân cực và kể cả chất có cấu tạo liên

kết ion, như việc tách các ion kim loại trong sắc ký trao đổi ion.

Trong hệ pha này, thành phần pha động cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tách sắc ký. Ảnh

hưởng của thành phần pha động là làm thay đổi thời gian lưu của chất tan, độ phân giải của hệ pha

và chiều cao đĩa píc sắc ký.

Trong hệ RP-HPLC, so với các chất hữu cơ, nước là một dung môi phân cực hơn. Do đó sự

thêm nước vào dung môi hữu cơ là để tạo ra một pha động phân cực hơn chất hữu cơ nguyên một

mình nó. Ví dụ thêm nước vào methanol hay vào ethanol sẽ được một pha động có độ phân cực cao

hơn methanol hoặc ethanol. Tất nhiên độ phân cực lớn hơn bao nhiêu là phụ thuộc vào lượng nước

được thêm vào. Nghĩa là ta tạo ra được một pha động có độ phân cực nằm giữa độ phân cực của hai

dung môi đơn. Chính tính chất này làm cho hệ pha linh động và tạo điều kiện tốt cho sự tách sắc ký.

Ngoài các dung môi chính như đã nêu ở trên, trong thành phần pha động của nhiều trường hợp

tách với hệ pha ngược còn có thêm chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký, chất tạo phức

để tạo ra sự rửa giải chọn lọc, chất điện ly, chất tạo cặp ion trong sắc ký cặp ion. Đặc biệt là trong

sự tách của các amin, aminoaxit, anion thì những chất phụ trợ này trong pha động, nếu chọn được

thành phần phù hợp thì chúng cũng đóng góp tốt cho kết quả tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu.

Trong sắc ký trao đổi ion (IEx-HPLC) thì pha động là dung dịch nước của các axit hay bazơ,

hoặc là dung dịch nước của các muối kim loại kiềm, kiềm thổ, có chứa chất đệm pH, chất cho ion,

tạo cặp, chất tạo phức. Ví dụ để rửa giải các ion kim loại kiềm và kiềm thổ ra khỏi cột tách chứa

pha tĩnh Dowex50-8, người ta dùng dung dịch nước của NH4CH3COO nồng độ 1M và để rửa giải

các ion Cu(II), Pb(II), Zn(II), Co(II), Ni(II), người ta dùng dung dịch axit HNO3 2,5M. Dung dịch

nước của EDTA 0,04M có chứa chất đệm axetate pH 4 để rửa giải các đất hiếm. Trong loại sắc ký

này, đặc biệt là sự tách các ion kim loại chuyển tiếp, các đất hiếm thì pH pha động và chất tạo phức

có ý nghĩa rất lớn.


Thuộc nhóm sắc ký ion còn có sắc ký cặp ion. Trong sắc ký cặp ion, pha động vẫn dùng dung

môi nước và methanol là dung môi chính, thêm vào đó là chất chứa ion tạo cặp, chất đệm pH, chất

tạo phức. Ví dụ khi tách các nguyên tố đất hiếm bằng sắc ký cặp ion trên cột pha tĩnh Hypersil ODS

(C18) thì pha động là dung dịch nước có chứa chất tạo phức -HIBA, chất đệm pH là NH4CH3COO,

chất cho ion tạo cặp là SDS (Natri Dodecyl Sunfat).

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của thành phần pha động lên thời gian lưu tRI : Pha tĩnh Zorbax C8. 5m., pha

động MeOH/H2O : 1,8 ml/phút., chất tan A : Phenol, B : Benzaldehyde, C : Nitrobenzen, D :

Metylbenzoat

No % MeOH trong

nước

Thời gian lưu tRi (phút) Kết quả tách sắc

ký A B C D

1 25 10,00 22,00 43,00 88,10 Tách tốt

2 45 4,20 6,80 10,10 17,20 Tách tốt

3 65 2,30 3,00 3,80 4,80 Tách tồi

4 80 1,70 1,86 2,10 2,17 Không tách

Khác với sắc ký trao đổi ion, trong sắc ký chiết (LLC), pha động cũng có hai loại : ưa nước và

kỵ nước. Loại kỵ nước là loại đối với sắc ký chiết pha thường. Ở đây pha tĩnh cũng kỵ nước, còn

pha động cũng là những chất hữu cơ kỵ nước. Nó có thể là một dung môi hữu cơ, hay là hỗn hợp

của hai hay ba dung môi hữu cơ, ví dụ như cloroform, tetraclorocacbon, benzen, ethyl acetate, hay

hỗn hợp của các chất đó với nhau theo những tỷ lệ nhất định. Ngược lại đối với sắc ký chiết pha

ngược thì pha động lại là những dung môi phân cực, hoặc là dung dịch axit hoặc bazơ loãng có

thêm chất đệm, muối tan của kim loại kiềm, kiềm thổ và có thể có cả chất tạo phức,…

Trên đây là khái quát về pha động trong kỹ thuật phân tích HPLC. Qua đó chúng ta thấy có 4 vấn đề

cần quan tâm xem xét và chọn cho phù hợp. Đó là:

- Bản chất của dung môi pha chế pha động. Đây là một yếu tố rất quan trọng, nó góp phần

quyết định đến kết quả tách sắc ký. Đồng thời nó cũng biểu hiện bản chất của mỗi loại sắc ký.

- Yếu tố thứ hai là thành phần của các chất tạo ra pha động. Khi thay đổi thành phần của

pha động chúng ta có thể làm tốt hơn hoặc làm xấu đi sự tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu trên một

hệ pha tĩnh đã chọn.

- Yếu tố thứ ba là tốc độ của pha động. Vì khi pha động đã có một thành phần phù hợp rồi,

nhưng nếu tố độ rửa giải của pha động không phù hợp thì cũng chưa có được kết quả tách sắc ký

hoàn toàn tốt.

- Yếu tố thứ tư là pH của pha động. Yếu tố này rất có ý nghĩa đối với sắc ký trao đổi ion

và cặp ion, hay một số trường hợp trong sắc ký hấp phụ pha ngược và sắc ký chiết. Còn trong sắc

ký hấp phụ pha thường thì pH hầu như không có tác dụng. Vì pha động ở đây là những dung môi

hữu cơ kỵ nước. Có thể nói ảnh hưởng pH trong pha động thể hiện rất rõ trong các pha động phân

cực, nhất là các pha động có chứa nước.

Đó là 4 yếu tố quan trọng trong pha động có liên quan và ảnh hưởng đến kết quả tách sắc ký của

một hỗn hợp mẫu. Ngoài 4 yếu tố trên, nhiệt độ cũng có đóng góp thêm vào sự ảnh hưởng đến kết

quả tách. Nhưng yếu tố này nhiều trường hợp thể hiện không rõ ràng và mạnh như 4 yếu tố đã nêu

trên. Song trong thực tế chúng ta cũng cần phải biết đến để nếu có tác dụng thì phải chọn cho phù

hợp nhằm mục đích thu được kết quả tách tốt nhất.

Làm sạch dung môi

ViÖc lµm s¹ch dung m«i mang l¹i:

Çc kÕt qña lÆp l¹i.

VËn hµnh víi viÖc b¶o dìng thiÕt bÞ møc tèi thiÓu.

Mét dung m«i bÈn cã thÓ g©y ra:


ån vµ tr«i ®êng nÒn.

T¾c nghÏn nh÷ng çi läc dung m«i bëi çc vËt liÖu d¹ng h¹t

Chất lượng dung môi

Sö dông dung m«i lo¹i HPLC ®Ó b¶o ®¶m çc kÕt qña cã thÓ thu ®îc tèt nhÊt. Läc dung m«i

qua çi läc 0,45-m tríc khi sö dông. Dung m«i ®· qua chng cÊt trong dông cô thñy tinh nãi

chung duy tr× ®îc ®é tinh khiÕt cña chóng tõ l« nµy sang l« kh¸c; sö dông chóng ®Ó b¶o ®¶m çc

kÕt qña cã thÓ thu ®îc tèt nhÊt.

Bản kê chuẩn bị

Nh÷ng híng dÉn mang tÝnh nguyªn t¾c cña viÖc chuÈn bÞ dung m«i ®îc ®a ra díi ®©y gióp

b¶o ®¶m æn ®Þnh ®êng nÒn vµ mang l¹i ®é ph©n gi¶i tèt:

Läc dung m«i víi çi läc 0.45-m.

Degas vµ/hoÆc sparge dung m«i

KhuÊy trén dung m«i.

Gi÷ dung m«i trong vÞ trÝ çch biÖt khái giã vµ va ch¹m.

Nước

ChØ sö dông níc tõ mét hÖ thèng siªu läc chÊt lîng cao. NÕu hÖ thèng níc kh«ng t¹o ra ®îc

níc läc, läc nã qua mét mµng läc 0.45-m tríc khi sö dông.

Các chất đệm

Khi b¹n sö dông çc chÊt ®Öm, tríc tiªn hßa tan muèi, ®iÒu chØnh pH, sau ®ã läc ®Ó lo¹i bá vËt

liÖu kh«ng tan.

Tetrahydrofuran (THF)

Khi sö dông THF kh«ng æn ®Þnh, b¶o ®¶m dung m«i cña b¹n lµm t¬i míi. Nh÷ng chai THF ®·

më tõ tríc cã chøa chÊt « nhiÔm peroxide, nguyªn nh©n g©y ra tr«i ®êng nÒn

C¶nh b¸o: Çc chÊt « nhiÔm THF (çc peroxide) tiÒm Èn nguy c¬ g©y næ nÕu nh bÞ c« ®Æc hoÆc

trë nªn gÇn kh«

2.4.1 Tính tương thích của dung môi

Çc thiÕt bÞ HPLC chÊt lîng ®îc t¹o ra b»ng nh÷ng cÊu kiÖn thÐp kh«ng gØ chÊt

lîng cao, tuy cã thÓ cã mét sè h¹n chÕ kh«ng quan träng, nhng cã thÓ ®îc sö dông

víi tÊt c¶ çc dung m«i. Môc nµy liÖt kª mét sè dung m«i cã thÓ cã vµ còng cã thÓ

kh«ng ®îc phª chuÈn sö dông víi thiÕt bÞ HPLC.

Tr¸nh nh÷ng dung m«i sau

Nh÷ng dung m«i díi ®©y sÏ tÊn c«ng hoÆc hoµ tan èng Teflon AF trong bé lo¹i khÝ ch©n kh«ng

inline:

TÊt c¶ çc dung m«i perfluoro ®îc t¹o ra ë 3M díi tªn th¬ng m¹i FluorinertTM.

TÊt c¶ çc dung m«i perfluoro ®îc t¹o ra bëi Ausimont díi tªn th¬ng m¹i GaldenTM vµ

FomblinTM.


CẢNH BÁO: Nguy hiÓm ®Õn èng degas tõ viÖc tiÕp xóc víi nh÷ng dung m«i perfluoro lµ ngay tøc

th× vµ kh«ng thÓ thay ®æi ®îc.

ViÖc tiÕp xóc cè ®Þnh thêi gian dµi víi çc muèi halogen (lÊy vÝ dô fluoride, bromide, chloride

vµ iodide) sÏ lµm rç vµ ¨n mßn những vËt liÖu thÐp kh«ng gØ. Khi sö dông nh÷ng muèi nµy, thæi kü

hÖ thèng víi níc, nÕu b¬m ë trong tr¹ng th¸i Idle (trạng thái thiết bị đã sẵn sàng chạy mẫu nhưng

không vận hành) nhiÒu h¬n hai ngµy.

Sử dụng những dung môi sau

Nh÷ng vËt liÖu kiÕn t¹o ®îc sö dông trong thiÕt bÞ HPLC chÊt lîng cao lµ kh«ng cã ph¶n øng

g× víi hÇu hÕt axit, baz¬, muèi vµ çc dung m«i h÷u c¬.

Nh÷ng dung m«i ®îc liÖt kª trong b¶ng 2.6 ®Õn 2.9 díi ®©y ®· ®îc phª chuÈn sö dông víi

thiÕt bÞ HPLC. Chóng bao gåm çc muèi, çc axit vµ çc baz¬ ë nång ®é lªn ®Õn 1M (trõ phi ®îc

lu ý kh¸c ®i), vµ çc dung m«i h÷u c¬ ë nång ®é lªn ®Õn 100% (trõ phi ®îc lu ý kh¸c ®i). Nh÷ng

nång ®é cao h¬n cã thÓ ®îc sö dông trong nhiÒu trêng hîp.

B¶ng 2.6. Çc chÊt ®Öm hÖ níc ®îc sö dông víi HPLC

Các chất đệm hệ nước

Acetate K2SO4 Na2S Perfluorobutyric acid

Al2SO4 K3Fe(CN)6 Na2CO3 NH4Cl

Ca(OCl)2 K4Fe(CN)6 Na2SO4 Phosphate

CaCl2 KBr NaCl Tartrate

Citrate KCl Sodium acetate Trilithium citrate

H2O2 lªn ®Õn 10% KHCO3 NaH2BO3 Tris

HIBA KMnO4 NaHCO3 Monohydrat muèi 4-(2-pyridylazo) resorcinol monosodium

K2CO3 KNO3 NaHSO4

K2Cr2O3 LiClO4 NaNO3

K2S Na2B4O7 NaOCl

B¶ng 2.7: Çc axit sö dông ®îc víi HPLC

Axit

Axit acetic b¨ng Hydrochloric Perchloric

Benzoic Lactic Phosphoric

Chromic Methanesulphonic Pyridine-2,6-dicarboxylic

Citric Nitric, lªn ®Õn 37.5% (6N) Sulfuric, lªn ®Õn 0.20M

Formic Octanesulphonic Trifluoroacetic (TFA), lªn ®Õn 10%.

Glyceric Oxalic

B¶ng 2.8: Çc baz¬ ®îc sö dông víi HPLC

Bazơ

Ba(OH)2 NaOH, lªn ®Õn 10M


KOH NH4OH, lªn ®Õn 3M

LiOH Tetramethylammonium hydroxide pentahydrate

B¶ng 2.9: Nh÷ng dung m«i h÷u c¬ ®îc sö dông víi HPLC

Các dung môi hữu cơ

4-cyanophenol Chloroform Ethylene glycol Methylene chloride

Acetone Cyclohexane Formaldehyde n-Propanol

Acetonitrile Cyclohexanone Heptane Phenol

Amyl acetate Dibutyl phathalate Hexane Tetrahydrofuran (THF)

Benzaldehyde Dimethyl formamide iso-Octane Toluene

Benzene Dimethyl sulfoxide Iso-Propanol Waters PICTM Reagents

Benzyl alcohol Ethanol Lysine hydrochloride

Xylene

Butanol Ethyl acetetate Methanol

Carbon tetrachloride Ethylene dichloride Methyl ethyl ketone

2.4.2 Tính trộn lẫn dung môi

Tríc khi thay ®æi dung m«i, tham kh¶o b¶ng 2.10 ®Ó x¸c ®Þnh tÝnh trén lÉn cña çc dung m«i

®îc sö dông. Khi b¹n thay ®æi dung m«i, cÇn nhËn thøc ®îc:

Thay ®æi hai dung m«i cã tÝnh trén lÉn cã thÓ ®îc thùc hiÖn trùc tiÕp. Thay ®æi hai dung m«i

kh«ng trén lÉn hoµn toµn (lÊy vÝ dô tõ chloroform thµnh níc), ®ßi hái cÇn cã mét dung m«i

trung gian (vÝ dô nh methanol).

NhiÖt ®é t¸c ®éng lªn tÝnh trén lÉn cña dung m«i. NÕu b¹n ®ang ch¹y mét øng dông nhiÖt ®é cao,

c©n nh¾c hiÖu øng nhiÖt ®é cao h¬n lªn tÝnh tan dung m«i.

Çc chÊt ®Öm hßa tan trong níc cã thÓ kÕt tña khi ®îc trén lÉn víi çc dung m«i h÷u c¬.

Khi chuyÓn tõ mét chÊt ®Öm m¹nh sang mét dung m«i h÷u c¬, thæi chÊt ®Öm ra khái hÖ

thèng b»ng níc cÊt tríc khi thªm dung m«i h÷u c¬.

B¶ng 2.10: TÝnh trén lÉn dung m«i

Chỉ số

phân cực

Dung môi Độ nhớt

CP, 200C

Điểm sôi 0C

(@1 atm)

Số tính

trộn lẫn

(M)

Cutoff

(nm)

-0.3 N-decane 0.92 174.1 29 -

-0.4 Iso-octane 0.50 99.2 29 210

0.0 N-hexane 0.313 68.7 29 -

0.0 Cyclohexane 0.98 80.7 28 210

1.7 Butyl ether 0.70 142.2 26 -

1.8 Triethylamine 0.38 89.5 26 -

2.2 Isopropyl ether 0.33 68.3 - 220

2.3 Toluene 0.59 100.6 23 285

2.4 P-xylene 0.70 138.0 24 290


3.0 Benzene 0.65 80.1 21 280

3.3 Benzyl ether 5.33 288.3 - -

3.4 Methylene chloride 0.44 39.8 20 245

3.7 Ethylene chloride 0.79 83.5 20 -

3.9 Butyl alcohol 3.00 117.7 - -

3.9 Butanol 3.01 177.7 15 -

4.2 Tetrahydrofuran 0.55 66.0 17 220

4.3 Ethyl acetate 0.47 77.1 19 260

4.3 1-propanol 2.30 97.2 15 210

4.3 2-propanol 2.35 117.7 15 -

4.4 Methyl acetate 0.45 56.3 15, 17 260

4.5 Methyl ethyl ketone 0.43 80.0 17 330

4.5 Cyclohexanone 2.24 155.7 28 210

4.5 Nitrobenzene 2.03 210.8 14, 20 -

4.6 Benzonitril 1.22 191.1 15, 19 -

4.8 Dioxane 1.54 101.3 17 220

5.2 Ethanol 1.20 78.3 14 210

5.3 Pyridine 0.94 115.3 16 305

5.3 Nitroethane 0.68 114.0 - -

5.4 Acetone 0.32 56.3 15, 17 330

5.5 Benzyl alcohol 5.80 205.5 13 -

5.7 Methoxyethanol 1.72 124.6 13 -

6.2 Acetonitril 0.37 81.6 11, 17 190

6.2 Acetic acid 1.26 117.9 14 -

6.4 Dimethylformamide 0.90 153.0 12 -

6.5 Dimethylsulfoxide 2.24 189.0 9 -

6.6 Methanol 0.60 64.7 12 210

7.3 Formamide 3.76 210.5 3 -

9.0 Water 1.00 100.0 - -

Sử dụng các con số tính trộn lẫn như thế nào (M-numbers)

Sö dông çc con sè tÝnh trén lÉn ®Ó dù ®o¸n tÝnh trén lÉn cña mét chÊt láng víi mét dung m«i

chuÈn (xem b¶ng 2.10)

§Ó dù ®o¸n tÝnh trén lÉn cña hai chÊt láng, trõ gÝa trÞ M-Numbers nhá h¬n tõ gÝa trÞ M-Numbers

lín h¬n.

NÕu hiÖu gi÷a hai sè M-number b»ng 15 hoÆc nhá h¬n, hai chÊt láng trén lÉn víi tÊt c¶ çc tû lÖ

t¹i 150C.

GÝa trÞ hiÖu sè 16 chØ ra nhiÖt ®é dung dÞch tíi h¹n n»m gi÷a 25 vµ 750C, víi 500C lµ nhiÖt ®é tèi

u.

NÕu hiÖu sè lµ 17 hoÆc cao h¬n, çc chÊt láng kh«ng trén lÉn hoÆc lµ nhiÖt ®é dung dÞch tíi h¹n

n»m trªn 750C.

Mét sè dung m«i tá ra kh«ng trén lÉn t¹i c¶ hai ®Çu cña thang hÊp thu, nh÷ng dung m«i ®ã chøa

®ùng mét M-number kÐp:

Sè thø nhÊt, lu«n lu«n nhá h¬n 16 chØ ra møc ®é trén lÉn víi nh÷ng dung m«i cã tÝnh hót mì cao.


Sè thø hai ¸p dông víi ®Çu ®èi diÖn cña thang chia, mét hiÖu sè lín gi÷a hai con sè nµy cho thÊy

d¶i tÝnh trén lÉn ®îc bÞ h¹n chÕ.

LÊy vÝ dô, mét sè fluorocarbon kh«ng trén lÉn víi tÊt c¶ çc dung m«i chuÈn vµ cã M-numbers

lµ 0 vµ 32. Hai chÊt láng víi M-numbers kÐp thêng thêng trén lÉn víi nhau.

Mét chÊt láng ®îc ph©n lo¹i theo hÖ thèng M-numbers nhê kiÓm tra tÝnh trén lÉn víi lÇn lît

çc dung m«i chuÈn. ThuËt ng÷ hiÖu chØnh 15 ®¬n vÞ hoÆc ®îc thªm vµo hoÆc ®îc trõ ®i tõ ®iÓm

cutoff ®èi víi tÝnh trén lÉn.

2.4.3 Các dung môi pha động

Khi sö dông chÊt ®Öm, dïng lo¹i chÊt lîng tèt vµ läc nã qua mµng läc 0.45-m

Kh«ng ®Ó mÆc chÊt ®Öm lu tr÷ trong hÖ thèng s¾c ký láng sau khi sö dông. Thæi tÊt c¶ ®êng ®i

cña chÊt láng víi níc chÊt lîng HPLC tríc khi t¾t hÖ thèng vµ ®Ó l¹i níc cÊt trong hÖ thèng

(thæi víi níc chÊt lîng HPLC 90%: 10% methanol ®èi víi lÞch tr×nh t¾t hÖ thèng h¬n mét ngµy).

Thæi tèi thiÓu 15mL ®èi víi thiÕt bÞ trang bÞ sparge, vµ tèi thiÓu 45mL ®èi víi thiÕt bÞ ®îc trang bÞ

bé lo¹i khÝ ch©n kh«ng inline.

Độ cao trên đỉnh

§Þnh vÞ çc bÓ chøa dung m«i t¹i møc n»m phÝa trªn hÖ thèng HPLC hoÆc trªn ®Ønh thiÕt bÞ (cã

b¶o vÖ chèng trµn t¬ng xøng).

2.4.4 Độ nhớt dung môi

Nh×n chung ®é nhít kh«ng quan träng khi b¹n ®ang vËn hµnh víi mét dung m«i hoÆc vËn hµnh

díi ¸p lùc thÊp. Tuy nhiªn khi b¹n ®ang ch¹y mét gradient, cã thÓ xuÊt hiÖn nh÷ng thay ®æi vÒ ®é

nhít khi çc dung m«i ®îc trén theo nh÷ng tû lÖ kh¸c nhau, nh÷ng thay ®æi vÒ ®é nhít nh vËy g©y

ra sù thay ®æi vÒ ¸p lùc trong lóc ch¹y. LÊy vÝ dô hçn hîp 1:1 cña níc vµ methanol t¹o ra ¸p lùc

cao gÊp hai lÇn so víi chØ m×nh níc hoÆc m×nh methanol.

NÕu cha biÕt ®îc ph¹m vi t¸c ®éng cña viÖc thay ®æi ¸p lùc lªn phÐp ph©n tÝch, cÇn ph¶i theo

dâi ¸p trong lóc ch¹y vµ nÕu cã th× sö dông biÓu ®å ¸p vÏ theo sù biÕn ®æi thµnh phÇn pha ®éng.

2.4.5 Loại khí dung môi pha động

Nh÷ng khã kh¨n vÒ pha ®éng lµ nguyªn nh©n g©y ra trªn 70% trong sè tÊt c¶ nh÷ng vÊn ®Ò cña

s¾c ký láng. Sö dông dung m«i ®· qua lo¹i khÝ lµ ®iÒu quan träng, ®Æc biÖt lµ ë nh÷ng bíc sãng

n»m díi 220nm.

ViÖc degas t¹o ra:

- §êng nÒn æn ®Þnh vµ n©ng cao ®é nh¹y.

- Thêi gian lu ®èi víi pÝc röa gi¶i lÆp l¹i.

- ThÓ tÝch tiªm ®èi víi c«ng viÖc ®Þnh lîng lÆp l¹i.

- B¬m vËn hµnh æn ®Þnh.

Nh÷ng môc tr×nh bµy th«ng tin vÒ tÝnh tan çc lo¹i khÝ, çc ph¬ng ph¸p lo¹i khÝ dung m«i, vµ

nh÷ng c©n nh¾c vÒ viÖc lo¹i khÝ dung m«i.

Độ tan các loại khí

ChØ cã mét lîng khÝ nhÊt ®Þnh lµ cã thÓ hßa tan ®îc vµo trong mét thÓ tÝch chÊt láng ®a ra.

Lîng khÝ nµy phô thuéc vµo:

¸i lùc hãa häc cña khÝ ®èi víi chÊt láng.

NhiÖt ®é chÊt láng.

¸p lùc ¸p lªn chÊt láng.


Nh÷ng thay ®æi vÒ thµnh phÇn, nhiÖt ®é, hoÆc ¸p lùc cña pha ®éng cã thÓ g©y ra khÝ th¶i.

Çc hiÖu øng tõ lùc t¬ng t¸c gi÷a çc ph©n tö

Çc lo¹i khÝ kh«ng ph©n cùc (N2, O2, CO2, He) hßa tan nhiÒu h¬n trong dung m«i kh«ng ph©n

cùc so víi dung m«i ph©n cùc. Nh×n chung khÝ hßa tan m¹nh nhÊt trong dung m«i cã lùc t¬ng t¸c

ph©n tö t¬ng tù nh lùc t¬ng t¸c ph©n tö trong chÊt khÝ ("like dissolves like").

Çc hiÖu øng cña nhiÖt ®é

NhiÖt ®é t¸c ®éng lªn ®é tan cña khÝ. NÕu dung dÞch ®îc ®èt nãng táa nhiÖt, ®é tan cña khÝ

gi¶m khi b¹n ®èt nãng dung m«i. NÕu dung dÞch ®îc ®èt nãng thu nhiÖt, ®é tan t¨ng khi b¹n ®èt

nãng dung m«i. LÊy vÝ dô, ®é tan cña He trong níc gi¶m khi gia t¨ng nhiÖt ®é, nhng ®é tan cña

He trong benzen t¨ng khi t¨ng nhiÖt ®é.

Çc hiÖu øng cña ¸p lùc côc bé

Khèi lîng khÝ hßa tan trong mét thÓ tÝch dung m«i nhÊt ®Þnh tû lÖ víi ¸p lùc riªng phÇn cña khÝ

trong pha h¬i cña dung m«i. NÕu b¹n gi¶m ¸p lùc riªng phÇn cña khÝ, lîng khÝ ®ã trong dung dÞch

còng gi¶m.

Các phương pháp loại khí dung môi

B¹n cã thÓ lo¹i khÝ dung m«i b»ng mét trong çc ph¬ng ph¸p díi ®©y:

Sôc víi He.

Lo¹i khÝ ch©n kh«ng

Sôc

ViÖc tiÕn hµnh sôc lo¹i bá khÝ khái dung dÞch nhê thay thÕ çc lo¹i khÝ ®· hßa tan trong dung

m«i víi khÝ Ýt tan h¬n, th«ng thêng lµ helium. Dung m«i ®· ®îc sôc ®Òu sÏ n©ng cao hiÖu qña cña

b¬m. Sôc He ®Ó ®a dung m«i ®Õn tr¹ng th¸i c©n b»ng, viÖc ®ã cã thÓ ®îc duy tr× nhê sôc chËm

hoÆc nhê gi÷ mét líp He n»m phÝa trªn dung m«i. ViÖc t¹o líp He ng¨n chÆn hiÖn tîng hÊp thô trë

l¹i çc lo¹i khÝ trong khÝ quyÓn.

LƯU Ý: ViÖc sôc cã thÓ lµm thay ®æi thµnh phÇn cña nh÷ng dung m«i ®îc trén.

Lo¹i khÝ ch©n kh«ng

Bé lo¹i khÝ ch©n kh«ng vËn hµnh theo nguyªn lý cña ®Þnh luËt Henrry ®Ó lo¹i bá çc khÝ hßa tan

khái dung m«i. Theo ®Þnh luËt Herry, phÇn mol cña khÝ hßa tan trong chÊt láng tû lÖ víi ¸p lùc côc

bé cña khÝ trong pha h¬i n»m trªn chÊt láng. NÕu nh ¸p lùc côc bé cña khÝ bªn trªn bÒ mÆt chÊt

láng ®îc gi¶m xuèng (lÊy vÝ dô b»ng çch x¶ bít ra), th× sÏ cã mét lîng khÝ tû lÖ ®îc lÊy ra khái

dung dÞch.

CHÚ Ý: ViÖc lo¹i khÝ ch©n kh«ng cã thÓ lµm thay ®æi thµnh phÇn dung m«i ®îc trén.

Những cân nhắc về việc loại khí

Lùa chän çch vËn hµnh lo¹i khÝ hiÖu qña nhÊt ®èi víi øng dụng của b¹n. §Ó lo¹i bá khÝ hßa tan

mét çch nhanh chãng, c©n nh¾c:

Sôc

Sôc He mang l¹i ®êng nÒn æn ®Þnh vµ ®é nh¹y ph¸t hiÖn tèt h¬n so víi siªu ©m, vµ ng¨n chÆn

®îc hiÖn tîng hÊp phô trë l¹i çc khÝ trong khÝ quyÓn. Sö dông ph¬ng ph¸p nµy ®Ó lµm chËm sù

oxihoa khi b¹n ®ang sö dông THF hoÆc nh÷ng dung m«i t¹o d¹ng peroxide kh¸c.

Loại khí bằng chân không


Dung m«i tiÕp xóc víi ch©n kh«ng l©u h¬n, khÝ hoµ tan ®îc lo¹i bá nhiÒu h¬n. Hai yÕu tè t¸c

®éng lªn lîng thêi gian dung m«i tiÕp xóc víi ch©n kh«ng lµ:

Tèc ®é dßng - T¹i tèc ®é dßng thÊp, hÇu hÕt çc dung m«i ®îc lo¹i bá khi ®i qua buång

ch©n kh«ng. T¹i nh÷ng tèc ®é dßng cao h¬n, lîng khÝ trªn mét ®¬n vÞ thÓ tÝch dung m«i

®îc lo¹i bá Ýt h¬n.

DiÖn tÝch bÒ mÆt cña mµng lo¹i khÝ - §é dµi cña mµng lo¹i khÝ ®· ®îc cè ®Þnh trong tõng

buång ch©n kh«ng. §Ó gia t¨ng chiÒu dµi cña mµng, b¹n cã thÓ nèi hai hoÆc nhiÒu buång ch©n

kh«ng h¬n thµnh mét d·y.

2.4.6 Lựa chọn bước sóng

Nh÷ng b¶ng trong môc nµy ®a ra çc gÝa trÞ UV cutoff (bíc sãng mµ t¹i ®ã ®é hÊp thô cña

dung m«i b»ng 1 AU) ®èi víi

Nh÷ng dung m«i phæ th«ng

Nh÷ng pha ®éng trén lÉn phæ biÕn

Çc lo¹i chromophore

Các giá trị UV Cutoff đối với những dung môi phổ thông

B¶ng 2.11 chØ ra UV cutoff ®èi víi mét sè dung m«i s¾c ký phæ th«ng. ViÖc vËn hµnh gÇn

hoÆc díi cutoff sÏ lµm t¨ng ®é ån ®êng nÒn do ®é hÊp thô cña dung m«i.

B¶ng 2.11: Çc bíc sãng UV cutoff ®èi víi mét sè dung m«i s¾c ký phæ th«ng

Dung môi UV Cutoff

(nm)

Dung môi UV Cutoff

(nm)

1-Nitropropane 380 Ethylene glycol 210

2-Butoxyethanol 220 Isooctane 215

Acetone 330 Isopropanol 205

Acetonitril 10 Isopropyl chloride 225

Amyl alcohol 210 Isopropyl ether 220

Amyl chloride 225 Methanol 205

Benzene 280 Methyl acetate 260

Carbon disulfide 380 Methyl ethyl ketone 330

Carbon tetrachloride 265 Methyl isobutyl ketone 334

Chloroform 245 Methylene chloride 233

Cyclohexane 200 n-pentane 190

Cyclopentane 200 n-propanol 210

Diethyl amine 275 n-propyl chloride 225

Dioxane 215 Nitromethane 380

Ethanol 210 Petroleum ether 210

Ethyl acetate 256 Pyridine 330

Ethyl ether 220 Tetrahydrofurane 230

Ethyl sulfide 290 Toluene 285

Ethylene dichloride 230 Xylene 290

Các pha động trộn lẫn được

B¶ng 2.12 ®a ra çc gÝa trÞ bíc sãng cutoff gÇn ®óng ®èi víi mét sè dung m«i, chÊt ®Öm, çc t¸c nh©n kh¸c, vµ çc pha ®éng kh¸c. Nång ®é dung m«i ®a ra lµ nh÷ng gÝa trÞ nång ®é ®îc sö dông phæ biÕn nhÊt. NÕu b¹n muèn sö dông gÝa trÞ nång ® é kh¸c,


b¹n cã thÓ x¸c ®Þnh ®é hÊp thô gÇn ®óng sö dông ®Þnh luËt Beer, bëi v× ®é hÊp thô tû lÖ víi nång ®é.

B¶ng 2.12: Bíc sãng Cutoff ®èi víi nh÷ng pha ®éng kh¸c

Pha động UV Cutoff

(nm)

Pha động UV Cutoff

(nm)

Acetic acid, 1% 230 Sodium chloride, 1M 207

Ammonium acetate, 10mM

205 Sodium citrate, 10mM 225

Ammonium bicarbonate, 10mM

190 Sodium dodecyl sulfate 190

BRIJ 35, 0.1% 190 Sodium formate, 10mM 200

CHAPS, 0.1% 215 Tirethyl amine, 1% 235

Diammonium phosphate, 50mM

205 Trifluoracetic acid, 0.1% 190

EDTA, disodium, 1mM 190 TRIS HCI, 20mM, pH 7.0, pH 8.0

202, 212

HEPES, 10mM, pH 7.6 225 Triton-XTM 100, 0.1% 240

Hydrochloric acid, 0.1% 190 Waters PIC Reagent A, 1 vial/liter

200

MES, 10mM, pH 6.0 215 Waters PIC Reagent B-6,

1 vial/liter

225

Potassium phosphate, monobasic, 10mM

Dibasic, 10mM

190

190

Waters PIC Reagent B-6, low UV, 1 vial/liter

190

Sodium acetate, 10mM 205 Waters PIC Reagent D-4,

1 via/liter

190

Chỉ số khúc xạ đối với những dung môi phổ thông

B¶ng 2.13 liÖt kª nh÷ng chØ sè khóc x¹ ®èi víi mét sè dung m«i s¾c ký phæ biÕn. Sö dông b¶ng nµy ®Ó kiÓm tra dung m«i cã ý ®Þnh sö dông ®èi víi phÐp ph©n tÝch cã chØ sè khóc x¹ kh¸c ®¸ng kÓ so víi nh÷ng chØ sè khóc x¹ cña çc thµnh phÇn mÉu hay kh«ng.

B¶ng 2.13: ChØ sè khóc x¹ ®èi víi nh÷ng dung m«i s¾c ký phæ th«ng

Dung môi RI Dung môi RI

Fluoroalkanes 1.25 Tetrahydrofuran (THF) 1.408

Hexafluoroisopropanol (HFIP) 1.2752 Amyl alcohol 1.410

Methanol 1.329 Diisobutylene 1.411

Water 1.33 n-Decane 1.412

Acetonitril 1.344 Amyl chloride 1.413

Ethyl ether 1.353 Dioxane 1.422

n-pentane 1.358 Ethyl bromide 1.424

Acetone 1.359 Methylene chloride 1.424

Ethanol 1.361 Cyclohexane 1.427

Methyl acetate 1.362 Ethylene glycol 1.427

Isopropyl ether 1.368 N,N-Dimethyl Formamide (DMF) 1.428

Ethyl acetate 1.370 N,N-Dimethyl Acetamide (DMAC) 1.438

1-Pentene 1.371 Ethyl sulfide 1.442


Acetic acid 1.372 Chloroform 1.443

Isopropyl chloride 1.378 Ethylene dichloride 1.445

Isopropanol 1.38 Carbon tetrachloride 1.466

n-Propanol 1.38 Dimethyl sulfoxide (DMSO) 1.477

Methylethylketone 1.381 Toluene 1.496

Diethyl amine 1.387 Xylene 1.50

n-Propyl chloride 1.389 Benzene 1.501

Methylisobutylketone 1.394 Pyridine 1.510

Nitromethane 1.394 Chlorobenzene 1.525

1-Nitropropane 1.400 o-Chlorophenol 1.547

Isooctane 1.404 Aniline 1.586

Cyclopentane 1.406 Carbon disulfide 1.626

2.4.7 Nước dung cho sắc ký

Nước dùng làm dung m«i cho s¾c ký còng nh dïng trong chuÈn bÞ mÉu lµ

níc lo¹i 1 (Type I). S¾c ký n»m trong mét lo¹t kü thuËt ®ßi hái çc yÕu tè ¶nh hëng

ở mứ c tèi thiÓu vµ ®é chÝnh x¸c, ®é ®óng ë møc tèi ®a. Níc lo¹i 1 ®îc yªu cÇu sö

dông cho çc kü thuËt sau: HÊp thô nguyªn tö. Phæ ph¸t x¹ ngän löa. XÐt nghiÖm ligand. Kim lo¹i vÕt. Quy tr×nh enzymatic nh¹y víi kim lo¹i vÕt. Quy tr×nh ®iÖn chuyÓn. Çc quy tr×nh s¾c ký ®é nh¹y cao. Çc quy tr×nh huúnh quang. Çc dung dÞch ®Öm. Çc dung dÞch chuÈn.

B¶ng 2.14 ChuÈn chÊt lîng níc lo¹i 1

NCCLS ASTM

§iÖn trë1, megohms-cm, t¹i 250C, tèi thiÓu 10.0 18.0

§é dÉn, microsiemens/cm, cùc ®¹i 0.1 0.056

Silicate, mg/L, maximum 0.05 0.003

VËt liÖu h¹t, läc m 0.22 0.2

Microoganism, colony forming units/milliliter

10 Xem chó ý 2

§iÖn trë vµ ®é dÉn cña níc lo¹i 1 ph¶i ®îc ®o in -line (ngay trong dßng ch¶y). §o trong mét b×nh chøa sÏ t¹o ra gÝa trÞ ®äc thiÕu chÝnh x¸c.

§èi víi ASTM Níc lo¹i IA - 10/1000mL Níc lo¹i IB - 10/100mL Níc lo¹i IC - 100/10mL

§Ó n¾m b¾t ®îc vÊn ®Ò çc tiªu chuÈn trªn nghÜa lµ g× tèt h¬n, chóng ta h·y kh¶o s¸t mét sè chÊt « nhiÔm cã thÓ cã mÆt trong níc.

§Çu tiªn, níc lµ mét dung m«i tuyÖt vêi vµ lµ m«i trêng cña hÇu hÕt çc qóa tr×nh sèng trªn hµnh tinh nµy. VËy v× sao níc bÞ « nhiÔm víi mäi thø nã b¾t gÆp vµ v× sao vi


sinh vËt sinh trëng trong nã dÔ dµng vËy. Nh ®· biÕt, viÖc lµm s¹ch níc khã kh¨n h¬n nhiÒu so víi viÖc t¹o ra nã. 5 kiÓu chÊt « nhiÔm cã thÓ t×m thÊy trong níc lµ:

Çc lo¹i h¹t. Çc chÊt v« c¬ hßa tan (chÊt r¾n vµ chÊt khÝ). Çc chÊt h÷u c¬ hßa tan. Çc vi sinh vËt. ChÊt g©y sèt (pyrogen)

Çc vËt liÖu h¹t bao gåm phï sa, m¶nh vì èng dÉn vµ çc chÊt keo. Çc vËt liÖu h¹t l¬ löng nµy cã thÓ lµm t¾c nghÏn çi läc, van, èng dÉn phßng thÝ nghiÖm , mµng läc thÈm thÊu ngîc vµ thiÕt bÞ ®o ®é dÉn. Çc d¹ng h¹t ®îc nhËn biÕt khi vÈn ®ôc hoÆc ®ôc vµ ph¸t hiÖn ®îc nhê sö dông phÐp ®o fil läc hoÆc phÐp ph©n tÝch träng lîng, hoÆc ph¬ng ph¸p hiÓn vi. TiÒn läc 10 ®Õn 20 micron thêng ®îc ®Æt lµm cÊu ki Ön ®Çu tiªn trong hÖ thèng lµm s¹ch níc ®Ó lo¹i bá nh÷ng h¹t lín h¬n. Nh÷ng h¹t nhá h¬n lÇn lît ®îc lo¹i bá b»ng lo¹i thÈm thÊu ngîc, läc b¸n micro vµ siªu läc.

Çc chÊt v« c¬ hßa tan gåm çc ion Ca vµ Mg hßa tan tõ ®¸ (hai ion nµy lµm cøng níc), çc lo¹i khÝ nh CO2 díi d¹ng ion trong níc (CO2 dÔ dµng hßa tan trong níc ®Ó t¹o thµnh carbonic acid cã tÝnh axit nhÑ), silicat läc ra tõ nÒn s«ng chøa çt hoÆc tõ çc b×nh chøa thñy tinh, çc ion ferric vµ ferrous tõ çc èng s¾t han gØ, çc ion chloride vµ fluoride tõ çc thiÕt bÞ xö lý níc, phosphat tõ chÊt tÈy röa, nitrat tõ ph©n bãn vµ nhiÒu çc hîp chÊt kh¸c.

Cã mét sè phÐp kiÓm tra ®îc sö dông ®Ó nhËn diÖn d¹ng chÊt v« c¬ hßa tan cô thÓ. PhÐp kiÓm tra ®¬n gi¶n nhÊt lµ ®o trùc tiÕp ®é dÉn ®iÖn hoÆc ® iÖn trë. HÇu hÕt çc chÊt v« c¬ hßa tan hoÆc lµ tÝch ®iÖn ©m (çc anion) hoÆc lµ tÝch ®iÖn d¬ng (çc cation), vµ sÏ t¹o ra dßng ®iÖn khi cã mét ®iÖn ¸p ¸p vµo çc ®iÖn cùc trong níc. Cã mÆt nhiÒu ion h¬n, ®é dÉn cao h¬n, hoÆc lµ ®iÖn trë cña níc thÊp h¬n.

§é dÉn ®îc biÓu diÔn theo microsiemens/cm vµ ®îc sö dông ®Ó ®o níc víi sè lîng lín çc ion cã mÆt. §é dÉn vµ ®iÖn trë çi nä lµ nghÞch ®¶o cña çi kia. Do vËy,

t¹i 250C, 18.2M lµ níc tinh khiÕt nhÊt cã thÓ cã ®îc b»ng c«ng nghÖ ngµy nay, níc nµy còng cã thÓ ®îc xem lµ ®· cho ®é dÉn 0.055 microsiemen/cm.

B¶ng 2.15 T¬ng quan ®iÖn trë vµ ®é dÉn ®Õn chÊt lîng níc

§iÖn trë 0.1 1.0 10.0 18.24 Megohm-cm

§é dÉn 10.0 1.0 0.1 0.055 Microsiemen/cm

Çc chÊt h÷u c¬ hßa tan bao gåm çc chÊt thuèc trõ s©u, thuèc diÖt cá, gasoline, m« ®éng thùc vËt ph©n r·. ChÊt h÷u c¬ hßa tan cã thÓ ®Õn tõ èng dÉn, çc khíp nèi, vµ çc b×nh chøa b»ng nhùa. Chó ý nguån t¹o ra çc chÊt « nhiÔm h÷u c¬ cuèi cïng lµ tõ nh÷ng hÖ thèng lµm s¹ch níc ®îc thiÕt kÕ kh«ng hîp lý. Do ®ã, mét hÖ thèng läc níc ph¶i võa lo¹i bá ®îc çc chÊt « nhiÔm cã mÆt trong níc cÊp vµo, võa ph¶i ®îc thiÕt kÕ ®Ó gi¶m thiÓu cã thªm çc chÊt « nhiÔm vµo níc.

ViÖc thiÕu v¾ng chÊt h÷u c¬ hßa tan trong níc lµ ®iÒu rÊt quan träng khi thùc hiÖn ph©n tÝch vËt liÖu h÷u c¬ trong HPLC, s¾c ký khÝ, ®iÖn di, vµ phæ huúnh quang, hoÆc trong nghiªn cøu nu«i cÊy m«.

Cã mét vµi híng ®o møc h÷u c¬ hßa tan. PhÐp kiÓm tra thêi gian lu mÇu KMnO 4 lµ mét phÐp kiÓm tra ®Þnh tÝch h÷u c¬ cã thÓ ®îc sö dông. TiÒn ®Ò cña phÐp kiÓm tra nµy lµ KMnO4 cã mÇu tÝm t¬i, mét t¸c nh©n oxihoa m¹nh, sÏ chuyÓn tõ cã mÇu sang trong nÕu nh trong níc cã ®ñ lîng chÊt h÷u c¬ ®îc oxihoa. §iÒu trë ng¹i cña phÐp kiÓm tra nµy lµ nã chËm, kh«ng nh¹y víi møc rÊt thÊp cña çc vËt liÖu h÷u c ¬ (mµ cã thÓ nh÷ng møc ®ã vÉn lµ qóa cao ®èi víi môc ®Ých HPLC), vµ nã kh«ng mang tÝnh ®Þnh lîng - nã kh«ng cho biÕt cã bao nhiªu phÇn tû chÊt h÷u c¬ cã mÆt.


Çc thiÕt bÞ ph©n tÝch TOC, oxihoa chÊt h÷u c¬ vµ ®o lîng CO 2 tho¸t ra, ®ang ®îc sö dông phæ biÕn ®Ó x¸c ®Þnh møc chÊt h÷u c¬ trong níc lo¹i 1 nhê vµo ®é nh¹y ph¸t hiÖn møc thÊp cña chóng. Møc TOC thÊp lµ rÊt quan träng ®èi víi ngêi sö dông HPLC.

Vi sinh vËt t¹o nªn mét nhãm chÊt « nhiÔm kh¸c trong níc. Níc bÒ mÆt cã thÓ bÞ

« nhiÔm víi mét d¶i réng çc lo¹i vi sinh vËt bao gåm vi khuÈn (bacteria), ®éng vËt

®¬n bµo (protzoa), t¶o (algae), amip (amoebae), rotifer, t¶o çt (diatom) vµ çc lo¹i kh¸c. Tõ viÖc hÇu nh níc cña phßng thÝ nghiÖm lÊy tõ çc thiÕt bÞ xö lý níc cÊp ®«

thÞ, níc nµy chØ ®îc xö lý vi sinh vËt mang tÝnh bao qu¸t, do ®ã mèi lo ng¹i chÝnh

®èi víi çc hÖ thèng läc níc siªu s¹ch lµ vi khuÈn. Møc vi khuÈn tiªu biÓu ®èi víi nguån cÊp níc phßng thÝ nghiÖm di ®éng theo ®¬n vÞ cfu/ml.

Nh÷ng th¸ch thøc ®èi víi mét hÖ thèng läc níc siªu s¹ch lµ:

a) Lo¹i bá vi khuÈn trong níc cÊp vµo.

b) Ng¨n chÆn vi khuÈn ®i vµo hÖ thèng vµ lµm « nhiÔm nã.

c) B¶o ®¶m kh«ng cã vi khuÈn trong níc s¶n phÈm.

d) Ng¨n chÆn sù sinh trëng cña vi khuÈn qua mét thiÕt kÕ vµ vËn hµnh hîp lý.

Vi khuÈn lµ mét d¹ng tÕ bµo h÷u c¬ ph¸t triÓn nh©n lªn ë tèc ®é cÊp sè mò, ph¸t triÓn m¹nh trong níc ®äng, vµ cã thÓ cã mÆt trªn nhiÒu bÒ mÆt vµ trong kh«ng khÝ. Vi khuÈn tån t¹i trªn nhiÒu thÓ trong níc tinh khiÕt, bao gåm çc d¹ng h÷u c¬ hßa tan nh çc vËt liÖu nhùa vµ çc d¹ng v« c¬ hßa tan nh s¾t vµ sulfur.

Vi khuÈn sÏ ®i vµo mét hÖ thèng lµm s¹ch níc cha ®îc b¶o vÖ tõ níc cÊp, tõ bÊt kú vÕt r¹n nøt nµo trong hÖ thèng, hoÆc qua ®Çu dispenser (x¶). Mét khi ®· n»m trong hÖ thèng, vi khuÈn sÏ s¶n ra mét vËt liÖu polymeric, g¾n chÆt vËt liÖu nµy ®Õn bÒ mÆt b×nh chøa, çc cartridge khö ion, çc èng dÉn vµ çc bÒ mÆt hard -to-clean. Vi khuÈn thêng ®îc ph¸t hiÖn vµ ®îc ®Õm b»ng çch läc níc qua mµng läc 0.45micron vµ nu«i cÊy mµng läc trong mét m«i trêng phï hîp trong vµi ngµy. Sè lîng vi khuÈn ®Õm ®îc thêng ®îc b¸o ço theo ®¬n vÞ cfu/mL.

Vi khuÈn cã thÓ bÞ giÕt chÕt b»ng çc chÊt tÈy nh hydrogen peroxide, hydrochlorite vµ formaldehyde. Tuy nhiªn khi vi khuÈn bÞ giÕt, sù bµi tiÕt polymeric vµ çc m¶nh tÕ bµo lipopolysaccharide vÉn cã thÓ lµ mét nguån « nhiÔm nÕu chóng kh«ng ®îc lo¹i bá.

ChÊt g©y sèt, tiªu biÓu lµ çc m¶nh tÕ bµo vi khuÈn gam ©m hoÆc çc lipopolysccharide. Khi ®îc tiªm vµo ®éng vËt cã vó, pyrogen cã thÓ lµm t¨ng nhiÖt ®é c¬ thÓ. Do vËy níc trong dîc phÈm ph¶i kh«ng cã pyrogen. Pyrogen còng cã nh÷ng bÊt lîi hoÆc hiÖu øng chÕt ngêi trªn nu«i cÊy m«.

Çc pyrogen ®îc ph¸t hiÖn hoÆc b»ng çch tiªm níc vµo thá ®· qua nu«i dìng ®Æc biÖt vµ theo dâi nhiÖt ®é c¬ thÓ chóng t¨ng lªn, hoÆc víi phÐp kiÓm tra LAL (Limulus Amoebocyte Lysate), mét phÐp kiÓm tra nh¹y víi nång ®é thÊp cña çc lipopolysaccharide.

2.4.8 Các phương pháp làm sạch nước nói chung và cho phân tích HPLC

8 ph¬ng ph¸p ®îc sö dông phæ biÕn ®Ó lµm s¹ch níc, chóng lµ:

1. Chng cÊt (distillation)

2. Khö ion (deionization)

3. ThÈm thÊu ngîc (Reverse osmosis)

4. Läc cacbon ho¹t tÝnh (activated carbon filtration)

5. Läc microporous (microporous filtration)

6. Siªu läc (ultrafiltration)

7. Oxi hãa b»ng bøc x¹ tö ngo¹i (ultraviolet oxidation)

8. §iÖn thÈm t¸ch (electrodialysis)


B¶ng NCCLS díi ®©y so s¸nh hiÖu lùc cña 7 trong sè çc kü thuËt trªn ®îc sö dông ®Ó lo¹i bá çc chÊt « nhiÔm kh¸c nhau khái níc (®iÖn thÈm t¸ch kh«ng ®îc liÖt kª trong s¬ ®å NCCLS).

B¶ng 2.16 Çc kü thuËt vµ kh¶ n¨ng lo¹i bá chÊt « nhiÔm

KỸ THUẬT CHẤT Ô NHIỄM VÀ KHẢ NĂNG LOẠI BỎ CHÚNG

ChÊt r¾n

hßa tan

KhÝ

hßa tan

ChÊt h÷u

c¬ hßa

tan

VËt liÖu

h¹t

Vi sinh

vËt

Pyrogen

Chng cÊt EG(1) P G E E E

Khö ion E E P P P P

ThÈm thÊu

ngîc

G(2) P G E E E

Läc cacbon P P(3) EG(4) P P P

Läc

microporous

P P P E E P

Siªu läc P P G(5) E E E

Oxihoa UV P P EG(6) P G(7) P

E = TuyÖt vêi (cã kh¶ n¨ng lo¹i bá hoµn toµn hoÆc gÇn nh lµ toµn bé).

G = Tèt (cã kh¶ n¨ng lo¹i bá víi mét tû lÖ phÇn tr¨m lín).

P = Tåi (lo¹i bá ®îc Ýt hoÆc lµ kh«ng lo¹i bá ®îc).

(1) §iÖn trë cña níc ®îc lµm s¹ch b»ng chng cÊt lµ mét bËc cêng ®é nhá h¬n so víi níc ®îc lµm s¹ch b»ng ph¬ng ph¸p khö ion, chÝnh lµ do sù cã mÆt cña CO 2.

(2) Nång ®é tån d cña chÊt r¾n hßa tan phô thuéc vµo nång ®é gèc trong níc cÊp.

(3) Than ho¹t tÝnh sÏ lo¹i bá clo b»ng hÊp phô hãa häc.

(4) D¹ng than ®Æc biÖt cã thÓ ®a ra nh÷ng kh¶ n¨ng lo¹i bá vÕt chÊt h÷u c¬ tuyÖt vêi.

(5) Siªu läc sÏ lo¹i bá çc chÊt h÷u c¬ trªn c¬ së cutoff träng lîng ph©n tö cña mµng siªu läc.

(6) Mét sè hÖ thèng oxihoa UV nµo ®ã ®îc thiÕt kÕ ®Æc biÖt mang l¹i kh¶ n¨ng lo¹i bá vÕt chÊt h÷u c¬ tuyÖt vêi. §iÒu nµy kh«ng ®îc nhÇm lÉn víi thiÕt bÞ khö trïng UV.

(7) Çc hÖ thèng UV, trong khi kh«ng lo¹i bá vi khuÈn vÒ mÆt vËt lý, cã thÓ bÞ h¹n chÕ kh¶ n¨ng bacteriocidal hoÆc bacteriostatic vÒ mÆt cêng ®é, thêi gian tiÕp xóc vµ tèc ®é dßng.

Chng cÊt cã mét sè ®Æc trng tÝch cùc. ThiÕt bÞ t¬ng ®èi rÎ tiÒn, kh«ng bÞ hao mßn c¹n kiÖt so víi çc thiÕt bÞ thñy tinh vµ ®èt nãng thay thÕ kh¸c, vµ nh×n chung nã t¹o ra ®îc níc chÊt lîng tèt. Tiªu biÓu chng cÊt t¹o ra ®îc níc chÊt lîng lo¹i 2

vµ lo¹i 3, ®iÖn trë vµo kho¶ng 1.0M

Tuy nhiªn chng cÊt cã mét sè mÆt h¹n chÕ, vµ do nh÷ng mÆt h¹n chÕ nµy trong qóa khø nã ®· kh«ng thÓ ®îc sö dông réng r·i. Chng cÊt kh«ng ph¶i lµ quy tr×nh on -demand (theo yªu cÇu, cÇn lµ cã ngay). VÒ khÝa c¹nh nµy, mét lîng níc ph¶i ®îc chng cÊt vµ cÊt gi÷ ®Ó sö dông sau. NÕu b×nh chøa kh«ng ®îc t¹o ra tõ vËt liÖu tr¬, çc ion hoÆc vËt liÖu nhùa sÏ th«i ra khái b×nh chøa níc vµ lµm « nhiÔm níc trë l¹i. Vi khuÈn ®îc biÕt lµ sinh trëng tèt trong níc ®äng. Chai cã thÓ ®îc khö trïng vµ níc thu ®îc ®îc mang hÊp tiÖt trïng. Tuy nhiªn mét khi chai ®· më ra, nã tiÕp xóc víi vi khuÈn vµ « nhiÔm trë l¹i.


Chng cÊt cßn cã nh÷ng h¹n chÕ kh¸c, bao gåm tiªu hao nhiÒu n¨ng l îng vµ níc - tiªu biÓu chØ cã 5% níc ®îc sö dông trong quy tr×nh biÕn thµnh níc s¶n phÈm. VÉn ®ßi hái lµm s¹ch thêng xuyªn do tÝch luü kho¸ng tõ níc cÊp.

Khö ion ®îc sö dông phæ biÕn trong çc phßng thÝ nghiÖm ®Ó t¹o ra níc s¹ch khi cÇn (on-demand). Tiªu biÓu çc hÖ thèng deionization cã mét ®Õn 4 cartridge ®ång trôc ®îc mãc vµo çc ®êng èng dÉn vµ treo trªn têng gÇn víi bån röa.

Deionization thùc hiÖn chøc n¨ng nhê trao ®æi ion hydro víi çc chÊt « nhiÔm anion vµ ion hydroxyl cho çc chÊt « nhiÔm anion trong níc cÊp. Nhùa khö ion lµ çc h¹t nhùa rÊt nhá h×nh cÇu mµ níc cÊp sÏ ®i qua. Sau mét thêi gian nhÊt ®Þnh, çc cation vµ anion tõ níc sÏ ®æi chç tÊt c¶ çc nhãm hydrogen vµ hydroxyl trong h¹t nhùa vµ nhùa cÇn ®îc thay hoÆc ®îc t¸i chÕ.

Dionization cã mét vµi lîi thÕ (h¬n chng cÊt) ®Ó t¹o ra níc s¹ch. Nã lµ mét quy tr×nh on-demand cung cÊp níc s¹ch khi cÇn thiÕt. Nhùa deionization lo¹i nuclear lo¹i

bá hÇu hÕt çc vËt liÖu ionic trong níc ®Õn ®iÖn trë 18.2M-cm (t¹i 250C).

Tuy nhiªn chØ m×nh deionization kh«ng t¹o ra ®îc níc s¹ch tuyÖt ®èi. Çc m¶nh rÊt nhá cña nhùa trao ®æi ion ®îc röa ra khái hÖ thèng trong lóc vËn hµnh vµ níc ®äng trong çc cartridge cã thÓ lµm cho vi khuÈn sinh trëng qóa møc. Deionization còng kh«ng lo¹i bá tÊt c¶ çc chÊt h÷u c¬ hßa tan khái níc cÊp, vµ trªn thùc tÕ çc chÊt h÷u c¬ hßa tan cã thÓ lµm bÈn nhùa trao ®æi ion. Cuèi cïng, çc cartridge cã thÓ trë thµnh g¸nh nÆng chän lùa ®¾t tiÒn ®èi víi nh÷ng phßng thÝ nghiÖm a chän thay thÕ çc cartridge h¬n so víi t¸i sinh chóng.

Cã nhiÒu híng thö nghiÖm ®Ó kh¾c phôc mét phÇn nhîc ®iÓm cña khö ion vµ chng cÊt. Trong mét sè thiÕt lËp, chng cÊt ®îc ®Æt tríc khö ion - h¹n sö dông çc cartridge kÐo dµi h¬n nhiÒu nhng çc vÊn ®Ò « nhiÔm vi khuÈn vÉn cßn ®ã.

ThÈm thÊu ngîc lµ mét quy tr×nh kh¾c phôc ®îc nhiÒu nhîc ®iÓm cña chng cÊt vµ cña khö ion.

ViÖc hiÓu vÒ thÈm thÊu ngîc lµ nh thÕ nµo sÏ thuËn lîi h¬n sau khi ®· hiÓu quy tr×nh tù nhiªn cña sù thÈm thÊu. ThÈm thÊu lµ sù di chuyÓn cña níc qua mét mµng b ¸n thÊm tõ mÆt lo·ng h¬n (s¹ch h¬n) sang mÆt ®Ëm ®Æc h¬n (muèi h¬n). Sù di chuyÓn nµy sÏ tiÕp tôc cho ®Õn khi nång ®é ®¹t ®Õn c©n b»ng hoÆc ¸p lùc trªn mÆt ®Æc h¬n trë nªn ®ñ cao ®Ó dõng dßng di chuyÓn l¹i. ThÈm thÊu lµ mét qóa tr×nh tù nhiªn, mµ theo ®ã níc ®i vµo trong rÔ thùc vËt, hoÆc di chuyÓn tõ mét tÕ bµo nµy sang mét tÕ bµo kh¸c trong c¬ thÓ cña chóng ta.

NÕu cã mét ¸p lùc cao h¬n ¸p lùc thÈm thÊu ®Æt ¸p vµo dung dÞch ®Ëm ®Æc h¬n (sö dông b¬m cao ¸p), çc ph©n tö níc ®îc thæi ngîc l¹i ngang qua mµng sang mÆt Ýt ®Ëm ®Æc h¬n, t¹o ra níc s¹ch. §©y lµ quy tr×nh thÈm thÊu ngîc.

Tiªu biÓu thÈm thÊu ngîc lo¹i bá 90-99% hÇu hÕt çc chÊt « nhiÔm. B¶ng díi ®©y lµ çc ®Æc trng hiÖu qña cña thÈm thÊu ngîc:

B¶ng 2.17 HiÖu qu¶ lo¹i bá chÊt « nhiÔm cña thÈm thÊu ngîc

ChÊt « nhiÔm HiÖu qña lo¹i bá


ChÊt r¾n l¬ löng 100%

Vi khuÈn 99.5%

Vi rót 99.5%

Pyrogen 99.5%

Ph©n tö chÊt h÷u c¬ träng lîng >250 Daltons 97-99.5%

Çc chÊt v« c¬ monovalent 94-96%

Çc chÊt v« c¬ divalent 96-98%

Çc chÊt v« c¬ trivalent 98-99%

Do hiÖu qña lµm s¹ch hiÕm cã cña nã, thÈm thÊu ngîc lµ mét c«ng nghÖ hiÖu qña víi chi phÝ rÊt cao vµ thêng ®îc sö dông tiÒn lµm s¹ch níc cÊp ®Ó lµm s¹ch h¬n n÷a b»ng çc c«ng nghÖ kh¸c. Tõ viÖc thÈm thÊu ngîc lo¹i bá mét tû lÖ % cao v i khuÈn vµ pyrogen, nã thêng ®îc kÕt hîp víi trao ®æi ion ®Ó kÐo dµi ®¸ng kÓ tuæi thä cña çc cartridge "polishing" khö ion. Thªm vµo ®ã, mét hÖ thèng cho phÐp ph©n ph¸t níc thÈm thÊu ngîc t¹o ra nguån níc tiÒn lµm s¹ch chÊt lîng cao thÝch hîp cho nh iÒu môc ®Ých phßng thÝ nghiÖm phæ th«ng.

Läc cacbon ho¹t tÝnh lo¹i bá chlorine nhê hÊp phô hãa häc vµ çc chÊt h÷u c¬ hßa tan nhê hÊp phô vµ thêng ®îc t×m thÊy t¹i hai vÞ trÝ trong mét hÖ thèng lµm s¹ch níc. Do hîp chÊt film máng mµng thÈm thÊu ngîc nh¹y víi chlorine vµ nhiÔm bÈn tõ chÊt h÷u c¬ hßa tan ë møc ®é Ýt h¬n, cacbon ho¹t tÝnh thêng ®îc ®Æt tríc mµng RO ®Ó lo¹i bá çc chÊt « nhiÔm ®ã.

Mét bé läc than ho¹t d¹ng h¹t còng thêng ®îc ®Æt trong vßng ®Þnh cì polishing cña mét hÖ thèng lµm s¹ch níc ®Ó lo¹i bá lîng vÕt çc chÊt h÷u c¬ hßa tan t¹o ra chÊt lîng níc phï hîp cho nhiÖm vô HPLC.

Läc microporous hoÆc läc b¸n micro sö dông mµng hoÆc sîi rçng víi kÝch thíc lç tuyÖt ®èi 0.2micron ng¨n chÆn bÊt kú chÊt « nhiÔm nµo cã kÝch thíc lín h¬n 0.2micron khái ®i qua nã. Çc bé läc b¸n micro gi÷ l¹i nh÷ng h¹t cacbon mÞn tõ cartridge cacbon, çc m¶nh nhùa tõ cartridge khö ion vµ bÊt kú vi khuÈn nµo cã kh¶ n¨ng ®i vµo hÖ thèng.

NCCLS mong muèn níc kh«ng cã çc vËt liÖu h¹t khi nã ®· ®i qua mµng läc 0.2micron. Nh÷ng mµng läc microporous ®îc xem lµ mét cÊu kiÖn kh«ng thÓ thiÕu cña hÖ thèng lµm s¹ch níc, trõ phi chóng ®îc thay b»ng mµng siªu läc.

Siªu läc sö dông mµng rÊt gièng víi mµng läc sö dông trong hÖ thèng thÈm thÊu ngîc ngo¹i trõ lç cña mµng siªu läc t¬ng ®èi réng h¬n. Mµng siªu läc ®îc sö dông ®Ó lo¹i bá çc pyrogen vµ çc ph©n tö h÷u c¬ m¹ch dµi kh¸c nh RNase khái níc s¹ch.

Tõ viÖc cã mét tû lÖ phÇn tr¨m cao níc ®i qua ®îc mµng siªu läc, cuèi cïng nã sÏ bÞ t¾c nÕu kh«ng ®îc b¶o dìng. Trong mét hÖ thèng ®îc thiÕt kÕ hîp lý th× mµng siªu läc sÏ thêng xuyªn ®îc röa bá chÊt « nhiÔm. Víi kiÓu thiÕt kÕ nµy, siªu läc lµ mét c«ng nghÖ næi bËt b¶o ®¶m mang l¹i chÊt lîng níc siªu s¹ch rÊt æn ®Þnh.

Tö ngo¹i hoÆc quang oxihoa sö dông bøc x¹ tö ngo¹i t¹i bíc sãng biocidal 254nm ®Ó lo¹i bá vi khuÈn khái hÖ thèng. Nã còng ph¸ vµ ion hãa mét sè chÊt h÷u c¬ nµo ®ã t¹i bíc sãng 185nm ®Ó tiÕp theo lo¹i bá b»ng çc cartridge khö ion vµ cartridge hÊp phô h÷u c¬ trong vßng ®Þnh cì polishing.

§iÖn thÈm t¸ch lo¹i bá çc chÊt bÈn khái níc sö dông dßng ®iÖn ®Ó kÐo çc chÊt « nhiÔm ion qua mµng lùa chän ion vµ lo¹i ra khái níc s¹ch. ThØnh tho¶ng ®îc sö dông ®Ó t¹o ra níc uèng tõ níc cÊp nhiÔm mÆn s¹ch. §iÖn thÈm t¸ch lµ mét kü thuËt c¹nh tranh víi thÈm thÊu ngîc.

Tuy nhiªn ®Ó t¹o ra níc lo¹i cho phßng thÝ nghiÖm, ED cã mét vµi trë ng¹i vµ v× thÕ hiÕm khi ®îc sö dông trong phßng thÝ nghiÖm. §Çu tiªn çc chÊt « nhiÔm mµ ED cã thÓ lo¹i bá bÞ h¹n chÕ. ED kh«ng thÓ lo¹i bá çc chÊt « nhiÔm kiÓu nh mét s è chÊt


h÷u c¬, chÊt pyrogen nµo ®ã vµ çc nguyªn tè kim lo¹i cã ®iÖn tÝch bÒ mÆt yÕu hoÆc lµ kh«ng cã ®iÖn tÝch bÒ mÆt do chóng kh«ng bÞ hót ®Õn mµng. Thø hai, ED ®ßi hái cÇn cã mét ngêi vËn hµnh cã ®µo t¹o vµ b¶o dìng thêng nhËt. Çc ph©n tö lín cã man g ®iÖn tÝch ®¸ng kÓ nh mét sè chÊt keo vµ chÊt tÈy röa nµo ®ã cã thÓ lµm bÝt lç mµng, lµm gi¶m kh¶ n¨ng truyÒn ion qua chóng vµ yªu cÇu ph¶i lµm s¹ch thêng xuyªn. Trong lóc vËn hµnh, ED nh¶ ra x« ®a ¨n da cã thÓ lµm bong cÆn, nh¶ hydrogen t¹o ra nh÷ng nguy hiÓm tiÒm Èn. Sau cïng th× ED t¬ng ®èi ®¾t tiÒn. Khi çc chÊt « nhiÔm ion ®îc lo¹i khái níc, ®iÖn trë gia t¨ng, v× thÕ yªu cÇu ph¶i cã dßng ®iÖn cao h¬n ®Ó tiÕp tôc qu¸ tr×nh lµm s¹ch. ViÖc lµm s¹ch vît qóa møc níc uèng ®îc coi xem lµ l·ng phÝ v× tiªu hao ®iÖn n¨ng gia t¨ng. Çc vËt liÖu cÊu kiÖn nh platinum vµ thÐp kh«ng gØ còng lµ nh÷ng thø ®¾t tiÒn.

B¶ng 2.18 Híng dÉn vÒ tÝnh t¬ng thÝch hãa häc

cña mét sè vËt liÖu chÕ t¹o mµng läc

Dung m«i GHP PTFE Nylon PVDF

Acetone R R R NR

Acetonitril R R R R

Acetic acid, glacial R R NR R

n-butanol R R R R

Chloroform R R R R

Dioxane R R R

Dimethyl formamide R R R NR

Dimethyl sulfoxide R R R NR

Ethanol R R R R

Ethyl acetate R R R R

Ethyl ether R R R R

Freon TF R R R R

Hydrochloric acid (1N) R R NR R

Hexane, dry R R R R

Methanol R R R R

Methylene chloride R R R R

Methyl ethyl ketone R R R NR

N-Methyl pyrolidone R R R NR

Isopropanol R R R R

Sodium hydroxide (3N) R R LR NR

Tetrahydrofuran R R R NR

Tetrahydrofuran/water (50/50) R R R

Toluene R R R R

Water R R R R

R = Resistant. Kh«ng quan s¸t thÊy cã nh÷ng thay ®æi ®¸ng kÓ vÒ tèc ®é hoÆc bät

®iÓm trªn mµng.

LR = Limited Resistance . Cã nh÷ng thay ®æi võa ph¶i vÒ thuéc tÝnh vËt lý hoÆc vÒ

kÝch thíc mµng.


NR = Not Resistance. VÒ c¬ b¶n mµng kh«ng bÒn. Trong hÇu hÕt çc trêng hîp, xuÊt

hiÖn co hoÆc phång rép diÖn réng.

§Ó kiÓm tra tÝnh t¬ng thÝch cña nh÷ng dung m«i díi ®©y, 2mL dung m«i ®îc läc vµ ®é hÊp thô UV ®îc ®Æt t¹i 254nm (trõ phi ®îc lu ý kh¸c ®i). Sau khi läc, t×nh tr¹ng nguyªn vÑn cña mµng ®îc kiÓm tra b»ng ph¬ng ph¸p ®iÓm bät. D÷ liÖu díi ®©y ®îc sö dông nh mét híng dÉn do tÝnh hay thay ®æi cña çc quy tr×nh.

Acetone R* Hydrochloric acid (1N) R

Acetonitril R Hexane, dry R**

Acetic acid, Glacial R Isopropanol R

Butanol R Methanol R

Chloroform R** Methylene chloride R**

Dioxane R Methyl ethyl ketone R*

Dimethyl formamide R* N-Methylpyrrolidone R*

Dimethyl sulfoxide R* Sodium hydroxide (5N) R

Ethanol R Tetrahydrofuran R**

Ethyl acetate R* Tetrahydrofuran/H2O (50/50, v/v) R

Ethyl ether R Toluene R**

Freon TF R Water R

R Trë kh¸ng

R* Trë kh¸ng, UV ®Æt t¹i 365nm thay v× 254nm.

R** Nh÷ng thiÕt bÞ 4mm bÞ h¹n chÕ vÒ trë kh¸ng, nhưng cã thÓ phï hîp khi ®é hÊp thô

UV ®îc ®o t¹i nh÷ng bíc sãng kh¸c

2.5 Lực rửa giải và thành phần pha động

Trong kỹ thuật phân tích HPLC, để đặc trưng cho một quá trình sắc ký, tức là quá trình rửa giải

các chất mẫu ra khỏi cột tách bằng một pha động nhất định, người ta dùng đến khái niệm về lực rửa

giải E hay là lực dung môi. Trong quá trình sắc ký lực này là kết quả của tổng các tương tác của các

phần tử chất tan với pha động, với pha tĩnh, sự tương tác của các phần tử pha động với pha tĩnh.

Các tương tác đó có thể được phân chia thành 4 loại sau đây:

a/ Các tương tác phân tán

b/ Các tương tác lưỡng cực

c/ Các tương tác cầu hydro

d/ Các tương tác tĩnh điện

Bốn loại tương tác này có liên quan chặt chẽ với nhau và tuỳ từng trường hợp cụ thể của mỗi hệ

pha và mỗi loại sắc ký mà loại tương tác nào trong số chúng sẽ chiếm ưu thế. Khả năng, tính chất và

mức độ (ái lực) tương tác của các tương tác trên sẽ xác định độ lớn của đại lượng đặc trưng lực rửa

giải E của pha động.

Nói chung các dung môi phân cực sẽ tương tác ưu tiên và hoà tan tốt các chất phân cực. Trong

trường hợp này tương tác lưỡng cực và tương tác tĩnh điện có ý nghĩa lớn. Tất nhiên lực rửa giải là

phụ thuộc vào bản chất của dung môi hữu cơ pha chế pha động, và vào thành phần dung môi hữu cơ

pha pha động (bảng 2.6). Đồng thời trong một mức độ nhất định nó còn phụ thuộc vào cả pha tĩnh

(bảng 2.5). Bảng 2.19 là một vài ví dụ về lực rửa giải của các dung môi đơn khi thực hiện sự tách

trên chất nhồi cột chế tạo từ hai nguyên liệu nền Silica và Oxit nhôm.

Khi thành phần pha động thay đổi, làm cho lực rửa giải của pha động thay đổi, tức là làm thay

đổi thời gian lưu giữ chất tan ở trong cột. Điều đó có nghĩa là ứng với một thành phần pha động thì


ta có một giá trị lực rửa giải E nhất định và tương ứng với giá trị E đó chúng ta lại có một kết quả

tách nhất định của một hỗn hợp mẫu. Đồng thời cũng từ thực tế nghiên cứu thực nghiệm tách các

hỗn hợp bằng kỹ thuật HPLC đã chỉ ra rằng, khi giá trị lực rửa giải E của pha động thay đổi 0,05

đơn vị thì hệ số dung tích k’i của chất tan có thể thay đổi trong phạm vi từ 2 - 4 lần đối với sắc ký

hấp phụ.

Như vậy lực rửa giải và hệ số dung tích ki’ của chất tan có liên quan chặt chẽ với nhau. Vì thế

để định nghĩa lực rửa giải của dung môi người ta quy định và xác nhận lực rửa giải của hai dung

môi đơn là nước cất và n-pentan đối với pha tĩnh trên nền silica và nền oxit nhôm. Ở đây dung môi

n-pentan có lực rửa giải E = 0.00; còn nước cất có lực rửa giải E = 1.00 lớn nhất (xem ví dụ trong

bảng 2.19). Như vậy nếu trộn các dung môi trên với nhau ta sẽ được những pha động có lực rửa giải

nằm giữa 0.00 và 1.00. Đồng thời bảng này cũng cho ta thấy lực rửa giải E cũng có phụ thuộc ở một

mức độ nhất định vào bản chất loại chất nền pha tĩnh. Các kết quả thực nghiệm cho thấy loại nền

silica luôn cho lực rửa giải nhỏ hơn nền oxit nhôm và tuân theo gần đúng biểu thức sau đây:

E(silica) = 0,76 E(oxitAl)

Trong đó E(silica) là lực rửa giải với chất nhồi nền silica, còn E(oxitAl) là lực rửa giải với nền oxit

nhôm.

Bảng 2.19 Lực rửa giải của một số dung môi đơn nguyên chất

Tên dung môi Lực rửa giải E trên chất nhồi

Silica trần Oxit nhôm

n-Pentan 0.00 0.00

n-Hexan 0.01 0.01

n-Heptan 0.01 0.01

Izo octan 0.01 0.01

Tetra chlorocarbon (CCl4) 0.11 0.16

1-Chlorobutan 0.20 0.26

Chloroform 0.26 0.40

Dichloro-methylen (CH2Cl2) 0.32 0.42

Izo propyl ether 0.34 0.38

Ethyl acetat 0.38 0.58

Tetra hydrofuran 0.44 0.57

Dioxan 0.49 (0.59)

Axeto-nitril 0.50 0.65

Metanol 0.73 0.95

Nước 1.00 1.00

Như vậy pha tĩnh trên nền Silica luôn luôn có lực rửa giải nhỏ hơn pha tĩnh trên nền oxit nhôm.

Điều đó có nghĩa ảnh hưởng của nền silica đến lực rửa giải của dung môi là lớn hơn nền oxit nhôm.

Mặt khác ngay những pha động có cùng lực rửa giải, nhưng được pha chế từ những chất khác

nhau lại cũng ảnh hưởng khác nhau đến hệ số dung tích chất tan. Điều này có thể thấy trong ví dụ

tách hỗn hợp hai chất: (1)- Acetoxynaphthalen và (2)- 1,5-dinitronaphthalen (bảng 2.20).

Bảng 2.20 Ảnh hưởng của bản chất dung môi pha chế pha động đến hệ số dung lượng ki’ của chất tan

trong điều kiện pha động cùng lực rửa giải E = 0,25

% trong pentan k1’ k2’

'

2

'

1)21(

k

k

50% benzen 5,1 2,5 2,04


25% diethyl ether 2,5 2,9 1,1

23% dichorometan 5,5 5,8 1,05

4% ethyl acetat 2,9 5,4 1,86

0,5% DMSO 1,0 3,5 3,5

Điều này chỉ có thể giải thích được đó là ảnh hưởng của bản chất của các dung môi đơn trong

pha động đó. Nếu pha động gồm 2 hay 3 dung môi đơn được trộn với nhau, thì ứng với mỗi một

thành phần của pha động ta sẽ có lực rửa giải E của nó. Vì thế qua việc thay đổi thành phần của các

chất trong pha động chúng ta có thể điều chỉnh được lực rửa giải E theo yêu cầu để có được sự tách

sắc ký tốt nhất đối với một hỗn hợp chất tan đã chỉ ra. Nếu pha động được trộn từ hai dung môi, thì

lực rửa giải được tính theo công thức:

B

EE

B

AoABXXn

EEAoBo

1log..

1)()(..)(

Trong đó: là hệ số hấp phụ của pha tĩnh. E0(A) và E0(B) là lực dung môi của hai dung môi đơn

A và B. XB là nồng độ (số mol riêng phần) của dung môi B trong pha động, còn n là điện tích phân

tử của dung môi. Ở đây A là dung môi có thành phần chiếm trên 50%, còn B là dung môi phụ thêm

vào dung môi chính A.

Trên đây là công thức tính gần đúng lực rửa giải của một pha động gồm hai thành phần. Trong

thực tế thì loại pha động 2 thành phần là loại được sử dụng phổ biến nhất. Song cũng có trường hợp

pha động gồm ba hoặc bốn thành phần và trong những trường hợp này việc tính lực rửa giải E cũng

tương đối phức tạp. Nhưng từ nhiều kết quả thực nghiệm đã chỉ ra rằng lực rửa giải E của một pha

động là một đại lượng đặc trưng cho độ mạnh tách sắc ký của pha động đó ứng với một pha tĩnh

nhất định, và nói chung nó hầu như là hàm số của tỷ lệ thành phần của từng dung môi tạo ra pha

động, đồng thời cũng phụ thuộc vào độ phân cực của mỗi dung môi. Điều đó có nghĩa hai yếu tố

bản chất của dung môi đơn và thành phần của nó trong pha động là những yếu tố chính quyết định

đến lực rửa giải của một pha động. Điều này chúng ta thấy ở một ví dụ trong bảng 2.19 và 2.20.

Mặt khác chúng ta cũng thấy rằng, trong kỹ thuật HPLC, trong một số trường hợp pha động chỉ

là một dung môi đơn. Nhưng loại pha động bao gồm hai dung môi đơn trộn với nhau là phổ biến và

được trộn với nhau theo một thành phần phù hợp nhất để thu được kết quả tách tốt nhất của hỗn hợp

chất mẫu. Trong hệ NP-HPLC thì pha động là không phân cực hay ít phân cực. Còn trong hệ RP-

HPLC thì pha động là phân cực.

Trong các dung môi dùng cho HPLC, hiện nay có nước là dung môi có độ phân cực lớn, sau đó

đến formamide, ethylglycol, acetonitril, methanol (xem bảng 2.21). Tất nhiên ở đây có dung môi

không phân cực hoặc rất ít phân cực. Quan hệ về độ phân cực của dung môi, cho đến nay vẫn có

một số khái niệm khác nhau. Nhưng trong sắc ký lỏng cao áp thì thì định nghĩa của Rohrschneider

là phù hợp hơn cả. Vì thế khái niệm này được sử dụng phổ biến để tính toán lực rửa giải trong kỹ

thuật HPLC. Tất nhiên đó chỉ là những tính toán gần đúng để giải thích các vấn đề tách sắc ký của

thực tế. Song nó vẫn là những khái niệm ban đầu còn đang được nghiên cứu và hoàn thiện tiếp.

Bảng 2.21 là những ví dụ về độ phân cực P của một số dung môi trong HPLC theo quan niệm của

Rohrschneider.

Bảng 2.21 Độ phân cực của một số dung môi theo Rohschneider

TT Tên dung môi Độ phân cực P

1 Xyclohexan - 0,20

2 Cyclopentan - 0,20

3 n-Pentan 0,00

4 n-Hexan 0,10

5 n-Heptan 0,20

6 2-chloro-propane 0,20


7 Disulfur carbon 0,30

8 1-chloro butan 1,00

9 Tetra chloro carbon 1,60

10 Toluen 2,40

11 Ethyl ether 2,80

12 n-Butanol 3,90

13 n-Propanol 4,00

14 Chloroform 4,100

15 Ethanol 4,30

16 Axeton 5,10

17 Methanol 5,11

18 Axetonitril 5,80

19 Ethylglycol 6,90

20 Formamide 9,60

21 Nước cất 10,20

Như vậy theo định nghĩa của Rohrschneider thì độ phân cực của các dung môi hữu cơ thay đổi

từ -2,00 đến +10,00 và theo những nghiên cứu của kỹ thuật HPLC thì khi đại lượng P thay đổi hai

lần thì hệ số dung tích thay đổi xấp xỷ 10 lần. Điều này có thể được giải thích theo phương trình

sau:

2'

1

'

221

10

PP

k

k

(2.53)

đối với hệ sắc ký pha thường (NP-HPLC). Còn đối với hệ pha ngược (RP-HPLC) là tuân theo

phương trình sau:

2'

1

'

212

10

PP

k

k

(2.54)

Nói tóm lại là lực rửa giải của một pha động và độ phân cực của dung môi để pha chế tạo ra pha

động đó luôn luôn có mối quan hệ chặt chẽ với nhau và là một yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến

thời gian lưu giữ của chất tan đối với một hệ pha nhất định. Sự thay đổi thành phần các chất tạo ra

pha động luôn luôn kéo theo sự thay đổi thời gian lưu của chất tan và qua đó có thể làm tốt lên hay

xấu đi sự tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Chính vì thế qua việc lựa chọn pha động có thành phần

phù hợp chúng ta sẽ có kết quả tách tốt đối với một hỗn hợp mẫu đã cho.

2.6 Cân bằng động trong HPLC

Các cân bằng và động học các quá trình xảy ra trong cột tách HPLC là những vấn đề hết sức

phức tạp và còn nhiều điểm chưa được giải thích đầy đủ cả về lý thuyết và thực nghiệm. Vì thế ở

đây chúng ta chỉ đề cập đến vài vấn đề chính để làm sáng tỏ bản chất của quá trình sắc ký và các

yếu tố ảnh hưởng đến nó, ví dụ như:

- Bản chất của tương tác chính ở trong cột tách.

- Các cân bằng hoá học trong cột tách.

- Các yếu tố có ảnh hưởng đến cân bằng trong cột tách….

Các vấn đề này đều có liên quan đến các cân bằng động học, sự tương tác, bản chất của các

tương tác giữa các cấu tử (pha tĩnh, pha động, chất tan) ở trong cột sắc ký khi chúng ta tiến hành rửa

giải một hỗn hợp chất tan trong những điều kiện sắc ký đã chọn. Lúc này thành phần pha động, tốc

độ rửa giải của pha động, pH của pha động, nhiệt độ cột tách trong quá trình sắc ký và sự phân bố

của chất tan giữa hai pha có tuân theo quy luật đẳng nhiệt tuyến tính hay là không tuyến tính. Đồng


thời đóng góp thêm vào đó còn có các hiện tượng khuyếch tán và đối lưu của chất tan ở trong cột.

Các cân bằng phân bố là nhanh đạt được hay là chậm. Đó là những hiện tượng có thể xảy ra đồng

thời trong quá trình sắc ký, nhưng lại không độc lập nhau, mà luôn luôn có ảnh hưởng lẫn nhau.

Các ảnh hưởng đó dẫn đến cuối cùng là kết quả của sự tách.

Về mặt động học của sự tương tác các chất trong cột sắc ký, chúng ta đều thấy rằng khi mẫu

phân tích (chất tan) được nạp vào cột tách, trong cột tách sẽ tồn tại đồng thời ba thành phần chính

là:

- Pha tĩnh không chuyển động. Ở đây chỉ có các vị trí chứa nhóm hoạt động (trung tâm hoạt

động) sắc ký là có những tương tác nhất định (như hấp phụ hay trao đổi ion).

- Chất phân tích vừa chuyển động từ đầu cột đến cuối cột và đồng thời trong quá trình này

luôn luôn có sự phân bố lại giữa hai pha động và tĩnh để tạo ra sự sắc ký.

- Pha động, nó là dung môi rửa giải và chuyển động theo một tốc độ nhất định trong quá trình

sắc ký. Đồng thòi cũng chính trong quá trình chuyển động này nó mang chất phân tích ra khỏi cột

tách.

Như vậy trong quá trình sắc ký ở trong cột tách xảy ra đồng thời ba tương tác chính là:

1. Sự tương tác của chất tan với pha tĩnh (a),

2. Sự tương tác của chất tan với pha động (b) và

3. Sự tương tác của pha động với pha tĩnh (c).

Kết quả của 3 tương tác này làm cho chất tan được phân bố vào pha tĩnh hay pha động theo

những tỷ lệ nhất định trong các điều kiện sắc ký đã chọn. Nghĩa là mỗi chất tan sẽ phân bố vào hai

pha tĩnh và pha động theo những tỷ lệ nhất định và điều đó dẫn đến sự tách được, không tách được

các chất ra khỏi nhau trong một hỗn hợp mẫu được nạp vào cột sắc ký.

Tuy ba tương tác trên xảy ra đồng thời, nhưng hai tương tác (a) và (b) là quyết định cho một quá

trình sắc ký. Nếu chúng ta gọi lực tương tác ba tương tác trên là Fa, Fb và Fc thì tổng của ba tương

tác đó là lực Ftot sẽ quyết định thời gian lưu giữ của một chất tan ở trên cột tách. Nghĩa là ta có:

Ftot = (Fa + Fb + Fc) (2.55)

Tất nhiên Ftot là tổng đại số của 3 lực thành phần a,b và c. Vì 3 lực tương tác này ngược nhau.

Một cách tổng quát và hình thức toán học chúng ta có thể mô tả 3 tương tác đó theo mô hình trong

hình 2.11 sau đây

Fa Fc

Fb

Hình 2.11 Mô tả sự tương tác trong cột sắc ký

Trong 3 lực tương tác trên, hai lực Fa và Fb là ngược chiều nhau; Ở đây Fa giữ chất tan trong pha

tĩnh, còn Fb kéo chất tan vào pha động. Khi đó hai lực Fa và Fc là hai tương tác cạnh tranh của chất

tan và pha động lên pha tĩnh. Tất nhiên trong những điều kiện sắc ký nhất định thì những tương tác

trên là những cân bằng động. Những cân bằng này là diễn biến liên tục suốt trong quá trình sắc ký

từ khi nạp mẫu vào cột tách cho đến khi chất tan cuối cùng ra khỏi cột tách.

Trong quá trình diễn biến như thế, chất tan nào có lực tương tác tổng cộng Ftot lớn nhất sẽ bị giữ

lại trong cột tách lâu nhất, nghĩa là nó được rửa giải ra sau cùng. Ngược lại chất tan nào có lực rửa

giải Ftot nhỏ nhất sẽ được rửa giải ra trước tiên trong quá trình sắc ký. Nếu lực Ftot của các chất

SP

X MP


trong hỗn hợp mẫu phân tích khác nhau nhiều thì sự tách là tốt. Nghĩa là các chất được tách hoàn

toàn ra khỏi nhau sau quá trình sắc ký.

Trong các tương tác trên, tương tác (a), lực Fa là phụ thuộc vào tính chất và các đặc trưng của

pha tĩnh như kiểu xốp, độ xốp, vị trí nhóm hoạt động sắc ký trên bề mặt pha tĩnh. Đồng thời cũng

phụ thuộc cả vào tính chất và cấu trúc phân tử chất tan, các loại nhóm thế có trong phân tử chất tan.

Trong tương tác (b), lực Fb là phụ thuộc vào bản chất của dung môi tạo ra pha động và thành

phần của chúng. Đồng thời Fb cũng bị ảnh hưởng rất mạnh khi thay đổi tốc độ pha động qua cột

tách và ở đây có một tốc độ tốt nhất cho sự tách là giá trị tốc độ u0 (cm/gy) trong phương trình Van

Deemter. Với sắc ký trao đổi ion và cặp ion, ngoài các yếu tố trên lực Fb còn phụ thuộc cả vào pH

của pha động, tính chất của ion trao đổi cua pha tĩnh, ion tạo cặp trong sắc ký cặp ion.

So với hai tương tác (a) và (b), thì tương tác (c) không đóng vai trò quyết định. Lực Fc cũng có

thể dương mà cũng có thể âm, tuỳ theo mỗi trường hợp cụ thể, nó là sự tương tác cạnh tranh của

chất tan và các phân tử của pha động lên pha tĩnh. Vì thế nó cũng đóng góp một phần nhất định vào

thời gian tồn tại của chất tan trong pha tĩnh.

Một cách tổng quát và từ những kết quả thực nghiệm khi xem xét các cân bằng động học (a), (b)

và (c) của sự tách sắc ký trong kỹ thuật HPLC, người ta thấy lực Ftot là phụ thuộc vào nhiều yếu tố

như:

- Bản chất và các đặc trưng của pha tĩnh, kiểu cấu trúc xốp, bề mặt hoạt động, loại

nhóm chức hoạt động sắc ký, kích thước hạt của pha tĩnh.

- Bản chất của dung môi tạo ra pha động và thành phần của chúng, tốc độ rửa giải của

pha động qua cột tách.

- Tính chất của ion tạo cặp trong sắc ký ion.

- Giá trị pH của pha động.

- Chất hoạt động bề mặt, chất tạo phức, chất điện ly có trong pha động hay trong mẫu.

- Nhiệt độ cột tách trong quá trình sắc ký.

Tất cả những yếu tố này đều đóng góp trong những mức độ nhất định vào lực lưu giữ Ftot của

chất tan và đưa đến kết quả là có sự tách sắc ký hay không của một hỗn hợp mẫu trong một điều

kiện nhất định chạy sắc ký. Đồng thời cũng chính do những tính chất trên mà chúng ta có thể tìm

được những thông số và điều kiện phù hợp cho sự tách sắc ký một hỗn hợp mẫu để có kết quả tách

tốt nhất qua việc nghiên cứu thay đổi các yếu tố đó.

Nhưng hai yếu tố quan trọng nhất ở đây là bản chất của pha tĩnh và pha động. Nếu pha tĩnh là

chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ. Nếu pha tĩnh là chất lỏng ta lại có sắc ký phân bố (hay sắc ký

chiết). Trong những trường hợp này chất tan phân bố giữa hai pha theo cơ chế chiết liên tục trong

dòng chảy của pha động. Khác với hai loại trên, nếu pha tĩnh là các chất có mang nhóm trao đổi ion

thì ta có sắc ký trao đổi ion. Trong loại sắc ký này chất tan phân bố giữa pha tĩnh và pha động theo

cân bằng trao đổi ion qua các nhóm chức chứa ion trao đổi mang điện tích ở trên bề mặt pha tĩnh.

Khi đó với sắc ký cặp ion, thì sự phân bố của chất tan ở dạng hợp chất liên hợp giữa pha tĩnh và pha

động theo cả hai cơ chế vừa hấp phụ vừa trao đổi ion. Còn trong sắc ký thẩm thấu qua Gel thì các

chất tan phân bố giữa pha động và pha tĩnh được coi như là sự rây phân tử. Nghĩa là các phân tử có

kích thước nhỏ nhất sẽ chui vào sâu trong cùng của lỗ xốp pha tĩnh, các phân tử lớn nằm ngoài cùng.

Như vậy qua các cơ chế của từng loại sắc ký đã nêu, chúng ta thấy dù ở loại sắc ký nào thì cũng

luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân

bằng phân bố với hệ số phân bố Ki được tính theo công thức:

)(

)(

M

S

iCi

CiK (2.56)

Trong đó Ci(S) và Ci(M) là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh (S) và pha động (M).


Cân bằng phân bố này của các chất tan i giữa hai pha động và pha tĩnh cũng tuân theo quy luật

phân bố Langmuir và chỉ ở nồng độ nhỏ ta mới có sự phân bố tuyến tính. Còn ở vùng nồng độ lớn,

sự phân bố là không tuyến tính. Nhưng trong kỹ thuật phân tích HPLC, lượng mẫu được nạp vào

cột tách là nhỏ, nghĩa là nồng độ Ci nhỏ, nên trong hầu hết các trường hợp ta có sự phân bố tuyến

tính và píc sắc ký tương đối cân đối. Ngược lại nếu Ci lớn, thường dẫn đến sự phân bố không tuyến

tính, lúc này các píc sắc ký không cân đối. Điều đó dẫn đến kết quả tách không tốt, khi các píc sắc

ký có chân doãng rộng và không cân đối. Vì thế không nên nạp lượng mẫu lớn hơn giới hạn vùng

tuyến tính vào cột tách.

Nói chung, sự phân bố của chất tan i vào hai pha của một hệ sắc ký là phụ thuộc vào nhiều yếu

tố. Song hai yếu tố quyết định chính là bản chất, cấu trúc và thành phần của pha tĩnh và pha động.

Các yếu tố khác như pH pha động, nhiệt độ,…có ảnh hưởng trong một mức độ nhất định mà thôi.

Nghĩa là trong những điều kiện nhất định, chất tan i có thể tồn tại ở pha nào nhiều hay ít, bị lưu giữ

lâu hay không lâu là tuỳ thuộc vào sự xử sự của nó đối với mỗi pha theo các tính chất đặc trưng của

mỗi pha trong điều kiện sắc ký đã chọn. Tức là các đặc trưng nhiệt động của cân bằng phân bố

trong trạng thái dòng chảy liên tục. Nó tồn tại ở pha nào lâu nhất thì ở đó nó phải có hoạt độ nhiệt

động học (thế nhiệt động) thấp nhất. Như thế, nếu điều đó có ở pha tĩnh, thì chất tan i sẽ được lưu

giữ lâu trên pha tĩnh và bị rửa giải ra khỏi cột tách là chậm nhất.

Mức độ lưu giữ của chất tan trong một pha là được xác định bởi sự tương tác phân tử của chất

tan i với mỗi pha. Sự tương tác này có: Tương tác phân cực và tương tác không phân cực. Đó là các

tương tác của các phần tử:

- Lưỡng cực với lưỡng cực (tương tác Van dec Waals)

- Lưỡng cực với lưỡng cực cảm ứng,

- Sự liên kết cầu hydro,

- Sự tạo phức chuyển điện tích.

Đó là các tương tác đặc trưng thường thấy ở các phần tử phân cực với nhau hay với các phần tử

không phân cực. Bên cạnh đó còn có sự tương tác không đặc trưng của các phần tử không phân cực

với nhau do tác dụng của các lực phân tán và hấp phụ. Vấn đề này rất phức tạp, đa dạng và nó phụ

thuộc nhiều vào các điều kiện sắc ký. Vì thế những vấn đề trình bày ở đây chỉ là những nhận xét

chung có tính chất định hướng. Còn trong mỗi trường hợp cụ thể của một hệ pha trong các điều kiện

sắc ký đã chọn chúng ta cần xem xét chi tiết riêng biệt cho phù hợp với mỗi loại sắc ký khác nhau.

2.7. Ảnh hưởng của cấu trúc phân tử chất mẫu

Ngoài hai yếu tố quyết định đến kết quả của sự tách là pha tĩnh và pha động, thì cấu trúc của

phân tử chất mẫu là yếu tố thứ ba đóng góp vào việc quyết định kết quả tách sắc ký. Ở đây các

nhóm thế, vị trí của nó trong phân tử chất mẫu ảnh hưởng rõ rệt đến sự tách sắc ký trong một hệ pha

nhất định. Nghĩa là yếu tố này đóng góp vào việc quyết định thời gian lưu tRi của chất phân tích

trong cột sắc ký.

Xem xét một cách tổng quát, chúng ta thấy thời gian lưu tRi của một chất tan phụ thuộc vào các

yếu tố sau:

- Loại cấu trúc phân tử của chất tan,

- Loại nhóm thế, độ lớn và cấu trúc nhóm thế,

- Vị trí nhóm thế trong phân tử chất tan,

- Số nhóm thế trong phân tử chất tan.

Tất nhiên các yếu tố này ảnh hưởng đến kết quả tách như thế nào là còn có quan hệ chặt chẽ với

bản chất của mỗi hệ pha trong những điều kiện thí nghiệm nhất định và tất nhiên cùng một chất tan,

nhưng với hệ pha thường (NP-HPLC) và với hệ pha ngược (RP-HPLC) chúng sẽ xử sự hoàn toàn

khác nhau. Sự khác nhau này là do bản chất của pha tĩnh và pha động quyết định.


Với sắc ký pha thường: Nói chung trong loại này khả năng của chất tan bị lưu giữ trên pha tĩnh

là phụ thuộc rất nhiều vào độ lớn và tính phân cực của phân tử chất tan. Nếu phân tử chất tan có

dạng R-X, trong đó R là gốc hữu cơ, còn X là nhóm thế, thì thời gian bị lưu giữ tRi của chất tan i

trên cột tách theo thứ tự sau đối với nhóm thế X: Nhóm thế alkyl < halogen (F,Cl,Br,I) < ether <

tert-amin < nitril < nitro < ester của axit hữu cơ < aceton < aldehyde < piridim-amine < amid-axit <

alkohol < phenol < axit carboxilic < sunfo axit….. Như vậy chất tan nào có độ phân cực nhỏ nhất

trong hỗn hợp mẫu sẽ được rửa giải ra trước tiên. Chất nào có độ phân cực lớn nhất sẽ được rửa giải

ra sau cùng. Ngược lại trong một dãy đồng đẳng, thì thời gian lưu của chất tan là tăng theo trọng

lượng phân tử của chúng. Nghĩa là các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ được rửa giải ra trước (bảng

2.22).

Mặt khác khi số nhóm chức càng nhiều thì thời gian lưu tRi cũng tăng theo.

Bảng 2.22 Ảnh hưởng của độ lớn nhóm chức đến

thời gian lưu của chất tan

Tên chất Các nhóm thế R1, R2, R3 k’i

R1 R2 R3

1. Nitrazin H C2H7 CH3 0,60

2. Atrazine H C2H7 C2H5 0,80

3. Propazine H C3H7 C3H7 1,14

4. Trietazine C2H5 C2H5 C2H5 1,77

5. Jpazine C2H5 C2H5 C2H5 2,36

Với sắc ký pha ngược: Nói chung ảnh hưởng của phân tử chất tan đến sự tách là ngược lại với pha

thường. Ở đây người ta thấy thời gian lưu tRi của chất tan i là tăng khi độ tan của nó trong nước

giảm. Điều này có nghĩa những chất tan ít phân cực sẽ bị lưu giữ lâu hơn chất tan phân cực. Như

vậy trong hệ pha này, chất tan nào ít phân cực nhất sẽ được rửa giải ra sau cùng của quá trình sắc ký.

Tác dụng của nhóm chức với thời gian lưu trong trường hợp của hệ pha ngược tuân theo thứ tự sau:

Nhóm chức sulfo axit (axit carboxilic) < phenol < alkohol < amid axit < ….. < hydro carbon.

Còn trong một dãy đồng đẳng, với hệ pha ngược thì thời gian lưu tăng theo chiều dài của mạch

carbon của nhóm thế, số nhóm thế. Ví dụ khi tách hỗn hợp của bốn chất như: phenol, (CH3)-phenol,

2(CH3)-phenol và 3(CH3)-phenol ta thấy hệ số dung tích k’i tăng dần theo số nhóm thế CH3 từ một

nhóm đến 3 nhóm trong hệ pha tĩnh RP-18 và pha động là hỗn hợp MeOH và H2O.

Ví dụ với phenol khi có thêm hai nhóm thế (OH) thì thời gian lưu giảm, còn khi thêm 1, 2, và 3

nhóm thế CH3 thì thời gian lưu lại tăng. Cũng tương tự như vậy khi phenol có thêm nhóm thế C2H5

và C3H7.

Trên đây chỉ là một ví dụ, tất nhiên trong thực tế là rất đa dạng, và đối với một hệ pha thì ảnh

hưởng của cấu trúc phân tử chất mẫu và các nhóm thế là rất khác nhau. Với hệ pha thường và với hệ

pha ngược, nói chung ảnh hưởng này là ngược nhau.

2.8. Ảnh hưởng của thể tích mẫu nạp vào cột tách

Nghiên cứu vấn đề này chúng ta thấy rằng, nói chung trong một thể tích mẫu (lượng mẫu) nhất

định nhỏ hơn thể tích giới hạn V0 thì khi lượng mẫu nạp vào cột tăng thì chiều cao của píc sắc ký

cũng tăng theo tuyến tính. Còn khi lượng mẫu nạp vào cột là Vs lớn hơn V0 thì lúc này xẩy ra hiện

tượng là:

- Chiều cao của píc sắc ký không tăng tuyến tính với lượng mẫu,


- Độ rộng của píc sắc ký lại tăng rõ rệt theo lượng mẫu tăng. Do đó ảnh hưởng rõ rệt đến độ

phân giải (sự tách) của hai chất cạnh nhau. Đồng thời lúc này thời gian lưu của chất cũng thay đổi

chút ít. Để làm sáng tỏ vấn đề này chúng ta hãy lấy một ví dụ với lượng mẫu được nạp vào cột sắc

ký lần lượt là V1, V2, V3 và V0 (trong điều kiện V1 = 0,25V0; V2 = 0,5V0; V3 = 0,75V0); tốc độ pha

động F = 1,5 mL/phút. Chất mẫu là phenol trong hệ sắc ký pha ngược. Pha động là MeOH/H2O

trong tỷ lệ 70/30.

Kết quả là khi thể tích mẫu tăng từ V1 đến V0 L thì chiều cao píc sắc ký tăng đều đặn. Nhưng ở

thể tích mẫu V5 = 1,5V0 thì chiều cao píc sắc ký hầu như tăng rất ít mà sự mở rộng của píc là rõ

ràng hơn. Và nếu ta dùng thể tích V6 = 2V0 để nạp vào cột tách thì sự mở rộng píc lại càng rõ rệt

hơn, đặc biệt là sự mở rộng píc về phía sau (đẳng nhiệt loại L1). Thể tích mẫu V0 tương ứng với

lượng mẫu Q0 được gọi là lượng mẫu giới hạn tối đa có thể được nạp vào cột tách. Nhưng trong

thực tế phân tích HPLC người ta thấy rằng không nên nạp lượng mẫu vào cột tách bằng thể tích V0,

mà thường nhỏ hơn để có hiệu quả tách cao nhất. Thông thường là từ 0,5 đến 0,75V0 và thể tích Vs

= 0,5V0 được gọi là thể tích nạp cột tối ưu.

2.9 Rửa giải gradient trong HPLC

Trong thực tế của phân tích sắc ký nhiều khi chúng ta gặp một hỗn hợp mẫu phức tạp chứa

nhiều chất khác nhau, vì thế các chất trong hỗn hợp mẫu không thể tách ra khỏi nhau trong một điều

kiện sắc ký nhất định với thành phần pha động không đổi. Ở đây với thành phần pha động không

đổi thì một số chất trong hỗn hợp mẫu đã được tách ra khỏi nhau, nhưng cũng có một số chất không

tách được, hoặc chưa tách được hoàn toàn khỏi nhau. Điều đó có nghĩa là với các chất đó, thành

phần pha động đã chọn là chưa phù hợp. Vì thế phải thay đổi thành phần pha động cho từng nhóm

chất có trong hỗn hợp mẫu để một nhóm chất hay mỗi chất có được pha động phù hợp nhất. Điều

đó có nghĩa là thực hiện chế độ rửa giải gradient pha động. Quá trình gradient (thay đổi thành phần

pha động khi tách) có thể được thực hiện theo hai kiểu:

- Thay đổi từng bậc cho từng nhóm chất tan.

- Thay đổi liên tục trong suốt quá trình sắc ký.

Nghĩa là ta có chế độ gradient từng bậc và gradient liên tục nồng độ pha động. Như vậy quá

trình tách sắc ký một hỗn hợp chất tan sẽ đạt được kết quả tốt nhất.

Quá trình rửa giải gradient không những tạo điều kiện để tách một hỗn hợp chất, mà trong một

số trường hợp quá trình tách của một số chất trong điều kiện pha động đã chọn lại quá lâu, nghĩa là

chúng được rửa giải ra quá chậm. Trong trường hợp này chúng ta phải gradient pha động để cho các

chất này ra nhanh hơn. Lúc này chúng ta rút ngắn được thời gian sắc ký và tiết kiệm được pha động.

Việc rửa giải gradient có thể được thực hiện theo thành phần (nồng độ) của các chất tạo thành

pha động hay theo pH của pha động tuỳ thuộc yếu tố nào có tác động hữu hiệu đối với sự tách của

một hỗn hợp hay một nhóm chất trong hỗn hợp mẫu. Nghĩa là yếu tố nào làm tốt được quá trình

tách sắc ký của hỗn hợp mẫu thì được chọn để gradient.

Ngoài việc làm tốt quá trình sắc ký, trong nhiều trường hợp việc gradient pha động còn góp

phần làm tăng độ nhạy một số chất. Đặc biệt là các chất ra chậm, khi ta gradient pha động cho

chúng ra nhanh thường làm tăng chiều cao píc sắc ký. Điều đó có nghĩa ta đã tăng được độ nhạy.

2.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong nhiều trường hợp nhiệt độ cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến kết quả tách sắc ký của một

hỗn hợp chất mẫu. Nói chung khi tăng nhiệt độ trong một phạm vi nhất định thường làm tốt hơn kết

quả tách sắc ký của một hỗn hợp chất trong những điều kiện đã chọn.

Tác dụng của nhiệt độ ở đây có thể thông qua các yếu tố sau đây để gây ảnh hưởng đến kết quả

tách sắc ký

- Làm thay đổi (làm giảm) độ nhớt pha động có lợi cho hiệu lực cột tách.


- Khi nhiệt độ tăng sẽ làm thay đổi khả năng hấp phụ của pha tĩnh đối với chất tan, nghĩa là

làm thay đổi sự lưu giữ của chất tan.

- Khi nhiệt độ tăng thường làm tăng độ tan của các chất tan trong pha động. Do đó làm thay

đổi các cân bằng trong cột tách, ảnh hưởng đến độ chọn lọc của hệ pha.

- Các yếu tố trên dẫn đến làm thay đổi hệ số dung tích của mỗi chất tan có trong hỗn hợp mẫu,

để cuối cùng làm thay đổi hiệu quả tách sắc ký ứng với mỗi nhiệt độ khác nhau. Qua nhiều thực

nghiệm người ta thấy rằng khi tăng nhiệt độ cột tách lên 300C thì hệ số dung tích k’i của chất tan

thường giảm đi từ 1,5 đến 2 lần.

Nhưng cần lưu ý rằng trong thực tế không phải bất kỳ trường hợp nào khi tăng nhiệt độ ta cũng

có thể có kết quả tách tốt hơn. Bởi vì nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự tồn tại và độ bền của hệ pha,

pha tĩnh và pha động. Đồng thời cũng ảnh hưởng đến cả sự tồn tại của chính bản thân các chất tan

trong hỗn hợp mẫu. Vì thế khi muốn tăng nhiệt độ của quá trình sắc ký cần xem xét cẩn thận theo

từng trường hợp cụ thể, để chọn được nhiệt độ tách phù hợp cao hơn nhiệt độ phòng. Nếu không

chúng ta sẽ làm mất chất mẫu, hay một thành phần pha động bị phân huỷ hay bay hơi làm sai kết

quả sắc ký.

2.11. Độ chọn lọc của hệ pha trong HPLC

Trong kỹ thuật HPLC, độ chọn lọc của một hệ pha phụ thuộc vào 3 yếu tố chính:

1. Bản chất của pha tĩnh

2. Bản chất của pha động và thành phần của nó.

3. Bản chất và cấu trúc của phân tử chất mẫu

Ba yếu tố chính này quyết định hệ số dung tích k’i của chất tan và k’i là một tham số đặc trưng

cho độ chọn lọc của hệ pha. Nghĩa là nếu với một pha tĩnh cố định, thì khi thay đổi thành phần pha

động sẽ làm thay đổi độ chọn lọc của hệ pha. Ví dụ khi tách hỗn hợp hai chất acetoxynaphthalen và

1,5-dinitro-naphthalene dùng pha động là n-pentan (dung môi A), có thêm dung môi B vào A để tạo

ra pha động có thành phần như trong bảng 2.23 và giữ sao cho E = const thì hệ số chọn lọc của hệ

pha đã chỉ ra có hệ số k’1 và k’2 là được chỉ ra trong bảng 2.23 sau đây:

Bảng 2.23 Hệ số chọn lọc của một vài chất tan

trong những thành phần pha động khác nhau

No Dung môi B thêm vào k’1 k’2 r2/1

1 50% benzen 5,10 2,50 2,04

2 25% diethylethe 2,50 2,90 1,10

3 23% dichlometan 5,50 5,80 1,05

4 4% ethyl-acetat 2,90 5,40 1,86

5 0,05% DMSO 1,00 3,50 3,50

DMSO: dimethyl sulfoxide

Từ ví dụ trên cho ta thấy, bản chất và thành phần pha động ảnh hưởng rất rõ rệt đến độ chọn lọc

của hệ pha và cũng chính nhờ tính chất này người ta có thể tìm được thành phần pha động phù hợp

nhất cho một hỗn hợp mẫu để có kết quả tách sắc ký tốt nhất. Như ví dụ trên, pha động No-5 là cho

hệ số chọn lọc cao nhất, sau đó là hệ pha động No-1, No-4, còn pha động No-2 và No-3 thì không

có sự tách của hai chất đã nêu.

Cũng như trong ví dụ trên nhưng chúng ta thay dung môi B bằng các chất khác thì chúng ta lại

thu được kết quả như trong bảng 2.24 sau đây:

Bảng 2.24 Ảnh hưởng của thành phần pha động

No Dung môi B thêm vào k’1 k’2 r2/1

1 5% ethyl ether 6,50 4,00 1,60


2 5% triethylamin 4,40 2,00 2,20

3 23% CH2Cl2 2,20 2,30 1,05

4 15% CH2Cl-CH2Cl 3,20 2,90 1,10

5 30% CHCl3 2,00 2,60 1,30

Trong ví dụ này pha động N1 và N2 có tác dụng lớn nhất đến độ chọn lọc của hệ pha. Chính vì

trong hai trường hợp này dung môi thêm vào có tương tác cầu hydro giữa chất mẫu và pha động gây

nên sự thay đổi lớn thời gian lưu giữ của chất tan.

Từ hai ví dụ trên cho ta thấy, khi muốn tách sắc ký một hỗn hợp chất mẫu nhất định, sau khi đã

chọn được pha tĩnh rồi, thì việc nghiên cứu chọn một thành phần pha động phù hợp là một việc hết

sức cần thiết. Vì qua đó chúng ta sẽ có được một hệ pha có độ chọn lọc tốt nhất với hỗn hợp mẫu

phân tích của chúng ta. Như vậy có nghĩa là khi ta thêm dung môi B vào dung môi A ta đã tạo ra

được một pha động có lực rửa giải và độ phân cực phù hợp để tách các chất mẫu.

Ví dụ nếu có dung môi không phân cực A hay ít phân cực (P<1) ta thêm dung môi phân cực B

vào A và được pha động AB sẽ phân cực hơn dung môi A nhưng lại kém dung môi B. Nghĩa là độ

phân cực của pha động AB nằm giữa độ phân cực của dung môi A và dung môi B; Đồng thời lực

rửa giải EAB của pha động AB cũng có tính chất như thế. Lúc này độ phân cực của pha động AB

được tính gần đúng theo công thức sau:

)..( BBAAAB PPP (2.57)

Trong đó A, B là thể tích riêng của dung môi A và B có trong pha động AB; PA và PB là độ

phân cực của dung môi A và B.

Bây giờ nếu ta thay đổi dung môi B thành dung môi C thì ta được pha động AC, và giữ nguyên lực

rửa giải như pha động AB thì thể tích riêng phần của dung môi C trong pha động AC sẽ được tính theo

công thức:

C

BBC

P

P. (2.58)

Ví dụ nếu A là hexan, B là CHCl3 pha động AB có thành phần là 25% B, khi thay B bằng C là

ethylether và giữ nguyên lực rửa giải EAB thì thể tích C trong pha động AC là

C = 0,25.(4,4/2,9) = 38%

Ở đây PB = 4,4 và PC = 2,9

Như vậy nghĩa là trong hệ AB thì B bằng 25%, còn trong hệ AC thì C bằng 38% thì ta có cùng

lực rửa giải EAB = EAC

Công thức tính C cho ta tính được những thành phần của các pha động có thành phần khác

nhau, nhưng có cùng một giá trị lực rửa giải E, nhưng phải trong điều kiện hệ số dung tích k’i thoả

mãn điều kiện

1 k’i 5

2.12. Sự tách trên nhiều cột kế tiếp

Trong một số trường hợp, hỗn hợp mẫu chứa nhiều chất tan có độ phân cực và tính chất rất khác

nhau, nó gồm hai hay ba nhóm chất khác nhau. Vì thế trong một hệ pha nhất định, các chất không

thể được tách ra khỏi nhau hoàn toàn. Lúc này có nhóm gồm một số chất tan đã được tách tốt,

nhưng một số chất khác vẫn còn bị lưu giữ trên cột hoặc rửa giải ra tạo thành một cụm sắc đồ không

có sự tách. Khi gặp những trường hợp này, chúng ta phải sử dụng kỹ thuật tách với hai hay 3 cột

tách kế tiếp. Lúc này mỗi nhóm chất tan sẽ được tách trong một hệ pha động riêng phù hợp với nó

và như vậy toàn bộ các chất trong hỗn hợp mẫu sẽ được tách tốt sau quá trình sắc ký trên nhiều cột

kế tiếp nhau đồng thời. Lấy một ví dụ trong trên cột A, các chất từ số 1 đến số 4 là không được tách

ra khỏi nhau, còn các chất từ số 5 đến số 8 lại được tách tốt rồi. Do đó nếu ta đưa toàn bộ phần đầu


từ chất số 1 đến số 4 sang cột B, sau đó rửa giải các chất này bằng một pha động khác phù hợp thì

chúng lại được tách tốt. Đó chính là ưu việt và ý nghĩa của quá trình sắc ký nhiều cột kế tiếp.

Nhưng trong thực tế người ta cũng chỉ dùng hai cột. Bởi vì nếu dùng nhiều cột hơn nữa thì việc bố

trí các van chuyển đổi pha động là khó điều khiển. Hơn nữa việc dùng hai cột tách kế tiếp chỉ khi

với một cột mà ta đã sử dụng tất cả các điều kiện có thể thay đổi được như thành phần pha động,

gradient pha động, thay đổi nhiệt độ mà không đạt được kết quả tốt, lúc này chúng ta mới chọn kỹ

thuật hai cột tách kế tiếp nhau cho một hỗn hợp mẫu.

2.13. Tối ưu hoá các điều kiện trong HPLC

Trong kỹ thuật HPLC, muốn có được kết quả tách tốt nhất chúng ta phải tìm điều kiện sắc ký tốt

nhất cho một hỗn hợp mẫu. Đó là quá trình tối ưu hoá các điều kiện sắc ký. Các điều kiện đó có

1. Pha tĩnh

2. Pha động

3. Các trang bị đo và phát hiện

4. Các yếu tố khác

Trong bốn loại yếu tố trên, loại thứ 3 là các yếu tố thuộc về hệ thống trang bị của kỹ thuật

HPLC. Nó gồm có van bơm mẫu và vòng chứa mẫu, hệ thống ống dẫn, detector và các thông số của

nó. Ví dụ nếu dùng detector hấp thụ phân tử UV-VIS thì các thông số đó là: khe vào, khe ra của

chùm sáng, độ nhạy của băng hấp thụ, flowcell, bước sóng hấp thụ của chất phân tích. Nếu là

detector huỳnh quang chú ý chọn đúng sóng kích thích và sóng phát xạ huỳnh quang để đo,… Tất

cả những yếu tố trên nếu chúng ta khảo sát và chọn phù hợp nhất cho chất mẫu thì có nghĩa đã tiêu

chuẩn hoá loại yếu tố thứ 3. Tất nhiên chúng ta không thể có điều kiện tối ưu cho một hỗn hợp mẫu

nhiều chất. Mà đó là những điều kiện dung hoà phù hợp nhất cho tất cả các chất để có được kết quả

tách sắc ký khả quan nhất. Nhưng ở đây cần được quan tâm nhất là lựa chọn loại detector nào để

phát hiện và định lượng được các chất với hiệu quả tốt.

Sau khi chọn được các điều kiện trên rồi, thì còn lại là các yếu tố của pha tĩnh và pha động liên

quan và quyết định đến hiệu quả sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Những yếu tố này cũng đã được

đề cập đến trong phần nói về pha tĩnh và pha động ở các mục trên. Vì thế ở đây chỉ được nhắc lại

một cách tóm tắt mà thôi.

Pha tĩnh: Pha tĩnh là các chất để nhồi cột sắc ký và nó là một yếu tố quyết định hiệu quả tách của

một hỗn hợp chất mẫu. Tuỳ theo bản chất của hỗn hợp chất mẫu mà pha tĩnh có thể là loại hấp phụ

pha thường (NP-HPLC), hấp phụ pha ngược (RP-HPLC), trao đổi ion (IE-HPLC) sao cho để đạt

được hiệu quả tách tốt nhất. Hiệu quả tách này được thể hiện qua độ phân giải Rij của hai chất i và j

bên cạnh nhau theo pha tĩnh đã chọn. Độ phân giải Rij của hai chất này được tính theo công thức sau

đây:

2/1'

.'1

).1(

ii

ijiij

H

L

k

krR (2.59)

Trong đó Rij là hệ số chọn lọc (k’j/k’i); L là chiều dài cột tách; còn Hi là chiều cao đĩa lý thuyết

của chất i.

Phương trình trên cho ta thấy, độ phân giải của hai chất i và j là Rij phụ thuộc vào các thông số

của hệ pha là k’i, k’j và Hi. Theo công thức trên nếu cột tách có chiều dài L bằng 25cm thì công

việc ở đây là phải chọn chất nhồi có kích thước thế nào để hai chất i và j tách được hoàn toàn khỏi

nhau. Nghĩa là sau khi chọn được loại chất nhồi rồi, chúng ta chọn cỡ hạt (dp) của nó là bao nhiêu

cho phù hợp để cột tách có đủ số đĩa lý thuyết cần thiết, tức là thông số Hi để có được hiệu quả tách

tốt của hai chất i và j. Yếu tố thứ hai có thể thay đổi được ở đây là hệ số chọn lọc rij, tức là k’i và k’j.

Việc thay đổi hai tham số này có thể đạt được hiệu quả thông qua việc thay đổi thành phần dung

môi trong pha động và nhiệt độ cột tách.


Pha động: Yếu tố thứ hai quyết định hiệu quả tách trong kỹ thuật HPLC là bản chất của các chất tạo

thành pha động và thành phần của chúng. Đây là một yếu tố hết sức linh động và dễ dàng thay đổi.

Việc này có thể làm được nhờ trộn các dung môi khác nhau với các thành phần khác nhau ta sẽ

được một pha động tốt cho một hỗn hợp chất mẫu với một pha tĩnh đã được chọn. Các pha động đã

nêu trong bảng 2.10 và 2.11 là những ví dụ về việc nghiên cứu chọn pha động. Ví dụ pha động N

trong bảng 2.11 cho hiệu quả tách tốt nhất hai chất đã nêu; Vì rij bằng 2,20; còn pha động N3 cho

kết quả tách tồi nhất (rij bằng 1,05). Đó và các ví dụ về sự tách trên pha tĩnh phân cực (silica trần).

Ngược lại nếu chúng ta chọn pha tĩnh là silica đã được alkyl hoá nhóm mạch các bon C8, C18 như

RP-8, RP-18, Hpersil-ODS thì dung môi chính của pha động là acetonitril hay methanol, còn thành

phần B hay C thêm vào thường là nước cất, hay các dung môi hữu cơ phân cực khác nhau. Lấy ví

dụ khi dùng pha tĩnh là Hypersil-ODS 5m, pha động gồm methanol và nước, hai chất phenol và

nitrophenol. Nếu pha động chỉ gồm methanol hay là methanol có thêm 10% nước thì hai chất không

được tách. Nhưng nếu dùng pha động là methanol có thêm 30-35% nước thì hai chất lại được tách

hoàn toàn. Ở đây chính việc thay đổi thành phần pha động đã làm thay đổi rõ rệt hệ số dung tích k’i

của các chất, đưa đến làm độ chọn lọc rij tăng.

Nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm thấy rằng, khi thay đổi thành phần pha động chúng ta có

thể thay đổi được hệ số dung tích k’i của chất từ 2 đến 10 đơn vị mà vẫn có thể giữ nguyên được lực

rửa giải của pha động hoặc là có thay đổi không đáng kể. Vì thế người ta nói, pha động là một yếu

tố linh động và rất vạn năng của kỹ thuật tách HPLC. Vì ngoài việc thay đổi thành phần các dung

môi hữu cơ tạo ra pha động chúng ta còn điều chỉnh pH của pha động, thêm vào pha động các chất

tạo phức, chất hoạt động bề mặt, chất làm chậm,… trong nhiều trường hợp, những yếu tố này có

ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách của một hỗn hợp mẫu. Ví dụ với sắc ký trao đổi ion, thì pH và

chất tạo phức có ý nghĩa rất lớn.

Ngoài các yếu tố trên, một yếu tố khác có ảnh hưởng đến kết quả tách là nhiệt độ. Trong một số

trường hợp, khi tăng nhiệt độ sẽ làm cho hiệu quả tách tốt hơn. Tất nhiên việc tăng nhiệt độ cột tách

cũng có giới hạn. Thông thường cao nhất cũng chỉ đến 800C. Vì nhiệt độ cao hơn có ảnh hưởng đến

độ bền của pha tĩnh cũng như pha động.

Nói tóm lại tối ưu hoá các điều kiện trong kỹ thuật HPLC để tách một hỗn hợp chất mẫu nhất

định là phải giải quyết được những công việc như sau:

1. Chọn pha tĩnh:

- Loại pha tĩnh

- Cỡ hạt của chúng

2. Pha động:

- Dung môi chính

- Các dung môi khác thêm vào, chất phụ khác….

- Thành phần của chúng

- pH của pha động

- Tốc độ của pha động

3. Hệ thống trang bị để thực hiện sắc ký:

- Loại detector và các thông số của nó

- Van bơm mẫu, vòng định cỡ mẫu

- Hệ đường dẫn

4. Các yếu tố khác. Ở đây chủ yếu là nhiệt độ.

Dưới đây chúng ta sẽ tìm hiểu thông tin về việc phát triển và phê chuẩn một phương pháp sắc

ký lỏng hiệu quả cao sử dụng detector UV-VIS làm bộ phát hiện. Đây là detector phổ biến nhất

trong hầu như mọi phòng thí nghiệm HPLC. Các cấu hình khác về cơ bản cũng có đầy đủ các thông

số cần được tối ưu và phê chuẩn như với cấu hình này. Cái khác nằm ở phương pháp xử lý tín hiệu

và mức tiêu chuẩn áp dụng với chúng.

Có được kiến thức về lỗi có thể có do thiết bị tạo ra, nhờ vào việc quản lý mẫu và nhờ vào bản

thân mẫu cho phép phát triển các phương pháp phân tích và giảm thiểu các hiệu ứng của chúng lên


kết quả. Trong mục này chúng ta xem xét lại tiêu chuẩn định nghĩa một phương pháp tốt và các

chiến lược dùng để tìm kiếm các thông số phương pháp tối ưu.

2.13.1 Phát triển phương pháp

Do hầu hết các ứng dụng UV-Vis là những phép phân tích định lượng đơn thành phần, mục này

tập trung chủ yếu vào việc tối ưu những phương pháp như vậy. Điều này cũng là phù hợp với trạng

thái gần như là phổ biến trong các phòng thí nghiệm sắc ký lỏng (cả sắc ký lỏng hiệu quả cao HPLC

và sắc ký lỏng hiệu quả siêu cao UPLC) đều có trang bị tối thiểu một detector UV-Vis. Việc phát

triển phương pháp bao gồm lựa chọn bước sóng hoặc những bước sóng mang lại kết quả tốt nhất

đối với một phép phân tích cụ thể trên một thiết bị cụ thể. Ở đây khái niệm tốt nhất được định nghĩa

theo các thông số như độ đúng, độ chính xác, độ nhạy, độ tuyến tính, dải động học, độ chọn lọc và

ruggedness. Do tất cả những thông số này không thể được tối ưu tại cùng thời điểm, thông số hoặc

các thông số tối ưu phải được xác định và các yêu cầu được xác lập trước khi phân tích. Cho đến

thời gian gần đây trang thiết bị bị hạn chế về khả năng chọn bước sóng (chủ yếu liên quan đến các

vấn đề về độ lặp lại bước sóng) và hoặc về những công cụ phù hợp dùng để so sánh các chọn lựa đã

không còn tồn tại. Trên các thiết bị hiện đại những hạn chế này đã được loại trừ.

LƯU Ý: Phát triển phương pháp bao gồm việc sử dụng một số các công cụ thống kê khác nhau.

Thảo luận sâu hơn về việc những công cụ này tính toán như thế nào và về những lợi thế cũng như

những bất lợi liên quan đến chúng nằm ngoài mục đích trình bày trong phần này.

Độ tuyến tính

Độ tuyến tính là khả năng của một phương pháp tạo ra những kết quả tốt nhất tỷ lệ hoặc là trực

tiếp, hoặc nhờ chuyển đổi toán học một cách chi tiết với nồng độ của chất phân tích trong mẫu

trong một phạm vi dải nồng độ cụ thể.

Đối với các thiết bị UV-Vis, thường tương quan tuyến tính là định luật Beer, những trạng thái

nào mà độ hấp thụ của một chất tan tỷ lệ trực tiếp với nồng độ của nó. Đường chuẩn tuyến tính mô

tả mối liên quan giữa độ hấp thụ và nồng độ có dạng:

A = kc

Trong đó A là độ hấp thụ, c là nồng độ và k là hệ số chuẩn (hệ số góc của đường chuẩn). Phép

kiểm tra độ tuyến tính nằm trong số các phép kiểm tra hiệu ứng mô hình lý thuyết (định luật Beer)

của chúng ta ăn khớp tốt đến mức độ nào với các phép đo thực tế.

Về mặt lý thuyết, chỉ cần đến một phép đo độ hấp thụ của duy nhất một chuẩn đã biết nồng độ

để tạo ra chuẩn phục vụ định lượng. Giá trị độ hấp thụ đo được được chia cho nồng độ tạo ra hệ số

góc. Một số các thông số thiết bị và thông số mẫu có thể lệch khỏi định luật Beer. Có thể dẫn đến

đáng kể lỗi trong định lượng nếu đường chuẩn không được đặc trưng hoá một cách chính xác. Tuy

nhiên do độ lệch này phụ thuộc vào bước sóng nên việc lựa chọn bước sóng phù hợp có thể giảm

thiểu tác động này lên kết quả.

Để xây dựng đường chuẩn, phải đo được các phổ đồ của một tệp tối thiểu 3 dung dịch chuẩn.

Nồng độ của các dung dịch chuẩn phải bao được dải nồng độ mẫu phân tích mong đợi. Lý tưởng thì

tất cả các giá trị chuẩn đo được sẽ nằm trên một đường thẳng, nhưng trong thực tế cho thấy các giá

trị luôn luôn có một sự phân tán nhất định. Cần áp dụng phương pháp thống kê để tìm kiếm sự ăn

khớp tốt nhất của đường chuẩn với dữ liệu và trong bước thứ hai là để xác định kiểu đường chuẩn

mang lại sự ăn khớp tốt nhất đó. Phương pháp thống kê thường được sử dụng là tương quan tuyến

tính, nó còn được biết dưới tên là phương pháp bình phương tối thiểu.

Để so sánh hai đường chuẩn, yêu cầu thực hiện phép đo tính goodness của sự ăn khớp các

chuẩn. Một vài giá trị thống kê, bao gồm hệ số tương quan, lỗi chuẩn của sự hồi quy và độ không

chắc chắn có thể được sử dụng để đạt được phép đo này. Trong số đó, hệ số tương quan được sử

dụng phổ biến nhất. Giá trị này luôn luôn nằm giữa +1 và -1. Giá trị +1 chỉ thị cho sự tương quan

tuyến tính đầy đủ nhất giữa độ hấp thụ và nồng độ, với A gia tăng. Giá trị -1 cũng chỉ ra một tương

quan tuyến tính đầy đủ nhưng là với A giảm (sự giảm A này có thể xuất hiện nếu như sử dụng dữ


liệu đạo hàm). Giá trị bằng không cho thấy không có một sự tương quan nào giữa độ hấp thụ và

nồng độ.

Để xác định bước sóng tốt nhất hoặc sự kết hợp tốt nhất các bước sóng, các phổ đồ của tệp các

chuẩn tinh khiết với dải rộng nồng độ được đo. Một đường chuẩn tuyến tính được áp dụng cho từng

bước sóng và giá trị thống kê chọn lựa để ấn định độ tuyến tính được tính toán. Để việc đánh giá

được nhanh nhất, đồ thị đồ hoạ giá trị thống kê tuyến tính theo bước sóng sẽ là phương pháp rất có

ích.

Nếu một bước sóng độc lập không tạo ra được mức độ tuyến tính yêu cầu, việc kết hợp các

bước sóng có thể được áp dụng. Lấy ví dụ, sử dụng một bước sóng tham chiếu nội tại để loại bỏ lỗi

trôi đường nền trong các phép đo sẽ cải thiện được các kết quả.

Nếu không thể đạt được một mức độ tuyến tính mong muốn với một đường chuẩn tuyến tính

đơn giản, có thể áp dụng kiểu đường chuẩn khác để giảm thiểu tác động của tính không lý tưởng lên

các kết quả. Điển hình thì các hàm có dạng dưới đây :

A = a + kc (2.60)

A = kc + k’c2 và A = a + kc + k’c2 (2.61)

được sử dụng. Giống như trên, hệ số tương quan hoặc công cụ thống kê khác được sử dụng để ấn

định chất lượng tương đối của đường chuẩn. Lưu ý khi những kiểu đường chuẩn với mức độ tự do

cao hơn được sử dụng, đòi hỏi dùng nhiều chuẩn hơn cốt cho việc mô tả đặc trưng đường cong trở

nên hợp thức.

Đối với các phép phân tích đa thành phần, định luật Beer cũng được thừa nhận. Tuy nhiên ở đây

mô hình tính toán có cả định luật cộng đại số để giải thích tổng độ hấp thụ tại mỗi bước sóng. Phép

kiểm tra tuyến tính đơn giản mô tả ở trên không được áp dụng. Thay vào đó độ lệch chuẩn của phần

dư có thể được dùng để kiểm tra tệp chuẩn của chúng ta ăn khớp tốt đến mức nào với phổ đồ đo

được. Giá trị này là tổng các bình phương sai khác tại từng bước sóng giữa phổ đo được và phổ tính

toán được. Nó có thể được thừa nhận nếu phần dư bằng 0 - điều đó có thể xảy ra nếu như các chuẩn

ăn khớp hoàn toàn với phổ đo được. Nếu như độ lệch chuẩn của phần dư không bằng không, mô

hình lý thuyết không phản ảnh được hệ thống nghiên cứu do một trong các định luật không được

tuân thủ hoặc do sự có mặt thêm một thành phần mà thành phần này không có hoặc chưa được

chuẩn (calibration standard). Tuy nhiên trong thực tế, phần dư không bao giờ là zero và giá trị có

thể chấp nhận được đối với một phép phân tích phải được xác định bằng kinh nghiệm cùng với việc

sử dụng các kết quả phân tích đáp ứng các yêu cầu về độ đúng và độ chính xác.

Độ đúng

Độ đúng của một phương pháp là mức độ đồng thuận giữa một kết quả kiểm tra độc lập được tạo

ra bởi phương pháp và giá trị đúng

Để xác định bước sóng hoặc những bước sóng tạo ra độ đúng tốt nhất, các phổ đồ của một tệp

các chuẩn được đo và đường chuẩn được xây dựng tại tất cả các bước sóng như đã được mô tả ở

trên. Sau đó yêu cầu có một mẫu chuẩn biết trước nồng độ. Lý tưởng mẫu này là mẫu có nồng độ

chất phân tích từng được xác định sử dụng một kỹ thuật khác. Tuy nhiên nếu không có được một

mẫu như vậy, chuẩn bị một mẫu tổng hợp có trọng lượng mẫu biết trước. Phổ đồ của mẫu được đo,

phép định lượng được thực hiện tại tất cả các bước sóng trên dải sóng đã đo. Sau đó các kết quả

định lượng tại từng bước sóng được so sánh với giá trị đã biết. Đồ thị đồ hoạ các kết quả định lượng

theo bước sóng sẽ cho phép việc đánh giá được thực hiện nhanh chóng.

Do ồn có thể làm xê dịch độ đúng của bất kỳ phép đo độc lập nào, tốt hơn là nên thực hiện một

loạt các phép đo trên mẫu và sau đó tính toán giá trị trung bình. Phương pháp này giảm được sự

đóng góp của ồn lên lỗi độ đúng.

Tuy nhiên trong phép phân tích đa thành phần với dải các phổ đồ, không thể có được dải bước

sóng tối ưu với một kỹ thuật đơn giản như vậy. Thay vào đó dải tốt nhất phải được xác định thông


qua sự biến đổi thử và sai (trial-and-error) của dải sóng và thông qua việc so sánh các kết quả tính

được với các giá trị thực tế.

Độ chính xác

Độ chính xác của một phương pháp là mức độ đồng thuận giữa các kết quả kiểm tra độc lập khi

quy trình được áp dụng một cách lặp đi lặp lại với nhiều lần lấy mẫu.

Yêu cầu có một giá trị thống kê để xác định độ chính xác, phần trăm độ lệch chuẩn tương đối

(thu được nhờ chia giá trị độ lệch chuẩn cho giá trị trung bình và nhân với 100) và khoảng tin cậy là

công cụ phổ biến nhất để ấn định độ chính xác hoặc độ lặp lại của tệp các giá trị.

Để xác định độ chính xác của một phương pháp, điển hình đòi hỏi chuẩn bị một tệp 10-20 mẫu

cùng nồng độ. Sau đó những mẫu này được đo, và lượng chất phân tích được tính toán. Độ lệch

chuẩn của các kết quả là phép đo độ chính xác.

Nếu không đạt được mức mong đợi về độ chính xác, các kỹ thuật giảm ồn như lấy trung bình

theo bước sóng, lấy trung bình theo thời gian và tham chiếu nội tại cần phải được sử dụng để cải

thiện các giá trị. Những kỹ thuật như vậy có thể được áp dụng trong phép phân tích đa thành phần.

Độ nhạy

Độ nhạy được xem là giá trị phản hồi thu được đối với một lượng chất phân tích cụ thể và thường

được biểu thị theo hai yếu tố phân tích: giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

LOD là nồng độ chất phân tích thấp nhất có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết được

định lượng trong nền mẫu. Nhìn chung LOD là điểm mà tại đó tín hiệu từ chất phân tích bằng 3 lần

ồn trong phép đo. Từ các kết quả đo một số thiết bị phổ đưa ra độ lệch chuẩn dựa trên ồn trong phép

đo. LOD xấp xỷ 3 lần độ lệch chuẩn.

LOQ là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể được xác định với độ chính xác và độ đúng

chấp nhận được trong sự có mặt của nền mẫu. Để tính toán LOQ, các giới hạn chấp nhận đối với độ

chính xác và độ đúng (phụ thuộc vào mục tiêu phân tích) phải được ấn định. Các công cụ mô tả ở

trên có thể được sử dụng để xác định giới hạn chấp nhận.

Thường thì bước sóng với cực đại hấp thụ được thừa nhận mang lại độ nhạy tốt nhất. Tuy nhiên

do ồn thiết bị có thể có sự thay đổi đáng kể với bước sóng, nên cực đại hấp thụ không nhất thiết

phải áp dụng. Có một hướng tốt hơn để xác định bước sóng hoặc các bước sóng mang lại độ nhạy

tối ưu là đo phổ của một mẫu nồng độ thấp vài lần. Sau đó giá trị trung bình và phần trăm độ lệch

chuẩn của các giá trị đo được tại từng bước sóng được tính toán. Bước sóng với phần trăm độ lệch

chuẩn tương đối thấp nhất có thể mang lại độ nhạy tốt nhất.

Đối với một phép phân tích đa thành phần, kỹ thuật này có thể được sử dụng để nhận diện bước

sóng hoặc các bước sóng tối ưu cho mỗi thành phần. Những bước sóng này có thể được áp dụng

trực tiếp trong các hàm mô phỏng đơn giản hoặc đóng vai trò như dải sóng tối ưu trong phương

pháp bình phương tối thiểu.

Dải động học

Dải động học là khoảng cách giữa (và những gì ở giữa) mức trên và mức dưới của chất phân tích,

được tính toán với độ chính xác, độ đúng và độ tuyến tính yêu cầu.

Trước tiên dải được xác định nhờ phân tích các mẫu có nồng độ chất phân tích thay đổi và sau

đó sử dụng các công cụ mô tả ở trên để tính toán độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng của các kết

quả.

Độ chọn lọc


Độ chọn lọc là khả năng của một phương pháp định lượng một cách chính xác và đặc trưng chất

phân tích hoặc các chất phân tích trong sự có mặt của các chất khác.

Sự có mặt của bất kỳ hợp chất nào khác hấp thụ tại bước sóng được dùng để định lượng chất

phân tích sẽ dẫn đến lỗi định lượng. Các hợp chất khác này có thể là các tiền chất tổng hợp, các tạp

chất đã biết, các tá dược hoặc các sản phẩm phân huỷ trong nền mẫu. Nếu đã biết về kiểu chất ảnh

hưởng, người phát triển phương pháp có thể khảo sát phổ đồ của của chất phân tích và chất ảnh

hưởng để lựa chọn một bước sóng mà tại đó chất phân tích có một độ hấp thụ đáng kể nhưng chất

gây ảnh hưởng có ít độ hấp thụ. Nếu như việc chọn lựa bước sóng không triệt thoái được một cách

thoả đáng hiệu ứng của chất ảnh hưởng, một kỹ thuật hiệu chỉnh phù hợp ví dụ như việc sử dụng

một bước sóng đẳng hấp thụ có thể được áp dụng.

Nếu như diện mạo và/hoặc các phổ đồ có thể có các chất ảnh hưởng chưa biết rõ, gần như là

hướng kinh nghiệm nhận diện đã được mô tả ở trên có thể được sử dụng để xác định bước sóng

hoặc những bước sóng mang lại độ đúng tốt nhất. Trong trường hợp này, mẫu kiểm tra phải chứa

chất ảnh hưởng. Nếu đã biết nồng độ của chất phân tích trong mẫu. Bước sóng mang lại kết quả gần

với giá trị đã biết nhất sẽ tạo ra độ chọn lọc tốt nhất. Nếu chưa biết nồng độ chất phân tích. Bước

sóng tạo ra nồng độ thấp nhất thường mang lại độ chọn lọc tốt nhất (các tạp chất luôn luôn cộng

thêm độ hấp thụ, tạo ra kết quả cao sai).

Ruggedness

Ruggedness là mức độ lặp lại của các kết quả kiểm tra thu được nhờ phân tích cùng mẫu dưới một

sự đa dạng các điều kiện kiểm tra thông thường.

Phương pháp phải không bị tác động bởi những thay đổi về thời gian hoặc vị trí. Độ lặp lại của

phương pháp phải được thiết lập dưới những điều kiện khác nhau, lấy ví dụ với các lô thuốc thử với

nhau, tại những nhiệt độ thí nghiệm khác nhau và tại những thời điểm thí nghiệm trôi qua khác

nhau

Ruggedness của một phương pháp phân tích được xác định nhờ phân tích các phần mẫu của một

mẫu đồng thể trong các phòng thí nghiệm khác nhau và trên các thiết bị khác nhau. Các phép kiểm

tra này phải được thực hiện bởi những nhà phân tích khác nhau dưới các điều kiện vận hành và điều

kiện môi trường có sự thay đổi nhưng vẫn rơi vào phạm vi các thông số đặc trưng đối với phương

pháp. Sau đó mức độ lặp lại của các kết quả được tính toán như một hàm của các biến số thí nghiệm.

Giá trị này có thể được so sánh với độ chính xác của phương pháp dưới các điều kiện bình thường

để đạt được phép đo Ruggedness của nó.

Các yêu cầu đối với trang thiết bị

Trong phát triển một phương pháp phân tích, tất cả các dữ liệu phổ đều có giá trị, để đánh giá tất

cả những chọn lựa có thể có. Độ lặp lại bước sóng của thiết bị cũng phải là tuyệt vời cốt để không

hạn chế khả năng chọn lựa bước sóng hoặc các bước sóng. Một thiết bị phổ đo tự động nhiều phổ

và tính toán các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn cho từng giá trị độ hấp thụ có thể cải thiện mạnh

mẽ hiệu suất. Cuối cùng thì phần mềm trang bị phải có khả năng xử lý một lượng lớn dữ liệu và có

khả năng sử dụng các công cụ thống kê phù hợp.

Việc tính toán bằng tay hoặc chuyển đổi dữ liệu từ thiết bị phổ sang các ứng dụng khác để đánh

giá làm hạn chế nghiêm trọng hiệu suất.

2.13.2 Phê chuẩn phương pháp

Bất kỳ phương pháp phân tích nào được thiết kế để sử dụng trong một môi trường pháp lý, ví dụ

như trong phòng thí nghiệm kiểm soát chất lượng dược phẩm phải được phê chuẩn. Việc phê chuẩn

phương pháp là việc xử lý để xác định xem các đặc trưng hiệu quả của phương pháp có phù hợp với

mục tiêu đặt ra hay không.


Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia – USP) có các hướng dẫn chỉ đạo cụ thể để

phê chuẩn phương pháp. Việc phê chuẩn phương pháp giống với việc phát triển phương pháp, trong

đó bao gồm các nghiên cứu về tính đặc thù, độ tuyến tính, độ đúng hoặc khả năng thu hồi, độ nhạy,

và độ chính xác hoặc độ lặp lại. Tuy nhiên việc phê chuẩn phương pháp phải được giữ tách biệt

khỏi việc lựa chọn và phát triển phương pháp. Trong khi việc phát triển phương pháp gồm việc lựa

chọn các thông số cụ thể và các điều kiện cụ thể thì việc phê chuẩn phương pháp được dùng để xác

nhận các đặc trưng hiệu quả của phương pháp phù hợp với ứng dụng mong đợi trong các nghiên

cứu phòng thí nghiệm.

2.14 Chế tạo cột tách và kiểm tra cột

Cột tách là trái tim của hệ thống sắc ký. Các chất trong một hỗn hợp mẫu có được tách ra hay

không là được quyết định bởi chất lượng của cột tách và độ chọn lọc của hệ pha. Do đó cột tách

phải được chuẩn bị tốt thì mới có hiệu quả tách cao. Mặc dầu có rất nhiều loại cột tách đã được bán

sẵn trên thị trường, nhưng các nhà khoa học và những người chuyên nghiên cứu HPLC vẫn cứ

muốn tự chế tạo, nạp lấy cột tách cho đối tượng nghiên cứu của mình. Ở đây một phần là do tính

chất kinh tế, mặt khác dù cột mua về cũng cần kiểm tra lại trước khi dùng xem có phù hợp với yêu

cầu của mình hay không.

2.14.1 Chế tạo cột tách

Để chuẩn bị cột tách HPLC, trong những buổi ban đầu người ta hay dùng kỹ thuật nhồi khô.

Nhưng khi các hạt pha tĩnh có kích thước nhỏ hơn 15m thì kỹ thuật này không cho kết quả tốt, cột

không đồng nhất. Vì thế kỹ thuật nhồi huyền phù đã được phát triển để nhồi hạt có kích thước trong

dải từ 3 đến 10m. Nguyên tắc của kỹ thuật nhồi này là người ta nhũ hoá pha tĩnh trong một dung

môi có tỷ trọng bằng với tỷ trọng của pha tĩnh hay xấp xỷ bằng để tạo ra hỗn hợp huyền phù, rồi

cho hỗn hợp huyền phù này vào trong một cột chứa có nối cột sắc ký HPLC ở dưới. Sau đó dùng

một dung môi phù hợp nén tức khắc hỗn hợp huyền phù này vào cột tách đến khi áp suất ở cột tách

không đổi là được. Để nhũ hoá pha tĩnh người ta cho một lượng nhất định (đủ để nạp đầy cột tách)

vào bình nhũ hoá, thêm dung môi nhũ hoá (15-25mL) lắc đều và đặt trong máy siêu âm 5 phút. Lúc

này huyền phù phải là một thể đồng nhất và không sa lắng. Nhiều dung môi hay hỗn hợp dung môi

khác nhau đã được nghiên cứu để nhũ hoá pha tĩnh. Nhưng một điều quan trọng là dung môi nhũ

hoá pha tĩnh phải:

- Thấm ướt tốt pha tĩnh

- Có tỷ trọng bằng, xấp xỷ bằng tỷ trọng pha tĩnh

- Không gây hư hại pha tĩnh, làm ảnh hưởng đến tính chất sắc ký của pha tĩnh.

- Huyền phù phải bền vững được ít nhất 10 phút, để có đủ thời gian nạp huyền phù pha tĩnh

vào cột tách sau khi nhũ hoá.

Do những yêu cầu trên, hiện nay người ta thường dùng CCl4 hoặc CHCl3 có thêm một phần nhỏ

alkohol như methanol hay propanol….cho có tỷ trọng phù hợp với pha tĩnh. Nhưng đối với các chất

trao đổi ion trên nền polymer có khác đôi chút với kỹ thuật nêu trên. Đó là các chất nhồi trao đổi ion

loại này không bền vững dưới áp suất cao, mặt khác nó lại có độ trương nở lớn với thay đổi theo

thành phần pha động. Vì vậy phải nhũ hoá bằng chính pha động chạy sắc ký là tốt nhất. Đó là

nguyên tắc của kỹ thuật nạp cột với pha tĩnh rắn (hệ RL). Còn đối với sắc ký chiết (hệ LL), thì trước

hết ta cũng tiến hành nhồi chất mang trơ như trong kỹ thuật nói trên. Sau đó hoà tan pha tĩnh vào

trong một dung môi phù hợp và bơm qua cột đã đầy chất mang trơ đến bão hoà pha tĩnh. Tiếp đó

dùng một pha động phù hợp không hoà tan pha tĩnh bơm qua cột để lấy hết dung môi mang pha tĩnh

ra khỏi cột. Như vậy pha động này phải hoà tan tốt dung môi mang pha tĩnh lúc đầu. Trong quá

trình nhồi như thế pha tĩnh được phân bố trên bề mặt chất mang trơ tạo thành một lớp pha tĩnh bao

quanh bề mặt chất mang trơ.

Sau khi nạp xong điều quan trọng là phải kiểm tra xem các thông số đặc trưng của cột đã thoả

mãn yêu cầu đặt ra chưa, để sau đó dùng vào mục đích nhất định hay là không dùng được. Việc

kiểm tra cột như vậy sẽ tránh được những đánh giá sai lầm khi ta xem xét kết quả tách sắc ký một


hỗn hợp mẫu, ví dụ như sự tách không tốt, sự doãng píc,…là tại cột hay do điều kiện tách chưa tối

ưu.

Để đánh giá chất lượng của một cột tách, chúng ta phải kiểm tra 3 thông số chính là:

1. Chiều cao của đĩa H hay số đĩa N

2. Độ bất đối xứng của píc sắc ký

3. Độ thấm pha động

Trên cơ sở kết quả xác định 3 thông số này chúng ta sẽ biết được cột tách có được nhồi tốt hay

không và có thể dùng được hay không cho một quá trình sắc ký một loại mẫu nhất định. Nói chung

một cột tách tốt thì phải có:

- Số đĩa lý thuyết tối thiểu N 3000 (từ 3000 đến 5000)

- Độ bất đối xứng của píc sắc ký phải nhỏ hơn 10%

- Độ thấm pha động phải nằm trong khoảng 500-1200

Độ thấm pha động được tính theo công thức:

2

0

2

).(

..

L

TdpP

(2.62)

Trong đó P là áp suất đặt vào cột tách, T0 là thời gian không lưu giữ; là độ nhớt của pha động;

L là chiều dài cột tách; dp là đường kính hạt pha tĩnh.

Độ bất đối xứng được tính theo công thức:

a

bAsys (2.63)

ở đây a và b là độ rộng bên phải và bên trái píc sắc ký ở chiều cao 10% so với chiều cao cực đại

Hmax

2.14.2 Kiểm tra cột tách

Các thuộc tính vật lý của silica

Phân bố kích thước hạt: Sử dụng thiết bị phân tích kích thước hạt cảm biến vùng điện tử

(electrozone-sensing) phân giải đa kênh (có thể lên đến 128 kênh). Sự phân bổ kích thước hạt tác

động đến cả hiệu quả cột và ngược áp (back-pressure). Kích thước hạt trung bình (50% cum vol

[m]) và tỷ lệ 90%/10% làm phép đo độ rộng của sự phân bố.

Ngoài ra kích thước hạt còn được khảo sát bằng kính hiển vi điện tử, tìm kiếm những hạt có

khuyết tật, khuyết tật đó chỉ ra vấn đề về việc xử lý tạo hạt.

Hấp thụ nitơ đa điểm đưa ra diện tích bề mặt đặc trưng (m2/g), sự phân bố thể tích lỗ (% độ xốp)

(pore-volume) và kích thước lỗ (pore-size) đặc trưng (đường kính lỗ trung bình [A0]). Tính chất xốp

của hạt bắt nguồn từ thể tích lỗ và quan trọng đối với tỷ trọng lớp nhồi. Diện tích bề mặt đặc trưng

tác động lên khả năng lưu giữ của vật liệu nhồi và sự phân bố kích thước lỗ xác định kiểu phân tích

mà vật liệu có thể tiến hành được.

Các thuộc tính hoá học của silica và pha liên kết

Hoạt tính nhóm silanol

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), Solid State 29Si-NMR và thành phần kim loại, tất cả đều

có liên quan đến việc mô tả đặc trưng hoạt tính các nhóm silanol trên bề mặt silica trước khi tạo liên

kết. Đặc tính tự nhiên của các silanol ảnh hưởng đến sự cân đối píc của các hợp chất bazơ. Kim loại

ô nhiễm, đặc biệt là nhôm và sắt (đo bằng phát xạ nguyên tử) phải được giữ ở mức thấp bởi vì

chúng làm tăng tính axit của bề mặt silanol. Từ 29Si-NMR chúng ta thu được tỷ lệ silanol đơn trên

silanol nhóm, và từ phổ FTIR chúng ta có thể khẳng định được sự không có mặt của các silanol đơn

lẻ (đánh giá sự phân bố silanol). Các silanol đơn lẻ (không tạo liên kết hydro) gây phiền toái do

chúng có tính axit mạnh, do đó gây ra sự giãn đuôi píc đối với các chất phân tích bazơ.


Thành phần cacbon và bề mặt bao phủ

Ở cấp liên kết pha, một phép phân tích nguyên tố được thực hiện. Thành phần cacbon tìm thấy

trở thành điểm dữ liệu quy chiếu (Tổng cacbon %). Tuy nhiên bề mặt bao phủ (diện tích bao phủ

C18 [mol/m2]) có ý nghĩa hơn trong việc chỉ ra thành phần bề mặt khi mang so sánh với vật liệu

nhồi trên silica khác. Bề mặt bao phủ là lượng pha đã liên kết trên một đơn vị diện tích bề mặt. Nó

được rút ra từ thành phần cacbon và bề mặt đặc trưng.

Chương 3 CÁC TRANG BỊ KỸ THUẬT HPLC

3.1 Mở đầu

Trong kỹ thuật sắc ký lỏng nói chung và kỹ thuật HPLC nói riêng, sự tách của các chất xảy ra

liên tục trong cột sắc ký từ lúc nạp vào cho đến khi nó được đẩy ra khỏi cột tách cùng với pha động

thành dòng chảy liên tục. Vì thế các trang thiết bị của một hệ thống HPLC là phải có sự phù hợp

giữa các bộ phận với nhau để bảo đảm thu được kết quả tách tốt. Đặc biệt là bộ phận phát hiện chất

phân tích.

Do đó về nguyên tắc một hệ thống máy phân tích theo kỹ thuật HPLC tối thiểu phải có các bộ

phận sau đây:

1. Hệ thống loại khí dung môi (thuộc loại này có kỹ thuật loại khí theo nguyên lý sục khí He và kỹ

thuật loại khí chân không).

2. Van bơm mẫu nạp chính xác một lượng nhất định chất phân tích vào cột sắc ký.

3. Bơm cao áp để bơm pha động qua cột tách thực hiện quá trình sắc ký. Về nguyên lý có các loại

bơm: bơm đồng thể (isocratic)., bơm trộn trước khi bơm (quatenary)., bơm trước khi trộn hay

còn gọi là bơm đôi (binary)., bơm mao quản (capillary)., bơm dùng cho sắc ký điều chế. Nếu

theo áp lực chúng ta có bơm dùng cho sắc ký lỏng HPLC và bơm dùng cho sắc ký lỏng siêu

hiệu quả UPLC.

4. Bộ phận để theo dõi và phát hiện các chất phân tích. Đó là một detector để đo nồng độ của chất

phân tích theo một tính chất hoá lý nào đó, lấy ví dụ như sự hấp thụ quang, sự thay đổi dòng

điện, độ dẫn, chiết suất….

5. Bộ phận chỉ thị kết quả phát hiện của detector. Thông thường người ta dùng máy tự ghi để ghi

sắc đồ của sự tách, hay có thể dùng máy printer, intergrator,….

Một cách khái quát, chúng ta có thể thấy rằng hệ thống trang bị kỹ thuật HPLC có tối thiểu 5 bộ

phận. Nghĩa là từ những hệ thống HPLC thô sơ ra đời lần đầu tiên cho đến những hệ thống HPLC

hiện đại ngày nay cũng không thể thiếu được các bộ phận đó.

Song do sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, những hệ thống trang thiết bị HPLC

ngày nay càng được hoàn thiện về nhiều mặt để nâng cao độ nhạy, độ chính xác, tốc độ phân tích

cũng như tự động hoá các quá trình sắc ký. Vì thế các hệ thống HPLC còn có thêm chương trình

dung môi để thay đổi thành phần pha động trong quá trình sắc ký, máy vi tính để chỉ huy và điều

khiển quá trình tách. Tức là cùng với sự phát triển của khoa học thì các hệ thống trang bị HPLC

cũng được hoàn thiện hơn để đáp ứng mọi yêu cầu phong phú và phức tạp đa dạng của nhiều loại

hỗn hợp mẫu khác nhau đạt hiệu suất cao.

3.2 Bộ phận loại khí hoà tan trong dung môi

Bé lo¹i khÝ ch©n kh«ng gåm cã çc kªnh ch©n kh«ng, thêng bao gåm 4 kªnh víi 4 mµng cã kÕt cÊu micro vµ mét b¬m ch©n kh«ng. Khi bé lo¹i khÝ ch©n kh«ng ®îc bËt lªn, m¹ch ®iÒu khiÓn bËt b¬m ch©n kh«ng ®Ó t¹o ra ch©n kh«ng côc bé trong buång

ch©n kh«ng. Áp lực được đo bëi mét c¶m biÕn ¸p. Bé lo¹i khÝ ch©n kh«ng duy tr× ch©n

kh«ng côc bé nhê bËt vµ t¾t b¬m ch©n kh«ng theo tÝn hiÖu tõ c¶m biÕn ¸p lùc.


B¬m LC kÐo dung m«i tõ çc chai cña chóng qua çc mµng nhùa h×nh èng ®Æc biÖt trong buång ch©n kh«ng. Khi dung m«i ®i qua çc èng ch©n kh«ng bÊt kú khÝ hßa tan nµo trong dung m«i sÏ thÊm qua mµng vµo trong buång ch©n kh«ng. Dung m«i sÏ ®îc ®uæi khÝ gÇn nh hoµn toµn.

Khi nµo sö dông bé lo¹i khÝ ch©n kh«ng

Cho çc b¬m trén ¸p suÊt cao t¹i tèc ®é dßng thÊp hoÆc khi b¹n cã çc ®iÒu kiÖn díi ®©y:

- NÕu detector cña b¹n sö dông ®Õn ®é nh¹y cùc ®¹i trong d¶i sãng UV thÊp.

- NÕu øng dông cña b¹n ®ßi hái ®é chÝnh x¸c cña viÖc tiªm mÉu tèi u.

- NÕu øng dông cña b¹n ®ßi hái tÝnh lÆp l¹i cña thêi gian lu cao nhÊt (b¾t buéc sö dông t¹i çc gÝa trÞ tèc ®é dßng 0.5 ml/phót)

- NÕu mÉu cña b¹n hoÆc sù ph¸t hiÖn lµ nh¹y víi oxy hßa tan trong pha ®éng (sù tho¸i biÕn).

- Víi detecto huúnh quang

Nh×n chung mét bé lo¹i khÝ cÇn ®îc sö dông khi cã nh÷ng t¸c ®éng tiªu cùc do khÝ hßa tan trong pha ®éng vît qóa giíi h¹n ®îc ngêi sö dông chÊp nhËn. Nh÷ng t¸c ®éng tiªu cùc cã thÓ do khÝ hßa tan g©y ra lµ:

- Dßng kh«ng æn ®Þnh do çc ®iÒu kiÖn b¬m kh«ng æn ®Þnh. §iÒu nµy cã thÓ t¹o ra gîn sãng cao hoÆc ®é lÖch chuÈn cao ®èi víi thêi gian lu cña pÝc vµ diÖn tÝch pÝc, ®Æc biÖt lµ t¹i tèc ®é dßng thÊp.

- §é ån ®êng nÒn trªn çc detector nh¹y víi sù thay ®æi chØ sè khóc x¹.

- Tho¸i biÕn mÉu.

- T¾t huúnh quang do oxy hßa tan.

- Tr«i ®êng nÒn trong detecto ®iÖn ho¸ do oxy hßa tan, ®Æc biÖt lµ trong chÕ ®é khö.

3.3 Bơm cao áp trong HPLC

Bơm cao áp là một bộ phận quang trọng của hệ thống trang bị HPLC, đây cũng là điểm khác

biệt và để phân biệt với kỹ thuật sắc ký lỏng cổ điển (áp suất thường trước đây). Đến nay người ta

đã nghiên cứu và sản xuất được rất nhiều loại bơm cao áp khác nhau. Nhưng về nguyên tắc nó chỉ

theo hai kiểu chính:

- Bơm nén trực tiếp pha động từ xylanh.

- Bơm màng nén ép pha động.

Trong hai loai này, loại thứ hai có nhiều ưu điểm hơn. Đặc biệt là nó không làm nhiễm bẩn pha

động (vì pha động không qua pittông của bơm). Với nguyên tắc này ngày nay có rất nhiều loại bơm

cho kỹ thuật HPLC đã ra đời và được ứng dụng phổ biến. Để phục vụ cho mục đích tách, các bơm

này có thể thay đổi áp suất từ vài bar đến 300 bar với tốc độ pha động từ 0,2 ml đến 10 ml/phút.

Còn để nạp cột có thể đến áp suất 1200 bar.

Tuy có nhiều loại khác nhau, nhưng bất kỳ một bơm cao áp nào dùng cho kỹ thuật HPLC cũng

cần đạt được những yêu cầu sau:

1. Bơm được ở những áp suất cao nhất định tuỳ chọn cho một quá trình sắc ký,nhưng phải nhanh

chóng đạt cân bằng của tốc độ bơm đã chọn và phải lặp lại được, cũng như ổn định trong suốt

quá trình bơm đã đặt theo những tốc độ cần thiết.

2. Không làm bẩn pha động để gây nhiễu cho quá trình sắc ký.

3. Phải dễ dàng điều chỉnh được những tốc độ bơm mong muốn của pha động trong phạm vi cho

phép.

4. Bơm phải có độ bền cao và không đắt tiền.

5. Vùng thay đổi tốc độ bơm phải tương đối rộng, để có thể phục vụ được cho nhiều quá trình sắc

ký khác nhau.


Đó là những yêu cầu cần thiết và với kỹ thuật cơ khí chính xác cao hiện nay người ta hoàn toàn

có thể có khả năng thoả mãn được tất cả các yêu cầu đó một cách rất tốt. Đồng thời có thể khống

chế tự động tốc độ bơm đã chọn, bảo hiểm khi áp suất cao quá quy định hoặc chỉ thị những sai sót

trong quá trình bơm.

Mặc dù có nhiều loại bơm khác nhau, nhưng về nguyên tắc cấu tạo đều phải có mấy bộ phận

chính như sau:

- Môtơ động cơ bơm.

- Buồng bơm và

- Hệ van vào và van ra của pha động.

- Các van điều chỉnh áp suất bơm đẩy pha động.

Trong các loại bơm cao áp của HPLC, có loại một kênh và loại 2 kênh, tức là loại một buồng

bơm và loại 2 buồng bơm. Khi bơm ở áp suất cao trên 100bar, loại 2 buồng bơm cho kết quả ổn

định hơn.

HÖ thèng b¬m ®ång thÓ (mét b¬m). Sö dông mét dung m«i hoÆc hçn hîp dung m«i trén tríc ngoµi hÖ thèng. Çc chÊt ®îc t¸ch víi thµnh phÇn pha ®éng kh«ng ®æi.

HÖ thèng gradient hai b¬m trén ¸p suÊt cao. Çc dung m«i ®îc b¬m ®éc lËp ë ¸p suÊt cao, ®îc trén víi nhau ë ch÷ T vµ sau ®ã lµ trong bé trén. Çc chÊt ®îc t¸ch víi thµnh phÇn pha ®éng thay ®æi (lÊy vÝ dô 10 ®Õn 80% acetonitril (90 ®Õn 20% níc))

HÖ thèng gradient mét b¬m trén ¸p suÊt thÊp. Çc chÊt ®îc t¸ch víi thµnh phÇn pha ®éng thay ®æi. Hçn hîp çc dung m«i ®îc trén ë ¸p suÊt thÊp t¹i mét van lùa chän dung m«i, sau ®ã hçn hîp ®îc b¬m b»ng b¬m cao ¸p (mét b¬m).

3.4 Van bơm mẫu trong HPLC

Van bơm mẫu là một dụng cụ để đưa một lượng chính xác mẫu phân tích vào cột sắc ký. Ở đây

có loại có vòng mẫu và loại không có vòng mẫu. Trong kỹ thuật HPLC người ta đã dùng các loại

van bơm mẫu 3 chiều, 4 chiều, 6 chiều và nhiều chiều. Trong đó van 6 chiều có vòng định cỡ mẫu

là loại được dùng phổ biến nhất. Về nguyên tắc cấu tạo và làm việc van này bao gồm một vị trí nạp

mẫu vào vòng mẫu và một vị trí bơm mẫu vào cột tách sắc ký. Các loại vòng mẫu thường có thể

tích là 20, 50, 100 l cho mục đích phân tích và 200, 500, 1000, 5000 l cho bán điều chế. Các van

6 chiều chỉ có một vòng mẫu để nạp mẫu vào cho cột tách.

Ngày nay do yêu cầu phân tích, người ta đã chế tạo được những van bơm mẫu 10, 12 chiều để

có thể chọn những vòng mẫu có thể tích phù hợp cho mỗi đối tượng tách mà không phải tháo ra

thay vòng mẫu như trong các van 6 chiều.

Hệ thống lấy và tiêm mẫu tự động

Hệ thống lấy mẫu tự động cho phép lấy tự động một lượng mẫu chính xác và lặp lại, sau đó đưa

lượng mẫu này vào đường truyền dung môi để chuyển đến cột tách.

Có nhiều nguyên lý vận hành khác nhau đối với bộ lấy mẫu tự động. Tuy nhiên bất kỳ theo

nguyên lý nào thì một bộ lấy mẫu tự động về cơ bản cần có các bộ phận sau:

- Xylanh với kim tiêm và môtơ điều khiển để kéo mẫu vào vòng định cỡ mẫu cũng như để

đẩy mẫu vào đường chuyển động của dung môi.

- Vòng định cỡ mẫu để lấy được thể tích mẫu chính xác và lặp lại.

- Hệ van đa chiều (thường là 6 chiều) hoặc hệ tổ hợp van hoạt kích để đồng bộ hoá giai đoạn

nạp mẫu và giai đoạn truyền mẫu.

- Cơ cấu truyền động để lấy lọ mẫu đưa vào vị trí lấy mẫu. Đây là các robot có khả năng

chuyển động theo các phương x, y, z và phương theta cùng các cảm biến nhận diện lọ mẫu và hệ

thống giải mã định vị vị trí lọ mẫu.


- Một bơm bổ sung cho chức năng rửa kim xylanh tự động. Bơm này hoạt động đồng bộ với

giai đoạn nạp và truyền mẫu của bộ lấy mẫu tự động. Bơm này thường dùng riêng một loại dung

môi chuyên cho rửa kim. Loại dung môi này thường có độ hoà tan mẫu bằng hoặc tương đương với

dung môi tách sắc ký.

- Khay mẫu chuyên dụng cho các loại kích thước lọ mẫu khác nhau. Các loại lọ có kích thước

khác nhau (khác nhau về độ cao, đường kính ngoài của thân lọ và đường kính cổ lọ). Những lọ mẫu

tự động này thường được mã hoá mầu sắc phần nắp lọ hoặc septum nắp lọ để các cảm biến của bộ

phận vận chuyển lọ mẫu nhận diện.

Hệ thống lấy mẫu tự động là một trang bị tương đối phức tạp với các cơ cấu hoạt động tự động

hoá cao cả về không gian và thời gian, về độ chính xác và độ đúng. Ngoài ra để phân tích mẫu kém

bền, mẫu dễ phân huỷ nhiệt hoặc một số loại mẫu sinh học nào đó người ta đưa ra hệ thống lấy mẫu

tự động có điều nhiệt. Phương pháp điều nhiệt truyền thống là sử dụng một thiết bị điều nhiệt tuần

hoàn. Ngày nay các thiết bị điều nhiệt Peltier không dùng chất làm lạnh đã phát triển và được đưa

vào ứng dụng rộng rãi trong việc làm lạnh các cấu kiện,chi tiết phạm vi nhỏ. Dưới đây là một ví dụ

về cơ chế vận hành của một thiết bị lấ mẫu tự động

Çc chuyÓn ®éng c¬ häc cña çc cÊu kiÖn bé lÊy mÉu tù ®éng trong tuÇn tù lÊy mÉu ®îc theo dâi liªn tôc bëi bé xö lý cña bé lÊy mÉu tù ®éng. Bé xö lý ®Þnh râ çc cöa sæ thêi gian ®Æc trng vµ çc d¶i c¬ häc cho mçi mét chuyÓn ®éng. NÕu nh mét bíc ®Æc trng nµo ®ã cña tuÇn tù lÊy mÉu kh«ng ®îc hoµn tÊt mét çch thµnh c«ng, lêi nh¾n lçi ®îc ®a ra.

Dung m«i ®îc ®i vßng qua bé lÊy mÉu tù ®éng nhê van tiªm trong tuÇn tù lÊy mÉu. Lä mÉu ®îc lùa chän b»ng tay kÑp tõ mét gÝa mÉu tÜnh, hoÆc tõ çc vÞ trÝ mÉu ng o¹i vi. Tay cÆp ®Æt lä mÉu díi ®Çu kim tiªm. ThÓ tÝch mÉu yªu cÇu ®îc kÐo vµo vßng ®Þnh cì mÉu nhê thiÕt bÞ ®o. MÉu ®îc ¸p vµo cét khi van tiªm quay trë l¹i vÞ trÝ mainpass t¹i thêi ®iÓm kÕt thóc tuÇn tù lÊy mÉu.

TuÇn tù lÊy mÉu xuÊt hiÖn theo trËt tù díi ®©y:

1. Van tiªm bËt sang vÞ trÝ bypass.

2. Pitt«ng cña thiÕt bÞ ®o dÞch chuyÓn ®Õn vÞ trÝ khëi ®éng (initialization).

3. Tay cÆp dÞch chuyÓn khái vÞ trÝ home (vÞ trÝ dù phßng), vµ lùa chän lä mÉu. Cïng lóc nµy, ®Çu kim n©ng lªn khái châ ngåi cña nã.

4. Tay kÑp ®Æt lä díi ®Çu kim.

5. §Çu kim h¹ xuèng ®i vµo lä mÉu.

6. ThiÕt bÞ ®o kÐo thÓ tÝch mÉu mong muèn.

7. §Çu kim n©ng lªn khái lä mÉu.

8. NÕu chÕ ®é röa kim tù ®éng ®îc lùa chän, tay cÆp ®Æt lä mÉu trë l¹i chç cò, ®Þnh vÞ lä röa díi ®Çu kim, h¹ thÊp ®Çu kim ®i vµo trong lä, sau ®ã n©ng ®Çu kim ra khái lä röa.

9. Tay cÆp kiÓm tra n¾p an toµn ®· ®îc ®Þnh vÞ.

10. Tay cÆp ®Æt lä trë l¹i vÞ trÝ cò, vµ quay trë l¹i vÞ trÝ dù phßng. §ång thêi ®Çu kim h¹ thÊp vµo chç ngåi cña nã.

11. Van tiªm chuyÓn sang vÞ trÝ mainpass.

Tuần tự tiêm mẫu

Tríc khi khëi ®éng tuÇn tù tiªm mÉu, vµ trong lóc ph©n tÝch, van tiªm ë trong vÞ trÝ

mainpass. Trong vÞ trÝ nµy, pha ®éng ch¶y qua thiÕt bÞ ®o bé lÊy mÉu tù ®éng, vßng ®Þnh cì mÉu, ®Çu kim, b¶o ®¶m tÊt c¶ çc phÇn tiÕp xóc víi mÉu ®îc phun trong lóc ch¹y, theo çch ®ã gi¶m thiÓu hiÖu øng mang sang


Khi tuÇn tù mÉu b¾t ®Çu, thiÕt bÞ van bËt sang vÞ trÝ bypass. Dung m«i tõ b¬m ®i vµo thiÕt bÞ van t¹i cæng 1, ch¶y trùc tiÕp ®Õn cét qua cæng 6.

KÕ tiÕp ®Çu kim ®îc n©ng lªn, vµ lä ®îc ®Þnh vÞ díi ®Çu kim. §Çu kim di chuyÓn xuèng vµo trong lä mÉu, thiÕt bÞ ®o kÐo mÉu vµo trong vßng ®Þnh cì mÉu.

Khi thiÕt bÞ ®o ®· kÐo thÓ tÝch mÉu ®ßi hái vµo trong vßng ®Þnh cì mÉu, ®Çu kim ®îc n©ng lªn, lä ®îc ®Æt trë l¹i chç cò trong khay mÉu. §Çu kim ®îc h¹ thÊp xuèng vµo trong chç ngåi ®Çu kim, van tiªm bËt trë l¹i vÞ trÝ mainpass, ®Èy mÉu phun vµo cét.

3.5 Cột tách trong HPLC

Cột tách là bộ phận chính của quá trình sắc ký. Vì diễn biến của sự tách một hỗn hợp chất mẫu

là xảy ra ở đây và kết quả của sự tách tốt hay không tốt thì cột tách cũng là một yếu tố quyết định.

Người ta nói cột tách là trái tim của hệ thống sắc ký cũng là hoàn toàn đúng.

Cột tách được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm

bar, có khi lên đến 1000bar. Trong cột tách là chất nhồi cột; nó là pha tĩnh của hệ sắc ký. Cột tách

cũng có thể được chế tạo với vỏ chịu áp bằng thép, còn ống trong cùng làm bằng thạch anh. Loại

cột này thường dùng trong quá trình tách pha động có môi trường axit cao và có chất tạo phức mạnh

mà thép không có khả năng chịu được. Loại cột này tất nhiên chế tạo phức tạp, đắt tiền. Vì thế nó

không được dùng phổ biến như cột ống thép.

Cột tách có nhiều cỡ khác nhau tuỳ thuộc vào mức độ và mục đích của quá trình sắc ký. Nhưng

một cách đại cương, người ta chia thành 3 loại:

1. Tách phân tích: dài 10-25cm, đường kính 2-5mm

2. Bán điều chế: dài 50-100cm, đường kính 5-10mm

3. Tách điều chế: dài 100-150cm, đường kính 10-50mm

Trong một mức độ nhất định thì đường kính hay nói chung là kích thước của cột sắc ký cũng có

ảnh hưởng đến kết quả tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu cụ thể. Vì nếu chọn được cột tách có kích

thước phù hợp thì chúng ta sẽ có kết quả tách tốt nhất.

3.6 Các loại detector trong HPLC

Trong HPLC, việc tách của các chất mẫu là xảy ra liên tục trong cột tách và các chất tan được

dẫn ra khỏi cột tách nhờ pha động. Vì thế detector là bộ phận theo dõi, phát hiện các chất tan trong

pha động chảy ra từ cột tách một cách cũng liên tục. Nó là một dụng cụ thu nhận và phát hiện các

chất hay hợp chất của nó dựa theo một tính chất hoá lý nào đó của chất phân tích, hay là theo tính

chất vật lý. Nhưng dù theo tính chất nào thì cũng phải có điều kiện là trong một vùng nồng độ nhất

định của chất phân tích ta phải có quan hệ sau:

A = k.C

Trong đó A là tín hiệu đo của chất phân tích hay hợp chất của nó theo tính chất đó. C là nồng

độ của chất phân tích trong mẫu, còn k là hằng số điều kiện thực nghiệm của detector đã chọn. Tín

hiệu đo A này có thể là:

- Độ hấp thụ quang phân tử của chất,

- Cường độ phát xạ của vạch phổ chất phân tích,

- Cường độ dòng điện, điện thế,

- Độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt,

- Chiết suất của chất phân tích,

- Cường độ tín hiệu phổ khối,…

Trên cơ sở những tính chất đó, ngày nay người ta đã chế tạo được nhiều loại detector khác nhau

cho kỹ thuật HPLC, cụ thể là:

1. Detector hấp thụ quang phân tử (UV-VIS, DAD, PDA),

2. Detector huỳnh quang,


3. Detector phổ phát xạ nguyên tử,

4. Detector điện hoá đo dòng, cực phổ,

5. Detector đo thế mV,

6. Detector đo độ dẫn điện, điện trở,

7. Detector đo chiết suất,

8. Detector đo hiệu ứng nhiệt, độ dẫn nhiệt,

9. Detector đo độ nhớt,

10. Detector khối phổ (ICP-MS và MS).

Đó là một số loại detector đã và đang được dùng trong kỹ thuật HPLC. Song loại detector hấp

thụ quang UV-VIS là được dùng phổ biến nhất. Sau đó đến detector huỳnh quang, điện hoá, chiết

suất. Gần đây detector khối phổ ICP-MS đã ghép nối thành công với HPLC (cả về phần cứng, phần

mềm điều khiển, thu nhận và xử lý dữ liệu đồng bộ) mang đến một khả năng phân tích rất đặc thù

đối với các hợp chất cơ kim loại (cơ Sn, Se,…).

Tuy có nhiều loại detector khác nhau, nhưng dù là detector loại nào nó cũng cần phải thoả mãn

được một số yêu cầu sau đây mới có thể dùng được trong kỹ thuật HPLC:

1. Có tính chất chọn lọc cho chất phân tích hay một nhóm các chất phân tích và độ chọn lọc

càng cao càng tốt.

2. Có độ nhạy cao đối với chất phân tích trong hỗn hợp mẫu. Có như thế mới phát hiện và đo

định lượng được các nồng độ nhỏ.

3. Phải hoạt động ổn định và bền vững với những điều kiện nhất định của hệ pha trong quá

trình sắc ký.

4. Vùng tuyến tính động học của phép đo không quá nhỏ. Nghĩa là càng rộng càng tốt cho việc

phát hiện và định lượng trong một vùng nồng độ rộng của chất phân tích trong mẫu.

5. Không bị ảnh hưởng hoặc ít bị ảnh hưởng của các tác động của môi trường xung quanh, như

độ ẩm, áp suất và nhiệt độ.

6. Không quá phức tạp, khó sử dụng và quá đắt tiền.

Với những yêu cầu trên, ngày nay rất nhiều loại detector đã thoả mãn được và đã được đưa

vào sử dụng phổ biến với kết quả tốt. Song để đánh giá chất lượng của một loại detector người ta

cần phải căn cứ vào các đặc trưng chính sau đây:

1. Độ nhiễu tự thân của detecor. Yếu tố này phải nhỏ và ổn định. Đường nền không trôi và

không lớn theo thời gian

2. Giới hạn phát hiện: phải có giới hạn phát hiện đối với chất phân tích ở nồng độ càng nhỏ

càng tốt, bình thường là trong mức từ ng-g/mL

3. Vùng tuyến tính động học: Nói chung với yếu tố này thì càng rộng càng tốt. Bình thường là

từ 1-104 lần. Có như thế mới thích hợp với việc định lượng chất phân tích có nồng độ trong một

vùng rộng mà không cần phải pha nhiều dãy chuẩn. Đối với đặc trưng này thì hiện nay detector

khối phổ ICP-MS là có dải tuyến tính rộng nhất (1-109) lần

4. Độ doãng píc tự thân của detector. Yếu tố này phải nhỏ. Nói chung không được lớn hơn

10% tổng độ doãng píc của píc sắc ký. Không gây ảnh hưởng đến độ cân đối của píc.

5. Hằng số thời gian. Phải có hằng số thời gian nhỏ. Nghĩa là phải có sự đáp tuyến nhanh và

nhạy với mọi sự thay đổi nhỏ của nồng độ chất phân tích. Thời gian đáp tuyến phải nhỏ hơn 0,1

giây. Thường thì các nhà chế tạo thiết bị gọi đây là thời gian phản hồi của detector, thời gian phản

hồi nhỏ mới cho phép thực hiện sắc ký nhanh. Thời gian phản hồi này chủ yếu phụ thuộc vào tốc độ

các hệ thống ghi nhận điện tử (các linh kiện thu nhận, chuyển đổi tín hiệu vật lý, chuyển đổi analog

sang digital, tích phân kế, vi mạch,….).

6. Độ lặp lại của tín hiệu đo. Phải có độ lặp lại cao. Nghĩa là số đo nhiều lần (tối thiểu 7 lần)

phải không được sai khác nhau quá 10% đối với một nồng độ nằm trong vùng tuyến tính.


Đó là những đặc trưng quan trọng để đánh giá và xem xét chất lượng của một loại detector trong

HPLC và cũng nhờ những đặc trưng này mà chúng ta có thể chọn loại detector nào cho một nhiệm

vụ sắc ký. Tất nhiên để phát hiện các chất chúng ta có thể sử dụng hai hay 3 loại detector khác nhau.

Nhưng hiển nhiên là sẽ có loại detector cho độ nhạy cao, có loại cho độ nhạy thấp hơn. Điều này

chúng ta có thể thấy trong ví dụ tách 3 chất Epinerphrine, Norepinerphrine và Dopamine trong bảng

3.1 dưới đây:

Bảng 3.1: Độ nhạy của chất phân tích với các detector khác nhau (ng/mL mẫu)

Chất phân tích Loại detector

Hấp thụ UV-VIS Huỳnh quang Điện hoá

Epinephrine 5-10 0,6-1,0 0,2-0,5

Norepinephrine 5-10 0,3-1,2 0,3-0,5

Dopamine 5-8 0,5-1,5 0,25-0,4

Đồng thời cũng nhờ những đặc trưng nói trên, người ta có thể so sánh các loại detector với nhau

đối với kỹ thuật HPLC. Bảng 3.2 là một ví dụ cụ thể về các đặc trưng cơ bản của một số loại

detector đã và đang được sử dụng trong HPLC.

Trên đây chúng ta đã trình bày và xem xét về các yêu cầu và đặc trưng của các loại detector

trong HPLC, nhưng về nguyên tắc cấu tạo thì bất kỳ loại detector nào dùng trong kỹ thuật HPLC

cũng phải có cấu tạo cơ bản gồm các bộ phận sau:

1. Buồng đo (Flowcell) có thể tích từ 3-12L.

2. Hệ quang học hoặc quang ion (đối với detector phổ khối). Hệ quang học có nhiệm vụ cung

cấp, phân ly, tách chùm tia cần đo. Hệ quang ion có nhiệm vụ hội tụ chùm ion, giảm độ phân tán

năng lượng, tách chùm ion khỏi các phần tử không mang điện (các phần tử trung hoà, photon ánh

sáng) và tách các ion khỏi nhau (buồng tách khối).

3. Hệ điện tử (hệ đo tín hiệu) có nhiệm vụ thu nhận và khuyếch đại tín hiệu đo để chỉ thị theo

một cách nào đó (ví dụ như máy tự ghi, máy in số đó, tín hiệu số hoá trên màn hình máy tính,…).

Đó là những bộ phận cơ bản nhất, cần thiết nhất của một detector. Nhưng hiện nay các detector

hiện đại có thêm một vài bộ phận khác nữa như bộ chương trình hoá, máy tính, tích phân kế…. để

làm cho detector có tính vạn năng hơn và đáp ứng được nhiều yêu cầu phân tích nhanh và hàng loạt

của các đối tượng thực tế. Sau đây chúng ta sẽ xem xét một vài loại detector đang được dùng trong

HPLC.

Bảng 3.2: Đặc trưng của một số detector dùng trong HPLC

Loại detector Tính chất đo Độ nhạy Độ tuyến tính Tính phổ biến

Hấp thụ UV Hấp thụ quang phân tử 0,1-1,0 n.102 Phổ biến

Hấp thụ UV-VIS Hấp thụ quang phân tử 0,1-1,0 n.102 Phổ biến

Huỳnh quang Tính huỳnh quang 0,05-0,2 n.103 Tương đối

Phổ F-AAS Hấp thụ nguyên tử 0,1-0,5 n.102 Tương đối

Phổ ICP-AES Phát xạ nguyên tử 0,01 n.105 Tương đối

Phổ ICP-MS Phổ khối lượng 10-6 n.109 Tương đối

Chiết suất Đo chiết suất 0,1-1,0 n.102 Ít dùng

Amper Đo dòng điện 0,01 n.102 Tương đối

Cực phổ Đo dòng cực phổ 0,1 n.102 Ít dùng

Điện cực chọn lọc Đo thế 0,05 n.104 Ít dùng

Độ dẫn Đo độ dẫn của dung dịch 0,1 n.103 Ít dùng

Dẫn nhiệt Đo sự hấp thụ nhiệt hay 0,1 n.102 Ít dùng


phát nhiệt

GHI CHÚ: Độ nhạy tính theo đơn vị g/ml mẫu, Hằng số thời gian: 0,1-0,01 giây

3.6.1 Detector hấp thụ quang phân tử

Detector loại này thực chất là các máy phổ hấp thụ phân tử tử ngoại (UV) và khả kiến (VIS)

(UV-VIS Spectrophotometer). Nhưng ở đây buồng đặt cuvét đo được thay bằng cuvet động (còn có

tên gọi là cuvet dòng chảy hoặc buồng đo dòng chảy – flowcell). Việc đo để phát hiện chất phân

tích hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của nó ở trong dung

dịch tại một độ dài sóng nào đó; nhưng dung dịch ở đây là pha động của quá trình sắc ký, nó chảy

liên tục qua flowcell. Các chất tan trong pha động có thể cho phổ hấp thụ trực tiếp của chính nó,

như phenol, toluene, benzen, nitrobenzen,…. ở bước sóng 254nm. Nhưng đối với một số chất khác

như ion kim loại thì là đo hợp chất của chúng với một thuốc thử nào đó, ví dụ phức Fe-SCN, ở sóng

480nm, Zn-Dz ở sóng 560nm, Cr-DPC ở sóng 535nm,… Song phản ứng để tạo thành các hợp chất

để đo này là phải có tính chất định lượng hoàn toàn trong những điều kiện xác định.

Như vậy nói chung tất cả các chất hay hợp chất của nó với một thuốc thử phân tích theo phản

ứng có tính chất định lượng mà có khả năng hấp thụ quang nhạy tại một bước sóng nào đó trong

vùng phổ UV-VIS đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại detector này. Nguyên tắc của

việc phát hiện định lượng ở đây là dựa theo định luật hấp thụ quang:

lCEI

IA ..log 0 (3.1)

Trong đó A là mật độ hấp thụ quang của chất phân tích hay hợp chất phức của nó với thuốc thử

phân tích đã chọn. E là độ tắt phân tử của nó, còn l là bề dày của lớp hấp thụ (chiều dài của

flowcell).

Về nguyên tắc cấu tạo, loại detector này bao gồm những phần chính như sau:

- Nguồn sáng (đèn D2-Lamp hoặc đèn W-Lamp hoặc kết hợp cả hai loại đèn này).

- Môi trường hấp thụ (flowcell).

- Hệ thống đơn sắc để thu, phân ly và lựa chọn tia sáng cần đo. Trong các detector đơn

giản thì đây là một hệ kính lọc vùng phổ. Trong các detector hiện đại thì đây là các cách tử nhiễu xạ

với độ phân giải phổ cao hơn nhiều.

- Bộ phận nhân điện tử để thu nhận và khuyếch đại tín hiệu đo. Trong các detector loại

DAD hoặc PDA thì là một dãy (có lúc gọi là mảng) các diod quang.

- Bộ phận chỉ thị kết quả đo (máy ghi, tích phân kế, máy tính số hoá).

Trong thực tế, rất nhiều chất hữu cơ và hợp chất phức của kim loại với một thuốc thử đều có thể

phát hiện và xác định bằng loại detector này. Cho đến nay thì loại detector này vẫn là loại được

dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật HPLC

3.6.1.1 Các nguyên lý cơ bản

Phổ điện từ

Bức xạ Ultraviolet và Visible chỉ bao gồm một phần nhỏ của phổ điện từ, phổ điện từ còn có

cả một số dạng bức xạ khác như radio, infrared (IR), cosmic và X-ray (hình 3.1).

Năng lượng liên quan đến bức xạ điện từ theo hàm dưới đây:

.hE (3.2)

Trong đó E là năng lượng (theo J), h là hằng số Plank (6,62.1034 Js) và là tần số (theo giây).


Bước sóng và tần số

Bức xạ điện từ có thể được xem như một sự đan xen giữa điện trường và từ trường truyền dẫn

trong không gian với một chuyển động sóng. Do bức xạ đóng vai trò như một sóng, nó có thể được

phân loại theo các khái niệm hoặc sóng hoặc tần số, chúng quan hệ với nhau theo hàm dưới đây:

c (3.3)

Trong đó là tần số (theo giây), c là tốc độ của ánh sáng (3.108 ms-1), và là bước sóng (theo

m). Trong phổ UV-VIS, bước sóng thường được biểu diễn theo nanomet (nm) (1 nm = 10-9).

Theo các dạng hàm trên thì bức xạ có bước sóng thấp hơn sẽ có năng lượng cao hơn. Trong phổ

UV-Vis, ánh sáng UV có bước sóng ngắn sẽ có năng lượng cao nhất. Trong một số trường hợp năng

lượng này đủ để tạo ra các phản ứng quang hoá không cần thiết khi đo phổ mẫu (nên nhớ thành

phần UV của ánh sáng gây sạm da).

Nguồn gốc của phổ UV-Vis

Khi bức xạ tương tác với vật chất, có thể xuất hiện một số quá trình bao gồm phản xạ, tán sắc,

hấp thụ, huỳnh quang/lân quang (hấp thụ và phát xạ lại), và các phản ứng quang hoá (hấp thụ và bẻ

gãy liên kết). Nhìn chung khi đo phổ UV-Vis chúng ta chỉ muốn xuất hiện quá trình hấp thụ.

Do ánh sáng là một dạng của năng lượng, sự hấp thụ ánh sáng của vật chất làm cho thành phần

năng lượng của phân tử (hoặc nguyên tử) gia tăng. Tổng thế năng của một phân tử nhìn chung được

biểu diễn là tổng của năng lượng điện tử, năng lượng dao động và năng lượng quay:

rotationallvibrationaelectronictotal EEEE

Lượng năng lượng của các quá trình phân tử trong từng dạng là không liên tục mà là một loạt

các mức hay các trạng thái rời rạc. Sự khác biệt về năng lượng giữa các trạng thái khác nhau xắp

xếp theo trật tự như sau:

rotationallvibrationaelectronic EEE

Trong một số phân tử và nguyên tử, các photon của ánh sáng UV và VIS có đủ năng lượng để

gây ra các chuyển tiếp giữa các mức năng lượng điện tử khác nhau. Bước sóng của ánh sáng bị hấp

thụ có năng lượng được đòi hỏi để chuyển dịch một điện tử từ một mức năng lượng thấp hơn lên

một mức năng lượng cao hơn. Hình 3.2 chỉ ra một ví dụ về các chuyển tiếp điện tử trong

formaldehyde và các bước sóng ánh sáng gây ra những chuyển tiếp này.

Hình 3.1. Phổ điện từ


Hình 3.2. Các chuyển tiếp điện tử trong formaldehyde

Những chuyển tiếp này sẽ tạo ra các băng phổ hấp thụ rất hẹp tại những bước sóng có tính đặc

trưng cao về hiệu số các mức năng lượng của các dạng hấp thụ. Điều này đúng với các nguyên tử,

được mô tả như trong hình 3.3.

Hình 3.3. Các chuyển tiếp điện tử và phổ nguyên tử

Tuy nhiên đối với các phân tử, các mức năng lượng dao động và năng lượng xoay bị chồng lên

các mức năng lượng điện tử. Do có thể xuất hiện nhiều chuyển tiếp với năng lượng khác nhau, các

băng phổ bị mở rộng (xem hình 3.4). Sự mở rộng băng thậm chí còn mạnh hơn trong dung dịch do

các tương tác của dung môi và chất tan.


Hình 3.4. Các chuyển tiếp điện tử và phổ UV-VIS trong phân tử

Sự truyền qua và hấp thụ

Khi ánh sáng đi qua hoặc bị phản xạ từ một mẫu, lượng ánh sáng bị hấp thụ là hiệu số giữa bức

xạ đến (I0) và bức xạ truyền qua (I). Lượng ánh sáng bị hấp thụ được biểu diễn hoặc theo độ truyền

qua hoặc theo độ hấp thụ. Độ truyền qua thường được đưa ra dưới các thuật ngữ như là một phần

của 1 hoặc là tỷ lệ phần trăm và nó được định nghĩa như sau:

0I

IT hoặc 100%

0

I

IT (3.4)

Độ hấp thụ được định nghĩa như sau:

TA log (3.5)

Đối với hầu hết các ứng dụng, giá trị độ hấp thụ được áp dụng do mối tương quan giữa độ hấp

thụ với cả nồng độ và độ dài đường truyền thường là tuyến tính.

Đạo hàm phổ

Nếu một phổ đồ được biểu diễn thành độ hấp thụ (A) theo một hàm của bước sóng (), việc lấy

đạo hàm phổ sẽ như sau:

Bậc 0 fA (3.6)

Bậc nhất

'fd

dA (3.7)

Bậc hai

''2

2

fd

Ad (3.8)

Hình 3.5 dưới đây chỉ ra các tác động của việc lấy đạo hàm trên một băng hấp thụ Gaussian

đơn giản. Phổ đạo hàm luôn luôn phức tạp hơn so với phổ bậc 0.

Đạo hàm bậc nhất là tốc độ thay đổi độ hấp thụ theo bước sóng. Nó bắt đầu và kết thúc ở zero,

đi qua zero tại cùng bước sóng max của băng hấp thụ. Đạo hàm này có một băng dương và băng âm

với cực đại và cực tiểu tại cùng bước sóng là điểm uốn trong băng hấp thụ. Hàm trùng phương này

là đặc trưng của tất cả các đạo hàm bậc lẻ.


Đặc trưng phân biệt lớn nhất của đạo hàm bậc hai là một băng âm với cực tiểu nằm tại cùng

bước sóng là cực đại trên băng bậc zero. Đạo hàm này cũng chỉ ra hai băng vệ tinh dương trên mỗi

mặt của băng chính. Đạo hàm bậc 4 chỉ ra một băng dương tại cùng bước sóng là cực đại nằm trên

băng bậc 0. Các đạo hàm bậc chẵn cho thấy có một băng dương hoặc một băng âm với với cực tiểu

hoặc cực đại nằm tại cùng bước sóng là max trên băng hấp thụ.

Hình 3.5. Đạo hàm phổ của một băng hấp thụ Gaussian

Thu phổ đạo hàm

Các phương pháp quang học, điện tử hoặc toán học tất cả đều có thể được sử dụng để tạo ra phổ

đạo hàm. Mặc dù các kỹ thuật quang và điện tử được hình thành trên cơ sở phổ UV-Vis sơ đẳng,

những kỹ thuật này đã bị thay thế bởi các phương pháp toán học.

Để tính toán đạo hàm tại một bước sóng cụ thể (), một cửa sổ n điểm dữ liệu được lựa chọn,

và một đa thức được đưa ra nhờ vào phương pháp bình phương tối thiểu.

l

laaaaA ......2

210

Các hệ số a0….al tại mỗi bước sóng là các giá trị đạo hàm, ở đây a1 là đạo hàm bậc nhất, a2 là

đạo hàm bậc 2 và v…v… Savitzky và Golay phát triển một phương pháp hiệu quả hơn để thực hiện

những tính toán dựa trên cơ sở các thuật toán lấy đạo hàm có trong hầu hết các thiết bị thương mại.

Phương pháp này cũng làm trơn dữ liệu. Nếu bậc đa thức (l) nhỏ hơn so với số điểm dữ liệu (2n+1)

trong cửa sổ thì nhìn chung đa thức không thể đi qua được tất cả các điểm dữ liệu. Theo đó phép

bình phương tối thiểu sẽ tạo ra một xấp xỷ làm trơn với các điểm dữ liệu gốc.

Mặc dù việc chuyển đổi một phổ đồ UV-Vis thành đạo hàm bậc nhất hoặc bậc cao hơn của nó

thường mang đến một hiện trạng dữ liệu phức tạp hơn so với phổ hấp thụ bậc zero (xem hình 3.5),

thành phần thông tin bên trong không có gia tăng.

Các ứng dụng

Phổ đạo hàm có thể được sử dụng để cải thiện sự khác biệt giữa các phổ, để giải quyết sự chồng

chập các băng phổ trong phân tích định tính (xem mục xác nhận diện mạo) và điều quan trọng nhất


là giảm các hiệu ứng của ảnh hưởng từ sự phân tán, nền hoặc các hợp chất hấp thụ khác trong phân

tích định lượng (xem mục “Đạo hàm phổ”).

Signal-to-Noise

Một hiệu ứng không mong muốn của việc xử lý đạo hàm là sự suy giảm S/N với những bậc đạo

hàm cao hơn. Sự suy giảm này bắt nguồn từ hiệu ứng phân biệt đối xử (xem mục “Đạo hàm phổ”)

và từ thực tế là ồn luôn luôn có những đặc trưng sắc nét nhất trong phổ đồ. Theo đó nếu dữ liệu phổ

đồ được sử dụng trong tính toán đạo hàm nằm ở khoảng cách 2-nm, ồn sẽ có độ rộng băng 20nm,

S/N của đạo hàm bậc nhất sẽ 10 lần tồi hơn so với phổ bậc zero. Các thuộc tính làm trơn của kỹ

thuật Savitzky-Golay có thể được dùng để giảm bớt sự suy giảm S/N, nhưng phải cẩn thận với việc

sử dụng mức độ làm trơn quá cao sẽ làm méo mó phổ đạo hàm.

Những cân nhắc về trang thiết bị

Độ phân giải cao hơn của phổ đạo hàm đặt ra vấn đề gia tăng đòi hỏi về tính lặp lại của bước

sóng của thiết bị phổ. Lỗi bước sóng nhỏ có thể gây ra lỗi tín hiệu lớn hơn nhiều trong chế độ đạo

hàm hơn so với trong chế độ độ hấp thụ.

Hiệu ứng âm của việc lấy đạo hàm trên S/N cũng đặt ra vấn đề gia tăng nhu cầu trên đặc trưng

ồn thấp của thiết bị phổ. Nếu thiết bị phổ có thể quét và lấy trung bình nhiều phổ, S/N có thể được

cải thiện hơn trước khi lấy đạo hàm.

3.6.1.2 Phân tích định tính

Nhận diện - phổ và cấu trúc

Phổ UV-VIS nhìn chung cho thấy chỉ có các băng hấp thụ bị mở rộng một ít. Khi được so sánh

với các kỹ thuật như phổ hồng ngoại (kỹ thuật phổ này tạo ra nhiều băng phổ hẹp), phổ UV-VIS có

một mức độ hạn chế nhất định về thông tin định tính. Hầu hết độ hấp thụ của các hợp chất hữu cơ

hình thành từ sự có mặt của các liên kết . Một chromophore thường là một nhóm phân tử có chứa

liên kết . Khi liên kết này được đưa vào trong một dung dịch hydrocacbon bão hoà (dung dịch

hydrocacbon bão hoà biểu lộ không có phổ hấp thụ UV-VIS), nó tạo ra một hợp chất với độ hấp thụ

nằm giữa 185 và 1000 nm. Bảng 3.3 dưới đây liệt kê một số chromophore và bước sóng cực đại hấp

thụ của chúng.

Bảng 3.3. Các chromophore chọn lọc và cực đại hấp thụ của chúng

Chromophore Công thức Ví dụ max (nm)

Carbonyl (ketone) RR’C=O Acetone 271

Carbonyl (aldehyde) RHC=O Acetaldehyde 293

Carboxyl RCOOH Acetic acid 204

Amide RCONH2 Acetamide 208

Ethylene RCH=CHR Ethylene 193

Acetylene RC=CR Acetylene 173

Nitrile RC=N Acetonitril <160

Nitro RNO2 Nitromethane 271

Sự có mặt của một băng hấp thụ tại một bước sóng cụ thể thường là một chỉ thị tốt cho sự có

mặt của một chromophone. Tuy nhiên, vị trí của cực đại hấp thụ không cố định mà phụ thuộc một

phần vào môi trường phân tử của chromophore và trên dung môi mà mẫu hoà tan trong đó. Các

thông số khác như pH và nhiệt độ cũng có thể gây ra thay đổi cả về cường độ và bước sóng cực đại

hấp thụ.

Sự liên hợp liên kết đôi với thêm các liên kết đôi khác làm gia tăng cả cường độ lẫn bước sóng

của băng hấp thụ. Đối với một số hệ thống phân tử, ví dụ như các hydrocacbon hoặc các carotenoid

liên hợp, mối tương quan giữa cường độ và bước sóng đã được điều tra nghiên cứu một cách có hệ

thống.


Những kim loại chuyển tiếp cũng có các mức năng lượng điện tử hấp thụ trong vùng 400-

700nm dải VIS.

Xác nhận diện mạo

Mặc dù phổ đồ UV-VIS không có khả năng nhận diện một cách tuyệt đối về hợp chất chưa biết,

nhưng chúng thường được sử dụng để nhận diện diện mạo của một chất thông qua so sánh phổ thu

được với một phổ tham chiếu.

Khi các phổ đồ có đặc tính tương tự cao, việc lấy đạo hàm phổ có thể được áp dụng. Như đã chỉ

ra trong hình 3.6, số lượng băng hấp thụ gia tăng với các đạo hàm bậc cao hơn. Sự gia tăng tính

phức tạp của phổ đạo hàm có thể trở nên có ích trong phân tích định tính, hoặc cho mục đích mô tả

đặc trưng vật liệu hoặc cho mục đích nhận diện. Lấy ví dụ phổ hấp thụ của steroid testoteron cho

thấy chỉ có một băng hấp thụ rộng, duy nhất định tâm xung quanh 330nm, trong khi đó phổ đạo

hàm có đến 6 píc phân biệt rõ rệt.

Hiệu ứng cải thiện độ phân giải có thể có những ích lợi rõ rệt trong việc nhận diện hợp chất

chưa biết. Hình 3.6 chỉ ra một tính toán mô phỏng. Khi hai băng Gaussian với độ rộng băng phổ tự

nhiên 40-nm được tách khỏi nhau 30nm trong chế độ độ hấp thụ. Trong đạo hàm bậc 4, có thể nhận

thấy rõ ràng hai băng hấp thụ này với cực đại định tâm gần max của các băng thành phần.

Hình 3.6. Cải thiện độ phân giải

Mầu sắc

Mầu sắc là một thuộc tính quan trọng của một chất. Mầu sắc của một vật liệu liên quan đến khả

năng hấp thụ hoặc phản xạ của nó. Mắt người nhìn thấy mầu bù với mầu mà nó bị hấp thụ như chỉ

ra trong hình 3.7 và hình 3.8.


Hình 3.7. Sự truyền qua và mầu sắc

Hình 3. 8. Mầu được hấp thụ và mầu kết hợp tạo ra ánh sáng trắng

Trong thực tế cả sự hình thành và cảm giác về mầu sắc có tính phức tạp cao và phụ thuộc vào

nhiều yếu tố, trong đó có cả phổ của vật chiếu sáng và trong trường hợp của chất rắn là cấu trúc bề

mặt. Các hệ thống đo mầu chuyên dụng như CIE L*a*b và trang thiết bị để đo mầu đã được phát

triển. Khi được trang bị với phần mềm tương thích, hầu hết các thiết bị phổ có thể được dùng để đo

mầu. Thảo luận sâu hơn về vấn đề mầu sắc không nằm trong phạm vi mục đích của cuốn sách này.

Những thông tin định tính khác

Phổ UV-VIS có thể được sử dụng để xác định nhiều thông tin hoá lý của hợp chất và do đó nó

có thể cung cấp thông tin để nhận diện một hợp chất cụ thể nào đó. Lấy hai ví dụ như sau:

Nhiệt độ kết tinh protein và nucleic axit

Phổ hấp thụ của protein hình thành chủ yếu từ amino axit thơm tryptophan, tyrosine và

phenylalamine. Protein ở nhiệt độ phòng có một cấu trúc bậc ba đặc trưng hoặc ở dạng có một môi

trường điện tử đặc thù với các amino axit thơm. Nếu protein được gia nhiệt, tại một nhiệt độ nào đó

xảy ra sự trương nở hoặc tan chảy và làm mất đi cấu trúc của nó. Trong quá trình này, môi trường

điện tử của các axit amino thơm thay đổi, dẫn đến làm thay đổi hoặc làm trôi phổ.

Phép phân tích đa thành phần có thể được sử dụng để xác định xem có bao nhiêu trong số từng

amino axit thơm có mặt trong một protein nguyên trạng.


Deoxyribonucleic axit (DA) trong trạng thái tự nhiên của nó bao gồm hai dải phân tử

deoxyribose uốn xoắn ốc xung quanh cùng một trục. Các dải này được liên kết với nhau bằng liên

kết hydro giữa các bazơ purine và pyrimidine - adenine được nối với thymine (A-T) và guanine với

cytosine (G-C). Các bazơ này có khả năng phản hồi cho phổ hấp thụ UV của DNA với một cực đại

píc tại 260 nm. Trong bất kỳ hệ thống đa thành phần nào, độ hấp thụ quan sát được của bất kỳ phân

tử DNA nào bằng tổng của các độ hấp thụ độc lập:

ADNA = Aadenine + Aguanine + Acytosine + Athymine

Tuy nhiên độ hấp thụ quan sát được luôn luôn thấp hơn đáng kể so với giá trị mong đợi do liên

kết hydro giữa các bazơ làm thay đổi môi trường điện tử của chúng. Khi một phân tử bị gia nhiệt,

các liên kết hydro bị bẻ gãy, hai xoắn ốc bị duỗi ra và độ hấp thụ gia tăng đến phù hợp với mong

đợi từ tổng của tất cả các bazơ. Quá trình biến tính còn được biết đến dưới nghĩa tan chảy. Trong

một thực nghiệm tan chảy DNA, nhiệt độ của một dung dịch DNA được gia tăng theo kiểu bậc

thang, và độ hấp thụ tại 260 nm tại mỗi nhiệt độ được đo và được vẽ đồ thị thành một đường cong

tan chảy.

Điểm giữa của dải nhiệt độ xuất hiện sự tan chảy là giá trị Tm. Giá trị Tm của một mẫu DNA

cụ thể phụ thuộc chủ yếu vào tỷ lệ % của cặp G-C trong mẫu, mỗi cặp như vậy có chứa 3 liên kết

hydro (ngược lại mỗi cặp A-T chứa hai liên kết hydro). Nếu trong mẫu có tỷ lệ cặp G-C cao hơn sẽ

quan sát được giá trị Tm cao hơn.

Hoạt tính enzym

Hoạt tính enzym là một phép đo khả năng hoạt động của nó như một chất xúc tác. Nồng độ của

enzym có thể được biểu diễn theo đơn vị trên millilit và hoạt tính đặc trưng có thể được biểu diễn

theo đơn vị trên milligam protein. Khi một enzym được tinh chế, hoạt tính đặc trưng gia tăng đến

một giới hạn nào đó (giới hạn của enzym tinh khiết).

Do tốc độ phản ứng thay đổi với những yếu tố như nồng độ cơ chất, pH, cường độ ion và nhiệt

độ, những điều kiện mà dưới những điều kiện đó hoạt tính được xác định cần phải được xác lập một

cách chính xác. Những điều kiện này thường là các điều kiện thí nghiệm tối ưu tại một nhiệt độ cố

định (25, 30 hoặc 370C) với tất cả các cơ chất có mặt ở nồng độ bão hoà. Để xác định hoạt tính, một

hệ thống được thiết lập với nồng độ của các cơ chất và nếu cần là cả các coenzym đã biết trước. Đã

biết khối lượng enzym cho vào và tốc độ phản ứng được xác định. Chủ yếu phép đo hoạt tính

enzym được kiểm soát trong môi trường nghiên cứu khi các enzym được cô lập và tinh chế, và

trong sản xuất các kít xét nghiệm enzym, trong đó hoạt tính enzym phải nhất quán từ lô này sang lô

khác.

Cân nhắc về thiết bị

Độ chính xác tuyệt đối về bước sóng và độ chính xác tuyệt đối về phổ là rất quan trọng trong

phân tích định tính, đặc biệt là đối với việc nhận diện và xác nhận diện mạo của hợp chất chưa biết.

Thường thì phổ trên những thiết bị khác nhau được thu nhận ở những thời điểm khác nhau được

đem ra so sánh. Về vấn đề này, phổ có thể được đo tại độ phân giải thiết bị cụ thể.

3.6.1.3 Phân tích định lượng

Định luật Beer

Nếu có 100 photon ánh sáng đi vào một cell và chỉ có 50 ra khỏi mặt bên kia, độ truyền qua sẽ

là 0,5 hoặc là 50%. Nếu sau đó 50% này lại đi qua một cell tương tự, sẽ chỉ còn 25% đi ra…. Hình

3.9 chỉ ra đồ thị truyền qua theo độ dài đường truyền.


Hình 3. 9. Độ truyền qua và độ dài đường truyền – Định luật Bouguer Lambert

Vào năm 1760, Lambert đã lần đầu tiên thừa nhận công thức toán học của hiệu ứng này, mặc

dù vào năm 1729 cũng lần đầu tiên nó đã đuợc Bouguer công bố. Biểu diễn toán học là:

kbeI

IT

0 (3.9)

trong đó I0 là cường độ ánh sáng tới, I là cường độ ánh sáng truyền qua, e là cơ số logarit tự nhiên, k

là hằng số, b là độ dài đường truyền (thường tính theo cm).

Định luật của Beer tương tự với định luật của Bouguer, ngoại trừ nó được công bố theo khái

niệm nồng độ. Lượng ánh sáng bị hấp thụ tỷ lệ với số lượng các phân tử hấp thụ khi ánh sáng đi qua.

Hình 3.10 chỉ ra đồ thị độ truyền qua theo nồng độ.

Hình 3.10. Độ truyền qua và nồng độ - định luật Beer

Kết hợp hai định luật chúng ta có được định luật Beer-Bouguer-Lambert:

kbceI

IT

0

(3.10)

Trong đó c là nồng độ của các dạng hấp thụ (thường được biểu diễn theo g/lít hoặc mg/lít). Hàm

này có thể được chuyển thành dạng biểu diễn tuyến tính nhờ lấy logarit và thường được biểu diễn

theo dạng decadic:


bcI

I

I

ITA 0

0

logloglog (3.11)

Trong đó là hệ số tắt hay hệ số hấp thụ phân tử. Cách biểu diễn này được biết dưới cái tên phổ

biến là định luật Beer. Hình 3.11 chỉ ra đồ thị độ hấp thụ theo nồng độ.

Hình 3.11. Định luật Beer-Bouguer-Lambert

Hệ số tắt () là đặc trưng cho mỗi một cơ chất cụ thể, dưới một tệp các điều kiện được ấn định

chính xác, ví dụ như bước sóng, dung môi, nhiệt độ. Trong thực tế hệ số tắt đo được cũng phụ thuộc

một phần vào các đặc trưng của thiết bị được sử dụng. Đối với những vấn đề này, các giá trị hệ số

tắt đã xác định từ trước không được dùng cho phân tích định lượng. Thay vào đó, một đường chuẩn

(calibration curve) hay đường cong làm việc (working curve) cho cơ chất phân tích được xây dựng

sử dụng một hoặc nhiều dung dịch chuẩn với nồng độ chất phân tích biết trước.

Đối với các chuyển tiếp điện tử, hiệu số năng lượng giữa trạng thái cơ bản và trạng thái kích

thích là tương đối lớn. Do đó tại nhiệt độ phòng có thể xem tất cả các phân tử có điện tử nằm ở

trạng thái cơ bản. Sự hấp thụ và quay về trạng thái cơ bản là một quá trình diễn ra nhanh, cân bằng

đạt được rất nhanh. Theo đó độ hấp thụ ánh sáng UV-VIS có độ chính xác định lượng cao. Tương

quan tuyến tính đơn giản giữa độ hấp thụ và nồng độ và việc thưc hiện phép đo ánh sáng UV-VIS là

tương đối dễ dàng đã làm cho phổ UV-VIS trở thành cơ sở cho hàng nghìn phương pháp phân tích

định lượng.

Thừa nhận định luật Beer tuân theo phổ bậc 0, một tương quan tuyến tính tương tự giữa nồng độ

và biên độ tất cả các bậc phổ đạo hàm như sau:

Bậc 0: bcA (3.12)

Bậc nhất: bcd

d

d

dA

(3.13)

Bậc thứ n: bcd

d

d

Ad nn

''

(3.14)

Tại bước sóng , A là độ hấp thụ, là hệ số tắt, b là độ dài đường truyền mẫu và c là nồng độ

mẫu.

Đối với phép định lượng một thành phần, việc lựa chọn bước sóng với phổ đạo hàm khó khăn

hơn so với phổ hấp thụ do sự có mặt của cả píc âm lẫn píc dương. Các đạo hàm bậc chẵn có một píc


cực đại hoặc cực tiểu tại max như của phổ hấp thụ, nhưng đối với các đạo hàm bậc lẻ thì điểm này

là điểm cắt zero. Hiệu số giữa cực đại cao nhất và cực tiểu thấp nhất đưa ra S/N tốt nhất nhưng cũng

có thể làm gia tăng độ nhạy đối với các yếu tố ảnh hưởng từ những thành phần khác.

Các yêu cầu về mẫu

Để có được kết quả chính xác, mẫu được phân tích phải chỉ chứa thành phần hấp thụ, thành

phần này được thực hiện chuẩn (calibration). Nếu mẫu là một dung dịch, mẫu dung môi tinh khiết

phải được sử dụng làm mẫu trắng (blank). Nó có thể được dùng để hiệu chỉnh một thành phần ảnh

hưởng với một bước sóng thứ 2.

Phân tích đa thành phần

Phép phân tích đa thành phần sử dụng phổ UV-VIS đã được thực hiện như là đối với phép phân

tích một thành phần, nhưng do kỹ thuật được dùng trong phân tích đa thành phần thường cho kết

quả không đúng nên chúng không được áp dụng rộng rãi. Tuy nhiên ngày nay các thiết bị hiện đại

đã đưa ra được những kết quả chính xác hơn, và những kỹ thuật lập đường cong ăn khớp đã mang

lại những kết quả chính xác hơn – và có lẽ điều quan trọng hơn là vai trò chỉ thị khi các kết quả

không đúng. Về những lý do này phép phân tích phổ UV-VIS đa thành phần trở nên được ưa dùng

hơn.

Nguyên lý cộng

Theo định luật Beer, độ hấp thụ tỷ lệ với số lượng phân tử hấp thụ bức xạ tại bước sóng cụ thể.

Nguyên lý này đúng nếu như có mặt nhiều hơn một dạng hấp thụ. Tất cả các phương pháp định

lượng đa thành phần có cơ sở dựa trên nguyên lý độ hấp thụ của một hỗn hợp tại bất kỳ bước sóng

nào bằng tổng độ hấp thụ của từng thành phần tại bước sóng đó.

Phương pháp hàm mô phỏng đơn giản

Hướng đơn giản để phân tích đa thành phần là dựa trên những phép đo tại một số các bước

sóng bằng số lượng các thành phần có trong hỗn hợp. Thông thường những bước sóng được lựa

chọn là những bước sóng nằm tại cực đại hấp thụ của từng thành phần. Để chuẩn thiết bị

(calibration). Độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn thành phần tinh khiết đã biết trước nồng độ được

đo để xác định hệ số tắt cho mỗi thành phần tại từng bước sóng được chọn.

Do đó đối với hai thành phần x và y, hàm sẽ là:

yyxxyxyx bcebceAAA ''''' (3.15)

và

yyxxyxyx bcebceAAA '''''''''' (3.16)

Trong đó A’ là độ hấp thụ tại bước sóng ‘, A’’ là độ hấp thụ tại bước sóng ‘’, e’ là hệ số hấp thụ

mol tại bước sóng ‘ và e’’ là hệ số hấp thụ mol tại bước sóng ‘’, c là nồng độ và b là độ dài đường

truyền.

Những hàm này được giải một cách dễ dàng để xác định nồng độ từng thành phần. Nếu luôn

luôn có được những phép đo lý tưởng thì có thể đạt được kết quả chính xác ngay cả với hỗn hợp đa

thành phần phức tạp và với các phổ đồ rất giống nhau. Tuy nhiên trong thực tế luôn luôn xuất hiện

lỗi các phép đo. Những lỗi như vậy tác động đáng kể lên độ chính xác kết quả phép đo khi các phổ

đồ có sự chồng chập đáng kể. Hình 3.12 chỉ ra một hỗn hợp hai thành phần được mô phỏng là

không có chồng chập phổ tại các cực đại hấp thụ.


Hình 3.12. Một hỗn hợp hai thành phần với ít sự chồng chập phổ đồ

Nhưng ngược lại, hình 3.13 chỉ ra một hỗn hợp hai thành phần được mô phỏng với sự chồng

chập đáng kể các phổ đồ tại cực đại hấp thụ.

Hình 3.13. Một hỗn hợp hai thành phần với sự chồng chập phổ đáng kể

Đối với một hỗn hợp x và y mà trong đó cx = cy = 1, độ hấp thụ đo được sẽ là:

Với ít chồng chập phổ Với chồng chập phổ đáng kể

A’(x+y) = 1.1 + 0.0 = 1.1 A’(x+y) = 0.6 + 0.5 = 1.1

A’’(x+y) = 0.0 + 0.9 = 0.9 A’’(x+y) = 0.4 + 0.5 = 0.9

Nếu xuất hiện 10% lỗi trong phép đo trong phép đo A’(x+y) và A’’(x+y), mà lúc này A’(x+y) = 0,99

(-10%) và A’’(x+y) = 0,99 (+10%) thì việc tính toán các kết quả định lượng được đưa ra như trong

bảng 3.4 dưới đây.


Bảng 3.4. So sánh kết quả phân tích đa thành phần cho ví dụ với ít sự chồng chập

và với sự chồng chập đáng kể các phổ đồ

Thành

phần

Nồng độ

danh nghĩa

Ít sự chồng chập phổ Chồng chập phổ đáng kể

Nồng độ tính

được

% lỗi Nồng độ tính

được

% lỗi

x 1 0,9 -10% 0,0 -100%

y 1 1,1 +10% 1,98 +10%

Phương pháp bình phương tối thiểu

Có thể giảm tác động do nền ngẫu nhiên gây ra nhờ thông qua việc sử dụng thêm thông tin phổ,

đó là dùng một dãy các điểm dữ liệu để định lượng thay vì chỉ dùng 2. Đây là trường hợp của cái

gọi là hệ thống overdetermined, phép bình phương tối thiểu sẽ khớp các phổ chuẩn với phổ đo được

của mẫu để đưa ra các kết quả định lượng. Hình 3.14 miêu tả một phổ hỗn hợp hai thành phần trong

hình 3.13 với lỗi ngẫu nhiên 10% tại từng điểm đo.

Hình 3.14. Phổ hỗn hợp với 10% lỗi ngẫu nhiên tại từng bước sóng

Với 21 điểm dữ liệu (khoảng cách 2-nm trên dải 200-240nm), kết quả định lượng từ phương

pháp bình phương tối thiểu có lỗi nhỏ hơn 1% khi được so sánh với lỗi xấp xỷ 100% từ những phép

đo thông thường chỉ tại hai bước sóng, như chỉ ra trong bảng 3.5 dưới đây:

Bảng 3.5. So sánh các kết quả phân tích đa thành phần từ phương pháp hàm đồng thời đơn giản và từ phương pháp bình phương

tối thiểu

Thành phần Nồng độ

danh nghĩa

Chỉ dùng 210-230nm Sử dụng 200-240nm

Nồng độ

tính được

% lỗi Nồng độ tính

được

% lỗi

x 1 0,0 -100% 1,003 +0,3%

y 1 1,98 +98% 0,995 - 0,5%

Phương pháp này cho phép phân tích những hỗn hợp phức tạp hơn và những hỗn hợp đa thành

phần đơn giản có các phổ đồ tương tự nhau. Phần dư từ tính toán bình phương tối thiểu là một sự

chỉ thị tốt cho việc phổ chuẩn ăn khớp với phổ mẫu tốt đến như thế nào và do đó đó là một chỉ thị

tốt về độ chính xác các kết quả phân tích có thể đạt được.

Một ví dụ về phép phân tích đa thành phần là việc định lượng 5 hemoglobin trong máu cùng

với việc giảm thiểu công việc chuẩn bị mẫu. Hình 3.15 chỉ ra phổ hấp thụ của các dẫn xuất


hemoglobin. Trước đây phép phân tích này đã được thực hiện sử dụng các kỹ thuật phân tích khác

nhau, bao gồm cả phương pháp phổ và phương pháp chuẩn độ.

Hình 3.15. Phổ hấp thụ các dẫn xuất hemoglobin

Các phương pháp khác

Các hướng giải quyết thống kê khác đối với phép phân tích đa thành phần khác gồm phương

pháp bình phương tối thiểu không hoàn chỉnh hay còn gọi là phương pháp bình phương tối thiểu

cục bộ (Partial Least Squares – PLS), phương pháp hồi quy thành phần cơ bản (Principle

Component Regression – PCR) và phương pháp bình phương tối thiểu đa bội (Multiple Least

Squares – MLS). Về lý thuyết thì các phương pháp này có một số lợi thế hơn so với các phương

pháp đã mô tả ở trên, nhưng trong thực tế thì việc xử lý chuẩn (calibration) phức tạp hơn nhiều.

Yêu cầu đối với mẫu

Các phương pháp hàm đồng thời đơn giản và phương pháp bình phương tối thiểu chỉ mang đến

kết quả chính xác nếu việc chuẩn được tiến hành sử dụng các chuẩn tinh khiết hoặc hỗn hợp chuẩn

tinh khiết đối với từng thành phần trong mẫu có đóng góp vào phổ UV. Mẫu chưa biết phải không

có bất kỳ khả năng hấp thụ thêm nào khác.

Yêu cầu về trang thiết bị

Phép định lượng đơn thành phần thường thực hiện nhờ đo trên cùng thiết bị một chuẩn hoặc

một loạt chuẩn và theo sau đó là mẫu chưa biết thành phần. Việc xử lý chuẩn thiết bị như thế này

loại bỏ được sự thiên lệch của thiết bị, việc tạo ra độ chính xác bước sóng tuyệt đối và độ chính xác

phổ tuyệt đối tương đối là không quan trọng. Trong khi đó, độ lặp lại phổ là điều quan trọng để

mang lại kết quả chính xác. Nếu phép đo chỉ thực hiện tại bước sóng cực đại hấp thụ, độ tái lặp

bước sóng cũng ít quan trọng do tốc độ thay đổi thay đổi độ hấp thụ theo bước sóng chậm. Tuy

nhiên nếu sử dụng bước sóng nằm trên một mặt của băng phổ thì độ lặp lại của bước sóng là rất

quan trọng. Cuối cùng thì dải tuyến tính thiết bị là một yếu tố mang tính tới hạn, khi mà việc xử lý

chuẩn nằm trên tương quan tuyến tính.

Phép phân tích đa thành phần đòi hỏi S/N phải là tuyệt vời, đặc biệt là trong trường hợp

phương pháp hàm đồng thời đơn giản được sử dụng. Trong phương pháp bình phương tối thiểu, dữ

liệu từ các mặt của các băng hấp thụ được tích hợp vào trong tính toán, mang đến độ tái lặp bước

sóng tuyệt vời. Hơn thế nữa do yêu cầu nhiều dữ liệu, thiết bị cần có khả năng quét nhanh để mang

lại độ lặp cao.


3.6.1.4 Định lượng gián tiếp

Dẫn xuất hoá hoá học

Do nhiều hợp chất biểu lộ hoặc rất yếu hoặc không có khả năng hấp thụ trong vùng UV hoặc

vùng VIS, một số phương pháp sử dụng phép dẫn xuất hoá hoá học đã được khai thác. Thường

những phương pháp như vậy có dùng đến một tác nhân hữu cơ thêm vào, tạo ra một phức với khả

năng hấp thụ mạnh. Giai đoạn đo cuối cùng gần giống với phép đo của phương pháp trực tiếp. Với

kỹ thuật này, việc chọn một tác nhân phù hợp có thể cải thiện đáng kể cả độ nhạy và độ chọn lọc.

Chuẩn độ phổ

Trong phân tích thể tích, sự thay đổi mầu sắc biểu thị cho điểm kết thúc quá trình chuẩn độ

thường được phát hiện thông qua quan sát bằng mắt. Quá trình này vốn dĩ dựa trên yếu tố chủ quan

và có thể là nguồn gây ra lỗi. Việc sử dụng thiết bị phổ để xác định điểm kết thúc đã đưa yếu tố

khách quan vào phép phân tích.

Các xét nghiệm động học enzym

Phân tích trực tiếp UV-VIS một thành phần trong các nền sinh học, lấy ví dụ trong nền máu

hoặc thực phẩm là một công việc khó khăn. Yếu tố ảnh hưởng từ các thành phần khác thường làm

mất đi khả năng đo trực tiếp một thuộc tính đặc trưng nào đó, ví dụ thuộc tính hấp thụ. Việc tách

hợp chất quan tâm có thể tốn kém và mất thời gian và do đó phi thực tế đối với phân tích thường

nhật.

Xét nghiệm enzym có thể được sử dụng trong phân tích gián tiếp một hợp chất hoặc một nhóm

các hợp chất trong một nền phức tạp. Nếu enzym được lựa chọn một cách cẩn thận, thì bất kỳ sự

thay đổi nào trong mẫu trong mẫu sau khi thêm enzym sẽ chỉ là từ phản ứng của hợp chất hoặc các

hợp chất đặc trưng. Sự chọn lọc này là cơ sở của các xét nghiệm enzym.

Các xét nghiệm enzym đại khái được chia thành 2 kiểu: xét nghiệm tốc độ và xét nghiệm điểm

kết thúc. Tốc độ của một enzym phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm có nhiệt độ, pH, hoạt tính

enzym, nồng độ enzym và nồng độ cơ chất. Tuy nhiên nếu tất cả các thông số khác được kiểm soát

ở một mức không đổi thì tốc độ phản ứng tỷ lệ trực tiếp với nồng độ cơ chất. Với xét nghiệm điểm

kết thúc, các điều kiện được lựa chọn sao cho cơ chất chuyển đổi hoàn toàn thành sản phẩm trong

phạm vi thời gian hợp lý (5-20 phút). Hiệu số giữa độ hấp thụ ban đầu và độ hấp thụ cuối cùng tỷ lệ

trực tiếp với lượng cơ chất.

3.6.1.5 Trang thiết bị

Một cách lý tưởng thì các thiết bị phân tích luôn luôn tạo ra các phép đo chính xác một thông

số hoá học hoặc thông số hoá lý, nhưng trong thực tế tất cả các thiết bị đều có lỗi. Trong mục này

chúng ta sẽ xem xét các cấu kiện cơ bản của một thiết bị phổ và các cấu hình thiết bị hiện có. Các

thông số thiết bị then chốt và những tác động bất lợi tiềm ẩn của chúng trên các giá trị đo được cũng

được thảo luận.

Thiết kế thiết bị

Các cấu kiện

Một thiết bị phổ là thiết bị dùng để đo độ truyền qua hoặc độ hấp thụ của mẫu thành một hàm

của bước sóng bức xạ điện từ. Những thông số then chốt của một thiết bị phổ là:

Một nguồn sáng để tạo ra băng rộng bức xạ điện từ,

Một thiết bị tán sắc để lựa chọn từ bức xạ băng rộng của nguồn một bước sóng cụ thể (hay

đúng hơn là một băng sóng),

Một vùng chứa mẫu,

Một hoặc nhiều detector để đo cường độ bức xạ.


Ngoài ra còn có các cấu kiện quang học khác như thấu kính, gương, rơle ánh sáng chạy qua

thiết bị.

NGUỒN SÁNG

Nguồn sáng lý tưởng sẽ tạo ra cường độ ánh sáng không đổi trên tất cả các bước sóng với ồn

thấp và độ ổn định dài hạn. Tuy nhiên thật không may là không thể có được một nguồn sáng như

vậy. Có hai nguồn sáng được dùng phổ biến trong các thiết bị phổ UV-VIS.

Nguồn thứ nhất là đèn hồ quang dơtơri, đèn này tạo ra cường độ

ánh sáng tốt và liên tục trong vùng UV và cường độ sáng hữu ích

trong vùng VIS (Hình 3.16). Mặc dù đèn hồ quang dơtơri hiện đại

có ồn thấp, ồn từ đèn vẫn là một yếu tố hạn chế trong hiệu quả ồn

tổng thể của thiết bị. Theo thời gian, cường độ của ánh sáng từ đèn

hồ quang dơtơri giảm một cách đều đặn. Một đèn như vậy điển

hình có bán tuổi thọ (thời gian để cường độ giảm xuống một nửa

giá trị khởi đầu của nó) xấp xỷ 1000 giờ.

Nguồn thứ 2 là đèn tungsten-halogen (xem hình 3.17) mang lại

cường độ tốt trên một phần phổ UV và trên toàn bộ dải VIS. Kiểu

đèn này có ồn rất thấp và trôi thấp, có thời gian sử dụng hữu ích

điển hình là 10000 giờ.

Hầu hết các thiết bị phổ được dùng để đo dải UV-VIS đều có cả hai

kiểu đèn. Trong những thiết bị như vậy, hoặc phải dùng đến một bộ

lựa chọn nguồn để bật chuyển giữa các đèn phù hợp, hoặc ánh sáng

từ hai nguồn được trộn lại với nhau để tạo ra một nguồn băng rộng

duy nhất.

Một nguồn sáng khác là đèn Xe (xem hình 3.18), đèn này tạo ra

một nguồn liên tục tốt trên toàn bộ vùng UV và VIS. Tuy nhiên do

ồn từ đèn Xe hiện có là đáng kể hơn so với đèn hồ quang dơtơri và

đèn tungsten, nên đèn Xe chỉ được dùng cho các ứng dụng như các

phép đo phản xạ khuyếch tán, trong những phép đo này cường độ

ánh sáng là mối quan tâm chính.

CÁC THIẾT BỊ TÁN SẮC

Các thiết bị tán sắc làm cho những bước sóng khác nhau của ánh sáng được tán sắc tại những

góc khác nhau. Khi kết hợp với một khe ra thích hợp, những thiết bị này có thể được dùng để lựa

chọn một bước sóng cụ thể (hay đúng hơn là một băng sóng hẹp) của ánh sáng từ một nguồn liên

tục. Có hai kiểu thiết bị tán sắc là lăng kính và cách tử nhiễu xạ được dùng phổ biến trong các thiết

bị phổ UV-VIS.

Lăng kính tạo ra cầu vồng từ ánh sáng mặt trời. Cũng nguyên lý này được áp dụng vào trong

thiết bị phổ. Lăng kính đơn giản và rẻ tiền, nhưng lại tạo ra sự tán sắc góc phi tuyến (hình 3.19a).

Hơn nữa góc phân tán lại nhạy với nhiệt độ.

Hình 3.16. Cường độ phổ của đèn

hồ quang dơtorium

Hình 3.17. Cường độ phổ của đèn

Tungsten-halogen

Hình 3.18. Cường độ phổ của đèn Xe


Khắc phục những lý do này, hầu hết các thiết bị phổ hiện đại

đều có cách tử thay cho lăng kính. Những thiết bị này được làm

từ thuỷ tinh tinh khiết, trên đó được kẻ những rãnh soi rất hẹp.

Theo truyền thống thì công việc này được thực hiện bằng cơ

học, nhưng các thiết bị sản xuất hiện đại đã sử dụng quy trình

xử lý quang học nhiễu xạ. Kích thước của các rãnh soi cùng bậc

như nhau khi bước sóng ánh sáng được tán sắc. Cuối cùng một

lớp phủ Al được áp lên để tạo ra nguồn phản xạ. Ánh sáng đến

cách tử được phản xạ theo những góc khác nhau, tuỳ thuộc vào

bước sóng. Cách tử nhiễu xạ tạo ra tán sắc góc tuyến tính với

bước sóng và không nhạy nhiệt độ. Tuy nhiên chúng phản xạ

ánh sáng theo các bậc khác nhau, có sự chồng chập (xem hình

3.19b). Hệ quả là phải dùng đến bộ lọc để bảo đảm chỉ có ánh

sáng từ bậc phản xạ mong muốn đến được detector. Cách tử

lõm đồng thời vừa phản xạ vừa hội tụ ánh sáng.

Một hệ đơn sắc sẽ bao gồm một khe vào, một thiết bị tán sắc và một khe ra. Lý tưởng thì ra khỏi

hệ thống đơn sắc sẽ là ánh sáng đơn sắc. Tuy nhiên trên thực tế ra khỏi hệ đơn sắc luôn luôn là một

băng phổ, hình dạng cân đối về mặt quang học. Độ rộng của băng tại nửa chiều cao của nó là độ

rộng băng của trang thiết bị (IBW)

BỘ PHÁT HIỆN TÍN HIỆU

Detector chuyển tín hiệu ánh sáng thành tín hiệu điện. Lý tưởng thì nó sẽ tạo ra một phản hồi

tuyến tính trên một dải rộng cùng với ồn thấp và độ nhạy cao. Thông thường các thiết bị phổ có

hoặc là một detector ống nhân quang điện hoặc là một detector photodiod.

Ống nhân quang điện (hình 3.20) kết hợp việc chuyển đổi

tín hiệu với một vài giai đoạn khyếch đại vào trong phạm vi

thân ống. Đặc tính tự nhiên của vật liệu chế tạo catốt xác định

độ nhạy phổ. Chỉ một nhân quang điện duy nhất đã có thể mang

lại độ nhạy tốt trên toàn bộ dải UV-VIS. Kiểu detector này có

độ nhạy cao ở mức ánh sáng thấp. Tuy nhiên trong các ứng

dụng phổ phân tích, khái niệm độ nhạy cao có liên quan đến

nồng độ thấp, kéo theo độ hấp thụ thấp, dẫn đến yêu cầu về

mức cường độ cao. Để phát hiện chính xác những khác biệt nhỏ

giữa phép đo mẫu trắng và mẫu, detector phải có được ồn thấp

ở mức cường độ cao.

Theo đà phát triển, các photodiod được dùng làm detector trong các thiết bị phổ (hình 3.21).

Các bộ phát hiện photodiod có dải động học rộng hơn và là những thiết bị liên tục (solid-state), hoạt

động mạnh mẽ hơn so với các detector ống nhân quang điện.

Trong một photodiod, ánh sáng tập trung lên vật liệu bán dẫn làm cho các điện tử chạy qua nó,

làm suy giảm điện tích trong tụ điện kết nối qua vật liệu. Lượng điện tích cần để tích điện lại tụ điện

tại những khoảng cách đều đặn tỷ lệ với cường độ ánh sáng. Các photodiod thời kỳ đầu có độ nhạy

thấp trong dải UV thấp, nhưng vấn đề này đã được khắc phục trong các detector hiện đại. Giới hạn

phát hiện trong dải xấp xỷ 170-1100 nm đối với các detector gốc silicon.

Hình 3.20. Detector ống nhân quang

Hình 3.19. Thiết bị tán sắc


Hình 3.21. Bộ phát hiện photodiod

Một số các thiết bị phổ hiện đại có cả một dãy (có lúc còn gọi là mảng) các bộ phát hiện

photodiod thay vì chỉ có một bộ phát hiện duy nhất. Mảng diod bao gồm một loạt các bộ phát hiện

photodiod được định vị sát cạnh nhau trên một tinh thể silicon. Mỗi diod có một tụ điện riêng biệt

và được nối nhờ bộ phận chuyển mạch liên tục (solid-state switch) đến đường ra chung. Các cái

chuyển mạch được điều khiển bằng bộ ghi nhớ trôi (drift register) (hình 3.22). Ban đầu các tụ điện

được tích điện đến một mức cụ thể. Khi photon xâm nhập vào sillicon, điện tích tự do di chuyển

làm tụ điện phóng điện. Tụ điện được nạp lại ở những khoảng cách đều đặn tương ứng với chu kỳ

của mỗi vòng quét.

Hình 3.22. Sơ đồ một photodiod array

Lượng điện tích cần để nạp lại các tụ điện tỷ lệ với số lượng photon được phát hiện bởi diod,

theo đó tỷ lệ với cường độ ánh sáng. Ta thu được phổ hấp thụ nhờ đo sự dao động cường độ ánh

sáng trên toàn bộ dải sóng. Điển hình thì một mảng diod nằm giữa 200 và 1000 chi tiết tuỳ thuộc

vào thiết bị và ứng dụng mong đợi. Hãng Agilent có thiết bị phổ với 1024 diod và vùng đo nhạy

phổ xấp xỷ 25 x 0,5mm. Chu kỳ đọc tín hiệu ra tương ứng với thời gian chiếu sáng là 100ms.

Công nghệ chế tạo mảng diod giống với công nghệ vi xử lý. Mảng diod là thiết bị phức tạp

nhưng do chúng ở trạng thái liên tục nên có độ tin cậy rất cao

HỆ THỐNG QUANG HỌC


Hoặc các thấu kính hoặc các gương lõm được sử dụng để định lại hướng và hội tụ ánh sáng

chạy qua thiết bị. Các thấu kính đơn giản thì không đắt tiền nhưng bị quang sai mầu, tức là ánh sáng

tại những bước sóng khác nhau không hội tụ được chính xác tại cùng một điểm trong không gian.

Tuy nhiên với những thiết kế cẩn thận, chi tiết thì các quang sai mầu của các thấu kính độc lập

trong một hệ thống quang có thể được dùng để khử lẫn nhau, và một hệ thống quang hiệu quả có

thể được chế tạo với các cấu kiện đơn giản và không đắt tiền này.

Các thấu kính không mầu (tiêu sắc) kết hợp nhiều thấu kính của các loại thuỷ tinh khác nhau với

chỉ số khúc xạ khác nhau vào trong một thấu kính phức hợp, thấu kính như thế này không có quang

sai màu ở phạm vi rộng. Những thấu kính như vậy được dùng trong camera. Chúng mang lại hiệu

quả cao nhưng chi phí tương đối cao.

Các gương lõm rẻ tiền hơn so với chế tạo thấu kính tiêu sắc và hoàn toàn không có quang sai

mầu. Tuy nhiên bề mặt nhôm dễ bị ăn mòn dẫn đến mất hiệu quả.

Tại mỗi điểm của bề mặt quang học, bao gồm cả những phần nằm giữa các cấu kiện trong một thấu

kính tiêu sắc có từ 5-10% ánh sáng bị mất thông qua sự hấp thụ hoặc phản xạ. Lý tưởng thì những thiết

bị phổ như vậy cần được thiết kế với số lượng bề mặt quang học tối thiểu.

Các thiết bị phổ phổ thông

Hình 3.23 chỉ ra sơ đồ một thiết bị phổ một chùm tia phổ thông. Ánh sáng đa sắc từ nguồn sáng

được hội tụ lên khe vào của một hệ thống đơn sắc, khe này cho phép truyền chọn lọc một băng ánh

sáng hẹp, ánh sáng tiếp tục đi qua vùng mẫu đến detector. Độ hấp thụ của mẫu được xác định nhờ

đo cường độ của ánh sáng đến detector khi không có mẫu (blank) và so sánh với cường độ ánh sáng

đến detector sau khi đi qua mẫu. Như đã thảo luận ở trên, hầu hết các thiết bị phổ có hai nguồn sáng,

một đèn dơtơri và một đèn tungsten và sử dụng hoặc ống nhân quang điện hoặc gần đây là các

photodiod làm detector.

Hình 3.23. Sơ đồ một thiết bị phổ phổ thông

Thiết kế này phù hợp để đo độ hấp thụ tại một điểm trong phổ. Tuy nhiên nó ít phù hợp hơn

khi đo những hợp chất khác nhau tại những bước sóng khác nhau, hoặc khi dùng đo thu phổ đồ của

mẫu. Để thực hiện những nhiệm vụ như vậy trên các thiết bị phổ phổ thông, các bộ phận của hệ

thống đơn sắc phải xoay, dẫn đến vấn đề sẽ đưa vào phép đo tính kém tái lặp lại cơ học. Hơn thế

nữa việc thu nhận sery dữ liệu vốn dĩ đã là một quá trình chậm.

Thiết bị phổ diod array


Hình 3.24 chỉ ra sơ đồ một thiết bị phổ diod array. Ánh sáng đa sắc từ nguồn sáng đi qua vùng

mẫu và được hội tụ lên khe vào của hệ thống đa sắc. Hệ thống đa sắc phân tán ánh sáng lên trên một

mảng diod, trên đó mỗi diod đo một băng phổ hẹp. Độ rộng băng ánh sáng được phát hiện bởi một

diod có liên quan đến kích thước khe vào của hệ thống đa sắc và kích thước của diod. Mỗi một diod

có chức năng như khe ra trên hệ thống đơn sắc.

Hình 3.24. Sơ đồ của một thiết bị phổ mảng diod

Hệ thống đa sắc (khe vào cộng thêm thiết bị tán sắc) và mảng diod kết hợp lại trong một thiết bị

được xem như là một thiết bị ghi phổ. Do các vị trí tương đối của mẫu và thiết bị tán sắc khi so sánh

với thiết bị phổ phổ thông đã bị đảo ngược, cấu hình này thường được xem như là hệ quang ngược.

Để giảm thiểu các phản ứng quang hoá có thể xảy ra, một màn trập (chớp) được sử dụng để

ngăn chặn ánh sáng từ nguồn cho đến khi một phép đo có thể được thực hiện hoàn tất. Khi phép đo

được khởi động, cửa chập tự động mở ra và ánh sáng đi qua mẫu đến mảng các diod. Sự khác biệt

về cường độ ánh sáng khi đến detector giữa có và không có mẫu được đo như đã mô tả trong phần

“Các thiết bị phổ phổ thông” ở trên. Vốn dĩ thì một thiết bị phổ mảng diod rất nhanh nhờ vào những

khả năng quét điện tử và thu nhận dữ liệu song song của nó, độ tái lặp bước sóng là tuyệt vời và có

độ tin cậy cao.

Cấu hình

Về mặt thương mại đã có nhiều cấu hình thiết bị phổ khác nhau. Mỗi một cấu hình lại có những

lợi thế và bất lợi riêng của nó.

THIẾT KẾ MỘT CHÙM TIA

Cả các thiết bị phổ phổ thông và thiết bị mảng diod đều là loại một chùm tia. Các thiết bị một

chùm tia có chi phí chế tạo thấp, và hệ thống quang đơn giản mang đến khả năng truyền dẫn xuyên

suốt (throughput) cao và do đó có độ nhạy cao. Các thiết bị phổ tham chiếu do các Viện nghiên cứu

chất chuẩn Quốc gia sử dụng như Viện Chuẩn và Công nghệ Quốc gia (NIST) ở Hoa Kỳ và Viện

Vật lý Quốc gia (NPL) ở Anh quốc là các thiết bị một chùm tia.

Trong thực tế, các thiết bị phổ mảng diod khá phù hợp với cấu hình một chùm tia do phổ được

thu nhận rất nhanh và do khoảng cách về thời gian giữa phép đo mẫu trắng và phép đo mẫu được

giảm thiểu. Thêm vào đó phép tham chiếu nội tại (internal referencing) có thể được dùng để giảm

hơn nữa các tác động của hiện tượng đèn trôi.

Hình 3.25 chỉ ra hệ thống quang học của một thiết bị phổ mảng diod hiện đại. Cấu hình một

chùm tia này có một số lượng các cấu kiện quang học tối thiểu mang lại hiệu quả truyền dẫn cao

nhất và có một mảng diod 1024-element dùng đo dải sóng từ 190 đến 1100 nm với độ phân giải tốt.


Hình 3.25. Sơ đồ quang của một thiết bị mảng diod hiện đại

THIẾT KẾ HAI CHÙM TIA

Trong thiết bị phổ một chùm tia phổ thông, mẫu trắng và mẫu được đo liên tiếp với khoảng cách

vài giây đối với phép đo một bước sóng và lên đến vài phút đối với phép đo toàn dải phổ trên một

thiết bị phổ thông. Đèn trôi có thể dẫn đến đáng kể lỗi trên những khoảng thời gian kéo dài.

Thiết bị phổ hai chùm tia được phát triển để bù trừ cho những thay đổi về cường độ đèn này

giữa phép đo cuvet mẫu trắng và phép đo cuvet mẫu. Trong cấu hình này có một chopper đặt trên

đường truyền quang gần với nguồn sáng. Chopper chuyển đổi đường truyền ánh sáng giữa một

đường quang tham chiếu và đường quang mẫu đến detector. Nó xoay ở tốc độ cho phép các phép đo

mẫu trắng và mẫu được luân phiên vài lần trong một giây, theo đó hiệu chỉnh được những thay đổi

trung hạn và dài hạn cường độ đèn (trôi).

Hình 3.26 chỉ ra một sơ đồ thiết bị phổ hai chùm tia. Khi so sánh với thiết kế một chùm tia, các

thiết bị hai chùm tia có nhiều cấu kiện quang học hơn., nó làm giảm khả năng truyền qua cũng nhử

cả độ nhạy. Để có độ nhạy cao đòi hỏi kéo dài thời gian đo. Thêm vào đó thiết kế cơ học phức tạp

hơn của thiết bị phổ hai chùm tia có thể làm cho độ tin cậy kém đi.

Hình 3.26. Hệ thống quang của một thiết bị phổ hai chùm tia


Về khía cạnh truyền thống thì độ ổn định cao hơn của các thiết bị hai chùm tia đã trở thành yếu

tố chính trong thiết kế các thiết bị phổ hiệu quả cao. Tuy nhiên những thành tựu đạt được trong thời

gian gần đây về thiết kế đèn và hệ thống điện tử đã cải thiện nhiều độ ổn định của các thiết bị phổ

một chùm tia và làm hồi sinh cấu hình này. Các thiết bị một chùm tia có độ nhạy cao hơn và dễ sử

dụng hơn nhiều, với độ trôi điển hình chỉ bằng một hệ số 2 xấu hơn so với của các thiết bị hai chùm

tia.

Thiết bị phổ mảng diod thương mại đầu tiên là một thiết kế đa tia (hình 3.27). Bộ quản lý tia

được dùng dẫn luân phiên các tia đi qua vị trí tham chiếu và nhiều đến 4 vị trí mẫu (trong hình chỉ

chỉ ra một vị trí).

Hình 3.27. Hệ thống quang của thiết bị phổ mảng diod thời kỳ đầu

THIẾT KẾ CHIA TIA

Các thiết bị phổ chia tia (xem hình 3.28) cũng tương tự như thiết bị phổ hai chùm tia nhưng sử

dụng bộ chia tia thay cho chopper để gửi đồng thời ánh sáng dọc theo đường truyền blank và đường

truyền mẫu đến hai detector tách biệt nhưng giống hệt nhau. Cấu hình này cho phép mẫu trắng và

mẫu được đo cùng lúc. Mặc dù thiết kế chia tia về mặt cơ học đơn giản hơn so với thiết bị hai chùm

tia đích thực và đòi hỏi có ít cấu kiện quang học hơn, thì việc sử dụng hai detector độc lập sẽ tạo ra

một nguồn gây trôi tiềm ẩn khác.

Hình 3.28. Hệ thống quang của một thiết bị phổ chia tia


Thiết kế này có độ ổn định cao, mặc dù không cao được như là thiết bị hai chùm tia do hai

detector có thể trôi độc lập, và có độ ồn tốt mặc dù không tốt được như là thiết bị một chùm tia do

ánh sáng bị chia và vì thế ánh sáng gửi qua mẫu < 100%.

THIẾT KẾ HAI BƯỚC SÓNG

Với thiết kế hai bước sóng, hai bước sóng có thể được đo đồng thời đối với những ứng dụng đặc

trưng, ví dụ nghiên cứu hai phản ứng cùng xảy ra trong một mẫu. Hệ thống đơn sắc có hai thiết bị

tán sắc với đầu ra được kết hợp vào một chùm tia duy nhất. Điển hình thì thiết bị phức tạp này đắt

tiền hơn đáng kể so với các thiết bị phổ phổ thông và đã bị các thiết bị phổ mảng diod thay thế trên

diện rộng (các thiết bị đa bước sóng)

ĐO MỘT MẪU

Mức độ tương tác của mẫu với bức xạ (truyền qua và hấp thụ) được xác định nhờ đo cả cường

độ bức xạ đến (không có mẫu) và cường độ truyền qua (có mẫu). Tương ứng các giá trị cường độ

này được biểu thị là I0 và I.

Do hầu hết những mẫu được đo phổ UV-VIS nằm ở dạng dung dịch, cho nên mẫu trắng phải

được đo trên cuvett chứa dung môi tinh khiết được dùng để tách mẫu. Quá trình này loại trừ khỏi

phép đo mẫu bất kỳ độ hấp thụ nào gây ra bởi dung môi.

Với thiết bị một chùm tia, cuvett chứa dung môi được đặt trong thiết bị phổ và mẫu trắng được

đo. Dung dịch mẫu sau đó được đo trong cùng một cuvett như vậy. Tất cả các thiết bị hiện đại đều

tự động lưu giữ giá trị I0 tham chiếu, giá trị được sử dụng để tính toán các giá trị độ hấp thụ cho

mẫu.

Với các thiết bị hai chùm tia hoặc thiết bị chia tia cần đến 2 cuvett. Ban đầu cả hai cuvett được

nạp đầy dung môi tinh khiết và vì thế một phép đo được gọi là phép đo cân bằng được thực hiện.

Phép đo này phản ánh sự khác biệt về độ hấp thụ giữa hai đường truyền quang đang sử dụng. Sau

đó cuvett mẫu được nạp đầy dung dịch mẫu để đo, I0 và I được đo gần như là đồng thời. Phổ kết

quả được hiệu chỉnh nhờ trừ đi phổ cân bằng.

3.6.1.6 Các thông số thiết bị then chốt

Trong mục này chúng ta sẽ thảo luận về một số thông số thiết bị có tác động lên độ chính xác và

độ đúng của giá trị độ hấp thụ đo được. Nguồn gây ra lỗi phép đo có liên quan đến mẫu được mô tả

trong mục “Xử lý và đo mẫu” sau này.

Độ phân giải phổ

Độ phân giải phổ là một phép đo khả năng thiết bị phân biệt hai bước sóng liền kề. Thường thì

hai bước sóng được xem như phân giải nếu như cực tiểu giữa hai píc của tín hiệu ra detector thấp

hơn 80% so với cực đại. Điều kiện này được biết dưới cái tên tiêu chuẩn Rayleigh. Hình 3.29 chỉ ra

dưới dạng biểu đồ một trường hợp của hai vạch phát xạ liền sít nhau (tín hiệu vào thiết bị) và tín

hiệu hiện thời ra khỏi detector.


Hình 3.29. Định nghĩa độ phân giải

Hình 3.29. Định nghĩa độ phân giải

Độ phân giải có liên quan chặt chẽ đến độ rộng băng phổ thiết

bị (SBW). SBW được định nghĩa là độ rộng tại ½ cường độ

cực đại của băng ánh sáng rời khỏi hệ thống đơn sắc (xem

hình 3.30).

Độ chính xác của bất kỳ giá trị độ hấp thụ đo được nào phụ

thuộc vào tỷ lệ của SBW với độ rộng băng tự nhiên (NBW)

của cơ chất hấp thụ. NBW là độ rộng của băng hấp thụ mẫu

tại ½ cực đại hấp thụ (xem hình 3.31)

Một tỷ lệ SBW/NBW bằng 0,1 hoặc nhỏ hơn sẽ tạo ra được

phép đo hấp thụ với độ chính xác 99,5% hoặc tốt hơn. Ở tỷ lệ

SBW/NBW cao hơn 0,1%, phổ đo được dần trở nên biến dạng

hơn (hình 3.32). Các băng phổ có thể không được phân giải

một cách hợp lý và lỗi xuất hiện trong các giá trị độ hấp thụ

trở nên đáng kể tại hầu hết các bước sóng. Trước hết phải thấy

rằng SBW là một hàm của độ rộng khe vào và khe ra của hệ

thống đơn sắc và của độ tán sắc cách tử. Các mức độ phân giải

0,5; 0,2 và 0,1 là bình thường, nhưng những độ phân giải cao

hơn có thể làm suy biến đáng kể tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N.

Trong các thiết bị phổ hiện đại, khoảng cách lấy mẫu

(sampling interval) được dùng để số hoá phổ cho máy tính

đánh giá và lưu giữ cũng có tác động lên độ phân giải (trong

thiết bị phổ mảng diod, sự số hoá xuất hiện ngay trên mảng).

Hình 3.33 chỉ ra tác động này.

Hình 3.30. Độ rộng băng phổ thiết bị

Hình 3.31. Độ rộng băng phổ tự nhiên

Hình 3.31. Độ rộng băng phổ

tự nhiên


Nếu khoảng cách lấy mẫu là tương đối lớn so với SBW, độ phân giải của thiết bị sẽ bị suy giảm.

Khoảng cách lấy mẫu nhỏ hơn cải thiện độ phân giải nhưng lại dẫn đến dung lượng tệp tin phổ lớn

hơn nhiều, có thể gây khó khăn cho việc quản lý dữ liệu. Trên thực tế, thiết lập khoảng cách lấy

mẫu tốt nhất là bằng hoặc nhỏ hơn chút ít so với SBW.

Khi cân nhắc các yêu cầu về trang thiết bị, điều quan trọng là xác định xem độ phân giải nào

được yêu cầu. Như đã được thảo luận trong phần “Các nguyên lý và ứng dụng của phổ UV-VIS”,

băng hấp thụ trong phổ UV-VIS thường là khá rộng, đặc biệt là đối với mẫu trong dung dịch. Xấp

xỷ 99% các phép đo thường nhật, độ rộng băng phổ SBW 2nm là lớn hơn so với mức thích hợp để

tạo ra các phép đo băng hấp thụ chính xác với NBW 20nm hoặc cao hơn.

Nếu một thiết bị có SBW 2 nm được dùng để đo mẫu có NBW nhỏ hơn 20 nm (lấy ví dụ

benzen) sẽ gây ra lỗi đối với các phép đo hấp thụ tuyệt đối. Lỗi này gia tăng khi NBW giảm (xem

hình 3.32), trường hợp này cần đến một thiết bị có SBW hẹp hơn. Tuy nhiên hầu hết các phép đo

UV-VIS dùng để định lượng thường chỉ yêu cầu các phép đo tương đối (lấy ví dụ độ hấp thụ của

một nồng độ chưa biết tương đối so với độ hấp thụ của chuẩn). Một đường chuẩn được xây dựng,

trong dải chuẩn có chứa mức nồng độ mẫu chưa biết sẽ tạo ra kết quả định lượng chính xác ngay cả

đối với những băng rất hẹp

Độ chính xác và độ đúng bước sóng

Sự khác biệt giữa độ đúng và độ chính xác thường không được hiểu một cách rõ ràng (xem phần

phụ lục để được giải thích về sự khác nhau giữa độ đúng và độ chính xác). Độ đúng bước sóng quan

trọng đối với việc so sánh các phép đo thực hiện trên các thiết bị khác nhau. Tuy nhiên, trong hầu

hết các phép phân tích UV-Vis, các phép đo được thực hiện trên cùng thiết bị liên quan đến chuẩn

(standard) và độ chính xác bước sóng (đó là khả năng thiết lập lại) là vấn đề quan trọng nhất.

Hình 3.34 chỉ ra tác động của khả năng thiết lập lại bước sóng tồi. Nếu bước sóng tại cực đại

hấp thụ được lựa chọn cho phép đo định lượng, những lỗi bước sóng nhỏ xuất hiện khi thiết lập lại

thiết bị phổ đến bước sóng đó sẽ có tác động tối thiểu lên độ hấp thụ đo được. Phương pháp này

mang lại các kết quả định lượng lặp lại nhất. Nhưng ngược lại việc chọn bước sóng nằm trên mặt

dốc của băng hấp thụ, với cùng lỗi thiết lập lại bước sóng sẽ tạo ra đáng kể lỗi trong độ hấp thụ đo

được. Trong trường hợp này các kết quả định lượng trở nên không đáng tin cậy.

Tất cả các sách chuẩn về phổ UV-VIS đều nhấn mạnh rằng để định lượng chính xác phải lựa

chọn bước sóng phân tích tại cực đại hấp thụ, ngay cả dù các bước sóng khác có tạo ra độ chọn lọc

tốt hơn. Tuy nhiên những sách này viết dựa trên cơ sở các kỹ thuật quét cơ học phổ thông và không

áp dụng với các thiết bị mảng diod, những thiết bị hầu như đạt được khả năng tuyệt đối về việc thiết

lập lại bước sóng.

Hình 3.33. Tác động của việc số

hoá lấy mẫu Hình 3.32. Tác động của các SBW khác

nhau lên hình dạng băng phổ đo được


Hình 3.34. Tác động của khả năng thiết lập lại bước sóng tồi

Độ đúng và độ chính xác phổ

Thừa nhận rằng thiết kế quang học và thiết kế điện tử là tốt, chỉ có hai yếu tố tác động lên độ

đúng và độ chính xác phổ: sự phân tán ánh sáng và ồn.

Sự phân tán ánh sáng

Sự phân tán ánh sáng được định nghĩa là khi phát hiện được ánh sáng của bất kỳ bước sóng nào

nằm ngoài độ rộng băng của bước sóng được lựa chọn. Hàm được dùng để tính toán độ truyền qua

và do đó là độ hấp thụ như sau:

s

s

II

IIT

0

(3.17)

Trong đó T là độ truyền qua, I0 là cường độ ánh sáng tới, I là cường độ ánh sáng truyền qua, Is là

cường độ ánh sáng phân tán.

Cường độ của ánh sáng phân tán thường không phụ thuộc vào cường độ ánh sáng truyền qua.

Nếu Is vẫn gần như là hằng định, nó trở thành đối tượng lấn át ở mức I thấp. Tại độ hấp thụ cao, ánh

sáng phân tán gây ra sự hiệu dịch âm giá trị phản hồi thiết bị và rốt cuộc trở thành yếu tố hạn chế

đối với độ hấp thụ, theo đó là nồng độ có thể đo. Do đó độ đúng về phổ của thiết bị cần được bù trừ.

Hình 3.35 chỉ ra tác động của các mức ánh sáng phân tán khác nhau lên độ hấp thụ đo được khi

được so sánh với độ hấp thụ thực tế.

Hình 3.35. Tác động của ánh sáng phân tán lên độ hấp thụ mẫu đo được


Ồn

Điển hình một thiết bị phổ có hai yếu tố gây ồn. Yếu tố thứ nhất (ồn photon hay ồn Schott) hình

thành từ sự phân bố thống kê các photon phát ra bởi nguồn sáng, nó tỷ lệ với căn bậc 2 của cường

độ ánh sáng. Khi đo mẫu nồng độ thấp với độ hấp thụ thấp, yếu tố này có thể ngăn cản việc đo

chính xác sự khác biệt nhỏ giữa hai mức ánh sáng cao. Yếu tố gây ồn thứ hai vốn dĩ có sẵn từ hệ

thống điện tử của thiết bị (bộ khuyếch đại detector, bộ chuyển đổi analog-to-digital….) và yếu tố

này không lệ thuộc vào cường độ ánh sáng đo được. Yếu tố ồn này trở nên đáng kể tại những mức

độ hấp thụ cao, khi mà tín hiệu mẫu là rất nhỏ, nó có thể được giảm thiểu thông qua một thiết kế hệ

thống tốt.

Ồn có tác động âm lên độ chính xác các phép đo và đối với bất kỳ phép đo nào nó có thể gây ra

lỗi độ chính xác. Tuy nhiên ồn có thể giảm được nhờ gia tăng thời gian đo (xem phần “thời gian lấy

trung bình”)

Dải động học tuyến tính

Một chỉ số kỹ thuật thường được nêu ra và thường bị hiểu nhầm là dải thiết bị. Trong hầu hết các

trường hợp, dải thiết bị đơn giản là dải số mà một thiết bị có thể hiển thị. Một chỉ số kỹ thuật có ý

nghĩa hơn là dải động học tuyến tính, chỉ số này cho biết độ lệch có thể chấp nhận được từ các giá

trị độ hấp thụ tối thiểu và tối đa tuyến tính (tỷ lệ % của độ hấp thụ).

Lỗi tiềm ẩn tại những độ hấp thụ khác nhau có thể tính được từ ánh sáng phân tán và ồn.

Theo đó, phần trăm lỗi do ánh sáng phân tán là:

100A t

mt AA (3.18)

Trong đó At là độ hấp thụ đúng và Am là độ hấp thụ đo được, những giá trị này được tính như sau:

0

logI

IAt (3.19)

s

sm

II

IIA

0

log (3.20)

Trong đó I0 là cường độ ánh sáng tới, I là cường độ ánh sáng truyền qua và Is là cường độ ánh

sáng phân tán. Hình 3.35 chỉ ra đường cong lỗi chỉ do ánh sáng phân tán gây ra.

Thêm vào đó, độ hấp thụ đo được có thể bị lỗi do ồn thiết bị:

Do đó lỗi do ồn gây ra là:

100

A t

mt AA (3.21)

Trong đó 0

logI

IAt (3.22)

và enpntm AAT

AA 100

(3.23)

hoặc enpn AAT

100

Am (3.24)

Trong đó Apn là ồn photon trong AU, Aen là ồn điện tử trong AU và T là độ truyền qua theo tỷ

lệ %.


Lỗi tổng cộng tại bất kỳ bước sóng nào là tổng các lỗi do ánh sáng phân tán và do ồn gây ra.

Hình 3.36 miêu tả lỗi tổng cộng đối với một ví dụ có ồn photon là 0,0004 AU và ồn điện tử

0,0001AU. Đồ thị cho thấy các phép đo độ hấp thụ được tiến hành từ xấp xỷ 0,3 đến 1,0 AU có độ

đúng và độ chính xác cao nhất. Dải động học thiết bị có thể được xác định từ lỗi phép đo chấp nhận

được.

Hình 3.36. Lỗi độ hấp thụ lý thuyết so với độ hấp thụ

Trôi

Một yếu tố tiềm ẩn khác gây ra lỗi phổ là sự trôi. Bình thường thì hiện tượng trôi là do

những dao động cường độ đèn giữa phép đo I0 và phép đo I. Những thay đổi trong hệ thống điện tử

của thiết bị cũng gây ra trôi. Một thiết kế thiết bị tốt có thể giảm thiểu độ trôi, tác động này có thể

làm giảm độ chính xác các kết quả, đặc biệt là qua một thời gian làm việc kéo dài (xem hình 3.37).

Với dữ liệu đa bước sóng, vấn đề trôi có thể được giảm thiểu nhờ sử dụng những kỹ thuật như kỹ

thuật tham chiếu nội vi (ngay trong thiết bị).

Hình 3.37. Hiệu ứng độ trôi lên các giá trị độ hấp thụ đo được

3.6.1.7 Lấy mẫu và đo

Chấp nhận rằng chúng ta đã hiểu về những hạn chế thiết bị và thiết bị phổ được vận hành đúng

đắn, nguồn lớn nhất gây ra lỗi trong phổ UV-VIS liên quan đến việc lấy mẫu và hoá học về mẫu.

Trong phần này chúng ta sẽ thảo luận về những nguồn tiềm ẩn gây ra lỗi và các bước để phòng

tránh chúng.


Mẫu lỏng

Cell

Phổ UV-VIS được sử dụng chính để đo chất lỏng hoặc các dung dịch. Chế độ này đơn giản hơn

và cho phép thực hiện các phép phân tích định lượng chính xác hơn so với các phép đo hệ số phản

xạ trên mẫu rắn. Với kỹ thuật này, cell phải chứa chất lỏng hoặc dung dịch đặt trong vùng mẫu của

thiết bị phổ.

VẬT LIỆU CHẾ TẠO CELL

Lý tưởng cell trong suốt hoàn toàn tại tất cả các bước sóng do nếu có bất kỳ sự hấp thụ nào từ

bản thân cell sẽ làm giảm hiệu quả dải động học tuyến tính đối với mẫu. Lấy ví dụ nếu giới hạn trên

của dải động học tuyến tính thiết bị là 2,5 AU nhưng cell hấp thụ 1 AU, dải hữu ích còn lại đối với

mẫu nằm giữa 1 và 2,5 AU. Tức là chỉ còn lại 1,5 AU.

Cell có chi phí thấp nhất làm từ nhựa, thường thường là nhựa acrylic. Những cell này không

chịu được tất cả các loại dung môi và hấp thụ mạnh ở bước sóng dưới 300 nm, làm chúng không

phù hợp với những phép đo trong vùng này. Độ nhất quán (độ hấp thụ và độ dài đường truyền) có

thể thay đổi từ cell này đến cell khác, tuỳ thuộc vào nhà chế tạo.

Các cell thuỷ tinh đắt tiền hơn chút ít so với cell nhựa, nhưng lại bền hơn và nếu giữ gìn hợp lý

có thể cho phép sử dụng được vài năm. Thuỷ tinh hấp thụ mạnh dưới 320 nm và do đó không phù

hợp để đo trong vùng này.

Các cell thạch anh biến tính có độ trong suốt trung bình xuống tận dưới 210 nm. Cell loại tốt

nhất được sản xuất từ silica tổng hợp biến tính có độ tinh khiết cao và có độ trong suốt vừa phải

xuống dưới 190 nm.

Hình 3.38 chỉ ra các đặc trưng hấp thụ của các loại cell bằng vật liệu khác nhau. Lưu ý tất cả các

vật liệu đều cho thấy mất đi tối thiểu xấp xỷ 10% độ truyền qua tại tất cả các bước sóng.

Hình 3.38. Các đặc trưng truyền qua quang học của một số loại vật liệu chế tạo cell (buồng đo chứa mẫu)

KIỂU CELL

Về mặt thương mại đã có một dải rộng các loai cell được đưa ra thị trường, và ở đây chỉ mô tả

những cell quan trọng nhất. Cell được dùng thường xuyên nhất là loại cell hình chữ nhật hở miệng

(hay còn gọi là đỉnh hở) (hình 3.39a). Cell này có độ dài đường truyền từ 1 đến 100 mm, nhưng độ

dài đường truyền phổ biến nhất là 10 mm. Hầu hết tất cả các cell hình chữ nhật có độ rộng bên

ngoài là 12,5 mm. Khi thể tích mẫu có hạn, cell mở rộng thường được sử dụng (xem hình 3.39b).

Khi thể tích mẫu rất hạn chế, loại microcell có thể được

dùng để giảm độ mở diện tích mẫu tới một mặt cắt rất nhỏ


(điển hình là 2 x 2,5 mm) như chỉ ra trong hình 40a. Phép

đo với loại cell này chỉ đòi hỏi thể tích mẫu xấp xỷ 60 l.

Với các ultramicrocell đặc biệt, có thể đo được với thể tích

mẫu giảm xuống 5 l. Đối với các ứng dụng tự động hoá,

cuvet dòng chảy thông suốt (xem hình 3.40b) được sử

dụng. Các cell hiện đại được nối đến ống truyền mẫu với

các khớp vặn. Hiện có nhiều kiểu Cell dòng có các kích

thước độ mở và kiểu dáng khác nhau trong một dải rộng

độ mở đường truyền.

Với các cell và microcell độ mở có hạn, một phần chùm

sáng bị chặn lại, do đó độ truyền dẫn thông suốt bị giảm đi

và độ nhạy bị thoả hiệp đến một mức độ nhất định. Sự suy

giảm độ nhạy phụ thuộc vào mức độ lộ sáng (độ mở) và

vào kiểu dáng hình học.

NGUỒN GÂY LỖI

Nếu các cell được thiết kế và sử dụng hợp lý, phần lỗi của chúng đóng góp vào các phép đo độ

hấp thụ được giảm thiểu. Tuy nhiên người phân tích cần hiểu biết về một vài nguồn tiềm ẩn gây lỗi.

Do độ hấp thụ đo được phụ thuộc vào độ dài đường truyền, độ chính xác về độ dài đường truyền

đóng vai trò quan trọng trong các phép đo tuyệt đối. Dung sai độ dài đường truyền cell đối với cell chất

lượng tốt là 0,01 mm với độ dài đường truyền từ 0,5 đến 100 mm.

Để có được độ chính xác tối đa của phép định lượng, sử dụng cùng một cell cho các phép đo

chuẩn và phép đo mẫu.

Khi được đặt trong chùm tia mẫu, cell trở thành một cấu kiện quang học hoạt động. Những bề

mặt quang học không phẳng hoặc không song song có thể làm trệch hướng chùm sáng và gây ra lỗi

độ hấp thụ biểu kiến. Những cell tốt nhất cần có bề mặt quang rất phẳng và rất song song giảm thiểu

các tác động quang học. Cell cần luôn luôn được hướng theo cùng một chiều trong bộ gá giữ cell để

bảo đảm tất cả các hiệu ứng quang cell sẽ giống nhau đối với cả phép đo blank và phép đo mẫu.

Với cell hạn chế độ mở, những phần của cell không chứa mẫu phải được che kín hợp lý để tránh

những truyền qua và phản xạ không cần thiết qua các thành mặt bên. Nếu sử dụng cell chưa được

che kín, phép đo sẽ bị lỗi. Mức độ lỗi phụ thuộc vào kiểu dáng quang học trong vùng mẫu. Nếu

chùm quang có tính hội tụ mạnh sao cho phần lớn ánh sáng đi qua một phần mở rất nhỏ trong cell,

kết quả đạt được với cell chưa che kín có độ chính xác chấp nhận được do bản thân hệ quang có

hiệu ứng tự che kín. Ngược lại, nếu chùm quang rộng và được chuẩn trực (song song), sẽ có nhiều

ánh sáng đi qua thành cell thay vì đi qua mẫu và phép đo sẽ không chính xác.

THAO TÁC VỚI CELL

Cầm cell cẩn thận tránh cào xước. Cần tránh chạm các ngón tay vào bề mặt quang, dầu từ các

ngón tay có thể gây hấp thụ đáng kể. Nếu bề mặt quang của cell bị ô nhiễm chút ít, cell có thể được

lau chùi cẩn thận với giấy lụa loại dùng cho phổ. Nếu cell bị ô nhiễm nghiêm trọng, có thể làm sạch

nó với chất tẩy sulfonic nhẹ hoặc với chất lỏng làm sạch đặc biệt do các nhà sản xuất cell cung cấp.

Trong vài trường hợp, có thể dùng cách xử lý với axit HCl hoặc HNO3.

Chọn dung môi

Dung môi lý tưởng để chuẩn bị các dung dịch mẫu cần hoà tan được tất cả các kiểu hợp chất,

không có khả năng bắt lửa và không độc, và cần phải trong suốt hoàn toàn tại tất cả các bước sóng.

Nước cất là dung môi lý tưởng nhưng không phù hợp đối với nhiều hợp chất hữu cơ không phân

cực. Bảng 3.6 liệt kê một số dung môi được sử dụng phổ biến nhất. Ngoại trừ nước cất, tất cả những

Hình 3.40. Cell micro (a) và cell dòng chảy thông (b)


dung môi này đều có một bước sóng cutt-off trong dải UV, dưới bước sóng này chúng hấp thụ quá

mạnh cho phép thực hiện các phép đo mẫu.

Bảng 3.6. Thuộc tính của một số dung môi

Dung môi Độ phân cực* Bước sóng Cutt-off

(nm)**

Mức nguy

hiểm***

Nước cất 78,5 <195 -

Hexane 1,9 199 F

Ethanol (tuyệt đối) 24,3 207 F

Methanol 32,6 210 F

Cyclohexane 2,0 211 F

Chloroform 4,8 246 F/T

Dimethylsulfoxide - 270 H

Acetone 20,7 331 F

* Hằng số điện môi tại nhiệt độ phòng

** Bước sóng mà tại đó độ truyền qua với độ dài đường truyền 10-mm là nhỏ hơn 25%

*** F: có thể bắt lửa; T: độc; H: nguy hiểm đến sức khoẻ.

Với các dung môi hữu cơ bay hơi, như acetone hoặc methyl chloride, nên dùng cell có đậy nắp để

loại trừ sự bay hơi (sự bay hơi sẽ dẫn đến những thay đổi rất nhanh chóng về nồng độ).

Tác động của dung môi, nồng độ, pH và nhiệt độ

Một số các yếu tố bao gồm dung môi được sử dụng cũng như nồng độ, pH và nhiệt độ của mẫu

có thể tác động đến vị trí và cường độ băng hấp thụ của các phân tử. Những thông số này được điều

khiển để bảo đảm mang lại độ chính xác tối đa và khi so sánh các phổ đồ được đo dưới những điều

kiện khác nhau.

Độ phân cực của một dung môi có thể làm thay đổi môi trường điện tử của chromophore hấp

thụ. Nhìn chung, cường độ trôi có thể có liên quan đến độ phân cực dung môi. Do đó lấy ví dụ hấp

thụ tối đa của acetone có thể thay đổi từ 259 đến 279nm tuỳ thuộc vào dung môi được sử dụng. Để

so sánh các phép phân tích, phải sử dụng một dung môi duy nhất cho tất cả các phép đo.

Bình thường thì nồng độ chỉ tác động lên cường độ băng. Tuy nhiên, ở những nồng độ cao các

tương tác phân tử (lấy ví dụ sự dime hoá) có thể làm thay đổi hình dạng và vị trí băng hấp thụ. Quay

lại những thay đổi này tác động lên tương quan tuyến tính của nồng độ theo độ hấp thụ và có thể

dẫn đến những kết quả định lượng thiếu chính xác. Tác động của pH lên phổ hấp thụ có thể rất rộng

và có nguyên nhân chính là sự trôi cân bằng giữa hai dạng khác nhau. Lấy ví dụ chỉ thị pH bằng mắt

có thể nhìn thấy sự thay đổi mầu sắc tại các pH khác nhau. Nếu quá trình nghiên cứu phổ thấy nó bị

tác động bởi pH, có thể dùng chất đệm để điều khiển thông số này. Tuy nhiên lưu ý rằng hầu hết

các chất đệm đều biểu lộ khả năng hấp thụ đáng kể, có thể tác động lên dải bước sóng các phép đo

đang thực hiện trên dải đó.

Nhiệt độ cũng có thể tác động lên các phép đo UV-VIS, làm giãn nở dung môi, đặc biệt là đối

với một số dung môi hữu cơ, sự giãn nở đó có thể đủ để gây ra thay đổi độ hấp thụ biểu kiến và

theo đó là độ chính xác của các kết quả định lượng. Thêm vào đó nhiệt độ có thể tác động lên cân

bằng, hoặc là cân bằng hoá học hoặc là cân bằng vật lý. Một ví dụ về cân bằng vật lý là sự biến tính

nucleic axit khi nhiệt độ gia tăng, điều đó nó làm thay đổi khả năng hấp thụ. Điều đáng lưu ý cuối

cùng là chỉ số khúc xạ của các dung môi hữu cơ có thể có những thay đổi đáng kể theo nhiệt độ.

Khi nhiệt độ khác nhau làm xuất hiện các dòng đối lưu trong những phần khác nhau của cell, hiệu

ứng Schlieren có thể làm thay đổi độ hấp thụ biểu kiến. Nếu thấy nhiệt độ có tác động đáng kể lên

phép đo, nhiệt độ mẫu phải được kiểm soát sử dụng bộ gá giữ cell có điều nhiệt. Bộ gá giữ cell này

có thể là một bao nước đơn giản sử dụng cùng với một bể nước tuần hoàn hoặc là bộ điều khiển


nhiệt độ Peltier tinh xảo hơn. Với các dung môi hữu cơ, nên sử dụng cell có nắp đậy để giảm thiểu

hiệu ứng Schlieren.

Mẫu rắn

Có một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến độ đúng và chính xác phép đo độ truyền qua mẫu rắn

như mẫu thuỷ tinh hoặc tinh thể

KHÔNG THAM CHIẾU

Thường thì mẫu rắn được đo để xác định phổ đồ, hoặc để định lượng một thành phần trong nền

rắn. Tuy nhiên không phải lúc nào cũng có thể có được mẫu rắn nền không chứa chất phân tích.

Trong trường hợp này phép đo mẫu trắng phải được thực hiện trên không khí do không thể thực

hiện được phép đo mẫu trắng thực (nền không có chất phân tích). Kết quả tốt nhất của quá trình này

sẽ tạo ra được một giá trị bù không đổi tại tất cả các bước sóng và tồi tệ nhất là phổ đo được là phổ

của một phức hợp chất phân tích và nền. Có thể đạt được phép phân tích định lượng chính xác nếu

có được hai hoặc nhiều hơn các chuẩn và nếu sử dụng được đường chuẩn không ép qua zero. Phần

chắn trên trục y biểu thị (đại diện) cho độ hấp thụ do nền gây ra. Nếu không có được nhiều mẫu

chuẩn, phương pháp tham chiếu nội tại sử dụng một bước sóng tham chiếu là bước sóng mà tại đó

chất phân tích không xuất hiện hấp thụ, đây là một trong những khả năng có thể áp dụng được.

CHỈ SỐ KHÚC XẠ

Không có mẫu tham chiếu cũng là nguyên nhân gây ra sự thay

đổi đáng kể về chỉ số khúc xạ giữa mẫu trắng (không khí) và

mẫu rắn. Nếu chùm quang được chuẩn trực trực giao với mẫu

thì tác động này không quan trọng. Tuy nhiên nếu chùm quang

hội tụ, mẫu rắn trở thành một cấu kiện quang hoat động và làm

thay đổi độ dài đường truyền quang. Quay lại sự thay đổi độ dài

đường truyền quang này làm thay đổi đáng kể mức độ chiếu

sáng của detector giữa mẫu trắng và mẫu (xem hình 3.41), gây

ra lỗi độ hấp thụ biểu kiến. Một vấn đề như vậy sẽ rất khó phát

hiện, và nếu thiết bị là một thiết kế chùm tia hội tụ sẽ không có

giải pháp giản đơn nào cho nó. Tuy nhiên hiệu ứng này có thể

được giảm thiểu nhờ đặt mẫu gần detetor nhất ở mức độ có thể

được.

KIỂU DÁNG HÌNH HỌC CỦA MẪU

Thường mẫu rắn có thể là thuỷ tinh hoặc fil lọc nhựa được tạo khuôn hoặc là thấu kính (lấy ví

dụ thấu kính kính râm). Những mẫu như vậy là những cấu kiện quang hoạt động nằm trong hệ

thống và sẽ làm trệch hướng hoặc hoặc làm thay đổi độ dài tiêu cự của chùm sáng. Hệ quả tất yếu

detector mắc lỗi phát hiện một phần chùm sáng (xem hình 3.42), lỗi này giống như lỗi đo độ hấp

thụ biểu kiến. Hiệu ứng này có thể kiểm tra được nhờ xoay hoặc đảo ngược mẫu trong khuôn giữ

mẫu và có thể giảm thiểu được nhờ đặt mẫu ở gần detector nhất ở mức có thể được.

Hình 3.41. Hiệu ứng của chỉ số khúc xạ


Hình 3.42. Hiệu ứng kiểu dáng hình học mẫu không phẳng

Hấp thụ yếu

Một vấn đề dai dẳng trong hoá học phân tích là độ nhạy thấp, độ nhạy thấp có thể do nồng độ

mẫu thấp hoặc do khả năng hấp thụ của chất phân tích rất yếu. Ở độ hấp thụ thấp, ồn trong phép đo

làm mất đi độ chính xác, bất kỳ phép đo đơn lẻ nào đều có thể mất đi độ đúng của nó. Chỉ số kỹ

thuật độ ồn là một thông số then chốt trong lựa chọn thiết bị phổ, nhưng cũng phải lưu ý rằng việc

thay đổi các thông số đo sẽ giảm được mức ồn.

THAY ĐỔI ĐỘ RỘNG KHE

Nếu thiết bị phổ có thể thay đổi được độ rộng khe, mức độ ồn có thể được giảm xuống nhờ gia

tăng độ rộng khe cho phép có nhiều ánh sáng chạy qua hệ quang. Sự gia tăng về độ rộng này dẫn

đến giá trị S/N tốt hơn nhưng lại giảm độ phân giải thiết bị.

LẤY TRUNG BÌNH THEO THỜI GIAN

Việc lấy trung bình các điểm dữ liệu giảm ồn theo căn bậc hai số

lượng điểm được lấy trung bình. Hình 3.43 chỉ ra sự cải thiện giá

trị S/N với việc gia tăng thời gian lấy tích phân đối với một loại

phẩm nhuộm ở nồng độ rất thấp. Những phép đo được thực hiện

nhờ sử dụng thiết bị phổ mảng diod với thời gian tích phân là 0,1

và 1,6 giây. Sự cải thiện thực tế đạt đến gần với sự cải thiện

mong đợi về lý thuyết là 4 lần. Lưu ý việc mở rộng thời gian tích

phân sẽ cải thiện độ nhạy chỉ khi nào các hiệu ứng khác như hiệu

ứng trôi trở nên chiếm ưu thế

LẤY TRUNG BÌNH BƯỚC SÓNG

Một kỹ thuật lấy trung bình khác là kỹ thuật lấy trung bình bước sóng. Hình 3.44 cho thấy một

băng hấp thụ mở rộng. Các phép đo định lượng phổ thông sẽ được thực hiện tại cực đại hấp thụ.

Nếu có được dữ liệu tại tất cả các bước sóng, các dữ liệu tăng cường tại mỗi mặt xung quanh cực

đại hấp thụ có thể được lấy trung bình. Mức độ giảm ồn tương đương căn bậc hai số lượng điểm dữ

liệu. Tuy nhiên nếu nhiều điểm dữ liệu hơn được thêm vào, độ hấp thụ trung bình sẽ giảm, gây ra

Hình 3.43. Tác động của thời gian tích

phân lên S/N


tác động âm lên tín hiệu. Đối với một độ rộng băng hấp thụ cụ thể, một số lượng điểm dữ liệu nào

đó sẽ tạo ra S/N tối ưu (xem hình 3.44)

Hình 3.44. Hiệu ứng của việc lấy trung bình theo bước sóng lên S/N

Độ trôi cũng có tác động lên độ đúng phép đo độ hấp thụ. Phép lấy tham chiếu nội tại có thể

được sử dụng để cải thiện độ chính xác và độ đúng tại những mức hấp thụ thấp.

Hấp thụ mạnh

Khi mẫu hấp thụ quá mạnh, dải động học tuyến tính của thiết bị sẽ bị vượt quá và tương quan

giữa độ hấp thụ và nồng độ trở nên phi tuyến. Giải pháp dễ nhất với vấn đề này là pha loãng mẫu

đến mức độ hấp thụ nằm trong phạm vi dải động học tuyến tính. Tuy nhiên với các mẫu rắn thì điều

này là không thể được. Hơn nữa bất kỳ bước xử lý mẫu nào, ngay cả là pha loãng sẽ tạo ra lỗi và do

đó sẽ là tốt hơn cần tránh áp dụng. Một trong các cách có thể áp dụng là lựa chọn một hoặc nhiều

hơn những bước sóng trên mặt băng hấp thụ, ở đây khả năng hấp thụ thấp hơn (hình 3.45). Khi

bước sóng của cực đại hấp thụ (241nm) được dùng để chuẩn, có thể đo ở nồng độ tối đa xấp xỷ 0,26

mg/ml với độ đúng chấp nhận được. Tuy nhiên, việc chuyển sang độ hấp thụ trên mặt của băng

(266nm) cho phép nồng độ lên đến 5 mg/ml được đo với độ đúng tương đương. Một điều kiện tiên

quyết để sử dụng kỹ thuật này là độ tái lặp của bước sóng phải là tuyệt vời.

Hình 3.45. Sử dụng cách chuyển đổi bước sóng để gia tăng dải động học


3.6.1.8 Ảnh hưởng

Các kiểu ảnh hưởng

Một cách lý tưởng thì độ hấp thụ xuất hiện trong các phép đo UV-Vis chỉ do chất phân tích mục

tiêu gây ra. Tuy nhiên trong thực tế độ hấp thụ gây ảnh hưởng lên các phép đo thường xuất hiện

theo các lý do về hoá học hoặc vật lý.

Các hợp chất hấp thụ khác

Sự có mặt của bất kỳ hợp chất nào khác hấp thụ trong cùng vùng như hợp chất mục tiêu sẽ gây

ra lỗi trong phép đo độ hấp thụ. Trong một số trường hợp chỉ có duy nhất một hợp chất ảnh hưởng

được biết đến, lấy ví dụ phụ phẩm từ quá trình tổng hợp một sản phẩm dược. Trong những trường

hợp còn lại có thể có nhiều dạng hấp thụ và nhiều trong số chúng chưa được biết rõ (lấy ví dụ trong

các mẫu sinh học như mẫu máu), chúng có thể gây ra hấp thụ nền băng rộng.

Sự phân tán

Một vấn đề xuất hiện thường xuyên trong các phép phân tích dược phẩm và sinh học là sự phân

tán ánh sáng do các hạt rắn lơ lửng trong dung dịch gây ra. Trong các phép phân tích dược phẩm,

các hạt này thường là tá dược hoặc chất độn dùng trong công thức sản xuất thuốc viên hoặc con

nhộng. Sự phân tán bức xạ dẫn đến hấp thụ nền biểu kiến, sự hấp thụ này ảnh hưởng đến các phép

đo độ hấp thụ. Việc lọc mẫu trước khi đo loại bỏ sự phân tán nhưng giải pháp này không phải luôn

luôn khả thi, và người phân tích thường phải làm việc với những phổ có cả thành phần phân tán

trong đó.

Sự phân tán gây ra hấp thụ biểu kiến do ánh sáng thay vì phải

đi qua dung dịch đến detector thì lại bị phân tán ở một góc nào

đó. Do đó, ngay cả không xuất hiện sự hấp thụ thì ánh sáng

đến được detector vẫn sẽ ít hơn như trong hình 3.46

Trong phần UV-Vis của phổ đồ, có thể thấy có hai kiểu phân

tán. Phân tán Rayleigh xuất hiện khi các hạt tương đối nhỏ so

với bước sóng của ánh sáng và tỷ lệ nghịch với luỹ thừa bốn

của bước sóng. Phân tán Tyndall xuất hiện khi các hạt tương

đối lớn so với bước sóng của ánh sáng và tỷ lệ nghịch với bình

phương bước sóng. Trong các hệ thống hoá học, số mũ của

bước sóng có thể nằm trong dải từ -4 đến -2 tuỳ thuộc vào sự

phân bố kích thước hạt

nscatterA

1

Trong đó A là độ hấp thụ do phân tán, là bước sóng và n là bậc phân tán. Mối quan hệ này cho

thấy lỗi gây ra do phân tán gia tăng tại những bước sóng ngắn hơn như trong hình 3.47.

Hình 3.46. Sự phân tán

Hình 3.46. Sự phân tán ánh sáng


Hình 3.47. Phổ phân tán

Có thể giảm được cường độ của hiệu ứng phân tán nhờ đặt mẫu càng gần với detector càng tốt. Tuy

nhiên với sự phân tán là đáng kể, ánh sáng bị mất và độ nhạy cũng như độ chính xác phép phân tích

định lượng bị suy giảm nghiêm trọng.

3.6.1.9 Các kỹ thuật hiệu chỉnh

Một số các kỹ thuật có thể được sử dụng để loại bỏ hoặc giảm lỗi ảnh hưởng. Nhìn chung nếu đã

biết nguồn gây ra lỗi và ảnh hưởng này mang tính kiên định từ mẫu này sang mẫu khác thì lỗi có thể

được loại bỏ. Các kỹ thuật hiệu chỉnh luôn luôn đòi hỏi phải có dữ liệu từ tối thiểu hai bước sóng. Các

kỹ thuật hiệu chỉnh tinh xảo hơn đòi hỏi phải có dữ liệu nhiều bước sóng hoặc dữ liệu từ nhiều phổ.

Đẳng hấp thụ

Khi đã biết về thành phần ảnh hưởng lên một phổ đồ. Lỗi gây ra bởi thành phần này tại bước sóng

phân tích của chất phân tích mục tiêu có thể được loại trừ nhờ lựa chọn bước sóng quy chiếu mà tại đó

hợp chất ảnh hưởng đưa ra cùng giá tri độ hấp thụ như độ hấp thụ tại bước sóng phân tích, như trong

hình 3.48. Độ hấp thụ còn lại là độ hấp thụ thực của chất phân tích.

Hình 3.48. Hiệu chỉnh đẳng hấp thụ

Độ tin cậy của kỹ thuật này thấp khi đặc tính tương tự phổ chất phân tích và phổ ảnh hưởng là cao.

Hơn nữa nó chỉ có thể hiệu chỉnh cho một ảnh hưởng.


Phân tích đa thành phần

Một sự mở rộng đẳng hấp thụ là phép phân tích đa thành phần, như được mô tả trong phần “Phép

phân tích đa thành phần”. Ở đây phổ của chất ảnh hưởng hoặc của các chất ảnh hưởng phải được đo

dưới dạng với các chất chuẩn. Kỹ thuật này có thể được áp dụng thành công khi các phổ đồ có sự chồng

chập đáng kể và khi có mặt nhiều hơn một chất ảnh hưởng.

Mô hình hoá nền

Phép mô hình hoá nền phù hợp khi ảnh hưởng là do các quá trình vật lý (thường hầu hết vẫn là sự

phân tán), trong đó có thể đánh giá được ảnh hưởng tại bước sóng phân tích nhờ phép ngoại suy từ mô

hình tại một dải sóng khác. Một phần của phổ đồ mà ở đó độ hấp thụ biểu kiến chỉ do ảnh hưởng được

lựa chọn. Sau đó một đa thức được ráp vào với phần này của phổ sử dụng phương pháp bình phương tối

thiểu với phép lấy logarit độ hấp thụ.

naA (3.25)

)log()log()log( naA (3.26)

Trong đó A là độ hấp thụ, là bước sóng, n là bậc liên hệ giữa độ hấp thụ và bước sóng và a là một

hằng số. Có thể đánh giá được độ hấp thụ nền tại tất cả các bước sóng sử dụng các hệ số xác định được

từ đường cong ăn khớp. Sau đó các giá trị này được trừ vào giá trị đo được để đưa ra giá trị độ hấp thụ

do chất phân tích như trong hình 3.49.

Hình 3.49. Mô hình hoá nền

Tham chiếu nội tại

Một trong những kỹ thuật hiệu chỉnh đơn giản nhất là tham chiếu nội tại, kỹ thuật này sử dụng một

bước sóng tham chiếu duy nhất. Phương pháp này thường được dùng nhất khi xuất hiện sự trôi đường

nền giữa các phép đo. Nhìn chung bước sóng tham chiếu được lựa chọn tốt nhất là càng gần với bước

sóng phân tích càng tốt nhưng phải có độ hấp thụ không đáng kể so với chất phân tích. Độ hấp thụ tại

bước sóng tham chiếu được trừ vào độ hấp thụ bước sóng phân tích. Bất kỳ ảnh hưởng nào đều là hằng

số tại tất cả các bước sóng được hiệu chỉnh như trong hình 3.50. Mặc dù trong thực tế ảnh hưởng

thường không phải là hằng số tại tất cả các bước sóng, kỹ thuật đơn giản này thường mang lại những cải

thiện tốt về độ đúng một cách đáng ngạc nhiên.


Hình 3.50. Tham chiếu nội tại

Hiệu chỉnh 3-điểm

Phép hiệu chỉnh 3 điểm hay Morton-Stubbs sử dụng hai bước sóng tham chiếu, thường thì chúng

nằm về từng bên của bước sóng phân tích. Sau đó có thể đánh giá được độ hấp thụ nền ảnh hưởng tại

bước sóng phân tích sử dụng phép nội suy tuyến tính (xem hình 3.51). Phương pháp này cải thiện kết

quả tốt hơn so với kỹ thuật tham chiếu một bước sóng do nó hiệu chỉnh bất kỳ độ hấp thụ nền nào bộc lộ

một tương quan tuyến tính với bước sóng. Trong nhiều trường hợp, nếu dải sóng hẹp, nó sẽ là một phép

hiệu chỉnh chấp nhận được cho những hấp thụ nền phi tuyến như sự hấp thụ có nguyên nhân từ sự phân

tán hoặc từ một nền phức tạp

Hình 3.51. Phép hiệu chỉnh 3-điểm (Morton-Stubbs)

Đạo hàm phổ

Dựa vào hai thuộc tính của nó, phổ đạo hàm có thể được sử dụng để giảm hoặc loại bỏ ảnh hưởng

nền từ một dải rộng các loại nguồn gây lỗi. Trước tiên bất kỳ ảnh hưởng nào cho thấy có một mối tương

quan tỷ lệ trực tiếp với các bậc khác nhau của bước sóng với dạng chung:

n

naaaA .....1

10 (3.27)


được loại bỏ sử dụng bậc đạo hàm gia tăng cao hơn. Theo đó hằng số bù đường nền (a0) được loại bỏ

nhờ đạo hàm bậc nhất, độ hấp thụ nền gia tăng tuyến tính với bước sóng được loại bỏ nhờ vào đạo hàm

bậc 2 và …. Thật không may trong phổ UV-Vis chỉ có hằng số bù đường nền là phổ biến.

Thứ hai và có lẽ là quan trọng hơn so với thuộc tính thứ nhất, đạo hàm phân biệt đối xử giữa băng

hấp thụ tương đối rộng hơn so với băng hấp thụ hẹp. Phép phân biệt đối xử này xuất phát từ một thực tế

là biên độ (Dn) của một băng Gaussian trong đạo hàm bậc thứ n tỷ lệ nghịch với độ rộng băng gốc (W)

lập từ bậc n:

nW

1nD (3.28)

Do vậy hai băng trùng khớp bằng nhau về mặt cường độ nhưng độ rộng băng tại bậc zero khác

nhau, biên độ đạo hàm bậc n của băng sắc nhọn hơn (X) là lớn hơn so với biên độ của băng rộng

hơn (Y) theo một hệ số phụ thuộc vào độ rộng băng tương đối và phụ thuộc vào bậc đạo hàm:

n

X

n

Y

n

Y D

W

D

n

XD (3.29)

Hình 3.52 chỉ ra hiệu ứng của việc lấy đạo hàm hai băng với độ rộng băng tự nhiên NBW là 160 và

40. Trong chế độ độ hấp thụ các băng này có biên độ tương đương nhau. Trong đạo hàm bậc nhất băng

hẹp hơn có biên độ lớn hơn 4 lần và trong đạo hàm bậc hai là 6 lần. Thuộc tính này cải thiện độ đúng

của phép định lượng bất kỳ thành phần băng hẹp nào trong sự hiện diện của bất kỳ thành phần băng

rộng nào. Nói gần hơn đó có thể là một thành phần ảnh hưởng, như chỉ ra trong hình 3.52.

Hình 3.52. Sự phân biệt đối xử các băng rộng bằng phổ đạo hàm

Phổ hình thành từ sự phân tán cũng có băng rộng và việc sử dụng đạo hàm có thể giảm đi phần

đóng góp của nó. Lấy ví dụ trong hình 3.53 chỉ ra một băng hấp thụ với NBW 40nm và một băng như

vậy khi có mặt nền phân tán ánh sáng. Nếu không có bất kỳ sự hiệu chỉnh nào thì biên độ tại 500nm là

1,0920A thay vì là 1,0A do sự phân tán đóng góp vào. Phép định lượng tại bước sóng này hình thành

9,2% lỗi. Lấy đạo hàm bậc nhất giảm sự đóng góp từ thành phần phân tán nói trên, dùng phần sóng từ

cực đại đến cực tiểu. Tín hiệu trong sự có mặt của phân tán ánh sáng là 0,02992A thay vì là 0,0302A -

lỗi định lượng bây giờ chỉ là -1,1%.


Hình 3.53. Hiệu chỉnh phân tán bằng phổ đạo hàm

Tuy nhiên thường thì vấn đề phân tích không thể xác định rõ một cách đơn giản nó là thành phần sự

phân tán, trôi đường nền hay hấp thụ băng rộng không mong muốn. Hơn nữa sự kết hợp của hai hay

nhiều hiệu ứng này sẽ tạo ra nền có khả năng hấp thụ nền băng rộng. Phổ đạo hàm là một công cụ tuyệt

vời để giảm hoặc loại bỏ những nguồn gây lỗi khó mô tả này.

3.6.1.10 Các vấn đề quang hoá

Huỳnh quang

Một số mẫu huỳnh quang chúng phát ra ánh sáng trên một dải sóng khi được chiếu ánh sáng có

bước sóng ngắn hơn (nhiều năng lượng hơn). Ánh sáng phát ra này dẫn đến lỗi trong các phép đo độ

hấp thụ. Vị trí và biên độ lỗi tuỳ thuộc vào thiết bị hoặc thuộc loại hệ quang xuôi chiều phổ thông hay

loại hệ quang ngược.

Trong một thiết bị hệ quang xuôi chiều, mẫu được chiếu sáng với ánh sáng có bước sóng thay đổi

theo thời gian. Khi dải sóng kích thích được quét, quá trình huỳnh quang bắt đầu xuất hiện tại ánh sáng

có bước sóng dài hơn. Do detector không thể phân biệt được giữa các bước sóng độc lập, độ hấp thụ đo

được tại bước sóng kích thích là quá thấp (xem hình 3.54). Khi dải sóng phát xạ được quét, không xuất

hiện huỳnh quang và theo đó các phép đo độ hấp thụ đạt độ chính xác.

Hình 3.54. Hiệu ứng huỳnh quang trên phổ hấp thụ đo được

Trong một thiết bị hệ quang ngược, mẫu được chiếu sáng với đồng thời tất cả các bước sóng ánh

sáng, bao gồm trong đó có cả ánh sáng tại bước sóng kích thích. Do đó mẫu có hiệu ứng huỳnh quang


và phát ra ánh sáng, nhưng do sau đó có sự lựa chọn bước sóng sau khi nó đi qua mẫu. Độ hấp thụ đo

được tại bước sóng phát xạ là quá thấp (hình 3.54), nhưng độ hấp thụ đo được tại bước sóng kích thích

là đúng.

Thêm một yếu tố nữa tác động lên biên độ của lỗi còn được gọi

là góc chấp nhận của detector như chỉ ra trong hình 3.55. Ánh

sáng huỳnh quang phát ra theo tất cả các chiều. Nếu góc tiếp

nhận rộng sẽ có một phần đáng kể ánh sáng huỳnh quang đến

được detector. Nhưng ngược lại nếu góc chấp nhận của detector

hẹp, sẽ chỉ có một lượng nhỏ ánh sáng huỳnh quang đến được

detector và do đó tương ứng lỗi độ hấp thụ sẽ nhỏ. Các thiết bị

với hệ quang ngược có góc chấp nhận của detector nhỏ và do

đó ít mắc lỗi huỳnh quang.

Việc đặt một bộ lọc trong chùm sáng có thể loại trừ lỗi do

huỳnh quang gây ra. Trong một thiết bị phổ thông, bộ lọc được

đặt giữa mẫu và detector để lọc bỏ bước sóng hoặc các bước

sóng phát xạ, trong khi đó trong một thiết bị hệ quang ngược,

bộ lọc được đặt giữa nguồn sáng và mẫu để loại trừ bước sóng

kích thích.

Sự phân huỷ mẫu

Một số mẫu nhạy với phản ứng quang hoá, đặc biệt là khi tiếp xúc với ánh sáng UV bước sóng thấp.

Trong những trường hợp xấu có thể cần đến một bộ lọc để loại bỏ ánh sáng này.

3.6.1.11 Phát triển và phê chuẩn phương pháp

Phát triển phương pháp

Do hầu hết các ứng dụng UV-VIS là các phép phân tích một thành phần (single-component), trong

mục này chúng ta tập trung vào tối ưu những phương pháp như vậy. Việc phát triển phương pháp bao

gồm lựa chọn bước sóng hoặc những bước sóng mang lại kết quả tốt nhất đối với một phương pháp cụ

thể, trên một thiết bị cụ thể. Ở đây khái niệm tốt nhất được định nghĩa theo các thông số như độ đúng,

độ chính xác, độ nhạy, mức độ tuyến tính, dải tuyến tính, độ chọn lọc và ruggedness. Do tất cả các

thông số này không thể được tối ưu cùng một thời điểm, thông số hoặc các thông số cần được xác định

và yêu cầu đặt ra được xác lập trước khi phân tích. Cho đến thời gian gần đây, các trang thiết bị vẫn bị

hạn chế trong việc lựa chọn bước sóng (nguyên nhân chính gây ra các vấn đề về độ tái lập bước sóng)

và/hoặc không có công cụ thích hợp để so sánh các chọn lựa. Những hạn chế này đã được khắc phục

trong các trong bị hiện đại

LƯU Ý: Phát triển phương pháp bao gồm trong đó có cả việc sử dụng các công cụ thống kê khác nhau.

Trong tài liệu này không thảo luận sâu về nội dung những công cụ này được tính toán như thế nào hay

là về những thuận lợi và bất lợi liên quan đến chúng.

Mức độ tuyến tính (Linearity)

Mức độ tuyến tính là khả năng của phương pháp mang lại kết quả kiểm tra tỷ lệ hoặc trực tiếp hoặc

nhờ thông qua chuyển đổi toán học cụ thể với nồng độ chất phân tích có trong mẫu, trong phạm vi một

dải nồng độ cụ thể (Linearity is the ability of the method to produce test results that are proportional,

either directly or by a well-defined mathematical transformation, to the concentration of analyte in

sample within a given range.)

Đối với các phép đo UV-Vis, tương quan tuyến tính thường dùng là định luật Beer, các trạng thái

hấp thụ của chất tan tỷ lệ trực tiếp với nồng độ của nó. Đường chuẩn tuyến tính biểu thị quan hệ giữa độ

hấp thụ và nồng độ có dạng như sau:

Hình 3.55. Góc tiếp nhận và

biên độ lỗi huỳnh quang


A = kc

Trong đó A là độ hấp thụ, c là nồng độ và k hệ số chuẩn thiết bị (hệ số góc của đường chuẩn). Theo

đó việc kiểm tra hiệu quả mức độ tuyến tính là kiểm tra xem mô hình lý thuyết của chúng ta (định luật

Beer) phù hợp đến mức độ nào với phép đo thực tế.

Về mặt lý thuyết chỉ cần một phép đo độ hấp thụ trên một dung dịch chuẩn đã biết trước nồng độ là

đủ để chuẩn định lượng. Giá trị độ hấp thụ đo được chia cho nồng độ để được hệ số góc. Một số trang bị

và các thông số mẫu có thể gây ra sai lệch so với định luật Beer, có thể gây ra những lỗi đáng kể về mặt

định lượng nếu như đường chuẩn không mô tả chính xác các đặc trưng phép đo. Tuy nhiên do những sai

lệch này phụ thuộc vào bước sóng, việc lựa chọn được bước sóng phù hợp có thể giảm thiểu các tác

động của chúng lên kết quả.

Hình 3.56. Lỗi tiềm ẩn hình thành từ chuẩn thiết bị không phù hợp

Để xây dựng một đường chuẩn, cần đo được phổ của một tệp tối thiểu 3

dung dịch chuẩn chất phân tích. Nồng độ của các dung dịch chuẩn bao

phủ được dải nồng độ mẫu phân tích dự kiến. Lý tưởng thì tất cả các

giá trị chuẩn đo được sẽ nằm trên một đường thẳng, nhưng trên thực tế

các giá trị luôn luôn có sự phân tán. Phương pháp thống kê được áp

dụng để tìm ra sự phù hợp tốt nhân của đường chuẩn với dữ liệu đo

được, bước tiếp theo là xác định xem kiểu đường chuẩn nào là kiểu tốt

nhất. Phương pháp thống kê hay sử dụng nhất là tương quan tuyến tính,

nó còn được biết đến dưới cái tên phương pháp bình phương tối thiểu.

Để so sánh hai đường chuẩn, chúng ta cần đo tính ăn khớp của các mức

nồng độ chuẩn so với vạch chuẩn yêu cầu. Một số giá trị thống kê bao

gồm: hệ số tương quan, lỗi tương quan và tính không chắc chắn có thể

được sử dụng để tạo ra phép đo này.

Dĩ nhiên trong số đó hệ số tương quan là phổ biến nhất. Giá trị này luôn

luôn nằm giữa +1 và -1. Giá trị +1 biểu thị tương quan tuyến tính đầy

đủ giữa độ hấp thụ và nồng độ. Giá trị -1 cũng chỉ ra một tương quan

tuyến tính đầy đủ, nhưng là với độ hấp thụ A giảm (xuất hiện nếu như

sử dụng dữ liệu đạo hàm). Giá trị 0 cho thấy không có một mối tương

quan nào giữa độ hấp thụ và nồng độ.

Để xác định được bước sóng hoặc sự kết hợp các bước sóng tốt nhất, đo phổ của một tệp các

dung dịch chuẩn tinh khiết nằm trong một dải nồng độ. Áp dụng đường chuẩn tuyến tính cho từng bước

sóng, tính toán giá trị thống kê đã chọn để đánh giá mức độ tuyến tính. Để đánh giá được nhanh nhất, sử

dụng đồ hoạ giá trị thống kê mức độ tuyến tính theo bước song.

Hình 3.57. Tệp dữ liệu chuẩn


Hình 3.58 mô tả phổ của 4 chuẩn phẩm nhuộm mầu vàng và phổ hệ số tương quan tương ứng theo

một kiểu đường chuẩn tuyến tính đơn giản. Chuẩn thiết bị tốt nhất theo khái niệm về mức độ tuyến tính

đạt được tại điểm mà hệ số tương quan thu được đồng nhất. Trong ví dụ này, bước sóng tại độ hấp thụ

cực đại (414nm) không trùng với bước sóng (402nm) mang lại độ tuyến tính tốt nhất. Điển hình cần đạt

được giá trị hệ số tương quan tốt hơn 0,999.

Hình 3.58. Lựa chọn bước sóng hoặc những bước sóng mang lại độ tuyến tính tốt nhất

Nếu một bước sóng cụ thể không mang lại mức độ tuyến tính yêu cầu, có thể sử dụng kết hợp nhiều

bước sóng. Lấy ví dụ sử dụng một bước sóng tham chiếu nội tại để loại bỏ lỗi trôi đường nền trong các

phép đo sẽ cải thiện được các kết quả.

Nếu kiểu đường chuẩn tuyến tính đơn giản không mang lại mức độ tuyến tính mong muốn, có thể áp

dụng kiểu đường chuẩn khác để giảm thiểu tác động không lý tưởng lên kết quả. Điển hình các dạng

hàm có thể sử dụng như sau:

A = a + kc (3.30)

A = kc + k'c2 (3.31)

và

A = a + kc + k'c2 (3.32)

Ngược lại, hệ số tương quan hoặc công cụ thống kê khác cần được sử dụng để đánh giá chất lượng

tương đối của các đường chuẩn. Chú ý khi sử dụng kiểu đường chuẩn có mức độ tự do cao hơn, đòi hỏi

có nhiều điểm chuẩn hơn để mô tả hợp lý đặc trưng của đường chuẩn.

Đối với phép phân tích đa thành phần, định luật Beer cũng được chấp nhận. Tuy nhiên ở đây mô

hình tính toán có thêm định luật bổ trợ để giải thích cho tổng độ hấp thụ tại từng bước sóng. Phép kiểm

tra mức độ tuyến tính đơn giản mô tả ở trên không sử dụng được, thay vào đó có thể sử dụng độ lệch

chuẩn phần dư để kiểm tra xem tệp chuẩn của chúng ta ăn khớp với phổ đo được ở mức độ nào. Giá trị

này là tổng các bình phương sai khác tại từng bước sóng giữa phổ đo được và phổ tính toán. Có thể

chấp nhận phần dư bằng 0 nếu như các chuẩn tạo ra được sự ăn khớp hoàn toàn với phổ đo được - Định

luật Beer và định luật bổ trợ giữ cho hệ thống luôn có được khả năng nghiên cứu phong phú. Nếu độ

lệch chuẩn của phần dư không bằng 0, mô hình lý thuyết đã không phản ánh được hệ thống nghiên cứu

do một trong các định luật chưa được tuân thủ hoặc do sự có mặt của thêm một thành phần nào đó chưa

được tính vào chuẩn thiết bị. Tuy nhiên trong thực tế, phần dư không bao giờ bằng 0, và giá trị có thể

chấp nhận được đối với một phép phân tích phải được xác định bằng thực nghiệm nhờ sử dụng các kết

quả phân tích đáp ứng được những yêu cầu về độ đúng và độ chính xác.


Độ đúng

Độ đúng phương pháp là mức độ phù hợp giữa một kết quả kiểm tra cụ thể được tạo ra bởi phương

pháp đó và giá trị thực tế (Accuracy of a method is the degree of agreement between an individual test

result generated by the method and the true value.)

Để xác định xem bước sóng hoặc những bước sóng nào mang lại độ đúng tốt nhất, đo phổ của một

tệp các chuẩn và đường chuẩn được xây dựng tại tất cả các bước sóng như đã mô tả ở trên. Sau đó cần

có một mẫu phân tích đã biết trước nồng độ. Lý tưởng thì mẫu này có nồng độ chất phân tích đã được

xác định bằng kỹ thuật khác. Tuy nhiên nếu như không có được mẫu như vậy, chuẩn bị mẫu tổng hợp

có chứa lượng biết trước chất phân tích. Đo phổ mẫu, thực hiện phép định lượng tại tất cả các bước sóng

trên dải sóng được đo. So sánh kết quả định lượng tại từng bước sóng với giá trị đã biết. Đồ thị các kết

quả định lượng theo bước sóng sẽ là thông tin đánh giá nhanh.

Hình 3.59 là kết quả của mẫu phẩm mầu vàng. Mặc dù bước sóng phân tích đặt tại 414nm với

phương pháp truyền thống, bước sóng hay những bước sóng mang lại độ đúng tốt nhất lại nằm trong

vùng 400nm.

Hình 3.59. Lựa chọn bước sóng mang lại độ đúng tốt nhất

Do ồn có thể làm xê dịch độ đúng của bất kỳ phép đo độc lập nào, ưu tiên thực hiện hàng loạt phép

đo trên mẫu và sau đó tính toán giá trị trung bình. Phương pháp này làm giảm sự đóng góp của ồn vào

lỗi độ đúng.

Tuy nhiên, trong phép phân tích đa thành phần không thể nhận ra dải sóng tối ưu nhờ sử dụng một

kỹ thuật đơn giản như vậy. Thay vào đó dải tốt nhất phải được xác định qua dao động trial-and-error của

dải sóng và thông qua so sánh các kết quả tính toán với những giá trị thực.

Độ chính xác

Độ chính xác của một phương pháp là mức độ tương đồng giữa các kết quả độc lập khi áp dụng quy

trình lấy nhiều mẫu lặp đi lặp lại (Precision of a method is the degree of agreement among individual

test results when the procedure is applied repeatedly to multiple samplings).

Cần đến một giá trị thống kê để xác định độ chính xác. Độ lệch chuẩn, phần trăm độ lệch chuẩn

tương đối (thu được nhờ chia độ lệch chuẩn cho giá trị trung bình và nhân với 100), và độ tin cậy thống

kê là công cụ phổ biến nhất để đánh giá độ chính xác hay độ lặp lại của tệp các giá trị.

Để xác định độ chính xác của phương pháp, điển hình cần chuẩn bị một tệp từ 10 đến 20 mẫu có

cùng nồng độ. Sau đó đo tất cả các mẫu này và tính toán lượng chất phân tích. Độ lệch chuẩn của các

kết quả là giá trị đo của độ chính xác. Hình 3.60 mô tả một ví dụ về độ phân tán của các kết quả và độ

lệch chuẩn mà có thể xem như đây là một phép phân tích tốt.


Hình 3.60. Xác định độ chính xác của một phép phân tích

Nếu không đạt được mức yêu cầu về độ chính xác, có thể sử dụng các kỹ thuật giảm ồn như lấy

trung bình bước sóng, lấy trung bình thời gian, tham chiếu nội tại để cải thiện các giá trị. Các kỹ thuật

đó cũng có thể áp dụng trong phân tích đa thành phần.

Độ nhạy

Độ nhạy được xem là khả năng phản hồi đạt được với lượng chất phân tích cụ thể và thường được

biểu thị bởi hai yếu tố phân tích: giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ (Sensitivity refers

to the response obtained for a given amount of analyte and is often denoted by two analytical factors:

the limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ)).

LOD là nồng độ chất phân tích thấp nhất có thể được phát hiện nhưng không cần định lượng trong

nền mẫu. Nhìn chung LOD là điểm mà tại đó tín hiệu từ chất phân tích tương đương 3 lần ồn của phép

đo. Kết quả đo từ một số thiết bị phổ liệt kê độ lệch chuẩn dựa trên ồn thiết bị. LOD xấp xỷ 3 lần độ

lệch chuẩn.

LOQ là nồng độ chất phân tích thấp nhất có thể xác định được trong nền mẫu với độ chính xác và

độ đúng chấp nhận. Để tính toán LOQ, phải xác lập rõ giới hạn chấp nhận độ chính xác và độ đúng (phụ

thuộc vào mục tiêu phép phân tích). Sau đó có thể sử dụng các công cụ mô tả ở trên để xác định giới

hạn chấp nhận.

Thông thường chúng ta chấp nhận bước sóng có cực đại hấp thụ sẽ mang lại độ nhạy tốt nhất. Tuy

nhiên do ồn trang bị có thể gây ra dao động đáng kể theo bước sóng thì đây lại là trường hợp không cần

thiết. Có một hướng tốt hơn để xác định bước sóng hoặc những bước sóng mang lại độ nhạy tối ưu là đo

phổ của mẫu nồng độ thấp vài lần. Tính toán giá trị trung bình và % độ lệch chuẩn tương đối của các giá

trị đo được tại từng bước sóng. Bước sóng với %RSD thấp nhất sẽ mang lại độ nhạy tốt nhất. Hình 3.61

minh hoạ kỹ thuật áp dụng cho phẩm nhuộm mầu vàng. Mặc dù những bước sóng nằm giữa 400 và 450

nm mang lại độ nhạy tuyệt vời, nhưng độ nhạy tốt nhất lại thu được ở 220 nm.


Hình 3.61. Lựa chọn bước sóng và những bước sóng mang lại độ nhạy tốt nhất

Đối với phép phân tích đa thành phần, kỹ thuật này có thể sử dụng để nhận diện bước sóng hoặc

những bước sóng tối ưu cho từng thành phần. Những bước sóng này được áp dụng trực tiếp vào phương

pháp hàm đồng thời duy nhất hoặc sử dụng làm chỉ dẫn về dải sóng tối ưu trong phương pháp bình

phương tối thiểu.

Dải động học

Dải động học là khoảng cách giữa (và bao gồm) các mức trên và mức dưới của chất phân tích được

tính toán với độ chính xác, độ đúng và độ tuyến tính yêu cầu (Range is the between (and including) the

upper and lower levels of analyte that heva been calculated with the required precision, accuracy, and

linaerity).

Dải được xác định nhờ trước tiên là phân tích mẫu có chứa những mức nồng độ chất phân tích khác

nhau. Sau đó sử dụng các công cụ đã mô tả ở trên để tính toán độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng

các kết quả.

Độ chọn lọc

Độ chọn lọc là khả năng của một phương pháp trong định lượng chính xác và đặc trưng chất phân

tích hoặc các chất phân tích trong sự có mặt của các chất khác (Selectivity is the ability of a method to

quantify accurately and specifically the analyte or analytes in the presence of other compounds.)

Sự có mặt của bất kỳ chất phân tích nào khác mà có khả năng hấp thụ tại bước sóng được sử dụng

để định lượng chất phân tích sẽ gây ra lỗi định lượng. Những hợp chất khác này có thể là các tiền chất

tổng hợp, các tạp chất đã biết, các tá dược hoặc các sản phẩm phân huỷ trong nền mẫu. Nếu đã biết

trước kiểu ảnh hưởng, người phát triển phương pháp có thể khảo sát phổ chất phân tích và phổ ảnh

hưởng để lựa chọn một bước sóng mà tại đó chất phân tích của chúng ta hấp thụ đáng kể nhưng chất

ảnh hưởng ít hấp thụ. Nếu việc lựa chọn bước sóng không đủ khả năng khắc phục hiệu ứng của chất ảnh

hưởng, có thể áp dụng kỹ thuật hiệu chỉnh phù hợp khác như kỹ thuật sử dụng một bước sóng đẳng hấp

thụ (isoabsorbance).

Nếu nhận diện và/hoặc phổ của các chất ảnh hưởng có thể có mà chưa biết trước về chúng, hướng

thực nghiệm dùng cho nhận diện đã mô tả ở trên có thể được dùng để xác định xem bước sóng hay

những bước sóng nào mang lại độ đúng tốt nhất. Trong trường hợp này các mẫu kiểm tra cần chứa chất

ảnh hưởng. Nếu đã biết trước nồng độ chất phân tích trong mẫu, bước sóng mang lại kết quả gần với giá

trị đã biết nhất sẽ có độ chọn lọc tốt nhất. Nếu chưa biết nồng độ chất phân tích, bước sóng tạo ra nồng

độ thấp nhất thường mang lại độ chọn lọc cao nhất (tạp chất luôn cộng thêm vào độ hấp thụ, gây ra kết

quả cao nghiêm trọng).

Trong ví dụ ở hình 3.62, mẫu phẩm nhuộm mầu vàng bị ô nhiễm bởi phẩm nhuộm mầu đỏ. Đồ thị

nồng độ theo bước sóng chỉ ra rằng bước sóng nằm giữa 390 và 420 nm tạo ra độ chọn lọc tốt nhất. Chú

ý do ô nhiễm, dải lỗi độ đúng phải rộng hơn so với phẩm nhuộm mầu vàng tinh khiết.


Hình 3.62. Lựa chọn bước sóng hoặc những bước sóng mang lại độ chọn lọc tốt nhất

Ruggedness

Ruggedness là mức độ tái lặp lại các kết quả kiểm tra, thu được nhờ phân tích cùng mẫu dưới đa

dạng nhiều điều kiện kiểm tra thông thường (Ruggdness is the degree of reproducibility of test results

obtained by analyzing the same samples under a variety of normal test conditions).

Phương pháp phải không bị tác động bởi những thay đổi về thời gian và vị trí. Cần phải thiết lập độ

tái lặp của phương pháp dưới những điều kiện khác nhau, lấy ví dụ với những lô hoá chất khác nhau, tại

những mức nhiệt độ thực nghiệm khác nhau và ở những mốc thời gian thực nghiệm trôi qua khác nhau.

Ruggdness của một phương pháp phân tích được xác định nhờ phân tích những phần nhỏ hơn của

một mẫu đồng nhất trong các phòng thí nghiệm khác nhau và trên những trang thiết bị khác nhau. Các

kết quả kiểm tra này được thực hiện bởi các nhà phân tích khác nhau dưới những điều kiện vận hành và

điều kiện môi trường có sự dao động nhưng vẫn rơi vào phạm vi đã xác lập cho các thông số. Sau đó

mức độ tái lặp lại của các kết quả được tính toán thành hàm của các dao động thực nghiệm. Giá trị này

có thể được so sánh với độ chính xác của phương pháp dưới những điều kiện bình thường để có được

giá trị đo ruggedness của nó.

3.6.1.12 Kiểm tra hiệu quả thiết bị

Trong vài năm trở lại đây, những yêu cầu về chất lượng được ISO9000 (BS 5750), Phòng thí

nghiệm thực hành tốt (Good Laboratory Practice GLP), Thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing

Practice GMP) và United Kingdom National Measurement Accreditation Service NAMAS đều đã có sự

gia tăng về tính quan trọng. Theo đó trong công nghiệp dược phẩm, những đề nghị có trong dược điển

trở nên có tính thuyết phục hơn. Việc kiểm tra liên tục hiệu quả hợp lý các thiết bị phổ UV-VIS là một

yếu tố then chốt đáp ứng những yêu cầu về chất lượng này.

Các thông số kiểm tra

Mặc dù không có một định nghĩa rõ ràng nào về những thông số nào cần được kiểm tra để thẩm

định hiệu quả thiết bị, nhìn chung các nhà chế tạo và người sử dụng đều đi đến thống nhất về tiêu chuẩn

thảo luận dưới đây xứng đáng được tính đến.

ĐỘ ĐÚNG VÀ ĐỘ CHÍNH XÁC BƯỚC SÓNG

Độ đúng của bước sóng là tiêu chuẩn hiệu quả thiết bị quan trọng nhất để phân biệt các phổ đồ khi

chúng được đo trên những thiết bị khác nhau. Nó cũng đóng vai trò trong phép phân tích định lượng khi

sử dụng đến các hệ số tắt. Do các hệ số này phụ thuộc vào bước sóng, những phép đo này phải được

thực hiện tại chính xác cùng một bước sóng mà đầu tiên tại đó những hệ số này được xác định. Tuy

nhiên khi so sánh các phổ đồ hoặc các giá trị độ hấp thụ được đo trên cùng thiết bị (khi mà hầu hết các

phép phân tích định lượng đều đo dung dịch chuẩn), thì độ chính xác bước sóng mới là thông số tới hạn.

Để đo độ đúng và độ chính xác bước sóng đòi hỏi có dung dịch chuẩn tham chiếu. Lý tưởng thì

chuẩn này có các píc rõ ràng và rất hẹp tại một loạt bước sóng nằm rải suốt dải UV và VIS như chỉ ra


trong hình 3.63. Hiện không thể có được chuẩn lý tưởng này, mặc dù một số chuẩn đạt đến gần lý tưởng.

Hiện tại đối với các chuẩn độ đúng bước sóng, do các píc không cân đối lý tưởng nên sự thay đổi độ

rộng khe của thiết bị sẽ có chút ít tác động lên vị trí píc đo được.

Hình 3.63. Phổ lý tưởng cho độ hấp thụ và chuẩn bước sóng

ĐỘ ĐÚNG VÀ ĐỘ CHÍNH XÁC PHỔ

Độ đúng phổ là tiêu chuẩn quan trọng nhất đối với phép phân tích định lượng khi sử dụng hệ số tắt.

Tuy nhiên để so sánh các phép đo, độ chính xác phổ mới là thông số tới hạn.

Cần một chuẩn tham chiếu để đo độ đúng và độ chính xác phổ. Lý tưởng thì chuẩn này phải có được

độ hấp thụ không đổi tại tất cả các bước sóng xuyên suốt dải UV và VIS (hình 3.63) cốt để lỗi độ đúng

bước sóng không tác động lên kết quả. Trong thực tế thì không có được một chuẩn như vậy, mặc dù

thuỷ tinh trung tính đạt đến gần như là lý tưởng trong dải sóng VIS. Điển hình thì các chuẩn được sử

dụng có các píc và vùng lõm rộng.

PHÂN TÁN ÁNH SÁNG

Phân tán ánh sáng là yếu tố tác động mạnh nhất lên tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng

độ tại những độ hấp thụ cao. Nó gây ra sự xê dịch có tính hệ thống hạ thấp độ hấp thụ khi gia tăng nồng

độ. Phân tán ánh sáng cũng là nguồn tác động chính lên giới hạn giới hạn trên của dải động học tuyến

tính đối với một phép phân tích.

Để đo độ phân tán ánh sáng cần đến một bộ lọc. Bộ lọc này sẽ hấp thụ tất cả ánh sáng tại bước sóng

thực hiện phép đo và truyền qua tại những bước sóng cao hơn và thấp hơn (nguồn phân tán ánh sáng,

hình 3.64). Tuy nhiên trong thực tế cũng không thể có được một bộ lọc như vậy. Thay vào đó những bộ

lọc cut-off (bộ lọc mang lại độ hấp thụ bằng một đơn vị) truyền qua tất cả ánh sáng nằm trên hoặc dưới

một bước sóng nào đó và chặn tất cả ánh sáng trong dải sóng đo được sử dụng.

Hình 3.64. Phổ lý tưởng của một bộ lọc ánh sáng phân tán


ĐỘ PHÂN GIẢI

Độ phân giải là yếu tố tới hạn trong xác định hình dạng các píc đo được. Nhìn chung độ phân giải

phải tốt hơn xấp xỷ 10 lần độ rộng băng của píc được đo. Nếu thiết bị không đủ độ phân giải, độ hấp thụ

đo được tại cực đại hấp thụ sẽ quá thấp. Theo đó độ đúng của phổ sẽ có sự xê dịch mang tính hệ thống.

Sự xê dịch này đóng một vai trò theo chốt nếu như độ đúng tuyệt đối là yếu tố căn bản, nhưng như đã

thảo luận trong mục “Độ phân giải phổ” của phần thảo luận về “Phát triển và phê chuẩn phương pháp”,

nó trở nên ít quan trọng trong các phép đo tương đối kiểu như phép định lượng.

Đo độ phân giải là một công việc khó khăn. Kinh nghiệm cách giải quyết thường được dùng là đo

chiều cao tương đối của píc và vùng lõm đối với mẫu có băng hẹp.

ĐỘ ỒN

Độ ồn là yếu tố chủ yếu tác độ lên độ chính xác các phép đo độ hấp thụ. Nó đặc biệt quan trọng ở

những độ hấp thụ thấp, khi mà tại những mức độ hấp thụ này được dùng để xác định giới hạn phát hiện.

Điển hình thì ồn được đo tại độ hấp thụ zero (không có mẫu nằm trên đường truyền ánh sáng).

ĐƯỜNG NỀN PHẲNG

Thường thường thì việc đo ồn tại tất cả các bước sóng không mang tính thực tế. Tuy nhiên độ

phẳng của đường nền chỉ thị cho ồn tại tất cả các bước sóng và hé lộ những vấn đề về thiết bị hình thành

từ sự chuyển đổi bộ lọc hoặc thay đổi nguồn sáng.

ĐỘ ỔN ĐỊNH

Độ ổn định tác động lên độ đúng của các phép đo độ hấp thụ như là một hàm theo thời gian. Độ trôi

trong các phép đo độ hấp thụ gây ra lỗi hệ thống về độ đúng phổ.

Điển hình độ ổn định được đo tại độ hấp thụ zero.

ĐỘ TUYẾN TÍNH

Độ tuyến tính thường được xem là một thông số quan trọng để thẩm tra hiệu quả. Tuy nhiên do độ

tuyến tính phụ thuộc nhiều vào mẫu, chúng ta có cảm giác tốt nhất là nó được đo trong một phép kiểm

tra tính tương thích hệ thống như được mô tả dưới đây.

Vấn đề chính trong phép thẩm tra hiệu quả cho thấy một thực tế tất cả các thông số được liệt kê ở

trên phụ thuộc vào bước sóng và trong trường hợp phân tán ánh sáng là phụ thuộc vào mẫu. Do việc

thực hiện tất cả các phép kiểm tra tại tất cả các bước sóng là phi thực tế, nên chỉ một số ít bước sóng đại

diện cho mục đích mong đợi được lựa chọn. Kết quả của các phép kiểm tra này được so sánh với chỉ số

kỹ thuật hiệu quả tuyệt đối dành cho phương pháp đang sử dụng. Phép thẩm định hiệu quả sẽ chứng

minh một cách thiết thực rằng các đặc trưng hiệu quả có bị thay đổi hay không, và sự thay đổi đó có

theo hướng tác động lên tính đúng đắn của các kết quả phân tích hay không.

Tuy nhiên, sự tuân thủ tiêu chuẩn trên (được xác định khi sử dụng một tệp các chuẩn tham chiếu

phù hợp) không bảo đảm rằng một phép phân tích cụ thể có thể được thực hiện với việc đáp ứng độ

đúng và độ tuyến tính yêu cầu. Do nhiều thông số phụ thuộc vào mẫu, độ đúng và độ tuyến tính mong

đợi chỉ có thể đạt được với một phép kiểm tra tính tương thích hệ thống và được thực hiện trên ngay bản

thân mẫu.

Chất chuẩn

Mô tả chi tiết về tất cả các chuẩn và những lợi thế, bất lợi liên quan đến chúng nằm ngoài mục đích

trình bày trong cuốn sách này. Có một số tài liệu đề cập sâu hơn về vấn đề này như:

1. Standards in Absorption Spectrometry, Techniques in Visible and Ultraviolet Spectrometry:

Volume 1; Burgess, C.; Knowles, A., Eds.; Chapman & Hall: London, 1981.

2. Nowicka-Jankowska, T.; Gorczynska, A.; Michalik, A,; Wieteska, E. Comprehensive

Analytical Chemistry, Volume XIX, Analytical Visible And Ultraviolet Spectrometry; Elsevier:

Amsterdam, 1986.


Dưới đây là một số bình luận chung liên quan đến 3 kiểu chất chuẩn chính:

CHẤT CHUẨN PHÁT XẠ

Một số nguồn phát xạ như đèn hồ quang thuỷ ngân và đèn hồ quang deuterium cho ra những vạch

sắc nét tại những bước sóng cụ thể, là những nguồn lý tưởng dùng để kiểm tra độ đúng và độ chính xác

bước sóng. Thực tế trong nhiều thiết bị phổ hiện đại, các vạch deuterium tại 486,0 và 656,1 nm của bản

thân nguồn sáng được dùng để kiểm tra và chuẩn lại độ đúng bước sóng. Tuy nhiên nguồn phát xạ đòi

hỏi phải có nguồn cấp năng lượng điện, và nếu thiết bị tự chuẩn sử dụng nguồn deuterium gắn sẵn thì

một chuẩn khác phải được dùng để thẩm tra. Hơn thế nữa những nguồn phát xạ không phải là mẫu điển

hình nên chúng không kiểm tra được toàn bộ hệ thống.

CHUẨN HẤP THỤ THỂ RẮN

Các chuẩn rắn không yêu cầu có thêm bất kỳ bước chuẩn bị nào, dễ dùng và bảo quản, tương đối ít

nhạy với nhiệt độ và có độ ổn định tốt theo thời gian. Tuy nhiên với các chuẩn rắn không thể bảo đảm

được tính đồng thể từ chuẩn này sang chuẩn khác hoặc từ lô vật liệu này sang lô vật liệu khác. Do đó

mỗi một chuẩn phải được chuẩn riêng độc lập trên một thiết bị phổ tham chiếu. Do quá trình này mất

thời gian nên các chuẩn rắn đắt tiền. Hơn thế nữa các chuẩn rắn không có độ ổn định tuyệt đối nên

chúng phải được đưa quay lại để chuẩn lại tại những khoảng thời gian định kỳ. Sau cùng thì những mẫu

này phải được giữ cực kỳ sạch sẽ và không được dùng để kiểm tra các hệ thống phân tích trong dòng

chảy.

Bảng dưới đây tổng kết một số chuẩn rắn được biết là tốt nhất, mục đích sử dụng, những lợi thế và

bất lợi của chúng.

Bảng 3.7. Một số chuẩn thể rắn

Chuẩn Sử dụng Lợi thế Bất lợi

Thuỷ tinh Holmium oxit Chuẩn bước sóng Có các píc nằm tại bất

kỳ bước sóng nào từ

280 đến 2000 nm

Vị trí các píc thay

đổi từ lô này sang

lô khác

Thuỷ tinh Didymium

oxit

Chuẩn bước sóng Có các píc nằm tại bất

kỳ bước sóng nào từ

400 đến 1920 nm

Vị trí các píc thay

đổi từ lô này sang

lô khác và không

có píc nằm duới

400nm

Ngọc hồng lựu

Neodymium yttrium

alumium

Chuẩn bước sóng Có các píc tại bất kỳ

bước sóng nào từ 350

đến 1000 nm

Không có píc nằm

dưới 350 nm

Thuỷ tinh trung tính Chuẩn phổ Hiện trạng hấp thụ rất

phẳng trong vùng sóng

VIS

Không phù hợp

cho dải UV

Không tuyệt đối

ổn định, phải

chuẩn lại định kỳ

CHUẨN HẤP THỤ DẠNG LỎNG

Thông thường các chuẩn dạng lỏng là chuẩn vật lý thuần tuý. Mặt khác nếu các chuẩn lỏng được

chuẩn bị nhờ sử dụng những vật liệu tinh khiết phù hợp, bản thân chúng có các thuộc tính hấp thụ, cực

đại píc và v.…v…được yêu cầu để kiểm tra độ đúng. Do việc chuẩn các dung dịch (calibration) là

không cần thiết nên các chuẩn lỏng tương đối rẻ tiền. Các chuẩn này cũng có thể được dùng để kiểm tra

hệ thống dòng. Hơn thế nữa quá trình sử dụng một dung dịch làm chuẩn gần giống với quá trình dùng

cho một mẫu bình thường. Nhìn chung bất lợi của chuẩn lỏng là chúng phải được chuẩn bị tươi mới.

Công việc chuẩn bị này mất thời gian và đòi hỏi có một mức độ kỹ năng nhất định từ bộ phận người vận

hành. Một số nhà cung cấp đã cố gắng khắc phục vấn đề này bằng cách cung cấp các chuẩn đóng kín

trong cuvet. Tuy nhiên do bản thân cuvet đóng góp một phần độ hấp thụ nên những chuẩn này phải

được chuẩn và chuẩn lại độc lập, việc làm đó gia tăng chi phí. Hơn nữa do chuẩn lỏng ít ổn định hơn


chuẩn rắn, chúng phải được chuẩn lại thường xuyên hơn. Các dung dịch đã chuẩn bị được đóng kín

trong ămpul, sử dụng với các cuvet thường mang lại cả tính dễ sử dụng và hiệu quả kinh tế.

Bảng 3.8. Một số chuẩn lỏng

Chuẩn Sử dụng Lợi thế Bất lợi

Holmium oxit trong axit

perchloric

Chuẩn bước sóng Có các píc nằm tại

bất kỳ bước sóng nào

từ 240 đến 650 nm

Không có píc ổn định

trên 650 nm

Samarium oxit trong axit

perchloric

Chuẩn bước sóng Có các píc nằm tại

bất kỳ bước sóng nào

trong dải 300 đến 500

nm

Không có píc ổn định

trên 500 nm

Benzen (hơi) Chuẩn bước sóng Có các píc rất hẹp từ

230 đến 260 nm

Dải sóng rất hạn chế

Potassium dichromat

trong axit perchloric hoặc

sulfuric

Chuẩn phổ Có các píc rộng tại

257 và 350 nm và các

vùng lõm rộng tại

235 và 313 nm

Không hấp thụ trong

dải vis. Rất nhạy pH

và là tác nhân oxihoa

mạnh, có thể không

ổn định.

Hỗn hợp muối Co và Ni Chuẩn phổ Có các píc tại 302,

395, 512 và 678 nm

bao phủ vùng UV và

VIS

Do các băng phổ khá

hẹp, độ đúng bước

sóng có thể tác động

lên kết quả

Dung dịch NaNO2 (50

g/l)

Phân tán ánh

sáng

Cut-off tại 390 nm.

Được dùng để đo

phân tán ánh sáng tại

340 nm hoặc dưới đó

Không

Dung dịch KI hoặc NaI Phân tán ánh

sáng





Có khuynh hướng

phân huỷ

Dung dịch KCl (12 g/l) Phân tán ánh

sáng





Do phép đo được

thực hiện trên một

mặt của góc cutoff,

lỗi độ đúng bước

sóng có thể tác độ lên

độ phân tán ánh sáng

đo được

Toluen trong hexan Độ phân giải Hướng giải quyết

theo kinh nghiệm sử

dụng píc (269 nm) và

vùng lõm (266 nm)

trong phổ TOLUEN

Chỉ có thể được dùng

để xác định độ phân

giải tại một điểm

trong phổ. Có thể có

sự thay đổi bước

sóng

Các yêu cầu pháp lý

Mục dưới đây chúng ta sẽ xem lại một số trong số nhiều quy định pháp lý quan trọng bao trùm lên

vấn đề sử dụng các thiết bị phổ UV-VIS.


GLP/GMP

Các yêu cầu về GLP và GMP dùng để phê chuẩn thiết bị có thể được tổng kết như sau:

Lập tài liệu thẩm tra rằng hệ thống hoặc các hệ thống phụ trợ hoạt động như một đại diện đáp ứng từ

đầu đến cuối nhu cầu mong đợi hoặc đáp ứng dải vận hành cho trước (Documented verification that the

system or subsystem performs as intended throughout representative or anticipated operating ranges).

Đối với lĩnh vực phổ, nguyên tắc chỉ đạo đưa ra như sau:

Vào lúc thích hợp, các phép kiểm tra định kỳ cần được thực hiện (lấy ví dụ,… độ phân giải, chỉnh

xắp hàng hệ quang và độ đúng bước sóng của các thiết bị phổ ….).

DƯỢC ĐIỂN CHÂU ÂU

Có thể tìm thấy những yêu cầu đối với trang thiết bị phổ UV-VIS được sử dụng cho phép phân tích

dược phẩm khu vực Âu Châu trong dược điển Âu Châu (EP). Các yêu cầu này dựa trên và gần như là

tương tự với các yêu cầu được liệt kê dược điển quốc gia, ví dụ như dược điển Anh Quốc (BP) ở Great

British và Deutsche Arzneimittelbuch (DAB) ở Đức

Kiểm soát các bước sóng - kiểm tra tỷ lệ bước sóng sử dụng cực đại hấp thụ của dung dịch holmium

perchlorate, vạch của đèn phóng điện hydrogen hoặc đèn phóng điện deuterium hoặc những vạch của hồ

quang hơi thuỷ ngân được chỉ ra dưới đây. Dung sai cho phép là 1 nm đối với dải UV và 3 nm đối

với dải VIS.

241,15 nm (Ho) 404,66 nm (Hg)

253,70 nm (Hg) 435,83 nm (Hg)

287,15 nm (Ho) 486,00 nm (D)

302,25 nm (Hg) 486,10 nm (H)

313,16 nm (Hg) 536,30 nm (Ho)

334,15 nm (Hg) 546,07 nm (Hg)

361,50 nm (Ho) 576,96 nm (Hg)

365,48 nm (Hg) 579,07 nm (Hg)

Kiểm soát độ hấp thụ - Kiểm tra độ hấp thụ sử dụng dung dịch K2Cr2O7 R tại những bước sóng đưa ra

trong bảng dưới đây, bảng dưới đây đưa ra cho mỗi bước sóng một giá trị chính xác A (1%, 1 cm) và

giới hạn cho phép

Bước sóng (nm) A (1%, 1 cm) Dung sai tối đa

235 124,5 122,9 – 126,2

257 144,0 142,4 – 145,7

313 48,6 47,0 – 50,3

350 106,6 104,9 – 108,2

Giới hạn phân tán ánh sáng - Sự phân tán ánh sáng có thể được phát hiện tại một bước sóng cụ thể với bộ

lọc hoặc dung dịch phù hợp: lấy ví dụ độ hấp thụ của dung dịch 1,2% m/V KCl R trong cell 1 cm phải

lớn hơn 2 tại 200 nm khi được so sánh với nước được dùng làm chất lỏng bù trừ.

Năng suất phân giải – khi đã được quy định có mặt trong một công trình nghiên cứu, phép đo độ phân

giải của trang thiết bị là như sau: ghi phổ của dung dịch 0,02% V/V toluen R trong hexan R. Tỷ lệ tối

thiểu của độ hấp thụ tại cực đại 269 nm so với độ hấp thụ tại cực tiểu 266nm đáp ứng như đã được công

bố trong công trình nghiên cứu.

LƯU Ý: BP công bố tỷ lệ phải “…không nhỏ hơn 1,5 trừ phi tỷ lệ này được chỉ rõ khác đi trong

công trình nghiên cứu.”


DƯỢC ĐIỂN HOA KỲ

Tại Hoa Kỳ, các quy định pháp lý đối với thiết bị phổ UV-VIS không được định nghĩa một cách rõ

ràng như ở Âu Châu. Dược điển Hoa Kỳ (USP) XII, mục 831 (“Spectrophotometry and light

scattering”) công bố:

Kiểm tra độ đúng của công việc chuẩn thiết bị. ….Tỷ lệ bước sóng cũng có thể được chuẩn nhờ đo

những bộ kính lọc phù hợp, những bộ lọc này có các băng hấp thụ hữu ích qua cả vùng VIS và vùng UV.

Kính lọc chuẩn có chứa didymium (một hỗn hợp của praseodymium và neodymium) đã được sử dụng

rộng rãi. Kính lọc có chứa holmium được xem là tốt hơn.

Để kiểm tra tỷ lệ phổ, một số kính lọc thuỷ tinh vô cơ chuẩn cũng như những dung dịch chuẩn đã

biết trước độ truyền qua như là dung dịch K2Cr2O7 hoặc K2CrO4 được sử dụng.

Mới đây có đưa ra một tham chiếu chéo:

Để có thêm chi tiết về cả tỷ lệ bước sóng và tỷ lệ phổ của một thiết bị phổ, việc lấy tham chiếu có

thể được thực hiện theo các tài liệu của Viện chất chuẩn và công nghệ quốc gia (NIST).

Viện chất chuẩn và công nghệ quốc gia (NIST) đưa ra một dải các chất chuẩn thể rắn và thể lỏng để

xác định độ đúng bước sóng, độ đúng phổ và ánh sáng phân tán. Bảng dưới đây tổng kết những chuẩn

quan trọng nhất.

Bảng 3.9. Các chuẩn NIST

SRM# Kiểu Mô tả NIST

930 Kính lọc trung tính SRM này dùng để thẩm tra và chuẩn tỷ lệ độ

truyền qua và độ hấp thụ của thiết bị phổ hấp thụ

visible.

931 Dung dịch Co và Ni trong hỗn hợp HNO3/HClO4 SRM để thẩm tra và chuẩn tỷ lệ độ hấp thụ của

các thiết bị phổ hấp thụ ultraviolet và visible có

băng thông hẹp.

935 K2Cr2O7 rắn để chuẩn bị dung dịch kiểm tra SRM để thẩm tra và chuẩn tỷ lệ độ hấp thụ của

thiết bị phổ hấp thụ ultraviolet

2031 Kim loại trong thạch anh SRM này để thẩm tra và chuẩn tỷ lệ độ hấp thụ

và độ truyền qua của thiết bị phổ hấp thụ

ultraviolet và visible

2034 Dung dịch HoO trong HClO4 SRM này để sử dụng trong thẩm tra và chuẩn tỷ

lệ bước sóng của thiết bị phổ hấp thụ ultraviolet

và visible có độ rộng băng phổ danh nghĩa không

vượt quá 3 nm

2032 KI rắn để chuẩn bị dung dịch kiểm tra SRM này sử dụng ấn định năng lượng

heterochromic stray radiant (phân tán ánh sáng)

trong thiết bị phổ hấp thụ ultraviolet

CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CHUẨN MỸ CHÂU

Các phương pháp kiểm tra chuẩn Mỹ Châu (ASTM) công bố các phương pháp kiểm tra để đo những

đặc trưng hiệu quả then chốt của các thiết bị phổ UV-VIS.

Độ đúng và độ chính xác bước sóng: được xác định nhờ sử dụng đèn phóng điện hơi thuỷ ngân (vùng UV),

đèn hồ quang deuterium hoặc đèn hồ quang hydrogen (vùng VIS), hơi thuỷ ngân (vùng UV), hoặc kính

lọc HoO hoặc dung dịch holmium perchlorate (vùng UV và vùng VIS). ASTM đề nghị rằng những

bước sóng chuẩn được dùng phải bao phủ bước sóng phân tích.

Độ tuyến tính: được xác định nhờ chuẩn bị một đường cong làm việc phân tích với chất phân tích mục

tiêu (xem “Tính tương thích hệ thống” sẽ trình bày sau).

Độ đúng phổ: được xác định sử dụng các chuẩn NIST 930, 2031, hoặc 935.


Độ chính xác phổ: được xác định sử dụng khảo sát mettalic hoặc dùng kính lọc phù hợp.

Tính quan trọng của độ rộng khe và độ phân giải đã được đề cập đến trong tài liệu ASTM, nhưng

thực tế không đưa ra một phương pháp nào để đo các thông số này. ASTM công bố bổ sung tài liệu mô

tả các chất chuẩn và các quy trình dùng đo độ phân tán ánh sáng.

Bảng 3.10 dưới đây tổng kết các yêu cầu và các đề nghị của các ban pháp lý khác nhau

Bảng 3.10. Các thông số và chuẩn được áp dụng bởi các cơ quan pháp lý chính yếu

Kiểu test Chuẩn USP NIST – SRM

EP ASTM

Độ đúng

bước sóng

Dung dịch

Holmium

perchlorate

- 2034 S X

Kính HoO X - - X

Đèn hồ quang D2 X - S X

Đèn hồ quang Hg X - S X

Hơi benzen - - - X

Độ đúng và

độ tuyến tính

phổ

Dung dịch K2Cr2O7 X 935 S X

Kính trung tính - 930 - X

Dung dịch muối Co

và Ni

- 931 - X

Kim loại trên thạch

anh

- 2031 - X

Phân tán ánh

sáng

Dung dịch KCl - - S X

Dung dịch KI - 2032 - -

Dung dịch NaI - - - X

Dung dịch NaNO2 - - - X

Độ phân giải Dung dịch toluen

trong hexan

- - S -

Nội dung:

USP: chỉ phương pháp kiểm tra

NIST SRM: vật liệu chuẩn và phương pháp kiểm tra

EP: phương pháp kiểm tra và chỉ số kỹ thuật tối thiểu

ASTM: chỉ phương pháp kiểm tra

Việc chọn các chất chuẩn phụ thuộc vào phép phân tích được thực hiện trên thiết bị. Điều kiện lựa

chọn này được nêu bật bằng những yêu cầu GLP, những yêu cầu về phép thẩm tra cần được thực hiện

đáp ứng dải vận hành mong đợi và dải vận hành được dự đoán từ trước, theo những đề nghị của ASTM

và các quy định của NIST thì những bước sóng được dùng để chuẩn (calibration) bao trùm lên bước

sóng phân tích. Do đó lấy ví dụ, nếu mục đích mong muốn là đo độ hấp thụ trong vùng UV (giống như

trong hầu hết các phép phân tích dược phẩm), độ đúng phổ phải được kiểm tra không chỉ trong dải VIS

mà còn trong cả dải UV, tốt nhất là kiểm tra được tại vài bước sóng. Như vậy việc kiểm tra độ đúng

bước sóng chỉ tại vạch deuterium 656,1 nm là không phù hợp, do vậy đây không phải là một chỉ thị tin

cậy về độ đúng bước sóng trong vùng UV.

ĐỀ NGHỊ

Mặc dù không xác định rõ tệp các chuẩn kiểm tra hiệu quả một thiết bị phổ, nhưng những phép kiểm

tra dưới đây được đề nghị đối với người dùng là những ai chủ yếu phân tích các mẫu lỏng và những ai

cần đến sự tuân thủ các yêu cầu quy định chung.


Độ đúng bước sóng: Dung dịch holmium perchlorate (40 g HoO trong HClO4 10% v/v). Hình dưới đây chỉ

ra một phổ đồ của dung dịch này.

Hình 3.65: Phổ của dung dịch holmium perchlorate

Bảng tiếp theo đưa ra các giá trị được NIST chỉ rõ đối với những píc tham chiếu không ổn định tại 3

độ rộng băng phổ thiết bị khác nhau (SBWs). Các giá trị này được ưu tiên sử dụng hơn so với các giá trị

EP do EP không chỉ rõ SBW hoặc nhiệt độ được sử dụng do các giá trị EP và NIST bộc lộ sự khác biệt

đáng kể.

Bảng 3.11. Các giá trị NIST đối với các píc

dung dịch holmium perchlorate

SBW

0,5 nm 1,0 nm 2,0 nm

241,01 241,08 240,90

249,79 249,87 249,98

278,13 278,10 278,03

287,01 287,18 287,47

333,43 333,44 333,40

345,52 345,47 345,49

361,33 361,31 361,16

385,50 385,66 385,86

416,09 416,28 416,62

- 451,30 451,30

467,80 467,83 467,94

485,27 485,29 485,33

536,54 536,64 536,97

640,49 640,52 640,48

Độ đúng phổ: dung dịch K2Cr2O7 (xấp xỷ 60 mg/l trong 0,01N H2SO4). Hình dưới đây chỉ ra phổ của

dung dịch này. Các giá trị EP đối với chuẩn này được chỉ ra trên bảng tiếp theo.


Hình 3.66. Phổ của K2Cr2O7

Nếu các phép đo được thực hiện trong vùng VIS, thực hiện thêm phép kiểm tra trong vùng VIS với

kính lọc trung tính (ví dụ NIST SRM 930 là kính lọc phù hợp).

Phân tán ánh sáng: Dung dịch NaNO2 (50 g/l), NaI (10 g/l) và KCl (12 g/l) trong nước. Ba dung dịch

này cho phép đo độ phân tán ánh sáng tại 3 bước sóng khác nhau. Hình 3.67 chỉ ra các phổ đồ của

những dung dịch này. Nhìn chung NaNO2, NaI hoặc KI được đề nghị sử dụng, nhưng đối với người sử

dụng cần đến sự tương thích với các yêu cầu EP, KCl cần được sử dụng.

Hình 3.67. Phổ của dung dịch chuẩn sự phân tán ánh sáng

Độ phân giải: Dung dịch toluen trong hexan (0,02% v/v) được chỉ định trong EP. Hình 3.68 miêu tả

phổ của dung dịch này.


Hình 3.68. Phổ của toluen trong hexan

Độ phân giải được đánh giá nhờ lấy tỷ lệ độ hấp thụ của cực đại gần 269 nm so với độ hấp thụ của

cực tiểu gần 266 nm. Bằng kinh nghiệm cho thấy tỷ lệ này có liên quan đến SBW như chỉ ra trong bảng

dưới đây.

Bảng 3.12. SBW và tỷ lệ 269/266 nm (toluen)

SBW (nm) Tỷ lệ độ hấp thụ tại 269 nm so

với độ hấp thụ tại 266 nm

0,25 2,30

0,50 2,20

1,00 2,00

2,00 1,40

3,00 1,10

4,00 1,00

Độ ồn, độ phẳng đường nền và độ trôi cũng cần phải đo với vùng mẫu sạch (clear sample area).

Không đòi hỏi có chuẩn.

3.6.1.13 Thiết bị tự kiểm tra

Toàn bộ việc thẩm định hiệu quả của một thiết bị phổ tiêu tốn thời gian và do đó thường chỉ được

thực hiện theo thời gian định kỳ. Chu kỳ này được xác định theo độ ổn định của thiết bị. Để bảo đảm bất

kỳ sự lệch lạc nào so với hiệu quả xuất hiện giữa các lần thẩm định đều được phát hiện trong một khung

thời gian, thiết bị cần được trang bị các chức năng tự kiểm tra thường nhật, những chức năng này có thể

chạy hàng ngày. Những kiểm tra thường nhật này gồm kiểm tra vận hành điện tử và kiểm tra vận hành

quang học thiết bị phổ cũng như các phép kiểm tra độ đúng bước sóng với một hoặc cả hai vạch đèn

deuterium.

3.6.1.14 Tính tương thích hệ thống

Tính tương thích hệ thống được thiết kế để đánh giá các cấu kiện của một hệ thống phân tích, để

kiểm tra xem hệ thống đó có đáp ứng được các tiêu chuẩn do phương pháp yêu cầu. Không được lẫn lộn

tính tương thích hệ thống với việc phê chuẩn phương pháp. Trong khi việc phê chuẩn phương pháp

được thực hiện một lần vào cuối giai đoạn phát triển phương pháp thì các phép kiểm tra tính tương thích

hệ thống được thực hiện định kỳ trên một hệ thống cụ thể để xác định sự tương thích hoặc tính hiệu lực.

Những yêu cầu về tính tương thích hệ thống đã được xác lập rõ cho các hệ thống sắc ký nhưng chưa cụ

thể đối với các hệ thống phổ UV-VIS.

Trong thực tế, các nhà phân tích đã phát triển các chiến lược của riêng họ để thực hiện phép kiểm

tra tính tương thích hệ thống trên các thiết bị UV-VIS. Dưới đây là 2 ví dụ:


A. Đo và chuẩn (calibrate) dùng một chuẩn với nồng độ tương đương 100% nồng độ thành phần

mong đợi. Sau đó đo và định lượng chuẩn và chuẩn pha loãng 2 lần. Các kết quả của cả hai mẫu

phải rơi vào phạm vi tỷ lệ phần trăm cụ thể so với nồng độ đã biết. Việc đo lại chuẩn xác nhận

độ đúng của phép đo ban đầu.

B. Đầu tiên đo chuẩn sau đó đo một loạt dung dịch pha loãng của chuẩn và tính toán hệ số tắt (độ

hấp thụ chia cho nồng độ) đối với mỗi nồng độ. Các giá trị hệ số tắt phải không thay đổi nhiều

hơn một tỷ lệ phần trăm cụ thể.

3.6.1.15 Vận hành hợp lý

Tuy nhiên các phép đo kiểm soát chất lượng tốt như các phép kiểm tra thẩm định hiệu suất thiết bị

và phép phê chuẩn phương pháp, các kết quả độ đúng và độ chính xác vẫn phụ thuộc nhiều vào yếu tố

con người. Mặc dù có thể không bao giờ đánh giá được yếu tố này, nhưng từng bước có thể được tiến

hành cùng với việc giảm lỗi do con người gây ra.

Lưu giữ điện tử

Hầu hết các thiết bị phổ hiện đại đều được trang bị bộ vi xử lý hoặc được điều khiển máy tính và

mang đến khả năng lưu giữ điện tử các thông số phương pháp. Lý tưởng thì tất cả các thông sô liên quan

cần được lưu giữ trong một tệp tin phương pháp duy nhất dưới một cái tên riêng. Khi người vận hành

vào tên phương pháp, tất cả các thông số được đặt một cách tự động, do đó loại bỏ lỗi tiềm ẩn. Môi

trường pháp lý trong thực tiễn sẽ mang lại lợi thế tránh cho người vận hành khỏi phải thay đổi các thông

số phương pháp hoặc giữ lại luồng dữ liệu và báo cáo bất kỳ sự thay đổi thông số nào.

Các quy trình vận hành chuẩn

Mặc dù các thiết bị phổ có thể lưu giữ và thiết lập tự động tất cả các thông số phương pháp, nhưng

có một số quy trình ví dụ: làm rỗng, rửa, đổ đầy cuvet với mẫu phải được thực hiện bởi người vận hành

và có thể tạo ra đáng kể lỗi. Người vận hành phải được huấn luyện một cách hợp lý về các quy trình này,

và tất cả các bước phải được lập thành tài liệu một cách rõ ràng trong các bản hướng dẫn nhiệm vụ.

Trong một môi trường pháp lý, những bước này được biết dưới tên các quy trình vận hành chuẩn

(SOPs).

3.6.1.16 Dữ liệu phụ trợ

Các kết quả lỗi hoặc kết quả hoàn toàn không đúng có thể xuất hiện mặc dù trang thiết bị, việc phát

triển và phê chuẩn phương pháp, việc huấn luyện người vận hành đều ở mức tốt nhất. Lấy ví dụ do mẫu

có thể đã bị ô nhiễm. Trong khi bản thân một kết quả không đúng không phải khó giải quyết, nhưng

việc thừa nhận một kết quả không đúng có thể gây hậu quả nghiêm trọng. Hầu hết các kết quả phân tích

thu được với phổ UV-VIS dựa trên phép đo đơn lẻ tại một bước sóng duy nhất. Tuy nhiên với một điểm

dữ liệu duy nhất thì không có cách nào để phát hiện ra kết quả có đúng là đáng nghi ngờ hay không trừ

phi đã biết trước kết quả điển hình và kết quả thực tế lệch đáng kể so với giá trị đã biết. Dữ liệu phụ trợ

và nhiều phép đo tại cùng một bước sóng hoặc tốt hơn (ưu tiên) là tại nhiều bước sóng có thể giúp

khẳng định là kết quả đúng. Dữ liệu cũng có thể được dùng để điều tra nghiên cứu lý do gây ra kết quả

không đúng.

Các bước sóng xác nhận

Một hướng đơn giản để kiểm tra các kết quả phân tích định lượng là thông qua phép phân tích xác

nhận. Trong phép phân tích xác nhận độ hấp thụ tại một hoặc nhiều bước sóng cùng với bước sóng phân

tích đươc đo trên cả chuẩn và mẫu. Phép định lượng được thực hiện tại tất cả các bước sóng đo. Nếu

mẫu tinh khiết, kết quả tại bước sóng phân tích và bước sóng hoặc các bước sóng xác nhận sẽ giống

nhau. Nếu mẫu bị ô nhiễm, xác xuất lớn là chất ô nhiễm sẽ đóng góp một giá trị độ hấp thụ khác tại

bước sóng phân tích và bước sóng hoặc các bước sóng xác nhận và các kết quả sẽ khác đi. Hình dưới

đây là một ví dụ. Phép phân tích xác nhận cũng có thể được sử dụng để phát hiện xem có đúng mẫu

được đo hay không và phép đo có nằm ngoài dải động học tuyến tính của thiết bị hay không.


Hình 3.69. Phân tích xác nhận

Phổ đầy đủ

Đối với các kết quả tối ưu, phải thu nhận được phổ toàn dải của mẫu phân tích. Phổ của mẫu có thể

được chồng lên phổ của chuẩn để kiểm tra xem có bất kỳ sự khác biệt nào không, hoặc các phương

pháp toán học có thể được dùng để thu hệ số tương xứng, hệ số này chỉ ra đặc tính tương tự của mẫu so

với chuẩn. Thu được hệ số tương xứng nhờ vẽ đồ thị các giá trị độ hấp thụ tại từng bước sóng của mẫu

so với giá trị độ hấp thụ của chuẩn. Nếu các phổ đồ là giống nhau thì các điểm được vẽ đồ thị sẽ rơi lên

trên một đường thẳng. Hệ số góc của đường thẳng này là tỷ lệ của nồng độ mẫu so với chuẩn. Nếu các

phổ đồ không giống nhau, các điểm sẽ không rơi lên một đường thẳng mà cho thấy có sự phân tán. Hình

dưới đây chỉ ra đồ thị của hai phổ đồ tương tự và không tương tự nhau. Trong cả hai trường hợp, tương

quan tuyến tính có thể được sử dụng để khớp vạch thẳng nhất, và có thể tính được hệ số tương quan. Hệ

số tương quan là phép đo đặc tính tương tự của phổ mẫu so với phổ chuẩn. Nếu các phổ đồ hoàn toàn

giống nhau, hệ số tương quan sẽ là 1, trong khi đó phổ hoàn toàn không giống nhau, hệ số tương quan

sẽ là 0.

Hình 3.70. Đồ thị so sánh các phổ đồ giống và không giống nhau

Nếu phổ toàn dải được sử dụng, tất cả các thông tin phân tích đều có giá trị để đánh giá lại các kết

quả và để phát hiện vì sao kết qủa không đúng.


Thống kê

Một phép đo duy nhất sẽ không có tính pháp lý cao. Tất cả các phép đo sẽ có một mức độ xê dịch

nhất định và dao động ngẫu nhiên do ồn. Mặc dù sự xê dịch có thể phát hiện được nhờ sử dụng các kỹ

thuật như đã được mô tả ở trên, nhưng ồn cũng có thể gây ra đáng kể lỗi. Cần luôn luôn đánh giá độ

chính xác của các kết quả nhờ thực hiện nhiều phép đo và sau đó tính toán giá trị trung bình và độ lệch

chuẩn của giá trị trung bình. Độ lệch chuẩn là chỉ thị cho tính pháp lý của một phép đo. Việc giám sát

những thay đổi trong độ lệch chuẩn các kết quả theo thời gian có thể sẽ là một chuẩn đoán hữu ích cho

nhiều vấn đề liên quan đến phép đo.

3.6.1.17 Các đặc trưng của thiết bị phổ mảng diod

Lợi thế của phổ mảng diod

Thu nhận phổ nhanh: Khả năng thu nhận phổ nhanh làm cho các thiết bị phổ mảng diod trở thành

chọn lựa đầu tiên cho phép đo trong các hệ thống động học, những hệ thống kiểu như phát hiện phân

tích tiêm dòng, kiểm soát quá trình và các phép đo động học. Lấy ví dụ như trong hinh 3.71 dưới chỉ ra

các phổ được đo ở khoảng cách 1 giây một lần trong phản ứng thuỷ phân sultone. Với dữ liệu này có thể

theo dõi đồng thời sự biến mất của chất phản ứng và sự xuất hiện sản phẩm một cách đồng thời.

Hình 3.71: Phổ thuỷ phân sulfon

Đối với hầu hết các thiết bị phổ UV-VIS, người sử dụng không thực hiện được các phép đo trên

những hệ thống động học, tốc độ thu nhận toàn dải phổ nhanh mang lại đáng kể những lợi thế cho công

việc này. Do nó nhanh nên phương pháp này cho phép thu nhận toàn bộ dải phổ ngay cả khi phép phân

tích chỉ cần đến một bước sóng duy nhất. Dữ liệu toàn dải phổ có thể được sử dụng để hiệu chỉnh lỗi.

Sau cùng thì dữ liệu toàn dải phổ với chất lượng cao có thể được sử dụng trong phát triển phương

pháp và trong phân tích nhiều thành phần.

Đo đồng thời nhiều bước sóng: Hầu hết các thiết bị phổ thông có thể thực hiện các phép đo nhiều bước

sóng nhưng phải có sự di chuyển về mặt vật lý từ điểm này sang điểm khác trong phổ, và vì thế nó mất

nhiều thời gian. Với một thiết bị phổ mảng diod, tất cả các điểm trong phổ có thể được đo đồng thời. Do

đó các phép đo nhiều bước sóng được hoàn tất trong khoảng thời gian mà các thiết bị phổ thông thường

cần để thực hiện phép đo trên một bước sóng duy nhất. Kỹ thuật này thuận lợi trong việc mang lại thông

tin để có thể sử dụng các phương pháp khác nhau trong loại trừ lỗi (đẳng hấp thụ, tham chiếu nội tại,

hiệu chỉnh 3 điểm). Hơn thế nữa nó cung cấp dữ liệu bổ sung để xác nhận chất lượng dữ liệu tổng thể,

chất lượng dữ liệu chính và cải thiện hiệu quả khi sử dụng phương pháp hàm đồng thời duy nhất. Với

phép đo nhiều bước sóng, chỉ cần lưu giữ dung lượng dữ liệu nhỏ hơn so với đo toàn dải phổ. Tuy nhiên

kỹ thuật loại trừ lỗi kém hiệu quả hơn đôi chút so với sử dụng dữ liệu toàn dải phổ.

Mặc dù có thể sử dụng bước sóng phù hợp cho dải nồng độ cao và dải nồng độ thấp, nhưng dải động

học có thể tăng đến tối đa với thiết bị phổ mảng diod. Cực đại hấp thụ có thể được sử dụng cho các phép


đo độ nhạy cao, một bước sóng có độ hấp thụ thấp hơn trên một mặt băng hấp thụ sẽ tránh được lỗi do

lạc sáng.

Sau cùng thì thiết bị phổ mảng diod có thể được dùng trong nhiều ứng dụng mà trước đây cần đến

thiết bị phổ hai bước sóng đắt tiền.

Khả năng đặt lại bước sóng: Vốn dĩ các thiết bị phổ quét cơ học phổ thông đều mắc lỗi trong việc đặt

lại bước sóng, và lỗi này gia tăng theo thời gian khi có sự ăn mòn cơ học. Các thiết bị này cũng dễ mắc

trôi bưới sóng trong thời gian làm việc kéo dài. Do thiết bị phổ mảng diod không phải dịch chuyển để

thay đổi bước sóng quét, nên không có lỗi nào đáng kể về mặt cơ học hoặc lỗi trôi theo thời gian.

Dữ liệu ở tất cả các phần của phổ đồ không bị tác động bởi lỗi thiết lập lại bước sóng, đây là lợi thế

dành cho người phân tích. Nó cho phép lựa chọn bước sóng tối ưu để cải thiện dải động học, độ nhạy,

độ chọn lọc và để phát triển phương pháp. Hơn thế nữa nó đóng vai trò quan trọng trong cải thiện độ

nhạy nhờ lấy trung bình dữ liệu theo bước sóng, trong giảm độ nhạy với những chất hấp thụ mạnh và

trong xác nhận chất lượng dữ liệu với các bước sóng xác nhận. Các kỹ thuật khác sử dụng dữ liệu toàn

dải phổ bao gồm phép phân tích nhiều thành phần, phát triển phương pháp, xác nhận chất lượng dữ liệu,

phổ đạo hàm….

Khả năng thiết lập lại bước sóng tuyệt vời cũng sẽ bảo đảm cho nếu có bất kỳ khác biệt nào về kết

quả đo đều chỉ có nguyên nhân từ mẫu mà không phải từ lỗi thiết lập lại thiết bị. Khả năng nhận diện

được sự có mặt của hợp chất là hoàn toàn có thể ngay cả khi có biểu hiện trôi nhỏ trong bước sóng nhận

diện.

Phổ chất chuẩn có thể đo, lưu giữ trên đĩa, gọi lại hàng ngày và thậm chí là hàng tháng sau để sử

dụng trong phân tích định lượng mà không phải đo lại chuẩn. Phương pháp này cải thiện hiệu quả, đặc

biệt là trong trường hợp áp dụng với những hợp chất đắt tiền, khó mua sắm hoặc kém ổn định, những

chất mà không thể sử dụng thường nhật trong phòng thí nghiệm được.

Độ nhạy: Dải động học của một thiết bị phổ mảng diod có thể được mở rộng hơn ở mức hấp thụ thấp.

Thiết bị mảng diod ít phức tạp hơn và có ít bề mặt quang hơn so với thiết bị phổ thông. Hệ quả là ánh

sáng truyền qua mạnh hơn và mức ồn thấp hơn.

Khả năng thu nhận toàn bộ dải phổ nhanh cũng cải thiện được độ nhạy phổ khi sử dụng kỹ thuật lấy

trung bình thời gian.

Thông số thống kê phép: Thiết bị phổ mảng diod thực hiện nhiều phép đo và lấy trung bình đồng thời

một cách nhanh chóng. Tính toán được giá trị trung bình và độ lệch chuẩn cho từng điểm dữ liệu. Độ

lệch chuẩn là phép cho cho cho độ tin cậy của điểm dữ liệu, độ lệch chuẩn tính được cho từng giá trị hấp

thụ trong phổ. Với một phép đo duy nhất không có nhiều sai số thống kê. Tuy nhiên với các thiết bị phổ

phổ thông, việc thực hiện nhiều phép đo tốn thời gian.

Số liệu thống kê là công cụ chuẩn đoán hữu hiệu để đánh giá chất lượng các kết quả phân tích và

cũng cần được sử dụng trong phát triển phương pháp.

Mạnh mẽ và tin cậy: Các thiết bị phổ mảng diod đơn giản về mặt cơ học và chúng hầu như không có bộ

phận hay chi tiết nào phải di chuyển. Do có ít chi tiết có thể bị ăn mòn hoặc rạn nứt, những thiết bị này

có độ tin cậy cao hơn. Lợi thế đối với người dùng là giảm thiểu thời gian chết. Thêm vào đó chi phí phải

trả cho quyền sở hữu thấp hơn so với các thiết bị phổ thông do thiết bị phổ mảng diod không yêu cầu

bảo dưỡng hoặc chuẩn lại định kỳ. Thiết bị phổ mảng diod hiện đại được đánh giá là chỉ có một lỗi

trong 10 năm (liên quan đến thay đèn)

Bất lợi của phổ mảng diod

Do thiết bị phổ mảng diod khác so với các thiết bị quét phổ thông, có thể có nhiều vấn đề liên quan

đến hiệu quả của chúng.

Độ phân giải: Với các thiết bị phổ quét phổ thông, độ phân giải được thay đổi dễ dàng nhờ thay đổi độ

rộng khe. Tuy nhiên với một thiết bị phổ mảng diod, độ phân giải phụ thuộc thêm vào một yếu tố nữa:

khoảng cách lấy mẫu điện tử của mảng diod. Khoảng cách lấy mẫu lại phụ thuộc vào số lượng diod

trong mảng và dải sóng được đo. Mãi cho đến gần đây các thiết bị phổ mảng diod vẫn có những hạn chế


về độ phân giải khi được so sánh với thiết phổ phân giải 2-nm. Vấn đề này đã được khắc phục trong

thiết bị mảng diod hiện đại, những thiết bị có chứa nhiều diod. Mặc dù các thiết bị mảng diod không thể

đạt được độ phân giải 0.5-nm hoặc tốt hơn như có thể đạt được ở một số thiết bị phổ thông, nhưng trong

nhiều phép phân tích độ phân giải cao có thể không cần thiết. Hơn thế nữa độ phân giải cao cũng có

nghĩa có ít ánh sáng hơn đến được detector và vì thế độ nhạy thấp hơn. Lấy ví dụ nếu phổ được quét với

độ phân giải 0,1-nm nó có thể mất từ 1 cho đến hơn 1 giờ để thu được phổ có S/N tốt.

Lạc sáng: Trong một thiết bị phổ quét theo trình tự, lạc sáng được giảm nhờ nhờ di chuyển bộ lọc vào

đường quang phía trước hệ thống đơn sắc. Những bộ lọc này được thay đổi theo bước sóng ánh sáng tới.

Với một thiết bị phổ mảng diod, sử dụng bộ lọc theo cách này thường làm hạn chế dải sóng có thể đo

được đồng thời. Thay vào đó các bộ lọc được đặt ngay trên chính bản thân mảng diod để giảm độ phân

tán ánh sáng. Tuy nhiên do tất cả các bước sóng ánh sáng đều nằm trong vùng detector nên lạc sáng vẫn

tiềm ẩn nhiều vấn đề hơn so với các thiết bị phổ phổ thông.

Cho đến thời gian gần đây thì các thiết bị phổ mảng diod vẫn biểu lộ mức lạc sáng cao hơn so với

các thiết bị phổ thông. Các thiết bị phổ ngày nay cho phép thực hiện quét toàn dải phổ nhanh với công

nghệ giảm đáng kể lạc sáng. Đầu tiên quét phổ toàn dải. Sau đó một bộ lọc chặn tất cả ánh sáng dưới

430 nm đi vào hệ quang và đo phổ vùng trên 430 nm, lúc này chỉ có ánh sáng phân tán (lạc sáng) được

đo, trừ vào phổ đầu tiên để tạo ra phổ đã hiệu chỉnh lạc sáng. Toàn bộ quy trình chỉ mất khoảng 1,5 giây

(với hai phép đo 0,5 giây) với ánh sáng phân tán được giảm đến mức tương đương hoặc tốt hơn so với

các thiết bị quét phổ thông một hệ đơn sắc duy nhất.

Sự phân huỷ mẫu: Do thiết bị phổ mảng diod bức xạ mẫu tại tất cả các bước sóng ánh sáng, đặt ra vấn

đề là nó có thể gây phân huỷ mẫu. Tuy nhiên cường độ ánh sáng trong thiết bị phổ mảng diod không

cao hơn so với trong thiết bị phổ phổ thông. Do đó khi quét tuần tự phổ toàn dải với một thiết bị phổ

phổ thông, tổng lượng ánh sáng (tổng tất cả ánh sáng tại từng bước sóng) mà mẫu là chủ thể hấp thụ sẽ

tương đương với một thiết bị phổ mảng diod. Nếu mẫu nhạy phổ, cả hai thiết bị sẽ phân huỷ mẫu ở mức

độ như nhau. Trong một số trường hợp cho thấy thiết bị phổ mảng diod có thể thu nhận phổ của những

hợp chất độ nhạy phổ cao mà không thể có được phổ trên thiết bị phổ thông.

Khi đo một bước sóng, rõ ràng các thiết bị phổ phổ thông có lợi thế hơn so với thiết bị mảng diod do

mẫu được chiếu sáng nhiều hơn. Tuy nhiên trên thực tế những vấn đề liên quan đến quang phân huỷ là

cực hiếm xảy ra.

Tính phức tạp: Nhiều người dùng cảm thấy bất ổn khi sử dụng thiết bị phổ mảng diod vì cho rằng

chúng quá phức tạp. Mặc dù quá trình xử lý dữ liệu bên trong liên quan đến thiết bị mảng diod phức tạp

hơn so với thiết bị phổ thông, nhưng các thiết bị mảng diod tạo ra nhiều dữ liệu hơn so với các thiết bị

phổ thông, dữ liệu này đã được quản lý bằng những phần mềm hiện đại.

Lỗi trong đo mẫu huỳnh quang: Mặc dù thiết bị phổ mảng diod có thể tạo ra các kết quả không đúng

khi đo mẫu huỳnh quang, những các thiết bị quét phổ thông cũng gặp phải vấn đề tương tự như vậy.

3.6.2 Detector huỳnh quang

Một số chất phân tích hay hợp chất của nó với một chất khác, hoặc là sản phẩm oxihoa khử của

nó theo một phản ứng có tính chất định lượng mà có tính huỳnh quang thì cũng có thể phát hiện và

xác định được bằng detector huỳnh quang. Nghĩa là tính chất huỳnh quang là tự chất phân tích có

hay là sản phẩm của chất phân tích với một chất khác trong một điều kiện xác định.

Các thiết bị phổ huỳnh quang tạo ra độ nhạy cao và giới hạn phát hiện LOD thấp hơn khi so

sánh với các detector UV. Chỉ có khoảng 10% các phân tử hữu cơ có cấu trúc huỳnh quang, các

phân tử này hấp thụ ánh sáng trên một dải sóng. Sự hấp thụ làm cho điện tử trong phân tử chuyển

lên một trạng thái kích thích giống như với bất kỳ phân tử nào khác có chứa chromophore. Phân tử

huỳnh quang có khả năng phát ra năng lượng đã hấp thụ tại bước sóng dài hơn.

Như vậy nguyên tắc của phép đo huỳnh quang là chiếu một chùm tia sáng kích thích có bước

sóng xác định (EX) vào cuvet chứa mẫu của detector (flowcell) để chất phân tích phát ra chùm tia

phát xạ huỳnh quang của nó (EM). Sau đó nhờ vào hệ thống quang học thu, phân ly, tách lấy tia


phát xạ huỳnh quang cần đo hướng vào nhân quang điện để đo chúng và chỉ thị (biểu diễn) chúng

theo một cách nào đó (ví dụ như là máy tự ghi recorder, tích phân kế intergrator, máy tính

computer).

Nếu cường độ ánh sáng huỳnh quang được ghi lại trong khi bước sóng kích thích thay đổi và

bước sóng phát xạ cố định, ta thu được phổ kích thích. Hoặc bước sóng kích thích có thể được cố

định và bước sóng phát xạ được thay đổi. Quy trình này tạo ra phổ phát xạ của chất phân tích.

Những hợp chất không có huỳnh quang tự nhiên có thể được dẫn xuất hoá gắn một phân tử đánh

dấu huỳnh quang trong phản ứng tiền cột và hậu cột.

Việc phát hiện định lượng ở đây là dựa trên cơ sở: trong một vùng nồng độ nhất định của chất

phân tích thì cường độ tia phát xạ huỳnh quang phụ thuộc vào nồng độ của nó trong flowcell, nghĩa

là ta có:

lCkIq .. (3.33)

ở đây EfIk ..0 , trong đó I0 là cường độ chùm sáng kích thích, f là hiệu suất huỳnh quang còn

E là hệ số tắt huỳnh quang của chất phân tích hay hợp chất có tính huỳnh quang của nó, L là bề dày

lớp phát huỳnh quang (độ dài flowcell)

Theo công thức trên thì trong một điều kiện thực nghiệm nhất định k là hằng số, L không đổi và

như vậy cường độ huỳnh quang Iq chỉ còn phu thuộc vào nồng độ chất phân tích.

Như vậy về nguyên tắc detector huỳnh quang khác detector UV-VIS ở chỗ nó gồm hai bộ đơn

sắc hay hai hệ quang. Một hệ quang cung cấp chùm tia kích thích, một hệ quang thu nhận chùm tia

phát xạ huỳnh quang. Với những máy đơn giản thì hai bộ đơn sắc này được thay bằng hai bộ kính

lọc vùng phổ.

Trong detector huỳnh quang, đèn nguồn tạo chùm tia kích thích người ta thường dùng đèn

dơtorium (D2-Lamp) cho vùng tử ngoại, đèn Wolfram cho vùng khả kiến và đèn Xênon cho vùng

230-600 nm.

Detector huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc khá cao, về 2 mặt này nó hơn hẳn detector phổ

hấp thụ phân tử UV-VIS. Hiện nay nó cũng là một loại detector đang được sử dụng nhiều trong kỹ

thuật HPLC để phát hiện cả các chất hữu cơ cũng như vô cơ.

Bộ phát hiện huỳnh quang mang lại giới hạn phát hiện thấp đến mức ppt. Cường độ tín hiệu rất

thấp khi so sánh với độ hấp thụ UV và tốt nhất nên đo được tín hiệu ở mức ồn nền càng thấp càng

tốt. Vốn dĩ phép đo này nhạy hơn hai tín hiệu tương đối lớn từ mẫu blank và mẫu có khả năng phân

tích được bằng phổ hấp thụ UV. Tuy nhiên độ nhạy của phát hiện huỳnh quang phụ thuộc vào cả

tính chất huỳnh quang, thiết kế detector và thiết lập các thông số. Khả năng đáp ứng của bộ phát

hiện huỳnh quang phụ thuộc vào độ hấp thụ mol và môi trường lượng tử tại những điều kiện thực

nghiệm được sử dụng. Độ nhạy của bộ phát hiện huỳnh quang phụ thuộc vào một số yếu tố: cường

độ nguồn sáng, hiệu quả hệ thống quang, độ rộng băng phổ…..

DETECTOR HUỲNH QUANG LÀM VIỆC NHƯ THẾ NÀO

Thời kỳ đầu các bộ phát hiện huỳnh quang trang bị cách tử điều khiển bằng motor và có thể lập

trình bước sóng kích thích, bước sóng phát xạ. Cách bố trí xắp đặt của detector cho phép định vị tại

mỗi thời điểm một bước sóng và cần đến trạng thái dừng dòng (stop-flow) để thu nhận phổ. Do vậy

thu nhận phổ huỳnh quang trở thành quá trình mất nhiều thời gian và việc tối ưu các bước sóng kích

thích, bước sóng phát xạ không thể không làm xáo trộn phép tách sắc ký.

Một trong các thiết kế mới bộ phát hiện huỳnh quang giống như mô tả trong hình 3.72 sử dụng

đèn nháy Xe tạo ra cường độ ánh sáng cao nhất kích thích trong dải UV. Đèn nháy đánh lửa tạo ra

năng lượng cao chỉ trong dải micro giây. Mỗi lần nháy sẽ hình thành huỳnh quang trong flow cell

và tạo ra điểm dữ liệu độc lập trong sắc đồ. Đèn không được cấp năng lượng trong hầu hết thời gian

vận hành detector, vì thế tuổi thọ làm việc của đèn có thể lên đến vài nghìn giờ. Không cần đến thời

gian sấy đèn để hình thành đường nền phẳng. Cách tử holographic được sử dụng làm bộ tán sắc ánh


sáng polychromatic của đèn Xe. Sau đó ánh sáng tại bước sóng cần thiết được hội tụ lên flow cell

tối ưu quá trình kích thích. Để giảm thiểu ánh sáng kích thích từ mặt bên flow cell lạc vào bộ phận

đo huỳnh quang, hệ quang được xắp đặt để ánh sáng phát xạ được ghi ở một góc 900 so với tia tới.

Một cách tử holographic khác được sử dụng làm bộ đơn sắc phát xạ. Cả hai cách tử được tôí ưu ánh

sáng trong suốt dải VIS. Ống nhân quang điện là lựa chọn tối ưu để đo cường độ ánh sáng thấp từ

ánh sáng huỳnh quang phát ra. Đèn nháy Xe vốn dĩ có những dao động về cường độ ánh sáng từ lần

nháy này sang lần nháy khác, sử dụng hệ thống tham chiếu diod quang đo cường độ ánh sáng kích

thích và khởi phát quá trình bù tín hiệu detector.

Hình 3.72: Một cấu trúc hệ quang FLD

Chế độ phổ được sử dụng để thu nhận nhiều tín hiệu hơn hoặc để thu nhận thông tin phổ. Việc

đánh lửa đèn nháy đồng bộ hoá với quá trình xoay cách tử, hoặc là cách tử tán sắc ánh sáng hoặc là

cách tử tán sắc ánh sáng phát xạ. Công nghệ chế tạo motor điều khiển cách tử là thiết kế có tuổi thọ

kéo dài, giống như kiểu sử dụng phổ biến trong ổ cứng máy tính tốc độ cao. Bất cứ khi nào cách tử

đạt đến vị trí chính xác trong quá trình xoay, đèn Xe đánh lửa tạo ra một lần nháy, thời gian nháy

dưới 2 mili giây trong khi thời gian xoay cách tử mất 14 mili giây trở xuống. Do sử dụng công nghệ

xoay hệ tán sắc, chế độ phổ mất ít độ nhạy khi so sánh với phương pháp phát hiện hai bước sóng

của detector UV.

Các detector huỳnh quang còn có khả năng thực hiện phép đo off-line trong cuvét tĩnh, hỗ trợ

thu nhận phổ kích thích và phổ phát xạ trong nhiệm vụ giản đơn là tìm kiếm thông tin về một hợp

chất tinh khiết nào đó. Phổ huỳnh quang có thể xem dưới dạng đồ thị 3 chiều gồm bước sóng kích

thích, bước sóng phát xạ và cường độ phát quang.

3.6.2.1 Phát hiện sự phát lân quang

Ph¸t quang (Luminescence), sù ph¸t x¹ ¸nh s¸ng, xuÊt hiÖn khi çc ph©n tö thay ®æi

tõ mét tr¹ng th¸i bÞ kÝch thÝch sang tr¹ng th¸i nÒn cña chóng. Çc ph©n tö cã thÓ ®îc kÝch thÝch bëi çc d¹ng n¨ng lîng kh¸c nhau, mçi kiÓu ®i víi quy tr×nh kÝch thÝch cña riªng chóng. LÊy vÝ dô, khi n¨ng lîng kÝch thÝch lµ ¸nh s¸ng, quy tr×nh ®îc gäi lµ sù ph¸t quang hãa (photoluminescence).

Trong nh÷ng trêng hîp c¨n b¶n, sù ph¸t x¹ cña ¸nh s¸ng ®i ngîc l¹i sù hÊp thô. LÊy vÝ dô víi h¬i Na, phæ hÊp thô vµ phæ ph¸t x¹ lµ mét v¹ch ®¬n t¹i cïng bíc sãng. Phæ hÊp thô vµ phæ ph¸t x¹ cña çc ph©n tö h÷u c¬ trong dung dÞch t¹o ra çc b¨ng phæ thay v× lµ çc v¹ch phæ.

Khi mét ph©n tö phøc t¹p h¬n biÕn ®æi tõ tr¹ng th¸i n¨ng lîng nÒn vµo tr¹ng th¸i bÞ kÝch thÝch, n¨ng lîng hÊp thô ®îc ®îc ph©n bæ thµnh çc møc phô cña çc dao ®éng vµ quay kh¸c nhau. Khi ®· ë trong tr¹ng th¸i nµy, ph©n tö quay trë l¹i tr¹ng th¸i nÒn, ®Çu tiªn lµ sù mÊt m¸t n¨ng lîng dao ®éng vµ n¨ng lîng quay bëi sù håi phôc (h¹ thÊp n¨ng lîng) mµ kh«ng cã bÊt kú sù ph¸t x¹ nµo. Sau ®ã ph©n tö chuyÓn tõ møc n¨ng lîng nµy ®Õn mét trong çc møc phô dao ®éng vµ quay cña tr¹ng th¸i nÒn cña nã,

Do phần lớn cực đại phát xạ nằm trên 280 nm, bộ lọc

cut-off sẽ được sử dụng để ngăn chặn ánh sáng ở dưới

bước sóng này đi vào quang tuyến hệ đơn sắc phát xạ.

Các hệ thống đơn sắc kích thích và đơn sắc phát xạ có

thể chuyển đổi qua lại giữa các chế độ tín hiệu và chế

độ phổ. Trong chế độ tín hiệu chúng dịch chuyển đến vị

trí cụ thể mã hoá theo những bước sóng mong muốn,

giống như với detector truyền thống.

Chế độ này cho ra giới hạn phát hiện thấp nhất do tất cả

các điểm dữ liệu được tạo ra tại một bước sóng kích

thích và một bước sóng phát xạ duy nhất.


ph¸t ra ¸nh s¸ng. §Æc trng lín nhÊt cña sù hÊp thô ®èi víi vËt chÊt lµ EX cña nã vµ

®èi víi sù ph¸t x¹ lµ EM cña nã.

Sù ph¸t quang hãa lµ tªn chung cho c¶ hai hiÖn tîng, sù ph¸t huúnh quang (fluorescence) vµ sù ph¸t l©n quang (phosphorescence), mµ mçi hiÖn tîng kh«ng gièng

víi hiÖn tîng cßn l¹i theo mét híng ®Æc trng – trÔ ph¸t x¹ sau khi kÝch thÝch. NÕu mét ph©n tö ph¸t ra ¸nh s¸ng 10 -9 ®Õn 10 -5 gi©y sau khi nã ®îc chiÕu s¸ng quy tr×nh sau ®ã lµ sù ph¸t huúnh quang. NÕu mét ph©n tö ph¸t ra ¸nh s¸ng l©u h¬n 10 -3 gi©y sau khi chiÕu s¸ng quy tr×nh sau ®ã lµ sù ph¸t l©n quang.

S1

S2

H×nh 3.73 Mèi quan hÖ çc bíc sãng kÝch thÝch vµ bíc sãng ph¸t x¹

Sù ph¸t l©n quang lµ mét quy tr×nh dµi h¬n do mét trong trong çc ®iÖn tö cã mÆ t trong sù kÝch thÝch thÝch ®· thay ®æi spin (sù quay trßn) cña nã. VÝ dô nh trong lóc va ch¹m víi mét ph©n tö dung m«i. B©y giê ph©n tö bÞ kÝch thÝch n»m trong tr¹ng th¸i ®îc gäi lµ bé 3.

Ph©n tö cÇn thay ®æi spin cña nã trë l¹i mét lÇn n÷a tríc khi nã cã thÓ quay trë l¹i tr¹ng th¸i nÒn cña nã. Tõ kh¶ n¨ng cã thÓ x¶y ra va ch¹m víi ph©n tö kh¸c tÊt yÕu dÉn ®Õn sù thay ®æi chót Ýt vÒ spin, ph©n tö vÉn ë trong tr¹ng th¸i bé ba cña nã trong thêi gian nµo ®ã. Trong sù thay ®æi spin lÇn thø hai ph©n tö mÊt nhiÒu n¨ng lîng h¬n do hiÖn tîng níi láng (relax) n¨ng lîng mµ kh«ng cã ph¸t x¹. Do ®ã ¸nh s¸ng ph¸t ra trong sù ph¸t l©n quang cã n¨ng lîng nhá h¬n vµ t¹i bíc sãng dµi h¬n sù ph¸t huúnh quang.

C«ng thøc: E = h. -1

Trong hµm nµy: E lµ n¨ng lîng. h lµ h»ng sè Planck

lµ bíc sãng ¸nh s¸ng.

S1 thay ®æi spin

T1

S0 Ph¸t l©n quang

H×nh 3.74 ChuyÓn tiÕp n¨ng lîng ph¸t l©n quang

Sù chuyÓn tiÕp kh«ng ph¸t x¹


HiÖu øng Raman xuÊt hiÖn khi ¸nh s¸ng tíi kÝch thÝch çc ph©n tö trong mÉu mµ sau ®ã g©y ra sù t¸n x¹ ¸nh s¸ng. Trong ¸nh s¸ng bÞ t¸n x¹ nµy th× hÇu hÕt cã cïng bíc sãng nh lµ ¸nh s¸ng tíi, mét sè bÞ t¸n x¹ t¹i bíc sãng kh¸c. ¸nh s¸ng t¸n x¹ kh«ng ®µn håi nµy ®îc gäi lµ t¸n x¹ Raman. T¸n x¹ Raman ®îc t¹o ra tõ sù thay ®æi chuyÓn ®éng ph©n tö cña nã.

H×nh 3.75 HiÖu øng Raman

HiÖu sè n¨ng lîng gi÷a ¸nh s¸ng tíi (E i) vµ ¸nh s¸ng t¸n x¹ Raman (E s) b»ng n¨ng lîng cã trong sù thay ®æi tr¹ng th¸i dao ®éng cña ph©n tö (vÝ dô nã lµm cho ph©n tö dao ®éng, Ev). Kh¸c biÖt n¨ng lîng nµy ®îc gäi lµ sù tr«i Raman.

Ev = E i - Es

Thêng sÏ quan s¸t ®îc mét vµi tÝn hiÖu biÕn ®æi Raman kh¸c nhau; mçi mét tÝn hiÖu ®îc kÕt hîp víi çc chuyÓn ®éng dao ®éng hoÆc chuyÓn ®éng quay cña ph©n tö trong mÉu. Ph©n tö cô thÓ vµ m«i trêng cña nã sÏ x¸c ®Þnh nh÷ng tÝn hiÖu Raman nµo sÏ quan s¸t ®îc (nÕu cã).

§å thÞ cêng ®é Raman theo sù tr«i Raman lµ phæ ®å Raman.

3.6.2.2 Thiết bị quang học và các yêu cầu đối với thiết bị

TÊt c¶ çc nh©n tè cña hÖ thèng quang häc, bao gåm ®Ìn nh¸y Xenon, çi tô s¸ng kÝch thÝch, khe kÝch thÝch, g¬ng, çch tö kÝch thÝch, cuvet dßng, çi tô s¸ng ph¸t x¹, çi läc ngìng (cut-off filter), khe ph¸t x¹, çch tö ph¸t x¹ vµ èng nh©n quang ®iÖn. cÇn ®îc l¾p trong khu«n ®óc kim lo¹i n»m trong khoang detector. Detector huúnh quang cã mét hÖ thèng quang çch tö/çch tö, cho phÐp lùa chän c¶ bíc sãng kÝch thÝch vµ bíc sãng ph¸t x¹. Cã thÓ tiÕp cËn cuvet dßng tõ mÆt tríc cña detector huúnh quang t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho c«ng viÖc ch¨m sãc, b¶o dìng.

Nguån ph¸t x¹ lµ ®Ìn nh¸y Xenon. §Ìn nh¸y cÇn cã tÇn sè nh¸y díi 3s t¹o ra phæ ¸nh s¸ng liªn tôc tõ 200nm ®Õn 900nm. Sù ph©n bæ ®Çu ra ¸nh s¸ng cã thÓ ®îc biÓu diÔn nh lµ tû lÖ % theo kho¶ng çch 100nm. §Ìn cã thÓ ®îc sö dông kho¶ng 1000 giê trë lªn tïy thuéc vµo ®ßi hái vÒ ®é nh¹y. ThiÕt bÞ cÇn cã chøc n¨ng tiÕt kiÖm trong lóc vËn hµnh tù ®éng nhê sö dông çc ®iÓm thiÕt lËp tõ bµn phÝm, tõ phÇn mÒm cèt ®Ó ®Ìn chØ nh¸y trong ph¹m vi thêi gian phÐp ph©n tÝch cña b¹n. §Ìn cã thÓ ®îc sö dông cho ®Õn khi nã kh«ng bèc ch¸y n÷a, nhng møc ån cã thÓ gia t¨ng theo thêi gian sö dông vµ hÖ thèng ph¶i kiÓm so¸t còng nh bï trõ ®îc ån gia t¨ng nµy.

Sù suy biÕn UV, ®Æc biÖt lµ díi 250nm cao h¬n mét çch ®Çy ý nghÜa khi ®îc so s¸nh víi d¶i sãng Vis. Nãi chung çc thiÕt lËp kiÓu nh “LAMP ON d uring run” hoÆc sö dông “economy mode” sÏ gia t¨ng tuæi thä ®Ìn vÒ khÝa c¹nh cêng ®é.

Sù ph¸t x¹ ph¸t ra tõ ®Ìn ®îc t¸n s¾c vµ ®îc ph¶n x¹ bëi çch tö ®¬n s¾c kÝch thÝch lªn trªn khe vµo cuvet.

T¸n x¹ Raman (bíc sãng míi)

Ánh s¸ng t¸n x¹

Ánh s¸ng tíi

T¸n x¹ Raleigh (cïng bíc sãng nh ¸nh s¸ng tíi)

Mẫu


Çch tö holographic h×nh ch¶o sÏ lµ bé phËn chÝnh cña hÖ thèng ®¬n s¾c, t¸n x¹ vµ ph¶n chiÕu ¸nh s¸ng tíi. BÒ mÆt cã chøa nhiÒu r·nh nhá, sè r·nh cÇn >1200 r·nh trªn mçi milimet. Çch tö mang l¹i ¸nh s¸ng chãi ®îc c¶i thiÖn vÒ mÆt hiÖu qña trong d¶i sãng nh×n thÊy (visible).

H×nh d¸ng h×nh häc cña çc r·nh soi ®îc tèi u ®Ó ph¶n x¹ hÇu nh lµ tÊt c¶ ¸nh s¸ng tíi, thµnh bËc 1 vµ t¸n s¾c nã víi kho¶ng >70% hiÖu qña trong d¶i UV. HÇu hÕt trong sè 30% ¸nh s¸ng cßn l¹i ®îc ph¶n x¹ t¹i bËc 0, kh«ng t¸n s¾c. H×nh díi miªu t¶ ®êng truyÒn s¸ng t¹i bÒ mÆt çch tö.

H×nh 3.76 Sù t¸n s¾c ¸nh s¸ng bëi mét çch tö

Çch tö quay ®îc nhê sö dông mét m«t¬ DC 3-pha chæi nhá, vÞ trÝ cña çch tö x¸c ®Þnh bíc sãng hoÆc d¶i sãng cña ¸nh s¸ng r¬i lªn trªn cuvet dßng. Çch tö cã thÓ ®îc ch¬ng tr×nh hãa ®Ó thay ®æi vÞ trÝ cña nã vµ theo ®ã lµ bíc sãng trong ph¹m vi mét phÐp ch¹y.

§Ó thu nhËn phæ ®å vµ ph¸t hiÖn nhiÒu bíc sãng (multi -wavelength), çch tö cÇn xoay t¹i tèc ®é >4000 rpm (vßng trªn phót).

Çc çch tö kÝch thÝch vµ çch tö ph¸t x¹ lµ gièng nhau vÒ mÆt thiÕt kÕ, nhng cã d¶i sãng chãi s¸ng kh¸c nhau. Çch tö kÝch thÝch ph¶n x¹ hÇu hÕt ¸nh s¸ng bËc 1 trong d¶i UV xung quanh 250nm, trong khi ®ã çch tö ph¸t x¹ ph¶n x¹ tèt h¬n trong d¶i nh×n thÊy (visible) xung quanh 400nm.

Cuvet dßng lµ mét khèi th¹ch anh ®Æc víi ngîc ¸p cùc ®¹i lµ tèi thiÓu ph¶i lµ 20bar. Ngîc ¸p qóa møc sÏ dÉn ®Õn ph¸ hñy cuvet. §Ò nghÞ vËn hµnh detector gÇn lèi th¶i ®Ó h¹ thÊp ¸p ngîc. CÇn cã mét khe s¸ng ®îc tÝch hîp trªn khèi th¹ch anh.

¸nh s¸ng ph¸t quang tõ mÉu trong cuvet dßng ®îc gom l¹i t¹i gãc bªn ph¶i cña ¸nh s¸ng tíi nhê vµo mét thÊu kÝnh thø hai, vµ ®i qua khe thø hai. Tríc khi ¸nh s¸ng ph¸t quang tíi ®îc bé ®¬n s¾c ph¸t x¹, mét çi läc ngìng sÏ lo¹i bá ¸nh s¸ng n»m díi mét bíc sãng nµo ®ã, ®Ó gi¶m ån tõ t¸n s¾c bËc 1 vµ nhiÔu s¸ng bËc 2

3.6.2.3 Tìm kiếm những bước sóng tốt nhất

Nh÷ng th«ng sè quan träng nhÊt trong ph¸t hiÖn huúnh quang lµ bíc sãng ph¸t x¹ vµ bíc sãng kÝch thÝch. Theo çch th«ng thêng, cho r»ng bíc sãng kÝch thÝch tèt nhÊt cã thÓ t×m thÊy tõ phæ kÝch thÝch thu nhËn trªn mét thiÕt bÞ phæ huúnh quang. §ång thêi ngêi ta còng thõa nhËn mét khi bíc sãng kÝch thÝch tèi u ®· ®îc t×m thÊy trªn mét thiÕt bÞ cô thÓ nµo ®ã th× kiÓu bíc sãng nµy còng cã thÓ ®îc ®em ¸p dông víi çc thiÕt bÞ kh¸c.

Çch tö

Ánh s¸ng tr¾ng tíi

Tr¾ng Tr¾ng

Phản xạ bậc 0

không tán sắc

ánh sáng

200nm 800nm

Ph¶n x¹ bËc 1 ¸nh s¸ng ®· t¸n s¾c


C¶ hai sù thõa nhËn trªn lµ sai.

Bíc sãng tèi u cho sù kÝch thÝch phô thuéc vµo ®é hÊp thô cña hîp chÊt nhng còng phô thuéc vµo çc ®Æc trng cña thiÕt bÞ nh lµ kiÓu ®Ìn vµ çch tö. Khi hÇu hÕt çc hîp chÊt h÷u c¬ hÊp thô tèt nhÊt trong d¶i cùc tÝm (UV) detecto huúnh qu ang cÇn ®îc thiÕt kÕ ®Ó t¹o ra tû lÖ tÝn hiÖu trªn nhiÔu tèi u trong d¶i 210nm ®Õn 360nm cña phæ. §Ó ®¹t ®îc ®é nh¹y cao nhÊt, bíc sãng hÊp thô cña ph©n tö mÉu cña b¹n cÇn t¬ng xøng víi d¶i sãng cho thiÕt bÞ cña b¹n. Nãi çch kh¸c, bíc sãng kÝch thÝc h n»m trong d¶i UV. Detecto huúnh quang cña b¹n cÇn cã mét d¶i sãng kÝch thÝch réng, nhng ®Ó ®¹t ®îc ®é nh¹y cao nhÊt, b¹n cÇn chän mét bíc sãng trong d¶i UV (gÇn 250nm).

Çc yÕu tè thiÕt kÕ gãp phÇn h¹ thÊp hiÖu qña trong d¶i UV thÊp lµ ®Ìn chiÕu Xenon vµ çch tö. §Ìn kiÓu nhÊp nh¸y thay ®æi bíc sãng tèi u ®Õn d¶i sãng thÊp, detecto huúnh quang thay ®æi ®Õn cùc ®¹i 250nm lµ tèt nhÊt. Çch tö kÝch thÝch ®îc chiÕu s¸ng cho hiÖu qña cao nhÊt t¹i 300nm.

3.6.2.4 Tìm kiếm sự khuyếch đại tín hiệu tốt nhất

ViÖc gia t¨ng hÖ sè kuyÕch ®¹i nh©n quang ®iÖn sÏ gia t¨ng tÝn hiÖu vµ ån. §Õn mét hÖ sè nµo ®ã th× sù gia t¨ng tÝn hiÖu cao h¬n sù gia t¨ng ån.

Çc detector huúnh quang thêng ®îc chÕ t¹o víi bíc tõ hÖ sè khuyÕch ®¹i nµy ®Õn hÖ sè khuyÕch ®¹i kh¸c t¬ng ®¬ng víi mét hÖ sè cña 2.

Mét vÝ dô khi b¬m mÉu ®ång thÓ vµ PTMGAIN ®îc n©ng tõ 4 lªn 11 mét çch chËm ch¹p. Víi viÖc gia t¨ng PTMGAIN ®· c¶i thiÖn ®îc tû lÖ tÝn hiÖu trªn nhiÔu cho lªn ®Õn tËn hÖ sè 10. Trªn 10 ån gia t¨ng tû lÖ víi tÝn hiÖu mµ kh«ng c ã sù gia t¨ng tû lÖ tÝn hiÖu trªn nhiÔu.

Lý do ®a ra vÝ dô nµy lµ ®Ó lÊy c¬ së lËp luËn vÒ viÖc ®Þnh lîng ®êng nÒn (®Æc biÖt t¹i çc møc nÒn thÊp) lµ kh«ng thÝch hîp cho bé läc ph¬ng ph¸p lµm viÖc thèng kª. §Ó ®¹t ®îc hÖ sè khuyÕch ®¹i tèt nhÊt, kiÓm tra dung m«i cña b¹n díi çc ®iÒu kiÖn dßng víi hµm khuyÕch ®¹i tù ®éng. Kh«ng sö dông çc gÝa trÞ cao h¬n gÝa trÞ ®îc hÖ thèng ®Ò nghÞ nÕu thÊy kh«ng cÇn thiÕt, bëi v× nã g©y ra tÝn hiÖu huúnh quang cao qóa møc.

ThiÕt bÞ cÇn cã vµ sö dông ®îc phÐp kiÓm tra nh©n quang ®iÖn ®Ó x¸c ®Þnh gÝa trÞ thiÕt lËp mét çch tù ®éng.

3.6.2.5 Lựa chọn thời gian phản hồi tốt nhất

ViÖc gi¶m d÷ liÖu sö dông chøc n¨ng thiÕt lËp thêi gian ®¸p øng (®«i khi cßn ®îc gäi díi çi tªn thêi gian ph¶n håi) sÏ gia t¨ng tû lÖ tÝn h iÖu trªn nhiÔu cña b¹n.

Thêi gian ph¶n håi lµm viÖc tiªu biÓu cña çc detector huúnh quang LC lµ 2 hoÆc 4 gi©y. §iÒu quan träng cÇn ph¶i biÕt lµ so s¸nh ®é nh¹y gi÷a çc detector huúnh quang kh¸c nhau lµ yªu cÇu sö dông cïng thêi gian ph¶n håi. Thêi gian ph¶n håi 4 gi©y (mÆc ®Þnh) t¬ng ®¬ng víi h»ng sè thêi gian 1.8 gi©y vµ thÝch hîp víi çc ®iÒu kiÖn s¾c ký chuÈn.

3.6.2.6 Giảm sự nhiễu sáng

Detector huúnh quang cÇn cã çc çi läc ngìng dïng ®Ó lo¹i bá nhiÔu s¸ng bËc 2 nd hoÆc nhiÔu s¸ng bËc cao h¬n nhê cho phÐp truyÒn toµn bé ¸nh s¸ng trªn ngìng vµ chØ chót Ýt hoÆc kh«ng truyÒn ¸nh s¸ng díi ®iÓm ngìng. Chóng ®îc dïng gi÷a çch tö kÝch thÝch vµ çch tö ph¸t x¹, ®Ó ng¨n chÆn bÊt kú ¸nh s¸ng kÝch thÝch nµo cã thÓ víi ®Õn èng nh©n quang ®iÖn khi nã ®o ¸nh s¸ng ph¸t x¹.

Khi çc bíc sãng kÝch thÝch vµ bíc sãng ph¸t x¹ gÇn nhau, t×nh tr¹ng biÕn d¹ng do sù t¸n x¹ sÏ h¹n chÕ m·nh liÖt ®é nh¹y. Khi bíc sãng ph¸t x¹ gÊp hai lÇn bíc sãng kÝch thÝch, ¸nh s¸ng bËc 2 nd lµ hÖ sè giíi h¹n. §Ó kh¶o s¸t hiÖu øng cña ¸nh s¸ng bËc cao h¬n, chÊp nhËn detector bËt lªn nhng kh«ng cã mÉu nµo ®i qua cuvet dßng.


LÊy vÝ dô, ®Ìn göi 1 triÖu photon ®i vµo cuvet dßng t¹i 280nm. Sù t¸n x¹ trªn bÒ mÆt cu vÐt dßng vµ sù t¸n x¹ tõ çc ph©n tö dung m«i cho phÐp 0.1% ¸nh s¸ng nµy rêi khái cuvet qua cöa sæ t¹i nh÷ng gãc bªn ph¶i ¸nh s¸ng tíi. Kh«ng cã çi läc ngìng, 1000 photon cßn l¹i ®ã sÏ ®Õn ®îc çch tö ph¸t x¹, 90% sÏ ph¶n chiÕu hoµn toµn lªn nh©n quang ®iÖn mµ kh«ng bÞ t¸n s¾c. 10% cßn l¹i t¸n s¾c t¹i 280nm (bËc 1 s t) vµ t¹i 560nm (bËc 2nd). §Ó lo¹i bá nhiÔu s¸ng nµy, cÇn mét çi läc ngìng läc xung quanh 280nm.

3.6.2.7 Hệ thống quy chiếu

Çc detector huúnh quang cÇn cã mét diod quy chiÕu, ®îc ®Þnh vÞ phÝa sau cuvet dßng, ®o ¸nh s¸ng kÝch thÝch (EX) ®îc truyÒn qua cuvet dßng vµ hiÖu chØnh cho nh÷ng dao ®éng bÊt thêng cña ®Ìn nh¸y vµ hiÖu chØnh sù tr«i cêng ®é dµi h¹n (trong thêi gian dµi). Do tÝn hiÖu ®Çu ra diod phi tuyÕn (phô thuéc vµo bíc sãng kÝch thÝch EX), d÷ liÖu ®o ®îc ®îc tiªu chuÈn hãa.

Mét bé khuyÕch t¸n ®îc ®Þnh vÞ ë mÆt tríc cña diod quy chiÕu. Bé khuyÕch t¸n nµy ®îc t¹o ra tõ th¹ch anh, gi¶m ¸nh s¸ng vµ cho phÐp ®o tÝch ph©n ¸nh s¸ng.

3.6.2.8 Thông tin phân tích từ dữ liệu gốc

B©y giê chóng ta ®· biÕt ®îc d÷ liÖu gèc tõ mÉu ®· ®îc thu nhËn nh thÕ nµo trong thiÕt bÞ quang häc. Nhng viÖc d÷ liÖu ®îc sö dông nh lµ th«ng tin trong hãa häc ph©n tÝch sÏ lµ nh thÕ nµo? Nã phô thuéc vµo ®Æc ®iÓm hãa häc cña øng dông cña b¹n, ¸nh s¸ng ph¸t quang ®îc ®o bëi detector huúnh quang sÏ cã nh÷ng ®Æc trng kh¸c nhau. Sö dông nh÷ng hiÓu biÕt cña b¹n vÒ mÉu, b¹n cÇn lùa chän chÕ ®é ph¸t hiÖn nµo b¹n sÏ dïng cho phï hîp.

3.6.2.9 Phát hiện huỳnh quang

Khi ®Ìn lãe s¸ng, çc hîp chÊt ph¸t huúnh quang trong mÉu cña b¹n hÇu nh sÏ ®ång thêi cïng ph¸t quang. Sù ph¸t huúnh quang tån t¹i trong mét thêi gian ng¾n, do ®ã detector huúnh quang chØ cÇn ®o qua mét chu kú thêi gian ng¾n sau khi ®Ìn ®· chiÕu s¸ng.

3.6.2.10 Phát hiện lân quang

Ngay khi chän chÕ ®é ph¸t hiÖn l©n quang, thiÕt bÞ cÇn chØ ra mét th«ng sè thi Õt lËp thÝch hîp hç trî ngêi sö dông

Cêng ®é 100%

0 1 2 3

Thêi gian (sec) H×nh 3.77: PhÐp ®o huúnh quang

Track&Hold

Lãe s¸ng

Ph¸t l©n quang

Cêng ®é 100%

§o


3.6.2.11 Chiến lược phát triển phương pháp đo huỳnh quang

Các detector huỳnh quang được sử dụng trong sắc ký lỏng khi được yêu cầu về giới hạn phát

hiện và độ chọn lọc cao nhất. Xuyên suốt quá trình phát triển phương pháp gồm trong đó có bước

thu nhận phổ, bước đóng vai trò cơ sở để đạt được kết quả tốt nhất.

BƯỚC 1. Kiểm tra tạp chất hệ thống HPLC

Một vấn đề khó trong phát hiện huỳnh quang mức vết là phải đảm bảo hệ thống HPLC không

bị ô nhiễm chất phát huỳnh quang. Hầu hết các chất ô nhiễm có nguồn gốc trong dung môi kém tinh

khiết. Quét phổ huỳnh quang trong vài phút là cách phổ biến nhất để kiểm tra chất lượng dung môi.

Nạp đầy dung môi trực tiếp vào cuvett FLD và đo off-line ngay trước khi bắt đầu chạy sắc ký. Kết

quả được hiển thị dưới dạng đẳng huỳnh quang hoặc dạng đồ thị 3 chiều.

Hình 3.79 chỉ ra phổ của mẫu nước sẽ được dùng làm pha động, mẫu nước này bị ô nhiễm

lượng nhỏ tạp chất. Có thể nhìn thấy vùng phổ chỉ thị mẫu nước bị ô nhiễm giữa hai vùng lạc sáng:

lạc sáng Raleigh và lạc sáng Raman bậc nhất và bậc 2. Vì bước sóng lạc sáng Raleigh giống nhau

cả với ánh sáng "kích thích" và ánh sáng "phát xạ", vùng lạc sáng Raleigh bậc nhất nhìn thấy ở

vùng phía trên bên trái của sắc đồ. Băng Raman của nước là băng lạc sáng nằm dưới vùng lạc sáng

Raleigh bậc nhất. Do bộ lọc cut-off chặn ánh sáng dưới 280nm, phổ lạc sáng Raleigh bậc hai bắt

đầu trên 560 nm.

Sự lạc sáng đóng vai trò như tạp chất trong mô phỏng ồn nền. Trong cả hai trường hợp đều gây

ra mức ồn nền cao hơn và do đó giới hạn phát hiện sẽ cao hơn. Các phép đo độ nhạy cao cần được

thực hiện tránh xa những thiết lập bước sóng có nền lạc sáng cao.

Hình 3.79: Đồ thị isofluorescence của một pha động, mẫu nước tinh khiết đặt trong flow cell, bước

ghi nhận dữ liệu 5nm

BƯỚC 2. Tối ưu giới hạn phát hiện và độ chọn lọc

Để đạt được giới hạn phát hiện và độ chọn lọc tối ưu, người phân tích phải tìm kiếm các thuộc

tính huỳnh quang của hợp chất quan tâm. Lựa chọn bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ để

mang lại giới hạn phát hiện tối ưu và độ chọn lọc tốt nhất. Nhìn chung phổ huỳnh quang thu được

từ các thiết bị phổ khác nhau cho thấy có những khác biệt đáng kể phụ thuộc vào phần cứng và

phần mềm được sử dụng.

Thêi gian (sec)

H×nh 3.78: PhÐp ®o l©n quang


Cách truyền thống là tách ra một bước sóng kích thích phù hợp từ phổ UV (phổ tương tự phổ

kích thích huỳnh quang) và ghi phổ phát xạ (hình 3.80). Với bước sóng phát xạ tối ưu xác định

được, phổ kích thích được thu nhận.

Hình 3.80: Phổ kích thích và phổ phát xạ của quinidine

Công việc này được lặp đi lặp lại cho từng chất sử dụng hoặc thiết bị phổ huỳnh quang hoặc

điều kiện stop-flow trong HPLC. Thường mỗi chất cần một lần chạy mẫu tách riêng. Hệ quả thu

được một tệp phổ kích thích và phổ phát xạ cho từng chất. Đây là một quy trình nhàm chán, nó chỉ

có thể áp dụng khi chỉ quan tâm đến số lượng hạn chế các chất.

Các hệ thống phổ huỳnh quang hiện đại đưa ra 3 hướng khác nhau để thu nhận được đầy đủ

thông tin về tính chất huỳnh quang của hợp chất.

Quy trình 1 - Thực hiện quét phổ huỳnh quang off-line cho một hợp chất duy nhất trong pha động.

Ưu tiên sử dụng cuvett FLD thao tác tay khi có hợp chất tinh khiết.

Quy trình 2 - Chạy HPLC hai lần dưới những điều kiện phân tích đã biết và thu nhận riêng rẽ phổ

kích thích và phổ phát xạ.

Quy trình 3 - Kết hợp detector mảng diod DAD với detector FLD. Trong cùng một lần chạy thu

nhận cả phổ UV/VIS (phổ kích thích) và phổ phát xạ.

QUY TRÌNH 1. TẠO RA PHỔ QUÉT HUỲNH QUANG

Trước đây trên các detector huỳnh quang HPLC thế hệ đầu không dễ gì thu nhận được phổ

huỳnh quang. Các thiết bị phổ huỳnh quang tiêu chuẩn được sử dụng trong quá khứ để thu nhận

thông tin phổ của những hợp chất chưa biết bản chất. Khả năng tối ưu hoá theo hướng này bị hạn

chế khi giữa thiết kế quang cho một detector HPLC và cho một thiết bị phổ huỳnh quang và thậm

chí ngay giữa các detector đều có những khác biệt. Những khác biệt này có thể gây ra dao động

bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu.

Một detector huỳnh quang tốt cần cho ra được quét phổ huỳnh quang với tất cả thông tin phổ

như thu được với thiết bị phổ huỳnh quang chuẩn, không lệ thuộc vào việc nó chỉ là detector huỳnh

quang HPLC.

QUY TRÌNH 2. THỰC HIỆN HAI LẦN CHẠY HPLC VỚI FLD

Các điều kiện thiết lập để tách chất hữu cơ như chất PAH đã được mô tả chi tiết trong các

phương pháp chuẩn khác nhau, phổ biến là các phương pháp EPA và DIN. Để đạt được mức giới

hạn phát hiện tốt nhất đòi hỏi cần phải kiểm tra bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ đối với

tất cả các hợp chất. Cách tốt nhất là thu nhận phổ trực tuyến cho tất cả các chất trong một lần chạy.

Cách làm này tăng tốc độ khai thác, phát triển phương pháp. Hai lần chạy là đủ để tối ưu.


Trong lần chạy thứ nhất, chọn một bước sóng trong dải UV thấp làm bước sóng kích thích và

chọn dải phổ bước sóng phát xạ. Hầu hết các chất phát huỳnh quang hấp thụ mạnh tại những bước

sóng này. Sự kích thích đủ để thu nhận phổ phát xạ. Phổ phát xạ được sử dụng để thiết lập bảng thời

điểm lựa chọn bước sóng phát xạ tối ưu một cách hợp lý nhất cho tất cả các chất.

Trong lần chạy thứ hai, các điểm thiết lập bước sóng phát xạ được nhập vào chương trình thời

gian và ghi nhận phổ kích thích. Dữ liệu thu được được kết hợp lại để thiết lập bảng thời gian chạy

mang lại giới hạn phát hiện tốt nhất và độ chọn lọc tốt nhất.

QUY TRÌNH 3. THỰC HIỆN MỘT LẦN CHẠY VỚI SỰ KẾT HỢP DỮ LIỆU DAD/FLD

Đối với hầu hết các chất hữu cơ, phổ UV từ các detector mảng diod gần như là giống với phổ

kích thích huỳnh quang. Những sự khác biệt về phổ có nguyên nhân từ đặc trưng detector như về độ

phân giải phổ, về nguồn sáng.

Trên thực tế việc kết hợp một detector mảng diod với một detector huỳnh quang tạo ra tệp dữ

liệu đầy đủ cần thiết để đạt được các bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu cho một loạt

các hợp chất trong một lần chạy duy nhất. Với phổ UV/Vis/kích thích có được từ detector mảng

diod, detector huỳnh quang được đặt để thu nhận phổ phát xạ với bước sóng kích thích cố định

trong dải UV thấp.

3.6.3 Detector đo chỉ số chiết suất

Nguyên tắc hoạt động của detector đo chỉ số chiết suất là dựa trên cơ sở tính chất khúc xạ hay

phản xạ của chùm tia sáng giữa hai môi trường có chiết suất khác nhau. Như vậy do sự thay đổi

nồng độ chất mẫu trong pha động chảy qua flowcell của detector sẽ làm thay đổi cường độ chùm

sáng chiếu qua flowcell. Từ đó tạo ra sự thay đổi chiết suất của pha động không có chất mẫu hay có

chứa chất mẫu với nồng độ khác nhau. Đó chính là tín hiệu đo để phát hiện chất phân tích. Điều đó

có nghĩa là ứng với mỗi sự thay đổi nồng độ của chất phân tích trong pha động dẫn qua flowcell đều

kéo theo sự thay đổi chiết suất của pha động và trong một vùng (phạm vi) nhất định của nồng độ

chất phân tích (chất mẫu), thì sự thay đổi chiết suất này là phụ thuộc tuyến tính bậc nhất vào nồng

độ của chất mẫu trong pha động theo công thức:

Ckn . (3.34)

Trong đó n là sự thay đổi chiết suất của pha động, C là nồng độ của chất mẫu trong pha động,

k là hằng số thực nghiệm của các điều kiện đo chiết suất và của cấu tạo máy đo.

Detector đo chiết suất trong kỹ thuật HPLC có hai loại được chế tạo theo hai nguyên tắc. Một

loại theo nguyên tắc lệch hướng của chùm sáng và một loại theo nguyên tắc phản xạ của chùm sáng.

Vì thế người ta thường gọi:

- Detector khúc xạ (loại lệch hướng)

- Detector phản xạ (loại phản xạ, theo nguyên lý của Fresnel).

Tuy có hai loại nhưng nói chung chiết suất của chất mẫu phân tích tan trong pha động chảy qua

flowcell của detector đều được tính theo công thức:

00. nnkP ii

Trong đó n0 và ni0 là chiết suất của pha động khi không chứa chất phân tích và pha động khi

chứa chất phân tích. Còn k là một hằng số điều kiện như đã nói ở trên. Đồng thời từ công thức này

cũng cho ta thấy chất phân tích cần có chiết suất lớn hay khi hoà tan trong pha động phải tạo ra sự

thay đổi rõ rệt về chiết suất của pha động thì mới được phát hiện tốt theo loại detector này

Detector chiết suất có độ nhạy cao và độ chọn lọc cao. Nhưng lại bị ảnh hưởng nhiều bởi tác

động của điều kiện môi trường thực hiện phép đo, đặc biệt là ảnh hưởng của sự thay đổi nhiệt độ.

Vì sự thay đổi nhiệt độ luôn luôn kéo theo sự thay đổi chiết suất của pha động. Vì thế loại detector

này không được ứng dụng phổ biến như detector phổ UV-VIS và detector huỳnh quang, mà chỉ

dùng khi chất phân tích rất kém nhạy với detector UV-VIS hay huỳnh quang, nhưng lại nhạy với

detector đo chiết suất.


3.6.4 Detector điện hoá

Detector điện hoá có nhiều loại khác nhau. Nhưng được dùng nhiều và tốt đối với kỹ thuật

HPLC là loại detector điện hoá đo dòng Amor với buồng đo (flowcell) 3 điện cực. Nguyên tắc cấu

tạo và hoạt động của detector loại này là dựa theo sự biến thiên cường độ dòng điện đi qua điện cực

chỉ thị theo sự thay đổi nồng độ chất mẫu phân tích trong pha động chảy qua flowcell của detector.

Nguyên nhân sinh ra dòng điện này là do phản ứng điện hoá của chất phân tích xảy ra trên điện cực

chỉ thị tại một thế điện cực nhất định phù hợp cho chất phân tích. Trên cực chỉ thị chất phân tích

hoặc bị oxihoa hoặc bị khử. Tất nhiên dòng điện sinh ra ở đây là rất nhỏ (trong vùng nA-A). Dòng

điện này được phát hiện nhờ một cặp điện cực đặt trong flowcell của detector. Trong đó có cực chỉ

thị và cực so sánh. Điện cực so sánh thường dùng là cực calomen hay cực clorua bạc. Cực chỉ thị là

cực rắn chế tạo bằng than kính (glassy carbon). Trong một số trường hợp cực chỉ thị còn được chế

tạo từ hỗn hống Au-Hg. Nhưng để ổn định, khống chế cũng như kiểm soát được quá trình đo ở cực

chỉ thị trong flowcell của loại detector này người ta thường lắp thêm một điện cực phụ trợ làm bằng

kim loại trơ như Pt hay Au.

Với detector điện hoá loại này, pha động phải chứa chất điện ly như NaCl, KCl, NH4Cl,

LiCl,…chất điện ly trơ này cũng có thể được thêm vào từ đầu của dung dịch pha động để dẫn qua

cột tách HPLC nếu nó có lợi cho sự tách hoặc không ảnh hưởng đến sự tách.

Còn ngược lại nếu không thì nó phải được bơm vào pha động sau khi pha động ra khỏi cột tách,

để trộn đều với chất phân tích sau khi dẫn vào flowcell để phát hiện chúng. Trong trường hợp này

trước detector phải lắp thêm vòng phản ứng phụ để trộn đều chất điện ly vào pha động có chứa mẫu

trước khi dẫn vào detector.

Ở đây thế điện cực đặt vào 2 cực (cực chỉ thị và cực so sánh) để đo một chất hay một nhóm chất

là cố định. Khi đó phản ứng oxihoa khử xảy ra trên bề mặt điện cực chỉ thị sẽ sinh ra dòng điện và

dòng điện này là phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích có trong pha động chảy qua flowcell của

detector. Trong một giới hạn nhất định nồng độ C của chất phân tích, cường độ dòng điện này được

tính theo công thức.

CkI . (3.35)

với k là một hằng số điều kiện của phép đo. Nó được xác định bởi các hằng số máy và tính chất của

chất điện ly trơ thêm vào pha động.

Detector loại này có độ nhạy rất cao (giới hạn phát hiện nằm trong vùng ng), nhưng có nhược

điểm là tính chất bề mặt điện cực chỉ thị có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả đo. Vì thế phải luôn luôn

bảo vệ, kiểm tra và làm sạch bề mặt điện cực chỉ thị trước khi đo. Đồng thời trong quá trình đo còn

xuất hiện sự sụt thế giữa hai điện cực công tác. Để loại trừ yếu tố này người ta có thể dùng chất điện

ly trơ có nồng độ cao và độ dẫn lớn, chế tạo hình dáng thích hợp cho flowcell và đặt thêm một cực

phụ trợ trong flowcell để loại trừ sự sụt thế đó. Chính vì thế mà buồng đo của detector điện hoá phải

có 3 điện cực như đã nêu ở trên.

Detector điện hoá loại này có thể dùng để phát hiện cả chất vô cơ cũng như chất hữu cơ có phản

ứng điện hoá thuận nghịch trên bề mặt điện cực chỉ thị trong những điều kiện thí nghiệm nhất định.

Rất nhiều chất hữu cơ được phát hiện không tốt bởi detector huỳnh quang hay UV-VIS thì lại có độ

nhạy rất cao với loại detector điện hoá này, ví dụ như nhóm các hợp chất dopamin, adrenalin,….

3.6.5 Detector đo độ dẫn

Nguyên tắc làm việc của detector loại này là dựa trên cơ sở đo độ dẫn điện (hay điện trở) của

pha động qua flowcell của detector khi có hoà tan chất phân tích và khi không có hoà tan chất phân

tích. Việc đo độ dẫn ở đây là nhờ một cặp điện cực theo nguyên lý của định luật Ôm.

Thực chất của việc đo độ dẫn ở đây là đo hiệu số độ dẫn (hay điện trở) giữa pha động không hoà

tan chất phân tích và pha động có hoà tan chất phân tích. Nghĩa là khi nồng độ C của chất phân tích

trong pha động thay đổi thì độ dẫn của nó cũng thay đổi theo. Cặp điện cực dùng trong flowcell của


detector loại này bao gồm một điện cực so sánh (calomen hay clorua bạc) và điện cực chỉ thị là kim

loại Pt hay Au.

Theo phép đo này độ dẫn của một dung dịch là bằng tổng độ dẫn của các cation và anion có

trong dung dịch, nghĩa là độ dẫn A của dung dịch là:

)()( AAA (3.36)

Trong đó A(+) và A(-) là độ dẫn của các ion dương và ion âm trong dung dịch. Còn độ dẫn

đương lượng Ai của ion i được tính theo công thức:

NkAi

1000. cm2/(đg.lg.Ohm) (3.37)

với k là độ dẫn riêng và N là nồng độ đương lượng của chất i ở trong dung dịch. Vì thế trong một

vùng nhất định của nồng độ C của chất phân tích trong pha động, độ dẫn thu được qua điện cực chỉ

thị là phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của chất i trong pha động và được tính theo công thức sau:

CkLi .1 (3.38)

Trong đó k1 là hằng số điều kiện của phép đo này.

Một yếu tố ảnh hưởng nhiều đến kết quả đo theo detector loại này là bề mặt của điện cực chỉ thị.

Bề mặt này dễ bị đầu độc bởi các chất hoạt động bề mặt, các chất ức chế. Nó cũng có tác dụng

tương tự như trong detector điện hoá loại Amor. Vì thế phải luôn luôn làm sạch trước mỗi lần đo.

3.6.6 Detector điện hoá đo thế với điện cực chọn lọc ion

Nguyên tắc làm việc của detector loại này là dựa trên cơ sở đo sự thay đổi thế giữa hai cực trong

flowcell của detector trong điều kiện dòng không đổi (hoặc bằng 0) khi có pha động không hoà tan

chất phân tích và có hoà tan chất phân tích đi qua flowcell. Sự thay đổi thế này là tuân theo phương

trình Nerst và là hàm số của nồng độ C của chất phân tích có trong pha động. Cặp điện cực được

dùng ở đây bao gồm một cực so sánh (cực calomen hoặc cực clorua bạc), còn cực chỉ thị là cực

chọn lọc ion của chất phân tích. Ví dụ để phát hiện hay xác định Cu ta phải dùng cực chọn lọc ion

của ion Cu(II). Cực chỉ thị trong loại detector này hiện nay đang được dùng là điện cực rắn. Vì thế

bề mặt điện cực là một yếu tố có ảnh hưởng rất rõ rệt đến kết quả đo. Đồng thời thành phần và tính

chất của chất nền trong pha động cũng có vai trò rất quan trọng trong mỗi quá trình phân tích cụ thể.

Theo nguyên tắc trên detector loại này ứng với cực chỉ thị ta chỉ phát hiện và đo được một chất

mà thôi, nó không cho phép phát hiện cả một nhóm chất như detector đo dòng Amor nói trên, và

cũng được dùng chủ yếu để xác định các ion kim loại đã có điện cực chọn lọc ion của nó để lắp vào

buồng đo (flowcell).

Detector loại này có độ chọn lọc và độ nhạy khá cao. Độ nhạy trong vùng ng và độ tuyến tính

lên đến 104 lần. Tất nhiên độ nhạy ở đây là được quyết định bởi tính chất của điện cực chỉ thị. Song

trong một vùng nhất định của nồng độ chất phân tích trong pha động thì thế đo được của cực chỉ thị

là phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của chất phân tích trong pha động dẫn qua flowcell. Mối

quan hệ này có thể minh hoạ qua công thức đơn giản như sau:

CkE . (3.39)

Trong đó k là hằng số điều kiện của phép đo này, nó phụ thuộc vào tệp các điều kiện vận hành

detector và đặc trưng cho mỗi loại pha động khác nhau, C là nồng độ chất phân tích hoà tan trong

pha động. Tất nhiên vùng tuyến tính theo phương trình trên là khác nhau đối với mỗi nguyên tố

phân tích và loại điện cực chọn lọc.

Detector loại này được sử dụng không nhiều, vì những một lẽ là nó chỉ phát hiện được một chất

với một điện cực chỉ thị. Mặt khác còn vì điện cực chọn lọc rất đắt, tuổi thọ lại không được lâu,

thông thường là 6 tháng với kim loại kiềm, 2-3 năm với các kim loại như Cu, Pb, Zn. Vì thế xu

hướng hiện nay là nghiên cứu chế tạo điện cực chọn lọc ion lỏng. Vì thế người ta đã nghiên cứu chế

tạo cực chọn lọc ion lỏng thay thế cực chọn lọc ion dạng rắn.


3.6.7 Detector phổ phát xạ ion

Chúng ta không thảo luận chi tiết về loại detector này vì ngày nay nó không còn được ứng dụng

phổ biến nữa.

3.6.8 Detector hấp thu nhiệt

Loại detector này hoạt động theo nguyên tắc là khi chất phân tích bị một chất khác hấp phụ thì

kéo theo sự toả nhiệt hay thu nhiệt của buồng đo và trong một giới hạn nhất định thì hiệu ứng toả

nhiệt hay thu nhiệt này phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ chất phân tích theo phương trình:

CkH . (3.40)

Trong đó H là hiệu ứng nhiệt của quá trình hấp phụ trong buồng đo (flowcell) của detector; C là

nồng độ của chất phân tích có trong dung dịch mẫu chảy qua flowcell; còn k là một hệ số, được gọi

là hằng số thực nghiệm của phép đo này, nó được quyết định bởi các tham số máy đo và điều kiện

thí nghiệm.

Flowcell của loại detector này gồm có hai buồng, buồng so sánh và buồng mẫu. Mỗi buồng có

một cặp pin nhiệt điện có độ nhạy cao. Buồng so sánh được nhồi đầy bồng thuỷ tinh trơ, buồng mẫu

nhồi đầy chất hấp thu nhiệt, hai buồng này được đặt sát nhau và được bao bởi một tấm cách nhiệt.

Toàn bộ được đặt trong một hộp kín cách nhiệt với môi trường bên ngoài, để đảm bảo cho sự thay

đổi nhiệt trong flowcell chỉ là do dòng mẫu chảy qua gây ra. Độ nhạy của detector loại này là phụ

thuộc vào các yếu tố:

- Bản chất của chất mẫu tan trong pha động

- Bản chất của cặp pin nhiệt điện

- Bản chất của chất hấp thu nhiệt nhồi trong flowcell.

Loại detector này được sử dụng không nhiều. Vì chỉ có một số loại chất tan mới có hiệu ứng

nhiệt rõ ràng khi bị hấp phụ.

3.6.9 Detector phổ nguyên tử

3.6.9.1 Detector phát xạ nguyên tử ICP-AES

Detector nµy míi ®îc ph¸t triÓn vµ øng dông trong kho¶ng gÇn ba chôc n¨m trë l¹i ®©y. Nã rÊt phï hîp cho viÖc ph©n tÝch vµ ph¸t hiÖn hçn hîp çc kim lo¹i víi ®é nh¹y rÊt cao (trong ph¹m vi ng). Detector lo¹i nµy chÝnh lµ çc m¸y phæ ph¸t x¹ nguyªn tö ICP-AES nhiÒu kªnh.

Detector lo¹i nµy cã ®é nh¹y vµ ®é chän läc kh¸ cao, tèc ®é ph©n tÝch lín, ®ång thêi l¹i cã kh¶ n¨ng lo¹i bá ¶nh hëng thµnh phÇn nÒn cña pha ®éng. Detector lo¹i nµy ®· tõng ®îc sö dông rÊt cã hiÖu qu¶ cho ®Õn khi cã sù ra ®êi, ph¸t triÓn vµ ghÐp nèi thµnh c«ng hÖ thèng phæ khèi lîng ICP-MS víi HPLC trong viÖc ph©n tÝch çc nguyªn tè ®Êt hiÕm theo kü thu©t HPLC vµ nhiÒu nguyªn tè kim lo¹i trong mét hçn hîp mÉu phøc t¹p.

NhiÒu phßng thÝ nghiÖm cña çc níc tiªn tiÕn ®· ghÐp nèi gi÷a kü thuËt t¸ch HPLC víi kü thuËt ph©n tÝch phæ nguyªn tö ICP-AES ®Ó t¸ch vµ ph©n tÝch hçn hîp çc kim lo¹i mét çch ®ång thêi.

Theo nguyªn lý cña phÐp ®o AES th× tÝn hiÖu ®o cña detector ë ®©y lµ cêng ®é cña v¹ch phæ ph¸t x¹ nguyªn tè ph©n tÝch vµ trong mét vïng nhÊt ®Þnh nång ®é C cña chÊt ph©n tÝch th× tÝn hiÖu ®o nµy còng phô thuéc tuyÕn tÝnh vµo nång ®é ®é C theo ph¬ng tr×nh:

CkI .

Trong ®ã k lµ h»ng sè thùc nghiÖm cña phÐp ®o ICP-AES, nã lµ h»ng sè ®iÒu kiÖn ®îc x¸c ®Þnh bëi tÊt c¶ çc ®iÒu kiÖn thùc nghiÖm ®· ®îc chän cho phÐp ®o ®ã.

Detector lo¹i nµy cã vïng tuyÕn tÝnh ®éng häc rÊt réng, th«ng thêng lµ ®¹t ®Õn 10 5 lÇn vµ cã khi ®Õn 106 lÇn. §ã lµ u ®iÓm cña nã h¬n h¼n çc lo¹i detector kh¸c


3.6.9.2 Detector phổ khối ICP-MS

Phæ khèi plasma c¶m øng cao tÇn (ICP-MS: Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) ®îc khai th¸c nh mét kü thuËt ph©n tÝch th¬ng m¹i vµo ®Çu nh÷ng n¨m t¸m m¬i vµ tõ ®ã ®· ®îc ¸p dông ®Ó x¸c ®Þnh çc nguyªn tè vÕt, nguyªn tè thø yÕu vµ nguyªn tè chÝnh trong hÇu nh mäi lÜnh vùc ph©n tÝch. Søc m¹nh cña kü thuËt gåm cã:

- Bao phñ d¶i nguyªn tè réng - HÇu nh tÊt c¶ çc nguyªn tè cã thÓ ®îc ®o b»ng

ICP-MS, gåm çc nguyªn tè kiÒm vµ kiÒm thæ, çc kim lo¹i chuyÓn tiÕp vµ çc kim lo¹i kh¸c, çc nguyªn tè ®Êt hiÕm, hÇu hÕt çc halogen vµ mét sè phi kim.

- HiÖu qu¶ - TÝn hiÖu ®é nh¹y cao vµ nÒn thÊp kÕt hîp ®Ó mang l¹i møc giíi h¹n

ph¸t hiÖn rÊt thÊp (trong hÇu hÕt çc trêng hîp lµ cËn ng/L (sub -ng/L - parts-per-trillion (ppt)).

- D¶i lµm viÖc ph©n tÝch réng - Lªn ®Õn 9 bËc trong mét thu nhËn ®¬n lÎ.

- Th«ng tin ®ång vÞ

- Lµm detector s¾c ký tuyÖt vêi

Trong d¶i çc kü thuËt phæ nguyªn tö ®îc sö dông trong çc phßng thÝ nghiÖm ph©n tÝch, ICP-MS gi÷ mét vÞ trÝ ®éc t«n nhê vµo c«ng dông vÒ tèc ®é, ®é nh¹y, d¶i ®éng häc vµ d¶i nguyªn tè cã thÓ ph©n t Ých cña nã. Nã cã thÓ ®îc c©n nh¾c nh mét kü thuËt lùa chän cã thÓ ®îc so víi phæ ph¸t x¹ quang häc (ICP-Optical Emission Spectroscopy (OES) nãi trªn, mét kü thuËt ph©n tÝch cßn ®îc biÕt ®Õn díi çi tªn phæ ph¸t x¹ nguyªn tö Atomic Emission Spectroscopy hay AES) ®Ó ®o nhanh çc nguyªn tè nång ®é

cao h¬n (nång ®é g/L ®Õn mg/L hay parts-per-billion ®Õn parts-per-million). T¹i cïng thêi ®iÓm, ICP-MS c¹nh tranh hoÆc trong nhiÒu trêng hîp më réng kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn cña phæ hÊp thô nguyªn tö lß graphit (Graphite Furnace Atomic Absorption Spectroscopy GFAAS) ®Ó x¸c ®Þnh çc nguyªn tè vÕt vµ siªu vÕt (nång ®é ng/L hay ppt) vµ ngµy nay nã ®· ®îc ghÐp nèi thµnh c«ng víi thiÕt bÞ kü thuËt s¾c ký láng HPLC c¶ vÒ phÇn cøng, tÝnh ®ång bé trong ®iÒu khiÓn, thu nhËn d÷ liÖu vµ xö lý d÷ liÖu.

ViÖc s¾c ký láng (LC) vµ s¾c ký ion (IC) ®îc ghÐp víi ICP-MS sÏ cïng ®îc th¶o luËn do trong khi çc øng dông th× kh¸c nhau, nhng cÊu h×nh vµ kü thuËt vÒ c¬ b¶n lµ gièng nhau. LC- hoÆc IC-ICP-MS ®îc sö dông ®Ó ph©n tÝch çc hîp chÊt kh«ng bay h¬i hoÆc çc ion trong dung dÞch. Dung dÞch cã thÓ lµ d¹ng níc, h÷u c¬ hoÆc mét hçn hîp cña c¶ hai. ICP-MS chØ lµ detector d¹ng nguyªn tè, phæ th«ng, cã thÓ dïng cho s¾c ký láng vµ nh vËy sÏ cã ®îc nhiÒu øng dông. Khi ®îc kÕt hîp víi p hæ khèi ph©n tö, ICP-MS cã thÓ t¹o ra mét c«ng cô kh¶o s¸t m¹nh mÏ dïng cho chØ thÞ kim lo¹i trong çc hîp chÊt sinh häc. Khi ®îc sö dông víi s¾c ký ion, ICP-MS cã thÓ x¸c nhËn sù cã mÆt nguyªn tè t¨ng cêng cho c«ng viÖc nhËn diÖn çc d¹ng hîp chÊt b»ng thêi gian lu.

Bé kÝt kÕt nèi vÒ c¬ b¶n nã gåm mét ®o¹n èng dïng lµm ®êng truyÒn, çc ®Çu nèi vµ khíp nèi cÇn thiÕt, çp ®iÒu khiÓn tõ xa dïng cho giao tiÕp gi÷a LC vµ ICP -MS.

§· ®¹t ®îc giíi h¹n ph¸t hiÖn trªn bËc thÊp -ng/L cho kim lo¹i (hoÆc tuyÖt ®èi ë møc fg) nhê ghÐp nèi kü thuËt t¸ch HPLC víi phæ khèi ICP-MS. ViÖc nèi ghÐp vµ th¸o dì chØ trong ph¹m vi mét vµi phót, b¶o ®¶m ®¸p øng ph©n tÝch víi sè lîng mÉu lín c¶ tæng kim lo¹i vµ d¹ng kim lo¹i.

3.6.10 Detector phổ khối

Về nguyên tắc thì đây là một máy quang phổ khối lượng (MS). Việc sử dụng máy MS làm

detector cho HPLC là một thành công của sự ghép nối giữa hai kỹ thuật phân tích sắc ký và khối

phổ, ví dụ như ghép nối GC-MS, LC-MS, CE-MS. Sự ghép nối này đã mang lại những thành quả

rất tốt trong lĩnh vực tách và phân tích các chất, đặc biệt là đối với hỗn hợp chất phức tạp. MS là

một detector rất ưu việt cho sắc ký hiện nay.


Với sự phát triển như vũ bão của khoa học kỹ thuật, các hệ thống MS ngày càng hoàn thiện từ

phần cứng đến hệ thống dữ liệu, tốc độ, chính xác, đưa ra đa dạng thông tin về chất, các công cụ hỗ

trợ người sử dụng trong từng lĩnh vực về công việc nhận diện và định lượng chất. Ngày nay

detector phổ khối đã trở thành công cụ đắc lực nhất trong các phòng thí nghiệm phân tích, phòng thí

nghiệm an toàn thực phẩm, dược phẩm, nghiên cứu về thuốc, các chuyển hoá trao đổi chất, nghiên

cứu về lâm sàng, công nghệ sinh học (nghiên cứu về protein, giải trình tự protein, nghiên cứu về

gen).

Hệ thống phổ khối là phức tạp và đắt tiền. Người ta thường phân chia các dạng phổ khối theo

nguyên lý tách khối lượng, từ đơn giản như các hệ thống một tứ cực, đến các thiết bị phổ khối thời

gian bay, bẫy ion, cho đến các thiết bị lai ghép đa tứ cực, tứ cực ghép nối thời gian bay và đến các

hệ thống siêu phức tạp như phổ khối cộng hưởng quỹ đạo ion chuyển đổi Fourier và bẫy ion nối

ghép cộng hưởng quỹ đạo ion chuyển đổi Fourier.

Phần này chúng ta sẽ tìm hiểu những thông tin khái quát nhất về các hệ thống thiết bị phổ khối

đã nối ghép thành công với hệ thống tách sắc ký lỏng HPLC hoặc sắc ký lỏng siêu hiệu quả UPLC.

Trước hết chúng ta cần nắm được bất kỳ hệ thống thiết bị phổ khối nào từ đơn giản đến phức

tạp đều bao gồm các khối cấu kiện và có chức năng đi kèm như sau:

- Phần truyền mẫu: ở đây chúng ta thảo luận trong phạm vi phần truyền mẫu là hệ thống tách

sắc ký lỏng (LC), ngoài ra MS còn có thể sử dụng các hệ thống truyền mẫu (có kết hợp cả chức

năng ion hoá mẫu) như đầu dò gài trực tiếp (DIP), giải hấp ion hoá bằng laser với sự hỗ trợ của nền

(MALDI).

- Nguồn ion hoá để ion hoá phân tử chất phân tích thành phần tử mang điện. Có các loại nguồn

ion hoá được goị tên theo nguyên lý hoạt động như sau: ion phun điện tích ESI, ion hoá hoá học tại

áp suất khí quyển APCI, quang ion hoá tại áp suất khí quyển APPI. Các nguồn ion hoá khác như

trường ion hoá FI, ion hoá giải hấp FD sẽ không thảo luận ở đây vì chúng không nối ghép với

HPLC.

- Hệ thống cầu dẫn ion có chức năng dẫn truyền, duy trì năng luợng ion khi truyền dẫn ion đi từ

vùng này đến vùng kia trong hệ thống.

- Hệ thống tách khối lượng. Đây là phần quan trọng nhất, là trái tim của hệ thống phổ khối, nó

có chức năng tách các ion ra khỏi nhau theo số khối của nó (nói chính xác là theo tỷ lệ khối lượng

trên điện tích). Chúng ta sẽ xem xét các nguyên lý tách khối tứ cực (quadrupole), bẫy ion (ion trap),

thời gian bay (time-of-flight), cộng hưởng cyclotron quỹ đạo ion biến đổi fourier, tách theo độ linh

động của ion IMS và xem xét các hệ thống lai ghép như hệ thống ba tứ cực (triplequad), hệ thống tứ

cực nối ghép thời gian bay (Q-TOF), hệ thống bẫy ion nối ghép cộng hưởng cyclotron quỹ đạo ion

biến đổi fourier.

- Hệ thống phát hiện có chức năng chuyển tín hiệu các ion thành tín hiệu vật lý có thể đo được

(dòng điện). Hệ thống này hiện nay phổ biến có nhân điện tử EM và nhân quang điện.

Người đọc có thể cập nhật thông tin về kỹ thuật phân tích phổ khối trong các tài liệu chuyên sâu.

Chương 4 SẮC KÝ LỎNG ĐIỀU CHẾ

Các nguyên lý trong HPLC điều chế

Từ những ngày đầu của hoá học tổng hợp, việc sản xuất các hợp chất gồm 2 bước: tổng hợp hợp

chất và tinh chế nó. Cùng với các kỹ thuật tinh chế truyền thống như tinh thể hoá, chiết và chưng

cất, các thiết bị sắc ký cột điều chế đầu tiên đã được phát triển vào những năm 1950 và 60. Thường

chúng có cấu tạo gồm một cột và một bể chứa dung môi đặt trên cột. Mẫu được đưa bằng tay lên

đầu cột và sau đó cột được nối với bể chứa dung môi. Do hệ thống chưa có bơm, đạt được dòng

chảy qua cột là nhờ vào áp lực thuỷ tĩnh của dung môi. Để gia tăng số lượng mẫu và công suất tách,


các hệ thống HPLC đầu tiên đã được đưa vào khai thác đầu những năm 1970. Do vật liệu nhồi cột

đã tốt hơn cùng với kích thước hạt nhỏ hơn nên bơm cao áp được sử dụng để tạo ra dòng chảy.

Khi Merrifield phát triển tổng hợp pha rắn dùng cho peptid vào năm 1963, ông đã tránh được

việc phải tinh chế hỗn hợp phản ứng thô sau mỗi bước tổng hợp nhờ gắn cực C amino axit lên lớp

đỡ nhựa polymer không tan. Sau đó mỗi amino axit của trình tự peptide được gắn với trung gian cố

định này nhờ sử dụng các tác nhân và các nhóm bảo vệ của peptide tổng hợp truyền thống. Những

lợi thế đạt được đó là các hợp chất phản ứng có thể được sử dụng ở nồng độ cao, điều đó dẫn đến

tốc độ chuyển đổi tốt hơn và bước tinh chế trở thành một quy trình lọc đơn giản là rửa trôi mọi thứ

không được cặp với vật liệu nhựa.

Nguyên lý này đã được ứng dụng trên khắp ngành công nghiệp dược phẩm để tổng hợp số lượng

lớn các hợp chất theo hướng tổ hợp cùng với các xét nghiệm khảo sát số lượng mẫu lớn đã được

phát triển từ trước đó. Nhưng mặc dù cách giải quyết pha rắn đã lấy được hợp chất mục tiêu ra khỏi

hạt nhựa nhưng chúng vẫn chưa đủ độ tinh khiết để sử dụng trong các xét nghiệm trực tiếp. Để

tránh hiện tượng hình thành nút cổ chai (tắc nghẽn) trong quy trình nghiên cứu tìm kiếm thuốc, cần

có hệ thống tinh chế các hợp chất mục tiêu tốc độ cao.

Các phương pháp truyền thống như phương pháp chưng cất hoặc chiết không có khả năng tự

động hoá ở mức cao, đòi hỏi sự tập trung nhiều nhà hoá học tổng hợp. Phương pháp duy nhất đáp

ứng các yêu cầu về tinh chế tự động hoá và dễ sử dụng số lượng lớn các chất là HPLC điều chế.

Trong khi HPLC phân tích đã trở thành công cụ chuẩn trong ngành công nghiệp dược phẩm thì

vẫn còn có động lực lớn và đang trên đà phát triển trong lĩnh vực HPLC điều chế. Lấy ví dụ xu

hướng hiện nay là đang nhắm tới những hệ thống tinh chế tốc độ mẫu cao để tinh chế hàng trăm

hợp chất mỗi ngày hoặc hướng tới những hệ thống walk-up. Ở đó nhà quản lý hệ thống kiểm soát

các hệ thống và người sử dụng có thể độc lập tinh chế mẫu của họ.

Trong phần này chúng ta cùng tìm hiểu thông tin về các nguyên lý cơ bản của HPLC điều chế,

mô tả các cấu kiện của một hệ thống tinh chế, nói về các chiến lược gom phân đoạn và đưa ra một

số giải pháp ứng dụng cho những nhiệm vụ và những vấn đề chung nhất trong HPLC điều chế.

Trong phần này sẽ đưa ra khái quát chung liên quan đến HPLC điều chế, đề nghị tham khảo thêm

các tài liệu: Purification Solution Guide và Purification Application Compendium.

4.1 Giới thiệu về HPLC điều chế

4.1.1 HPLC điều chế có nghĩa là gì

Thuật ngữ HPLC điều chế thường liên quan đến cột lớn và tốc độ dòng cao. Tuy nhiên quy mô

trang thiết bị hoặc lượng pha động được bơm qua hệ thống không xác lập thực nghiệm HPLC điều

chế, mà đúng hơn là mục tiêu tách. Mục tiêu của một phép chạy HPLC phân tích là xác định định

tính và định lượng một hợp chất. Đối với một phép chạy HPLC điều chế, nó cô lập và tinh chế một

sản phẩm có giá trị (bảng 4.1). Do khi so sánh với các phương pháp tinh chế truyền thống như

chưng cất, tinh thể hoá hoặc chiết, HPLC điều chế đắt tiền hơn nên nó chỉ được dùng cho những sản

phẩm hiếm hoặc đắt tiền. Với sự gia tăng nhu cầu sản xuất đa dạng các hợp chất có độ tinh khiết

cao. Cùng với sự gia tăng nhu cầu sản xuất các hợp chất có độ tinh khiết cao trong sự thay đổi mạnh

về số lượng các khảo sát hoạt tính, độ độc, các khảo sát dược phẩm đã làm cho lĩnh vực vận hành

HPLC điều chế thay đổi.

Bảng 4.1 Định nghĩa HPLC phân tích và HPLC điều chế

HPLC phân tích HPLC điều chế

Mẫu từ detector đi vào vị trí thải

Mục đích: Định lượng và/hoặc nhận

diện hợp chất

Mẫu từ detector đi đến bộ thu phân đoạn

Mục đích: Cô lập và/hoặc tinh chế hợp chất

4.1.2 Các lĩnh vực hoạt động của HPLC điều chế


Quy mô HPLC điều chế được xác định bởi lượng hợp chất được tinh chế.

HPLC điều chế được sử dụng để cô lập và tinh chế những sản phẩm có giá trị trong công nghiệp

hoá học và công nghiệp dược cũng như trong lĩnh vực công nghệ sinh học và hóa sinh. Tuỳ thuộc

vào lĩnh vực hoạt động lượng hợp chất được cô lập hoặc tinh chế thay đổi đột ngột. Phạm vi thảo

luận trong tài liệu này chúng ta sẽ nói về tinh chế micro.

- Để nhận diện và giải nghĩa cấu trúc của những hợp chất chưa biết trong hoá học tổng hợp hoặc

hoá học sản phẩm tự nhiên, cần thu được các hợp chất tinh khiết trong dải từ một đến một vài

milligam.

- Lượng lớn hơn, tinh chế ở lượng gam là cần thiết đối với chất chuẩn, các chất tham chiếu và các

hợp chất dùng cho kiểm tra độc học và kiểm tra dược học.

- HPLC điều chế phạm vi công nghiệp hoặc phạm vi sản xuất, lượng cô lập và tinh chế là lượng

kg, ngày nay thường đó là các sản phẩm dược có giá trị.

Lĩnh vực hoạt động đối với HPLC điều chế được tổng kết trong bảng dưới đây

Bảng 4.2 Các lĩnh vực hoạt động của HPLC điều chế

Lượng chất Lĩnh vực hoạt động

g

mg

g

kg

Cô lập các enzym

Kiểm tra sinh học và hoá sinh

Giải nghĩa và mô tả đặc trưng cấu trúc

- Các sản phẩm phụ từ quá trình sản xuất

- Các chất chuyển hoá từ nền sinh học

- Các sản phẩm tự nhiên

Các hợp chất tham chiếu (chuẩn phân tích)

Các chất dùng cho khảo sát độc học

- Các chất cơ bản với độ tinh khiết cao

- Cô lập các sản phẩm phụ

Phạm vi công nghiệp, các chất hoạt động, thuốc

4.1.3 Phát triển phương pháp và tính toán luỹ tiến

Trong sắc ký phân tích lượng mẫu được áp lên cột điển hình nằm trong dải microgam nhưng

cũng có thể thấp hơn. Tỷ lệ khối lượng của hợp chất so với pha tĩnh là nhỏ hơn 1:100000. Thể tích

mẫu cũng thường nhỏ hơn thể tích cột (<1:100). Dưới những điều kiện này quá trình tách đạt chất

lượng tốt với píc sắc nhọn và cân đối. Sự khác biệt lớn nhất trong HPLC điều chế là luợng mẫu

được áp lên cột so với pha tĩnh lớn hơn nhiều. Tác động lên qúa trình sắc ký, các phương pháp tiêm

những lượng mẫu lớn và việc luỹ tiến phương pháp phân tích được mô tả trong những phần tiếp

theo.

4.1.4 Đẳng nhiệt hấp phụ

Mục đích của HPLC điều chế là xác định định lượng và/hoặc định tính hợp chất. Các thông số

sắc ký quan trọng để đạt được kết quả chính xác và tin cậy là độ phân giải, độ rộng píc và độ cân

đối píc. Nếu có nhiều mẫu hơn nữa được đưa lên cột, chiều cao và diện tích píc sẽ gia tăng nhưng

độ cân đối và hệ số dung tích vẫn không thay đổi như chỉ ra trong hình dưới đây.


Hình 4.1 Hình dạng píc đối với HPLC phân tích

Trong HPLC phân tích hình dạng píc gần giống với đường cong Gaussian. Độ lệch chuẩn của píc

v mô tả độ cân đối của nó và việc nó giống với đường cong Gaussian như thế nào. Hệ số dung tích

(k’) là thời gian lưu tương đối (t) so với thời gian lưu của hợp chất không lưu giữ (t0). Nếu mẫu

được đưa lên cột nhiều hơn một lượng nào đó, đường đẳng nhiệt hấp phụ trở nên phi tuyến. Điều

này có nghĩa píc trở nên mất cân đối, cho thấy có sự giãn đuôi mạnh và hệ số dung tích giảm như

trong hình 4.2. Trong HPLC điều chế hiệu ứng này được gọi là sự quá tải nồng độ. Tuỳ vào hợp

chất, trong một số trường hợp, hệ số dung tích gia tăng cùng với sự gia tăng quá tải, đây là lý do

dẫn đến sự giãn mạnh mặt trước píc. Do đường đẳng nhiệt hấp phụ phụ thuộc vào hợp chất, khả

năng tải của cột hệ thống sắc ký được xác định cho từng thực nghiệm HPLC điều chế.

Hình 4.2 Hệ số dung tích và độ lệch chuẩn đối với HPLC điều chế

4.1.5 Nạp cột và sự quá tải cột

Để tinh chế những lượng mẫu lớn, hai phương pháp có thể được sử dụng: Luỹ tiến hệ thống phân

tích hoặc quá tải cột. Luỹ tiến hệ thống phân tích có nghĩa sử dụng cột đường kính lớn hơn, tốc độ

dòng cao hơn và gia tăng thể tích mẫu với chiều dài cột và nồng độ mẫu vẫn không đổi. Các píc sẽ

vẫn sắc nhọn và cân đối. Bất lợi của phương pháp này là cần đến cột lớn và thể tích dung môi cao

để tách lượng nhỏ hợp chất, do đó phương pháp sẽ không kinh tế. Do đó quá tải cột là sự gia tăng

lượng mẫu được đưa lên cột trong cùng các điều kiện phân tích thường là phương pháp được lựa

chọn. Sử dụng giải pháp làm quá tải cột cho phép tách mẫu trong dải milligam ngay trên cột phân

tích. Đối với những lượng mẫu lớn, có thể cần phải luỹ tiến thêm phương pháp. Việc quá tải cột có

thể được thực hiện hoàn tất theo hai hướng: qúa tải nồng độ hoặc quá tải thể tích. Trong quá tải

nồng độ, nồng độ mẫu được gia tăng nhưng thể tích mẫu được tiêm vẫn giữ nguyên. Hệ số dung

tích k’ giảm và hình dạng píc thay đổi từ đường Gaussian sang dạng tam giác như chỉ ra trong hình

4.3 Hướng quá tải nồng độ chỉ có thể được thực hiện khi hợp chất mẫu có độ tan tốt trong pha động.


Hình 4.3 Hình dạng píc của hướng quá tải thể tích và quá tải nồng độ

Nếu độ tan hợp chất kém, giải pháp quá tải nồng độ không thể sử dụng được và phải tiêm vào thể

tích mẫu nhiều hơn. Kỹ thuật này còn được gọi là quá tải thể tích. Khi vượt quá một thể tích tiêm

nào đó, chiều cao píc không gia tăng và píc có dạng hình chữ nhật. Trong HPLC điều chế, quá tải

nồng độ được ủng hộ hơn so với quá tải thể tích do lượng mẫu có thể tách được cao hơn. Do độ tan

của hợp chất thường là một yếu tố hạn chế nên cả hai kỹ thuật quá tải được sử dụng kết hợp với

nhau. Bảng dưới đây khái quát các kỹ thuật quá tải.

Bảng 4.3 Khái quát quá tải nồng độ và quá tải thể tích

Quá tải nồng độ Quá tải thể tích

Được xác định bởi độ tan của hợp chất

trong pha động

Lĩnh vực “điều chế” của đẳng nhiệt

hấp phụ

Tốc độ số mẫu điều chế được xác định

bởi độ chọn lọc

Kích thước hạt của pha tĩnh ít bị tác

động

Được xác định bởi thể tích tiêm

Lĩnh vực “phân tích” của đẳng nhiệt hấp

phụ

Tốc độ số mẫu được điều chế được xác

định bởi đường kính cột

Yêu cầu hạt kích thước nhỏ

4.1.6 Phương pháp luỹ tiến

Cả quá tải nồng độ và quá tải thể tích đều làm giảm độ phân giải của hợp chất. Do việc tách các

hợp chất yêu cầu một độ phân giải nhất định nào đó nên việc quan trọng là phải tối ưu được độ phân

giải. Khi mà khả năng chọn lọc và sự quá tải phụ thuộc lẫn nhau, việc cải thiện độ chọn lọc sẽ gia

tăng lượng mẫu có thể tách được trong một lần chạy. Do đó việc tối ưu và luỹ tiến một phương

pháp phân tích thành phương pháp điều chế được thực hiện theo 3 bước:

1. Tối ưu phương pháp phân tích liên quan đến độ phân giải

2. Làm quá tải cột trên cột phân tích

3. Luỹ tiến cột điều chế

Nk

kRS )

1)(1(

'

1

'

1

4.1.7 Các tính toán luỹ tiến

Hai thông số phải được luỹ tiến khi chạy từ một cột với đường kính trong nhỏ hơn sang cột với

đường kính trong lớn hơn là tốc độ dòng và lượng mẫu đưa lên cột. Để luỹ tiến tốc độ dòng, hàm

trên trong hình 4.4 dưới đây được sử dụng, trong ví dụ này tốc độ dòng 0,6 ml/phút trên cột đường

Rs : Độ phân giải

: Độ chọn lọc tương đối

K’ : Hệ số dung tích

N : Số đĩa lý thuyết


kính trong 3 mm được luỹ tiến lên cột đường kính trong 21,2 mm. Để luỹ tiến lượng mẫu nạp lên

cột, hàm dưới được sử dụng, không có gì khác nhau giữa việc nó được dùng để luỹ tiến nồng độ hay

luỹ tiến thể tích tiêm. Hệ số CL bằng 1 nếu sử dụng hai cột có cùng độ dài. Sau các tính toán luỹ

tiến và phép chạy điều chế đầu tiên, thông thường cần tối ưu thêm một số thông số để đạt được kết

quả tách tốt nhất.

Cột phân tích Cột điều chế

2

2

2

1

2

1

r

r

V

V

Dòng: 0,6 ml/phút Dòng: 30ml/phút

Thể tích: 15 l/lần tiêm Thể tích: 750 l/lần tiêm

LCr

x

r

x 12

2

2

2

1

1

x1: thể tích tối đa trên cột 1 = 15 l

r1: bán kính cột 1 = 1,5 mm

x2: thể tích tối đa trên cột 2 = ?

r2: bán kính cột 2 = 10,6 mm

CL: tỷ lệ chiều dài cột = 1

Hình 4.4 Các hàm tính toán luỹ tích

4.1.8 Mục tiêu của sắc ký điều chế

Ba thông số quan trọng được sử dụng để xét đoán kết quả của một phép chạy điều chế là độ tinh

khiết của sản phẩm, sản lượng và số lượng mẫu đưa vào điều chế. Do các thông số này phụ thuộc

vào nhau, không thể tối ưu một phương pháp HPLC điều chế với tất cả 3 thông số này (hình 4.5).

Hình 4.5 Các kết quả của một lần chạy HPLC điều chế

Sắc đồ 1 cho biết một phép chạy HPLC điều chế có khả năng áp dụng với số lượng mẫu đưa vào

rất cao nhưng khả năng tách hai hợp chất tồi. Nó có thể được sử dụng để thu được một số phân

đoạn với độ tinh khiết cao cho từng chất nhưng khả năng thu hồi hay đúng hơn là sản lượng thì thấp.

Trong sắc đồ 2 các píc được tách tốt, do đó nó có thể cho ra cả hai hợp chất với độ tinh khiết và sản

lượng cao nhưng số lượng mẫu đưa vào điều chế thì rất thấp. Sắc đồ 3 sẽ là một phép chạy HPLC

điều chế tối ưu với sự dung hoà tất cả 3 thông số. Các píc hầu như đã tách khỏi đường nền, mang lại

độ tinh khiết và sản lượng cao và số lượng mẫu đưa vào điều chế cao nhất ở mức có thể được.

Thông số quan trọng nhất cho quá trình tách được tối ưu phụ thuộc vào ứng dụng. Lấy ví dụ nếu

hợp chất được cô lập phục vụ kiểm tra hoạt tính hoặc kiểm tra độ độc, cần thu được hợp chất này ở


độ tinh khiết cao. Số lượng mẫu điều chế và sản lượng ít quan trọng. Nếu giai đoạn tổng hợp trung

gian được tinh chế, độ tinh khiết không phải là quan trọng nhất, miễn là đủ để phục vụ bước tổng

hợp tiếp theo. Tuy nhiên số lượng mẫu đưa vào điều chế là một vấn đề do thông thường cần phải

hoàn tất toàn bộ quá trình tổng hợp càng nhanh càng tốt, sản lượng cũng quan trọng do giá trị của

hợp chất và do đó việc để thất thoát hợp chất cần được giảm thiểu.

4.2 Vai trò của cột trong HPLC điều chế

4.2.1 Giới thiệu

Cột thường được gọi (hay có thể phóng đại) là trái tim của sắc ký lỏng. Việc chọn cột và các điều

kiện pha động áp dụng cho mẫu tồi có thể làm cho tất cả các hệ thống trang thiết bị tinh chế và hệ

thống dữ liệu đắt tiền trong phòng thí nghiệm trở nên tầm thuờng. Tình trạng này cũng đúng với sắc

ký điều chế. Do một là thường làm việc với mẫu có độ tan hạn chế trong dung môi tiêm và/hoặc là

trong pha động và do thường xuyên sử dụng cách tiêm thể tích mẫu lớn để gia tăng lượng mẫu đưa

vào quá trình, một sự kết hợp giữa cột và pha động không phù hợp thậm chí còn có thể dẫn đến tình

trạng thảm hại hơn là mẫu có thể kết tủa tàn phá những cột lỗ rộng và trang thiết bị điều chế đắt tiền.

Cột đóng vai trò then chốt trong phát triển một phương pháp HPLC điều chế lặp lại, mạnh mẽ.

Trong phần này chúng ta sẽ xem xét những cột được dùng trong HPLC điều chế- việc lựa chọn chế

độ, hệ thống pha động và các điều kiện vận hành như thế nào cho phù hợp. Chấp nhận người đọc đã

quen thuộc với việc phát triển phương pháp HPLC phân tích và tối ưu quá trình tách.

Quá trình tách phân tích thường có dạng đẳng nhiệt kiểu Langmuir và hàm phân giải quá trình

tách được tuân thủ hoàn toàn. Trong HPLC điều chế, những cột thường xuyên và thỉnh thoảng bị tải

nặng, quá tải thì thực tế các đẳng nhiệt và những tương quan phổ biến được công nhận không còn

có tính định lượng nữa. Lấy ví dụ trong HPLC phân tích, một định nghĩa về dung tích cột phổ biến

được công nhận là: dung tích cột là khối lượng mẫu được tiêm làm tụt đi 10% hiệu quả cột. Trong

sắc ký điều chế, lượng mẫu được tiêm có thể vượt quá giá trị này ở mức một bậc cường độ và vì thế

hiếm khi dung tích cột được đưa ra dưới dạng giá trị tuyệt đối. Thay vào đó, quá tải trong HPLC

được định nghĩa là tải lượng không cho phép trích ly sản phẩm ở mức tinh khiết và thu hồi mong

muốn. Dung tích cột phải được kê khai cho các phân tử khác trong mẫu, bao gồm trong đó có cả

nền. Nên nhớ khi chúng ta thảo luận về dung tích chúng ta muốn nói đến dung tích mẫu và không

đề cập đến hệ số dung tích, một phép đo khả năng lưu giữ chất phân tích. Mục tiêu của tinh chế điều

chế là sản xuất ra tối đa sản phẩm tinh khiết trên mỗi lần tiêm mẫu.

Các thực nghiệm quá tải và luỹ tiến phải được thực hiện trên một cột phân tích có cùng vật liệu nhồi như cột điều chế.

Như đã thảo luận, việc luỹ tiến thành HPLC quy mô điều chế từ dữ liệu HPLC lỏng phân tích

thường tiêu tốn thời gian và gây lãng phí vật liệu trừ phi sử dụng một chiến lược luỹ tiến tối ưu.

Một chiến lược phát triển phương pháp được đề nghị là phát triển và tối ưu quá trình tách ban đầu

trên cột kích thước phân tích, nạp quá tải cột trong khi duy trì khả năng tách tương xứng các thành

phần quan tâm, sau đó luỹ tiến phù hợp theo cột điều chế có kích thước thích hợp dựa trên lượng

hợp chất cần tinh chế, dùng những nguyên tắc chỉ đạo như đã được phác thảo từ trước. Do đó việc

chọn cột phân tích thường do cột điều chế sẵn có quy định, đây là những cột điều chế có cùng loại

vật liệu nhồi cột, hoặc là dưới dạng cột đóng gói hoặc môi trường rời được bản thân người dùng

đóng gói. Sau đó dùng những hàm đã trình bày trong phần 4.1.7, việc luỹ tích phải là tuyến tính với

yêu cầu vấn đề “tweaking” có thể chỉ còn là thứ yếu để hoàn tất phương pháp điều chế. Một yêu cầu

rất được đề nghị là bảo đảm sẵn có cả hai cột phân tích và điều chế từ cùng dòng vật liệu nhồi trước

khi bắt đầu quy trình phát triển và tối ưu phương pháp

4.2.2 Chọn chế độ và pha tĩnh thích hợp trong sắc ký điều chế

Trong luỹ tiến điều chế, về lý thuyết sẽ sử dụng cùng các chế độ tách đã áp dụng trong sắc ký

quy mô phân tích. Tuy nhiên do chi phí và khả năng có được những vật liệu nhồi điều chế hiệu quả

cao, chi phí cho pha động và các phụ gia pha động, yêu cầu về số lượng mẫu đưa vào điều chế cao

và cần thu hồi những phân đoạn trích ly ở trạng thái có độ tinh khiết cao, tự bản thân người sử dụng

có thể giới hạn các chế độ sắc ký hấp phụ và sắc ký pha ngược mà mình ưa chuộng hơn. Thỉnh


thoảng sắc ký loại trừ theo kích thước và sắc ký trao đổi ion được sử dụng để bắt đầu luỹ tiến điều

chế nhưng thường kèm theo sau với một kỹ thuật thứ hai.

Trong hàng thập kỷ, sắc ký hấp phụ trên silica gel hoặc môi trường lỏng-rắn khác (ví dụ alumina,

kieselguhr) là kỹ thuật chính để tinh chế đa dạng các hỗn hợp hữu cơ tổng hợp cũng như những kiểu

mẫu khác. Tuy nhiên tính phổ biến quá mạnh của sắc ký pha ngược trong thế giới phân tích (RPC)

đã làm thay đổi tầm quan trọng sang chế độ vận hành này đối với HPLC điều chế. Cũng như vậy,

nhiều người sử dụng HPLC phân tích không thân thiện lắm với các nguyên lý sắc ký hấp phụ trong

khi họ lại thoải mái hơn với RPC; do đó họ có khuynh hướng hướng về nó khi đứng trước một nhu

cầu phân tích.

Một cân nhắc trong sắc ký điều chế mà thường là ít quan trọng hơn trong sắc ký phân tích là

dung tích của vật liệu nhồi. Do số lượng mẫu đưa vào điều chế (có nghĩa là lượng vật liệu được tinh

chế trên đơn vị thời gian) là tiêu chuẩn chính trong HPLC điều chế, những cột có dung tích cao hơn

có thể làm việc với nhiều vật liệu hơn trên một lần tiêm. Đối với sắc ký hấp phụ, diện tích bề mặt

của chất hấp phụ chế định dung tích. Diện tích bề mặt chất hấp phụ cao hơn cho phép tiêm khối

lượng lớn hơn so với diện tích bề mặt chất hấp phụ nhỏ. Trong RPC, tăng cường cùng với độ tan

của chất phân tích, mức độ che phủ pha liên kết trong RPC xác định dung tích mẫu. Mặc dù tồn tại

một ý nghĩ cho rằng dung tích của môi trường RPC được chế định bởi độ dài mạch alkyl của pha

liên kết (ví dụ C18 so với C4), nhưng dung tích bị tác động nhiều hơn bởi mức độ bao phủ pha liên

kết.

Xác định dung tích của một cột HPLC điều chế như thế nào?

Độ che phủ bề mặt thường được biểu diễn theo micromol/m2. Đối với loại vật liệu nhồi slicagel

điển hình, có khoảng 8 micromol/m2 bề mặt các silanol có khả năng liên kết. Do trong sắc ký hấp

phụ, nhóm silanol đại diện cho khả năng lưu giữ chất phân tích, diện tích bề mặt lớn hơn có nhiều

nhóm silanol hơn và khả năng lưu giữ mạnh hơn. Trong RPC, cơ chế là sự tương tác kỵ nước giữa

các nhóm alkyl và aryl trên chất phân tích với pha liên kết. Đối với một pha liên kết monomeric

C18 điển hình, do những lý do liên quan đến sự bố trí trong không gian, độ che phủ bề mặt thường

nằm trong dải 2,5-3 micromol/m2. Do phần chân cắm trên bề mặt của nó nhỏ hơn nên pha

monomeric C18 có thể có độ che phủ lớn hơn chút ít và thậm chí dạng C4 còn lớn hơn. Vì vậy trên

thực tế độ che phủ của một pha alkyl mạch ngắn hơn có thể vượt quá độ che phủ của pha liên kết

C18. Theo đó hiện tại lượng cacbon có khả năng tương tác kỵ nước với chất phân tích cung cấp một

giá trị đo độ che phủ bề mặt tốt hơn độ dài mạch alkyl. Hầu hết các nhà chế tạo đều đưa ra mức che

phủ cacbon đối với vật liệu nhồi pha ngược đặc trưng của họ.

Độ phân giải được xem như là yếu tố quan trọng nhất trong sắc ký phân tích và nó cũng có mức

độ quan trọng tương đương trong sắc ký điều chế. Tuy nhiên do trong HPLC điều chế, cột thường

xuyên bị quá tải và píc bị mở rộng, độ chọn lọc thường là yếu tố rất quan trọng để sử dụng thành

công HPLC điều chế. Nếu độ chọn lọc giữa hai thành phần mẫu được cô lập cao thì có thể nạp quá

tải cột đến quy mô lớn hơn nhiều so với nếu như độ chọn lọc thấp. Theo đó việc chọn lựa pha tĩnh

có thể là công việc mang tính tới hạn để mang lại độ chọn lọc tốt nhất cho những thành phần quan

tâm. Bảng dưới đây cung cấp một số hướng dẫn gần đúng về dung tích mẫu đối với cột RPC đóng

vai trò như một hàm của (độ chọn lọc). Dung tích mẫu thực tế đối với những thành phần mẫu cụ

thể có thể được xác định bằng phép đo thử và sai (trial-and-error)

Bảng 4.4 Hướng dẫn về dung tích của các cột HPLC điều chế

ID cột < 1,2 > 1,5

4.6 mm

9.4 mm

21.2 mm

2-3 mg

10-20 mg

50-200 mg

20-30 mg

100-200 mg

500-2000 mg

4.2.3 Cỡ hạt và kích thước cột

Những lợi thế và bất lợi của cỡ hạt nhỏ hơn trong HPLC điều chế là gì?


Kích thước hạt là một thông số quan trọng đối với HPLC phân tích. Nhìn chung kích thước hạt

nhỏ hơn cho phép đạt được hiệu quả cao hơn và có thể sử dụng những cột ngắn hơn để gia tăng tốc

độ tách. Trong HPLC điều chế là quan trọng nhưng do cột có thể được sử dụng ở trạng thái bị quá

tải, nên những hạt nhỏ hơn, đắt tiền hơn với đường kính trung bình 1,8- và 3,5-m được dùng làm

cột phân tích nhìn chung không được dùng làm cột điều chế có quy mô lớn hơn. Nếu mẫu là rất

phức tạp, độ phân giải và độ chọn lọc giữa các hợp chất quan tâm tồi và thỉnh thoảng gặp khó khăn

trong việc làm quá tải, thì những hạt kích thước 5-m thường xuyên được sử dụng. Đối với những

mẫu phân giải tốt, hạt có đường kính lớn hơn 7- và 10-m có thể được sử dụng. Do độ sụt áp tỷ lệ

nghịch với bình phương đường kính hạt, những hạt kích thước lớn tạo ra sụt áp thấp hơn, cho phép

sử dụng tốc độ dòng cao hơn, gia tăng số lượng mẫu dùng với các cột điều chế.

Kích thước cột được quy định bởi lượng vật liệu trên mỗi lần tiêm. Lượng mẫu có thể tiêm được

gia tăng cùng với đường kính trong và độ dài của cột (dùng các hàm cung cấp trong mục 1.2.7), có

thể tính toán được đường kính cột ăn khớp với cỡ mẫu được yêu cầu. Điển hình thì cột đường kính

trong 4,6-mm dùng cho HPLC điều chế ở phạm vi nhỏ, cột đường kính trong 7,8-mm dùng cho

HPLC bán điều chế và cột đường kính trong 21,2-mm dùng cho HPLC điều chế quy mô lớn hơn.

Thậm chí ngay cả những cột có đường kính lớn hơn 30-mm và 50-mm cũng có thể dùng cho mức

luỹ tiến cao hơn nữa. Các trang thiết bị điều chế, thiết bị xử lý quy mô lớn hơn cần đến cột có

đường kính vượt ra khỏi các gía trị này, những trang bị có thể đạt được tốc độ dòng cực cao (hàng

trăm millilit mỗi phút) và theo đó có mức độ sử dụng dung môi cao hơn.

4.2.4 Chọn pha động

Trong lúc luỹ tiến, thường có thể chuyển đổi được trực tiếp các điều kiện sắc ký. Các điều kiện

này đã được quyết định trong lúc phát triển phương pháp phân tích trên hệ dung môi sẽ được dùng.

Các yếu tố tác động lên việc lựa chọn dung môi là:

Các điều kiện pha tĩnh và pha động với độ chọn lọc các chất quan tâm là tối ưu;

Các đặc trưng phổ của dung môi (các dung môi) pha động (có nghĩa là độ truyền qua UV,

các thuộc tính huỳnh quang, khả năng tương thích phổ khối);

Độ bay hơi của dung môi để dễ loại bỏ khỏi phân đoạn đã trích ly;

Độ nhớt đáp ứng ngược áp cột thấp;

Độ tinh khiết đáp ứng mức chất ô nhiễm không bay hơi thấp;

Các thuộc tính tan tốt cho phép nạp tối đa mẫu;

Chi phí dung môi sử dụng thấp.

Đối với thuộc tính sau cùng, hình dưới đây chỉ ra một quan niệm chung của những dung môi có

độ tinh khiết cao cần cho việc phân đoạn điều chế.

Chi phí thấp Chi phí cao

dichloromethane

acetone MTB

ethyl acetate

methanol heptane acetonitril

hexane

Hình 4.6 Chi phí tương đối của các loại dung môi hữu cơ được dùng trong HPLC điều chế

Không lấy gì làm ngạc nhiên khi những hệ thống dung môi trong sắc ký pha thường thường đáp

ứng được những tiêu chuẩn này, tuy nhiên RPC vẫn đáng được lưu tâm nhất. Trong RPC phân tích,

những muối đệm không bay hơi thường được dùng để bảo đảm pH hợp lý và tránh hiện tượng giãn

đuôi, hình dạng píc tồi. Khi khai thác quá trình tách phân tích tiến đến luỹ tiến điều chế, đề nghị sử

dụng chất đệm bay hơi hoặc phụ gia pha động như ammonium formate hoặc ammonia đối với


phương pháp khởi đầu do việc loại bỏ chúng sẽ dễ dàng hơn nhiều trong các giai đoạn cuối của

phương pháp, và nếu phổ khối được dùng để xác nhận, một hệ thống dung môi như vậy sẽ tương

thích hơn. Bảng dưới đây là một danh sách các chất đệm bay hơi được đề nghị.

Bảng 4.5 Các chất đệm bay hơi được dùng phổ biến trong HPLC

Muối đệm bay hơi

Trifluoroacetate

Ammonium formate

Pyridinium formate

Ammonium acetate

Ammonium carbonate

Ammonium hydroxide

xx – 1,5

3,0-5,0

3,0-5,0

3,8-5,8

5,5-7,5

9,3-11,3

8,3-10,3

4.2.5 Ví dụ về các nguyên lý luỹ tiến từ sắc ký phân tích sang sắc ký điều chế

Nguyên lý luỹ tiến từ một cột sắc ký phân tích thành cột điều chế sẽ được minh hoạ cho quá trình

tách hai xanthine: caffein và theophylline. Những hợp chất này có thể được tách dễ dàng. Những

hợp chất này được tách dễ dàng với sắc ký pha ngược như mô tả trong hình 4.7, hình này cho thấy

sự gia tăng hàm lượng hai xanthine (từ 0,025-g mỗi chất lên 500-g mỗi chất) trên cột phân tích

C18 dài 150-mm, đường kính trong 3,0-mm. Quá trình tách được tiến hành đồng thể ở tốc độ dòng

0,6-ml/phút dùng hệ thống pha động nước-acetonitril không có mặt bất kỳ phụ gia nào. Do flowcell

detector UV có độ dài đường truyền chuẩn 10-mm được sử dụng tại bước sóng 270-nm, hệ thống

điện tử detector bị bão hoà ở những lượng mẫu cao dẫn đến hiện tượng píc đỉnh phẳng là điều hoàn

toàn bình thường.

Hình 4.7 Các thực nghiệm quá tải trên cột phân tích

Từ việc hai hợp chất này biểu lộ độ chọn lọc tách rất tốt, hai píc sắc ký phân giải rõ ràng, ngay cả

ở lượng mẫu nạp cao nhất. Độ chọn lọc tốt như vậy dự đoán việc làm quá tải trong giai đoạn kế tiếp

của quá trình luỹ tiến sẽ cho kết quả tốt. Dùng công thức tính toán từ mục 2.7 như đã mô tả, tiếp

theo chúng ta xác định được khối lượng tối đa có thể nạp lên cột điều chế, cột có cùng vật liệu nhồi

nhưng có kích thước là 21.2-mm đường kính trong và dài 150-mm (cùng độ dài như cột phân tích).

Hình 4.9 chỉ ra sắc đồ điều chế trên cột lớn hơn, thời điểm này sử dụng detector UV có flowcell

điều chế với độ dài đường truyền ngắn (3 mm). Cần đến độ dài đường truyền ngắn hơn này để tránh

hệ thống điện tử detector sớm bão hoà và cho phép quan sát các xanthine rửa giải, ngay cả ở mức

được tiêm là 25-mg. Chú ý tốc độ dòng được điều chỉnh đến 25-ml/phút thay vì là 30-ml/phút như

đã tính toán. Quá trình tách hai xanthine chỉ vừa đạt đến đường nền có nghĩa cả hai hợp chất có thể

được thu gom ở độ tinh khiết cao.


Cột phân tích C18 Cột điều chế C-18

3x150 mm, 5 m 2

2

2

1

2

1

r

r

V

V

21,2x50 mm, 5 m

Dòng: 0,6 ml/phút Dòng: 30ml/phút

Lượng: 500 g/lần tiêm Lượng: 25 mg/lần tiêm

LCr

x

r

x 12

2

2

2

1

1

V1 = dòng cột 1 = 0,6 ml/phút V2 = dòng cột 2 = ?

x1 = lượng tối đa trên cột 1 = 500 x2 = lượng tối đa trên cột 2 = ?

r1 = bán kính cột 1 = 1,5 mm r2 = bán kính cột 2 = 10,6 mm

Hình 4.8 Tính toán luỹ tiến – ví dụ thực tế

Hình 4.9 Kết quả tách điều chế từ những tính toán luỹ tiến

4.2.6 Sử dụng thành công sắc ký điều chế

Nhiều yếu tố có mặt trong sự thành công của HPLC phân tích cũng thường thấy có trong HPLC

điều chế. Do mẫu trong các các ứng dụng điều chế thường là hỗn hợp thô, tạp chất có thể tích luỹ ở

đầu cột và nếu như nó không được loại bỏ có thể làm cho hình dạng píc và thời gian lưu thay đổi.

Thỉnh thoảng thì những tạp chất tích luỹ không tác động lên thời gian lưu nhưng làm thay đổi áp

suất cột, và vì thế người phân tích nhận thấy áp suất cột gia tăng. Một ý kiến hay cho rằng đôi khi

cần thổi cột với những dung môi mạnh hơn để loại bỏ tạp chất đã gắn vào.

Sự tích luỹ vật liệu trong cột nhồi xuất hiện thường xuyên hơn khi dung môi tiêm mẫu yếu hơn

so với pha động và đặc biệt lưu ý là khi sử dụng phương pháp rửa giải đồng thể. Dung môi mạnh

hơn được dùng trong rửa giải gradient có xu hướng hỗ trợ loại bỏ những tạp chất đã bị gắn chặt.

Chất hấp phụ silica gel có xu hướng giữ trên nó những chất phân tích phân cực hơn, đặc biệt là đối

với những chất cơ bản, trong khi đó vật liệu nhồi pha ngược lại thiên về những tạp chất kỵ nước

hơn.

Để có hiệu quả tốt nhất, thỉnh thoảng cột cần được thổi với những dung môi mạnh để loại bỏ tạp chất bị gắn kết.

Sự hiểu biết về lịch sử cột điều chế là điều đặc biệt quan trọng. Do tạp chất từ những mẫu trước

đó có thể lộ diện bất ngờ khi những điều kiện tách điều chế mới đưa vào khai thác, nên bắt đầu với

một cột còn mới. Nếu không thực hiện được như vậy, đề nghị áp dụng một quy trình rửa dung môi.

Dĩ nhiên nếu chi phí của dung môi được yêu cầu cao hơn so với chi phí thay vật liệu nhồi hoặc thay

cột, thì nên hướng đến việc làm sạch vật liệu nhồi hoặc thay cột. Đối với những cột tự nhồi, việc

làm sạch vật liệu xốp từ bên ngoài có thể dễ thực hiện hơn so với khi làm sạch ở bên trong cột nhồi.


Thường thì vài centimet đầu tiên của cột bị ô nhiễm mạnh nhất và việc lấy vật liệu này ra, thay nó

với vật liệu nhồi còn mới có thể được tiến hành một cách tương đối dễ dàng.

4.2.7 Kết luận

Việc đọc thêm “in’s and out’s” và những hướng dẫn về việc sử dụng hợp lý các cột sắc ký điều

chế có thể tìm thấy trong các sách tham khảo và trong những tạp chí về nguyên lý và ứng dụng công

bố gần đây. Những thiết bị điều chế hiện đại được ghép nối với cột hiệu quả cao và thông lượng

mẫu cao có thể thực hiện nhiệm vụ tinh chế những cơ chất không tinh khiết một cách dễ dàng hơn

nhiều. Những cột điều chế lớn có thể chịu đựng được nhiều lần tiêm và vẫn sẽ làm việc tốt trong

những pha điều chế đặc biệt kiểu như chất hấp phụ monolith và dung tích cao.

4.3 Hệ thống tinh chế

4.3.1 Bộ thu phân đoạn làm việc như thế nào

Như đã đề cập ở phần trước, sự khác biệt duy nhất giữa HPLC phân tích và HPLC điều chế là cái

gì sẽ xuất hiện với mẫu sau khi nó rời khỏi detector. Trong khi mẫu di chuyển trực tiếp vào trong vị

trí thải trong HPLC phân tích thì nó đi đến bộ thu phân đoạn trong HPLC điều chế. Dựa trên một

quyết định khởi phát nào đó, bộ thu phân đoạn đổi hướng dòng mẫu hoặc đến vị trí thải hoặc một

phần mong muốn của mẫu đã tiêm đến bình chứa phân đoạn qua đầu kim thu phân đoạn. Công việc

này được thực hiện nhờ sử dụng van đổi hướng, van có khả năng bật chuyển qua lại, lấy ví dụ như

nhờ vào lập trình thời điểm dựa trên một tín hiệu detector. Hình dưới đây vẽ một sơ đồ bộ thu phân

đoạn.

Hình 4.10 Sơ đồ một bộ thu phân đoạn

Trên thị trường bộ thu phân đoạn có các kích cỡ và thiết kế khác nhau: Trong khi một số có thể

được dùng từ tốc độ dòng rất thấp cho đến rất cao, một số hãng lại đưa ra bộ thu phân đoạn mang

tính chuyên môn hoá cho 3 dải tốc độ dòng. Bộ thu phân đoạn được thiết kế cho những tốc độ dòng

dưới 100 L/phút, bộ thu phân đoạn quy mô phân tích được thiết kế cho tốc độ dòng dưới 10

mL/phút và bộ thu phân đoạn quy mô điều chế được thiết kế cho tốc độ dòng lên đến 100 mL/phút.

Một số thiết bị kết hợp cả bộ lấy mẫu tự động và bộ thu phân đoạn vào một nền tảng duy nhất hoặc

là với một đầu kim và van duy nhất để tiêm và thu phân đoạn hoặc là với hai thiết bị, một để tiêm

và cái còn lại để thu phân đoạn. Để thu một vài lọ phân đoạn, có thể dùng các ống test hoặc đĩa

giếng thương mại; hầu hết các bộ thu phân đoạn có thể làm việc với tất cả các bình chứa phân đoạn

này. Có hãng lại chế tạo bình chứa đặc biệt là khay hình phễu. Việc gom trực tiếp vào bình chứa

phân đoạn nhờ đầu kim chạy vào phễu giống như là cổng tiêm (injection-port-like), phễu này có

một mảnh ống được gắn vào. Ống này có thể đặt vào bất kỳ bình chứa phân đoạn nào, lấy ví dụ đặt

vào bình cổ hẹp đáy tròn, loại bình có thể sử dụng ngay trên một rotavapor sau khi hoàn tất công

việc thu phân đoạn. Khay hình phễu cho phép thu hầu như không hạn chế thể tích phân đoạn.


Hình 4.11 Khay hình phễu

4.3.2 Thời gian trễ phân đoạn là gì ?

Để thu được độ tinh khiết và độ thu hồi cao nhất, điều quan trọng là áp dụng chính xác thời gian

trễ phân đoạn!

Việc thiết lập hệ thống như được chỉ ra trong hình 4.10 - một detector nằm ở phía trước van đổi

hướng - đây là thiết lập điển hình cho một hệ thống được thiết kế để thu phân đoạn dựa vào píc.

Ngay khi detector phát hiện được một píc đáp ứng tiêu chuẩn khởi phát, van đổi hướng bật từ vị trí

thải vào vị trí gom. Tuy nhiên vào thời điểm detector tìm thấy một điểm bắt đầu của píc (t0), hợp

chất phát hiện được vẫn nằm trong buồng đo detector và chưa có mặt tại van chuyển hướng, do đó

sẽ là quá sớm để chuyển van sang vị trí gom. Việc chuyển van được trễ cho đến khi hợp chất di

chuyển từ buồng đo detector đến lối vào van đổi hướng. Thời gian này được gọi là thời gian trễ (tD1)

và phải được xác định trong cái được gọi là quy trình chuẩn thời gian trễ. Cùng một thời gian trễ

như vậy cũng được sử dụng để chuyển van quay lại vị trí thải khi detector tìm thấy điểm kết thúc

của píc (tE). Để có được những kết quả thu hồi tốt nhất, cộng thêm thời gian trễ tD2 vào để bảo đảm

rằng điểm kết thúc của píc không chỉ đạt được đến van đổi hướng mà còn đến được điểm cuối của

đầu kim thu mẫu (collection needle).

Hình 4.12 Thời điểm bắt đầu và kết thúc píc

Sử dụng các thời gian trễ theo cách sau sẽ mang lại những kết quả thu phân đoạn tốt nhất về độ

tinh khiết và thu hồi:

Bắt đầu thu phân đoạn khi điểm bắt đầu của píc đạt đến van đổi hướng.

Bắt đầu thu phân đoạn: t0 + tD1

Kết thúc thu phân đoạn khi điểm cuối của píc đạt đến chóp đầu kim

Kết thúc thu phân đoạn: tE + tD1 + tD2

Trong hệ thống thu phân đoạn dựa theo píc (như chỉ ra trong hình 4.10), thời gian trễ phụ

thuộc vào tốc độ dòng. Nếu đo được thời gian trễ tại một tốc độ dòng cụ thể, thể tích trễ VD1 giữa


detector và bộ thu phân đoạn có thể tính được. Thời gian trễ đối với bất kỳ tốc độ dòng nào đều có

thể tính được sau khi nhận được VD1, tránh phải chuẩn lại hệ thống.

4.3.3 Quy trình chuẩn trễ

Quy trình chuẩn trễ được dùng để xác định thời gian trễ giữa detector và bộ thu phân đoạn. Trong

phần này hai phương pháp truyền thống dùng để chuẩn thời gian trễ và một phương pháp đột phá sử

dụng cảm biến trễ phân đoạn sẽ được mô tả. Cũng như vậy có thêm hai trễ nữa của cái được gọi là

trễ detector và trễ hệ thống sẽ được giải thích.

4.3.3.1 Các quy trình chuẩn trễ truyền thống

Quy trình chuẩn trễ truyền thống là một quy trình tẻ nhạt và có thể xảy ra lỗi. Một quy trình có

thể sử dụng để xác định thời gian trễ là tiêm một phẩm mầu đậm đặc lên hệ thống và theo dõi tín

hiệu detector trong hiển thị trực tuyến trên phần mềm điều khiển. Ngay khi có thể nhìn thấy píc

trong màn hình trực tuyến một đồng hồ bấm giờ được khởi động và dừng lại khi nhìn thấy phẩm

mầu ra hết khỏi đầu kim thu phân đoạn. Thời gian trễ này là tổng của các thời gian trễ tD1 và tD2, sau

đó nhập vào phần mềm. Nếu phần mềm chỉ cho phép nhập một giá trị thời gian trễ, quy trình chuẩn

phải được lặp lại đối với bất kỳ mức tốc độ dòng nào.

Một quy trình chính xác hơn nhưng mất thời gian là bắt đầu với một thể tích hoặc thời gian trễ

đánh giá hoặc là thể tích trễ, thời gian trễ tính toán. Tiêm một mẫu với lượng mẫu đã biết và phân

đoạn có chứa hợp chất được gom, lượng hợp chất trong phân đoạn được xác định (ví dụ bằng

phương pháp HPLC phân tích) và sau đó thể tích trễ được thay đổi. Quy trình này được lặp lại cho

đến khi tìm thấy thời gian trễ hoặc thể tích trễ mang lại độ thu hồi tối đa.

4.3.3.2 Cảm biến trễn phân đoạn

Một số hệ thống tinh chế hoàn tất công việc chuẩn thời gian trễ nhờ sử dụng cảm biến trễ phân

đoạn, tức là một detector nhỏ, đơn giản được gắn vào bộ thu phân đoạn (hình 4.13)

Hình 4.13 Cảm biến trễ phân đoạn

Trong quy trình xác định thể tích trễ VD1 của hệ thống tự động hoá hoàn toàn một phẩm mầu

được tiêm và tín hiệu của phẩm mầu từ detector và từ cảm biến trễ phân đoạn được ghi lại (hình

4.14). Thể tích trễ hệ thống tổng thể được tính qua sự khác biệt thời điểm giữa các tín hiệu tD và tốc

độ dòng được dùng trong thực nghiệm. Để xác định thể tích trễ yêu cầu VD1, trừ các gía trị thể tích

đã biết VD2 (thể tích giữa van đổi hướng và chóp đầu kim thu phân đoạn) và VD3 (thể tích của cảm

biến trễ phân đoạn) vào thể tích trễ tổng thể hệ thống. Một khi đã nhận được thể tích trễ VD1, phần

mềm thiết bị sẽ tự động tính toán thời gian trễ tD1 cho bất kỳ tốc độ dòng nào khác. Việc chuẩn lại

hệ thống là không cần thiết trừ phi có bất kỳ sự thay đổi phần cứng nào khác, ví dụ như việc thay

mao quản hoặc flowcell của detector được tiến hành.


Hình 4.14 Quy trình chuẩn thời gian trễ

4.3.3.3 Trễ detector

Khi ghi một tín hiệu từ một detector (lấy ví dụ từ detector UV), chúng ta mong đợi có được một

tín hiệu trơn nhẵn như trong hình 4.15b. Tuy nhiên thực tế tín hiệu detector cho thấy do ồn điện tử

nên có dạng giống với tín hiệu chỉ ra trong hình 4.15a hơn.

Hình 4.15 a) tín hiệu thô b) tín hiệu đã được lọc

Để làm trơn tín hiệu, quá trình lọc về mặt toán học được áp dụng với tín hiệu thô thông qua phần

mềm điều khiển. Do đó một vài điểm dữ liệu detector đo được được lấy trung bình sử dụng thuật

toán làm trơn và giá trị cuối cùng được hiển thị, lấy ví dụ trong hiển thị trực tuyến của phần mềm.

Tuy nhiên việc lọc tín hiệu không chỉ làm trơn tín hiệu mà nó cũng gây trễ tín hiệu trong một

khoảng thời gian nào đó. Do điểm dữ liệu vẽ trong phần mềm là kết quả của sự tính toán trên một

vài điểm dữ liệu đo được, nên hiển thị trực tuyến luôn luôn chậm hơn chút ít so với điểm dữ liệu

thực tế trong detector (hình 4.16). Trễ này được gọi là trễ detector. Độ dài của trễ detecor tuỳ thuộc

vào việc lọc dữ liệu thô đã được áp dụng nhiều như thế nào, dải của nó có thể từ dưới 1 cho lên đến

hơn 10 giây. Trong quá trình thu phân đoạn dựa trên píc, việc khởi phát bộ thu phân đoạn được thực

hiện trên trên tín hiệu đã qua lọc. Tín hiệu thô sẽ quá ồn và sẽ dẫn đến nhiều phân đoạn không cần

thiết, trễ detector được đưa vào kiểm toán khi đo thời gian trễ. Hướng đơn giản nhất để làm việc

này là thực hiện chuẩn trễ sử dụng cùng những thiết lập lọc dữ liệu như sẽ được dùng trong phép

chạy điều chế thực tế. Với những hệ thống tinh chế hiện đại, việc điều chỉnh thời gian theo những

thiết lập lọc dữ liệu khác nhau được thực hiện tự động bằng phần mềm bộ thu phân đoạn.


Hình 4.16. Trễ detector do lọc tín hiệu a) tín hiệu thô b) tín hiệu đã lọc

4.3.3.4 Trễ hệ thống

Thực tế trong những phòng thí nghiệm tinh chế ở quy mô lớn hơn, các máy tính thường không

nối trực tiếp đến các thiết bị mà chúng điều khiển tất cả các thiết bị đã nối kết qua một mạng cục bộ

LAN (Local Area Network). Khi hệ thống tinh chế phát hiện ra một píc đáp ứng tiêu chuẩn tinh chế,

nó gửi thông tin này đến máy tính. Máy tính áp dụng trễ và sau đó gửi tín hiệu để chuyển van đổi

hướng của bộ thu phân đoạn. Quá trình tính toán thực hiện đưa thông tin từ detector đến máy tính

và tín hiệu khởi phát từ máy tính đến bộ gom phân đoạn, cả hai đều được gửi qua mạng LAN, một

vài yếu tố có thể tác động lên việc tính thời gian trễ phân đoạn. Nếu có bất kỳ dữ liệu nào khác, lấy

ví dụ một nhiệm vụ in lượng lớn được gửi qua cùng một mạng LAN, lưu lượng dữ liệu sẽ bị trễ lại,

điều đó có nghĩa thời gian trễ tổng thể sẽ không còn đúng nữa. Thêm vào đó nếu phần mềm vận

hành lắp trên máy tính điều khiển quá trình thu phân đoạn và áp dụng thời gian trễ thì mức độ sử

dụng CPU cao sẽ có tác động lên quá trình tính giờ trễ tổng thể, lấy ví dụ khi đồng thời đang có các

chương trình phần mềm khác chạy. Do đó những điểm dưới đây cần được cân nhắc:

Nếu hệ thống tinh chế được nối đến máy tính qua mạng LAN, mạng này phải không được

dùng cho bất kỳ cái gì khác mà có thể làm nặng lưu lượng dữ liệu mạng. Các trang thiết bị

cần được nối trực tiếp đến máy tính.

Nếu phần mềm máy tính điều khiển quá trình tinh chế, cần không có một chương trình nào

khác chạy trên máy tính vào thời điểm đó.

Lưu lượng mạng LAN hoặc mức độ sử dụng CPU nặng có thể tác động đến thời điểm khởi phát phân đoạn!

Để tránh những vấn đề như đã trình bày ở trên, nghĩa là tránh sự tác động của lưu lượng LAN và

mức độ sử dụng CPU lên việc tính thời điểm trễ, một số hệ thống tinh chế hiện đại làm việc theo

cách khác. Khi một phép chạy được khởi động, phương pháp được tải đầy đủ từ máy tính đến các

modul, các modul giao tiếp với nhau qua bộ điều khiển mạng cục bộ CAN (Controller Area

Network), một sự kết nối trực tiếp giữa các modul. Lấy ví dụ nếu detector khởi phát một píc, nó gửi

thông tin này đến bộ thu phân đoạn, đọc tốc độ dòng từ bơm, tính toán thời gian trễ và khởi phát

van chuyển hướng. Với tính thông minh tích hợp ngay trong hệ thống này tất cả các quyết định đều

được thực hiện ngay trong hệ thống, máy tính chỉ giao tiếp với người sử dụng để thiết lập phương

pháp và hiển thị các kết quả, điều đó có nghĩa lưu lượng LAN hoặc mức độ sử dụng CPU cao

không có bất kỳ sự tác động nào lên việc tính thời gian trễ.

4.3.4 Xác lập cấu hình và chuẩn trễ hệ thống thu phân đoạn dựa vào phổ khối

Việc xác lập cấu hình và tính thời gian trễ phân đoạn cho quá trình thu phân đoạn mà không có

detector chọn lọc khối lượng (MSD) là khá đơn giản. Toàn bộ dòng mẫu từ cột qua cell dòng

detector UV và từ đó đi đến bộ thu phân đoạn. Khi thể tích trễ giữa hai modul được xác định, thời

gian trễ có thể tính toán cho bất kỳ mức tốc độ dòng nào. Khi mà MSD không chịu được tốc độ


dòng nằm trên vài millilit và do nó là một detector phá huỷ nên hệ thống dùng cho thu phân đoạn

dựa trên khối lượng phải được thiết lập khác đi.

4.3.4.1 Xác lập cấu hình

Vì sao cần đến một bộ chia dòng trong hệ thống thu phân đoạn dựa trên khối lượng?

Do MSD là một detector phá huỷ, dòng chạy từ cột phải được chia thành dòng chính chạy đến bộ

thu phân đoạn và thành dòng chia chạy đến MSD để khởi phát phân đoạn. Thực hiện công việc này

sử dụng một thiết bị được gọi là bộ chia dòng.

Hình 4.17 Xác lập cấu hình hệ thống tinh chế dựa trên phổ khối

Do MSD phụ trách việc khởi phát bật van chuyển hướng trong bộ thu phân đoạn, phần hợp chất

nằm trong dòng chia phải ở tại MSD sớm hơn so với phần trong dòng chính nằm tại bộ thu phân

đoạn. Hiệu số thời gian giữa MSD và bộ thu phân đoạn là thời gian trễ phân đoạn. Do dòng thường

được chia với hệ số 1000-20000 nên dòng hướng đến MSD phải được tăng tốc sử dụng bơm bổ trợ

(hình trên). Các yếu tố khác dẫn đến phải sử dụng bơm bổ trợ là:

Gia tăng và ổn định dòng đáp ứng hiệu quả phun sương tốt hơn

Pha loãng mẫu đến một dải phù hợp cho phân tích MSD (<500 ng/s)

Mang đến khả năng tối ưu hoá các điều kiện ion hoá đối với MS, lấy ví dụ nhờ vào việc

thêm axit vào dòng bổ trợ.

4.3.4.2 Cân nhắc về việc sử dụng bộ chia dòng

Bộ chia dòng truyền thống là một bộ chia dòng thụ động thu được dòng chia nhờ sử dụng ống thu

hẹp (hình dưới). Những cân nhắc quan trọng đối với bộ chia dòng thụ động là:

Chỉ có thể được sử dụng trên một dải tốc độ dòng có hạn,

Việc đi ống ngoại vi phải tương xứng để tạo ra được tỷ lệ chia mong muốn,

Có đáng kể thể tích trễ nội vi,

Có tỷ lệ chia cố định,

Không giữ cố định được việc chia dòng trên gradient do độ nhớt dung môi thay đổi,

Tạo ra ngược áp cao dẫn đến có thể gây nguy hiểm cho flowcell của detector UV


Hình 4.18 Thiết kế bộ chia thụ động

Một hướng khác là sử dụng bộ chia chủ động. Nó có hai đường truyền dòng tách biệt và một van

chuyển nhanh truyền hợp chất từ dòng chính vào dòng bổ trợ. Nguyên lý vận hành như chỉ ra trong

hình dưới

Hình 4.19 Thiết kế bộ chia chủ động

Lợi thế lớn nhất của bộ chia chủ động là khả năng lựa chọn những tỷ lệ chia khác nhau nhờ thay

đổi tần số bật chuyển của van. Những khía cạnh khác có liên quan đến bộ chia dòng chủ động là:

Tỷ lệ chia chính xác, hằng định, không bị tác động bởi nhiệt độ, độ nhớt và độ dài ống,

Thể tích hậu cột là tối thiểu , giảm thiểu độ phân tán,

Thể tích trễ phụ thuộc vào tỷ lệ chia,

Hai đường truyền dòng độc lập cho phép sử dụng các chất hiệu chỉnh khác nhau trong dòng

chính và dòng bổ trợ, lấy ví dụ axit trifluoracetic để sắc ký tốt trong dòng chính và axit

formic để tránh triệt thoái ion trong dòng bổ trợ,

Seal bịt kín rotor phải được đổi sau khoảng 1,5 triệu lần xoay chuyển (vào khoảng xấp xỷ 4-

6 tháng)

Áp ngược ở mức tối thiểu, không gây nguy hiểm đối với cell đo của detector UV.

4.3.4.3 Chuẩn thời gian trễ đối với hệ thống thu phân đoạn dựa trên khối lượng

Đối với một hệ thống thu phân đoạn dựa trên phổ khối lượng, thời gian trễ là thời gian giữa khi

hợp chất đến được MSD và khi hợp chất đến bộ thu phân đoạn. Đối với một hệ thống thu phân đoạn

dựa vào píc, thời gian trễ có thể được tính toán từ thể tích trễ và tốc độ dòng của bơm. Đối với một

hệ thống thu phân đoạn dựa trên khối lượng cách này không thể thực hiện được do thời gian trễ phụ

thuộc vào các giá trị tốc độ dòng của hai bơm: bơm chính và bơm bổ trợ. Cái gì xuất hiện nếu một

trong những mức tốc độ dòng này bị thay đổi (như chỉ ra trong hình 4.20a và 4.20b)

Do thời gian trễ đối với hệ thống thu phân đoạn dựa vào phổ khối phụ thuộc vào tốc độ dòng của bơm chính và bơm bổ trợ nên nó

trở thành một thông số phương pháp.


Hình 4.20a minh hoạ cái gì sẽ xuất hiện với thời gian trễ nếu dòng của bơm bổ trợ gia tăng. Dòng

đến MSD gia tăng và do đó hợp chất sẽ đến MSD sớm hơn. Do dòng đi đến bộ thu phân đoạn

không thay đổi nên thời gian trễ tổng thể cũng gia tăng.

Hình 4.20 a) Dòng bổ trợ gia tăng và b) dòng chính giảm

Hình 4.20b minh hoạ cái gì sẽ xuất hiện khi dòng của bơm chính giảm. Trong khi tốc độ dòng đi

đến MSD vẫn như cũ thì hợp chất đi tới được bộ thu phân đoạn chậm hơn. Điều này cũng có nghĩa

thời gian trễ gia tăng. Thể tích trễ đối với một hệ thống thu phân đoạn dựa vào píc chỉ phụ thuộc

vào ống được dùng giữa detector và bộ thu phân đoạn và do đó nó là một thông số cấu hình. Hệ quả

là hệ thống chỉ phải chuẩn lại khi cấu hình thay đổi. Đối với hệ thống thu phân đoạn dựa vào phổ

khối, thời gian trễ phụ thuộc vào tốc độ dòng của hai bơm. Tốc độ dòng của hai bơm là các thông số

phương pháp nên thời gian trễ cũng là thông số phương pháp. Điều này có nghĩa hệ thống phải

được chuẩn lại bất kể khi nào một trong các giá trị tốc độ dòng (tốc độ dòng chính hoặc tốc độ dòng

bổ trợ) bị thay đổi.

4.3.4.4 Tối ưu hệ thống đáp ứng khả năng thu hồi cao nhất

Một thông số thường bị bỏ qua trong HPLC điều chế là độ phân tán, nó là sự mở rộng píc khi một

hợp chất di chuyển qua mao quản. Khi trong detector đã phát hiện được một píc, nó di chuyển qua

mao quản với một độ dài nào đó cho đến khi đạt đến bộ thu phân đoạn, điều này dẫn đến sự thay

đổi hình dạng píc do phân tán. Việc khởi phát thu phân đoạn được thực thi dựa trên hình dạng píc

trong detector. Do đó không phải là luôn luôn dự đoán được độ thu hồi và độ tinh khiết của hợp

chất trong phân đoạn gom được.

4.3.4.4.1 Tác động của sự phân tán lên độ thu hồi

Hình 4.21 chỉ ra một píc trong detector và sự thay đổi hình dạng píc khi píc di chuyển qua các

mao quản với độ dài tăng dần. Trong khi diện tích píc đo được tại bộ thu phân đoạn vẫn như vậy thì

chiều cao píc giảm và độ rộng píc gia tăng.


Hình 4.21 Sự thay đổi hình dạng píc do phân tán

Hình 4.22 cho biết tác động của sự phân tán lên khả năng thu hồi của phân đoạn gom được. Phân

đoạn sẽ được gom tại một ngưỡng cụ thể như đã chỉ ra bởi hộp đặt trong tín hiệu detector. Hộp này

được chuyển đến píc tại bộ thu phân đoạn, nó cho thấy một phần hợp chất sẽ không được gom. Mọi

thứ được đóng khung bằng các hộp mầu xám sẽ bị mất. Khi píc bị mở rộng và mở rộng hơn nữa với

sự gia tăng độ dài mao quản, phần thu được của píc và do đó là độ thu hồi giảm.

Sự kết nối mao quản giữa detector và bộ thu phân đoạn dài hơn cần thiết sẽ dẫn đến độ thu hồi

thấp hơn.

Hình 4.22 Độ thu hồi giảm cùng với sự gia tăng thể tích trễ

Do vậy khi thiết lập hệ thống tinh chế, mao quản nối giữa detector và bộ thu phân đoạn phải được

tối ưu, lý tưởng thì cần giữ cho nó ngắn nhất ở mức có thể được. Mặc dù tác động của việc mất độ

thu hồi là cực kỳ quan trọng đối với tinh chế ở những tốc độ dòng thấp, nó có thể vẫn được chấp

nhận với tốc độ dòng 25 đến 35 ml/phút.

4.3.4.4.2 Tác động của sự phân tán lên độ tinh khiết

Hình 4.23 chỉ ra tác động của sự phân tán lên píc có chứa 2 píc. Khi cả hai píc bị mở rộng cùng

với sự gia tăng độ dài mao quản giữa detector và bộ thu phân đoạn, các chất bắt đầu bị trộn lại trong

lúc di chuyển đến bộ thu phân đoạn.

Hình 4.23 Các píc trộn lại do sự phân tán

Một lần nữa độ thu hồi cho mỗi hợp chất sẽ giảm cùng với sự gia tăng độ dài mao quản khi việc

khởi phát được thực hiện dựa trên độ rộng píc trong detector. Tuy nhiên do một phần các chất trộn

lại, độ tinh khiết của mỗi phân đoạn gom được cũng sẽ thấp hơn mong đợi. Độ phân giải là một

thông số đo xem hai píc được tách ra khỏi nhau tốt đến mức độ nào. Hình 4.24 cho biết độ phân giải

của hai píc với các mức thể tích trễ cộng thêm khác nhau. Khi detector được định vị trước khi cộng

thêm thể tích trễ, độ phân giải của píc trong detector không thay đổi. Sau đó đo độ phân giải tại bộ

thu phân đoạn với thiết lập mao quản chuẩn (thể tích trễ cộng thêm = 0 L), thể tích trễ được cộng


thêm tương ứng với việc sử dụng mao quản đường kính trong 0,25 mm và mao quản đường kính

trong 0,8 mm.

Hình 4.24 Tác động của độ dài và đường kính trong mao quản lên độ phân giải

Mao quản nối vào với đường kính trong không phù hợp hoặc dẫn đến ngược áp cao hoặc dẫn đến độ thu hồi và độ tinh khiết thấp.

Chú ý với mao quản có đường kính trong nào đó, độ phân giải của hai píc giảm cùng với sự gia

tăng thể tích trễ được cộng thêm. Điều thú vị là độ phân giải trở nên tồi hơn nếu cộng thêm cùng thể

tích trễ nhưng sử dụng mao quản có đường kính trong lớn hơn (như chỉ ra trong hình 4.24). Khi

cộng thêm thể tích trễ 100 L với mao quản có đường kính trong 0,8 mm trở nên tồi hơn nhiều so

với khi cộng thêm cùng thể tích trễ nhưng là với mao quản có đường kính trong 0,25 mm. Đều này

dễ dàng được giải thích với hàm Aris-Taylor dưới đây. Độ mở rộng băng 2 tỷ lệ trực tiếp với tốc

độ dòng và độ dài mao quản nhưng tỷ lệ với luỹ thừa bậc 4 bán kính mao quản:

mD

LFr

.24

... 42

Do đó điều quan trọng là luôn luôn sử dụng những mao quản có đường kính trong tương thích

với tốc độ dòng yêu cầu cho ứng dụng cụ thể. Đường kính trong không phù hợp sẽ dẫn đến hoặc là

ngược áp quá cao nếu mao quản quá hẹp hoặc là hiệu quả thu phân đoạn tồi nếu nó quá rộng.

Tổng kết các tác động đã mô tả trong mục 7.4.5.1 và 7.4.5.2

Để giảm thiểu độ phân tán và tăng tối đa khả năng thu hồi, quan trọng là giữ cho mao quản

nối giữa detector và bộ gom phân đoạn càng ngắn càng tốt.

Nếu phải cộng thêm thể tích trễ vì bất cứ lý do gì, quan trọng là sử dụng mao quản có đường

kính trong phù hợp do mao quản rộng dẫn đến sự mở rộng băng và do đó hạ thấp độ thu hồi

và độ tinh khiết.

4.3.5 Các vấn đề an toàn

Khi làm việc trong HPLC điều chế, thể tích của những dung môi hữu cơ nguy hiểm như

acetonitril hoặc methanol cao hơn nhiều so với trong HPLC phân tích. Do đó phải đặc biệt cẩn thận

để tránh dung môi chảy tràn ra (lấy ví dụ nếu có xuất hiện rò rỷ trong hệ thống). Các phân đoạn

cũng có lượng lớn dung môi, dung môi bay hơi vào trong phòng thí nghiệm nếu các phân đoạn

không được làm khô ngay lập tức sau khi thu. Vì thế hệ thống tinh chế phải được trang bị các đặc

trưng an toàn để tránh gây nguy hiểm cho người vận hành và môi trường phòng thí nghiệm.

4.3.5.1 Quản lý rò rỷ

Lấy ví dụ trái với HPLC mao quản việc phát hiện rò rỷ trong HPLC điều chế thường dễ hơn. Do

thể tích dung môi được dùng trong HPLC điều chế cao, đề nghị không chạy hệ thống mà không có

sự giám sát (nếu không có những phòng ngừa trong trường hợp xuất hiện rò rỷ). Tuy nhiên bất lợi


của việc không nhận thấy có rò trong một trình tự chạy tinh chế không chỉ là lượng dung chảy ra mà

còn mất cả những mẫu có giá trị. Nếu hệ thống không nhận ra rò rỷ nó vẫn cứ tiêm mẫu, nó không

chỉ có nghĩa có dung môi chảy tràn nguy hiểm cho sức khoẻ người vận hành và nguy hại cho môi

trường phòng thí nghiệm mà còn làm mất những mẫu có giá trị đã tiêm sau khi xuất hiện rò rỷ. Do

đó hệ thống tinh chế phải được trang bị cảm biến rò rỷ, cho phép tắt hệ thống bơm và dừng tiêm

mẫu chưa chạy. Những hệ thống tinh chế hiện đại có trang bị cảm biến rò rỷ dừng hệ thống ngay

khi phát hiện được một vài giọt chất lỏng. Một hệ thống tiêu nước bảo đảm cho bất cứ khi nào rò rỷ

xuất hiện, dung môi chảy tràn luôn luôn được dẫn đến cảm biến rò rỷ của modul.

4.3.5.2 Dung môi bay hơi

Cuối một trình tự các phép chạy tinh chế, các phân đoạn gom được có chứa một vài lit dung môi.

Dung môi này sẽ bay hơi từ bình chứa phân đoạn vào trong không khí phòng thí nghiệm, nó có thể

dễ dàng đạt đến nồng độ cực đại trong môi trường làm việc. Do đó tối thiểu thì bộ thu phân đoạn

của hệ thống tinh chế phải được đặt dưới một tủ hút. Những hệ thống tinh chế hiện đại do có thiết

kế bộ thu phân đoạn bao kín nên hơi dung môi không thể bay hơi ra khỏi bộ thu phân đoạn. Quạt

nhỏ ở phía sau bộ thu phân đoạn loại bỏ hơi dung môi từ bên trong bộ thu phân đoạn và dẫn nó qua

đường ống vào tủ hút.

4.4 Các chiến lược thu phân đoạn

Trong phần xác lập cấu hình phần cứng bộ thu phân đoạn đã mô tả về việc van đổi hướng của bộ

thu phân đoạn phải được bật chuyển như thế nào từ vị trí thải sang vị trí gom sau khi trải qua thời

gian trễ. Trong phần này những cơ chế khác nhau về việc khởi phát bật chuyển van được mô tả,

cũng như mô tả về các thông số được dùng để quyết định một phân đoạn nào đó phải được gom hay

là không. Những cơ chế khởi phát dưới đây được giải thích:

Thu phân đoạn bằng tay

Việc bật chuyển van đổi hướng được khởi phát bằng tay nhờ nhấn hoặc nút trên thiết bị hoặc trên

phần mềm.

Gom phân đoạn dựa trên thời điểm

Gom theo những khoảng cách thời gian nào đó từ một phép chạy tinh chế.

Gom phân đoạn dựa trên píc

Gom dựa trên một tín hiệu detector

Gom phân đoạn dựa trên khối lượng

Gom nếu như MSD tìm thấy khối lượng mục tiêu do người sử dụng lựa chọn.

4.4.1 Gom phân đoạn bằng tay

Việc khởi phát phân đoạn bằng tay là một công cụ có giá được dùng để ngắt một phép chạy thu

phân đoạn tự động hoá trong trường hợp có vấn đề.

Thu phân đoạn bằng tay có nghĩa người sử dụng khởi phát việc bật chuyển van đổi hướng bằng

tay, thông thường là dựa trên đồ thị tín hiệu trên hiển thị thiết bị hoặc trong phần mềm. Dùng cách

thu phân đoạn bằng tay có độ linh hoạt cao nhất do chỉ có những phần mong đợi của phép chạy tinh

chế được gom. Điều trở ngại đối với phương pháp này chắc chắn là do mất tính tự động hoá và số

lượng mẫu đưa vào chạy thấp. Do đó việc thu phân đoạn bằng tay thường chỉ được dùng cho:

Những ứng dụng có ít mẫu

Những mẫu rất có giá trị

Khi tính an toàn đòi hỏi ngắt bằng tay một phép chạy tinh chế tự động

Hai khía cạnh quan trọng đối với độ chính xác của việc thu phân đoạn bằng tay là: trước tiên thể

tích trễ cũng phải được áp dụng cho quyết định khởi phát. Thời điểm nhìn thấy píc trong đồ thị tín

hiệu chưa phải là thời điểm hợp chất đi đến van đổi hướng. Do đó hệ thống phải chờ trong khoảng


thời gian trễ sau khi người vận hành đã nhấn nút để khởi phát phân đoạn. Hơn thế nữa đồ thị tín

hiệu phải là đồ thị thời gian thực, có nghĩa phải không có trễ giữ phép đo trong detector và tín hiệu

được hiển thị.

Với những hệ thống tinh chế hiện đại, việc thu phân đoạn bằng tay có thể được thực hiện nhờ sử

dụng bộ điều khiển cầm tay, nó cũng cho phép ngắt bằng tay một phép chạy tự động.

4.4.2 Thu phân đoạn dựa vào píc

Thu phân đoạn dựa vào píc là một hướng tự động hoá thu phân đoạn dựa trên tín hiệu detector,

thường là từ một detector UV. Thường thường thông số được dùng để quyết định có hay không một

píc trong sắc đồ sẽ khởi phát bộ thu phân đoạn là ngưỡng và/hoặc hệ số góc.

Hướng đơn giản nhất để thu phân đoạn dựa vào píc là chỉ khởi phát trên ngưỡng: Ngay khi tín

hiệu vượt quá một giới hạn định trước, một phân đoạn bắt đầu được khởi phát; khi tín hiệu rơi trở

lại xuống dưới ngưỡng cụ thể việc thu gom được ngắt.

Hình 4.25 chỉ ra kết quả của việc thu phân đọan dựa vào píc chỉ trên cơ sở ngưỡng. Mặc dù píc

đầu tiên và píc cuối cùng đã được gom chính xác, hai píc ở giữa được gom thành một phân đoạn

duy nhất không quan tâm đến việc các chất đang được tách trên cột ở mức độ nào. Hướng duy nhất

để thu chúng thành những phân đoạn tách biệt là gia tăng ngưỡng, nhưng điều đó sẽ dẫn đến mất

một số chất vào lúc bắt đầu và lúc kết thúc của tất cả các píc. Hơn thế nữa đặc điểm chung của

phương pháp là phải làm việc với những chất có hệ số phản hồi khác nhau, ngưỡng phải được đặt

không quá cao nếu không thì một số píc có thể bị mất hoàn toàn.

Hình 4.25 Thu phân đoạn dựa vào píc trên ngưỡng

Để thu những píc không tách được đường nền, một thông số thứ hai được yêu cầu là hệ số góc.

Hệ số góc là đạo hàm bậc 1 của sắc đồ. Đối với píc dạng Gaussian đơn giản, hệ số được hiển thị

như trong hình 4.26. Như đã chỉ ra trong hình 4.26, hệ số góc đạt đến cực đại của nó tại điểm uốn

đầu tiên của nó, rơi trở về zero tại đỉnh píc và đạt đến cực tiểu của nó tại điểm uốn thứ hai của píc.

Đối với việc thu phân đoạn dựa vào píc trên hệ số góc píc có nghĩa là một píc chỉ có thể được khởi

phát trước điểm uốn đầu tiên theo sự gia tăng giá trị hệ số góc.


Hình 4.26. Sắc đồ và hệ số góc của một píc Gaussian

Nếu sử dụng giá trị hệ số góc cao hơn giá trị tại điểm uốn tất cả píc sẽ không được thu. Do điểm

uốn thứ hai có cùng hiệu lực như vậy nên không thể khởi phát bắt đầu và/hoặc dừng lại phân đoạn

giữa các điểm uốn của píc với việc chỉ dựa trên hệ số góc píc! Trong khi việc khởi phát điểm bắt

đầu của píc sử dụng giá trị hệ số góc là công việc đơn giản - ngay khi vượt qua hệ số góc cụ thể,

điểm bắt đầu píc được khởi phát - ngắt thu phân đoạn dựa vào giá trị hệ số góc khó khăn hơn. Do

giá trị hệ số góc tại đỉnh píc bằng 0 và rơi xuống cực tiểu, phần mềm điều khiển sử dụng thuật toán

sau để khởi phát việc dừng píc: một thông số hệ số góc là up-slope được sử dụng để khởi phát bắt

đầu píc; một thông số thứ 2 là down-slope được dùng để khởi phát dừng píc. Áp dụng down-slope

do người sử dụng đưa vào, phần mềm theo dõi giá trị âm và sau đó khởi phát dừng khi đầu tiên hệ

số góc rơi xuống và sau đó tăng quay trở lại trên giá trị này (hình 4.27).

Hình 4.27. Việc khởi phát dựa trên up-slope và down-slope với phần mềm điều khiển

Một vấn đề có thể nảy sinh khi khởi phát trên hệ số góc và tín hiệu chạy vào vùng bão hoà của

detector. Đầu tiên chỉ nhìn thấy các đỉnh píc phẳng, sau đó là khá ồn do ồn điện tử (hình 4.28) khi

được phóng đại. Do hệ số góc đối với một píc như vậy có một vài cực đại, vài zero và vài cực tiểu

dẫn đến một vài phân đoạn sẽ được khởi phát khi sử dụng các thông số hệ số góc.


Hình 4.28. Ồn điện tử trong píc khi detector bão hoà

Ngưỡng trên (upper threshold) được dùng như thế nào để tránh thu nhiều phân đoạn không cần thiết nếu píc chạy vào vùng

detector bão hoà?.

Để tránh khởi phát những phân đoạn không cần thiết này, cần sử dụng thêm một thông số nữa gọi

là ngưỡng trên. Khi tín hiệu nâng lên trên ngưỡng trên việc khởi phát bắt đầu và dừng lại được lờ đi.

Để bảo đảm một vài vùng lõm có thực giữa hai píc không bị lờ đi, ngưỡng trên cần được đặt gần

với giới hạn bão hoà của detector UV.

Như đã chỉ ra trong hình 4.25 hai píc chưa tách đường nền không thể được gom thành những

phân đoạn tách biệt với việc sử dụng ngưỡng hợp lý. Khi thu phân đoạn chỉ trên hệ số góc hai píc

có thể được tách ra nhưng cũng có thể sẽ khởi phát những phân đoạn không cần thiết do ồn đường

nền. Do đó một sự kết hợp các thông số ngưỡng và hệ số góc thường được sử dụng để thu phân

đoạn. Logic kết hợp các thông số này như thế nào được mô tả dưới đây, kết quả của việc thu phân

đoạn được chỉ ra trong hình 4.29.

Hình 4.29. Thu các píc chưa tách đường nền

Bắt đầu một píc được chỉ thị theo vạch 1 trong hình 4.29, píc được khởi phát khi cả hai tiêu

chuẩn được đáp ứng: Tín hiệu phải tăng lên trên ngưỡng và hệ số góc phải tăng lên trên giá trị up-

select. Để khởi phát dừng píc chỉ cần một trong các tiêu chuẩn dừng được đáp ứng: hoặc tín hiệu rơi

xuống dưới ngưỡng hoặc tiêu chuẩn down-slope được khởi phát như đã mô tả ở trên. Do hệ số góc

tại vùng lõm giữa hai píc bằng zero, píc dừng lại như chỉ định bởi vạch 2 trong hình 4.29, được khởi

phát trước vùng lõm. Không lâu ngay sau đó việc bắt đầu phân đoạn thứ hai được khởi phát do

ngưỡng vẫn bị vượt qua và hệ số góc tăng trở lại trên giá trị up-slope cụ thể (vạch 3). Việc kết thúc

phân đoạn thứ 2 được khởi phát như chỉ ra với vạch 4 trong hình 4.29 do tín hiệu rơi xuống dưới

ngưỡng thiết lập dù thiết lập down-slope chưa được đáp ứng.

Tuỳ vào ứng dụng, có thể cần thiết lập hệ thống khởi phát không chỉ bằng tín hiệu từ detector UV

mà còn bằng tín hiệu từ bất kỳ detector nào khác, lấy ví dụ detector huỳnh quang (FLD) hoặc

detector phân tán ánh sáng pha hơi (ELSD). Những detector này không cần xuất phát từ cùng một

nhà chế tạo hệ thống tinh chế, nhưng tuy nhiên chúng cần có thể khởi phát được bắt đầu hoặc dừng

píc theo tín hiệu từ những detector này.

4.4.3 Thu phân đoạn dựa vào khối lượng

Trong thu phân đoạn dựa vào píc tất cả các hợp chất được gom nếu píc của chúng đáp ứng tiêu

chuẩn khởi phát. Thì chỉ hợp chất nào có khối lượng mong đợi là được gom chọn lọc khi thu phân

đoạn dựa vào khối lượng. Do đó số lượng phân đoạn thu được thấp hơn nhiều so với thu phân đoạn

dựa vào píc. Để thành công trong việc thu phân đoạn dựa vào khối lượng, hai yêu cầu phải được

đáp ứng: biết khối lượng phân tử của hợp chất quan tâm và hợp chất ion hoá được để có thể phát

hiện được bằng MSD.


Phải nhập khối lượng mục tiêu đặc trưng của mẫu vào phần mềm để chạy thành công tinh chế

dựa vào phổ khối. Cần vào khối lượng monoisotopic tuyệt đối của hợp chất và không vào khối

lượng trung bình (mặc dù một số phần mềm cho phép vào công thức tổng quát). Giống khối lượng

mục tiêu là một thông số đặc trưng cho mẫu, sản phẩm cộng mong đợi phụ thuộc vào pha động sử

dụng trong dòng chính và dòng bổ trợ và do đó là những gì đặc trưng, cụ thể theo phương pháp. Lấy

ví dụ nếu pha động có pH thấp được sử dụng trong dòng bổ trợ, hầu như chắc chắn là có thể nhìn

thấy [M+1]+ trong MSD. Nếu pha động bổ trợ có chứa Na, [M+23]+ là sản phẩm mong đợi. Tổng

khối lượng mục tiêu và ion cộng bằng ion khởi phát, nhờ ion đó MSD khởi phát thu phân đoạn

(hình 4.30)

Hình 4.30 Ví dụ tính toán ion khởi phát

Dựa vào ion khởi phát, MSD tính toán sắc đồ ion chiết (EIC) từ sắc đồ tổng ion (TIC) và áp các

thông số khởi phát ngưỡng và hệ số góc lên nó. Khi tiêu chuẩn được đáp ứng, MSD khởi phát bộ

thu phân đoạn để gom một phân đoạn (hình 4.31)

Hình 4.31 EIC của ion khởi phát

Hiển nhiên việc vào đúng khối lượng mục tiêu cho mẫu là phần tới hạn trong thu phân đoạn dựa

vào phổ khối. Nếu khối lượng được vào không đúng, không có hợp chất nào được gom và hợp chất

mục tiêu chạy thẳng vào vị trí thải. Để tránh mất hoàn toàn mẫu, nhiều hệ thống tinh chế dựa vào

phổ khối được trang bị những vị trí thu hồi cụ thể theo mẫu, trong đó tất cả mẫu được gom lại là

những mẫu chưa được nhận diện là một phân đoạn.

4.4.4 Sự kết hợp thu phân đoạn dựa vào píc và dựa vào phổ khối

Trong HPLC phân tích, một lợi thế của detector MSD là độ nhạy cao của nó so với detector UV.

Trong HPLC điều chế độ nhạy thường không phải là vấn đề. Thậm chí độ nhạy cao hơn của MSD

có thể lại là một bất lợi. Ngay cả khi sử dụng ở tỷ lệ chia dòng cao, tín hiệu của MSD thường mở

rộng hơn tín hiệu của detector UV trong đường truyền dòng giữa cột và bộ chia. Sự mở rộng píc

này là do quá tải detector MSD, đặc biệt là của buồng phun sương và mao quản điện môi. Do đó có

thể xuất hiện vấn đề những píc rửa giải sít nhau không được hệ thống tinh chế thu gom tốt do ion

mục tiêu “giãn đuôi” vào píc kế tiếp. Một ví dụ chỉ ra trong hình dưới đây:


Hình 4.32. Sự giãn đuôi ion khởi phát vào píc kế tiếp

Khi nhìn vào TIC có thể thấy phân đoạn được chỉ thị bằng vạch trắng và vạch đen - phải được ngắt sớm

hơn để mang lại kết quả có độ tinh khiết tốt nhất. Tuy nhiên EIC của ion khởi phát (217) cho thấy phân

đoạn được gom một cách hợp lý miễn là EIC của ion khởi phát nằm trên ngưỡng cụ thể.

Có thể đạt được kết quả thu phân đoạn tốt hơn nếu khối lượng mục tiêu nếu khối lượng mục tiêu

của hợp chất rửa giải gần sít cũng được nhập vào trong phần mềm. Khi cả hai ion khảo sát (217 và

245) được thu gom, phân đoạn đầu tiên sẽ được ngắt ngay khi ion khởi phát (245) vượt lên trên ion

khởi phát đầu tiên (217) trong phổ khối. Mặc dù kết quả thu phân đoạn đạt được với kỹ thuật này là

thoả đáng, vấn đề là ở chỗ phải biết được khối lượng mục tiêu của tạp chất đồng giải hấp cục bộ

trước khi bắt đầu chạy tinh chế. Chắc chắn đây không phải là trường hợp đối với tất cả các tạp chất

trong mẫu. Do đó phải tiến hành chạy phân tích trước khi chạy điều chế để xác định các khối lượng

mục tiêu của những tạp chất có thể có. Thuật toán này làm việc tốt miễn là trật tự rửa giải và độ

phân giải trong chạy điều chế tương xứng với của phép chạy phân tích. Nếu trật tự rửa giải hoặc độ

phân giải thay đổi, nó có thể làm nhiễu loạn quá trình thu phân đoạn dẫn đến làm giảm độ thu hồi

và độ tinh khiết.

Giải pháp tốt hơn với vấn đề này là kết hợp tín hiệu MSD với tín hiệu của một detector UV được

đặt trong đường truyền dòng giữa cột và bộ chia. Detector này sẽ hiển thị hình dạng píc thực tế của

hợp chất đến từ cột và chạy vào bộ thu phân đoạn nếu hiệu ứng phân tán được giảm thiểu như đã

mô tả trong những phần trước.

Để có được kết quả tinh chế tốt nhất, tín hiệu MSD cần được kết hợp với tín hiệu detector UV sử dụng logic kết hợp AND.

Hình 4.33 cho biết kết quả thu phân đoạn của mẫu giống với mẫu chỉ ra trong hình 4.32 nhưng

với logic kết hợp AND các tín hiệu detector UV và MS. Điều đó có nghĩa một phân đoạn chỉ được

thu khi cả hai detector UV và MS nhận thấy tín hiệu đáp ứng tiêu chuẩn khởi phát và trải qua các

khoảng thời gian trễ khác nhau của cả hai detector. Trong ví dụ chỉ ra ở hình 4.33 việc khởi phát ở

detector MSD được thực hiện theo cùng hướng như đã mô tả trong hình 4.32, trong detector UV

việc khởi phát được thực hiện chỉ dựa trên hệ số góc. Do đó phân đoạn được ngắt đủ sớm do tiêu

chuẩn down-slope trong detector UV đã được đáp ứng trong khi ion khởi phát vẫn đang hiện diện.

Hình 4.33. Thu phân đoạn dựa trên tín hiệu UV và MSD sử dụng logic kết hợp AND


Nhìn vào các sắc đồ EIC của hai khối lượng 217 và 245 (hình 4.34) cho thấy việc gom phân đoạn

đã được dừng trước khi nó bị ô nhiễm bởi một phần hợp chất đồng giải hấp.

Hình 4.34. EIC của các khối lượng khởi phát của hợp chất mục tiêu và tạp chất.

Việc kết hợp tín hiệu UV và MSD sử dụng logic AND có một số thuận lợi hơn so với việc kết

hợp khối lượng mục tiêu với các khối lượng của các tạp chất. Không cần thiết chỉ rõ khối lượng

mục tiêu của các tạp chất đồng giải hấp có thể có khi việc khởi phát trên tín hiệu UV không chọn

lọc, điều đó có nghĩa nó không tác động lên việc thu phân đoạn nếu trật tự rửa giải của hợp chất

trong phép chạy điều chế thay đổi khi được so sánh với phép chạy phân tích. Cũng không cần nhận

diện các khối lượng mục tiêu của những tạp chất đồng giải hấp có thể có trong một phép chạy phân

tích trước khi phép chạy điều chế được bắt đầu.

Documents

HPLC Primer